DK175780B1 - Lipidderivater af antivirale nucleosider - Google Patents

Description

F---- DK 175780 B1

Den foreliggende opfindelse angår generelt behandling af virale infektioner under anvendelse af lipidderivater af antivirale nucleosidanaloger. Nærmere bestemt angår den foreliggende opfindelse lipidderivater og især phospholipidderivater af modificerede antivirale nucleosidanaloger, der kan integreres ind i liposomers struktur, hvorved der v 5 dannes et mere stabilt liposomkompleks, der kan udlevere større mængder lægemidler til målceller med mindre toksicitet samt anvendelse af disse ved fremstilling af en sammensætning til behandling af en viral eller retroviral infektion hos et pattedyr.

De publikationer og andre referencematerialer, hvortil der refereres heri, er af praktiske 10 grunde opstillet i en bibliografisk liste efter beskrivelsens afslutning.

Der har været en stor interesse i de senere år for anvendelsen af nucleosidanaloger til behandling af virusinfektioner. Et nucleosid består af en pyrimidinbase eller purinbase, der er bundet til ribose, en sukkerart med fem carbonatomer og med cyklisk struktur.

15 De antivirale nucleosidanaloger har en stor lighed med naturlige nucleosider og er udformet til at inhibere virusfunktioner ved at forhindre syntesen af ny DNA eller RNA.

Nucleosider samles enzymatisk sammen til DNA eller RNA.

Under DNA-syntese reagerer frie nucleosid-triphosphater (nucleosider, der er bundet 20 med tre phosphatgrupper) med enden af en voksende DNA-kæde. Reaktionen indebærer binding af phosphatgruppen ved 5'-stillingen på det indkommende nucleosidtri-phosphat med hydroxyl gruppen i sukkerringens 3'-stilling på enden af den under dannelse værende DNA-kæde. De to andre phosphatgrupper frigøres under reaktionen, der således resulterer i addition af et nucleotid til DNA-kæden.

25

Nucleosidanaloger er forbindelser, der imiterer de naturligt forekommende nucleosider i tilstrækkelig grad til, at de er i stand til at deltage i viral DNA-syntese. Imidlertid har de antivirale nucleosidanaloger strategisk placerede forskelle i den kemiske struktur, som inhiberer virusenzymer såsom omvendt transskriptase eller som forhindrer yderli-30 gere DNA-syntese, når analogen først er blevet bundet til den voksende DNA-kæde.

I DK 175780 B1 I

I I

I Didesoxynucleosider er antivirale forbindelser, som mangler de hydroxylgrupper, der I

I normalt er til stede i riboses anden og tredje stilling. Når et didesoxynucleosid inkorpo- I

I reres i en voksende DNA-kæde, gør fraværet af gruppen 3-OH på dets ribosegruppe det I

I umuligt at binde et yderligere nucleotid og kæden afsluttes. Didesoxynucleosider er I

I 5 særligt nyttige ved behandling af retrovirale infektioner, hvor viral replikation kræver I

I transskription af viral RNA til DNA ved viral omvendt transskriptase. Andre nucleosi- v I

I danaloger indbefatter desoxynucleosider og nucleosidånaloger, der kun har et fragment I

I af ribose eller en anden pentose forbundet med basemolekylet. I

10 Erhvervet-immundefekt-syndrom (AIDS) er forårsaget af den humane immunde- I

I fekt-virus (HIV). HTV inficerer celler, der bærer overfladeantigenet CD4 (T4), såsom I

I CD4+ hjælperlymfocytter, CD4+ monocytter og makrofager og visse andre CD4+ cel- I

I letyper. HIV-infektionen af CD4+ lymfocytter resulterer i cytolyse og celledød, som I

I bidrager til AIDS’s immundefekt; imidlertid behøver CD4+ monocytter og makrofager I

I 15 ikke at blive kraftigt skadet af virusen. Viral replikation i disse celler ses at være mere I

I forlænget og mindre cytotoksisk end i lymfocytter og som følge heraf repræsenterer I

I monocytter og makrofager vigtige reservoirer for HTV-infektion. Det er for nylig opda- I

get, at makrofager kan tjene som reservoirer for HIV-infektion, selv hos visse I

I AIDS-patienter, som giver negativ prøve for tilstedeværelsen af HIV-antistoffer. Der er I

I 20 ingen effektiv kur til rådighed til behandling af AIDS, selv om didesoxynucleosider har I

I vist sig at forlænge levetiden og at reducere forekomsten af visse fatale infektioner, der H

I er forbundet med AIDS. H

Det har vist sig, at visse monocyt-afledte makrofager, når de inficeres med nogle I

I 25 stammer af HTV, bliver resistente mod behandling med didesoxycytidin, azidothymidin H

I H

I og andre didesoxynucleosider in vitro, som vist af Richman et al. (1). Resistensen kan H

I delvis skyldes de lave niveauer af didesoxynucleosid-kinase, der resulterer i en nedsat

I : evne til at phosphorylere AZT, ddC eller ddA. Det ville naturligvis være nyttigt at have H

I mere effektive måder til at levere store mængder af effektive antivirale forbindelser til H

I 30 makrofager inficeret med HIV eller andre vira og andre celler med virusinfektioner. H

I --- DK 175780 B1 ( 3

Det ville også være nyttigt at have mere effektive metoder til levering af antivirale forbindelser, som ikke blot forøger deres styrke, men også forlænger deres effektivitet.

Didesoxynucleosidanaloger såsom AZT er de mest kraftige midler, der for tiden kendes v 5 til behandling af AIDS, men ved en nylig human afprøvning noteredes alvorlig toksici tet, der viste sig ved anæmi (24%) og granylocytopæni (16%) (2,3). Det er derfor ønskeligt at tilvejebringe et middel til administrering af AZT og andre didesoxynucleosi-der på en sådan måde, at disse lægemidlers toksiske bivirkninger reduceres. Det er endvidere ønskeligt at tilvejebringe selektiv målretning af didesoxynucleosidet til mo-10 nocytter/makrofager for at forøge lægemidlets effektivitet mod virusinfektion i denne cellegruppe. En måde at gøre dette på, er at udnytte makrofagers optagelse af liposomer.

1 1965 opdagede Alex Bangham og medarbejdere, at tørrede film af phosphatidylcholin 15 spontant dannede lukkede bimolekylære småbladede småblærer (vesikler) ved hydrati-sering (4). Senere blev disse strukturer kendt som liposomer.Der er foreslået et antal anvendelser for liposomer inden for medicinen. Nogle af disse anvendelser er som bærere til at levere terapeutiske midler til målorganer. Midlerne indkapsles under liposo-memes dannelsesproces og frigives in vivo, når liposomeme smelter sammen med lipi-20 deme i celleoverflademembranen. Liposomer giver et middel til at levere højere koncentrationer af terapeutiske midler til målorganer. Da liposomudlevering fokuserer behandlingen på stedet for liposomoptagelse reducerer en sådan behandling desuden toksiske bivirkninger.

;' 25 For eksempel er antimonholdige liposomlægemidler flere hundrede gange mere effek- | five end det frie lægemiddel ved behandling af leishmaniase, hvilket er vist uafhængigt af Black og Watson (5) og Alving et al. (6). Liposomindfanget amfotericin B ses at være mere effektiv end det frie lægemiddel ved behandling af immunundertrykkede patienter med systemisk svampesygdom (7). Andre anvendelser for liposomindkapsling 30 indbefatter begrænsning af doxorubicintoksicitet (8) og formindskelse af aminoglyco-sid-toksicitet (9).

I DK 175780 B1 I

I 4 I

I Som tidligere nævnt har man nu lært af makrofager er et vigtigt reservoir for I

I HIV-infektion (10, 11). Makrofager er også et primært sted for liposomoptagelse (12, I

I 13). Det ville således være ønskeligt at udnytte liposomer til at forstærke effektiviteten

I 5 hos antivirale nucleosidanaloger ved behandling af AIDS og andre virusinfektioner. I

I Anvendelsen af liposomer til at levere phosphoryleret didesoxynucleosid til I

AIDS-inficerede celler, der er blevet resistente mod terapi, har været foreslået for at I

I komme uden om de lave didesoxynucleosid-kinase-niveauer. I

I 10 I

Der er også gjort forsøg på at inkorporere nucleosid-analoger, såsom joddesoxyuridin I

I (IUDR), acylovir (ACV) og ribavirin i liposomer til behandling af andre sygdomme H

I end AIDS. Imidlertid har disse forsøg ikke været helt tilfredsstillende på grund af, at I

I disse relativt små vandopløselige nucleosidanaloger har tendens til at sive ud fra lipo- I

I 15 somet hurtigt (14, 15), hvilket giver en nedsat målretningseffektivitet. Andre ulemper I

I indbefatter tendensen til at sive ud af liposomer i nærværelse af serum, vanskeligheder H

ved Iiposomformulering og stabilitet, lav grad af liposomladning og hydrolyse af lipo- I

I some didesoxynucleosid-phosphater, når de udsættes for sure hydrolaser efter cellulær I

optagelse af liposomeme. I

I 20 I

I Det er også forsøgt at kombinere nucleosid-analoger, såsom arabinofuranosylcytosin I

I (ara-C) og arabinofyranosyladinin (ara-A) med phospholipider for at forøge deres kata- I

I boliske stabilitet som kemoterapeutiske midler ved behandling af forskellige kræfttyper I

I (16). De resulterende midler viste en nedsat toksicitet og forøget stabilitet i forhold til H

I 25 uinkorporerede nucleosid-analoger. Imidlertid udviste de resulterende midler ringe cel- H

I leoptagelse (16) og ringe lægemiddel absorption (17). H

I EP A 0122145 (36) beskriver fremstillingen af primære eller sekundære alkoholderiva- I

I ter af phospholipider ved hjælp af en enzymatisk overføringsteknik, som udskifter den I

I 30 strukturelle alkoholrest af en phospholipidart med en primær eller sekundasr alkohol H

I gennem den enzymatiske aktivitet af phospholipase DM. H

1-— - i DK 175780 B1 . 5

Phospholipidet kan vælges fra bl.a. en særlig defineret gruppe af 1,2-O-diacyl og 1,3- O-diacylglycerolmonophosphatphospholipider og den primære alkohol kan vælges fra bl.a. nucleosideme cytidin, uridin, aribinocylcytocin, adenosin, guanosin, cyclocytidin, 5 deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxyguanosin, deoxythymidin, deoxyuridin og inosin.

Imidlertid indeholder EPA 0122151 ikke nogen beskrivelse af nogen farmakologiske fordele af sådanne forbindelser, og kun meget få af de mulige individuelle forbindelser, som udspringer fra de teoretiske mulige udvælgelser, er vist eller foreslået.

10 J. Med. Chem. 25 (1982), siderne 1322*1329 (Rye et al) (37) beskriver fremstillingen af visse særlige phospholipidkonjugater af ara-C og visse andre nucleosider. Phospho-lipid-nucleosidbindingen kan være 3-diphosphat eller monophosphat, afhængig af det særlige konjugat, som beskrives, og i visse af konjugateme er nucleosideme cytidin, arabinosylcytosin, arabinosyladenin og 7-deazaadenosin til stede. En farmakologisk ak-15 tivitet mod musemyeloma er rapporteret for visse konjugater. Nogen form for antiviral eller antiretroviral aktivitet er ikke foreslået EPA 0262876 (3) beskriver fremstillingen af visse særlige 1,2-O-diacyl og 1,2-0-dialkylglycerolmonophosphatphospholipidderivater af nucleosider og rapporterer, at 20 sådanne derivater har stærk antitumoraktivitet og "overlegen" opløselighed i vandigt medium. Antiviral eller antiretroviral aktivitet foreslås ikke. Nucleosideme 5-fluoruridin, 5-fluorcytidin, bredinin, tubercidin, arabinosyl-cytosin, arabinosyl-5-fluorcytosin, arabinosyl-5-fluorcytidin, arabinosyl-adenin, arabinosyl-thymin, 5-fluor-2'-deoxyribo-uridin og neplanosin-A er nævnt som eksempler, selvom kun 5-25 fluoruridin, neplanosin-A og arabinosyl-5-fluorcytidin er til stede i nogle af de specifikke forbindelser, som er omtalt.

GB A 21 68 350 (39) beskriver fremstillingen af visse særlige l-O-alkyl-2-O-acylglyceroldiphosphatphospholipidderivater af visse nucleosider, i hvilket sukkeret er 30 ribose, 2'-deoxyribose, arabinose eller 2’,2'-dihydroxyribose, og basen er adenin, cyto-sin, 5-fluoruracil, 5-azacytosin, 6-mercaptopurin eller 7-deazaadenin og rapporterer ge-

I DK 175780 Β1 I

Η

I I

Η nerelt, at sådanne derivater har anticancer (antitumor) og antiviral aktivitet, selvom kun I

I en antitumoraktivitet af to forbindelser i mus med lymfoid leukæmi er underbygget af I

specifikke data. I

I 5 For at anvende nucleosid-analoger inkorporeret i liposomer til behandling af virusin- I

I fektioner på en mere effektiv måde er det ønskeligt at forøge stabiliteten af foreningen ' I

I mellem liposomet og nucleosid-analogen. I

I For yderligere at forøge effektiviteten hos disse antivirale liposomer ville det være øn- I

I 10 skeligt at målrette liposomeme til inficerede celler eller infektionssteder. Større specifi- I

I citet i liposomlevering kan opnås ved, at inkorporere monoklonale antistoffer eller an- I

dre ligander i liposomeme. Sådanne ligander vil målstyre liposomeme til steder for li- I

posomoptagelse, som er i stand til at binde liganderne. Der er beskrevet to forskellige I

I forsøg på inkorporering af antistoffer i liposomer for at skabe immunliposomer: Den I

I 15 ifølge Huang og medarbejdere (18), der indebærer syntese af palmitoylantistof og den I

I ifølge Leserman et al. (19), der involverer binding af thioleret antistof til liposominkor- I

I poreret phosphatidylethanolamin (PE). I

I De her beskrevne metoder gælder ikke blot for didesoxynucleosider anvendt ved be- I

I 20 handling af AIDS og andre retrovirale sygdomme, men også anvendelsen af antivirale I

nucleosider ved behandling af sygdomme forårsaget af andre vira såsom herpes I

I simplex virus (HSV), human herpes vims 6, cytomegalovirus (CMV), hepatitis B virus,

I Epstein-Barr vims (EBV) og varicella zoster vims (VZV). Således anvendes betegnel- I

I sen "nucleosid-analoger" til at referere til forbindelser, der kan inhibere viral replika- I

I 25 tion i forskellige trin indbefattet inhibering af viral omvendt transskriptase, eller som I

kan inkorporeres i viral DNA eller RNA, hvor de udviser en kædeafsluttende funktion.

I Den foreliggende opfindelse tilvejebringer forbindelser og præparater til anvendelse I

I ved behandling af vimsinfektioner, indbefattet infektioner af HIV (AIDS), herpes I

I 30 simplex vims (HSV), human herpes vims 6, cytomegalovirus (CMV), hepatitis B vims, I

I Epstein-Barr vims (EBV) og varicella zoster vims (VZV). Et præparat kan ved siden af I

r -——-^ DK 175780 B1 7 en farmaceutisk acceptabel bærer indeholde en lipofil antiviral forbindelse fremstillet ved kemisk binding af en antiviral nucleosid-analog til i det mindste én lipidart. Den antivirale nucleosid-analog kan være bundet til lipidet gennem en monophosphatgrup-pe, diphosphatgruppe eller triphosphatgruppe. Opfindelsen anviser endvidere en meto-5 de til inkorporering af sådanne lipidderivater af antivirale midler ind i liposomer til forbedret levering af det antivirale middel. Et liposom omfatter et relativt kugleformet dobbeltlag, som helt eller delvis omfattes af de ovenfor beskrevne lipidderivater af antivirale midler. Liposomet kan også indeholde farmakologisk inaktive lipider. Desuden kan liposomet indeholde en ligand, såsom et monoklonalt antistof til et virusbindings-10 sted (såsom CD4) eller et andet bindende protein. En sådan ligand giver yderligere specificitet for leveringsstedet for det antivirale middel. Opfindelsen anviser en metode til inkorporering af sådanne ligander i antivirale liposomer.

Opfindelsen er defineret i de vedhæftede krav.

15 I en foretrukket udførelsesform er forbindelsen et phosphatidyldidesoxynucleosid eller didesoxynucleosid-diphosphat-diglycerid. I en anden udførelsesform kan lipidarten omfatte mindst én acylestergruppe, ethergruppe eller vinylethergruppe af glyce-rolphosphat.

20 I en anden udførelsesform er nucleosid-analogen et purin eller pyrimidin bundet gennem en β-N-glycosylbinding til en pentoserest, der mangler mindst ét af 2’- eller 3’-carbonatomeme, men bibeholder 5’-carbonatomet, og phosphatgruppen er bundet til 5-carbonatomet (dvs. det, der ville have været 5'-carbon- atomet i en komplet pentose-• 25 rest). I en anden udførelsesform for opfindelsen er lipidarten en N-acylsphingosin.

