MXPA00012785A - Vacuna de circovirus y parvovirus porcina. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a preparaciones antigenicas y vacunas dirigidas contra el sindrome de atrofia multisistemica porcino (PMWS), que comprenden al menos un antigeno de circovirus porcino, preferiblemente del tipo II, y al menos un antigeno de parvovirus porcino.

Description

VACUNA DE CIRCOVIRUS Y PARVOVIRÜS PORCINA Campo de la Invención .

La presente invención se refiere a una vacuna contra el síndrome PMWS (Síndrome de Atrofia Muí tisis témica Porcina también llamada Síndrome de Atrofia Mult is istémica Porcina Posterior al Destete) .

Antecedentes de la Invención.

Se citan varios documentos en el siguiente texto, y se hace referencia o se citan varios documentos en los documentos citados en el siguiente texto. No se admite que estos documentos son en efecto la técnica anterior a la presente "invención. Todos los documentos citados en la presente y todos los documentos a los que se hace referencia o se cita en los documentos citados en la presente, son, por lo tanto, incorporados en la presente para referencia.

El CVP' (para "CircoVirus Porcino") se detectó originalmente como un contaminante no Ref: 125934 citopatogénico en líneas de células de riñon de cerdo PK/15. Este virus se clasifica entre los Circovirus con el virus de anemia del pollo (VAP para Virus de Anem ia del Pol l o ) y el virus VEGPP ( Virus de la Enfermedad Gran ula r y del Pi co Psi t a cína ) . Este es un virus pequeño no envolvente (de 15 hasta 24 nm) cuya característica común es que contiene un genoma en forma de un ADN de trenzado sencillo circular de 1.76 hasta 2.31 kb . Esta fue la primera idea de que este genoma codificaba un polipéptido de alrededor de 30 kDa (Todd y colaboradores, Arch Virol 1991, 117; 129- 135) . Sin embargo, un trabajo reciente ha mostrado una transcripción más completa (Meehan B. M. y colaboradores, 1997, 78; 221-227) . Por otra parte, no se conocen homologías en la secuencia del nucleótido o en antigénicos comunes determinantes -entre los tres tipos de circovirus conocidos.

El CVP derivado de las células PK/15 se considera que no es patogénico. Esta secuencia se conoce de B.M. Meehan y colaboradores, J. Gen. Virol -1997 (78) 221-227. Solo muy recientemente, algunos autores han tenido la idea de que las cepas de CVP pueden ser patogénicas y asociadas con el síndrome PMWS (Gupi P.S. Nayar y colaboradores, Can. Vet. J, vol. 38, 1997: 385-387 y Clark E.G., Proc. Am . Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501) . Nayar y colaboradores han detectado el ADN de CVP en cerdos que tienen el síndrome PMWS usando técnicas PCR.

El síndrome PMWS detectado en Canadá, los Estados Unidos y Francia, se caracteriza clínicamente por una pérdida gradual de peso y por manifestaciones tales como taquinea, disnea e ictericia. Desde el punto de vista patológico, se manifiesta por infiltraciones granulomatosas o linfocí ticas , 1 infadenopa t í as y, más raramente, por hepatitis y nefritis granulomatosas o linfocíticas (Clark E.G., Proc. Am . Assoc. Swine Prac. 1997; 449-501; La Semaine Vétérinaire No. "26, suplemento de La Semaine Vétérinaire 1996 (834); La Semaine Vétérinaire 1997 (857) : 54; Gupi P.S. Nayar y colaboradores, Can. Vet. J, vol. 38, 1997; 385-387) .

El solicitante ha tenido éxito aislando cinco nuevas cepas de CVP de muestras pulmonares o gangliónicas obtenidas de granjas situadas en Canadá, los Estados Unidos (California) y Francia (Brittany) . Estos virus se han detectado en lesiones de cerdos con el síndrome PMWS, pero no en cerdos saludables.

El solicitante tiene, además, la secuencia del genoma de cuatro de estas cepas, especialmente las cepas obtenidas de Canadá y los Estados Unidos así como dos cepas Francesas. Las cepas exhiben una homología muy fuerte con cada una de las otras al nivel nucleótido, excediendo el 96% y mucho más débil con la cepa PK/15, alrededor del 76%. Las cepas nuevas pueden de esta manera considerarse como que son representativas de un nuevo tipo de circovirus porcino, nombrado en la presente tipo II, el tipo I se representa por PK/15.

Se depositaron preparaciones purificadas de cinco cepas, bajo el Tratado de Budapest, en el ECACC (European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Portón Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG; Reino Unido) el Jueves 2 de Octubre de 1997: acceso No. V97100219 (llamada en la presente Imp. 1008PCV) acceso No. V97100218 (llamada en la presente Imp. 1010PCV) - acceso No. V97100217 (llamado en la presente Imp. 999PCV) , y el Viernes 16 de Enero de 1998: acceso No. V98011608 (llamado en la presente Imp. 1011-48285) acceso No. V98011609 (llamado en la presente Imp. 1011-48121) .

El solicitante ha observado que, en un experimento para la reproducción experimental del síndrome de atrofia muí t isi s témica porcino, un parvovirus porcino combinado con el circovirus porcino puede llevar a un agravamiento de la enfermedad .

Descripción de la Invención.

El objeto de la presente invención es, por lo tanto, una vacunación de cerdos usando un circovirus porcino, en particular del tipo I ó del tipo II, preferiblemente del tipo II, vacunado, combinado con una vacunación con una vacuna de parvovirus porcino. Se entenderá el significado de vacunación con ya sea una vacuna bivalente, o el uso simultáneo, en cerdos, de una vacuna de circovirus porcino y de una vacuna de parvovirus porcino .

La cepa de parvovirus de referencia es la cepa NADL-2 que es accesible de la colección ATCC bajo la preferencia VR-742. La vacunación contra el parvovirus porcino es bien conocida por personas hábiles en la técnica y las vacunas contra el parvovirus porcino están comercialmente disponibles. Pueden mencionarse, por ejemplo Parvovax® (vacuna inactiva contra parvovirosis porcina, distribuida por MERIAL) . Ver también, por ejemplo, P. Vannier y A. Laval. , Point. Vét. 1993, 25 (151), 53-60; G. Florent y colaboradores, Proceedings of the Ninth Congress of Pig "Veterinary Society, Julio 15-18, 1986, Barcelona, España. Para la? vacunas ADN, puede referirse, por ejemplo, a la WO-A-98 03658.

El objeto ae la presente invención es, por lo tanto, una pre ración antigénica dirigida contra el síndrome PMWS, que comprende al menos un antígeno de circovirus porcino (preferiblemente circovirus del tipo II) y al menos un antígeno de parvovirus porcino. De conformidad con la invención, el antígeno de circovirus porcino (preferiblemente circovirus del tipo II) y el antígéno de parvovirus porcino comprende, independientemente uno del otro, un antígeno elegido del grupo que consiste de un antígeno completamente vivo atenuante, un antígeno completamente inactivo, un antígeno de sub-unidad, un vector de vida recombinante y un vector ADN. Se entenderá que la combinación de conformidad con la invención puede involucrar el uso de cualquier antígeno apropiado o forma de preparación antigénica, siendo entendido que no es necesario el uso de la misma forma para una combinación dada. La preparación antigénica puede comprender, además, como se conoce en sí misma, un vehículo o "excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario, y opcionalmente un adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario.

