PT91101B - Processo de preparacao de derivados lipidos de nucleosidos antivirais, de suspensoes de lipossomas e de composicoes farmaceuticas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 91 101

REQUERENTE: VICAL, Inc., norte -americana, com sede em

9373 Towne Center Drive, San Diego,CA 92121, Estados Unidos da América.

EPÍGRAFE: PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE DERIVADOS LlPI

DOS DE NUCLEÔSIDOS ANTIVIRAIS,DE SUSPENSQES DE LIPOSSOMAS E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS .

INVENTORES: Karl Y.Hostetler, Raj Kumar e Louise M. Stuhmiller.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América, em 07 de Julho de 1988, 06 de Março de 1989 e em 28 de Junho de 1989 sob os n*s 216,412 e 319,485, 373.088.

INPI MOO 113 RF 15732 «*z

Processo de preparação de derivados líp_i dos de nucleósidos antivirais, de suspen s&es de lipossomas e de composições farma cê titicas

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CASE: VICAW-CRI-Portuga 1

S,

PATENTE K5. 91 1C1 para que

VICAL, Inc., pretende obter privilégio de invenção em Portugal.

RESUMO presente invento refere-se ao processo de preparação de compostos para o tratamento de SIDA, herpes e outras infecções virais por meio de derivados lípidos de agentes an tivirais. Cs compostos consistem em análogos de nucleósidos possuindo actividade antiviral, que estão ligados, geralmente através de um grupo fosfato na posição 5’ do resíduo pentose, a um de um grupo seleccionado de lípidos. 0 processo compreende o passo de reagir um nucleósído antiviral, possuindo um grupo ribose hidroxilo, com um fosfolípido na presen ça de um reagente de acoplamento, pelo que o referido nucleósido é ligado ao referido fosfolípido por uma ligação fosfa_ to na posição do referido grupo ribose hidroxilo compreenden do um análogo de nucleósído possuindo uma porção base compreendendo uma purina ou pirimidina ou seu análogo, e uma porção açúcar compreendendo um resíduo pentose, onde pelo menos uma das referidas porções é um componente nucleósído que não ocorre naturalmente; e uma porção lípido ligada ao referido resíduo pentose; com a condição do referido composto estar na forma de um lipossoma quando o referido resíduo pentose é ara-

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A/

-1 abinose e a referida porção base é citosina ou adenina.

A natureza lipofílica destes compostos proporciona vantagens em relação ao uso do análogo de nucleósido sozinho. Torna também possível incorporá-los na estrutura lamelar de lipossomas, quer sózinhos quer combinados com molécu las semelhantes. Na forma de lipossomas, estes agentes anti_ virais são preferencialmente retidos por macrófagos e monócitos, células que se verificou ancorarem o vírus HIV alvo.

A especificidade de sítio adicional pode ser incorporada nos lipossomas com a adição de ligandos, tal como anticorpos monoclonais ou outros pêptidos ou proteínas que se ligam a pro teínas virais. Os análogos de nucleósido eficazes são dideso xinucleósidos, azidotimina (AZT) e aciclovir; grupos lipidos podem ser glicolípidos, esfingolípidos, fosfolípidos ou ácidos gordos. Os compostos persistem, após hidrólise intracelu lar, como nucleósidos antivirais não fosforilados. Os compos tos são eficazes no melhoramento da eficácia dos análogos de nucleósido antivirais por prolongarem a actividade antiviral depois da administração da droga ter terminado, e na presença da replicação retroviral em infecções por HIV que se tornaram resistentes à terapia com formas convencionais dos agentes anti-retrovirais.

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MEMÓRIA DESCRITIVA

Antecedentes do invento presente invento refere-se na generalidade ao trata_ mento de infecções virais usando derivados lípidos de análogos de nucleósidos antivirais. Mais particularmente_r o presen te invento refere-se a derivados lípidos e, especialmente,fos folípidos de análogos de nucleósidos antivirais modificados, que podem ser integrados na estrutura de lipossomas, formando, /' assim, um complexo lipossómico mais estável que pode distribuir maiores quantidades de drogas a células alvo, com menor toxicidade.

As publicações e outros materiais de referência aqui re feridos sSo incorporados por referência e estão listados, por conveniência, na bibliografia anexa no final desta descrição.

Nos anos mais recentes tem havido muito interesse no uso de análogos de nucleósidos para tratar infecções virais.

Um nucleósido consiste numa base pirimidina ou purina que está ligada a ribose, um açúcar com cinco carbonos possuindo uma es trutura cíclica, os análogos de nucleósidos antivirais assemelham-se estreitamente aos nucleósidos naturais e são concebidos para inibir as funções virais por evitarem a síntese de no vo ADN ou ARN. Os nucleósidos sao reunidos enzimaticanente em ADN ou ARN.

Durante a síntese de ADN, os trifosfatos de nucleósido livres (nucleósidos com três grupos fosfato ligados) reagem com a extremidade de uma cadeia de ADN em crescimento. A reacção envolve a ligação do grupo fosfato na posição 5', no trifosfato de nucleósido de chegada, com o grupo hidroxilo na posi ção 3’ do anel do açúcar na extremidade da cadeia de ADN em formação. Os outros dois grupos fosfato são libertados durante a reacçao, resultando assim na adição de um nucleótido â cadeia de ADN.

Os análogos de nucleósidos são compostos que imitam os nucleósidos que ocorrem naturalmente de modo suficiente pelo

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-3que são capazes de participar na síntese de ADN virai. Contudo os análogos de nucleosidos antivirais têm diferenças na estru tura química estrategicamente localizadas, que inibem as enzi mas virais, tais como a transcriptase inversa ou que evitam síntese de ADN posterior logo que o análogo tenha sido ligado a cadeia de ADN em crescimento.

Os didesoxinucleósidos são compostos antivirais aos quais faltam os grupos hidroxilo, normalmente presentes na segunda e terceira posição de ribose. Quando um didesoxinucle6sido é incorporado numa cadeia de ADN em crescimento, a ausên cia do grupo 3-OH no seu grupo ribose torna impossível ligar outro nucleótido e a cadeia é terminada, os didesoxinucleósidos são particularmente úteis no tratamento de infecções retrovirais, nas quais a replicação virai necessita da transcri ção de ARN virai em ADN por transcriptase inversa virai. Outros análogos de nucleósidos incluem análogos de desoxinucleó sidos e nucleósidos possuindo apenas um fragmento de ribose ou outra pentose ligado à molécula de base.

síndroma da imunodeficiência adquirida (SIDA) é causado pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). 0 HIV infec ta células transportando o antigénio de superfície CD4 (T4), tais como os linfócitos helper CD4⁺, os monócitos e macrófa gos CD4⁺ e vários outros tipos de células CD4⁺. A infecção por HIV de linfócitos CD4⁺ resulta na citólise e na morte de células que contribui para a imunodeficiência de SIDA; contudo, os monócitos e macrófagos CD4⁺ podem nao ser muito danifí. cados pelo vírus. A replicação virai nestas células parece ser mais prolongada e menos citotóxica do que em linfócitos e, como resultado, os monócitos e macrófagos representam reser vatórios importantes da infecção por HIV. Descobriu-se recente mente que os macrófagos podem servir como reservatórios da infecção por HIV mesmo em certos pacientes com SIDA cujos testes para a presença de anticorpos para HIV são negativos. Não exis te cura efectiva para a SIDA, embora se tenha mostrado que os didesoxinucleósidos prolongam a vida e reduzem a incidência de certas infecções fatais associadas à SIDA.

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,η _4 Veríficou-se que certos macrófagos derivados de monocitos, quando infectados ccm algumas estirpes de HIV são resistentes ao tratamento com didesoxicitidina, azidotimidina e outros didesoxinucleósidos in vitro, como mostrado por Richtnan, et al. (1). A resistência pode ser devida, em parte, aos níveis baixos de didesoxinucleósido quinase que resultam numa capacidade reduzida para fosforilar AZT, ddC ou ddA. Cia. ramente, seria útil ter vias mais eficazes para distribuir grandes quantidades de compostos antivirais eficazes a macrófagos infectados com HIV ou outros vírus e outras células pos_ suindo infecções virais. Seria também útil possuir vias mais eficazes para distribuir compostos antivirais que não apenas aumentassem a sua potência mas que prolongassem também a sua eficácia.

Os análogos de didesoxinucleósidos, tais como AZT são os agentes mais potentes conhecidos correntemente para o tratamento de SIDA, mas num ensaio humano recente, observou-se uma toxicidade grave, evidenciada por anemia (24%) e granulocitopenia (16%) (2,3). Ê desejável, portanto, proporcionar um meio para administração de AZT e outros didesoxinucleósidos de maneira que os efeitos secundários tóxicos destas drogas sejam reduzidos. Além disso, é desejável proporcionar alvejamento selectivo do didesoxinucleósido para monócito/macrófa gos, para melhorar a eficiência da droga contra a infecção virai neste grupo de células. Uma via para conseguir isto é tirar partido da absorção e incorporação de lipossomas pelos macrófagos.

Em 1965, Alex Bangham e colaboradores descobriram que películas secas de fosfatidilcolina formavam espontaneamente vesículas em folhinha bimoleculares fechadas, aquando da hidr£ tação (4). Estas estruturas tornaram-se, eventualmente, conhecidas por lipossomas.

Têm sido propostos vários usos em medicina para os lipossomas. Alguns destes usos são como veículos para distribuir agentes terapêuticos a orgãos alvo. Os agentes são capsulados durante o processo de formação do lipossoma e libertados in vi vo quando os lipossomas se fundem com os lipidos da membrana d.

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-5superfície da célula. Os lipossomas proporcionam um meio de distribuir concentrações ma is elevadas de agentes terapêuti cos a orgaos alvo. Além disso, uma vez que a distribuição lipossórnica foca a terapia ao local' da absorção e incorpora^ çSo lipossórnica, ela reduz os efeitos secundários tóxicos.

As drogas antimoniais lipossómicas, por exemplo, são várias centenas de vezes mais eficazes que a droga livre no tratamento de leispraaniase como foi mostrado, independentemente, por Black e Watson (5) e Alving, et al. (6). A anfote ricina B retida em lipossoma parece ser mais eficaz do que a droga livre no tratamento de pacientes imuno-suprimidos com doença fúngica sistémica (7). Outros usos para a encapsulação em lipossoma incluem a restrição da toxicidade da doxor rubicina (8) e a diminuição da toxicidade de aminoglicosido (9) .

Como se mencionou anteriormente, pensa-se agora que os macrófagos são um importante reservatório da infecção por HTV CIO,II). Cs macrófagos são também um local predominante da absorção e incorporação de lipossomas (12,13). Assim, seria desejável utilizar lipossomas para melhorar a eficácia de aná logos de nucleósidos antivirais no tratamento de SIDA e outras infecções virais.

Tem sido proposto o uso de lipossomas para distribuir didescxinucleósidos fosforilados a células infectadas com SIDA que se tornaram resistentes à terapia de modo a ultrapassar os níveis baixos de didesoxinucleósido guinase.

Também têm sido feitas tentativas para incorporar anál^ gos de nucleósidos, tais como iododesoxi-uridina (rUDR), aciclcvir (ACV) e ribavirina em lipossomas para o tratamento de doenças diferentes de SIDA. Estas tentativas, contudo, não têm sido inteiramente satisfatórias porque estes análogos de nucle ósidos, solúveis em água, relativamente pequenos, tendem a fugir rapidamente do lipossoma (14,15), resultando na diminuição da eficácia de alvejamento. Outras desvantagens incluem a tendência para fugir dos lipossomas na presença de soro, dificul-

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-6 — dades na formulação e estabilidade de lipossomas, baixo grau de acumulação lipossómica e hidrólise de fosfatos de didesoxinucleósido lipossómicos quando expostos a hidrolases ácidas após absorção e incorporação celular dos lipossomas.

Tém sido feitas tentativas para combinar análogos de nucleósidos, tais como arabinofuranosileitosina (ara-C) e ara binofuranosiladenina (ara-A), com fosfolípidos de modo a melhorar a sua estabilidade catabólica como agentes quimioterapéuticos no tratamento de vários tipos de cancro (16). Os agen tes resultantes mostraram uma toxicidade diminuída e uma estabilidade aumentada, em relação aos análogos de nucleósido n3o incorporados. Os agentes resultantes, contudo, exibiram uma absorção e incorporação celular pobre (16) e uma absorção da droga pobre (17).

De modo a usar análogos de nucleósido incorporados em lipossomas, para tratar infecçÔes virais mais eficazmente,é desejável aumentar a estabilidade da associação entre o lipossoma e o análogo de nucleósido.

De modo a aumentar ainda a eficácia destes lipossomas antivirais seria desejável alvejar os lipossomas para infectar células ou sítios de infecção. Pode obter-se maior especificidade na distribuição lipossómica incorporando anticorpos monoclonais ou outros ligandos nos lipossomas. Estes ligandos a lve jarão os lipossomas a sítios de absorção e incorporação de lipossomas capazes de ligarem os ligandos. Foram descritas duas abordagens diferentes para incorporar anticorpos em lipossomas para criar imunolipossomas: a de Huang e colaboradores (18) en volvendo a síntese de anticorpo palmitoil e a de Leserman et al. (19) envolvendo a ligação de anticorpos tiolado à fosfati^ diletanolamina (PE) incorporada em lipossomas.

Os métodos revelados aqui aplicam-se não só a didesoxinucleósidos usados no tratamento de SIDA e outras doenças retrovirais, mas também ao uso de nucleósidos antivirais no tratamento de doenças causadas por outros vírus, tais como vírus do herpes simplex (HSV), vírus 6 do herpes humano, citomegalovírus (CMV), vírus S da hepatite, vírus de Epstein-Barr (EBV)

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Za —7e vírus zoster da varicela (VZV). Assim, o termo análogos de nucleósidos é aqui usado para referir compostos gue podem inibir a replicação virai em vários passos, incluindo a inibição da transcriptase inversa virai ou que podem ser incorporados em ADN ou ARN virai, quando eles exibem uma função terminadora de cadeia.

Sumário do Invento invento proporciona compostos e composições para uso no tratamento de infecções virais, incluindo HIV (SIDA), vírus do herpes simplex (HSV), vírus 6 de herpes humano, citomegalovírus (CMV), vírus B da hepatite, vírus de Epstein-Barr (EBV) e vírus zoster da varicela (VZV). Uma composição pode conter, em adição a um veículo farmacêuticamente aceitá vel, um composto antiviral lipofílico preparado por ligação química de um análogo de nucleósido antiviral a, pelo menos, uma espécie de lípido. 0 análogo de nucleósido antiviral pode ser ligado ao lípido através de um grupo monofosfato, difosfato ou trifosfato. 0 invento proporciona, ainda, um meto do para incorporar estes derivados lípidos de agentes antivi. rais em lipossotnas para distribuição melhorada do agente antiviral. Um lipossoma compreende uma bicamada relativamente esférica que é compreendida, no todo ou em parte, pelos deri^ vados lípidos de agentes antivirais, descritos acima. O lipossoma pode conter lípidos farmacologícamente inactivos. Além disso, o lipossoma pode conter um ligando, tal como um anticorpo monoclonal para um sítio de ligação virai (tal como CD4) ou outra proteína de ligação. Um tal ligando proporciona especificidade adicional no sítio de distribuição do agente antiviral. 0 invento proporciona um método para incor porar esses ligandos em lipossomas antivirais.

Assim, de acordo com o invento proporeiona-se um composto, possuindo propriedades antivirais compreendendo:

um análogo de nucleósido possuindo uma porção base, compreendendo uma purina ou pirimidina ou seu análogo, e uma porção açúcar, compreendendo um resíduo de pento

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-8se, onde, pelo menos, uma das referidas porções é um componente de nucleósido que nâo ocorre naturalmen te ; e uma parte lípido ligada ao referido resíduo de pentose ;

com a condição do referido composto estar na forma de um lipossoma quando o referido resíduo de pentose for arabinofuranose e a referida porção base for citosina ou adenina. Numa concretização preferida, o composto é um fosfatidildidesoxinucleósido ou um diglicérido difosfato de didesoxinucléosido. Noutra, a espécie 1/ pida pode compreender pelo menos um grupo aciléster, éter ou viniléter de glicerol-fosfato. Cs ácidos fosfatídicos possuindo, pelo menos, um grupo aciléster, éter ou viniléter, podem também servir como uma espécie lípida preferida.

Noutra concretização, o análogo de nucleósido é uma purina ou pirimidina ligada através de uma ligação (3-N-glico silo a um resíduo de pentose ao qual falta, pelo menos, um dos carbonos 2’ ou 3‘, mas que retém o carbono 5’, e o grupo fosfato está ligado ao carbono 5’ (i.e. o que seria o carbono 5' numa parte pentose completa). Noutra concretização do invento, a espécie lípida é uma N-acil-esfingosina.