I nogle foretrukne udførelsesformer omfatter acylgruppeme eller alkylgruppeme i lipidarten uanset hvilken bindingstype, der er tale om, som f.eks. ester, ether eller vinylether, 2 til 24 carbonatomer. I en variation er mindst én af acyl- eller alkylgruppeme 30 mættet. I en anden har mindst én af acyl- eller alkylgruppeme op til seks dobbeltbindinger.

'^1

DK 175780 B1 I

Ved yderligere en udførelsesform er lipidresten et glycerid, og glyceridet har to I

acylgrupper, der er ens eller forskellige. H

5 Opfindelsen indbefatter endvidere et præparat, hvori liposomet ved siden af forbindel- I

sen yderligere omfatter phospholipider valgt fra gruppen bestående af phosphatidylcho- ' I

lin, phosphatidylethanolamin, phosphatidylglycerol, phosphatidylserin, phosphatidyl- I

inositol og sphingomyelin. I

10 Ved en udførelsesform for opfindelsen er den procentuelle andel af antiviralt middel fra I

0,01 til 100 vægt% af liposomet. I

Ved en anden udførelsesform omfatter liposomet yderligere en ligand bundet til et li- I

pidsubstrat. Liganden kan være et antistof, såsom et monoklonalt antistof til et virusan-

15 tigen. Det virale antigen kan være gp41 eller gpllO fra HIV eller kan være et hvilket H

som helst andet egnet virusantigen. Ved en udførelsesform er liganden H

CD4-receptor-protein eller selve CD4- proteinet. Alternativt er liganden et antistof til H

CD4 eller et protein eller et andet stof, der binder CD4. I

20 Ved en udførelsesform er nucleosid-analogen en nitrogenholdig base, som er et purin, I

pyrimidin eller et derivat deraf, og pentose- resten er et 2',3'-didesoxy-, I

2',3'-dideshydro-, azido- eller halogen-derivat af ribose eller et acyklisk hydroxyleret I

fragment af ribose. Pentoseresten kan således være en 2',3’-didesoxyribose, og nucleo- I

sid-analogen kan være 2',3'-didesoxycytidin, 2',3'-didesoxythymidin, I

25 2',3'-didesoxyguanosin, 2',3'-di- desoxyadenosin, 2',3'-didesoxyinosin eller , I

2,6-diaminopurin- 2’,3'-didesoxyribosid. I

Ved en anden udførelsesform er pentoseresten en 2*,3,-dideshydroribose og nucleosidet H

er 2',3'-dideshydrothymidin, 2’,3’- dideshydrocytidin carbocyklisk eller I

30 2,,3’-dideshydroguanosin. I

DK 175780 B1 9

Ved endnu en anden udførelsesform er pentoseresten et azidderivat af ribose, og nucleosidet er 3'-azido-3'-desoxythymidin, 3'-azido-3'-desoxyguanosin eller 2.6- diaminopurin-3-azido-2,,3,-didesoxyribosid.

5 Ved yderligere en anden udførelsesform for opfindelsen er pentoseresten et halogenderivat af ribose, og nucleosidet er S’-fluor-S'-desoxythymidin, 3'-fluor-2’,3'-didesoxyguanosin, 2',3'-didesoxy-2'-fluor-ara-adenosin eller 2.6- diaminopurin- 3'-fluor-2,-3'-didesoxyribosid. Opfindelsen indbefatter også halogenderivater af purinringen eller pyrimidinringen, som f.eks. 2-chlor-desoxyadenosin.

10 Alternativt er pentoseresten et acyklisk hydroxyleret fragment af ribose, og nucleosidet er 9-(4-hydroxy-r,2'-butadienyl)-adenin, 3-(4-hydroxy-l',2'-butadienyl)-cytosin, 9-(2-phosphonylmethoxyethyl)-adenin eller phosphonomethoxydiaminopurin.

Ifølge et yderligere træk ved den foreliggende opfindelse er nucleosid-analogen 15 acyklovir, gancyklovir, l-(2'-desoxy-2'-fluor-l-B-D-arabinofiiranosyl)-5-jodcytosm (FIAC) eller l-(2'-desoxy-2'-fluor-l-0-D-arabinofuranosyl)-5-jodurasil (FIAU).

I alle de ovennævnte forbindelser kan der være tilvejebragt en monophosphatbindings-gruppe, diphosphatbindingsgruppe eller triphosphatbindingsgruppe mellem pentose- i 20 restens 5'-stilling og lipidarten. I nogle yderligere udførelsesformer for opfindelsen er lipidarten en monoacylglycerol eller en diacylglycerol. Andre eksempler på lipidarter indbefatter D,L-1,2-diacyloxyethyl-(dimethyl)-B-hydroxyethyl-ammoniumgrupper.

I overensstemmelse med et yderligere træk ved den foreliggende opfindelse omfatter 25 lipidarten fra 1 til 4 fedtsyrerester, hvor hver rest omfatter fra 2 til 24 carbonatomer.

Med fordel er mindst én fedtsyrerest i lipidarten umættet og har fra 1 til 6 dobbeltbindinger.

Et særligt eksempel på disse forbindelser er l,2-diacylglycerophospho-5'-30 (2',3'-didesoxy)-thymidin.

I DK 175780 B1 I

I I

Specifikke forbindelser, der anvises, har formlen: I

I (L)m-(W)n-A-Q-Z I

hvor Z er nucleosid-analogens basedel, Q er pentoseresten, A er O, C eller S, W er

5 phosphat, n = 1 til 3, og L er en lipid-rest, hvor m = 1 til 5, og hvor hver L er bundet di- I

I rekte til en W. I

Indbefattet er også forbindelser med formlen I

I io z I

I I

I I

A

I 15 I I

L-W-L

I ^ hvor Z er nucleosid-analogens substituerede eller usubstituerede puringruppe eller py- H

I rimidingruppe, I

20 Q er pentoseresten,

I W er phosphat, A er O eller S, og I

I L er en lipidrest. I

I Ved en udførelsesform for opfindelsen, hvor der henvises til de foregående formler, er H

I 25 hver gruppe L uafhængigt valgt fra gruppen bestående af I

I CH=CH-(CH2)i2-CH3 λ I

I HjC-Rj I H2?'Ri I

I HC-(.2. I · "?·"* I

I RC,°,NT (CH3)2-N(CH2)2- I

I 2 h2c- I

--------------- 9 DK 175780 B1 11 hvor R, Ri og R2 uafhængigt af hinanden har fra 0 til 6 steder med umættethed, og har strukturen CH3-(CH2)3-(CH=CH-CH2)b-(CH2)c-Y, 5 hvor summen af a og c er fra 1 til 23, og b er 0 til 6, hvor Y er C(0)0-, C-O-, C=C-0-, C(0)S-, C-S- eller OC-S-.

I en udførelsesform for de ovennævnte forbindelser omfatter pentoseresten ribose, di-desoxyribose, dideshydroribose eller en azido- eller halogensubstitueret ribose bundet 10 til 9-stillingen i purinet eller til 1 -stillingen i pyrimidinet.

En fremgangsmåde til syntetisering af et lipidderivat af et antiviralt nucleosid omfatter trinnet at et antiviralt nucleosid med en ribosehydroxylgruppe med et phospholipid i nærværelse af et koblingsreagens, hvor nucleosidet forenes med phospholipidet med en 15 phosphatbinding i ribosehydroxylgruppens stilling. I en fordrukken udførelsesform er phospholipidet et diacylphosphat. Ved en anden udførelsesform er phospholipidet en phosphatidinsyre eller et ceramid. Der anvises her også en metode til syntetisering af et lipidderivat af et antiviralt nucleosid omfattende trin til omsætning af et antiviralt nu-cleosid-monophosphat med et reagens HL, hvor L repræsenterer en afgående gruppe, 20 til dannelse af et nucleosid-P04-L, og omsætning af nucleosid-P04-L med en phosphatidinsyre for at binde syren til nucleosidet gennem en pyrophosphatbinding. Ved en variation af denne metode er nucleosid-monophosphatet AZT-5'-monophosphat.

Yderligere en metode til syntetisering af et glyceridderivat af en nucleosid-analog om-25 fatter trinnene at forene et monoglycerid eller diglycerid og et antiviralt nucleo-sid-monophosphat med et koblingsmiddel i nærværelse af en basisk katalysator. Ved en udførelsesform er glyceridet 1-O-stearoylglycerol og nucleosidet AZT-monophosphat.

En fremgangsmåde til fremstilling af en suspension af liposomer til anvendelse ved be-30 handling af virale og retrovirale infektioner hos et pattedyr omfatter tilvejebringelse af et lipofilt antiviralt middel, der omfatter mindst én lipidart bundet til en nucleo-

I DK 175780 B1 I

I 12 I

I sid-analog gennem en monophosphatbindingsgruppe, diphosphatbindingsgruppe eller I

I triphosphatbindingsgruppe ved 5’-stillingen i nucleosidets pentoserest, kombinering af I

I det lipofile antivirale middel og et farmakologisk acceptabelt vandigt opløsningsmiddel I

I til dannelse af en blanding og dannelse af liposomer ud fra det lipofile antivirale mid- I

I 5 del. Liposomeme kan f.eks. dannes ved sonikation, ekstrudering eller mikrofluidise- I

I ring. Ved en foretrukken udførelsesform omfatter kombinati- onstrinnet yderligere I

I kombinationen af et farmakologisk inaktivt lipofilt lipid. Dette inaktive lipid kan f.eks. I

I være en phosphatidylethanolamin, en sphingolipid, et sterol eller et glycerophosphatid. I

I Metoden kan også indbefatte behandling af liposomeme med thi oantistoffer til frem- I

I 10 stilling af immunliposomer, eller at der i kombinationen inkluderes en lipofilt lipid, I

I som delvis er omfattet af en ligand. Således kan liposomet indbefatte en ligand bundet I

I til et lipidsubstrat. I

I Med opfindelsen anvises endvidere en metode til behandling af retrovirale og virale in- I

I 15 fektioner hos et pattedyr, såsom et menneske, ved at indgive en tilstrækkelig mængde I

I af de her beskrevne antivirale nucleosid-analoger for at levere en terapeutisk dosis af I

I det antivirale middel til pattedyret. Ved en foretrukken udførelsesform anvendes meto- I

I den til at behandle retrovirale og virale infektioner hos et pattedyr, hvor retrovirusen er

I blevet resistent mod behandling med konventionelle former for antiviralt middel. Med I

I 20 den foreliggende opfindelse anvises også en metode til behandling af patienter, der har I

I stammer af HIV, som har udviklet resistens mod AZT eller reduceret følsomhed for I

I AZT omfattende trin til at indgive en forbindelse ifølge opfindelsen til en sådan patient I

I i en effektiv, retrovirusinhiberende dosis. Med den foreliggende opfindelse anvises og- I

I så en metode til behandling af en virusinfektion hos et pattedyr omfattende trin til ind- I

I 25 givelse af en effektiv mængde, som beskrevet her, til et pattedyr. Infektionen kan være I

I en infektion af herpes simplex og forbindelsen kan være phosphatidylacyklovir. Alter- I

I nativt kan virusen være HIV retrovirus, og forbindelsen kan være S'-palmitoylAZT. I

I Metoden indbefatter anvendelse, hvor retrovirusen er en stamme af HIV, der har udvik- I

I let resistens mod en nucleosid-analog. I

30 I

DK 175780 B1 13

Med den foreliggende opfindelse anvises også en metode til at forlænge den antivirale effekt hos en nucleosid-analog i et pattedyr, omfattende indgivelse af nucleo-sid-analogen til pattedyret i form af de her beskrevne nucleosid-lipid-derivater. Der anvises også en metode til at undgå eller overvinde resistensen hos retrovirusen overfor 5 nucleosid-analoger ved at indgive analogen i form af de her beskrevne lipidderivatfor-bindelser.

Den foreliggende opfindelse indbefatter anvendelse af forbindelserne og præparaterne ifølge opfindelsen ved fremstilling af et lægemiddel til behandling af en human virusin-10 fektion. Præparaterne ifølge opfindelsen kan omfatte en forbindelse ifølge opfindelsen og en farmaceutisk acceptabel bærer. Præparater ifølge opfindelsen kan omfatte en forbindelse ifølge opfindelsen og mindst én anden antiviral forbindelse.

Liposomievering af antiretrovirale og antivirale lægemidler giver en højere dosis til 15 makrofagceller og monocytceller, som let optager liposomer. De enestående fordele ved den foreliggende opfindelse er, at lipidderivateme af de antivirale nucleosider inkorporeres overvejende i liposomets phospholipidlag snarere end i det vandige område.

Dette giver mulighed for at inkorporere større mængder af antiviral analog i liposomer end i det tilfælde, hvor der anvendes vandopløselige phosphatestere af nucleosideme.

20 Der vil blive opnået komplet inkorporering af det antivirale derivat i liposomer, således at man forbedrer både forholdet mellem lægemiddel og lipid og formuleringens effektivitet. Desuden vil der ikke være nogen udsivning af de antivirale lipidanaloger fra li-posomet under lagring. Endelig muliggør liposomterapi under anvendelse af disse forbindelser levering af større mængder antiviral forbindelse til de inficerede makrofag-25 celler og monocytceller. Behandling med liposomforbindelser, der indeholder stedspecifikke ligander, muliggør, at endnu større mængder af antivirale forbindelser leveres med forøget specificitet.

En yderligere ny fordel ved den foreliggende opfindelse er, at hver klasse af lipidderi-30 vater af antivirale nucleosider som beskrives nedenfor, antages at give direkte anled- I DK 175780 B1 I 14 I ning til antivirale phosphorylerede eller ikke-phosphorylerede nucleosider efter cellu- I lær metabolisme.

En yderligere fordel ved den foreliggende opfindelse er, at de hidtil ukendte lipidderi- I 5 vater inkorporeres i . cellen, idet cellen beskyttes i forlængede tidsperioder op til eller I overskridende 48 timer efter at lægemidlet er fjernet.

I Disse og andre fordele og træk ved den foreliggende opfindelse vil blive mere åbenbare ud fra den efterfølgende beskrivelse og patentkravene.

I 10 I Kort beskrivelse af tegningen

I Fig. 1-5 er kurver, der afbilder p24-produktion af HIV-inficerede celler som en funkti- I

I . on af den in vitro indgivne mængde af forbindelsen ifølge opfindelsen. I

I 15

I Detaljeret beskrivelse af opfindelsen I

I Den foreliggende opfindelse involverer lipidderivater af nucleosid-analoger, som kan I

inkorporeres i liposomers lipiddobbeltlag. Disse derivater omdannes til nucleo- I

20 sid-analoger ved processer, der indgår i de cellulære metaboliske processer, og har an- I

tivirale virkninger in vivo og in vitro. I

Velegnede lipidderivater af nucleosid-analoger omfatter phosphatidylnucleosider, I

nucleoside-diphosphat-diacylglyceroler og ceramidphosphonucleosider. Lipidderiva- I

25 terne af disse forbindelser tilvejebringer en eller to hydrofobe acylgrupper til foran- I

kring af nucleosidet i liposomets lipiddobbeltlag. Den foreliggende opfindelse omfat- I

I ter også lipidderivater, der er i stand til at give yderligere acylgrupper og således større I

forankringsstyrke for nucleosid-analoger. Forøgelsen af forankringsstyrken gør det mu- I

ligt at udnytte nucleosid-analoger med større polaritet i liposomformuleringer. Derfor I

i 30 beskrives der her yderligere nucleosid-strukturer af denne type til anvendelse ved lipo- I

somterapi. I

15 DK 175780 B1 ; Nomenklatur !

Lipidderivateme ifølge opfindelsen er opbygget af komplekse strukturer, som kun kan 5 defineres rigoristisk ved hjælp af en besværlig terminologi. For klarhedens skyld vil beskrivelserne af lipider og nucleosidkomponenter og deres kombinationer foregå i form af almindeligt anvendte trivialnavne, der er velkendte for fagfolk. For eksempel vil det velkendte lægemiddel 3’-azido-3'-desoxythymidin hyppigt blive betegnet som AZT. Tilsvarende vil derivatet af AZT, som omfatter en 10 1,2-diacylglycerol-3-pho$phat-rest hyppigt blive betegnet som phosphati- dylAZT eller pAZT. Parallelle derivater af didesoxythymidin eller didesoxycytidin vil tilsvarende blive betegnet som phosphatidylddT eller pddT og phosphatidylddC og pddC. Derivater af halogenerede nucleosider vil blive betegnet som f.eks. phosphatidyl--3'BrddT.