El objeto de la presente invención también es una composición inmunogénica o una vacuna contra el síndrome PMWS, que comprende una cantidad efectiva de una preparación antigénica de circovirus + parvovirus como se describe anteriormente, en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario, y, opcionalmente, un adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario. Una composición inmunogénica obtiene una respuesta inmunológica que puede ser, pero no necesariamente es, protectora. Una composición de vacuna obtiene una respuesta protectora. En consecuencia, el término "composición inmunogénica" incluye una "composición de vacuna" (como el término formado puede ser una composición protectora) .

El objeto de la invención es también un estuche inmunológico o de vacunación que contiene, empacados de manera separada, una preparación antigénica o una composición inmunológica o una -vacuna contra el circovirus porcino y una preparación antigénica o una composición inmunogénica o una vacuna contra el parvovirus porcino. Este estuche puede tener las diferentes características colocadas anteriormente para las preparaciones antigénicas, composiciones inmunogénicas y vacunas.

El objeto de la invención también es un método de inmunización o de vacunación contra el síndrome PMWS, que comprende la administración de una composición inmunogénica o una vacuna contra el circovirus porcino y de una composición inmunogénica o una vacuna contra el parvovirus porcino o la administración de una composición o vacuna inmunogénica bivalente, que comprenden, en la misma formulación, una preparación antigénica específica para cada virus. Este método de inmunización o vacunación usa, en particular, las vacunas como se definieron anteriormente.

El objeto de la invención es también el uso de una preparación antigénica o de una composición o una vacuna inmunogénica contra el parvovirus, como - se define en particular en la parte de arriba, -para la preparación de una composición farmacéutica que se intenta usar en el contexto de la prevención del síndrome PMWS, en combinación con una preparación antigénica o una composición o una vacuna inmunogénica contra el circovirus porcino .

Para la producción de preparaciones antigénicas de circovirus, los circovirus pueden obtenerse después de pasar en las células, en particular en las líneas de células, por ejemplo células PK/15. Los cultivos sobrenadantes o extractos, opcionalmente purificados por técnicas estándares, pueden usarse como preparación antigénica.

En el contexto de las preparaciones antigénicas atenuantes y las composiciones o vacunas inmunogénicas atenuantes, la atenuación puede llevarse a cabo de conformidad con los métodos comunes, por ejemplo, pasando en las células, preferiblemente pasando en células de cerdo, especialmente líneas de célula, tales como células PK/15 (por ejemplo desde 50 hasta 150, especialmente del orden de 100, pasadas) . Estas •composiciones y vacunas inmunogénicas comprenden, general, un vehículo o diluyente aceptable desde el punto de vista veterinario, opcionalmente un adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario, así como opcionalmente un estabilizador secado por congelamiento.

Estas preparaciones antigénicas, composiciones y vacunas inmunogénicas, preferiblemente comprenden desde 103 hasta 107 TCID50 de los virus atenuantes en cuestión.

Estas pueden ser preparaciones antigénicas, composiciones y vacunas inmunogénicas basadas en un antígeno completamente inactivo. Las composiciones y vacunas inmunogénicas inactivas comprenden, además, un vehículo o un diluyente aceptable desde el punto de vista veterinario, con, opcionalmente, además, un adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario.

Los circovirus de conformidad con la invención, con las fracciones que pueden presentarse, son inactivos de conformidad con las •técnicas conocidas por las personas hábiles en la técnica. La inactivación puede llevarse a cabo preferiblemente por la vía química, por ejemplo exponiendo el antígeno a un agente químico tal como formaldehído (formalino), paraformaldehído, ß-prbpiolactona o etilenimina o sus derivados. El método preferido de inactivación, es, en la presente, exponer a un agente químico y en particular a etilenimida o ß-propiolactona.

Preferiblemente, las preparaciones antigénicas inactivas y las composiciones y vacunas inmunogénicas inactivas de conformidad con la invención se suministran con adyuvantes, ventajosamente siendo proporcionadas en la forma de emulsiones, pr ejemplo agua en aceite o aceite en agua, de conformidad con técnicas bien conocidas por personas hábiles en la técnica. Es posible por el carácter adyuvante, tener también la incorporación de un compuesto adyuvante común en el ingrediente activo.

Entre los ad uvantes que pueden usarse, puede mencionarse a modo de ejemplo el hidróxido de "aluminio, las saponinas (por ejemplo, saponina Quillaja o Qu J 1 A; Ver Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, editada por Michael F. Pcwe y Mark J. Newman, Plennium Press, Nueva York y Londres, pagina 210) , Avridina® (Vaccine Desigr, pagina 148), DDA (bromuro de dimetildioctadecil-amonio, Vaccine Design, pagina 157), polifosfacano (Vaccine Design, pagina 204), o alternativamente emulsiones aceite en agua basadas en aceite mineral, escualeno (por ejemplo emulsión SPT, Vaccine Design, pagina 147), escualeno (por ejemplo MF59, Vaccine Design, pagina 183), o emulsiones agua en aceite basadas en aceite metabolizable (preferiblemente de conformidad con la WO-A-94 20071) así como las emulsiones descritas en la US-A-5 , 422 , 109. También es posible elegir combinaciones de adyuvantes, por ejemplo Avridine® o DDA combinada con una emul sion .

Estas preparaciones antigénicas, composiciones y vacunas inmunogénicas, preferiblemente comprenden desde 105 hasta 108 TCID50 del virus completo inactivado en cuestión.

Los adyuvantes para vacunas vivas descritos anteriormente pueden seleccionarse de aquellos dados para la inactividad. Las emulsiones son las preferidas. Para aquellos indicados para la vacuna inactiva, pueden agregarse aquellos descritos en la WO-A-9416681.

Como estabilizador secado por congelamiento, se pueden mencionar a modo de ejemplo el SPGA (Bovarnik y colaboradores, J. Bactereology 59, 509, 950), carbohidratos tales como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína, derivados de estos compuestos, o soluciones amortiguadoras tales como fosfatos de metal alcalino.

Las preparaciones antigénicas, composiciones y vacunas inmunogénicas, de conformidad con la invención pueden comprender uno o más ingredientes activos (antígenos) de uno o más circovirus y/o parvovirus de conformidad con la invención.

El solicitante ha, además, obtenido el genoma de cuatro de los circovirus porcinos del tipo II "aislados, identificados por la SEQ ID NO: 1 hasta 4. La secuencia de la cepa PK-15 se da como la SEQ ID NO: 5. Esto va sin decir que la invención automáticamente convierte las secuencias equivalentes, que dice que las secuencias que no cambian la funcionalidad o lo especifico de la cepa de la secuencia descrita o de los polipéptidos codificados por esta secuencia. Por supuesto que se incluye las diferencias en la secuencia por la degradación del código.

La invención también cubre las secuencias equivalentes en el sentido de que estas son capaces de hibridizarse con la secuencia anterior bajo condiciones de alto rigor y/o tienen una alta homología con las cepas de la invención.

Estas secuencias y sus fragmentos pueden usarse ventajosamente para las expresiones in vitro o in vivo de los polipéptidos con la ayuda de los vectores apropiados.

En particular, las estructuras de lectura abiertas (ORF1-13), forman fragmentos de ADN de conformidad con la invención, que pueden usarse -para este efecto siendo identificados en la secuencia genómica del circovirus tipo II. La invención se refiere a cualquier polipéptido que contiene al menos una de estas estructuras de lectura abierta (secuencia de aminoácido correspondiente) . Preferiblemente, la invención se refiere a una proteína esencialmente consistente de ORF4, ORF7, ORF10 u ORF13.