Em algumas concretizações preferidas os grupos acilo ou alquilo da espécie lípida, de qualquer ligação, como por exemplo éster, éter ou viniléter, compreende 2 a 24 átomos de carbono. Numa variação, pelo menos, um dos grupos acilo ou al quilo está saturado. Noutra, pelo menos, um dos grupos acilo ou alquilo tem até seis ligações duplas. Também noutra concre tização, um grupo acilo ou alquilo pode ser ligado directamen te por ligação éster ou alquilo ao 5'-hidroxilo do nucleósido

Ainda numa outra concretização, a parte lípido é um gl cérido e o glicérido tem dois grupos acilo que são iguais ou diferentes. Ainda noutra concretização do invento, a espécie lípida é um resíduo de álcool gordo gue é unido a um grupo de

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-9ligação fosfato por uma ligação éster. 0 composto pode, van tajosamente, ter um a trés grupos fosfato e, pelo menos, um éster de álcool gordo e pode ter dois ou mais resíduos de álcool gordo que são iguais ou diferentes na estrutura. Estes álcoois gordos são preferivelmente ligados ao grupo fos fato terminal do composto.

Além disso, o invento inclui uma composição, na qual, em adição ao composto, o lipossoma compreende ainda fosfolí pidos seleccionados do grupo consistindo em fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilse rina, fosfatidil-inositol e esfingomielina.

Numa concretização do invento, a percentagem de agen te antiviral é de 0,01 a 100 por cento em peso do lipossoma.

Noutra concretização, o lipossoma compreende ainda um ligando ligado a um substrato lípido. O ligando pode ser um anticorpo, tal como um anticorpo monoclonal para um antigénio virai, o antigénio virai pode ser gp41 ou gpllO de HIV ou pode ser qualquer outro antigénio virai adequado. Numa concretização, o ligando é proteína receptora de CD4 ou a pró pria proteína CD4. Alternativamente, o ligando é um anticorpo para CD4 ou uma proteína ou outra substância gue liga CD4.

invento também contempla uma composição para uso no tratamento de infecções virais e retrovirais, compreendendo um lipossoma formado, pelo menos, em parte por um agente lipo fílico antiviral, compreendendo, o agente, um análogo de núcleos ido possuindo uma base e um resíduo de pentose, estando, pelo menos, uma espécie lípida ligada ao análogo de nucleósido através de um grupo de ligação monofosfato, difosfato ou trifosfato no 5'-hidroxilo do resíduo de pentose do análogo de nucleósido, e um veículo farmacêuticamente aceitável.

Assim, proporciona-se uma composição possuindo proprie dades antivirais, compreendendo um análogo de nucleósido anti virai possuindo uma porção base, compreendendo uma purina, ou pirimidina substituída ou não substituída, e uma porção açúcar, compreendendo um resíduo de pentose, e uma parte lípida

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-10ligada ao resíduo de pentose, cora a condição de a composição estar na forma de um lipossoms quando o resíduo de pentose for ribose e a porção base for citosina e quando o resíduo de pentose for arabinose e a porção base for citosina ou ade nina. Numa concretização, o análogo de nucleósido é uma base azotada que é uma purina, pirimidina ou um seu derivado, e o resíduo de pentose é um derivado 2’,3¹-didesoxi, 2',3·-άίάβsidro, azido ou halo de ribose ou um fragmento acíclico hidro xilado de ribose. 0 resíduo de pentose pode assim ser uma 2^r, 3 *-didesoxi—ribose e o análogo de nucleósido pode ser 2‘,3·-didesoxicitidina, 2‘,3 *-didesoxitímidina, 2 *,3 *-didesoxiguanosina, 2¹,3*-didesoxiadenosina, 2·,3·-didesoxi-inosina, ou 2,6 diaminopurina, 2·,3‘-didesoxi-ribosido.

Noutra concretização, o resíduo de pentose é uma 2', *-didesidro-ribose e o nucleósido é 2 ‘ ,3 ' -didesidrotimidina , 2 ’ ,3* -didesidrocitidina carbocíclica ou 2' ,3·-didesidroguanjo sina .

Ainda noutra concretização, o resíduo de pentose é um derivado az ida de ribose e o nucleósido é 3·-azido-3*-desoxi timidina, 3'-azido-3·-desoxiguanosina ou 2,6-diaminopurína-3-azido-2‘,3'-didesoxi-ribósido.

Ainda noutra concretização do invento, o resíduo de pentose é um derivado halo de ribose e o nucleósido é 3‘-fluoro-3'-desoxitimidina, 3^r-fluoro-2¹, 3 *-didesoxiguanosina, 2’,3 *-didesoxi-2'-fluoro-ara-adenosina, ou 2,6-diaminopu rina-3‘-fluoro-2’,3’-didesoxiribósido. 0 invento também inclui derivados halo dos anéis purina ou pirimidina, tal como, por exemplo, 2-cloro-desoxi-adenosina. Alternativamente, o re síduo de pentose é um fragmento acíclico hidrcxilado de ribose e o nucleósido é 9-C4-hidroxi-12'-butadienil)adenina, 3-(4-hidroxi-1' ,2·-butadienil)eitos ina, 9-(2-f osf onilmetoxietil)adenina ou fosfonometoxidiaminopurina,

De acordo com outro aspecto do invento, o análogo de nucleósido é aciclovir, ganciclovir, l-(2'-desoxi-2*-fluoro-l-(3-D-arabinofuranosil) — 5-iodocitosina (FIAC) ou l-(2‘-deso

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-11xi-2'-fluoro-l-^-D-arabinofuranosil)-5-iodo-uracilo (FIAU).

Em todas as composições anteriores, pode ser proporcionado um grupo de ligação monofosfato, difosfato ou trifos fato, entre a posição 5’ do resíduo de pentose e a espécie lípida. Alternativamente, pode haver uma ponte alifática com preendendo dois grupos funcionais e possuindo de 0 a lo átomos de carbono entre os grupos funcionais, ligando a ponte, o lípido e o resíduo de pentose. Ainda em mais concretizações do invento, a espécie lípida é um ácido gordo, um monoacilgli ceroi, um diacilglicerol ou um fosfolípido. O fosfolípido pode ter um grupo de cabeça compreendendo um açúcar ou um álcool poli-hídrico. Exemplos específicos de fosfolípidos incluem bis(diacilglicero)—fosfato e difosfatidilglicerol. Outros exemplos de espécies lípidas incluem grupos D,L-2,.3-diaciloxi propil-(dimetil)-beta-hidroxietilamónio.

De acordo com outro aspecto do presente invento, a espécie lípida compreende de 1 a 4 partes ácido gordo, compreendendo cada parte de 2 a 24 átomos de carbono. Vantajosamente, pelo menos, uma parte ácido gordo da espécie lípida é insaturada e tem de 1 a 6 ligações duplas.

Exemplos particulares destas composições incluem 3-fos. fometoxietil-2,6-diaminopurina; 1,2-diacilglicerofosfo-5’— <2 *,3’-didesoxi)timidina.

Proporcionam-se composições específicas possuindo a fórmula:

(L) -(W) -A-Q-Z m n na qual

Z é a porção base do analogo de nucleósido, Q é o resíduo de pentose, AéO, CouS, wé fosfato, n=0 a 3 e L é uma parte lípido na qual m=l a 5 e, na qual, cada L está ligado directa mente a um ri, excepto quando n=0, caso em que cada l está ligado directamente a A,

EstSo também incluídas composições possuindo a fórmula

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-12Ω Ω

Α Α

I I

L-W-I^-W-L , OU

L-W-I^-W-L

Ω

I

Α

I

L-W-L na qual Ζ é ο grupo purina ou pirimidina substituído ou não substituído do análogo de nucleósido,

Q é o resíduo de pentose,

W é fosfato, A é 0, C ou S, Lj é (CH₂-CHCH-CH₂) e L é uma par te lxpida.

Numa concretização do invento, com referência às fórmu las anteriores, cada L é independentemente seleccionado do grupo consistindo em R, ^H2^C-R1

CH=CR-(CH₂)₁₂-ch₃ h₂c-Ri

HC-R₂,

H₂cHC OH

I

RC(0)NH-CH

HC-R.

(CH^-lUCR, )_?h₂conde R, R^ e R₂ são, independentemente uns dos outros, grupos alifáticos C₂ a C₂^ e onde R, R^ e R₂ têm, independentemente uns dos outros, de O a 6 locais de insaturação e têm a estrutura CK₃-(CK₂)_a-(CH=CH-CH₂)_b-(CH₂)_c-Y na qual a soma de a e c é de la 23 e b é 0 a 6ena qual γ é c(c)o-, c-c-, C=C-C-, C(C)S-, C-S-, ou c=c-s-.

Muma concretização das composições anteriores, o resíduo de pentose compreende ribose, didesoxi-ribose, didesidro-ribose, ou uma ribose substituída por azido ou halo, ligada à posição 9 da purina ou à posição 1 da pirimidina.

presente invento também proporciona um método para sintetizar um derivado lípido de um nucleósido antiviral, com preendendo o passo de fazer reagir um nucleósido antiviral possuindo um grupo hidroxilo de ribose, com um fosfolípido na presença de um reagente de acoplamento, pelo que o nucleósido

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-13é unido ao fosfolípido por uma ligação fosfato na posição do grupo hidroxilo da ribose. Numa concretização preferida, o fosfolípido é um diacilfosfato. Noutra, o fosfolípido é um ácido fosfatídico ou uma ceramida. Também se proporciona aqui um método de sintetizar utn derivado lípido de um nucleósido antiviral, compreendendo os passos de fazer reagir um monofos fato de nucleósido antiviral com um reagente HL, no qual L re presenta um grupo que se despede, para formar um nucleósido PO^-L, fazer reagir o nucleósido PO^-L com um ácido fosfatídi^ co para ligar o ácido ao nucleósido através de uma ligação pirofosfato. Numa variação do método, o monofosfato de nucleósido é 5*-monofosfato de AZT.

Ainda um outro método proporcionado pelo presente invento é um método para sintetizar um derivado glicérido de um análogo de nucleósido, compreendendo o passo de unir um monoglicérido ou diglicérido e um monofosfato de nucleósido antiviral com um agente de acoplamento na presença de um catalisador básico. Numa concretização, o glicérido é 1-0-estearoi.l glicerol e o nucleósido é monofosfato de AZT.

Faz também parte do presente invento um método para preparar uma suspensão de lipossomas para uso no tratamento de infecções virais e retrovirais num mamífero, compreendendo proporcionar um agente lipofílico antiviral, compreendendo, pelo menos, uma espécie lípida, ligada a um análogo de nucleósido através de um grupo de ligação monofosfato, difosfato ou trifosfato na posição 5* do resíduo de pentose do nucleós do, combinar o agente lipofílico antiviral e um solvente aqu so farmacologicamente aceitável para formar uma mistura e for mar lipossomas a partir do agente lipofílico antiviral. Os li possomas podem ser formados, por exemplo, por tratamento ultrassónico Csonicetion), extensão ou microfluidificação. Nu ma concretização preferida o passo de combinação compreende ainda incluir na combinação um lípido lipofílico farmacologicamente inactivo. Este lípido inactivo pode ser, por exemplo, uma fosfatidiletanolamina, um esfingolipido, um esterol ou um glicerofosfatídeo. 0 método também pode incluir tratar os lio|

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-14possomas com tio-anticorpos para produzir imunolipossomas ou incluir na combinação um lipido lipofílico que, em parte, com preende um ligando. Assim, o lipossoma pode incluir um ligando ligado β um substrato lipido.

Em adição, o invento inclui um método para tratar ínfeeçÕes retroviraís e virais num mamífero, tal como um ser hu mano, por administração de uma quantidade suficiente dos análogos de nucleósido antivirais descritos aqui, para distribuir uma dose terapêutica do agente antiviral ao mamífero. Nu ma concretização preferida, o método é usado para tratar infecções retroviraís e virais num mamífero, nas quais o retrovírus se tornou resistente à terapia com formas convencionais de um agente antiviral. o presente invento também inclui um método de tratamento de pacientes possuindo estirpes de HIV que desenvolveram resistência a AZT ou que têm sensibilidade reduzida a AZT, compreendendo o passo de administrar uma composição do presente invento a esse paciente numa dosagem eficaz , inibidora de retrovírus. Está também incluído no presen te invento um método para tratar uma infecção virai num mamífero, compreendendo o passo de administrar uma quantidade efi caz de uma composição, como aqui descrita, a um mamífero. A infecção pode ser uma infecção de herpes simplex e a composição pode ser fosfatidilaciclovir. Alternativamente, o vírus pode ser retrovírus HIV e a composição pode ser 5*-palmitoil AZT. O método inclui o uso quando o retrovírus é uma estirpe de KIV que desenvolveu resistência a um análogo de nucleósido

Também se revela aqui um método para prolongar oefeito antiviral de um análogo de nucleósido num mamífero, compreendendo administrar o análogo de nucleósido ao mamífero, na for ma dos derivados nucleósido-lípido revelados aqui. E também revelado um método para evitar ou ultrapassar a resistência do retrovírus aos análogos de nucleósido, através da administração do análogo na forma das composições de derivado lipido reveladas aqui.

Finalmente, o presente invento inclui o uso destas com

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-15posições na preparação de um medicamento para o tratamento de uma infecção virai humana.

A distribuição lipossómica de drogas anti-retrovírais e antivirais resulta no doseamento maior de células de macró fago e monócito que aceitam lipossomas facilmente. As vantagens singulares do presente invento consistem em os derivados lípidos dos nucleósidos antivirais serem incorporados, predominantemente, na camada de fosfolípido do lipossoma em vez de o serem no compartimento aquoso, Zsto permite que sejam incor poradas nos lipossomas maiores quantidades de análogo antiviral do que no caso em que se usam ésteres fosfato dos nucleósidos, solúveis em água.Obter-se-à a incorporação completa do derivado antiviral em lipossomas, melhorando, assim, tanto a razSo droga para lípido e a eficiência da formulação.

Além disso, não haverá fuga dos análogos lípidos antivirais do lipossoma durante o armazenamento. Finalmente, a terapia lipossómica usando estas composições permite distribuir maio res quantidades de composto antiviral às células de macrófago e monócito infectadas. A terapia com composições lipossómicas contendo ligandos específicos de sítio permite distribuir ainda maiores quantidades de compostos antivirais, com especificidade aumentada.

Outra nova vantagem deste invento é a de que se crê que cada classe de derivados lípidos de nucleósidos antivirais, revelada abaixo, dá origem directamente a nucleósidos antivirais fosforilados ou não fosforilados no metabolismo celular.

Uma outra vantagem deste invento é a de que os novos derivados lípidos são incorporados na célula, protegendo a cé lula durante períodos de tempo prolongados, de até, ou excedendo, 48 horas após a droga ser removida.

Sstas e outras vantagens e características do presente invento tornar-se-ão mais evidentes da descrição que se segue e das reivindicações anexas.

570

-16Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras 1-5 são gráficos, representando a produção de p24 pelas células infectadas com HIV em função da quantidade da composição do presente invento administrada in vitro.

Descrição Detalhada do Invento

O presente invento envolve derivados lipidos de análogos de nucleósidos que podem ser incorporados na bicamada de lípido de lipossomas. Estes derivados são convertidos em análogos de nucleósidos por processos metabólicos celulares cons tituintes e têm efeitos antivirais in vivo e in vitro.

Derivados lipidos de análogos de nucleósidos, adequados, compreendem fosfatidilnucleósidos, diacilgliceno difosfato de nucleósido, acilfosfatos de nucleósidos e ceramidofos fonucleósidos. Com a excepção dos acilfosfatos, que podem incluir de um a cinco grupos acilo; os derivados lipidos destas composiçoes proporcionam um a dois grupos acilo hidrofóbicos para ancorar o nucleósido na bicamada de lípido do lipossoma.

O presente invento também compreende derivados lipidos capazes de proporcionar grupos acilo adicionais e portanto maior força de ancoragem para análogos de nucleósidos. 0 aumento na força de ancoragem torna possível utilizar análogos de nucleósidos de maior polaridade nas formulações de lipossoma. Assim, revelamos estruturas de nucleósido deste tipo, adicionais, para uso em terapias lipossómicas. Revelamos também derivados lipidos de análogos de nucleósidos, nos quais o grupo lípido é ligado directamente ao nucleósido em vez de o ser através de uma ligação fosfato.