15 Nucleosid-analogeme ifølge opfindelsen kan være et hvilket som helst nucleosid, der ikke forekommer naturligt i den art, der skal behandles for virusinfektion. Den kan omfatte en naturligt forekommende purinbase eller pyrimidinbase bundet til en analog af en naturligt forekommende ribosegruppe. Den kan ligeledes omfatte en analog af en purinbase eller pyrimidinbase bundet til en ribosegruppe eller desoxyribosegruppe, som 20 er til stede i naturligt forekommende nucleosider. Alternativt kan både baseresten og riboseresten i nucleosid-analogeme være analoger til dem, der findes i naturen. En nucleosid-analog kan også omfatte enten en normal base eller en baseanalog bundet til en ikke-ribose-sukkerrest.

25 Analoger af både purinbasen eller pyrimidinbasen og ribose-gruppen kan afvige fra den tilsvarende naturligt forekommende rest ved at have nye substituentgrupper bundet dertil, ved at have naturligt forekommende substituentgrupper udtaget derfra eller ved at have atomer, der normalt er til stede, erstattet med andre. Eksempler på analoger dannet ved substitution er 2,6-diaminopurin og 3’-azido-3'-desoxyribose; ved udeladelse 30 6-oxypurin eller dideshydroribose; ved erstatning 8-azaguanin.

i

I DK 175780 B1 I

I 16 I

Nucleosid-analoger kan også omfatte en purinbase eller pyrimidinbase bundet til pen· I

I toseresten i en ikke-naturligt forekommende binding, som f.eks. gennem nitrogenato- I

B met i 3-stillingen i stedet for i 1-stillingen i pyrimidineme. I

B 5 1 almindelighed vil nucleosid-analogeme, der anvendes ved fremstilling af liposomeme I

B ifølge opfindelsen, have en purinbase eller pyrimidinbase, f.eks. adenin, guanin, cyto- ' I

B sin eller thymin, eller en analog deraf, bundet til en pentose såsom ribose eller en rest I

B og/eller et derivat af ribose. Bindingen er gennem nitrogenatomet i 9-stillingen hos pu- I

B rineme og gennem nitrogenatomet i 1-stillingen hos pyrimidineme. Disse nitrogenato- I

B 10 mer er bundet med en β-N-glycosyl-binding til kulstofatom 1 i pentoseresten. I

B Pentose-resten kan være en fuldstændig pentose eller et derivat såsom desoxy- eller di- I

B desoxypentose. Desuden kan pentoseresten være et fragment af en pentose, såsom en I

B hydroxyleret 2-propoxymethylrest eller en hydroxyleret ethoxymethylrest. Særlige I

B 15 nucleosidrester med disse strukturer indbefatter acylovir og gancyklovir. Pentosen kan I

B j også have en oxygen- eller svovl substitution for et carbonatom, f.eks. ved 3-stillingen i I

I j desoxyribose(BCH-189). I

Phosphatgmppeme er i almindelighed forbundet til pentosemes 5'-carbonatom i forbin- I

20 delseme ifølge opfindelsen; imidlertid ligger forbindelser, hvor phosphatgruppeme er I

bundet til pentosens 3'-hydroxylgruppe, inden for opfindelsens rammer, hvis de har an- I

tiviral aktivitet. I

Det er vigtigt at erkende, at i forbindelser, der har pentoserester, der ikke er komplette I

H 25 pentoser, er phosphatgruppeme forbundet til det carbonatom, som ville have været I

j 5'-carbonatomet, hvis pentosen var komplet. I disse pentosefragmenter kan 2’- og/eller I

3'-carbonatomeme mangle; ikke desto mindre betragtes de som værende nucleosidderi- I

vater inden for betydningen heraf for den foreliggende opfindelse, og carbonatomet, I

hvortil phosphatgruppeme er bundet, vil generelt blive betegnet her som I

30 5’-carbonatomet for derved at give overensstemmelse med anvendelsen. I

17 DK 175780 B1 ! i t

Den antivirale aktivitet kan ligge i en hvilken som helst bestanddel af li-pid-nucleosid-komplekset, dvs. i en nucleosid-baseanalog, i en riboseanalog eller i en anden pentose som anvendes i stedet for ribose. Den kan også ligge i komplekset som en helhed, hvor f.eks. en svagt antiviral analog eller en, der har umærkelig eller latent 5 viral aktivitet, bliver mere kraftig efter inkorporering heraf i et nucleotids lipidderivat.

Nucleosider, der vides at have en sådan aktivitet, er medlem- mer af den klasse, der omfatter 3'-azido-2,,3,-didesoxypyrimidinnucleosider, f.eks. AZT, AZT-P-AZT, AZT-P-ddA, AZT-P-ddl, AzddCIU, AzddMeC, AzddMeC N4-OH, AzddMeC N4Me,.

10 AZT-P-CyE-ddA, AzddEtU(CS-85), AzddU(CS-87), AzddC(CS-91), AzddFC, Azdd-BrU og AzddlU; den klasse der omfatter 3'-halogenpyrimidin-didesoxy-nucleosider, f.eks. 3-FddClU, 3-FddU, 3-FddT, 3-FddBrU og 3-FddEtU; den klasse der omfatter 2',3'-dideshydro-2',3'-di-desoxynucleosider (D4-nucleosider), f.eks. D4T, D4C, D4MeC og D4A; den klasse der omfatter 2',3'-usubstituerede didesoxypyrimi-15 din-nucleosider, f.eks. 5-FddC, ddC og ddT; klassen der omfatter 2',3'-usubstituerede didesoxypurin-nucleosider, f.eks. ddA, ddDAPR(diaminopurin), ddG, ddl og ddMeA(N6-methyl); og klassen omfattende sukkersubstituerede didesoxypurin-nucleosider, f.eks. 3-N3ddDAPR, 3-N3ddG, 3-FddDAPR, 3-FddG, 3-FddaraA og 3-FddA, hvor Me er methyl, Et er ethyl og CyEt er cyanoethyl.

20

Andre velegnede nucleotid-analoger kan være antivirale midler, såsom acyklovir og gancyklovir (DHPG) eller andre analoger som beskrevet nedenfor. Fortrukne dideso-xyderivater er dem, der anvendes ved behandling af AIDS indbefattet 3'-azido-3’-des-oxythymidin (azidothymidin eller AZT); 2',3'-didesoxythymidin (ddT); 25 2',3'didesoxycytidin (ddC); 2’,3’-didesoxyadenosin (ddA); og 2',3’didesoxyguanosin (ddG). AZT, ddT og ddC er de for tiden mest foretrukne analoger. Dideshydropyrimi-dineme såvel som carbovir, et carbocyklisk 2',3'-dideshydroguanosin foretrækkes også.

Endvidere foretrækkes 3’-azidoderivater af desoxyguanosin (AZG) og pyrimidinet, de-soxyuridin og 3'-fluor- derivaterne af desoxythymidin og desoxyguanosin. Blandt 2',6’-30 diaminopurineme foretrækkes 2’,3’-desoxyribosidet og dets 3'-fluor- og 3’-azido-derivater. Endvidere foretrækkes 2-chlor- desoxyadenosin.

Η

I DK 175780 B1 I

I 18 I

I Blandt de acykliske sukkerderivater foretrækkes 9-(4,-hydroxy- I

1 ',2'-butadienyl)-adenin (adenallen) og dets cytosinækvivalent Foretrukne acykliske I

I derivater med en purinbase eller diaminopurinbase er 9-(2-phosphonyl- I

5 methoxyethyl)-adenin og phosphonomethoxyethyldesoxydiaminopurin (PMEDADP). I

I Stereoisomerer af disse nucleosider såsom 2’-fluor-ara-ddA, kan være fordelagtige på I

B grund af deres resistens mod syrekatalyseret hydrolyse af glycosidbindingen, hvilket I

forlænger deres antivirale aktivitet. I sådanne tilfælde foretrækkes sådanne. I

I 10 I

B Til behandling af infektioner af herpes, cytomegalavirus og hepatitis B kan man anven- I

I de lipidderivateme af acyklovir, gangcyklovir, 1 -(2'-desoxy-2'-fluor-1 -β-D-ara- I

B binofuranosyl)- 5-jodcytosin (FIAC) eller 1 -(2'-desoxy-2’-fluor-1 -B-D-arabinofurano- I

I syl)-5-jodurasil (FIAU). I

I I

Lipideme er fortrinsvis bundet til nucleosid-analogeme gennem phosphatbindinger. Li- I

B pidderivater, der omfatter en phosphatbinding mellem nucleosid-analogen og lipidet, I

B kan frem- stilles ud ffa phospolipider, phosphorylerede nucleosid-analoger eller begge I

dele. Velegnede phospholipider omfatter phosphoglycerider eller sphingolipider. I

I 20 I

I Lipidderivater af nucleosid-analoger, hvori lipider er bundet enten gennem mono-, di- I

B eller triphosphatgrupper, kan fremstilles ud fra phosphorylerede nucleosid-analoger. I

I Phosphorylerede nucleosid-analoger er kendte. Didesoxynucleosid-analogen phospho- I

ryleres ifølge konventionelle fremgangsmåder, såsom phosphoroxychloridmetoden I

B 25 ifølge Toorchen og Topal (20). Den foretrukne modificerede analog er I

B 5'-monophosphatet. Da AZT, ddC og andre didesoxynucleosider kun har 5’-hydroxyl, I

B dannes der kun 5'-monophosphat under phosphoryleringen; imidlertid kan der i andre I

B analoger, hvori 3’-hydroxyl er til stede, dannes et 3’-monophosphat. Diphosphat- og. I

B triphosphat-analogeme af antivirale nucleosider kan også anvendes. I

B 30 I

DK 175780 B1 19 ί

Lipidrestemes alifatiske grupper har fortrinsvis kædelængder på 2 til 24 carbonatomer og har 0 til 6 dobbeltbindinger. De alifatiske grupper kan være bundet til glycerolresten med acylbindinger, etherbindinger eller vinyletherbindinger.

5 Syntetiske metoder

Lipid-nucleotid-forbindelseme ifølge opfindelsen kan syntetiseres ved hjælp af generelle metoder, der er anvendelige for alle lipider og alle antivirale nucleosider, som beskrevet nedenfor, som vist i flowdiagrammet på fig. og vist specifikt i eksempel 1 til 10 6.

Lipider, der omfatter fedtsyrer, alkoholer, glycerider og phospholipider, kan købes fra handelsleverandører (Avanti Polar Lipids, Inc., Pelham, Alabama 35124) eller kan syntetiseres i overensstemmelse med kendte metoder. Antivirale nucleosid-analoger kan 15 leveres af Aldrich, Milwaukee, Wisconsin eller Sigma, St. Louis, Missouri.

Det er vigtigt, at alle spor af vand fjernes fra reaktanterne for at koblingsreaktionerne skal kunne forløbe. Derfor bliver lipideme først enten frysetørret ved opløsningsmiddelafdampning under vakuum eller i en vakuumovn over P2O5. Reaktionerne gennem-20 føres også under en inaktiv gas som f.eks. argon.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan dannes i overensstemmelse med syntetiske fremgangsmåder, der kobler et phospholipid til en nucleosid-analog eller, som kobler et phospholipid til et nucleosid-analog-monophosphat eller -diphosphat, hvor phosphat-25 gruppen er placeret på nucleosidets ribosegruppe i enten 3'-stilling eller fortrinsvis 5'-stilling.

Lipider, der er velegnede til kobling til nucleosider, omfattende primært monoglyceri-der eller diglycerider, ceramider og andre lipidarter som beskrevet nedenfor, kan 30 phosphoryleres ved behandling med passende midler, f.eks. under anvendelse af phe-nylphosphordichloridat i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Brown (32), * i

I DK 175780 B1 I

I 20 I

ved behandling med phosphoroxychlorid som beskrevet i eksempel 6 eller ved andre I

I kendte phosphoryleringsmetoder. I

I I

I Ved den første type af syntese kobles et phospholipid, som f.eks. en phosphatidinsyre, I

I 5 til en udvalgt nucleosid-analog i enten 3’- eller 5'-hydroxyl ved hjælp af et koblings- I

middel, som f.eks. 2,4,6-triisopropylbenzensulfonylchlorid i nærværelse af en basisk * I

| katalysator, f.eks. vandfrit pyridin, ved stuetemperatur. Andre koblingsmidler, såsom I

I dicyklohexylcarbodiimid kan også anvendes. I

I 10 Lipidderivater kan også syntetiseres ved kobling af en phosphatidinsyre til et antiviralt I

nucleosid-monophosphat gennem en pyrophosphatbinding. Ved denne fremgangsmåde I

I omdannes nucleosid-monophosphatet eller -diphosphatet til et derivat med en afgående I

I gruppe, f.eks. morpholin, bundet til den terminale phosphatgruppe i overensstemmelse I

I med metoden ifølge Agranoff og Suomi (21) og som illustreret i eksempel 4 til frem- I

I 15 stilling af et derivat af AZT og i eksempel 6 til fremstilling af et derivat af ddA. En I

I kobling af phosphatidinsyre og nucleosid-phosphat-morpholidatet sker ved behandling I

I af en tør blanding af de to reaktanter med en basisk katalysator såsom vandfrit pyridin, I

I ved stuetemperatur. I

I 20 Reaktionerne følges under anvendelse af tyndtlagskromatografi (TLC) og passende op- I

I løsningsmidler. Når reaktionen, som bestemt ved TLC, er tilendebragt, ekstraheres I

I produktet med et organisk opløsningsmiddel og renses ved kromatografi på en bærer, I

I der er velegnet til lipidadskil 1 el se, f.eks. kiselsyre. I

I 25 Syntesen af produkter, der omfatter adenin eller cytidin med reaktionsdygtige ami- I

I nogrupper, kan lettes ved at blokere disse grupper med acetat før koblingsreaktionen I

ved behandling med eddikesyreanhydrid. Efter kromatografering af slutproduktet fjer- I

I nes blokeringen fra aminogruppeme under anvendelse af ammoniumhydroxid (eksem- I

I pel 3). I

2l DK 175780 B1

Lipi dderi vater

Forbindelser, der vil være mest effektive, vil have en lipiddel, der er tilstrækkelig til at 5 være i stand til at inkorporere materialet på en stabil måde i et liposomdobbeltlag eller i et andet makromolekylært arrangement.

Nogle foretrukne lipidderivater af nucleosid-an aloger, som er inden for rammerne af den foreliggende opfindelse, ligger inden for fire generelle klasser: 10 1. Antivirale nhosphatidvlnucleosider:

Strukturen af disse antivirale lipidforbindelser er vist nedenfor: 15 h2c-Ri hc-r2 o I " h2Uo-p-a-n 0- 20 hvor N er et "kædeafsluttende" didesoxynucleosid, såsom AZT, ddC, ddA, ddl eller et andet antiviralt nucleosid, såsom acyklovir eller gancyklovir, A er et chalcogen (O eller S), og Ri og R2, som kan være ens eller forskellige, er Q^alifatiske grupper med fra 0 til 6 steder med umættethed og har fortrinsvis strukturen 25 CH3-(CH2)a-(CH=CH-CH2)b-(CH2)c-Y, hvor summen af a og c er fra 1 til 23, og b er 0 til 6; og hvor Y er C(0)0', C-0\ C=C-0‘, C(0)S-, C-S-, C=C-S-, under dannelse af henholdsvis acylesterbindinger, etherbindinger eller vinyletherbindinger mellem de alifatiske grupper og glycerolresten. Disse alifatiske grupper i acylesterbinding omfatter derfor naturligt forekommende mættede fedtsyrer, såsom laurinsyre, myristinsyre, pal-30 mitinsyre, stearinsyre, arachidinsyre og lignoserinsyre og de naturligt forekommende umættede fedtsyrer palmitoleinsyre, oleinsyre, linolsyre, linolensyre og arachidonsyre.