Para la expresión de las sub-unidades in vitro como un medio de expresión, se usa preferiblemente E. coli o un baculovirus ( US-4 , 745 , 051 ) . La secuencia de codificación o sus fragmentos pueden integrarse en el genoma del baculovirus (por e-jemplo el virus poliedrosis nuclear californica autógrafa baculovirus AcNPV) y este ultimo puede entonces propagarse en células de insecto, por ejemplo Spodoptera frugiperda Sf9 (deposito ATCC CRL 1711) . Las sub-unidades pueden también producirse en células eucarióticas tales como células de levaduras (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae) o células de mamíferos por ejemplo CHO, BHK) .

El objeto de la invención también es el uso de sub-unidades de los polipéptidos que pueden •producirse in vitro por estos medios de expresión, y entonces purificarse opcionalmente de conformidad con técnicas convencionales. Las composiciones y vacunas inmunogénicas de subunidades, comprenden al menos un polipéptido de esta manera obtenido, o fragmento, en un vehículo o diluyente aceptable desde el punto de vista veterinario, y opcionalmente un adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario.

Para la expresión in vivo, para el propósito de producir composiciones y vacunas inmunogénicas del tipo vivo recombinante o del tipo ADN, la secuencia codificadora o sus fragmentos se insertan en un vector de expresión apropiado bajo condiciones que permitan la expresión de los polipéptidos. Como vectores vivos apropiados, pueden usarse preferiblemente virus vivos, preferiblemente capaces de multiplicarse en cerdos, no patogénicos para los cerdos (naturalmente no patogénicos o que se interpretan como tales), de conformidad con técnicas bien conocidas por personas hábiles en la técnica.

Pueden usarse en particular herpesvirus de cerdo "tales como "virus de la enfermedad Aujeszky, adenovirus porcinos, poxvirus, especialmente virus de vacuna, virus avipox, virus canaripox, virus swinepox. Los vectores ADN pueden también usarse como vectores ( WO-A- 9011092 , WO-A- 9319813 , WO-A- 9421797, WO-A-9520660) .

El objeto de la invención es, por lo tanto, también, los vectores y las composiciones o vacunas inmunogénicas de tipo ADN (pol inucleot ido ) o del tipo vivo recombinante de esta manera preparados, su preparación y su uso, las composiciones y las vacunas inmunogénicas comprenden, además, un vehículo o diluyente aceptable desde el punto de vista veterinario.

Para definición, una composición o vacuna inmonogénica ADN comprende un vector ADN que es un plásmido de vacuna circular, sobre coloide o similar, o una molécula ADN lineal, incorporada y expresada in vivo en una secuencia nucleótida que codifica un poiipéptido antigénico.

Las composiciones y vacunas inmunogénicas del "tipo ADN pueden comprender un adyuvante.

En el contexto de los programas de inmunización o vacunación combinados, es posible combinar la inmunización o vacunación contra el circovirus por lio y el parvovirus porcino con una inmunización o vacunación contra otros patógenos del cerdo, en particular aquellos que se asocian con el síndrome PMWS. La composición o vacuna inmunogénica de conformidad con la invención puede, por lo tanto, comprender otra valencia correspondiente a otro patógeno del cerdo elegido del SRRP (Síndrome Respiratorio y Reproductor del Porcino) y/o Mycroplasma hyopneumoniae , y/o E. coli, y/o rinitis atrófica, y/o virus de la seudorabia (enfermedad de Aujeszky) y/o influenza porcina y/o Actinobacillus pleuroneumoniae y/o cólera Hog, y combinaciones de las mismas. Preferiblemente, el programa de inmunización o vacunación y las vacunas de conformidad con la invención pueden combinar inmunizaciones o vacunaciones contra el circovirus y el parvovirus, y el SRRP ( WO-A93 / 07898 , WO-A- 94 / 18311 , FR-A-2 709 966); C. Charreyre y colaboradores, Proceedings of the 15 IPVS Congress, Birmingham, Inglaterra, "julio 5-9 1998, pagina 139; y/o Mycroplasma hyopneumoniae (EP-A-597 852, EP-A-550 477, EP-A571 648; O. Martinon y colaboradores, pagina 157, 284, 285 y G. Reynaud y colaboradores, pagina 150, todos a los que se hace referencia anteriormente proceden del 15th IPVS Congress) y/o influenza porcina. Es posible usar cualquier forma apropiada de composición o vacuna inmunogénica, en particular cualquier vacuna comercial disponible, para combinarse con la composición o vacuna inmunogénica contra el circovirus porcino y el parvovirus porcino como se ha descrito aquí.

El objeto de la presente invención es, por lo tanto, también, composiciones y vacunas inmunogénicas muí t i valentes , estuches de vacunas múltiples, y métodos de inmunización o vacunación combinados que hacen posible el uso de tales programas de inmunización o vacunación combinados.

La invención se describe ahora en mayor detalle con la ayuda de las formas de realización ejemplares no limitativas, tomando como referencia los dibujos, en las cuales: La Figura 1 es una secuencia ADN del genoma de la cepa Imp . 1011-48121.

La Figura 2 es una secuencia ADN del genoma de la cepa Imp . 1011-48285.

La Figura 3 es una secuencia ADN del genoma de la cepa Imp. 999.

La Figura 4 es una secuencia ADN del genoma de la cepa Imp . 1010.

La Figura 5 es la alineación de 4 secuencias de conformidad con las figuras 1 hasta 4 con la secuencia de la cepa CVP PK/15.

Listado de secuencia SEQ ID SEQ ID No: 1 es una secuencia ADN del genoma de la cepa Imp 1011-48121. SEQ ID No: 2 es una secuencia ADN del genoma de la cepa Imp 1011-48285.

SEQ ID No: 3 es una secuencia ADN del genoma de la cepa Imp . 999.

SEQ ID No: 4 es una secuencia ADN del genoma de la cepa Imp . 1010.

SEQ ID No: 5 es una secuencia ADN del genoma de la cepa PK/15.

Ejemplos Ejemplo 1: Cultivo y aislamiento de las cepas de circovirus porcino : Se colectaron muestras de tejido en Francia, Canadá y los Estados Unidos del pulmón y de los ganglios linfáticos de lechones. Estos lechones exhibían señales clínicas típicas del síndrome de atrofia muí tisis témica posterior al destete. Para facilitar el aislamiento de los virus, las muestras de tejido se congelaron a -70°C inmediatamente después de la autopsia.

Para el aislamiento viral, se prepararon suspensiones que contenían alrededor del 15% de muestra de tejido en un medio mínimo que contenía •sales Earle (EMEM, Biowhittaker UK Ltd., Wokingham, RU), penicilina (100 IU/ml) y estreptomicina (100 ug/ml) (medio MEM-SA), moliendo los tejidos con arena estéril usando argamasa estéril y un triturador. Esta tierra de preparación se tomó en MEM-SA, y entonces se centrifugó a 3000 g por 30 minutos a +4°C con objeto de recoger el sobrenadante.

Antes de la inoculación de los cultivos celulares, se agrego un volumen de 100 µl de cloroformo a 2 ml de cada sobrenadante y se mezcló continuamente por 10 minutos a temperatura ambiente. Esta mezcla se transfirió entonces a un tubo microcentrifugado , centrifugando a 3000 g por 10 minutos, y entonces se retiró el sobrenadante. Este sobrenadante se usó entonces como un inoculo para los experimentos de aislamiento viral.