Nomenclatura:

Cs derivados lipidos do presente invento são constituídos por estruturas complexas que só podem ser definidas rigoro samente por terminologia incómoda, para maior clareza, as descrições de componentes lipidos e nucleósidos e suas combinações serão feitas em termor dos nomes triviais, usados comunmente, familiares aos especialistas. Por exemplo, a droga muito conhecida, 3'-azido-3¹-desoxitimidina será frequentemente

570 fl

-17designada por AZT. Similarmente o derivado de AZT compreenden do uma parte l,2-diacilglicerol-3-fosfato, será frequentemente designado por fosfatidilAZT ou pAZT. Derivados paralelos de didesoxitimidina ou didesoxicitídina serão, correspondente mente, designados por fosfatidilddT ou pddT e fosfatídilddC e pddC. Derivados de nucleósidos halogenados serão designados por, por exemplo, fosfatidil-3*BrddT.

Os análogos de nucleósidos do invento podem ser qualquer nucleósido que não ocorra naturalmente nas espécies a tratar da infecção virai. Podem compreender uma base purina ou pirimidina, que ocorra naturalmente, ligada a um análogo de um grupo ribose que ocorra naturalmente. Pode igualmente compreender um análogo de uma base purina ou pirimidina ligado a um grupo ribose ou desoxi—ribose que está presente em nu cleósidos que ocorrem naturalmente. Alternativamente, ambas as partes, base e ribose, dos análogos de nucleósidos podem ser análogos dos encontrados na natureza. Um análogo de nucle ósido pode também compreender quer uma base normal quer um análogo de base ligado a uma parte açúcar não ribose.

Análogos tanto da base purina como pirimidina e do gru po ribose podem diferir de uma parte correspondente que ocorre naturalmente, por terem novos grupos substituintes ligados, por terem sido deles eliminados grupos substituintes que ocorrem naturalmente ou por átomos normalmente presentes terem sido trocados por outros. Exemplos de análogos formados por subs tituição sâo 2,6-diaminopurina e 3 *-azido-3·-desoxi-ribose; por eliminação 6-oxipurina ou didesidro-ribose; por troca, 8-azaguanina.

Cs análogos de nucleósidos podem também compreender uma base purina ou pirimidina ligada à parte pentose numa ligação que n§o ocorre naturalmente, tal como, por exemplo, através do azoto na posição 3 em vez da posição 1 das pirimidinas.

Stn geral, os análogos de nucleósidos usados na preparação de lipossomas do presente invento terão uma base purina ou pirimidina, p.e., adenina, guanina, citosina ou ticnina, ou

570

-18utn seu análogo, ligado a uma pentose, tal como ribose ou um resíduo e/ou derivado de ribose. A ligação é feita através do azoto na posição 9 das purinas e através do azoto na posi. ção 1 das pirimidinas. Estes azotos estão ligados por uma li gaçSo -N-glicosilo ao carbono 1 do resíduo de pentose.

resíduo de pentose pode ser uma pentose completa ou um derivado tal como uma desoxi ou didesoxipentose. Em adição, o resíduo de pentose pode ser um fragmento de uma pento se, tal como um resíduo 2-propoximetil hidroxilado ou um resíduo etoximetil hidroxilado. Resíduos de nucleosidos particulares possuindo estas estruturas incluem aciclovir e ganci. clovir. A pentose também pode ter um átomo de carbono substi tuido por oxigénio ou enxofre, por exemplo, na posição 3' de descxi-ribose (BCH-189).

Nos compostos do presente invento, os grupos fosfato são geralmente ligados ao carbono 5‘ das pentoses; contudo, compostos, nos quais os grupos fosfato estão ligados ao grupo 3*-hidroxilo da pentose, são abrangidos pelo invento se possuírem actividade antiviral. Quando os lípidos são ligados directamente aos grupos pentose, essas ligações também podem ser feitas quer através do carbono 3' quer, preferivelmente através do carbono 5' da pentose.

á importante reconhecer que em compostos possuindo resíduos de pentose que não são pentoses completas, os grupos fosfato são ligados ao carbono gue seria o carbono 5' se a pentose estivesse completa. Nestes fragmentos de pentose, os carbonos 2' e/ou 3' podem estar ausentes; não obstante, eles são considerados derivados de nucleosidos no contexto do presente invento, e o átomo de carbono ao qual os grupos fosfato estão ligados será geralmente referido por carbono 5* com o objectivo da uniformidade na utilização.

Qualquer derivado lípido de um análogo de nucleósido possuindo uma actividade antiviral está dentro do âmbito do invento. A actividade antiviral pode residir em qualquer componente do complexo lípido-nucleósido, isto é, num análogo de base do nucleósido, num análogo de ribose, ou na substituição

57C

-19de ribose por outra pentose. Pode também residir no complexo como um todo, onde, por exemplo, um análogo fracamente antiviral ou um que possui actividade virai imperceptíve1 ou latente se torna mais potente a seguir â sua incorporação num derivado lípido de um nucleósido.

Os nucleósidos que se sabe terem essa actividade são membros da classe compreendendo nucleósidos de 3'-azido-2',

3* -cfidesoxipirimidina, por exemplo, AZT, AZT-P-AZT, AZT-PddA, AZT-P-ddT, AzddClV, AzddMeC, AzddMeC N4-0H, AzddMeC N4Me, AZT—P-CyF—ddA , AzddEtU(CS-85), AzddU(CS-87), AzddC(CS-91), AzddFC, AzddBrU, e AzddIUr da classe compreendendo didesoxinucleósido de 3·-halopirimidina, por exemplo? 3-FddClU, 3-FddU, 3-FddT, 3-FddBrU, e 3-FddEtU? da classe compreendendo 2 ’ ,3'-didesidro-2*,3 *-didesoxinucleósido (nucleósidos D4) , por exemplo D4T, D4C, D4MeC e D4A? da classe compreendendo nu cleósidos de didesoxipírimidina 2',3*-não substituídos, por exemplo, 5-F-ddC, ddC e ddT? da classe compreendendo nucleósi^ dos de didesoxipurinas 2',3'-não substituídos, por exemplo, ddA, ddDAPR(diaminopurina), ddG, ddl, e ddMeA(N6-metil)? e da classe compreendendo nucleósidos de didesoxipurina substituídos com açúcar, por exemplo, 3-N^ddDAPR, 3-N^ddG, 3-FddDAPR, 3-FddG, 3-FddaraA, e 3-FddA, onde Me é metilo Et é etilo e CyEt é cianoetilo.

Outros análogos de nucleósidos adequados podem ser agen tes antivirais como aciclovir ou ganciclovir (DKPG) ou outros análogos como se descreve abaixo. Os derivados didesoxi preferidos são os usados no tratamento de SIDA, incluindo 3'-azido-3·-desoxitimidina (azidotimidina ou AZT)? 2',3'-didesoxitimidina (ddT) ; 23'-didesoxicitidina (ddC); 2',3'-didesoxi-adeno sina (ddA); e 2',3'-didesoxiguanosina (ddG). A AZT, ddT e ddC são os análogos mais preferidos, presentemente. Preferem-se também as didesidropirimidinas, bem como carbovir, uma 2',3'-didesidroguanosina carbocíclica. Igualmente preferidos são os derivados 3'-azido de desoxiguanosina (AZG) e da pirimidina, desoxi-uridina e os derivados 3'-fluoro de desoxitimidina e de soxiguanosina. De entre as 2',6'-diaminopurinas preferem-se o

570 fÀ.

20—

2‘,3 *-desoxi-ribosido e os seus derivados 3‘-fluoro e 3’-azi do. Prefere-se também 2-cloro-desoxi-adenosina.

De entre os derivados açúcar acíclicos preferem-se a 9-(4-hidroxi-1',2»-butadienil)adenina (adenaleno) e o seu equi valente citosina. Derivados acíclicos preferidos possuindo, uma base purina ou diaminopurina são 9-(2-fosfonílmetoxietil)adenina e fosfonometoxietil-desoxidiaminopurína (PMEDADP).

Os estereo-isómeros destes nucleósidos, tal como 2‘-fluoro-ara-ddA, podem ser vantajosos devido à sua resistência à hidrólise catalisada por ácido da ligação glicosídica, o que prolonga a sua actividade antiviral. Em tais casos eles são preferidos.

Para o tratamento de infecções por herpes, citomegalov_í rus e hepatite B, podem utilizar-se derivados lípidos de aciclovir, ganciclovir, l-( 2 '-desaxi-2 ‘-f luoro-I-(^-D-arabinof uranosil)—5—iodocitosina (FTAC) ou l-(2 ' -desoxi-2 ‘ -f luoro-l-(3-D-arabinofuranosil)-5-iodo-uracilo (FTAtr) .

Os lípidos são preferivelmente ligados aos análogos de nucleósidos através de ligações fosfato. Os derivados lípido compreendendo uma ligação fosfato entre um análogo de nucleós_i do e um lípido podem ser preparados a partir de fosfolípidos, análogos de nucleósido fosforilados ou ambos. Os fosfolípidos adequados compreendem fosfoglicéridos, esfingolipidos ou acilfosfatos.

Cs derivados lípidos de análogo de nucleósido, nos quais os lípidos estão ligados através dos grupos mono-, di-, ou trifosfato podem ser preparados a partir de análogos de nucleósido fosforilados. Os análogos de nucleósido fosforilados são conhecidos. 0 análogo didesoxinucleósido é fosforilado de acordo com procedimentos convencionais tais como o método de oxicloreto fosforoso de toorchen e Topai (20). 0 análogo modificado preferido é o 5¹-monofosfato. Uma vez que a A2T, a ddc e outros didesoxinucleósidos apenas têm o 5'-hidroxilo, apenas se forma o 5'-monofosfato durante a fosforilação; contudo, em outros análogos, nos quais o 3'-hidroxilo está presente pode

570

-21formar-se um 3'-monofosfato. Os análogos difosfato e trifosfato de nucleósidos antivirais também podem ser usados.

Os grupos alifáticos das partes lípido têm preferível, mente comprimentos de cadeia de dois a vinte e quatro átomos de carbono e têm zero a seis ligações duplas. Os grupos alifáticos podem ser ligados à parte glicerol por ligações acilo, éter ou viniléter.

Métodos sintéticos:

As composições de lípido-nucleótido do presente invento podem ser sintetizadas de acordo com métodos gerais aplicá veis a todos os lipidos e todos os nucleósidos antivirais des critos abaixo, como indicado no diagrama de fluxo da Figura e demonstrado especificamente nos Exemplos 1 a 7.

Os lipidos compreendendo ácidos gordos, álcoois, glicé ridos e fosfolípidos podem ser adquiridos em fontes comerciais (Avanti Polar Lipids, Inc., Pelbam, Alabama 35124) ou ser sintetizados de acordo com métodos conhecidos. Os análogos de nucleósidos antivirais estão disponíveis em Aldrich, Milwaukee, Wisconsin ou em sigma, St. Louis, Missouri.

E importante que todos os vestígios de água sejam remo vidos dos reagentes de modo a efectuarem-se as reacçoes de acoplamento. Assim, os lipidos são primeiro secos por congela ção, por evaporação sob vácuo quer num forno de vácuo em P₂0^. As reacçoes também são realizadas sob um gás inerte, tal como, por exemplo, argon.

Os compostos do invento podem ser formados de acordo com procedimentos sintéticos que acoplam um fosfolípido a um análogo de nucleósido ou gue acoplam um fosfolípido a um mono fosfato ou difosfato de análogo de nucleósido, onde o grupo está localizado no grupo ribose do nucleósido, na localização 3’ ou preferivelmente 5*.

Os lipidos adequados para acoplar a nucleósidos, compre endendo principalmente ácidos gordos de cadeia longa ou álcoois, monoglicéridos ou diglicéridos, ceramidas e outras espé69 570

-22- * cies lípidas descritas abaixo, podem ser fosforilados por tratamento com agentes apropriados, por exemplo usando fosfo rodicloridrato de fenilo de acordo com o procedimento de Brown (32), por tratamento com oxicloreto de fósforo tal como no Exemplo 6, ou por outros procedimentos de fosforilação conhecidos.

No primeiro tipo de síntese, um fosfolípido, tal como, por exemplo, um ácido fosfatídico, é acoplado a um analogo de nucleósido seleccionado no 3’- ou no 5·-hidroxilo por meio de um agente de acoplamento, tal como, por exemplo, cloreto de 2,4,.6-triIsopropilbenzeno-sulfonilo na presença de um catalisador básico, por exemplo, piridina anidra, ô temperatura ambiente. Podem usar-se outros agentes de acoplamento, tal como díciclo-hexílcarbodiimida.

Os derivados lípido também podem ser sintetizados por acoplamento de um ácido fosfatídico a um monofosfato de nucle ósido anti virai através de uma ligação pirofosfato. Neste procedimento, o monofosfato ou difosfato de nucleósido é convertido num derivado possuindo um grupo que se despede, por exemplo, morfolina, ligado ao grupo terminal fosfato, de acor do com o procedimento de Agrznoff e Suomi (21) e como ilustra do no Exemplo 4, para preparar um derivado de AZT, e no Exemplo 6, para um derivado de ddA. Ocorre, um acoplamento do áci. do fosfatídico e do morfilidato de fosfato de nucleósido por tratamento de uma mistura seca dos dois reagentes com um cata lisador básico, tal como piridina anidra, à temperatura ambiente .

As reacções são seguidas usando cromatografia de camada fina (TLC) e solventes apropriados. Quando a reacção está completa, determinado por TLC, o produto é extraído com um sol vente orgânico e purificado por cromatografia num suporte adequado para separação de lípidos, por exemplo, ácido sílicico.

A sintese de produtos compreendendo adenina ou citidina possuindo grupos amino reactivos pode ser facilitada por bloqueamento desses grupos com acetato, antes da reacção de acopla_

570

-23mento, por tratamento com anidrido acético; após a cromatografia do produto final, os grupos amino são desbloqueados usando hidróxido de amónio (Exemplo 3).

Derivados Lípidos:

As composições que serão mais eficazes terão uma porção lípido suficiente para ser capaz de incorporar o material de uma maneira estável numa bicamada lipossómica ou outro arranjo macromolecular.

Alguns derivados lípidos preferidos, de análogos de nu í cleósidos, que estão no âmbito do presente invento caiem em quatro classes gerais:

1. Fosfatidilnucleósldos antivirais

A estrutura destes compostos lípidos antivirais é apresentada a seguir:

H₂0- R_z HO-R₂ O

I II

H₂0— 0 - P-A -N onde N é um didesoxinucleósido terminador de cadeia” tal como AZT, ddC, ddA, ddZ ou outro nucleósido antiviral tal como aciclovir ou ganciclovir, A é um elemento do grupo VI da tabe la periódica (O, C ou S) e R^ e R₂ , que podem ser iguais ou diferentes, são grupos alifáticos a C possuindo 0 a 5 locais de insaturação e tendo, preferivelmente, a estrutura CH₃-(CH₂)_a-(CH=CH-CH₂)_b-(CH₂)_c-Y onde a soma deaecé Ia23;ebéoa6;e onde Y é C(O)C^-, C-0 , C=C-O , C(O)S-, C-S-, C=C-S-, formando ligações aciléster, éter ou viniléter, respectivamente, entre os grupos alif£ ticos e a parte glicerol. Estes grupos alifáticos na ligação aciléster compreendem portanto ácidos gordos saturados, gue ocorrem naturalmente, tal como láurico, miristico, palmítico,

570

esteárico, araquídico e lenhocérico e os ácidos gordos insaturados que ocorrem naturalmente palmítoreico, oleico, linoleico, linolénico e araquidónico. Concretizações preferidas compreendem um monoéster ou diéster, ou um derivado fosfatidil 1-éter, 2-aciléster. Em outras concretizações, os grupos alifáticos podem ter cadeias ramificadas com o mesmo número de carbonos e compreendem grupos alcanoi ou alcoxi primários ou secundários e ligações éter internas.

Esta classe de compostos pode ser preparada por exemplo a partir da reacção de um ácido diacilfosfatídico e de um análogo de nucleósido antiviral em piridina, como descrito para a preparação de 1,2-dimiristoílglicerofosfo-5·-(3‘-azido-3*-desoxl)timidina no Exemplo 1.

Após absorção e incorporação lipossómica, crê-se que os compostos sofrem metabolismo pelas fosfolipases presentes na célula. Por exemplo, no caso específico de um derivado diacilfosfatidil de um nucleósido, a fosfolipase C actuaria de modo a dar um diacilglicerol e o monofosfato de nucleósido como se apresenta abaixo:

H

H

HK— C— o—C—R.

c

I c

K

II c

R.

o <1

P — A

Fosfolipase C

H— c —c—íH— C — O

-R_{2 +} + 0' c

II

PAlternativamente, o mesmo fosfatidilnucleósido pode ser hidrolisado por fosfolipase A e lisofosfolipase seguida por fosfodiesterase para dar glicerol e monofosfato de nuc le ósido, pela sequência apresentada abaixo:

570

K—C— 0 — C—R„ FosfolipaseA

2 -^c-*

-0-g —R.