I DK 175780 B1 I

I 22 I

I Foretrukne udførelsesformer omfatter en monoester- eller diester- eller et 1-ether, I

I -2-acylester-phosphatidylderivat. I andre udførelsesformer kan de alifatiske grupper I

I være forgrenede kæder med det samme antal carbonatomer og omfatte primær eller se- I

kundær alkanol eller alkoxygrupper, cyklopropangrupper og indre etherbindinger. I

I 5 I

I Denne klasse af forbindelser kan f.eks. fremstilles ved reaktion mellem en dia- I

cylphosphatidinsyre og en antiviral nucleosidanalog i pyridin som beskrevet for frem- I

I stillingen af 3,2- dimyristoy]g]ycerophospho-5'-(3'-azido-3'-desoxy)-tbymidin i eksem- I

I pel 1. I

I I

I Ved liposomoptagelse antages det, at forbindelserne underkastes metabolisme ved I

I hjælp af de i cellerne tilstedeværende phospholipaser. For eksempel er det således i det I

I specifikke tilfælde med et diacylphosphatidylderivat af et nucleosid, at phospholipase I

C vil indvirke for at give et diacylglycerol og nucleosid-monophosphatet som vist ne- I

15 denfor: I

I I

DK 175780 B1 23 1 O ? o M —C— O— C-*, H —C—C-.5-ft( ° I ® o „ i._. § _ »‘«ev'MouieAi.E'C y—I—« B Λ t 5 i I I L· H—c.—o—r — A —— X h—-c—e- O© i O© 1

Alternativ kan det samme phosphatidylnucleosid hydrolyiseres med phospholipase A 10 og lysophospholipase efterfulgt af phosphodiesterase for at give glycerol og nucleo-sid-monophosphat ved den nedenfor viste sekvens:

15 ? I

1 T I t

* Ί— A -N h—-£— o — * — A'-K

i U i <e & \% \*ί»

Ve v< Ϊ “ H-c-C* H-i—Ο

Ι ^ I p-csP'oJiesrøiASc* I

* ?— o. -r r—A —* f:-*—- K—c—Ο Ι I e

* C—o« Q® tt—C-e_U A -H

^ H C©

I DK 175780 B1 I

I 24 I

2. Antivirale nucleosid-diphosphat-dielvcerider: I

Den kemiske struktur af denne klasse af forbindelser er vist nedenfor: I

I 5 I

H2c-Ri

I i I

HC-R? 00

I I B I

I I

I I

hvor N, A og Rj og R2 er som beskrevet ovenfor. I

I Nucleosid-diphosphat-diglycerider er kendte. De antivirale nucleo- I

I sid-diphosphatdiglycerider kan fremstilles ud fra phosphatidinsyre og de antivirale I

15 nucleosid-monophosphomorpholidater ved metoden ifølge Agranoff og Suomi (21) I

I som modificeret af Prottey og Hawthorne (22). Denne syntesetype er præsenteret i ek- I

I sempel 4 for syntesen af AZT-5'-diphosphat-dipalmitoylglycerol. I

I Ved liposomlevering til celler vil denne klasse af forbindelser tage del i flere typer af I

20 reaktioner, da det er en analog af CDP-diglycerid, et vigtigt naturligt forekommende I

I mellem produkt ved biosyntesen af phosphatidylglycerol, cardiolipin og phosphatidyli- I

I nositol som vist nedenfor: I

DK 175780 B1 25 •-rj—«» + j—A—*

I ; U

ir—t—·— r— P— iKlOS'-roL * O© / , ' «•-‘C —*, U«·« I I | e ? ^«eirM*-r(>yu6.v>te<ew. *»—C—" + ©— — A ——%

] f · · ' ) « ø J I

* *“·“'· j — O—· j— A ——»1 »i—4— · — i — O 0— * O— « — * o© e® © o® i* · » % %> .

' -U . ; T 0—A " *—<.—*» 1 _ . I · t , r- c— · — r — o— I I - *f 6 c©

Alle disse reaktioner fremkalder nucleosid-monophosphat og et nyt phospholipid. Det er vigtigt at bemærke, at Poorthuis og Hostetler (23) tidligere viste, at en varietet af nucleosider kunne træde i stedet for CDP-diglycerider i disse reaktioner indbefattet 20 UDP-diglycerid, ADP-diglycerid og GDP-diglycerid (23). Signifikant syntetiserede Ter Scheggett et al. (24) desoxy-CDP-diglycerid og fandt at det også kunne erstatte CDP-di- glycerid i den mitochondrielle syntese af phosphatidylglycerol og cardiolipin, hvilket antyder muligheden for anvendelse af disse nye forbindelser til at fremkalde an-tivirale nucleosid-phosphater i målcellerne.

25 CDP-diglycerid-hydrolase katalyserer en anden vigtig metabolisk omdannelse, som giver anledning til nucleosid-monophosphat og phosphatidinsyre som vist nedenfor:

I DK 175780 B1 I

l

I 26 I

H2C-R! I

| CDP-diql vcend-y

I HC-R? 0 O hydrolase I

I j a B I

H?c— O- P-o — P-A— N

ii I

5 0-0-

I HoC-Ri I

l i I

HC-R2 O o

I I I

I H'jC-O-P— O" + O"— p-A — N I

I i 1 I

10 0-0-

I Denne reaktionsvej blev først beskrevet i pattedyrsvæv af Rit- tenhouse et al. (25). Det- I

te enzym, som er en pyrophosphatase, forventes at spalte didesoxynucleo- I

I sid-diphosphat-diglycerid til nucleosid-monophosphatet og phosphatidinsyre, hvilket I

I 15 giver en anden måde, hvorpå nucleosid-monophosphatet kan dannes i målcellerne. I

I 3. Ceramid-antivirale phosphonucleosider: I

Antivirale nucleosidphosphater kan også fremkaldes i celler efter liposomlevering af et I

I 20 ceramid-(antiviralt nucleosid)- phosphat med den nedenfor viste almene struktur: I

I ° I

I CER-0—P — A-N I

I I

I 25 I

hvor CER er et N-acylsphingosin med strukturen: I

I CH=CH-(CH2)12-CH3 I

I CHOH I

I I

RC(O)NH-CH I

I h2c- I

DK 175780 B1 1 27 hvor R har den tidligere angivne betydning eller et ækvivalent lipidsubstitueret derivat af sphingosin og N er et "kædeafsluttende" antiretroviralt nucleosid eller antiviralt nucleo- sid som tidligere defineret. Denne klasse af forbindelser er anvendelige i lipo-somformulering og behandling af AIDS og andre virussygdomme, da de kan påvirkes 5 af sphingomyelinase eller phosphodiesteraser i cellerne, hvilket giver anledning til, at der dannes nucleosid-monophosphat. Ved siden af de ovenfor viste forbindelser, kan ceramid-diphosphat-didesoxynucleosider også syntetiseres, og sådanne kan nedbrydes af cellulære pyrophosphataser for at give nucleosid-monophopshat og ceramid-phosphat.

10

Ceramid-(antiviralt nucleosid)-phosphater kan fremstilles ved en metode ligesom metoden til fremstilling af antivirale nucleosid-diphosphat-diglycerider ved passende udskiftninger af udgangsmaterialerne.

15 4. Andre linidderivater af antivirale nucleosider

En vej frem til at opnå endnu større stabilitet hos lipidderivater af nucleosid-analoger i liposomer er at forøge den indbyrdes lipid-lipidindvirkning mellem li-pid-nucleosid-strukturen og dobbeltlaget I overensstemmelse hermed kan der ved fo-20 retrukne udførelsesformer syntetiseres lipidderivater af nucleosid-analoger med op til fire lipofile grupper. En klasse af disse omfatter diphosphatidylglycerolderivater med den generelle struktur: AZT OK O" 123 I I I 3" 2" 1" c C-C-C—P—o—C——C—C—O-P—o—c—c-—c

II H 1' 2' 3' Il II

Rx R2 0 0 *3 *4 !

I DK 175780 B1 I

I denne klasse bindes nucleosider til det ene eller begge phosphater med en phospho- I

diesterbinding til 5'-OH i desoxyribosedelen, ribosedelen eller didesoxyribosedelen i I

det antivirale nucleosid. I tilfælde af acykliske nucleosider såsom acyklovir og gang- I

cyklovir vil bindingen være til den OH-gruppe, der er ækvivalent med den i I

5 5'-stillingen hos ribose, desoxyribose eller didesoxyribose. Der kan være et eller to nu- j I

cleosider bundet til hvert molekyle. Nucleosid-phosphater kan også bindes med en py- j'

rophosphatbinding som i eksempel 4. j I

En anden klasse af derivater med forøgede lipidkomponenter omfatter ; I

10 bis-(diacylglycero)-phosphonucleotider med den generelle struktur: I

ddC I

15 I

Ri R2 O *3 *4

Rm kan være to, tre eller fire alifatiske grupper, der uafhængigt er som tidligere defi- I

neret, hvilke grupper kan være i acylesterbindinger, etherbindinger eller vinyletherbin- I

20 dinger. Denne forbindelse kan fremstilles ved metoden beskrevet i eksempel 3.

Diphosphatversionen af denne forbindelse, med følgende struktur: I

ddC I

°=P—O" I

?*1 i-2 ^3 *4 I

DK 175780 B1 29 kan fremstilles ved at koble nucleosid-monophosphomorpholidatet til phosphoester-resten af bis-(diacylglycero)-phosphat i overensstemmelse med den procedure, der er beskrevet i eksempel 4. Denne forbindelse vil blive metaboliseret til AZT-P i cellerne ved hjælp af CDP-diglycerid-hydrolase (en pyrophosphatase). Disse 5 to typer af forbindelser kan give overlegne metaboliske og fysiske egenskaber.

Andre velegnede lipidderivater af nucleosider kan syntetiseres mider anvendelse af hidtil ukendte lipider. Det er f.eks. ønskeligt at syntetisere phospholipidderivater af antivi-rale og antiretrovirale nucleosider, som vil give anledning til kraftige antivirale midler 10 efter skiftende metabolismereaktionsveje ved hjælp af målcellerne, som optager lipid-formuleringen. Til derivater fremstillet af følgende typer af forbindelser, vil man kunne forvente en cellulær metabolisme, som adskiller sig fra den, der sker med mere konventionelle phospholipidderivater, da disse har en phosphatgruppe, som fernes fra den ; sædvanlige lipidgruppe ved hjælp af en nitrogenholdig gruppe. Strukturen hos disse li- 15 pider har træk som et kvatemært ammoniumderivat.

En foretrukken klasse omfatter DL-2,3-diacyloxyethyl-dimethyl-betahydroxyethylammoniumderivater.

20 I alle de lipid-derivater, der er beskrevet i de foregående afsnit 1 til 4 ovenfor, kan nucleosidet være et hvilket som helst antiviralt nucleosid. Ri.2 (såvel som R3^ for bis-(diacylglycero)-forbindelserne) kan være en hvilken som helst mættet eller umættet fedtsyre med fra 2 til 24 carbonatomer. Polyumættede, hydroxygruppeholdige, forgrenede og cyklopropangruppeholdige fedtsyrer er også mulige. Glycerolrestemes stereo-25 kemi kan indbefatte sn-1- eller sn-3-phosphoesterbindinger eller racemiske blandinger deraf. Der kan være 1 eller 2 (såvel som 3 eller 4 for bis-(diacylglycero)-forbindelseme) acylestergrupper eller alkylethergrupper eller vinyl-ethergrupper efter ønske.

30 Forskellige andre phospholipider kan være bundet til nucleosider indbefattet, men ikke begrænset til, phosphatidylglycerolderivater. I dette tilfælde vil

I DK 175780 B1 I

I I

nucleosid-phosphatet blive tilsat ved forestring til en eller flere af hydroxylgruppeme i I

alkoholen. Andre glycolipider kan også tjene som den ligand, hvortil phosphatgruppen I

i nucleotidet er bundet ved forestring til en glycolipid-hydroxylgruppe. I

5 Yderligere kan antivirale nucleosider bindes til de phosphatsubstituerede carbo- I

I hydratrester fra phospholipider eller glycolipider, enten af naturlig eller syntetisk op- I

rindelse. I

Phospholipider med alkylkæder bundet med etherbindinger eller vinyletherbindinger I

I 10 kan også anvendes til fremstilling af nucleotidderivater ifølge opfindelsen. Velegnede i I

I phospholipider til dette formål omfatter naturligt forekommende acetalphosphatider el- I

I ler plasmalogener, som omfatter en langkædet fedt- syregruppe, der er til stede i en I

I umættet vinyl etherbinding. Alternativt kan der fremstilles analoger af I

I 1-O-alkylglycerol eller 2-O-alkylglycerol syntetisk, og disse kan bindes til et udvalgt I

I 15 nucleotid som beskrevet i eksempel 7. Derivater af glyce- I

ro-3-phospho-5’-azidothymidin foretrækkes og kan fremstilles ved at kondensere I

I AZT-monophosphat med forskellige analoger med 1-O-alkylglycerol med en al- I

I kyl gruppe med en kædelængde på 2 til 24 carbonatomer i glycerolets 1-stilling. 1-0- I

I alkylgruppen kan bestå af en mættet eller umættet alifatisk gruppe med en kædelængde I

I 20 på 2 til 24 carbonatomer. 1-O-alkyl-glycerolresten kan være racemisk eller stereospeci- I

I fik. Denne forbindelse kan acyleres med fedtsyrechlorider eller -anhydrider, hvilket gi- I

I ver syntese af l-0-alkyl-2-acyl-glycero-3-phospho-5'-azidothymidin. I

I Fremstilling af liposomer. der omfatter linidderivater af antivirale nucleosider I

I 25 I

I Efter syntesen inkorporeres lipidderivatet af nucleosid-analogen i liposomer eller en I

anden passende bærer. Inkorporeringen kan gennemføres i overensstemmelse med vel- I

kendte metoder til fremstilling af liposom, såsom lydbehandling (sonikation), ekstrude- I

I ring eller mikrofluidisering. Velegnede konventionelle metoder til liposomfremstilling I

I 30 indbefatter men er ikke begrænset til dem, der er beskrevet af Bangham et al. (4), ΟΙ- I

DK 175780 B1 31 son et al. (26), Szoka og Papahadjapoulus (27), Mayhew et al. (28), Kim et al. (29),

Mayer et al. (30) og Fukunaga et al. (31).

Liposomeme kan fremstilles ud fra lipidderivateme af nucleosid-analoger alene eller i 5 kombination med et hvilket som helst konventionelt syntetisk eller naturligt phospholi-pidliposommateriale indbefattet phospholipider fra naturlige kilder såsom æg, plante-kilder eller dyrekilder, såsom phosphatidylcholin phosphatidylethanolamin, phosphati-dylglycerol, sphingomyelin, phosphatidylserin eller phosphatidylinositol. Syntetiske phospholipider, der også kan anvendes, indbefatter men er ikke begrænset til dimy-10 ristoylphosphatidylcholin, dioleoylphosphatidylcholin, dipalmitoylphosphatidylcholin og distearoylphosphatidylcholin og de tilsvarende syntetiske phosphatidylethanolami-ner og phosphatidyl glyceroler. Andre additiver såsom kolesterol eller andre steroler, kolesterolhemisuccinat, glycolipider, cerebrosider, fedtsyrer, gangliosider, sphingolipi-der, l,2-bis-(oleoyloxy)-3-(trimethylammonio)-propan (DOTAP), 15 N-[l-(2,3-dioleyl)-propyl]-N,N,N-trimethylammonium-(chlorid) (DOTMA), D,L-2,3-distearoyloxypropyl-(dimethyl)-6-hydroxyethylammonium-(acetat), glucopsy-chosin eller psychosin kan også tilsættes sådan som det er konventionelt kendt. De relative mængder af phospholipid og additiver, der anvendes i liposomeme, kan varieres om ønsket. De foretrukne grænser er fra ca. 80 til 95 mol% phospholipid og 5 til 20 20 mol% psychosin eller et andet additiv. Kolesterol, kolesterol-hemisuccinat, fedtsyrer eller DOTAP kan anvendes i mængder der ligger fra 0 til 50 mol%. Mængderne af antiviral nucleosid-analog, der inkorporeres i lipidlaget i liposomer kan varieres med koncentrationen af deres lipider liggende fra ca. 0,01 til ca. 100 mol%.

25 Ved anvendelse af konventionelle metoder til indfangning af aktiv forbindelse indfanges ca. 20 til 50% af det materiale, der er til stede i opløsning. Således går ca. 50 til 80% af den aktive forbindelse til spilde. Hvor i modsætning hertil nucleosid-analogen inkorporeres i lipider bliver praktisk talt hele mængden af nucleosidanalog inkorporeret i liposomet, og der går praktisk talt intet af den aktive forbindelse til spilde.

30

I DK 175780 B1 I

I 32 I

Liposomeme med de ovennævnte fonnuleringer kan gøres endnu mere specifikke for I

deres påtænkte mål ved inkorporering af monoklonale antistoffer eller andre ligander, I

der er specifikke for et mål. For eksempel kan monoklonale antistoffer til CD4 I

(T4)-receptoren inkorporeres i liposomet ved binding til phosphatidylethanolamin (PE) I

5 inkorporeret i liposomet ved metoden ifølge Leserman et al. (19). Som tidligere be- I

I skrevet vil HIV inficere de celler, der bærer CD4-(T4)-receptoren. Anvendelse af dette I

CD4-målrettede immunliposom vil derfor fokusere antiviral forbindelse på steder, hvor I

I der kan være HIV-infektion. Ved i stedet at anvende et andet CD4-erkendelsesprotein, I

I vil der opnås det samme resultat. På den anden side vil erstatning med monoklonalt an- I

I 10 tistof til gpl 10 eller gp4l (HIV-virusbelægningsproteiner) fokusere antivirale immun- I

I liposomer ved steder med løbende aktiv HIV-infektion og replikation. Monoklonale an- I

I tistoffer til andre vira, såsom herpes simplex el ler cytomegalovirus, vil fokusere aktiv

forbindelse på steder med infektion af disse vira. I

I 15 Terapeutiske anvendelser af lioidderivater I

I Den Iiposominkorporerede phosphorylerede nucleosid-analog administreres til patien- I

I ter ved hjælp af en hvilken som helst af de kendte metoder, der anvendes til administre- I

ring af liposomer. Liposomeme kan administreres intravenøst, intraperitonealt, intra- I

20 muskulært eller subkutant som en pufret vandig opløsning. En hvilken som helst far- I

maceutisk acceptabel vandig puffer eller et andet vehikel kan anvendes, når blot sådan- I

I ne ikke destruerer liposomstrukturen eller lipidnucleosid-analogens aktivitet. En veleg- I

I net vandig puffer er 150 mM NaCl indeholdende 5 mM natriumphosphat med en I

pH-værdi på ca. 7,4 eller andre fysiologiske puffede saltopløsninger. I

I 25 I

I Dosis til et pattedyr, indbefattet et menneske, kan variere i afhængighed af infektionens I

I omfang og alvorlighed og af den indgivne forbindelses aktivitet. Dosisniveauer for I

I nucleosid-analoger er veletablerede. Dosisniveauer for lipidderivater af nucleo- I

I sid-analoger bør være således, at der administreres ca. 0,001 mg/kg til 1000 mg/kg til I

I 30 patienten på en daglig basis eller mere foretrukket fra ca. 0,05 mg/kg til ca. 100 mg/kg. I

DK 175780 B1 33 ! Med den foreliggende opfindelse udnyttes de ovenfor noterede antivirale nucleosidde- rivater inkorporeret i liposomer for at dirigere disse forbindelser til makrofager, mono-cytter og en hvilken som helst anden celle, som kan optage liposompræparatet. Der kan også inkorporeres ligander for yderligere at fokusere liposomemes specificitet.