Todos los estudios de aislamiento virales se llevaron a cabo en cultivos de células PK/15, conocidas por estar no contaminadas con el circovirus porcino (CVP), pestivirus, adenovirus porcino y parvovirus porcino (Alian G. y colaboradores Pathogenesis of - porcine circovirus experimental infections of colos t rum-depr i ved "piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995, 44, 49-64) .

El aislamiento de los circovirus porcinos se llevó a cabo de conformidad con la siguiente técnica : Se disociaron monocapas de células PK/15 por tripsinización (con una mezcla tripsina-verseno) a partir de cultivos confluentes, y se tomó en un medio MEM-SA conteniendo suero de becerro fetal no contaminado por pestivirus (= medio MEM-G) en una concentración final de alrededor de 400,000 células por ml . Fracciones alícuotas de 10 ml de esta célula de suspensión se mezclaron entonces con fracciones alícuotas de 2 ml del inoculo descrito anteriormente, y las mezclas finales fueron alícuotas en volúmenes de 6 ml en dos matraces Falcon de 25 cm2. Estos cultivos se incubaron entonces a +37°C por 18 horas bajo una atmósfera que contenía C02 al 10%.

Después de la incubación, el medio de cultivo de las monocapas semiconfluyentes se trato con 300 •mM de D-glocosair.ina (Cat # G48175, Sigma-Aldrich Company Limitpd, Poole RU) (Trischr I. y colaboradores, Arch. Virol., 1987 96 39-57), entonces se continuó la incubación por un periodo adicional de 48-72 horas a +37°C. Después de esta ultima incubación, uno de los dos Falcons de cada inoculo se sometió a 3 ciclos sucesivos de congelamiento/de congelamiento. Las células PK/15 del Falcon sobrante se trataron con una solución de tripsino-verseno , se volvieron a suspender en 20 ml de medio MEM-G, y entonces se inocularon en Falcons de 75 cm2 a una concentración de 400,000 celulas/ml. Los matraces recientemente inoculados fueron entonces , sobreinfectados" por la adición de 5 ml de la lisata correspondiente obtenida después de los ciclos de congelamiento/des congelamiento .

Ejemplo 2: Preparación de las muestras de cultivo celular para la detección de circovirus porcino por la inmunoflorecencia o por la hibridización in si u .

Un volumen de 5 ml de la suspensión sobreinfectada se colectó y se inoculó en un plato Petri de 55 mm de diámetro conteniendo una cubierta deslizable de vidrio libre de grasa y estéril. Los cultivos en los matraces y en las cubiertas deslizables de vidrio se incubaron a +37°C y se trataron con glucosamina como se describe en el Ejemplo 1. Los cultivos en las cubiertas deslizables de vidrio se recogieron desde las 24 hasta las 48 horas después del tratamiento con glucosamina y se determinaron, ya sea con acetona por 10 minutos a temperatura ambiente, o con una solución amortiguadora de formaldehído al 10% por 4 horas. Después de esta determinación, todas las cubiertas deslizables de vidrio se almacenaron a -70°C, en gel de sílice, antes de su uso para los estudios de hibridización in situ y los estudios de marcado inmunoci toquimico .

Ejemplo 3: Técnicas para la detección de secuencias CVP por hibridización in situ.

La hibridización in s i t u se llevo a cabo en tejidos colectados de los cerdos muertos y determinados con formaldehído, y también en las preparaciones de cultivos celulares inoculados por el aislamiento viral (ver Ejemplo 2) y fijados en cubiertas deslizables de vidrios.

Se usaron sondas genómicas completas correspondientes al circovirus porcino PK/15 (CVP) correspondientes y al virus de anemia del pollo infeccioso (VAP) . El plásmido pPCVl, conteniendo la forma de replica del genoma CVP, clonado en forma de un inserto par (kbp) base de 1.7 kilos simple (Meehan B. Y colaboradores. Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses, J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227), se usó como la fuente de ADN viral especifica para el CVP. Un plásmido análogo, pCAAl, conteniendo la forma de replica 2.3 kbp del circovirus avian de VAP se usó como un control negativo. Las existencias de glicerol respectivas de los dos plásmidos se usaron para la producción y purificación de los plásmidos de conformidad con la técnica de lisis alcalina (Sambrook J. y colaboradores. Molecular cloning: A Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) que se usaron entonces como templatos para la preparación de las sondas. Las sondas de circovirus representativas de los genomas completos de CVP y •del VAP se produjeron de los plásmidos purificados descritos anteriormente (1 µg para cada sonda) y de los hexanucleót idos primarios aleatorios usando un estuche de marcado no radioactivo comercial ("estuche de marcado DIG DNA", Boehringer Manneheim, Lewes, RU) de conformidad con las recomendaciones del distribuidor.

Las sondas marcadas con digoxigelina se tomaron en un volumen de 50-100 µl de agua estéril antes de que se usaran en la hibridización in situ .

Las muestras de tejido de cerdo muertos, enlazadas con parafina y fijadas con formaldehído, así como las preparaciones de cultivo de células infectadas, fijadas con formaldehído, se prepararon para la detección de los ácidos nucleicos CVP de conformidad con la siguiente técnica : Se cortaron secciones de 5 µm de grosor de bloques de tejido enlazados en parafina, libres de parafina fundida, y entonces se volvieron a hidratar en soluciones sucesivas de alcohol a concentraciones reducidas. Las secciones de tejido y los cultivos de célula fijados con formaldehído se incubaron por 15 minutos y 5 minutos respectivamente a +37°C en una solución de proteinasa K al 0.5% en solución amortiguadora de tris-HCl 0.05 M conteniendo 5 mM de EDTA (pH 7.6) . Los deslizadores se colocaron entonces en ' una solución de glicina al 1% en agua destilada o autoclave, por 30 segundos, lavando dos veces con 0.01 M de solución amortiguadora de PBS (solución amortiguadora salina de fosfatos) (pH 7.2), y finalmente se lavo por 5 minutos en agua destilada estéril. Finalmente se secó al aire y se colocó en contacto con las sondas.

Cada preparación de tejido/sonda se cubre con una cubierta deslizable de vidrio libre de grasa y limpia, y entonces se coloca en un horno a + 90 ° C por 10 minutos, y entonces se coloca en contacto con un bloque de hielo por 1 minuto, y finalmente se incuba por 18 horas a +37°C. Las preparaciones se sumergen entonces brevemente en solución amortiguadora de sal de citrato de sodio 2X (SSC) (pH 7.0) con objeto de remover la cubierta deslizable de vidrio, y entonces se lava dos veces •por 5 minutos en una solución amortiguadora de SSC 2X y finalmente se lava dos veces por 5 minutos en solución ^amortiguadora de PBS.

Después de estos lavados, las preparaciones se sumergen en una solución de ácido maléico 0.1M, NaCl 0.15' M (pH 7.5) (solución amortiguadora maléica) por 10 minutos, y entonces se incuban en una solución al 1% de reactivo de bloqueo (Cat # 10966176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, RU) en solución amortiguadora maléica por 20 minutos a +37°C.

Las preparaciones se incuban entonces con una solución 1/250 de un anticuerpo monoclonal anti- digoxigenino (Boehringer Mannheim), diluido en una solución amor ci-ruadora de bloqueo, por 1 hora a +3~7°C, lavando en PBS y finalmente incubando con un anticuerpo de inmunoglobina antiratón biotinila tado por 30 minutos a +37°C. Las preparaciones se lavan en PBS y la actividad de la peroxidasa endógena se bloquea por el tratamiento con una solución de peróxido de hidrogeno al 0.5% en PBS por 20 minutos a temperatura ambiente. Las preparaciones se lavan nuevamente en PBS y se "tratan con un substrato de 3-amina-9- diet ilcarbazol ?EC) (Cambridge Bioscience, Cambridge, RU) preparada inmediatamente antes del uso .