H— C— 0 — Ρ— A

0'

H- C	— OH	0
1 H— C	— OH + Οθ	II - P —
1		1©
H—C I	— OH
1 H
2	. Diglicéridos
A	estrutura	quím
tada abaixo:
	H-C —	• R-,
	2|	1
	HC —	-R2
	1 h2c-	C —

ί'/

G-><·

H— C—OH

M j=*osf odiesterases H— C — CH C

H— C— C— P — A — N

À©

O 0

P- 0 - P — A l_ i o

N onde Ν, A e R e Rg sâb descritos como acima.

Os diglicéridos de difosfato de nucleósidos são conhecidos, Cs diglicéridos de difosfato de nucleósido antiviral po dem ser preparados a partir de ácido fosfatídico e dos monofos foruorfolidatos de nucleósido antivirais pelo método de Agranoff e Suomi (21) modificado por Prottey e Hawthorne (22). Este tipo de síntese é apresentada no Exemplo 4, para a síntese de dipalmitoilglicerol-5·-difosfato de AZT.

Aquando da distribuição lipossómica às células, esta

BAD ORIGINAL

570

-26classe de compostos tomará parte em vários tipos de reacções, visto que á um análogo de CPD-diglicérido, um importante intermediário, que ocorre naturalmente, na biossíntese de fosfa tidilglicerol, cardiolipin e fosfatidil-inositol como se apre senta a seguir:

H

I

H-C-R.

I h-c-k₂.

O © · + O—P-A —N i© '©

H-C-O-P-O-Inosltol

I

H

H I

H-C-R

I ¹ H-C —Ro

I ΐ

H-C-0 - P— 0-P-A — N

H

I

H-C-R.

R₁~C-H+

O Fosf ot idi lgl ice roj ^H ι I rt o β

H-C-0- P-O-Glicerol-O-Pé© O©

H

Ra-C-H

I

-0-C-H

I

H

Θ ’ + 0^ P-A-M '©

H-C-R.

H-C-Rr

O ' I fl

N-C-0 — P— 0-glicerol + C© P—A — N '©

570 —2 7 —

Todas estas reacçoes geram monofosfato de nucleósido e um novo fosfolípido. tí importante notar que Poorthuis e Kos tetler (23) mostraram anteriormente que uma variedade de nucleósidos podia substituir CDP-diglicérido nestas reacçoes,in eluindo UDP-diglicérido, ADP-diglicérido e GDP-diglicérido (23). Significativamente, ter Scheggrtt, et al. (24) sintetizaram desoxi CDP-diglicérido e verificaram que ele também poderia substituir CDP-diglicérido na síntese mitocôndrica de fosfatidilglicerol e cardiolipin, sugerindo assim a possíbiLL dade de usar estes novos compostos para gerar os fosfatos de nucleósidos antivirais nas células alvo.

A CDP-diglicérido hidrolase catalisa outra importante conversão metabólica que dá origem a monofosfato de nucleósido e ácido fosfatídico, como se apresenta abaixo:

HC— R.

h₂c

-Ό

II

-p—o

I ll

-P-AI

CDP-diglicérido hidrolase

H„.C z .

— R.

HC-R

H_?C

0 II

0-P

I.

ll

P-A l_

-N

Ssta via foi primeiro descrita em tecidos de mamífero por Rittenhouse, et al, (25). Pensa-se que esta enzima, que é uma pirofosfatase, faça a clivagem de diglicérido de difosfato de didesoxinucleósido no monofosfato de nucleósido e ácido fos fatídico proporcionando uma segunda maneira pela qual o monofosfato de nucleósido pode ser formado nas células alvo.

. Acilfosfatos de nucleósidos Antivirais:

Cutra via de introduzir um composto lípido em células

57C

Μ* *

-28por meio de lipossomas é sintetizar acilésteres dos monofosfatos, difosfatos ou trifosfatos de nucleósido. Esta síntese pode ser realizada de acordo com o procedimento do Exemplo 5 para a síntese de di-hexadecil-fosfo-5·-didesoxicitidina.

A estrutura de um diacilfosfonucleósido é apresentada a seguir:

R-,— O— P— A—N I

?.

% onde N, A, e R^ são definidos como anteriormente. Em princípio, uma ou mais partes ácido do fosfato pode estar esteri— ficada e são possíveis muitas outras combinações de substitui, ção de fosfato e álcool gordo. Por exemplo um monofosfato de nucleósido pode ter um ou dois ésteres alifáticos; um difosfa_ to de nucleósido pode ter uma a três ésteres alifáticos e o trifosfato de nucleósido pode ter um a quatro ésteres alifát_i cos. Os nucleósidos podem ser didesoxinucleósidos terminadores de cadeiã’ ou outros nucleósidos antivirais.

Uma vez que as células contêm várias esterases, prevê-se que esta classe de compostos seja hidrolisada a nucleósido fosforilado, ultrapassando a deficiência em didesoxinucleósido quinase em monócitos e macrófagos humanos e restaurando assim a actividade antiviral,

4. Fosfonucleósidos antivirais de ceramida

Os fosfatos de nucleósidos antivirais também podem ser gerados em células após distribuição lipossómica de fosfatos de nucleósido de ceramida antivirais possuindo a estrutura ge ral apresentada a seguir:

CER— O — P- A- N

570 ,, Ζ ff /-£.

ff-29onde CSR é uma N-acil-esfingosina possuindo a estrutura: CR=CK-(CH₂ ) 22^^-3

CHCH

RC(0)NH-CH h₂conde R é definido como anteriormente ou é um derivado de es fingosina, substituído por lípido, equivalente, e N é um nu cleósido anti-retroviral ou um nucleósido antiviral terminador de cadeia'· definido como anteriormente. Esta classe de compostos é útil em formulação lipossómica e terapia de SIDA e outras doenças virais porque pode ser influenciada por esfingomielinase ou fosfodiesterases em células dando origem a monofosfato de nucleósido. Em adição ao composto apresentado acima, pode também sintetizar-se didesoxinucleósidos difosfa to de ceramida, que podem ser degradados por pirofosfatases celulares para dar monofosfato de nucleósido e fosfato de ce ramida.

Os fosfatos de nucleósido antivirais de ceramida podem ser preparados por um método semelhante ao método de pre paração de diglicéridos de difosfato de nucleósido antiviral, com variações apropriadas nos materiais de partida.

5. Outros Derivados Lípidos de Nucleósidos Antivirais

Uma abordagem para se conseguir ainda maior estabilidade de derivados lípidos de análogos de nucleósidos nos lipossomas é o aumento da interacção lípido-lípido entre a estrutura lípido-nucleósido e a bicamada. Assim, em concretiza ções preferidas podem ser sintetizados derivados lípido de análogos de nucleósido possuindo até quatro grupos lipofílicos. Uma classe destes compreende derivados difosfatidilglicerol possuindo a estrutura geral:

RAD ORIGINAL^

570

1

C—C

-301 2 c—c—

AZT CH 0

I I I c — C — P — O—C —C— C— O— F —

II ^{11 2}’ ³' II o o o - c—

R.

Nesta classe, os nucleósidos são ligados a ura ou ambos os fosfatos por uma ligação fosfodiéster ao 5*-OH da par te desoxi-ribose, ribose ou didesoxí-ribose do nucleósido an tiviral. No caso de nucleósidos acíclicos, tais como aciclovir ou ganciclovir, a ligação seria ao grupo OH equivalente ao da posição 5* da ribose,. desoxi-ribose ou didesoxi-ribose. Pode haver um ou dois nucleósidos ligados a cada molécula. Os fosfatos de nucleósido podem também ser ligados por uma ligação pirofosfato, como no Exemplo 4.

Outra classe de derivados possuindo componentes lipidos aumentados compreende bis(diacllglicero)fosfonucleótidos, possuindo a estrutura geral:

ddC

I

0“

I

C— C— C— 0—P— 0 I I II ^R1 ^R2 °

ΟΙ

R.

P°^{dem ser} dois, trés ou quatro grupos alifáticos que são, independentemente uns dos outros, R definido como anteriormen te, estando os referidos grupos em ligações aciléster, éter ou viniléter. Este composto pode ser feito pelo método do Exem pio 3 .

A versão difosfato deste composto com a seguinte estrutura :

dcJC

I

0—P o

C— C— C —0 ^R1 ^R2

R.

R,

57C

-31pode ser feita por acoplamento do monofosfomcrfolidato de nu cleósído ao resíduo fosfoéster de bis(diacilglicero)fosfato de acordo com o procedimento do Exemplo 4. Este composto será metabolizado a AZT-p nas células por CDP-diglicérido-hidro lase (uma pirofosfatase). Estes dois tipos de compostos podem proporcionar propriedades metabólicas e físicas superiores.

Podem ser sintetizados outros derivados lipidos adequa dos de nucleósidos usando novos lipidos. E desejável, por exemplo, sintetizar derivados fosfolípido de nucleósidos anti virais e anti-retrovirais que darão origem a agentes antivirais potentes por meio de vias alternativas de metabolismo pe las células alvo que absorve a formulação de lípido. Para derivados constituídos pelos seguintes tipos de compostos, pode prever-se um metabolismo celular distinto do dos derivados fosfolípido convencionais, porque estes têm um grupo fosfato que é removido do grupo lípido usual por um grupo contendo azo to. A estrutura destes lipidos é característica de um derivado de amónio quaternário.

C composto apresentado:

HC — R₂

HC-H ₊ l

N-CH^-CH^-OH

I (ch₃)₂ (I) acetato de D,L-2,3-diestearoiloxipropil(dimetil)-(3-hiârox ietil amónio foi primeiro sintetizado por Rosenthal e Geyer em 196c (35) e está disponível Calbiochem, La Jolla, Califórnia 92039. Ele pode servir facilmente para ligar fosfato de AZT ou qualquer outro fosfato de nucleósido antiviral, usando cloreto de tríisopropilbenzeno-sulfonilo (TIBSC) como descrito no Exemplo 1 ou 7.

Alternativamente, a AZT pode ser ligado ao lípido de

570

-3 2amónio fosforilado preparado por ΡΟΟίθ, usando TIBSC. Apresen ta-se abaixo o derivado de AZT do composto I fosforilado, ace tato de D,L-2,3-diaciloxipropil(dimetiI)-0-hidroxietilamónio, onde R^ e R₂ são grupos alifáticos definidos como anteriormen te, com a estrutura preferida: H_OC - R, ²I

KC-R„

HC-H ⁺N— CH,

CH,

O·

II

P(CK₃)₂

O

CH(II)

Além disso, o composto I de Rosenthal e Geyer pode tam bém ser fosforilado como eles descreveram no seu documento (35). Pode também usar-se o método do oxicloreto fosforoso de Toorchen e Topai (20) para preparar o éster fosfato de I. A es tas espécies fosforiladas pode então acoplar-se qualquer nucle ósido antiviral ou anti-retrovira1 usando o derivado morfolida_ to do fosfato de nucleósido como referido por Agranoff e Suomi, (21) e modificado por Prottey e Hawthorne, 1967 (22). Os derivados difosfato de nucleósido de I, resultantes, podem ter pro priedades Exemplares como agentes antivirais distribuídos em lipossomas a células infectadas. Os nucleósidos preferidos incluem, não lhes estando limitados: AZT, ddA, ddC, ddl, aciclovir, e ganciclovir. O derivado difosfato de AZT do Composto I é apresentado abaixo:

^H2?'

HC

R.

R,

HC-H +

ΚΟΚ;

CH,

O·

Cch₃)₂

O

II pI o

0· o

PI o

CH

(III)

570

-3 3Em qualquer dos derivados lípidos descritos nas secções 1 a 5 anteriores, o nucleósido pode ser qualquer nucleósido an tiviral; (bem como R^ 4 P^ara as espécies bis(diacilglicero) ) podem ser qualquer ácido gordo saturado ou insaturado pos suindo 2 a 24 átomos de carbono. São também possíveis ácidos gordos ciclopropano poli-insaturados, hidroxi, de cadeia ramificada. A esteroquímica das partes glicerol pode incluir ligações fosfoéster sn-1 ou sn-3 ou suas misturas racémicas. Pode haver 1 ou 2 (bem como 3 ou 4 para as espécies bis(diacilglice ro)) grupos aciléster ou grupos alquiléter ou viniléter, como necessário.

vários outros fosfolípidos podem ser ligados a nucleósidos, incluindo, mas não estando limitados por, fosfatidilglicerol, fosfatidil-inositol ou qualquer outro fosfolípido onde o grupo de cabeça contenha um grupo hidroxilo de ligação disponível, tanto num álcool poli-hidroxilo natural, como ino sitol, como num, no qual ele tenha sido substituído por outro álcool poli-nidroxi ou por um hidrato de carbono tal como um açúcar, de novo quer natural quer sintético. Neste caso, o fos fato de nucleósido será adicionado por esterificação a um ou mais dos hidroxilos do álcool ou do hidrato de carbono. Cutros glicolípidos podem também servir como ligando ao qual o grupo fosfato de nucleótido é ligado por meio de esterificação a um grupo hidroxilo de glicolípido. Podem também ser usados, vantajosamente, outros glicolípidos, quer sejam ou não fosfolípi. dos, tal como cerebrósidos ou gangliósidos seleccionados, quer naturais quer sintéticos, possuindo propriedades hidrofóbicas adequadas. Estes também podem ser ligados a nucleótidos por es terificação similar de grupos hidroxilo de hidrato de carbono.

Além disso, os nucleósidos antivirais podem ser ligados aos grupos fosfato dos mono-, di- e trifosfatos de fosfatidil-inositol ou às partes hidrato de carbono substituídas por fos fato de fosfolípidos ou glicolípidos, naturais ou sintéticos.

A fosfatidil-serina pode ser ligada a análogos de nucle ósido directamente por esterificação do seu grupo carboxilo com o 5*-hidroxilo do grupo ribose do nucleósido. Os fosfolípjL

570 vr?

-34dos sintéticos, que são semelhantes, em estrutura, a fosfat_i dil-serina, contendo um grupo carboxilo no grupo de cabeça polar, podem ser ligados por uma via similar.

Os fosfolípidos possuindo cadeias alquilo ligadas por ligações éter ou viniléter também podem ser usadas para prepa_ rar derivados de nucleótidos de acordo com o presente invento. Fosfolípidos adequados para este fim compreendem acetal fosfa t ide os de ocorrência natural ou plasmalogen.es , compreendendo um grupo ácido gordo, de cadeia longa, presente numa ligação viniléter insaturada. Alternativamente, podem preparar-se sin téticamente análogos de 1-0-alquilglicerol ou 2-0-alquilglice rol e ligar-se a um nucleótido seieccionado como descrito no Exemplo 7. Preferem-se derivados de glicero-3-fosfo-5*-azidotimidina e podem preparar-se por condensação de monofosfato de AZT com vários análogos de 1-0-alquilglicerol, possuindo um grupo alquilo com um comprimento de cadeia de 2 a 24 carbo nos na posição 1 de glicerol o grupo 1-0-alquilo pode consistir num grupo alifático saturado, insaturado possuindo um com primento de cadeia de 2 a 24 átomos de carbono. 0 resíduo de 1-0-alquilglicerol pode ser racémico ou estereoespecífico. Es te composto pode ser acilado com cloretos ou anidridos de áci dos gordos resultando na síntese de 1-0-alquil-2-acil-glicero -3-fosfo-5'-azidotimidina. Similarmente, usando um grande excesso de monofosfato de azidotimidina, podem sintetizar-se os análogos 1-0-alquil-2,3-bis(f osf o-5 ' ,3 ¹ -azido-3' -desoxitimidi. na)glicerol. Estes derivados têm a estrutura geral:

H₉C— 0— R.

I

HC—

I ⁰

I ii

H_ C — 0- P- A-N

Ιο onde R^ é uma cadeia alquilo insaturada ou saturada com 1 a 23 átomos de carbono de comprimento em ligação éter ou viniléter. R^ é OH ou um éster de ácido gordo saturado ou insaturado, com 2 a 24 átomos de carbono, á também possível uma ligação

570

-35éter ou viniléter em R₂. O grupo na posição 1 de glicerol também pode ser CH se R₂ é a cadeia alquilo ligada por éter.

N é qualquer nucleósido antiviral ligado numa ligação 5'-fo£ fodiéster e A é um elemento do grupo Via da Tabela periódica (Chalcogen) (O, C ou S).