5

De beskrevne derivater har flere enestående og nye fordele i forhold til de vandopløselige didesoxynucleosidphosphater, der er beskrevet i en af ansøgerens tidligere ansøgninger.

10 For det første kan de formuleres på en mere effektiv måde. Liposomer, der omfatter li-pidderivater af nucleosid-analoger, har betydeligt højere forhold mellem lægemiddel og lipid, da de inkorporeres i liposomets væg i stedet for at blive placeret i det vandige | kemeafsnit. For det andet vil der ikke ske udsivning under lagring fra liposomer, der indeholder de ovennævnte lipofile didesoxynucleosidderivater, hvilket giver en forbed-15 ret produktstabilitet. Endvidere kan disse præparater lyofiliseres, opbevares tørt ved stuetemperatur og rekonstitueres til brug, hvilket giver en forbedret lagerlevetid. De gør det også muligt effektivt at inkoiporere antivirale forbindelser i liposompræparater uden signifikant spild af aktiv forbindelse.

20 De giver også terapeutiske fordele. Stabiliteten hos det liposomt inkorporerede middel bevirker, at en større procentuel andel af det indgivne antivirale nucleosid vil nå det påtænkte mål, mens den mængde der optages af cellerne i almindelighed er minimal, hvorved nucleosidemes toksiske bivirkninger nedsættes. Nucleosidemes toksiske bivirkninger kan yderligere reduceres ved at målrette de liposomer, hvori de er indeholdt, 25 til faktiske eller potentielle infektionssteder ved i liposomeme at inkorporere ligander, der specifikt binder dertil.

Endelig er de ovennævnte forbindelser konstrueret på en ny måde, således at der opnås phosphorylerede didesoxynucleosider eller andre antivirale nucleosider efter yderligere 30 cellulær metabolisme. Dette forbedrer deres antiretrovirale (anti- virale) effekt i mono-cytter og makrofager eller andre celler, der vides at være resistente over for de frie an-

I DK 175780 B1 I

I I

tivirale forbindelsers effekter. Yderligere giver forbindelserne præinkuberet med lym- I

I foidceller fuldstændig beskyttelse mod HIV-infektion i op til og udover 48 timer efter I

at lægemidlet er jernet, mens de frie nucleosider ikke giver nogen beskyttelse 24 timer I

efter fjernelsen. Endelig forventes lipidforbindelseme at være nyttige ved behandling af I

I 5 HIV-infektioner forårsaget af stammer af virus, der er resistente over for de frie anti- I

I retrovirale nucleosidanaloger. I

Lipidderivater af antivirale midler har en forlænget antiviral effekt sammenlignet med I

de lipidfrie midler. Derfor giver de terapeutiske fordele som lægemidler, selv når de ik- I

I 10 ke inkorporeres i liposomer. Ikke-liposome lipidderivater af antivirale nucleo- I

! sid-analoger kan påføres huden eller slimhinden eller indføres i det indre af legemet, I

f.eks. oralt, intratrachealt eller på anden måde ad den pulmonale vej, enteralt, rektalt, I

I nasalt, vaginalt, lingualt, intravenøst, intraarterielt, intramuskulært, intraperitonealt, in- I

1 tradermalt eller subkutant. De foreliggende farmaceutiske præparater kan indeholde de I

I 15 aktive middel alene, eller kan indeholde yderligere farmaceutisk værdifulde stoffer. De I

I kan yderligere omfatte en farmaceutisk acceptabel bærer. I

I Farmaceutiske præparater, der indeholder lipidderivater af antivirale nucleosider, frem- I

I stilles ved konventionelle fremgangsmåder til opløsning og lyofilisering til at give et I

I 20 indhold på fra ca. 0,1% til 100%, fortrinsvis fra ca. 1% til 50% af den aktive ingredi- I

I ens. De kan fremstilles som salver, balsamer, tabletter, kapsler, pulvere eller sprøjte-

I præparater sammen med effektive excipienser, vehikler, fortyndingsmidler, duftstoffer I

I eller smagsstoffer for ved brug at gøre dem spiselige eller behagelige. I

25 Præparater til oral indtagelse er i form af tabletter, kapsler, piller, ampuller eller pulve-

riserede aktive midler eller oliebaserede eller vandige suspensioner eller opløsninger. I

I Tabletter eller andre ikke-flydende orale præparater kan indeholde acceptabel excipien- I

I ser, der er kendt inden for fagområdet til fremstilling af farmaceutiske præparater om- H

fattende fortyndingsmidler såsom lactose eller calciumcarbonat, bindemidler såsom ge- I

I 30 latine eller stivelse og et eller flere midler valgt fra gruppen bestående af sødemidler, H

smagsstoffer, farvestoffer eller konserveringsmidler for at give et spiseligt præparat. I

DK 175780 B1 35

Desuden kan sådanne orale præparater belægges ved kendte metoder for yderligere at forsinke desintegrationen og absorptionen i tarmkanalen.

Vandige suspensioner kan indeholde den aktive ingrediens i blanding med farmakolo-5 gisk acceptable ingredienser omfattende suspenderingsmidler såsom methylcellulose og befugtningsmidler såsom lecithin eller langkædede fedtalkoholer. Disse vandige suspensioner kan også indeholde konserveringsmidler, farvestoffer, smagsstoffer og sødestoffer i overensstemmelse med industrielle standarder.

j 10 Præparater til topisk og lokal applikation omfatter aerosol-sprøjtepræparater, lotioner, geler og salver i farmaceutisk passende vehikler, som kan omfatte lavere alifatiske alkoholer, polyglycoler, såsom glycerol, polyethylenglycol, estere af fedtsyrer, olier og fedtstoffer og siliconer. Præparaterne kan endvidere omfatte antioxidanter såsom ascorbinsyre eller tocoferol og konserveringsmidler såsom p-hydroxybenzoesyreestere.

15

Parenterale præparater omfatter specielt sterile eller steriliserede produkter. Der kan tilvejebringes injicerbare præparater, der indeholder den aktive forbindelse og et hvilket som helst blandt de velkendte injicerbare bærestoffer. Disse kan indeholde salte til at regulere det osmotiske tryk.

20

Den terapeutisk effektive mængde af lipidderivateme bestemmes ved reference til de anbefalede doser for det aktive antivirale nucleotid, idet man ved udvælgelse af den passende dosis i et hvilket som helst specielt tilfælde, må have i tankerne at man skal tage hensyn til patientens vægt, almindelige helbred, metabolisme, alder og andre fak-25 torer, der påvirker reaktionen på lægemidlet. Den parenterale dosis vil passende være en størrelsesorden mindre en den orale dosis.

En mere fuldstændig forståelse af opfindelsen vil kunne opnås ved at henvise til de efterfølgende illustrerende eksempler, der dog ikke er tænkt til på uberettiget måde at be-30 grænse opfindelsen.

DK 175780 B1 I

36 I

Eksempel 1

Syntese af l^-dimyristoylglycerophospho-S'-iB'-azido-B'desoxyi-thymidin, monona-

triumsalt I

Fremstilling af dimvristovlphosphatidinsvre fDMPA-H): I

I en 500 ml skilletragt opløstes dimyristoylphosphatidinsyre- dinatriumsalt (1 g, 1,57

mmol) først i chloroform/methanol (rumfangsforhold 2:1, 250 ml) og blandedes om- I

10 hyggeligt. 50 ml destilleret vand sattes til opløsningen og pH-værdien indstil- ledes til I

1 ved tilsætning af koncentreret saltsyre. Opløs- ningen blandede omhyggeligt og chlo- I

roformlaget opsamledes. Chloroformlaget vaskedes tilbage en gang med metha- I

nokvand (rumfangsforhold 1:1,80 ml) og inddampedes under nedsat tryk ved 30°C for I

at give dimyristoylphosphatidinsyre (DMPA-H) som et hvidt skum. Der tilsattes 10 ml I

15 cyklohexan og opløsningen lyofiliseredes til tørhed til opnåelse af 850 mg hvidt pulver, I

som derefter opbevaredes ved -20°C. En dag før koblingsreaktionen opløstes DMPA-H I

(250 mg, 0,42 mmol) i 10 ml cyklohexan i en 50 ml rundbundet kolbe og opløsnings- I

midlet afdampedes under nedsat tryk ved stuetemperatur. Denne proces blev gentaget I

fire gange yderligere, og DMPA-H tørredes yderligere i vakuumovn ved stuetempera- I

20 tur natten over P205 og opbevaredes i en ekssikkator ved -20°C. I

Koblingsreaktion: I

Under argon sattes til den 50 ml rundbundede kolbe indeholdende tørret DMPA-H (250 I

25 mg, 0,42 mmol) tørret 3'-azido-3'-desoxythymidin (AZT), Sigma Chemical, St. Louis,

Missouri, USA, (85 mg, 0,31 mmol, tørret over P2Os under vakuum natten over) og I

2,4,6-triisopropylbenzensulfonylchIorid (315 mg, 1,04 mmol) og 2 ml vandfrit pyridin I

tilsattes via en sprøjte til opnåelse af en klar opløsning. Reaktionsblandingen omrørtes I

ved stuetemperatur i 18 timer. (Reaktionen blev fulgt ved hjælp af tyndtlagskromato-

30 graft). Der sattes 1 ml vand til det rå produkt for at destruere overskud af katalysator og I

opløsningsmidlet afdampedes under nedsat tryk for at give en gul gummi, som derefter I

DK 175780 B1 37 genopløstes i et lille rumfang methanol :chloroform (rumfangsforholdet 1:9), og opløsningen påførtes til en kolonne af silikagel (45 g, Kieselgel 60, Vesttyskland). Kolonnen elueredes med 8% methanol i chloroform. Efter et forløb (kasseret) udvandtes AZT og derefter opnåedes dimyristoylphosphatidyl-3'-azido-3'-desoxythymidin (DMPA-AZT).

5 Fraktionerne indeholdende produktet kombineredes og opløsningsmidlet afdampedes under nedsat tryk. Der sattes 5 ml cyklohexan til remanensen og blandingen lyofilise-redes til tørhed under vakuum over P205 for at give rent DMPA-AZT (270 mg, 0,29 mmol, 95%).

10 Omdannelse til mononatriumsalt:

Til det tørrede DMPA-AZT genopløst i chloroform:methanol (rumfangsforhold 2:1, 30 ml) tilsattes 6 ml destilleret vand, der blandedes omhyggeligt og det vandige lags pH-værdi indstilledes til 1. Chloroformlaget opsamledes, og der tilsattes 10 ml metha-15 nokvand (1:1) og blandedes omhyggeligt. Det vandige lags pH-værdi indstilledes til 6,8 med methanolisk NaOH (0,1 N), der blandedes omhyggeligt, og det vandige lag holdtes på pH 6,8. Den kombinerede blanding af chloroform, methanol og vand inddampedes under nedsat tryk for at give dimyristoylphosphati-dyW-azido-S'-desoxythymidin-mononnatriumsalt. Remanensen genopløstes i chloro-20 fomumethanol (rumfangsforhold 2:1, 2 ml) og acetone tilsattes for at udfælde DMPA-AZT-mononatriumsalt, som yderligere tørredes fra 5 ml cyklohexan for at give et hvidt pulver (220 mg, 0,26 mmol, 78% udbytte baseret på AZT). Smeltepunktet var 230°C; Rf-værdien på silicagel G tyndtlagsplader var 0,32 (chloro-form:methanol:vand:ammoniak 80:20:1:1), Rf = 0,58 (chloro- 25 form:methanol:vand:ammoniak: 70:30:3:2), Rr = 0,31 (chloroform:methanol:vand 65:25:4); UV-absorptionmaksimum 266 nm (10.800); analyse beregnet for C^NjO, 1P1H72, 1 H20: C 57,24,; H 8,44; P 3,61: fondet: C 56,80; H 8,83; P 3,52. MS, m/e 864,60 (M+). Proton-NMR: (CDCL3) δ 0,88 (6H, bt, J=6,9 Hz, acyl CH3), 1,26 (40H, s, acyl CH2), 1,60 (4H, bs, β acyl CH2), 1,94 (3H, s thymin CH3), 2,31 (4H, m 30 a acyl CH2), 2,39 (2H, m, ribose 2Ή), 3,38 (2H, bd, J=12,6 Hz, ribose 5Ή), 3,78 (2H, m sn-3 CH2 glycerol), 4,00 (IH, dd, Jl=12 Hz, J2=6 Hz, sn-1 CH2 glycerol), 4,18 (IH,

I DK 175780 B1 I

I 38 I

I dd, Jl=12 Hz, J2=6 Hz, sn-1 CH2 glycerol), 4,07 (IH, m, ribose 3Ή), 4,41, m, ribose I

I 4'H), 5,24 (IH, m, sn-2 CH glycerol), 7,62 (IH, s, thyrain 6H), 6,21 (IH, t, J=6 Hz, ri- I

I bose ΓΗ). Toparealforholdet mellem phosphatidinsyre og AZT er 1. I

I 5 Eksempel 2 I

I Syntese af l,2-dimyristoylglycerophospho-5'-(3'-desoxy)-thymidin, mononatriumsalt I

I 3'-desoxythymidin blev leveret fra Sigma Chemical, St. Louis, Missouri, USA. Lipid- I

I derivatet af denne analog syntetiseredes under anvendelse af den samme metode, som I

I 10 beskrevet ovenfor i eksempel 1. Smeltpunkt 235°C, Rf på silicagel G 0,25 (chloro- I

form/methanol/vand/ammoniak 80:20:1:1); 0,57 (chloro- I

I form:methanol:ammoniak:vand 70:30:3:2); 0,24 (chloroform:methanol: vand 64:25:4); I

I UV-absorptionsmaksimum 269 nm (é 8.400); analyse: beregnet for I

I C4jN200i]PiH72Na,*lH20: C 58,53; H 8,87; P 3,69; fundet: C 56,75; H 9,33; P 3,58. I

I 15 MS, m/e 823,00 (M+). Proton-NMR: (CDCL3). 0,91 (6H, bt, J=6,8 Hz, acyl CH3), 1,23 I

I (4H, bs, acyl CH2), 126 (4H, bs, acyl CH2), 1,28 (32H, bs, acyl CH2), 1,62 (4H, m, β I

I acyl CH2), 1,97 (3H, s, thymin CH3), 2,05 (2H, m, ribose 2'H), 2,35 (4H, m a acyl I

I CH2), 3,39 (2H, bs, ribose 5Ή), 3,90 (2H, m, sn-1 CH2 glycerol), 4,16 (IH, m, sn-1 I

I CH2 glycerol), 4,24 (IH, m, sn-1 CH2 glycerol), 4,38 (IH, m, ribose 4'H), 5,23 (IH, m, I

I 20 sn-2 glycerol), 6,10 (IH, bt, ribose ΓΗ), 7,68 (IH, s, thymin 6H). Toparealforholdet I

mellem phosphatidinsyre og 2’,3,-didesoxythymidin er 1. I

Eksempel 3 I

Syntese af l,2-dimyristoylglycerophospho-5'-(2',3'-didesoxy)-cytidin I

I 25 I

Fremstilling af 4-acethvl-2l.3,-didesoxvcvtidin: I

Til en under omrøring og tilbagesvalingskogning værende opløsning af I

I 2',3'-didesoxycytidin (DDC) (400 mg, 1,89 mmol) i vandfri ethanol (35 ml, tørret først I

30 med molekylsigtemateriale af Lindytype 4x og 2 gange destilleret over magnesiumspå- I

ner) sattes eddikesyreanhydrid (0,4 ml, 5,4 mmol). I løbet af en tilbagesvalingskog- I

DK 175780 B1 39 ningsperiode på 3 timer tilsattes fire yderligere portioner af 0,4 ml eddikesyreanhydrid med 30 minutters mellemrum. Reaktionen fulgtes ved hjælp af tyndtlagskromatografi (silicagel F254, Kodak Chromagram, fremkaldt med 10% methanol i chloroform). Efter den sidste tilsætning kogtes opløsningen under tilbagesvaling i yderligere 1 time.