Después de un lavado final con agua de la llave, las preparaciones se colorearon en contraste con hema toxilina "azulosa" bajo agua de la llave, y se montaron en cubiertas deslizables de vidrio de microscopio con un fluido montado (GVA Mount, Cambridge bioscience, RU) . Los controles experimentales incluyen el uso de una sonda negativa no pertinente (VAP) y una sonda positiva (CVP) en las muestras obtenidas de cerdos enfermos y de cerdos no enfermos.

Ejemplo 4: Técnica para la detección de CVP por inmunofluorescencia.

La depuración inicial de todas las preparaciones de cultivo celular fijadas con acetona, se llevó a cabo por una técnica de inmunoflurescencia indirecta (IIF) usando una dilusión 1/100 de un conjunto de sueros de cerdo adultos. Este conjunto de sueros comprende sueros "de 25 cerdos hembra adultos de Irlanda del Norte y se conoce que contienen anticuerpos contra una amplia variedad de virus porcinos, incluyendo CVP: parvovirus porcino, adenovirus porcino, y virus SRRP. La técnica IIF se llevó a cabo enlazando el suero (diluido en PBS) en contacto con los cultivos celulares por 1 hora a +37°C, seguido por dos lavados en PBS. Los cultivos celulares se colorearon entonces con una dilución 1/80 en PBS de un anticuerpo inmunoglobina anticerdo de conejo conjugado con isotiocianato fluorescente por 1 hora, y entonces se lavó con PBS y se montó en una solución amortiguadora de glicerol antes de la observación microscópica bajo luz ultravioleta.

Ejemplo 5: Resultados de la hibridización in situ en tejidos de cerdo enfermo.

La hibridización in situ, usando una sonda genómica CVP, preparada de tejidos colectados de lechones franceses, canadienses y cali fornianos que tenían lesiones de atrofia muí tisis témica y fijados con formaldehido, muestran la presencia de ácidos nucleicos CVP asociados con las lesiones, en varias de las lesiones estudiadas. No se observan señales cuando la sonda genómica CVP se usa en tejidos colectados de cerdos no enfermos o cuando la sonda CVP se usa en los tejidos de cerdo enfermo. La presencia de ácido nucleico CVP se identifica en el citoplasma y los núcleos de numerosas células mononucleares que infiltran las lesiones en los pulmones de los lechones cali fornianos . La presencia de ácidos nucleicos CVP se demostraron también en los pneumositos, las células epiteliales bronquiales y bronquioliares , y en las células endoteliales de las arterias, las venas y los bazos linfáticos.

En cerdos franceses enfermos, la presencia de ácidos nucleicos CVP se detectó en el citoplasma de numerosos limfocitos foliculares y en las células mononúcleares int rasinusoidales de los ganglios linfáticos. El ácido nucleico CVP también se detectó en la sincitia ocasional. Dependiendo de esta detección de resultados, las muestras de pulmón de cerdo californiano , ganglios linfáticos menestéricos de cerdos franceses, y órganos de cerdos canadienses se seleccionan para el propósito de aislar nuevas cepas de circovirus porcino .

Ejemplo 6: Resultados del cultivo celular de las nuevas cepas de circovirus porcino y detección por inmuno luorescencia .

No se observa efecto citopatico (CPE) en los cultivos celulares inoculados con las muestras colectadas de lechones franceses (cepa Imp . 1008) lechones californianos (cepa Imp.999) y lechones canadienses (cepa Imp.1010) mostrando señales químicas de síndrome de atrofia muí tisis temica . Sin embargo la inmunoetique tación de las preparaciones obtenidas de los cultivos celulares inoculados, después de fijar usando acetona y con un conjunto de sueros policlonales de cerdo, rebelaron fluorescencia nuclear en numerosas células en los cultivos inoculados usando los pulmones de lechones californianos (cepa Imp.999), usando los ganglios linfociticos medias t inales de lechones franceses ' (cepa Imp.1008) , y usando órganos de lechones canadienses (cepa Imp.1010) .

Ejemplo 7: Extracción del ADN genonico del circovirus porcino .

Las formas de replica de las nuevas cepas de circovirus porcino (CVP) se prepararon usando cultivos celulares PK/15 infectados (ver Ejemplo 1) (10 Falcons de 75 cm2) recogiendo después de 72-76 horas de incubación y tratando con glucosamina como se describe por la clonación de la forma de replica de la VAP (Todd. D. y colaboradores, Dot blot hybridization assay for chicken anaemia agent using a cloned DNA probé. J Clin. Microbiol. 1991. 29, 933-939) . El ADN de doble trenzado de estas formas de replica se extrae de conformidad con una modificación de la técnica Hirt (Hirt B. Selective estraction of polyoma virus DNA from infected cell cultures, J. Mol. Biol. 1967, 36, 365-369), como se describe por Molitor (Molitor T.W. y colaboradores, Porcine parvovirus DNA: characterization of the genomic and replicative form DNA of two virus isolates, Virology, 1984, 137, 241-254) .

Ejemplo 8: Mapa de restricción de la forma de replica del genoma del circovirus porcino y de la cepa Imp.999.

El ADN (1-5 µg ) extraído de conformidad con la Yécnica Hirt se trató con núcleasa Sl (Amersham) de conformidad con las recomendaciones del distribuidor, y entonces este ADN se ordena con varias enzimas de restricción (Boehriger Mannheim, Lewis, East Sussex, RU) y los productos de ordenamiento se separan por electrofores i s en un gel de agarosa al 1.5% en presencia de bromuro de etidio como se describe por Todd, y colaboradores.

(Purification and biochemical chracterization of chiken anemia agent. J. Gen. Virol. 1990, 71, 819- 823) . El ADN extraído de los cultivos de la cepa Imp.999 posee un sitio EcoRI único, 2 sitios Sacl y no posee ningún sitio PstI. Este perfil de restricción es por lo tanto diferente del perfil de restricción mostrado por la cepa PK/15 de CVP (Meehan B. y colaboradores Sequence of porcine circovirus DNA: affinities witn plant circoviruses , 1997 78, 221-227) que poseen en contraste un sitio PstI y no poseen ningún sitio EcoRI .

Ejemplo 9: Clonación del genoma del circovirus porcino de la cepa Imp.999.

El fragmento de restricción de alrededor de •1.8 kbp generado por el ordenamiento de la forma de replica de d^ble trenzado de la cepa Imp 999 de CVP con la enzima de restricción EcoRI se aisló después de la electroforesis en un gel de agarosa al 1.5% (ver Ejemplo 3) usando un estuche comercial Qiager. (QIAEXII Gel Extraction Kit, Cat # 20021, QIAGEM Ltd., Crawley, West Sussex, RU) . Este fragmento ce restricción EcoRI-EcoRI se ligó entonces con el vector pGEM-7 (Promega. Medical Supply Company, Dblin, Irlanda), ordenado previamente con las mismas enzimas de restricción y defos forilatada , de conformidad con las técnicas de clonación estándar (Sambrook J. y' colaboradores Molecular cloning: A Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) . Los plásmidos obtenidos se transformaron en una cepa hospedadora JM109 Eschirichia coli (estratagen, la jolla, EUA) de conformidad con las técnicas estándar. El fragmento de restricción EcoRI-EcoRI de la cepa Imp.999 de CVP también se clonó en el sitio EcoRI del vector pBlueScript SK+ (Stratagene Inc. La Jolla, EUA) . Entre los clones obtenidos para cada cepa hospedadora al menos dos clones que contienen los fragmentos del tamaño esperado se seleccionan.