Embora os nucleósidos antivirais fosforilados (nucleótidos) sejam concretizações preferidas do presente invento, é possível utilizar derivados lípidos, de análogos de nucleósido, não contendo fósforo, se não for necessário proporc ico nar às células infectadas o fosfato de nucleósido para conse( guir um efeito antiviral através de processos de metabolismo celular. Alguns exemplos de compostos deste tipo teriam ácidos gordos ester if içados ou presentes em ligação alquilo, di_ rectamente a 5*-hidroxilo do nucleósido de acordo com o méto do do Exemplo 13..

Alternativamente, uma molécula espaçadora, possuindo, por exemplo, grupos carboxilo em qualquer extremidade e 0 a 10 grupos CH^ no centro, pode ser esterif içada a 5* -hidroxi. lo do nucleósido antiviral. 0 outro carboxilo do espaçador pode ser esterificado no hidroxilo livre de diacilglícerol ou qualquer outro lípido possuindo uma função hidroxilo disponível. Podem também usar-se outros grupos de ligação (espaçado res) com grupos funcionais adequados nas extremidades, para ligar o diglicérido ou outro grupo lípido adequado ao nucleósido, por métodos químicos bem conhecidos dos peritos na arte ·

Preparação de lipossomas compreendendo Derivados de Nucleósidos Antivirais

Após síntese, o derivado lípido do análogo de nucleósjL do é incorporado em lipossomas ou outro veículo adequado. A in corporação pode ser realizada de acordo com procedimentos conhecidos de preparação de lipossoma tal como tratamento com uJL trassons (sonacetion), extrusão ou microfluidização. Métodos convencionais adequados de preparação de lipossomas incluem, os revelados por Bangham, et al. (4), Olson, et al. (26), Szo-

570

-36ka e Papahadjapoulos (27), Mayhew, et al, (28), Kim et al.

(29)/ Hayer, et al. (30) e Fukunaga, et al. (31), não lhes estando limitados.

Os lipossomas podem ser produzidos a partir de deriva_ dos lípidos de análogos de nucleósidos sozinhos ou em combinação com qualquer dos materiais fosfolípidos para lipossomas convencionais, sintéticos ou naturais, incluindo fosfolípidos de origens naturais tal como ovo, de origens de plantas ou animais tais como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina ou fosfatidil-inosítol. Os fosfolípidos sintéticos, que podem também ser usados incluem mas não estão limitados por, dimíristoilfosfatidilcolina, di-oleilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina e di-estearoilfosfatidilcolina e as correspondentes fosfatidiletanolaminas e fosfatidilgliceróis sin téticos. Como é convencionalmente conhecido podem também adicionar-se outros aditivos tais como colesterol ou outros este róis, hemi-succinato de colesterol, glicolípidos, cerebrósidos, ácidos gordos, gangliósidos_t esfingolípidos, 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamónio)propano (DOTAP), N-/ l-(2,3-di-oleoil)propil-N,N,N-trimetilamónio (cloreto) (DCTKA), D,L-2,3-diestea_ roiloxipr opil(dimetil) -(?)-hidr oxietilamónio (acetato), glucops_i cosina ou psicosina. As quantidades relativas de fosfolípido e aditivos usados nos lipossomas podem variar como desejado. As gamas preferidas são de cerca de 80 a 95 moles por cento de fosfolípido e 5 a 20 moles por cento de psicosina ou outro adi_ tivo. 0 colesterol hemi-succinato de colesterol, ácidos gordos ou DOTAP podem ser usados em quantidades variando entre 0 e 50 moles por cento. As quantidades de análogo de nucleósido antiviral incorporadas na camada de lipido de lipossomas podem variar com a concentração dos seus lípidos variando entre cerca de 0,01 e cerca de 100 moles por cento.

Usando métodos convencionais para reter, o composto acti vo retém aproximadamente 20 a 50% do material presente em solução; assim, aproximadamente 50 a 80% do composto activo é perdi do. Em contraste, quando o análogo de nucleósido é incorporado nos lípidos, virtualmente todo o análogo de nucleósido é incorporado no lipossoma e virtualmente nenhum composto activo é per

570

.. -- -3 7- ' <· dido .

Cs lipossomas com as formulações acima podem ser tor nados ainda mais específicos para os seus alvos pretendidos com a incorporação de anticorpos monoclonais ou outros ligandos específicos para um alvo. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para o receptor CD4 (T4) podem ser incorporados no lipossoma por ligação a fosfatidiletanolamina (PE) incor porada no lipossoma pelo método de Leserman, et al. (19). Co mo se descreveu anteriormente, o KIV infectará as células por tadoras do receptor CD4 (T4). 0 uso deste imunolipossoma diri^ gido para CD4 focará, o composto antiviral para sítios que KIV pode infectar. A substituição por outra proteína de reconhecimento de CD4 conseguirá o mesmo resultado. Por outro lado, a substituição de anticorpo monocIonal para gpllo ou gp41 (proteínas de revestimento virai de HIV) focará imunolipossomas antivirais para sítios de infecção e replicação de HIV correntemente activa, os anticorpos monoclonais para outros vírus, tais como Herpes Simplex ou citomegalovírus focará com posto activo para sítios de infecção destes vírus.

Usos Terapêuticos de Derivados LÍpidos análogo de nucleósido fosforilado incorporado no lipossoma é administrado a pacientes por qualquer dos procedimen tos conhecidos utilizados para administrar lipossomas. Os lipossomas podem ser administrados intravenosamente, intraperito nealmente, intramuscularmente ou subcutaneamente como solução aquosa tamponada. Qualquer tampão aquoso ou outro veículo farmaceuticamente aceitável pode ser utilizado desde que não destrua a estrutura do lipossoma ou a actividade do análogo de nu cleósido lípido. Um tampão aquoso adequado é fosfato de sódio 5 mM contendo NaCl 150 mM com um pH de cerca de 7,4 ou outras soluções salinas tamponadas fisiológicas.

A dosagem para um mamífero, incluindo um humano, pode variar dependendo da extensão e gravidade da infecção e da actividade do composto administrado. Os níveis de dosagem para os análogos de nucleósido estão bem estabelecidos. Os níveis de

570

-3 8dosagem dos derivados lípidos de análogos de nucleósido de vem ser tais que sejam administrados cerca de C,CC1 mg/Kilo grama a 1000 mg/Kilograma ao paciente numa base díaria e mais preferivelmente de cerca de 0,05 mg/Kilograma a cerca de 100 mg/Kilograma.

O presente invento utiliza os derivados de nucleósido antivirais apontados acima, incorporados nos lipossomas de modo a dirigir estes compostos para macrófagos, monócitos e quaisquer outras células que absorvem as composições lipos sómicas. os ligandos também podem ser incorporadas para focar mais a especificidade dos lipossomas.

Os derivados descritos têm várias vantagens invulgares e novas em relação aos fosfatos de didesoxinucleósidos solúveis em água descritos num pedido co-pendente anterior.

Primeiro, eles podem ser formulados mais eficazmente.

Os lipossomas compreendendo derivados lípidos de análogos de nucleósidos têm razões de droga para lípido muito mais eleva das porque eles são incorporados na parede do lipossoma em vez de se localizarem no compartimento aquoso do núcleo. Em segundo lugar, os lipossomas contendo os derivados de dideso xinucleósido lipof ílicos apontados acima não escspan durante a armazenagem, proporcionando maior estabilidade do produto. Além disso, estas composições podem ser 1iofilizadas, armazenadas secas à temperatura ambiente e reconstituídas para uso, proporcionando maior vida em prateleira. Eles permitem também a incorporação eficiente de compostos antivirais em formulações lipossómicas sem perda significativa de composto activo.

Eles proporcionam também vantagens terapêuticas. A es tabilidade do agente incorporado lipossomicamente obriga uma maior percentagem do nucleósido antiviral administrado a alcançar o alvo pretendido, ao passo que a quantidade absorvida pelas células é, em geral, mínima, diminuindo assim os efe tos laterais tóxicos dos nucleósidos. os efeitos laterais tóx cos dos podem ainda ser reduzidos dirigindo os lipossomas, nos quais eles estão contidos, para locais de infecção reais ou •H| ·Η|

57C

-39potenciais, incorporando os ligandos especificamente a eles ligados nos lipossomas.

Finalmente, os compostos apontados acima foram construídos por uma nova via de modo a originar didesoxinuc leós_i dos, fosforilados ou outros nucleósidos antivirais após meta bolismo celular adicional. Isto melhora o seu efeito anti-re troviral (antiviral) em monócitos e macrófagos ou outras células gue se sabe serem resistentes aos efeitos dos compostos antivirais livres. Além disso, os compostos pré-incubados com células linfóides proporcionam protecção completa con tra infecção por HIV por um período de até, e mais ou 48 horas após a droga ser removida, enquanto que o nucleósido livre não proporciona protecção 24 horas após a remoção. Fina_l mente, espera-se que os compostos lípidos sejam úteis no tratamento de infecções por HIV devidas a estirpes de vírus que são resistentes a análogos de nucleósidos anti-retrovirais li vres .

Os derivados lípidos de agentes antivirais têm um efei to antiviral prolongado quando comparados com os agentes isen tos de lípidos; eles proporcionam portanto vantagens terapêuticas como medicamentos mesmo quando não estão incorporados em lipossomas. Cs derivados lipidos não lipossómicos de análo gos de nucleósido antivirais podem ser aplicados a pele ou mu cosa ou ao interior do corpo, por exemplo oralmente, intratra. guealmente ou de outro modo por via pulmonar, entericamente, rectalmente, nasalmente, vaginalmente, lingualmente, intravenosamente, intra-arter ia lmente, intramuscularmente, intraperi. tonealmente, intradermicamente ou subcutaneamente. As presentes preparações farmacêuticas podem conter o agente activo só zinho ou podem conter ainda substâncias valiosas farmacêutica mente. Fias podem ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável.

As preparações farmacêuticas contendo derivados lípidos de nucleósidos antivirais são produzidas por processos convencionais de dissolução e liofílização de modo a conterem

570 fj. ·'<*

-4 0aproximadamente 0,1% a 100%, preferivelmente aproximadamente 1% a 50% do ingrediente activo. Elas podem ser preparadas como unguentos, pomadas, comprimidos, cápsulas, pós ou pulve rizações, em conjunto com excipientes eficazes, veículos diluentes, fragrâncias ou aromas de modo a torná-las palatáveis ou agradáveis de usar.

As formulações para ingestão oral estão na forma de comprimidos, cápsulas, pílulas, âmpolas de agente activo em pó ou suspensões ou soluções oleosas ou aquosas. Os comprimi dos ou outras composições não líquidas orais podem conter ex cipientes aceitáveis, conhecidos na arte da fabricação de com posições farmacêuticas, compreendendo diluentes, tais como la ctose ou carbonato de cálcio; agentes ligantes tais como gela tina ou amido; e um ou mais agentes seleccionados a partir do grupo consistindo, em agentes adoçantes, agentes aromatizantes, agentes corantes ou conservantes para proporcionar uma preparação palatável. Além disso, estas preparações orais podem ser revestidas por técnicas conhecidas para retardar ainda a desintegração e absorção no tracto intestinal.

As suspensões aquosas podem conter o ingrediente activo em mistura com excipientes farmacologicamente aceitáveis, compreendendo agentes de suspensão, tal como metil celulose; e agentes molhantes, tal como lecitina ou álcoois gordos de cadeia longa. As referidas suspensões aquosas podem também conter conservantes, agentes corantes, agentes aromatizantes e agentes adoçantes de acordo com standards da indústria.

As preparações para aplicação tópica e local compreendem pulverizações de aerossol, loções, geles e unguentos em veículos farmaceuticamente apropriados que podem compreender álcoois alifáticos inferiores, poli-glicóis tais como glicerol, polietileno-glicol, ésteres de ácidos gordos e óleos e gorduras e silicones. As preparações podem ainda compreender anti-oxidantes, táis como ácido ascórbico ou tocoferol e conservan tes tais como ésteres de ácido p-hidrobenzóico.

As preparações parentéricas compreendem particularmente

570

—41 — produtos ésteres ou esterilizados podem proporcionar-se com posições injectáveis contendo a composição activa e qualquer dos veículos injectáveis conhecidos. Estas podem conter sais para regular a pressão osmótica.

A quantidade terapeuticamente activa dos derivados 1/ pidos é determinada por referência às dosagens recomendadas do nucleótido antiviral activo, tendo em vista que, ao selec cionar a dosagem apropriada a qualquer caso específico, secfe ve tomar em consideração o peso, saúde geral, metabolismo, idade do paciente e outros factores que influenciem a respos ta à droga. A dosagem parentérica será aprópriadamente de uma ordem de grandeza inferior à da dose oral.

Pode conseguir-se uma melhor compreensão do invento por referência aos seguintes exemplos ilustrativos que não se destinam, contudo a limitar indevidamente o invento.

EXEMPLO 1

Síntese de 1,2-Dimiristoilglícerofosfo-5'-(3 *-azido-3·-desoxi)tiraidina, sal de mono-sódio.

Preparação de ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA-H)

Num funil de separação (5C0 ml), dissolveu-se primeiro salde di-sódio de ácido dimiristoilfosfatídico (1 g, 1,57 mmol) em clorofórmio:metanol (2:1 em volume, 250 ml) e mistu rou-se bem. Adicionou-se água destilada (50 ml) à solução e o pH foi ajustado a 1 por adição de ácido clorídrico concentrado. A solução foi bem misturada e a camada de clorofórmio foi recolhida. A camada de clorofórmio foi lavada (back mashed) uma vez com metanol:água (1:1 em volumes, 80 ml) e evaporada sob pressão reduzida a 3C-C para produzir ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA-H) sob a forma de uma espuma branca. Adicionou-se ciclo-hexano (10 ml) e a solução foi liofilizada até à secura para obter um pó branco (850 mg) que foi então armazenada a -20-C. Um dia antes da reacção de acoplamento, o DMPA-H (250 mg, 0,42 mmol) foi dissolvido em ciclo-hexano (10 ml) num balão de fundo redondo (50 ml) e o solvente foi evapo rado sob pressão reduzida à temperatura ambiente. Este proces

570

-42so foi repetido mais quatro vezes e o DMPA-H foi ainda seco no forno de vácuo à temperatura ambiente durante a noite so bre R₂°5 ^e armazenado num exsicador a -202c.

Reacçao de acoplamento:

Sob argon, adicionou-se, ao balão de 50 ml, com fundo redondo, contendo DKPA-H seco (250 mg, 0,42 mmol), 3*-azido-3'-desoxitiraidina (AZT) seca, Sigma Chemical, St. Louis, Mis. souri, (85 mg, 0,31 mmol, seca sobre P₂°5 ^s°b ^vacuo durante a noite) e cloreto 2,4,6-tri-isoprópilbenzenossulfonilo (315 mg, 1,04 mmol) e adicionou-se piridina anidra (2 ml) com seringa para obter uma solução límpida. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. (A reacção foi seguida por cromatografia em camada fina). Adicionou-se água (1 ml) ao produto bruto para destruir o catalisador em excesso e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida para produ zir uma goma amarela que foi então redíssolvida num pequeno volume de metanol:clorofórmio (1:9 em volume) e aplicada a uma coluna de sílica-gel (45 g, Kieselgel 60, Alemanha Ociden. tal). A coluna foi eluida com metanol a 8% em clorofórmio.

Após pre-recolha (rejeitada), recuperou-se AZT e depois obteve -se dimiristoilfosfatidil-3¹-azido-3’-desoxitimidina (DKPA-AZT). As fracções contendo o produto foram combinadas e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. 0 ciclo-hexano (5 ml) foi adicionado ao resíduo e a mistura foi liofilizada ate à secura sob vácuo sobre P₂°5 P^ara produzir DMPA-AZT puro (270 mg, 0,29 mmol, 95%).