5 Reaktionsblandingen afkøledes og opløsningsmidlet afdampedes under nedsat tryk.

Remanensen genopløstes i 8% methanol i chloroform (5 ml) og kromatograferedes på en silicagelkolonne (2,2 cm x 30 cm, Kiselgel 60, 70-230 mesh, EM Science, 45 g).

Kolonnen elueredes med 8% methanol i chloroform for at give rent 4-ace-tyl-2',3’-didesoxycytidin (DDC-OAC) i et udbytte på 80%.

10

Koblingsreaktion:

En dag før koblingsreaktionen opløstes DMPA-H (fremstillet som tidligere beskrevet, 250 mg, 0,42 mmol) i 10 ml cyklohexan i en 50 ml rundbundet kolbe, og opløsnings-15 midlet afdampedes under nedsat tryk ved stuetemperatur. Denne proces blev gentaget fire gange, og DMPA-H tørredes yderligere i en vakuumovn ved stuetemperatur natten over over P205. Under argon sattes der til den 50 ml rundbundede kolbe indeholdende tørret DMPA-H tørret DDC-OAC (85 mg, 0,33 mmol, tørret over P205 under vakuum natten over) og 2,4,6-triisopropylbenzensulfonylchlorid (315 mg, 1,04 mmol), samt 20 vandfrit pyridin (2 ml) gennem en sprøjte for at opnå en klar opløsning. Reaktionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur i 18 timer. (Reaktionen blev fulgt ved hjælp af tyndtlagskromatografi). Der sattes 1 ml vand til blandingen for at destruere overskud af katalysator. Opløsningsmidlet afdampedes under nedsat tryk for at give en gul gummi, som genopløstes i et lille rumfang methanol i chloroform (rumfangsforhold 1:9), og op-25 løsningen påførtes en kolonne af silicagel (45 g, Kieselgel 60, EM Science). Kolonnen blev foroven forsynet med en lille mængde sand (500 mg) for at forhindre, at prøven ! ville flyde ovenpå under eluering. Kolonnen elueredes med 8% methanol i chloroform (1,5 1). Efter et forløb (bortkastet) blev der derpå opnået dimyristoylphosphati-dyl-5'(2',3'-didesoxy)-cytidin (DMPA-DDC). De fraktioner, der indeholdt produktet, 30 blev kombineret, og opløsningsmidlet afdampedes under nedsat tryk. Remanensen blev yderligere tørret med cyklohexan for at give rent DMPA-DDC-OAC (210 mg, 0,21

I

Η

I DK 175780 B1 I

I 40 I

mmol, udbytte 70%). Rf = 0,40 (silicagel GF, 20 x 20 cm, Analtech, chloro- I

I form:methanol:vand:ammoniak i rumfangsforholdet 80:20:1:1). I

I Afblokerine med 9N N1LOH: I

I 5 I

I DDC-OAC-DMPA (40 mg, 0,04 mmol) opløstes i chloroform:methanol (1:1, 2 ml) og I

10 dråber 9N NH4OH tilsattes på én gang. Opløsningen omrørtes ved stuetemperatur i I

I 15 minutter og neutraliseredes derefter hurtigt med iseddikesyre til pH 7. Den neutrali- I

serede opløsning inddampedes til tørhed natten over under nedsat tryk for at give dimy- I

I 10 ristoylphosphatidyl-5'-(2,,3’-di-desoxy)-cytidin (DMPA-DDC, 35 mg, 0,037 mmol). I

I Smeltepunkt: DMPA-ddC blev sønderdelt ved 240°C. Ved tyndtlagskromatografi på I

I silicagel-GF-plader var Rrværdierne: 0,11 (chlorform:methanol:vand:ammoniak I

I 80:20:1:1); 0,38 (chloroform:methanol:ammoniak:vand 70:30:3:2); 0,15 (chloro- I

I form:methanol:vand 65:25:4); UV-absorptionsmaksimum 273 nm ( 5.800). I

I 15 I

I NMR: (CDCL3) o 0,86 (6H, bt, acyl CH3), 1,24 (40H, bs, acyl CH2), 1,57 (4H, m, β I

I acyl CH2), 2,28 (4H, m, α acyl CH2), 3,36 (2H, m, ribose 5Ή), 3,94 GH, bs, sn-3 CH2 I

I glycerol), 4,19 (IH, m, sn-1 CH2 glycerol), 4,29 (IH, m, sn*l CH2 glycerol), 4,40 (IH, I

I bs, ribose 4Ή), 5,19 (IH, m, sn-2 CH glycerol), 5,89 (IH, m, thymin 5-H), 7,44 (IH, I

I 20 bs, thymin NH3), 7,94 (IH, bs, thymin NH2). Toparealforholdet mellem phosphatidin- I

syre og 2',3-didesoxycytidin er 1. I

I Eksempel 4 I

I 25 Syntese af (3'-azido-3'-desoxy)-thymidin-5'-diphosphat-sn-3-(l,2-dipaImito- I

I yl)-glycerol I

Syntese af AZT-monophosphat-morpholidat: I

I 30 Denne forbindelse syntetiseredes ved at følge metoden ifølge AgranofF og Suomi (21). I

I AZT-monophosphat blev omdannet til den sure form ved at føre en opløsning i vand I

DK 175780 Βΐ 41 gennem en kolonne af Dowex 50W (50 x 2-200, 100-200 mesh, Sigma Chemicals, St.

Louis, MO). En opløsning af 117 mg AZT-monophosphat (0,3 mmol) i 3 ml vand overførtes til en tohalset rundbundet kolbe. Der tilsattes 3 ml t-butanol og 0,106 ml frisk destilleret morpholin (1,20 mmol), og blandingen blev anbragt i et oliebad ved 90°C. Fire 5 ækvivalenter dicyklohexylcarbodiimid (249 mg, 1,20 mmol) i 4,5 ml t-butanol tilsattes dråbevis. Reaktionen blev overvåget ved hjælp af tyndtlagskromatografi på silicagel 60, F254, plader (E. Merck, Darmstadt) med chloroform/methanol/eddikesyre/vand (rumfangsforhold 50:25:3:7) som fremkalderopløsningsmiddel. Reaktionen noteredes til at være tilendebragt efter 3 timer. Blandingen afkøledes og efter tilsætning af 4,5 ml 10 vand ekstraheredes der fire gange med 15 ml diethylether. Det vandige lag inddampedes til tørhed og tørredes under vakuum over P205. Produktet blev opnået (199 mg, 100% udbytte) og anvendt til kobling til phosphatidinsyre uden yderligere oprensning.

Kobling af AZT-monophosphat-moroholidat til dinalmitovlphosphatidinsvre: 15

Dipalmitoylphosphatidinsyre, dinatriumsalt omdannedes ti) den fri syre ved at ekstrahere materialet fra chloroform ved metoden ifølge Bligh og Dyer (34) under anvendelse af 0,1 N HC1 som den vandige fase. Chloroformlaget inddampedes til tørhed under vakuum, phosphatidinsyren (196 mg, 0,3 mmol) genopløstes i chloroform og overførtes 20 til beholderen indeholdende AZT-mono-phosphat-morpholidatet. Efter at chloroformen var fjernet under vakuum under anvendelse af en rotationsinddamper, tørredes blandingen ved tilsætning og afdampning af benzen og tørredes til sidst under vakuum over P205. Reaktionen startedes ved tilsætning af 30 ml vandfrit pyridin, og den klare blanding omrørtes ved stuetemperatur. Reaktionen blev overvåget med tyndtlagskromato-25 grafi som noteret ovenfor med chloroform:methanol:ammoniak:vand (rumfangsforhold 70:38:8:2) som fremkalderopløsningsmiddel. Rf-værdien for phosphatidinsyre, AZT-monophosphat-morpholidat og AZT-diphosphat-dipalmitoylglycerol er henholdsvis 0,11, 0,50 og 0,30.

30 Efter 70 timer afdampedes pyridinet og produktet ekstraheredes over i chloroform efter tilsætning af 15 ml vand, 30 ml methanol, 22 ml chloroform og tilstrækkeligt med IN

I DK 175780 B1 Η

i I

I 42 I myresyre til at indstille pH-værdi en på 4,0. De kombinerede chloroformlag efter to eks- fraktioner inddampedes til tørhed, remanensen opløstes i chloro- I form.methanol:ammoniakvand (70:38:8:2) og produktet rensedes ved søjlekromato- I grafi på silicagel i dette opløsningsmiddel under anvendelse af et lufttryk ækvivalent

I 5 med 1 m vandsøjle. Fraktioner der ikke var fuldstændigt rene blev yderligere renset ved I

HPLC på en omvendt-fase-kolonne (Vydac C18) under anvendelse af vandrmethanol I

(rumfangsforhold 8:2) og methanol som elueringsmidler. Fraktioner indeholdende det I

I ønskede produkt inddampedes til tørhed for at give 132 mg af et hvidt fast stof (44% I

I udbytte), som gav en enkelt plet ved tyndtlagschromatografi med silicagel g-plader I

I 10 fremkaldt med chloroform:methanol:ammoniak:vand (70:38:8:2) (Rf= 0,35) og chloro- I

form:methanol:vand (65:35:4)(^=0,54). I

I 500 MHz NMR (CDC13) 5 0,88 (3H, t, J=6,93 Hz, sn-2-acyl CH3), 0,92 (3H, t, J=7,48 I

Hz, sn-l*acyl-kæde CH3), 1,25 (48H, s, CH2 acylkæder), 1,55 (4H, bs, β CH2 I

I acyl-kæder), 1,83 (3H, s, CH3 thymin), 2,25 (2H, t, J=6,97 Hz, 2H, a CH2 I

I 15 sn-2-acyl-kæde), 2,27 (2H, t, J=7,79 Hz, aCH2, sn-l-acyl-kæde), 2,44 (4H, bs, 2' og 5’ I

I H ribose), 3,78 (IH, dd, J=l,68, 5,51 Hz, 3Ή ribose), 3,95 (2H, bs, sn:3 CH2 glycerol), I

I 4,07 (IH, bs, He(Ha sn- 1 CH2 glycerol), 4,13 (IH, bs, IH, sn-2 CH glycerol), 4,36 I

I (IH, bs, Ha/He sn-1 CH2 glycerol), 5,21 (IH, bs, sn-2 CH glycerol), 5,66 (IH, bs, 1Ή I

I ribose), 7,14 (IH, d, J=6,25 Hz, 6H thymin). Forholdet mellem acylkæ- I

20 der:glycerol:ribose:thymin som udledt ud fra de pågældende resonanser udgjorde I

I 2,12:0,93: 0,98:1,00. IR (KBr, plade) viste 2105 (azido), 1745 (C=0 ester) og 1705 I

(C=0 thymin) som identificerbare bånd. I

H Eksempel 5 I

25 Syntese af antiviralt nucleosid-diacylphosphat I

Dihexadecyl-phospho-5'-didesoxycytidin syntetiseres i overensstemmelse med den me- I

tode, der er beskrevet i eksempel 1, bortset fra, at reaktanterne er didesoxycytidin og I

dihexadecylhydrogenphosphat. Udgangsmaterialet dihexadecylhydrogenphosphat syn- I

30 tetiseres ud fra hexadecan-l-ol og phenylphosphordichloridat, som først rapporteret af I

I D. A. Brown et al. (32). I

DK 175780 B1 43

Eksempel 6

Syntese af didesoxyadenosin-diphosphat-ceramid, et antiviralt phosphonucleosid 5 Metoden ifølge eksempel 2 gentages bortset fra, at der anvendes didesoxyadeno-sin-monophosphat-morpholidat i stedet for didesoxycytidin-monophosphat-mor-pholidat. Ceramid-phosphorsyre fremstilles ved indvirkning af phosphoroxychlorid på ceramid. Ceramid-phosphorsyre anvendes i stedet for dimyristoyl-phos- phatidinsyren.

Der opnås tilsvarende resultater.

10

Eksempel 7

Fremstilling af liposomer indeholdende antiretrovirale liponucleotider 6,42 mikromol dioleoylphosphatidylcholin, 3,85 mikromol kolesterol, 1,28 mikromol 15 dioleoylphosphatidylglycerol og 1,28 mikromol dimyristoylphosphati-dyl-azidothymidin blandedes i et sterilt 2,0 ml hætteglas og opløsningsmidlet fjernedes under vakuum i en rotationsinddamper. Ved nogle forsøg blev dimyristoylphosphatidy-lazidothymidin erstattet med enten dimyristoylphosphatidyldidesoxythymidin, dimy-ristoylphosphatidyldides-oxycytidin eller azidothymidin-diphosphat-dimyri-20 stoylglycerol; kontrolliposomer fremstilledes ved at udelade det antivirale liponucleo-tid. Den tørrede film blev anbragt under højvakuum natten over ved stuetemperatur for at fjerne spor af opløsningsmiddel. Lipidfilmen hydrati seredes ved 30°C med 0,3 ml steril 10 mM natriumacetatpuffer (pH 5,0) indeholdende isotonisk dextrose og ampullen blev forseglet. Blandingen underkastedes vortex med mellemrum i 10 minutter ef-25 terfulgt af lydbehandling under anvendelse af en Heat Systems Ultrasonics sonikator med en bægerhomgenerator (43IB) ved udgangskontrolindstilling nr. 9 i 90 til 120 minutter, på hvilket tidspunkt prøven var klaret. Dette lydbehandlede præparat fortyndedes med steril RPMI-puffer og sattes til vævskulturbrønde ved den angivne koncentration.

I DK 175780 B1 I

I 44 I

Eksempel 8 I

I Kobling af monoklonale antistoffer til CD4 til et antiviralt lipidholdigt liposom I

5 Der anvendtes dimyristoylphosphatidyl-AZT fremstillet ved fremgangsmåden ifølge I

I eksempel 1, dimyristoylphosphatidylcholin, kolesterol og dimyristoylphosphati- I

I dylethanolamin i et molforhold på 39:39:20:2. 200 mg af denne lipidblanding tørredes I

under vakuum under anvendelse af en rotationsinddamper til dannelse af en tynd film i I

I en 100 ml rundbundet kolbe. 1 ml sterilt phosphatpufret saltvand tilsattes, og blandin- I

10 gen rystedes forsigtigt ved 20°C i 20 minutter efterfulgt af ti 30 sekunders cykler med I

vortexbehandling til dannelse åf multilamelliposomer. Suspensionen underkastedes 5 I

I cykler ekstrudering gennem to stablede Nucleopore polycarbonatfiltre med poredi arne- I

tre på 200 nm til fremstilling af eri homogen liposompopulation. Der kan anvendes an- I

I dre metoder, såsom lydbehandling, omvendt faseinddampning og brug af en French I

15 presse eller et mikrofluidiseringsapparat (Microfluidics, Newton, Massachusetts). 1 til I

2 mg OKT4a monoklonale antistoffer til CD4· antigen thioleredes ved inkubering med I

I 0,08 mM N-succinimidyl- 3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP). Ubehandlet SPDP I

fjernes ved gelfiltrering gennem Sephadex G25. Det udtømmende (eng.: voiding) I

DTP-protein reduceres med 0,05M dithiothreitol i 0,1M acetatpufret saltvand ved pH I

20 4,5 i 20 minutter, hvilket giver reduceret thioleret antistof. I

I Liposomer fremstillet ved metoden ifølge eksempel 5 repræsenterende 5 mikromol I

I phospholipid inkuberes natten over ved stuetemperatur med 1 mg thioleret antistof i I

H 0,20 ml isotonisk MES/HEPES-puffer, pH 6,7. De resulterende immunliposomer ren- I

25 ses ved den diskontinuerlige metrizimidgradientmetode ifølge Heath et al. (33) og steri- I

liseres ved passage gennem 200 nm filtre. I

* I

DK 175780 B1 45

Eksempel 9

Inhibering af HTV-replikation i vævskulturceller med lipidnucleosidkonjugater A. Metoder 5 Virusinfektion af humane T-celler:

Den humane T-lymfoblastoidcellelinie, CCRG-CEM (i det følgende betegnet som CEM) dyrkedes i RPMI 1640 medium indeholdende 100 U/ml penicillin G, 100 pg/ml streptomycin, 2 mM glutamin og 10% bovin fostersemm (Hyclone Laboratories, ιοί 0 gan, Utah). Celler inficeres med LAV-1-stammen (L. Montagnier, Paris, Frankrig) med mangfoldighed af infektion på en vævskultur 50% infektiøs dosis (TCID50)/celle i 60 minutter ved 37°C i et medium indeholdende 1% polybrene. CEM-celler inficeredes i suspension ved 6 x 104 celler/ml, vaskedes tre gange ved centrifugering og gensuspendering og derefter fordelt i plader med 96 brønde med 6 x 104 celler/brønd før tilsæt-15 ning af medium indeholdende de liposome antiretrovirale liponucleotidlægemidler.