Los clones obtenidos se cultivan entonces y los "plásmidos que contienen el genoma completo de la cepa Imp.999 se purifican en un volumen (2 mL ) pequeño o en (250 mL) un volumen grande de conformidad con la preparación del plásmido estándar y técnicas de purificación.

Ejemplo 10: Secuencia de un ADN genómico (forma de replica de doble trenza) de la cepa Imp.999 de CVP.

La secuencia nucleótida de clones de Imp . 999 EcoRI (clones pGEM-7/2 y pGEM-7/8) se determinó de conformidad con la técnica de dideoxinucleótido de Sanger usando el estuche de secuencia "AmpliTag DNA polymerase FS" (Cat # 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, RU) y un aparato de secuencia automático AB1373A Applied Biosysteme, de conformidad con las recomendaciones del distribuidor. Las reacciones de secuencia inicial se llevaron acabo con los primarios universales M13 "delantero" e "inverso". Las siguientes reacciones de secuencia se generaron de conformidad con la técnica "caminando el ADN". Los "oligonucleótidos necesarios para estas secuencias subsecuentes se sintetizaron por Life Technologies (Inchinnan Business Park, Paisley, RU) .

Las secuencias generadas se ensamblaron y se analizaron por medio del software MacDNASIS versión 3.2 (Cat # 22020101, Appligene, Durham, RU) . Las estructuras de lectura abiertas variadas se analizaron por medio del algoritmo BLAST disponible en el servidor del "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, EUA) .

La secuencia completa (fragmento EcoRI-EcoRI) se presenta en la SEQ ID No: 3 (Figura 3) . Esto da la secuencia total de esta cepa, que se hace para iniciar arbitrariamente en el comienzo del sitio EcoRI, que se da al G como el primer nucleótido.

El procedimiento se llevó a cabo de manera similar para obtener la secuencia de los otros tres aislados de conformidad con la invención (ver SEQ ID No: 1, 2 y 4 y Figuras 1, 2 y 4) .

El tamaño del genoma de estas cuatro cepas es Ejemplo 11: Análisis de la secuencia de la cepa Imp. 999 de CVP.

Cuando la secuencia generada de la cepa Imp . 999 se usa para probar la homología con respecto a las secuencias contenidas en el banco de datos GenBank, la única homología significante que se detectó es una homología de alrededor de 76% (a un nivel de ácido nucleico) con la secuencia de la cepa PK/15 (números de acceso Y09921 y U49186) (ver Figura No. 5) .

Al nivel de amino ácido, la prueba para la homología en la traslación de las secuencias en las 6 fases con los bancos de datos (algoritmo BLAST X en el servidor NABI) hace posible demostrar una homología de 94% con la estructura de lectura abierta correspondiente a la replica teórica del virus BBTV similar a los circovirus de las plantas (Gen Bank número de identificación "1841515) codificado por la secuencia U49186 del Gen Bank .

Ninguna otra secuencia contenida en los bancos de datos muestra una homología significante con la secuencia generada de la cepa Imp.999 de CVP.

El análisis de las secuencias obtenidas de la cepa Imp.999 cultivada usando lesiones colectadas de lechones californianos que tienen señales clínicas del síndrome de atrofia muí tisis témica muestran claramente que este aislamiento viral es una nueva cepa de circovirus porcino.

Ejemplo 12: Análisis comparativo de las secuencias .

La alineación de las secuencias nucleótidas de las 4 nuevas cepas CVP se hace con la secuencia de la cepa PK/15 de CVP (Figura 5) . Una matriz homologa toma en cuenta las cuatro nuevas cepas y la cepa pk/15 previa se establece. Los resultados son los siguientes: •1: Imp. 1011-48121 2: Imp. 1011-48285 3: Imp. 999 4: Imp. 1010 5: PK/15 La homología entre las dos cepas francesas Imp . 1011-48121 e Imp . 1011-48285 es mayor al 99% (0.9977) .

La homología entre las dos cepas Norte Americanas Imp . 999 e Imp . 1010 también es mayor al 99^ (0.9949) . La homología entre las cepas Francesas y l s cepas Norte Americanas es ligera'mente mayor al 96%.

La homología entre todas estas cepas y la PK/15 cae en un nlor entre el 75 y 76%.

Se deduce de esto, que las cepas de conformidad con la invención son representativas de un nuevo tipo de circovirus porcino, distinto del tipo representado por la cepa PK/15. Este nuevo tipo ais] ado de los cerdos que exhiben el síndrome PMWS, se llama circovirus porcino del tipo II, PK/15 representando el tipo I. Las cepas pertenecientes a este tipo II exhiben una homogeneidad de secuencia de nucleótido remarcable, no obstante que estas tienen de hecho que ser aisladas de regiones geográficas muy distantes .

Ejemplo 13 : Análisis de las proteínas codificadas por el genoma de las nuevas cepas CVP.

La secuencia nucleótida de la Imp. 1010 aislada se considera que es representativa de las otras cepas de circovirus asociadas con el síndrome de atrofia muí tisi s témica . Esta secuencia se analiza en mayor detalle con la ayuda del algoritmo BLASTX (Altschul y colaboradores. J. •Mol. Biol. 1990. 215. 403-410) y de una combinación de programas del software colocado de MacVector 6.0 (Oxford Molecular Group, Oxford 0X4 AGA RU) . Es posible detectar 13 estructuras de lectura abierta (u ORF) de un tamaño mayor a los 20 aminoácidos en esta secuencia (genoma circular) . Estas 13 ORF son las siguientes: Las posiciones del inicio y del fin de cada ORF se refieren a la secuencia presentada en la Figura No. 4 (SEQ ID No. 4), del genoma de la cepa 1010. Los limites de las ORF 1 hasta 13 son idénticos para la cepa 999. Estos también son idénticos para la cepa 1011-48121 y 1011-48285, excepto por la ORF3 y la 13: ORF3 1432-1539, dirección, 108 nt, 35 aa ORF13 314-1377, anti-dirección , 705 nt, 234 aa.

Entre estas 13 ORF, 4 tienen una homología significante con las ORF análogas situadas en el genoma del virus clonado PK/15 CVP. Cada una de las estructuras de lectura abiertas presentes en el genoma de todos los circovirus aislados asociados con el síndrome de atrofia "muí tisis témica se analizaron. Estas 4 ORF son las siguientes : Las posiciones del inicio y final de cada ORF se refieren a la secuencia presentada en la Figura 4 (SEQ ID No. 4) . El tamaño de la ORF (en nucleótidos = nt) incluye la detención del codon.

La comparación entre la organización genómica de la Imp. 1010 de CVP y la PK-15 de CVP aisladas, permite la identificación de 4 ORF conservadas en el genoma de los dos virus. La tabla siguiente presenta los grados de homología observada: La identidad de secuencia mayor se observa entre la ORF4 Imp. 1010 y la ORFl PK-15 (homología del 86%) . Esto se espera ya que esta proteína probablemente está involucrada en la replica del ADN viral y es esencial para la replica viral (Meehan y colaboradores. J, Gen. Virol. 1997. 78. 221-227; Mankertz y colaboradores J. Gen Virol. 1998. 79. 381-384) .