Conversão no sal de mono-sódio:

Ao DMPA-AZT seco, redissolvido em clorofórmio:metanol (2:1 em volume, 30 ml), adicionou-se água destilada (6 ml), misturou-se bem, e o pH da camada aquosa foi ajustada a 1. A camada de clorofórmio foi recolhida e adicionou-se 10 ml de metanolzágua (1:1) e misturou-se bem. 0 pH da camada aquosa foi ajustada a 6,8 com NaOH metanólico (0,1 M), misturou—se bem, e a camada aquosa foi mantida a pH 6,8. A mistura de cio rofórmio, metanol e água combinados foi evaporado sob pressão

570

-4 3reduzida para produzir sal de mono-sódio de dimiristoilfosfa tidil-3·-azido-3*-desoxitimidina. 0 resíduo foi redíssolvido em clorofórmio:metanol (2:1 em volume, 2 ml) e adicionou-se acetona para precipitar sal de mono-sódio de DMPA-AZT da qual foi ainda seco a partir do ciclo-hexano (5 ml) para pro duzir um pó branco (220 mg, 0,26 mmol, rendimento de 78% com base em AZT). C ponto de fusão foi de 230-C, valor de Rf em placas de camada fina de sílica-gel foi de G 0,32 (clorofórmio:metanol:água:amoníaco 80:20:1:1), Rf de 0,58 (clorofórmio: metanol:águajamoníaco 70:30:3:2), Rf de 0,31 (clorofórmio : meta nol: água : 65:25:4); máximo de absorção UV 266 nm (10,800); Análise calculada para ^c’4j^N5°j_2.^Pl^íí72 * ^{1 H}2°^{: Cf} 57,24; H, 8,44; P, 3,61; Encontrada: C, 56,80; H, 8,83; P, 3,52. SM, M/e 864,60 (M⁺).

RMN de protão: (CDCL3)ó 0,88 (6H, bt, J = 6,9 Hz, acilo CH3) , 1,26 (40 H, s, acilo CH2), 1,60 (4 H, bs,(í) acilo CH2) , 1,94 (3H, s, timina CH3), 2,31 (4H, m,0óacilo CK2) , 2,39 (2H, m, ribose 2Ή), 3,38 (2H, bd, J = 12,6 Hz, ribose 5*H), 3,78 (2H, m, sn-3 CH₂ glicerol), 4,00 (IH, dd, Jl = 12 Hz, J2 = = 6 Hz, sn-1 CH₂ glicerol), 4,18 (IH, dd, Jl = 12 Hz, J2 = =6 Hz, sn-1 CH₂ glicerol), 4,07 (IH, m, ribose 3‘H), 4,41 (IH, m, ribose 4‘H), 5,24 (1K, m, sn-2 CH glicerol), 7,62 (IH, s, timina 6H) , 6,21 (IH, t, J = 6 Hz, ribose 1Ή), A ra zão da área do pico entre ácido fosfatídico e AZT é 1.

EXEMPLO 2

Síntese de 1,2-Dimiristoilglicerofosfc-5’-(3'-desoxi)timidina, sal de mono-sódio

Obteve-se 3’-desoxitimidinaneSigma Chemical, St. Louis, r-íissouri. O derivado lípido deste análogo foi sintetizado usan do o mesmo método descrito acima no Exemplo 1. Ponto de fusão 235^c, Rf em sílica-gel G 0,25 (clorofórmio/metanol/água/amoníaco 80:20:1:1); 0,57 (clorofórmio:metanol:amoníaco:água 70: :30:3:2); 0,24 (clorofcrmio:metanol:água 64:25:4); máximo de absorção UV 296 nm ( 8,400); Análise: Calculada para ^C41^N2°ll^Pl^H72^Nal’^lH2^C’^{: C}' ⁵⁸/⁵³/* ^H' ⁸a⁸⁷7 ^p/ 3,69; Encontrada:

570

-44 C, 56,75; Η, 9,33; Ρ, 3,58. EM, m/e 823.00 (M+).

RMN de protão: (CDCL3 ) cf O, 91 (6K, bt, J = 6,8 Hz, aciloCK3), 1,23 (4H, bs, acilo CH2), 1,26 (4H, bs, acilo CH2), 1,28 (32H, bs, acilo CH2), 1,62 (4H, tn, (3 acilo CR2 ) , 1,97 (3H, s, timina CK3) , 2,05 (2H, m, ribose 2‘H), 2,35 (4H, m,o6acilo CH2), 3,3 9 (2H, bs, ribose 5*K) , 3,90 (2H, tn, sn-1 CK₂ glice rol), 4,16 (1H, m, sn-1 CH glicerol), 4,24 (1H, m, sn-1 CH glicerol), 4,38 (1H, nt, ribose 4‘H), 5,23 (1H, nt, sn-2 glice rol) 6,10 (1H, bt, ribose ΓΗ) , 7,68 (1H, s, timina 6H) . A razão da área do pico de ácido fosfatídico para 2*,3‘-dideso xitimidina é de 1.

EXEMPLO 3

Síntese de 1,2-Dimiristoilglicerofosfo-5’-(2*,3‘-didesoxi)citidina

Preparação de 4-acetil-2',3‘-didesoxicitidina

A uma solução agitada, refluxante de 2’,3’-didesoxicitidina (DDC) (400 mg, 1,89 mmol) em etanol anidro (35 ml, seco primeiro com peneiro molecular 4x do tipo Lindy e destilado duas vezes em aparas de magnésio adicionou-se anidrido acé tico (0,4 ml, 5,4 mmol). Durante o decurso de um período de refluxo de 3 horas, adicionaram-se mais porçoes de 0,4 ml de anidrido acético a intervalos de 30 minutos. A reacção foi se guida por cromatografia em camada fina (Sílica gel F254, Kodak chroma gram, revelada com metanol a 10% em clorofórmio). Após a adição final, a solução foi refluxada durante mais 1 hora. A mistura reaccional foi arrefecida e o solvente foi eva porado sob pressão diminuída, c resíduo foi redissolvido em me tanol a 8% em clorofórmio (5 ml) e cromatografado numa coluna de sílica-gel (2,2 cm x 30 cm, Kieselgel 60, ma lha de 70-230, EM Science 6,45 g). A coluna foi eluída com metanol a 8% em clorofórmio para produzir 4-acetil-2’,3 *-didesoxicitidina (DDC—CAC) pura com rendimento de 80%.

Reacção de Acoplamento:

Um dia antes da reacção de acoplamento dissolveu-se

570

-45DMPA-H (preparado como anteriormente, 250 mg, 0,42 mmol) em ciclo-hexano (10 ml) num balão de fundo redondo (50 ml) e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida a temperatura am biente. Sste processo foi repetido mais quatro vezes e o DMPA-H foi ainda seco num forno de vácuo à temperatura ambiente durante a noite sobre P^O^. Sob árgon, a um balão de fundo redondo, de 50 ml, contendo DMPA-H seco, adicionou-se (DDC-0AC) seco (85 mg, 0,33 mmol, seco sobre PgO^ ^so^ ^v^^cu° durante a noite) e cloreto 2,4,6-triisopropilbenzenossulfoni_ Io (315 mg, 1,04 mmol) e piridina anidra (2 ml) por meio de seringa de modo a obter-se uma solução límpida. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. fA reacção foi seguida por cromatografia em camada fina). Adiconou-se água (1 ml) à mistura para destruir o catalisador em excesso. 0 solvente foi evaporado sob pressão reduzida para produzir uma goma amarela que foi redissolvida num pequeno volume de metanol em clorofórmio Cl:9 em volume) e aplicada a uma coluna de sílica-gel (45 g, Kieselgel 60, SM Science). A coluna foi coberta com uma pequena quantidade de areia (50C mg) para evitar que a amostra flutuasse durante a eluição. A coluna foi eluída com metanol a 8% em clorofórmio (1,5 1).

Após uma pré-recolha (forerun) (rejeitada), obteve-se então dimiristoilfosfatidil-5’-(2‘,3*-didesoxi)citidina (DMPA-DCC). As fracções contendo o produto foram combinadas e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. 0 resíduo foi ainda seco com ciclo-hexano para produzir DMPA-DCC-CAC puro (210 mg,

0,21 mmol, rendimento de 70%). Rf 0,40 (Sílica-gel GP, 20 x x 20 cm, Analtech, clorofórmio:metanol:água:amoníaco 80:20:

: 1:1 em volume).

pesblocruearaento com NH^CH 9N:

Dissolveu-se DDC-OAC-DMPA (40 mg, 0,04 mmol) em clorofórmio: metanol (1:1, 2 ml) e adicionou-se de uma só vez NH OH 9N (10 gotas). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 15 minutos e foi então rapidamente neutralizada com ácido acético glacial até pH 7. A solução neutralizada foi eva porada até à secura durante a noite sob pressão reduzida para

BAD ORIGINAL

570

-46produzir dimiristoilfosfatidil-5 *-( 2 ’,3’-didesoxi)citidina fDMPAr-DDC, 35 mg, 0,037 mmol). Ponto de fusão: DMPA-ddC decomposto a 24OSC. Ma cromatografia, em camada, fina em placas de sílica-gel GF os valores de Rf foram: G,ll (clorofórmio: jmetanol:água:amoníaco 80:20:1:1); 0,38 (clorofórmio:metanol: :amoníaco:água 70:30:3:2); 0,15 (clorofórmio:metanol:água 65: :25:4) ; máximo de absorção UV 273 nm ( 5,800).

RMN: (CDCL3 } 6 0,86 (6H, bt, acildCH3), 1,24 f40H, bs, acilo CH2), 1,57 (4H, m, Ç) acilo CH2 ) , 2,28 (4H, m, oó acilo CH2 ) , 3,36 (2H, m_r ribose 5Ή), 3,94 (2H, bs, sn-3 CH₂ glicerol), 4,19 ClH, m, sn-I CH₂ glicerol), 4,29 ClH, m, sn-1 CH₂ glicerol), 4,40 (1H,. bs, ribose 4^lH), 5,19 ClH, m, sn-2 CH glicerol), 5,89 ClH, m, timina 5-íT), 7,44 ClH, bs, timina NH3) , 7,94 ClH, bs, timina NH₂). ^{A raz}^° ^da área do pico de ácido fosf£ tídico para 2',3¹-didesoxicitidina é de 1.

EXEMPLO 4

Síntese de C3*-Azido—3 *-desoxi)timidina-5^r-difosfato-sn-3 — _(l,2-dipaImitoil)glicerol

Síntese de rrtorf olidat o de AZT-monofosfato:

Este composto foi sintetizado seguindo o método de Agranoff e Suomi (21). 0 AZT-monofosfato foi convertido na forma acídica por passagem de uma solução em água através de uma coluna de Dowex 5Cw (50 x 2-200, malha de 100-200 Sigma Chemicals, St. Louis, Mo). Uma solução de 117 mg de AZT-monofosfato (0,3 milimoles) em 3 ml de água foi transferida para um balão de fundo redondo de duas tubuladuras. Adi cionaram-se os 3 ml de t-butanol e os 0,106 ml de morfolina recém-destilada (1,20 milimoles) e a mistura foi colocada num banho de óleo a 90²C. Adicionaram-se gota a gota quatro equivalentes de diciclo-hexilcarbodiimida (249 mg, 1,20 milimoles) em 4,5 ml de t-butanol. A reacção foi controlada por cromatografia em camada fina em placas de sílica-gel 6c,

F254 , (E . Merck Darmstadt) com clorofórmio/metanol/ácido acético/água (50/25/3/7 em volume) como solvente de revelação. Verificou-se que a reacção estava completa após 3 horas. A

57C

-4 7— mistura foi arrefecida e após adição de 4,5 ml de água foi extraída quatro vezes com 15 ml de éter dietilico. A camada aquosa foi evaporada até à secura e seca em vácuo sobre Ρ₂0^. 0 produto foi obtido (199 mg, rendimento de 100%) e usado para acoplamento a ácido fosfatídico sem mais purifica çã o.

Acoplamento de morfolldato de AZT-monofosfato a ácido dipalmltoílfosfatídico:

Ácido dipa lnritoí lfosf atídico, sal de dissódio, foi convertido no ácido livre por extracção do material em cloro fórmio, pelo método de Bligh e Dyer (34) usando HCl 0,1 N co mo fase aquosa. A camada de clorofórmio foi evaporada até à secura em vácuo, o ácido fosfatídico (196 mg, 0,3 milimoles) foi redissolvido em clorofórmio e transferido para o vaso con tendo o morfolidato de AZT-monofosfato. Após o clorofórmio ter sido removido em vácuo usando um evaporador rotativo, a mistura foi seca por adiçao e evaporação de benzeno e finamen te seca em vácuo sobre ^{A reac}Ç^° foi iniciada por adição de 30 ml de piridina anidra e a mistura límpida foi agita da à temperatura ambiente. A reacção foi controlada com croma tografia em camada fina, como se referiu anteriormente, com clorofórmio/metanol/amoníaco/água (70/38/8/2 em volume) como solvente de revelação. C Rf de ácido fosfatídico, morfolidato de AZT-monofosfato e AZT-difosfato dipalmitoilglicerol é de 0,11, 0,50 e 0,30, respectivamente.

Após 70 horas, a piridina foi evaporada e o produto foi extraído em clorofórmio após adição de 15 ml de água, 30 ml de metanol, 22 ml de clorofórmio e ácido fórmico 1 N suficiente para ajustar o pH a 4,0. As camadas de clorofórmio com binadas, após duas extracções, foram evaporadas até à secura, o resíduo foi dissolvido em clorofórmio/metanol/amoníaco/água, 70/38/8/2, e o produto foi purificado por cromatografia em co luna de sílica-gel neste solvente, aplicando uma pressão de ar equivalente a um metro de água. As fracções não completamente puras foram ainda purificadas por HPLC numa coluna de fase inversa (Vydac C18) usando água/metanol (8/2 em volume)

9 5 70

-4 8e metanol como eluentes. As fracçoes contendo o produto dese jado foram evaporadas até à secura para dar 132 mg de um sólido branco (rendimento de 44%) que deu uma única mancha por cromatografia em camada fina com placas de sílica-gel g reve ladas com clorofórmio/metanol/amoníaco/água, 70/38/8/2 (Rf 0,35) e clorofórmio/metanol/água, 65/35/4 (Rf 0,54).

500 MHz RMN (CDC1₃) cf 0,88 (3H, t, J = 6,93 Hz, sn-2-acilo CH₃), 0,92 (3H, t, J = 7,48 Hz, cadeia de sn-l-acilo CH^),

1,25 (48H, s,. CH₂ cadeias de acilo), 1,55 (4H, bs,(3cH₂ cadeias de acilo) 1,83 (3H, s, CH^ timina), 2,25 (2H, t, J = « 6,97 Hz, 2H, alfa CH₂ cadeia do sn-2-acilo), 2,27 (2H, t,

J = 7,79 Hz,0íCH₂ cadeia de sn-l-acilo), 2,44 (4H, bs, 2* e 5* H ribose), 3,78 (IH, dd, J = 1,68, 5,51 Hz, 3‘H ribose), 3,95 (2H, bs, sn-3 CH glicerol), 4,07 (IH, bs, He/Η sn-1 CH₂ glicerol), 4,13 (IH, bs, IH, sn-2 CH glicerol), 4,36 (IH, bs, Η /H sn-1 CH glicerol), 5,21 (IH, bs, sn-2 CH glicerol), 5,66 (IH, bs, 1Ή ribose), 7,14 (IH, d, J = 6,25 Hz, 6H timi — na). A razSo de cadeias de acilo:glicerol:ribose:timina, dedu zida a partir de ressonâncias apropriadas correspondia a 2,12: :0,93:0,98:1,00. IV (KBr, disco) mostrou 2105 (azido), 1745 (c=0 éster) e 1705 (c=0 timina) como bandas identificáveis.

EXEMPLO 5

Síntese de um diacilfosfato de nucleósido antiviral

A di-hexadecilfosfo-5*-didesoxicitidina é sintetizada de acordo com o método descrito no Exemplo 1, com excepção dos reagentes serem didesoxicitidina e hidrogenofosfato de di-hexadecilo. O material de partida hidrogenofosfato de di-hexa decilo é sintetizado a partir de hexadecano-l-ol e fosforodicloridrato de fenilo como foi primeiro revelado por D. A. Brown, et al. (32) .

EXEMPLO 6

Síntese de didesoxiadenosina difosfato ceramida: um fosfonucleósido antiviral

O método do Exemplo 2 é repetido com excepção de se su

9 5 70

-4 9bstituir morfolidato de monofosfato de didesoxicitidina por morfolidato de monofosfato de didesoxiadenosina. O ácido ce ramida-fosfórico é preparado por acção de oxicloreto de fós foro em ceramída, C ácido dimiristoilfosfatídico é substituído por ácido ceramidafosfórico. Obtêm-se resultados seme lhantes.

EXEMPLO 7

Síntese de l-0-estearoilglicero-rac-3-fosfo-5'-(3·-desoxi-3-azido)timidina:

Misturaram-se 1-0-estearoil—rac-3-glicerol seco (álcool batílico, 250 mg), sal de sódio de monofosfato de 3‘-azido-3’-desoxitimidina (0,725 g) e cloreto de 2,4,6-triiS£ propilbenzenossulfonilo (TPS, 1,.219 g) em piridina seca e agitaram-se durante a noite sob azoto. Adicionou-se clorofór mio (50 ml) e a mistura reaccional foi lavada duas vezes com HC1 0,2 N frio e bicarbonato de sódio 0,2 N. A fase orgânica foi removida em vácuo com um evaporador rotativo e o produto foí cristalizado a -20-C em 20 ml de clorofórmio/acetona (12: :8 em volume). A purificação final do composto foi feita por cromatografia preparativa em camada fina usando microcamadas 500 de sílica-gel G reveladas com clorofórmio/metanol/amonía co concentrado/água (70/30/1/1 em volume).