Antiviral aktivitet bestemt ved HIV p24 bestemmelse;

Antiviral aktivitet bestemtes efter 3 dage ved inhibering af produktionen af HIV p24 20 (gag) antigen i det cellefri dyrkningsmedium fra de inficerede celler udsat for forskellige koncentrationer af lægemiddel; p24 antigen måltes ved ELISA (Abbott Laboratories, Chicago, Illinois) i overensstemmelse med fabrikantens instruktioner. Resultaterne er gennemsnittet for to bestemmelser og udtrykkes som procent af en kontrol inhiberet i fravær af lægemidler.

25 i B. Forsøg H533-1: fig. 1

Liposomer indeholdende 10 mol% af enten dimyristoylphosphatidylazidothymidin (LN1), dimyristoylphosphatidyldidesoxythymidin (LN2) eller azidothymi-din-diphosphat-dimyristoylglycerol (LN4) i de angivne koncentrationer afprøvedes for 30 deres evne til at inhibere HIV-replikation i CEM-celler (vildtype) in vitro. Alle disse tre antiretrovirale liponucleotider inhiberede HIV p24 produktion; mængderne af læ-

I DK 175780 B1 I

I 46 I

I gemiddel, der behøvedes til at reducere virusprodukt med 50% (E.D. 50) var som føl- I

ger: I

I Phosphatidylazidothymidin(LNl) 2 μΜ I

I 5 Phosphatidyldidesoxythymidin (LN2) 30 μΜ I

AZT-diphosphat-dimyristoylglycerol (LN4) 8 μΜ I

I ' Dette viser, at lipidderivateme af antiretrovirale nucleotider kan indtræde i CEM-celler I

I og omdannes til aktivt nucleosid som forudset. Kontrolliposomeme (CONT) som ikke I

I 10 indeholdt noget antiretroviralt nucleotid havde ingen virkning på produktion af p24 I

I med CEM-celler. I

I C. Forsøg H747-la: fig. 2. I

I 15 Dimyristoylphosphatidylazidothymidin i liposomer (LN1) blev sammenlignet med det I

I frie azidothymidin (NI). Ved lave koncentrationer under 0,1 μΜ var frit AZT mere ef- I

I 1 fektivt end liponucleotidet. Ved koncentrationer, der ligger fra 1 til 170 μΜ, var I

I phosphatidyl-AZT-liposomeme mere effektive end det frie AZT. Kontrolliposomer I

I (CONT), der kun indeholdt uaktive lipider som angivet under metoder, var ineffektive I

I 20 med hensyn til at reducere p24. I

I D. Forsøg H747-lb: fig. 3. I

I Didesoxythymidin (N2) er en svag inhibitor af HIV p24 produktion. Overraskende er I

I 25 phosphatidyldidesoxythymidin (LN2) noget mere effektivt en det frie nucleosid. Som I

I det fremgår af kurven behøves der en lille smule mere frit ddT til at reducere produkti- I

on af p24 end med phosphatidyldidesoxythymidin. Kontrolliposomer (CONT) med en I

I tilpasset samlet phospholipidkoncentration er uden effekt. I

30 I

ί I

47 | DK 175780 B1 ! E. Forsøg H637-lb: fig. 4.

Ved dette forsøg blev CEM-celler erstattet med mutantceller (leveret af Dr. Dennis Carson, Scripp's Clinic, San Diego, Californien) som mangler thymidinkinaseenzymet 5 (CEM tk‘). Disse celler er ude af stand til at phosphorylere thymidinderivater, og derfor er A2T inaktiv, da det ikke kan omdannes til det aktive triphosphatderivat, som behøves til at inhibere replikation af HIV p24. Som det ses på kurven, er AZT (NI) fuldstændigt uden effekt på produktionen af p24 over et bredt koncentrationsområde (0,2 til 100 μΜ). Imidlertid var både phosphatidylAZT (LN1) og phosphatidylddT (LN2) i 10 stand til at reducere produktionen af p24, hvilket viser, at disse forbindelser metaboli-seres i cellen til nucleosid-monophosphat som igen kan yderligere aktiveres til triphosphatet ved hjælp af andre cellulære enzymer. Disse resultater giver bevis for de principper, der er skitseret i nærværende ansøgning med forudsigelse af direkte metabolisme til nucleosidmonophosphatet.

15

Forsøg H805-1: fig. 5.

Ved dette forsøg sammenlignedes dimyristoylphosphatidyldesoxycytidin (LN3) og di-meristoyldidesoxythymidin (LN2) med virkningerne af frit AZT (N2) og didesoxycyti-20 din (N3) i CEM-vild-typeceller in vitro. PhosphatidylddC var det kraftigste lipo-nucleotid (ED50 =1,1 μΜ) og phosphatdidylddT var mindre aktivt som tidligere anført (ED50 = 20 μΜ). Frie liposomer uden tilsat antiretroviralt nucleotid (CONT) var inaktive.

i i 25 Forsøg 1276: j

Ved dette forsøg blev antiviral beskyttelse tilvejebragt ved forinkubering med dimy-ristoylphosphatidylazidothymidin (LN1) i liposomer fremstillet som beskrevet ovenfor sammenlignet med beskyttelsen opnået med frit azidothymidin (NI). CEM-vildtype-30 celler forinkuberedes i 3 dage under standardbetingelser i RPMI-medium indeholdende 7,14 μΜ af enten frit AZT (NI) eller phosphatidyl-AZT (LN1). Cellerne blev derefter

I DK 175780 B1 I

I 48 I

I vasket to gange med PBS, og der tilsattes frisk RPMl-medium. Hver gruppe af celler I

I blev derpå delt i tre portioner. En portion blev øjeblikkeligt inficeret med HIV som an- I

I givet ovenfor. Efter bortvask af ubundet HIV fik prøven lov til at blive inkuberet i me- I

I diet alene i 3 dage. To andre portioner blev inkuberet i mediet alene i enten 24 eller 48 I

I 5 timer for at give mulighed for at ethvert intracellulært antiviralt middel, der måtte være I

I til stede, ville blive udtømt. Derefter inficeredes de med HIV, cellerne vaskedes frie for I

H virus, og der tilsattes RPMI-medium. Efter 3 dages yderligere inkubering blev de oven- I

stående væsker fra alle portioner afprøvet for tilstedeværelse af p24-protein. I

I 10 Kontrolceller: CEM-celler underkastedes HIV-infektion uden forinkubering, lægemid- I

I del tilsattes efter HIV-infektion som angivet, og cellerne inkuberedes i 3 dage. I

I Forinkuberede celler: CEM-celler forinkuberedes i 3 dage med medium indeholdende I

I AZT (NI) eller phosphatidyl AZT (LN1); efter 3 dage vaskedes cellerne, underkaste- I

15 des HIV-infektion efterfulgt at tilsætning af medium uden lægemidler. Efter en yderli- I

gere inkubering i 3 dage måltes p24. I

Resultater: I

p24: ng/ml I

20 efter 3 dages I

CEM-kontrolprøver: Ingen forinkubering inkubering I

I HIV-infektion alene 204; 207 I

I HIV + 7,14 μΜ azidothymidin (NI) 64; 69 I

I HIV+ 7,14 μΜ phosphatidyl-AZT (LN1) 16; 16 I

DK 175780 B1 49

Forinfektions- p24: ng/ml interval uden efter 3 dages CEM-forinkuberede celler lægemiddel inkuberine 5 7,14 μΜ azidothymidin (NI) 24 timer 404; 433 48 timer 271; 245 7,14 μΜ phosphatidylAZT (LN1) 24 timer 6; 7 48 timer 4; 15 10 Efter forinkubering i 3 dage efterfulgt af 48 timers inkubering i normalt medium efter fjernelse af lægemidlerne gav phosphatidyl*AZT fuldstændig beskyttelse mod replika-tion af HIV som bestemt ved reduceret produktion af p24. Imidlertid kunne forinkubering med AZT ikke beskytte cellerne mod HIV-infektion 24 og 48 timer efter fjernelse af lægemidlet.

15

Eksempel 10 HIV-parret isolat: antiviral følsomhed IC50, μΜ; HT4-6C-plakreduktionsbestemmelse.

Metoder: HT4-6C-celler (CD4+ HeLa-celler) blev leveret fra Dr. Bruce Chesebro, 20 Rocky Mountain National Laboratories, Hamilton Montana, og inficeret med HIV-i sol ater som angivet i eksempel 9. Efter inkubering i 3 dage vaskedes cellerne, fikseredes og farvedes med krystalviolet og antallet af plak blev talt. Kliniske prøver af HIV isoleredes før AZT-behandling (pre) og 6 og 12 måneder efter AZT-behandling (post). (D. D. Richman, B. Larder og G. Darby, manuskript fremsendt til publikation, 25 1989). Under anvendelse af HT4-6C-plakreduktionsbestemmelse bestemtes følsomhe den hos de parrede kliniske isolater under anvendelse af enten AZT, phosphatidyl-AZT eller phosphatidyl-ddT.

i

I DK 175780 B1 I

I I

I Isolat AZT p-AZT pddT I

I A012 . I

I 5 Pre (G762-3) 0,01 0,53 4,2 I

I Post (G691-2) 2 0,37 6,6 I

I A018 I

I Pre (Hl 12-2) 0,01 0,47 7,4 I

I 10 Post (G910-g) 4 0,59 6,3 . I

I A036 I

I Pre (G174-6c) 0,007 0,42 7,4 I

I Post (G704-2) 5,6 0,59 4,2 I

I 35 I

I PCP022 I

I Pre (Hl 12-5) 0,03 0,47 4,2 I

I Post (G7S0-1) 5,6 1,05 6,6 I

I 20 PCP026 I

I Pre (Hl 12-6) 0,01 0,33 6,6 I

I Post (G890-1) 2,8 0,74 2,6 I

25 Forkortelser: pAZT, phosphatidylazidothymidin, I

pddT, phosphatidyldidesoxythymidin. I

Post-AZT-behandling, alle 5 isolater udviste udtalt nedsættelse i følsomhed for AZT. I

Dette sås iklce at forekomme med pAZT og pddT, hvilket viser, at post-AZT-isolateme I

H 30 bibeholder deres sædvanlige følsomhedsniveau over for antiretroviralt nucleosid indgi- I

vet i form af hidtil ukendte phospholipidderivater. I

DK 175780 B1 51

Eksempel 11

Syntese af pbosphatidylacyklovir og effektivitet i herpes simplex virus-inficerede WI-38-celler 5

Dimyristoylphosphatidinsyre (dinatriumsalt) blev leveret af Avaiiti Polar Lipids, Birmingham, Alabama, USA, og omdannet til den fri syre (DMA-H) som beskrevet ovenfor i eksempel 1. Acykloguanosin (acyklovir, Zovirax®) blev leveret fra Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, og 73 mg (0,32 mmol) tørredes natten over over 10 phosphorpentoxid i en vakuumovn. 250 mg DMPA-H (0,42 mmol) sattes til en 50 ml uindbundet kolbe og tørredes natten over over phosphorpentoxid i en vakuumovn. Under tør argon sattes 73 mg acykloguanosin, 315 mg (1,04 mmol) triisopropylbenzensul-fonylchlorid (Aldrich, Milwaukee, WI) og 2 ml tør pyridin (Aldrich, Milwaukee, WI) til den rundbundede kolbe. Reaktionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur i 18 ti-15 mer efterfulgt af tilsætning af 1 ml destilleret vand.

Opløsningsmidlet afdampedes under vakuum for at give en gul gummi, som genopløstes i et lille rumfang chloroform:methanol (9:1) og påførtes en kolonne af silicagel (45 g; Kieselgel 60, EM Science, Cherry Hill, JN). Kolonnen elueredes med 8% methanol i 20 chloroform (500 ml), 10% methanol i chloroform (250 ml) efterfulgt af 15% methanol i chloroform (1,5 1). Efter et forløb på 1,5 1 (som kastedes bort) opnåedes dimy-ristoylphosphatidylacykloguanosin (pACV). Tre fraktioner opsamledes og analyseredes: fraktion 1 (200 ml, 130 mg pACV) fortsat ren pACV; fraktion 2 (200 ml, 150 mg) og fraktion 3 (200 ml, 50 mg) indeholdt pACV og små mængder af udgangsmaterialet 25 som urenheder. Fraktion 1 koncentreredes under vakuum og til remanensen sattes 5 ml cyklohexan. Opløsningen blev frosset og lyofiliseret til tørhed under phosphorpentoxid for at give rent phosphatidylacykloguanosin (80 mg, 0,1 mmol).

Den rensede forbindelse gav en enkelt plet med en Rrværdi på 0,29, når den blev på-30 ført K6G-silicagelplader (Whatman International, Maidstone, England) fremkaldt med chloroform:methanol:vand:ammoniak (rumfangsforhold 70:30:1). UV-absorptionen I DK 175780 B1 var maksimal ved 256 ran (extinktionskoefficient = 8,4 x 103 i CHC13). Phosphorpro- I I centen var 3,30% (teoretisk 3,89%) og smeltepunktet var 245°C. Ved HPLC-analyse I gav phosphatidylacykloguanosin en enkelt top med en retentionstid på 11 minutter I (Spheri-5; Brownlee Labs, Applied Biosystems, Santa Clara, CA) når der elueredes I 5 med en mobil fase af l-propanol:0,25 mM kaliumphosphat:hexan:ethanol:eddikesyre I (rumfangsforhold 245: 179:31:50:0,5) ved en strømningshastighed på 0,5 ml/min.

Cellekulturer

H

10 WI-38-celler blev leveret fra American Type Culture Collection (Rockville, Maryland Η 20852, USA) og dyrket i Dulbecco's minimale essentielle medium (DMEM) med 10%

kalvefosterserum (FCS). Cellerne dyrkedes i 250 cm3 kolber, indtil sammenløb var nå-H

et I 15 Virus I Herpes simplex virus (HSV) type 1 (HSV-1) og type 2 (HSV-2) blev leveret fra the

American Type Culture Collection. Begge virusstammer var fremstillet i Wi-38-celler; I

omfattende cytopatiske effekter (CPD) blev iagttaget, når stamvirusen hostedes ved en I

Η I 20 enkelt gang frysning og optøning, og celledebris klaredes ved centrifugering ved lav I

hastighed (2000 o/m). De ovenstående væsker indeholdende virusen blev i lige store I

portioner anbragt i små hætteglas og opbevaret ved -80°C. Begge stammer HSV-1 og I

HSV-2 blev titreret i Wi-38-celler før anvendelse ved forsøgene. I

H 25 Plakreduktionsbestemmelse med herpes simplex virus I

Plakreduktionsbestemmelsen blev anvendt til at måle den anti-virale effekt af phospha- I

tidylacyklovir eller frit ACV. Wi-38- celler blev trypsiniseret med 0,25% trypsin i 5 I

H minutter. Cellerne høstedes og centrifugeredes for at fjerne tilbageværende trypsin og I

H 30 cellebundfaldet gensuspenderedes i DMEM med 10% FCS. Wi-38-celleme blev ud- I

H strøget på en plade med 96 brønde (5x10 celler/brønd) i 1 time. De inficerede celler I

DK 175780 B1 53 blev derefter behandlet med phosphatidylacyklovir eller ACV. De anti-virale midler fremstilledes i stamopløsninger, som derefter fortyndedes to gange med 2% FBS i DMEM indeholdende 0,5% methylcellulose. 100 μΐ af hvert fortyndet antiviralt middel sattes til hver brønd med HSV-inficerede celler.

5

Kontrolprøveme og de lægemiddelbehandlede cellekulturer inkuberedes i en 37°C in-kubator med 5% carbondioxid i 24 timer. Når HSV-inficerede celler (kontrolprøver uden antiviralt middel) udviste aflæselige antal af plak, blev hele pladen fikseret med methanol og farvet med 1% krystalviolet i 10 minutter. Farvestoffet skylledes fra med i i 10 ledningsvand, og pladen tørredes og antallet af plak blev talt. Den antivirale effekt af ACV eller phosphatidylacyklovir bestemtes ved måling af plak-reduktion som vist i eksemplet nedenfor.

Resultater: Virkning af acyklovir og phosphatidylacyklovir på 25 plakdann.else med HSV-1 i WI-38-celler

Acyklovir 1 2 middel- % i forhold til kone. (μΜ)__vaerdi_uden legemiddel 10 000 0 5 0 0 0 0 2,5 000 0 1,25 43 3,5 13 0,625 867 26 ?n 0,31 17 19 20 65 0,155 18 22 20 73 0 20;3 0 30;30 27,5 100

Phosphatidyl- l 2 middel- % i forhold til ACV fuM)_____ vardi_uden lægemiddel 214 toksisk toksisk 107 0 0 0 0 54 0 0 0 0 25 27 2 3 2,5 9 13,4 465 18 6,7 6 9 7,5 27 3,3 10 12 11 40 1,67 17 20 18,3 67 0,84 24 26 25 91 0 20;30 30;30 27,5 100 !