La secuencia de identidad entre la ORF13 Imp. 1010 y la ORF2 PK-15 es menos fuerte (homología del 66.4%), pero cada una de estas dos ORF efectivamente exhiben una región básica N-terminal altamente conservada que es idéntica a la región N-terminal ' de la proteína de estructura mayor del circovirus de ave de VAP (Meehan y colaboradores.

Arch. Virol. 1992. 124. 301-319) . Adicionalmente, se observan grandes diferencias entre la ORF7 Imp. 1010 y la ORF 3 PK-15 y entre la ORF10 Imp . 1010 y la ORF4 PK-15. En cada caso, esta es una suspensión de la región C-terminal de la ORF7 y la ORF10 de la Imp . 1010 aislada cuando estas se comparan con la ORF3 y la ORF4 del PK-15 de CVP. La homología de secuencia mayor se observa al nivel de las reqiones N-terminales de ORF7/ORF3 (homología del 61.5% al nivel de salto) y de ORF10/ORF4 (homología del 83% al nivel del salto) .

Aparece que la organización genómica del circovirus porcino es completamente compleja como consecuencia de la extrema compactación de su genoma. La mayor proteína estructural probablemente se deriva del empalme entre varias "estructuras de lectura situadas en la misma trenza del genoma de circovirus porcino. Por lo tanto puede considerarse que cualquier estructura de lectura abiert (ORFl hasta ORF13), como se describe en la tabla anterior, puede representar todas o parte de las proteínas antigénicas codificadas por el circovirus porcino del tipo II y por lo tanto es potencialmente un antígeno que puede usarse para diagnósticos específicos y/o para vacunación. La invención, por lo tanto, se refiere a cualquier proteína que comprende al menos una de estas ORF. Preferiblemente, la invención se refiere a proteínas ' esencialmente consistentes de 0RF4, 0RF7, ORF10 u 0RF13.

Ejemplo 14 : Carácter infeccioso del genoma CVP clonado de las nuevas cepas .

El plásmido pGEM-7/8 conteniendo el genoma completo (forma replicativa) del Imp . 999 aislado, se transfectó en células PK/15 de conformidad con la técnica descrita por Meehan B. y colaboradores (Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form y -transfection capabilities of cloned genome fragments. Arch. Virol. 1992, 124, 301-319) . El análisis de inmunofluorescencia (ver Ejemplo 4) se llevó acabo en el primer paso después de la transfección en células PK/15 no contaminadas mostrando que el plásmido del clon pGEM7/8 es capaz de inducir la producción del virus CVP infeccioso. La disponibilidad de un clon para contener un material genético CVP infeccioso permite cualquier manipulación útil en el genoma viral con objeto de producir virus de CVP modificados (ya sea atenuados en cerdos o defectivos) que pueden usarse para la producción de vacunas atenuantes o recombinantes, o para la producción de antígenos para estuches de diagnostico .

Ejemplo 15: Producción de antigenos de CVP por cultivo in vitro.

El cultivo de las células PK/15 no contaminadas y la multiplicación viral se llevaron a cabo de conformidad con los mismos métodos como en el Ejemplo 1. Las células infectadas se recogieron después de la tripsini zación después de •cuatro días de incubación a 37 °C y se enumeraron.

El siguiente paso se inoculo con 400,000 células infectadas por ml .

Ejemplo 16: Inactivación de los antígenos virales Al final del cultivo viral, las células infectadas se recogieron y Usaron usando ultrasonido (Branson Sonifier) o con la ayuda de un rotor-estator del tipo coloide molido (Ul traTurrax, IKA) . La suspensión se centrifugó entonces a 3700 g por 30 minutos. La suspensión viral se inactivo con etilenimina al 0.1% por 18 horas a +37°C o con beta-propiolactona al 0.5% por 24 horas a +28 °C. Si el virus se valora antes, la inactivación es inadecuada, la suspensión viral se concentra por ultrafiltración usando una membrana con un corte de 300 kDa (Millipore PTMK300) . La suspensión viral inactiva se almacena a +5°C.

Ejemplo 17: Preparación de la vacuna en forma de una emulsión basada en aceite mineral.

La vacuna se prepara de conformidad a la siguiente fórmula: -suspensión de circovirus porcino inactivo: 250 ml -Montanide® ISA 70 (SEPPIC) : 150 ml La fase acuosa y la fase aceitosa se esterilizan separadamente por filtración. La emulsión se prepara mezclando y homogenei zando los ingredientes con la ayuda de un emulsificador de turbina Silverson.

Una dosis de vacuna contiene alrededor de 107'5 de TCID50. El volumen de una dosis de vacuna es de 0.5 ml para la administración por la vía intradermal, y 2 ml para la administración por la via intramuscular.

Esta vacuna se usa en un programa de vacunación contra el síndrome de atrofia muí tis is témica en combinación con la vacuna Parvovax® .

Ejemplo 18: Preparación de la vacuna en forma de una emulsión basada en aceite metabolizada .

La vacuna se prepara de conformidad con la siguiente fórmula: -suspensión de circovirus porcino inactivo. 200 ml -Dehymuls HRE 7 (Henkel) : 60 ml -Radia 7204 (Oleofina) : 740 ml La fase acuosa y la fase aceitosa se esterilizan separadamente por filtración. La emulsión se prepara mezclando y homogenei zando los ingredientes con la ayuda de un emulsificador de turbina Silverson.

Una dosis de vacuna contiene alrededor de 107'5 de TCID50. El volumen de una dosis de vacuna es de 2 ml para la administración por la vía intramuscular.

Esta vacuna se usa en un programa de vacunación contra el síndrome de atrofia muí t isi s témi ca en combinación con la vacuna Parvovax®.

Ejemplo 19: Resultados de la inmuno luorescencia "indirecta en relación con las cepas de virus CVP estadounidenses y francesas y al PK/15 contaminadas con un suero hiperinmune (CVP-T) , y un grupo de anticuerpos monoclonales F99 preparados de PK/15 y un suero hiperinmune preparado de la cepa canadiense (CVP-C) .

* La reciprocidad de la ultima dilución del suero o del anticuerpo monoclonal que da una reacción positiva en una inmunofluorescencia indirecta.

Ejemplo 20 : Producción experimental del síndrome de "atrofia multisisr.émica porcina - protocolo 1.

Lechones gno tobiót icos de tres días de edad obtenidos por cesárea y mantenidos en una unidad de aislamiento 5;e inocularon con soluciones de virus de CVP. los virus de CVP del tipo II usados fueron el Imp . 1010 aislado, y el virus obtenido del ganglio linfático homogéno obtenido de los cerdos enfermos .

Se formaron 5 grupos. Los lechones se inocularon todos a la edad de 3 días por vía oronasal con 1.5 ml de solución de virus de conformidad con el siguiente esquema: Resultados del reto experimental: Durante el periodo de observación de 5 semanas, los lechones no desarrollaron señales clínicas, aparte de un animal en el grupo B que mostró un cansancio substancial. En la autopsia, los cerdos en los grupos A, B y C, exhibieron hiperplasia del ganglio linfático (de un tamaño de 2 hasta 10 veces mayor que para los animales en los grupos D y E) , en particular el ganglio submaxilar, bronquial, menestérico, iliaco y femoral. Esta hiperplasia se enlaza a una expansión considerable de las zonas corticales por la infiltración de monocitos y macrófagos . Los lechones en los grupos A, B y C también exhibieron hiperplasia del tejido linfoide bronquial. Un lechón en cada uno de los grupos A, B y C tuvo neumonía. El lechón en el grupo B, que exhibió un cansancio substancial, y un lechón en el grupo A tuvieron ulcera gástrica.