Nas sínteses anteriores, os espectros de RMN de protão foram obtidos com espectrómetro General Electric QE-3C0, usando tetrametilsilano como padrão interno (chave=s=singuleto, d=dupleto, t=tripleto, q=quarteto, dd-dupleto de dupletos, b=largo), cs espectros de UV foram registados num espectrofotómetro Shimadzu UV-160. Cs espectros de massa de bombardeamento atómico rápido foram determinados pelo Laboratório do Serviço de Espectrometria de Massa da Universidade de Minneso ta. As análises elementares foram determinadas por Galbraitb Laboratories, Knoxville, TN. e Schawarzkopf Microanalytica1 La boratory, N.Y. Os pontos de fusão foram obtidos com um aparelho de fusão de Fisher-Johns. A cromatografia em coluna foi realizada em sílica-gel 60 da Merck (malha de 7O-23C). Cs valores de Rf foram obtidos em placas pré-revestidas de Kiesel69 570

-50gel 60 HPTLC Merck, 10 x 10 cm. A piridina anidra, o cloreto de 2,4,6—triisopropilbenzenossulfonilo CTPS) e a 3‘-azido-3*-desoxitimidina CAZT) foram adquiridos na Aldrich. 0 ácido d/ miristoilfosfatídico, sal dissódico, foi adquirido em Avanti; O álcool batílico foi obtido na Sigma Chemical, St. Louis, Missouri.

EXEMPLO 8

Preparação de Lipossomas contendo Liponucleótidos Antiretrovji rais

Misturaram-se 6,42 micromoles de dioleoilfosfatidíIcoIina, 3,85 micromoles de colesterol, 1,28 micromoles de dioleoilf osfatidilglicerol e 1,28 micromoles de dimiristoilfosfa. tidϋ-azidotimidina num frasco de vidro estéril, de 2,0 ml, e removeu-se o solvente em vácuo num evaporador rotativo. Em al gumas experiências a dimirist.oilfosfatidilazidotimidina foi substituída por dimiristoilfosfatidildidesoxitimidina, dimiristoilfosfatidildidesoxicitidina ou azidotimidina difosfato dimiristoilglicerol; os lipossomas de controlo foram preparados omitindo o liponucleótido antiviral. A película foi colocada sob alto vácuo durante a noite à temperatura ambiente pa. ra remover vestígios de solvente. A película de lípido foi hi dratada a 3C2C com 0,3 ml de tampão de acetato de sódio estéril 10 mM (pH 5,0) contendo dextrose isotónica e a ampola foi selada. A mistura foi submetida a vortex intermitentemente du rante 10 minutos seguida por sujeição a tratamento com ultras sons (sonication ) usando um aparelho (sonicator'*) Heat Sys tems Ultrasonics com um gerador de canpâ-iula (431B) com ajustamen to de controlo de saída de #9 durante 90 a 12C minutos, altura em que a amostra está clarificada. Esta preparação submet da a tratamento com ultrassons foi diluída com tampão PPMi e téril e adicionada às cavidades com cultura de tecido na concentração indicada.

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ΒΑΠ ORIGINAL

570

-51EXEMPLO 9

Acoplamento de anticorpos monoclonais para CD4 a um liposso ma contendo lípido antiviral

A dimiristoilfosfatidil-AZT é produzida pelo método do Exemplo 1, dimiristoilf osf atídilcolina, colesterol e dimi. ristoilfosfatidiletanolamina numa razão molar de 39:39:20:2 200 mg desta mistura de lípidos foi seca in vacuo usando um evaporador rotativo para formar uma película fina num balão de fundo redondo de 100 ml. Adicionou-se 1 ml de solução salina estéril, tamponada com fosfato, e a mistura foi agitada suavemente a 20-C durante 20 minutos seguindo-se de 7 ciclos de 30 segundos de sujeição a vortex para formar lipossomas multílamelares. A suspensão foi submetida a 5 ciclos de extrusão através de dois filtros de policarbonato Nucleopore empilhados possuindo diâmetros de poro de 200 nm, para produ zir uma população lipossómica homogénea. Podem ser usados mé todos, tais como tratamento com ultrassons, evaporação em fa se inversa e o uso de uma prensa Francesa ou de Microfluidificador (Microfluidics, Newton, Kassachusetts). 1 a 2 mg de anticorpos monoclonais CKT4a antigénio CD4 são tiolados por incubação com 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) 0,C8 mM. 0 SPDP não tratado é removido por filtração em gel através de Sephadex G25. A proteína DTP carente é reduzida com diotiotreitol 0,C5 M em solução salina tamponada com acetato 0,1 M a pH 4,5 durante 20 minutos, produzindo anticorpo tiolado reduzido.

Os lipossomas produzidos pelo método do Exemplo 5, re presentando 5 micrcmoles de fosfolípido são incubados durante a noite a temperatura ambiente com 1 mg de anticorpo tiolado em 0,20 ml de tampão isotónico MES/KEPES, pH 6,7. Os imunolipossomas resultantes são purificados pelo método do gradiente descontínuo de metrizimida de Eeatn, et al. (33) e esterilizados por passagem através de filtros de 200 nm.

Ί

BAP ORIGINAL

9 5 70

-52EXEMPLO 10

Inibição da Replicação de HIV em células de Cultura de Tecido por Conjugados de Nucleósidos lípidos

A. MÉTODOS

Infecção Virai de Células—T Humanas:

A linha de células linfoblastóide T humana, CCRG-CEM (daqui em diante designada por CEM) foi feita crescer em meio RPMI 1640 contendo 100 U/ml de penicilina G, 100/ig/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM e 10% de soro bovino fetal (Hyclone Laboratories, Logan, Utah). As células foram infectadas com a estirpe LAV-I (L. Montagnier, Paris, França) a uma multiplicidade de infecção de uma dose 50% infecciosa de cultura de tecido (TCID^QÍ/célula durante 60 minutos a 37-C em meio contendo 1% de polibreno. As células (EM foram infectadas em suspensão a 6 χ 10⁴ células/ml, lavadas trés vezes por centri fugação e ressuspensão e depois distribuídas em placas de 96 cavidades a 6 x lo⁴ células/cavidade antes da adição de meio contendo as drogas lipossómicas de liponucleótido anti-retroviral.

Actividade Antiviral determinada por Ensaio de HTV p24:

A actividade antiviral foi ensaiada após 3 dias pela inibição da produção de antigênio HIV p24 (gag) no meio de cu tura isento de células das células infectadas, exposto a dife rentes concentrações de droga; o antigênio p24 foi medido por ELISA (Abbott Laboratories, Chicago, IL) de acordo com as ins trucções dos fabricantes. Os valores são a média de duas dete. minações e estão expressos como percentagem de um controlo in cubado na ausência de drogas.

B. Experiências H533-1: Figura 1

Os lipossomas contendo 10 moles por cento de dimiris toilfosfatidilazidotimidina (LN1), dimiristoilfosfatidildidesoxitimidina (LN2) ou azidotimidina difosfato dimiristoilglicerol (LN4) nas concentrações indicadas foram testados quanto à sua capacidade para inibir a replicação de HIV em células

570

-53CEM (Tipo selvagem) in vitro. Todos estes três liponucleótidos anti-retrovirais inibiram a produção de HIV p24 ; as quan tidades de droga necessárias para reduzir a produção de vírus em 50% (E.D, 50) foram as seguintes:

Fosfatidilazidotimidina (LN1) 2 pM

Fosfatidildidesoxitimidina (LN2) 30 μΜ

AZT difosfato dimiristoilglicerol (LN4) 8 pM

Isto demonstra que os derivados lipidos de nucleótidos anti-retrovirais podem entrar nas células CEM e ser convertidos em nucleósido activo como se tinha previsto. Os lipossomas de controlo (CONT) que não continham qualquer nucleótido anti-retroviral não tiveram efeito na produção de p24 pelas células CEM.

C. Experiência H747-19: Figura 2

A dimiristoilfosfatidilazidotimidina em lipossomas (LN1) foi comparada com azidotimidina livre (Nl). A baixas concentrações, abaixo de 0,1/iM a AZT livre foi mais eficaz do que o liponucleótido. A concentrações variando entre 2 e 170/J.M os lipossomas de fosfatidilAZT foram mais eficazes do que a AZT livre. Os lipossomas de controlo (CC-NT) contendo so mente lipidos inactivos, como se mencionou nos métodos, foram ineficazes na redução de p24.

D. Experiência H747-lb: Figura 3

A didesoxitimidina (N2 ) é um inibidor fraco da produção de HIV p24. Surpreendentemente, a fosfatidildidesoxitimidina (LN2) é de certo modo mais eficaz do que o nucleósido li vre. Como se pode ver nos gráficos é necessário ligeiramente mais ci.dT livre para reduzir a produção de p24 do que com fosfatidildidesoxitimidina. Cs lipossomas de controlo (CONT) a uma concentração total de fosfolípido condizente não têm efei to.

Ξ. Experiência H637-lb: Figura 4

Nesta experiência, as células CEM foram substituídas

BAD ORIGINAL '

I ----69 570

X te»

-54 — por células mutantes (fornecidas por Dr. Dennis Carson, Serio ps Clinic, San Diego, CA) que não têm a enzima timidina-quina, se (CEMtK^-) . Estas células não são capazes de fosforilar deri. vados de timidina e a AZT é portanto inactiva uma vez que não pode ser convertida no derivado trifosfato activo que é neces. sário para inibir a replicação de KTV p24 . Como se mostra nos gráficos, a AZT (Nl) é ccmpletamente sem efeito na produção p24 numa grande gama de concentrações (0,2 a 1C0/1M). Contudo tanto a fosfatidilAZT (LNl) como a fosfatidilddT (LN2) foram capazes de reduzir a produção de p24, desde que estes compos( tos fossem metaboiizados na célula a monofosfato de nucleósido que pode ser ainda activado para trifosfato por outras enzimas celulares. Estes dados proporcionam a prova do princípios delineados na patente que prevê o metabolismo directo pa ra o monofosfato de nucleósido.

F. Experiência H805-1: Figura 5

Nesta experiência a dimiristoilfosfatidildidesoxicitidina (LN3) e dimiristoildidesoxitimidina (LN2) foram comparadas com os efeitos de AZT livre (N2) e didesoxicitidina (N3) em células CEM (tipo selvagem) in vitro. A fosfatidilddC foi o liponucleótido mais potente (ΞΏ^θ 1,1/lM) e a fosfatidilddT foi menos activo como se viu anteriormente (ΞΠ^θ 20/1M). Os lipossomas livres sem nucleótido anti-retrovira1 (CCNT) adicionado foram inactivos,

G. Experiência 1276:

Nesta experiência,a protecção antiviral proporcionada pela pré-incubação com dimiristoilfosfatidilazidotimidina (LNl) em lipossomas preparados como se mencionou acima foi comparada com a da azidotimidina livre (Nl). As células CEM (tipo selvagem) foram pré-incubadas durante 3 dias sob condições padrão em meios RPMI contendo 7,I4/1M de AZT livre (Nl) ou de fosfatidilAZT (LNl). As células foram então lavadas duas vezes com PB3 e adicionaram-se meios RPMI frescos. Cada grupo de células foi então dividido em três lotes. Um lote foi imediatamente infectado com HIV, como se viu acima; após

570 «r.

-55remoção por lavagem do HIV não ligado, a amostra foi deixada incubar em meios sózinhos durante 3 dias. Deixaram-se incubar dois outros lotes em meios sózinhos durante 24 ou 48 horas para permitir que qualquer agente antiviral intracelular ficasse esgotado. Sm seguida, eles foram infectados com HIV, as células foram isentas do vírus, por lavagem, e adicionaram-se meios RPMX frescos. Após 3 dias de mais incubação, os sobrenadantes de todos os lotes foram testados relativamente à presença de proteína p24.

Células de controlo; Células CEM foram sujeitas a infecção por KTV sem pré-incubação; a droga foi adicionada a seguir à infecção com HIV como indicado e as células foram incubadas durante 3 dias.

Células pré-incubadas: Células CEM foram pré-incubadas durante 3 dias com meios contendo AZT (Nl) ou fosfatidilAZT (LN1); após 3 dias as células foram lavadas, sujeitas a infecção por HIV seguida de adição de meios sem drogas. Após mais uma incu bação durante 3 dias, mediu-se o p24.

Resultados: p24: ng/ml após 3 dias de

Controlos de CEM: Sem Pré-incubação incubação

apenas infecção com	HIV			2 04 ;	2 07
HTV + azidotimidina	7,14		(Nl)	64;	69
HIV + FosfatidilAZT	7,14		(LN1)	16;	16
				p2	'4: ng/ml
			Intervalo	de Pré- ap	ós 3 dias
Células Pré-Incubada	s		-infecção	sem Droga de	incuba çã

Az idotimidina	7,14		(Ml)	24 48	h h	404 ; 271;	433 245
FosfatidilAZT	7,14		(LN1)	24	h	6 ;	7
			48	h	4;	15

570

X t-56Após uma pré-incubação de 3 dias, seguida por 48 horas de incubação em meios normais após remoção das drogas, a fosfatidilAZT proporcionou uma protecção completa contra a replicação de HIV como determinado pela produção reduzida de p24 . Contudo, a pré-incubação com AZT falhou na protecção das células contra a infecção por HIV 24 e 48 horas após a remoção da droga.

H. Experiência J45:

Nesta experiência o composto do Exemplo 7 (1-0-estearoilglicero-rac-3-fosfo-5¹-(3·-desoxi-3*-azido)timidina) foi incorporado em lipossomas contendo IO moles por cento do liponucleótido como indicado no Exemplo 8. Sste material foi diluído com meio RPMI até à concentração desejada e adiciona^ do a células HT4-6C (células CD4+HeLa) obtidas de Dr. Bruce Chesbro dos Rocky Mountain National Laboratories (Hamilton, Montana) gue tinham sido infectadas com LAV-1 como se mostrou anteriormente neste exemplo. Após uma incubação de 3 dias a 372C, as células foram lavadas com PBS, fixadas e coradas com violeta de cristal e as placas foram contadas. Os resultados são apresentados abaixo.

Concentração de Liponucleótido	Placas, Média	% de controlo não tratado
10 jiM	1	2
3,16	7	13
1,0	lo	29
0,316	32	58
C, ICO	39	71
0,0316	43	78
0	57

Cs dados mostram que a l-C-estearoil-rac-3-fosfo-5’-(3'-desoxi-3'-az ido)timidina é eficaz na inibição da formação de placas de HIV em células KT4-6C infectadas com LAV-1. A concentração necessária para produzir uma inibição de 5C% é de cerca de 0,35 micromolar.

570

Zt

-Τ'

-57EXEMPLO 11

Isolado emparelhai) HIV : Sensibilidade Antiviral I.C.^ ,^U.M; Ensaio de Redução de placas em HT4-6C

Métodos: as células HT4-6C (células CD4+ HeLa) foram obtidas do Dr. Bruce Chesebro, Rocky Kountain National Laboratories, Hamilton, MT), e infectadas com isolados de HIV como se mostrou no Exemplo 10. Após uma incubação de 3 dias as células foram lavadas fixadas e coradas com violeta de cristal e as placas foram contadas. As amostras clínicas de HIV foram iso ladas antes da terapia com AZT (Pre) e 6 a 12 meses após o tratamento com AZT (Post). (Richman, D.D., Larder, B., e Dar by, G., Manuscrito submetido a publicação, 1989). Usando o ensaio de redução de placas em HT4-6C, determinou-se a sensi bilidade dos isolados clínicos emparelhados usando AZT, fosfatidilAZT ou fosfatidilddT .