I DK 175780 B1 I

I I

I De ovenfor viste resultater viser, at phosphatidylacyklovir er effektiv i Wi-38-celler in- I

I ficeret med HSV-1. Den koncentration som giver 50% inhibering er 2 μΜ mod 0,4 μΜ I

I for acyklovir. Tilsvarende resultater blev opnået med Wi-38-celler inficeret med I

I HSV-2. I

Μ I

I DK 175780 B1 55

Referencer 1. Richman, D.D., Kornbluth, R.s, and Carson, D.A. (1587) J. Exp. Med., 166: 1144-1149.

2. Fischl, M.S., Richman, D.D., Grieco, M.H., et al., ! (1987) New Eng. J. Med., 317: 185-191.

3. Richman, D.D., Fischl, M.A., Grieco, M.H., et al., (1987) New Eng. J. Med., 317: 192-197.

4- Bangham, A.D., Standish, M.M. and Watkins, J.C. (1965) 10 J. Mol. Biol., 23: 238-252.

5. Black, C.D.V., Watson, G.J. and Ward, R.J. (1977)

Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 71: 550-552.

6. Alving, C.R., Steck, E.A., Chapman, W.L., Waits, V.3.,

Hendricks, L.D. Swartz, G.M. and Hanson, W.L. (1978) Proc.

15 Nati. Acad. Sci. USA 75: 2959-2963.

7. Lopez-Berestein, G. (1986) Ann. Int. Med. , 102: 694-699.

8. Herman, E.H., Rahman, A., Ferrans, V.J. Vick, J.A. and Shein, P.S. (1983) Cancer Res., 43: 5427-5432.

20 9- Ostro, M. (1987) Sci. Am. 256: 103-111.

10. Salahuddin, S.Z., Rose, R.M., Groopman, J.E.,

Markham, p.D. and Gallo, R.C. (1985) Blood, 68: 281-234.

11. Koenig, S., Gendelman, H.E., Orenstein, J.M. Dalcanto, M.C. Pezeshkpur, G.H., Yungbluth, M. Janotta, F. , Aksmit, 25 A., Martin, M.A. and Fauci, A.S. (1986) Science, 233: 1089- 1093.

12. Post, G., Kirsch, R. and Koestler, T. (1984) in Liposome Technology, Vol. Ill, G. Gregoriadis, Ed., CRC Press, Boca Raton, p. 1-28.

13. Scherphof, G. (1986) in Lipids and Biomembranes, Past, 30 Present and Future, op den Kamp, J., Roelofsen, B. and

Wirtz, K.W.A., Eds., Elsevier North Holland, Amsterdam, p.

113-136.

14. Norley, S.G., Huang, L. and Rouse, B.T. (1987) j.

Immunol., 136: 681-685.

35 15. Kond, M., Alving, C.R., Rill, w.L., Swartz, G.M. and

Cannonico, P.P.G. (1985) Antiroicrob. Agents Chemother. 27: 903-907. 1

Matsushita, T., Ryu, E.K., Hong, C.I. and MacCoss, M.

(1981) Cancer Res., 41: 2707-2713. i

I 5ς DK 175780 B1 I

I Referencer I

I 17. Ho. D.W.H. and Neil, B.L. (1577) Cancer Res., 37: I

1640-1643. I

I IS. Hkång, A., Huang, L. and Kennel, S.J. (1980) J. Biol. I

5 Chem. 255: 8015-801S. - I

I 19. Lesé'fftan, L.D., Barbet, J. and Kourilsky, F. (1980) I

NatureJ 288: 602-602. I

I 20. Toorchen, D. and Topal, M.D. (1983) Carcinogenesis, 4: I

1591*1597. I

I ίο I

21. Agranoff, B.W. and Suomi, W.D. (1963) Biochem. Prep., I

10: 46*51. I

I 22. Prottey, C. and Havthorne, J.N. (19 67) Biocher.. J., I

105: 375-352. I

I 23. Poorthuis, B.J.H.M. and Hostetler, K.Y. (1976) I

15 Biochim. Biophys. Acta, 431: 408-415. I

H 24. ter Scheggett, J., van den Bosch, H., van Baak, M.A., I

Hostetler, K.Y. and Borst, P. (1971) Biochim. Biophys. I

Acta, 239: 234-242. I

25. Rittenhouse, H.G., Seguin, E.B., Fisher, S.K. and I

20 Agranoff, B.W. (1981) J. Neurochem., 36: 991-999. I

26. Olsen, F., Hunt, c.A. Szoka, F.C., Vail, k.j. and I

Papahadjopoulos, D. (1575) Biochim, Biophys. Acta, 557: 5- I

23. . I

27. Szoka, F., and Papahadjopoulos, D. (1978) Proc. Nat. I

Acad. Sci. 75: 4194-4198. I

25 I

28. Mayhew, E., Lazo, R., Vail, W.J., King, j.f Green, I

A.K. (1984) 775: 169-175. I

29. Kim, S., Turker, M., Chi, E., et al., Biochim. I

Biophys. Act, 728: 339:348. I

30 30. Mayer, L.D. . , Hope, M.J. and Cullis, P.R. (1986) I

3iochim. Biophys. Acta, 858: 161-168. I

31. Fukanga, M., Miller, M.K., Hostetler, K.Y. and Deftos, I

L.J. (1984) Endocrinol. 115: 757-761. I

32. Brown, D.A., Malkin T. and Maliphant, G.K. (1955) J. I

Cher. Soc. (London) pp. 1584-1588. I

H 33. Heath, T.D., Lopez, N.G., Piper, J.R., Montgomery, I

J.A., Stern, W.H. and Papahadjopoulos, D. (1986) Biochim. I

Biophys. Acta, 862: 72-30. I

DK 175780 B1 57

Referencer 34. Bligh, E. and Dyer, W. (1959) Canad. J. Biochem. Physiol. 37:911*917.

5 35. Rosenthal, A.F. and Geyer, R.P. (1960) J. Biol. Chem. 235:2202.

36. European Patent Application No. EP-A-0122151.

37. RycesE.K. et al. (1982) J. Med. Chem. 25:1322-1329.

10 38. European Patent Application No. EP-A-0262876.

39. British Patent Application No. GB-A-2168350.

Claims (12)

1. Anvendelse ved fremstilling af en sammensætning til behandling af en viral eller I retroviral infektion hos et pattedyr af en liponucleotidforbindelse, der omfatter et konjugat I af en antiviral nucleosid-analog, der ikke forekommer naturligt hos det pattedyr, der skal 10 I behandles, og som er karakteriseret ved evnen til at udvise antiviral aktivitet på DNA- eller I RNA-vira, og en lipidrest bundet til nucleosid-analogens 5-stilling, hvor konjugatet har I formlen I I 15 (L)m-(W)n-A-Q-Z hvor I Z er nucleosid-analogens basedel; I I 20 I I Q er en pentoserest eller et acyklisk fragment deraf eller en carbocyklisk analog; I I A er O eller S; I 25. er phosphat; I n er l til 3; I 59 DK 175780 B1 i j og L er en lipidrest, hvor m = 1 til 5; hvor L er bundet direkte til W, og hvor L er valgt blandt Η,-C-R, CH=CH-(CI12),:-CHj H,C-R, i . I HC-R, ; HCOH ; og HC-R, ! I H.-C - RC(0)NH-CH (CHj);-N-(CH:),- I © HjC * hvor R, Rj og R2 uafhængigt har fra 0 til 6 steder med umættethed, og har strukturen 1 CH3-(CH2)a-(CH=CH-CH2)b-(CH2)c-Y 5 hvor summen af a og c er fra 1 til 23; og b er 0 til 6; og hvor Y er -C(0)0-, -C-O-, -C=C-0-, -C(0)S-, -C-S-, eller -OC-S-.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor den ikke-naturligt forekommende nucleosid-kompo-nent er en analog af en naturligt forekommende base eller pentose ved substitution, udeladelse eller erstatning. 1 2 3 4 5 6

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor pentoseresten er et 2\3'-desoxy-, 2',3'- 2 didesoxy-2',3'-dideshydro', azido- eller halogenderivat af ribose, eller et acyklisk hydroxy- 3 leret fragment af ribose. 4

4. Anvendelse ifølge krav 1-3, hvor gruppen A-Q-Z er valgt fra gruppen bestående af 5 2',3'-didesoxycytidin; 6 2',3'-didesoxythymidin; 2',3'-didesoxyguanosin; 2',3'-didesoxyadenosin; 2',3'-didesoxyinosin; I DK 175780 B1 I 60 2,6-diaminopurin-2\3'-didesoxyribosid; I 2\3'-didesoxy-2\3'-dideshydrothymidin; I 2',3,-didesoxy'2',3'-dideshydrocytidin-carbocyklisk; I 2',3'-didesoxy-2\3'-dideshydroguanosin; 5 3'-azido-3’-desoxythymidin; 3'-azido-3'-desoxyguanosin; 2,6*diaminopurin-3,-azido-2',3'-didesoxyribosid; I 3'-fluor-3,-desoxythymidin; I 3'-fluor-2’s3'-didesoxyguanosin; 10 2',3,-didesoxy-2'-fluor-ara-adenosin; 2,6-diaminopurin-3,-fluor-2',3’-didesoxyribosid; 9-(4'-hydroxy-r,2’-butadienyl)adenin; 3*(4’-hydroxy-r,2'-butadienyl)cytosin; 9-(2-phosphonylmethoxyethyl)adenin; 15 3-phosphonomethoxyethyl-2,6-diaminopurin; acyclovir eller ganciclovir.

5. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor nucleotid*forbin- delsen er til stede i en liposom eller er i stand til i sig selv af danne en liposom.

6. Antiviral eller antiretroviral liponucleotid med formlen I (L)m-(W)n-A-Q-2 hvor I Η Z er basedelen af en nucleosid-analog; I H Q er en pentoserest eller et acyklisk fragment deraf eller en carbocyklisk analog; I DK 175780 B1 61 A er O eller S; W er phosphat, n er 1 til 3; L er en lipidrest; 5. er 1 hvor lipidresten er valgt blandt Η,-C-R, CM=CH-(CH,),:-CHj H.C-R, ' i 1 .1 HC - R-. : HCOH ’ °s HC - I ‘ I 1

7. Forbindelse ifølge krav 6, hvor gruppen A-Q-Z er valgt blandt nucleosideme omfat- I tende H 15 2',3’-didesoxycytidin; 2',3’-didesoxythymidin; 2',3'-didesoxyguanosin; I 2',3'-didesoxyadenosin; I 2',3'-didesoxyinosin; I 20 2,6-diaminopurin-2',3'-didesoxyribosid; I H 2,,3'-didesoxy-2',3'-dideshydrothymidm; I 2,,3'-didesoxy-2',3'-dideshydrocytidin-carbocyklisk; I H j 2’,3,-didesoxy-2’,3'-dideshydroguanosin; I 3'-azido-3'-desoxythymidin; I 25 3'-a2ido-3'-desoxyguanosin; I 2,6-diaminopurin-3’-azido-2,,3,-didesoxyribosid; I I 3'-fluor-3’-desoxythymidin; I I 3'-fluor-2',3'-didesoxyguanosin; I 2,,3'-didesoxy-2’-fluor-ara-adenosin; I 30 2,6-diaminopurin-3'-fluor-2’,3,-didesoxyribosid; I 9-(4'-hydroxy-r,2'-butadienyl)adenin; I 3-(4'-hydroxy-r,2'-butadienyl)cytosin; I H 9-(2-phosphonylmethoxyethyl)adenin; I B 63 DK 175780 B1 3 -ph ospbonomethoxy ethyl-2,6-di aminopurin; acyclovir eller ganciclovir.

8. Forbindelser ifølge krav 6 valgt fra gruppen bestående af 5 phosphatidyl(3'-azido-3'-desoxy)thymidin (pAZT); phosphatidyl(2\3'-didesoxy)cytidin (pddC); phosphatidyl(2\3'-didesoxy)thymidin (pddT); ! (3'-azido-3'-desoxy)thyinidindiphosphatdiglycerid (AZTdpdg); phosphatidylacyclovir (pACV); 10 l-0-stearylglycero-rac-3-phospho-5'-(3'-azido,3'-desoxy)thymidin.

9. Liposom dannet i det mindste delvis ud fra en liponucleotidforbindelse omfattende et konjugat af en antiviral nucleosid-analog, der ikke forekommer naturligt i det pattedyr, der skal behandles, og som er karakteriseret ved evnen til at udvise antiviral aktivitet på DNA- eller RNA-vira, og en lipidrest bundet til nucleosid-analogens 5'-stilling, hvor 15 konjugatet af formlen (L)„r(W)n-A-Q-Z hvor Z er nucleosid-analogens basedel; Q er en pentoserest eller et acyklisk fragment deraf, eller en carbocyklisk analog; 20. er O eller S; j j W er phosphat; I DK 175780 B1 I I I I n er 1 til 3; I I og L er en lipidrest, hvor m = 1 til 5; hvor L er bundet direkte til en W, og hvor L er valgt I I blandt I I Hj-C-R, CH=CH-(CH2),2-CH3 H2C~R, I I I HC-R2 HCOH ; og' HC-R2 I I H2-C - RC(0)NH-CH (CHjli-N-iCH,),- I ©. I I h2c - hvor R, R, og R2 uafhængigt har 0 til 6 steder med umættethed og har strukturen I I 5 CH3-(CH2)a-(CH=CH-CH2)b-(CH2)c-Y I I hvor summen af a og c er fra 1 til 23; og b er 0 til 6; og hvor Y er -C(0)0*, -C-O-, I I -C=C-0-, -C(0)S-, -C-S-, eller -OC-S-. I

10. Liposom dannet i det mindste delvis ud fra et liponucleotid ifølge formlen i krav 6. I I I

10 -OC-O-, -C(0)S-, -C-S-, eller -C=C-S-, med den betingelse, at forbindelsen er i form af en liposom, når pentoseresten er arabino-furanose og basedelen er cytosin eller adenin, med den betingelse, at når lipidet er en 1,2-diradylglycerol og bindeleddet er 3-monophos-phat, er nucleosid-analogen ikke 5-fluor-uridin, 5-fluorcytidin, bredinin, tubercidin, 15 arabinosyl-cytosin, arabinosyl-5-fluorcytosin, arabinosyl-5-fluorcytosin, arabinosyl-adenin, arabinosyl-thymin, 5-fluor-2'-desoxyribo-uridin eller neplanocin A; med den betingelse, at når lipidresten er 1,2-diradyl eller 1,3-diradylglycerol og bindeleddet er monophosphat, er nucleosidet ikke cytidin, uridin, arabinosylcytosin, adenosin, I DK 175780 B1 I 62 I guanosin, cyclocytidin, desoxyadenosin, desoxycytidin, desoxyguanosin, desoxythymidin, desoxyuridin eller inosin; I med det forbehold, at når lipidresten er 1,2-di-O-acylglycerol og bindeleddet er 3-diphos- I phat, er nucleosidet ikke cytidin, arabinosylcytosin, arabinosyladenin, 7-desazaadenosin; I 5 med den betingelse, at når lipidresten er 1,2-di-O-alkylglycerol og bindeleddet er 3-diphos- I phat, er nucleosidet ikke arabinosylcytosin; med den betingelse, at når lipidresten er l,2-di*0-acyl glycerol og bindeleddet er mono- phosphat, er nucleosidet ikke arabinosylcytosin; I og med den betingelse, at når lipidresten er l-O-alkyl-2-O-acylglycerol, sukkerarten er I 10 ribose, 2’-desoxyribose, arabinose eller 2',2’-dihydroxyribose og bindeleddet er diphosphat, I indeholder nucleosidet ikke en base, som er adenin, cytosin, 5-fluoruracil, 5-azacytosin, I 6-mercaptopurin eller 7-desazaadenin.

11. Farmaceutisk sammensætning omfattende en liponucleotidforbindelse ifølge krav 6 I I 10 og en farmaceutisk acceptabel bærer. I

11,-C - RC(0)NH-CH (CH,VN*(CH,);- i Θ H,C - hvor R, R, og R2 uafhængigt har fra 0 til 6 steder med umættethed og har strukturen CH3-(CH2)a-(CH=CH-CH2)b-(CH2)c-Y hvor summen af a og c er fra 1 til 23; og b er 0 til 6; og hvor Y er -C(0)0-, -C-O-,

12. Farmaceutisk sammensætning omfattende en liponucleotidforbinelse ifølge krav 6 og I mindst én yderligere antiviral forbindelse sammen med farmaceutisk acceptable bærere. I