Sin embargo, todos los animales en los grupos A, B y C tuvieron miositis en la túnica muscular del estomago y del intestino.

La mayoría de los animales en los grupos A, B y C tuvieron infiltración de miocarditis, hepatitis multifocal con lnfocitos, macrófagos y eosinofilos, así como nefritis cortical y medularmente intestinal. Un lechón en el grupo C tuvo un hígado cuyo tamaño es mayor que el normal con material fecal claro diseminado en su superficie .

No se observó lesión en los lechones de los grupos D y E .

Se aisló el circovirus de los órganos de los cerdos en los grupos A, B y C.

Ejemplo 21: Reproducción experimental del síndrome de atrofia multisistemica porcina — protocolo 2 y 3.

Lechones convencionales, pero aislados de su madre desde el nacimiento, se incubaron con soluciones virales de CVP tipo II, de parvovirus porcino, o con una mezcla de los dos virus.

El virus CVP de tipo II se usó donde de se aisló el Imp . 1010 y el Imp. 1011 (cepa 48121) .

El virus PPV usado es un aislado de origen canadiense Imp . 1005. Este virus tienen una secuencia (1/3 del genoma de secuencia) que es idéntico al de otras cepas de parvovirus porcina, conocida (cepas PPV NADL-2 y cepa Kresse) .

Se llevaron cabo dos protocolos experimentales .

Protocolo 2 Se formaron tres grupos con lechones de 3 días de edad. Todos los lechones se inocularon por la ruta oronasal con 1 ml de una solución viral de conformidad con el siguiente esquema: Resultados del reto experimental : Grupo A: 2 lechones murieron 21 días después de la inoculación y un lechón se sacrificó humanamente 24 días después de la inoculación.

Grupo B: 1 lechón murió 23 días después de la inoculación y un lechón se sacrificó humanamente 24 días después de la inoculación.

Se llevaron a cabo las autopsias en los lechones que murieron después de la infección mostrando la presencia de lesiones macroscópicas sustanciales: presencia de fluido en la cavidad pleural, edema del pulmón, hemorragias en los ríñones, lesiones blanquecinas en forma de cabeza de alfiler en los ríñones, necrosis hepática. Estas lesiones son idénticas a aquellas observadas en los casos de campo.

Las autopsias llevadas a cabo en los lechones sacrificados no mostraron lesiones macroscópicas.

Las examinaciones histológicas realizadas en los órganos removidos de los lechones en los grupos A y B que murieron después de la infección, así como en los lechones sacrificados en estos 2 "grupos, muestran un patrón típico y completo de las lesiones del síndrome de atrofia muí tisis témica porcino que se observa en los animales en el campo: necrosis hepática, necrosis en el ganglio linfático, necrosis pancreática, necrosis focal y hemorragias severas en los riñones, presencia de sincitia en los pulmones, necrosis severa de los hepatocitos con presencia de inclusiones nucleares.

Se notará que una cantidad masiva de antígeno CVP se encontró en todas estas lesiones (cerdos muertos o sacrificados), pero que la presencia de antígeno PPV puede no detectarse en estas mismas lesiones .

No se pudo detectar lesión en los lechones de control del grupo C.

Protocolo 3 Se formaron cuatro grupos con lechones de 4 semanas de edad. Todos los cerdos se inocularon por la ruta oronasal con 1 ml de una solución "viral de conformidad con el siguiente esquema: Resultados del reto experimental Un lechón de "control" y 2 lechones en cada grupo experimental (B, C y D) se sacrificaron humanamente y se sometieron a autopsia 2 semanas después de la inoculación. Se observaron lesiones inmonuhis tológicas significantes en los dos lechones en el grupo D ( co-infección de CVP + PPV) . Se notará que no fue posible detectar la presencia de parvovirus porcino en estas lesiones, no obstante que se observó una seroconversión en relación al parvovirus porcino en todos los cerdos del grupo D .

No pudo observarse lesión macroscópica o histológica en el lechón de control y en los lechones de los otros grupos.

Por lo tanto aparece que la combinación CVP + PPV hace posible reproducir lesiones histológicas típicas del síndrome de atrofia muí tisis témica porcino. Después de estos dos protocolos experimentales, puede observarse que la inoculación del CVP solo, como una mezcla de CVP + PPV, lleva a más o menos una producción severa del síndrome de atrofia muí tisi s témica porcino, pero solo el circovirus porcino puede detectarse en las lesiones. En contraste, una infección experimental con PPV solo (grupo B del protocolo 3) no permite inducir lesiones macroscópicas o histológicas; sin embargo, en presencia de CVP, la apariencia de las "lesiones se observa en cerdos de 4 semanas de edad (grupo D del protocolo 3) .

Se hace_constar que con relación a este fecha, el mejor método conocido por el solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

Claims (16)

Reivindicaciones .

1. Una preparación antigénica dirigida contra el síndrome PMWS, caracterizada porque comprende un antígeno de circovirus porcino y un antígeno de parvovirus porcino.

2. La preparación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprenden un antígeno de circovirus porcino del tipo II.

3. La preparación de conformidad con la reivindicación, caracterizada porque el antígeno de circovirus porcino de tipo II es un antígeno de un circovirus seleccionado del grupo que consiste de las preparaciones depositadas en el ECACC, bajo las siguientes referencias: acceso No. V97100219 acceso No. V97100218 - acceso No. V97100217 acceso No. V98011608 acceso No. V98011609.

4. La preparación de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizada porque el antígeno de circovirus porcino y el antígeno de parvovirus porcino comprenden, independientemente uno del otro, un antígeno elegido del grupo que consiste de un antígeno completamente vivo atenuante, un antígeno completamente inactivo, una antígeno de subunidad, un vector de vida recombinante y un vector ADN.

5. La preparación de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizada porque' comprende, además, cualquier otra valencia que corresponde a otro patógeno de cerdo .

6. La preparación de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende "cualquier otra valencia elegida entre el grupo que consiste de: SRRP, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae , E. coli, rinitis atrópica, pseudorabia, cólera Hog, influenza Swine y combinaciones de las mismas.

7. La preparación de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende otra valencia que es SRRP.

8. Una vacuna contra el síndrome PMWS, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de una preparación antigénica de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario .

9. La vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende un adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario .

10. La vacuna de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizada porque comprende antígenos de varios circovirus porcino.

11. La vacuna de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 8 hasta 10, caracterizada porque comprenden antígeno de circovirus codificado por una estructura de lectura abierta de circovirus elegida entre el grupo que consiste de las ORF 1 hasta 13.

12. La vacuna de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque comprende un antígeno de circovirus codificado por una estructura de lectura abierta de circovirus elegida entre el grupo que consiste de las ORF 4, 7, 10 y 13.

13. La vacuna de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 8 hasta 12, caracterizada porque comprende un vector de expresión seleccionado del grupo que consiste de virus vivos capaces de multiplicarse en cerdos sin ser patogénicos para el cerdo, y vectores ADN, este vector de expresión comprendido y expresado en la -ORF.

14. La vacuna de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el vector viral es un virus seleccionado del grupo que consiste de virus de herpes de cerdo, adenovirus porcino y poxvi rus .

15. La vacuna de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el vector viral es un virus seleccionado del grupo que consiste del virus de la enfermedad de Aujesky, virus de vacuna, virus avipox, virus canaripox y virus swinepox.

16. Un estuche de vacunación caracterizado porque contienen, empacados separadamente, una vacuna contra el circovirus porcino de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 8 hasta 15, y una vacuna contra el parvovirus porcino.