ISOLADO	AZT	p-AZT	pddT
A012
Pre (G762-3)	0,01	0,53	4,2
Post (G691-2)	2	0,37	6,6
A018
Pre (H112-2)	0,01	0,47	7,4
Post (G91O-6)	4	0,59	6,3
AO36
Pre (G174-6c)	0,007	0,42	7,4
Post (G7O4-2)	5,6	0,59	4,2
PCPC22
?re (Kl12-5)	C,C3	0,47	4,2
Post (G780-1)	5,6	1,05	6,6
PCPO26
Pre (H112-6)	0,01	0,33	6,6
Post (G89O-1)	2,8	0,74	2,6

570

-58Abreviaturas: pAZT, fosfatidilazidotimidina pddT, fosfatidildidesoxitimidina

Após o tratamento com AZT, todos os 5 isolados mostra ram uma diminuição significativa na sensibilidade a AZT. Não se observou que isto ocorresse com pAZT e pddT, indicando que os isolados post-AZT retinham o seu nível de sensibilidade usual para o nucleósido anti-retrovira1 administrado na forma de novos derivados fosfolípidos.

EXEMPLO 12

Sintese de Fosfatidilaciclovir e eficácia em células WI-38 In fectadas com vírus Herpes Simplex

Obteve-se ácido dimiristoílfosfatídico (sal dissódico) em Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL e converteu-se no ácido livre (DMA—H) como se descreveu anteriormente no Exemplo 1. A acicloguanosina (aciclovir, Zovirax ) foi obtida na Sigma Chemical Co., St. Louis, MO e secaram-se 73 mg (0,32 mmol) du rante a noite em pentóxido de fósforo num forno de vácuo. Adi. cionaram-se 250 mg de DMPA-H (0,42 mmol) a \im balão de fundo redondo de 50 ml e secaram-se durante a noite em pentóxido de fósforo num forno de vácuo. Sob árgon seco, adicionaram-se a um balão de fundo redondo 73 mg de acicloguanosina, 315 mg (1,04 mmol) de cloreto de triisopropilbenzenossulfonilo (Aldrich, Milwaukee, Wl) e 2 ml de piridina seca (Aldrich, Milwaukee, Wl) . A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas seguindo-se a adição de 1 ml de água destilada .

O solvente foi evaporado em vácuo para produzir uma go ma amarela que foi dissolvida num pequeno volume de clorofórmio/metanol (9/1) e aplicada a uma coluna de sílica-gel (45 g: Kieselgel 60, EM Science, Cherry Hill, JN) . A coluna foi eluída com metanol a 8% em clorofórmio (500 ml), metanol a lc% em clorofórmio (250 ml) seguido por metanol a 15% em clorofórmio (1,5 1). Após uma pré-recolha de 1,5 litro (rejeitada) obteve-se dimiristoilfosfatidilcícloguanosina (pACV). Recolheram-se e analisaram-se três fracções: fracção 1 (200 ml, 130 mg de

9 570

-59pACV) continha pACV pura; fracção 2 (200 ml, 150 mg) e frac ção 3 (200 ml, 50 mg) continham pACV e pequenas quantidades de material de partida como impurezas. A fracção 1 foi concentrada em vácuo e adicionaram-se 5 ml de ciclo-hexano ao resíduo; a solução foi congelada e liofilizada até à secura sob pentóxido de fósforo para produzir fosfatidílacicloguanosina pura (80 mg, 0,1 mmol).

composto purificado deu uma única mancha com um Rf de 0,29 quando aplicado a placas de sílica-gel KGG (whatman International, Maidstone, Inglaterra) reveladas com clorofórmio/metanol/água/amoníaco ¢70/30/1 em volume). A absorção em UV foi máxima a 256 nm (coeficiente de extinção = = 8,4 x 10 em CHCl^). A percentagem de fósforo foi de 3,30%. (teórica 3,89%) e o ponto de fusão foi de 245^eC. A análise de HPLC, a fosfatidilacicloguanosina deu um único pico com um tempo de retenção de 11 minutos (Spheri-5; Brovmlee Labs, Applied Biosystems, Santa Clara, CA) guando eluída com uma fase móvel de 1-propanol/fosfato de potássio 0,25 mfVhexano/ /etanol/ácido acético (245/179/31/50/0,5 em volume) a um cau dal de 0,5 ml/tnn.

Culturas de Células

Obtiveram-se WI —38 na American Type Culture Collection (Rockville, Maryland 20852) e fizeram-se crescer em meio essencial mínimo de (DMSM) com 10% de soro de vitelo fetal (FCS). As células foram feitas crescer em frascos de 250 cm quadrados até alcançarem a confluência.

V írus

Obtiveram-se vírus de herpes Simplex (HSV) tipo 1 (HSV -1) e tipo 2 (HSV-2) na American Type Culture Collection. Ambos os stobs de vírus foram preparados em células WI-38; observaram-se efeitos citopáticos extensivos (CPD) quando o stock de vírus foi colhido com um simples congelamento e des congelamento e os resíduos celulares foram clarificados por centrifugação de baixa velocidade (2000 Rpm)· Cs fluídos sobre nadantes que continham o vírus foram divididos em alíquotas em

570

-60pequenos frascos e armazenados a SO⁹C. Os stocks de HSV-1 e HSV-2 foram titulados em células Wi-38 antes de utilização nas experiências.

Ensaio de Redução de placas de Vírus Herpes Simplex ensaio de redução de placas foi usado para medir o efeito antiviral de fosfatídilaciclovir ou ACV livre. As células Wi-38 foram tripsinizadas com tripsina a 0,25% durante 5 mn. As células foram colhidas e centrifugadas para remover tripsina residual e a pelota de células foi ressuspensa em DMEM com 10% de FCS. As células Wi-38 foram preparadas em lá minas numa lâmina de 96 cavidades (5 x 10 células/cavidade) durante uma hora. As células infectadas foram então tratadas com fosfatidilaciclovir ou ACV. Os agentes antivirais foram preparados em soluções de stock que foram depois diluídas duas vezes com 2% de FBS em DMEM. Contendo 0,5% de metil celulose. Adicionaram-se 100/^1 de cada agente antiviral diluí do a cada cavidade de células infectadas com HSV.

As culturas de controlo e de células tratadas com a droga foram incubadas numa incubadora a 37-C com 5% de dióxi do de carbono durante 24 horas. Quando as células infectadas com HSV (controlo sem agente antiviral) apresentaram um núme ro de placas legível, a lâmina inteira foi fixada com metanol e corada com violeta de cristal a 1% durante 10 mn. 0 co rante foi retirado por lavagem com água da torneira e a lâmi na foi seca e as placas contadas. C efeito antiviral de ACV ou fosfatidilaciclovir foi determinado por medição da redução de placa como se mostra no exemplo abaixo.

Resultados: Efeito de Aciclovir e de Fosfatidilaciclovir na formação de Placas por HSV-1 em Células WI-38

Cone, de Aciclovir 1 2 média % Sem droga pM 5

2,5

0 0 0 0 0 0 0 0

BAD ORlG^Al69 570

-61Conc. ãe Aciclovir 1 2 média % Sem droga

1,25	4	3	3/5	13
0,625	8	6	7	26
0,31	17	19	20	65
0,155	18	22	20	73
0	20;	30 3 0,-3 0	27,5	100
FosfatidilACV	1	2	média	% Sem droga
214 μΚ	tóxico	tóxico	—	—
107	0	0	0	0
54	0	0	0	0
27	2	3	2/5	9
13,4	4	6	5	18
6,7	6	9	7,5	27
3,3	10	12	11	40
1,67	17	20	18,5	67
0,84	24	26	25	91
0	2O;3O	3O;3O	27,5	100

Os resultados apresentados acima indicam gue o fosfatidilaciclovir é eficaz em células Wi-38 infectadas com HSV-1. A concentração que produz uma inibição de 50% é de 2 contra 0,4 gjM para o aciclovir. Obtiveram-se resultados seme lhantes com HSV-2 em células Wi-38 infectadas.

EXEMPLO 13

Síntese de 5’-palmitoil(3’-desoxi-3 ¹ -azido)timidina

Dissolveram-se 0,5 gramas de AZT (1,87 mmol) em 10 ml de clorofórmio seco e 2 ml de piridina seca. 0,78 gramas (2,8 mmol) de cloreto de palmitoilo (Aldrich Chemicals, Milwaukee WL) dissolvidos em 5 ml de clorofórmio seco foram adi cionados lentamente durante um período de 20 minutos a 4 e a mistura reaccional foi deixada aquecer a temperatura ambiente com agitação. Após 20 horas, a reacção foi interrompida r

BAD ORIGINAL

570

-62com a adição de 8 ml de água destilada e adicionaram-se 38 ml de clorofórmio/metanol/KC1 0,5 N (1/2/0,8 em volume). As fases foram separadas pela adição de 10 ml de clorofórmio e g ml de HCI 0,5 N. A fase orgânica, contendo o composto regue rido foi ainda lavada com bicarbonato de sódio 0,5 N. A fase de clorofórmio inferior foi seca em sulfato de sódio anidro e evaporada sob vácuo. 0 composto foi cristalizado em clorofórmio/acetona a -20^C. Obteve-se uma purificação adicional por cromatografia em coluna com ácido silicico e obtiveram— -se 145 mg de 5' -palmitoil(3*-azido-3‘-desoxi)timidina (rendimento de 15,3%). Análise elementar; C 61,59, H 8,5, N 13,8 e 0 15,8;-Encontrada C 60,74, H 8,6, N 13,5 e 0 17,9. Rf em placas de sílica-gel G cromatografia em camada fina: 0,92 (clorofórmio/metanol/amoníaco/água, 70/30/1/1); 0,83 (hexano/éter etílico/ácido acético, 80/20/1) e 0,86 (clorofórmio/ /acetona, 94/6), p.f. 77-80^0. ^max 26 5.

Eficácia de PalmitoilAZT em células HT4-6C Infectadas com HIV

A palmitoilAZT foi incorporada em lipossomas como se referiu no Exemplo 8 e incubada com células HT4-6c infectadas com LAV-1 como se referiu nos Exemplos 10 e 11. A palmitoilAZT 0,8/1?·! inibiu a formação de placas em 25% (134 placas ver sus 176 no controlo não tratado).

Deverá ser evidente do gue se expôs que se podem usar outros análogos de nucleósido e seus derivados fosfolípido nos Exemplos para obter resultados semelhantes, c AZT-monofos fato cu outro fosfato de nucleósido antiviral pode também estar contido nes compartimentos aquosos dcs lipossomas. A percentagem molar do nucleósido antiviral lípido pode variar de C,1 a 1CC% da mistura total de lípides. Além disso as misturas de lípidos nucleósido antiviral podem ser usadas na construção dos lipossomas para terapia de doenças virais. Deve ser ainda sublinhado que o presente invento não se limita ao uso de qualquer análogo de nucleósido antiviral particular; em vez disso, os resultados benéficos do presente invento der

BAD ORIGINAL i-

570 te

-6 3rivam da formação de lipossomas dos derivados lípidos destes materiais. Assim, independentemente do facto de um nucleósido antiviral ser presentemente conhecido ou vir a ser conhecido no futuro, os métodos de formação dos seus derivados l_í pidos presentemente contemplados são baseados em técnicas quí micas estabelecidas e a sua incorporação em lipossomas é largamente permitida pela revelação anterior. Deve ser de novo sublinhado que as presentes sínteses são largamente aplicáveis θ formação de compostos a partir de essencialmente todos os análogos de nucleósido para uso na prática do presente invento.

Assim, o invento pode ser concretizado noutras formas específicas sem se afastar do seu espírito ou caracteristicas essenciais. As concretizações descritas devem ser consideradas apenas, como - titulo ilustrativo e não restrictivo e o âmbito do invento é, portanto indicado pelas reivindicações anexas e não pela descrição anterior. Todas as modificações que caiem no significado e alcance da equivalência legal das reivindicações deverão ser abrangictes no seu âmbito.

Claims (48)

1. REIVINDICAÇÕBS

   15, - Processo para sintetizar um derivado lípido de um nucleósido antiviral, compreendendo:

   um análogo de nucleósido possuindo uma porção base compreen dendo uma purina ou pirimidina ou seu análogo e uma porção açúcar compreendendo um resíduo pentose, onde pelo menos uma das referi das porções é um componente nucleósido que não ocorre naturalmen te; e uma porção lípido ligada ao referido resíduo pentose;

   com a condição do referido composto estar na forma de um lipossoma quando o referido resíduo pentose é arabinofuranose e a referida porção base é citosina ou adenina, caracterizado por compreender o passo de reagir um nucleósido antiviral, possuindo um grupo hidroxilo na ribose, com um fosfolípido na presença de um reagente de acoplamento, pelo que o referido nucleósido é ligado ao referido fosfolípido por uma ligação fosfato na posição do referido grupo hidroxilo na ribose.
2. 2-. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o fosfolípido ser um diacilfosfato.

   35 . - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o referido fosfolípido ser UE ι ácido fosfatídico. 4§ . - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o referido fosfolípido ser uma ceramida. 55 . - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza

   do por o referido componente nucleósido que não ocorre naturalmen te ser um análogo de uma base que ocorre naturalmente ou pentose em virtude de substituição, delecção ou recolocação.

   65. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o referido resíduo pentose ser um derivado 23'-didesoxi , 23'-didesidro, azido ou halo de ribose ou um fragmento acíclico hidroxilado de ribose.
3. 7^. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracte69 570

   -65rizado por o referido resíduo de pentose ser uma 2^,,3’-didesoxirribose, e o referido análogo de nucleósido ser 2 ¹ ,3 ’-di_ desoxícitidina; 2¹,3‘-didesoxitimidina; 2’,3¹-didesoxiguanosina; 2¹,3¹-didesoxiadenosina; 2’,3'-didesoxí-inosina; ou 2, 6-diaminopurina; 2¹,3'-didesoxirribosido.
4. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracte rizado, por o referido resíduo de pentose ser uma 2‘,3'-dide sidrorribose e por o referido nucleósido ser 2',3·-didesidro timidina; 2¹ ,3*-didesidrocitidina carbocícIica; ou 2',3*-didesidroguanosina.
5. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracte rizado por o referido resíduo pentose ser um derivado azido de ribose e por o referido nucleósido ser 3‘ -azido-3' -desoxi. timidina; 3 *-azido-3'-desoxiguanosina; ou 2,6-diaminopurina-3*-azido-2’,3’-didesoxirribosido.
6. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracte rizado por o referido resíduo pentose ser um derivado halo de ribose e o referido nucleósido ser 3'-fluoro-3'-desoxítimidina ; 3’-fluoro-23’-didesoxiguanosina; 2’,3'-didesoxi-2’-fluoro-ara-adenosina; ou 2,6-diaminopurina-3 *-fluoro-2·,3'-didesoxirribosido.
7. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracte rizado por o referido resíduo pentose ser um fragmento acícli_ co hidroxilado de ribose, e o referido nucleósido ser 9-(4-hi droxi-1’,2'-butadienil)adenina, 3-(4-hidroxi-1',2’-butadieniDcitosina, 9-(2-f osf oni lmet oxiet il) adenina ou 3-fosf onometoxietilo, 2,6-diaminopurina.
8. 12 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o referido análogo de nucleósido ser aciclovir, ganciclovir, 1—(2'-desoxi-2'-fluoro-l-0-D-arabinofuranosil)-5-iodocitosina (7IAC) ou l-(2'-desoxi-2'-fluoro-l-^-D-arabinofuranosil)-5-iodo-uracilo (FZAU).
9. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o referido análogo de nucleósido ser 2-clorodesoxi

   69 57C

   -66adenosina.
10. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o referido análogo de nucleósido ser uma 3'-azido-2‘,3‘-didesoxipírimidina seleocionada do grupo consistindo em AzddClU, AzddMeC, AzddMeC N4-0H, AzddMeC N4Me, AzddFtU, AzddU, AzddC, AzddFC, AzddBrU, e AzddlU.
11. 15 — Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o referido análogo de nucleósido ser um 3‘-haIopirímidina didesoxinucleósido seleccionado do grupo consistindo em 3*-FddC; U, 3'-FddU, 3^l-Fddt, 3’-FddBrU, e 3'-FddEtU.
12. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o referido análogo de nucleósido ser um 2*,3'-άΙάβ sidro-2’,3'-didesoxinucleósido seleccionado do grupo consistindo em D4T, D4C, D4MeC, e D4A.
13. 17 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o referido nucleósido ser um didesoxípirimidina nu cleósido 2‘,3*-não substituído, seleccionado do grupo consistindo em 5-F-ddC, ddC e ddT.
14. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o referido nucleósido ser um didesoxipurina nucleósido 2',3’-não substituído do grupo consistindo em ddA, ddDAPR, ddG, ddT e ddMeA.
15. 19 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o referido nucleósido ser um didesoxipurina nucleósido substituído por açúcar seleccionado do grupo consistindo em 3-N₃ddDAPR, 3-N₃ddG, 3-FddDAPR, 3-FddG, 3-FddaraA, e 3-FddA.
16. 20 - Processo de acordo com qualguer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado por o composto preparado compreender ainda um grupo de ligação monofosfato, difosfato ou tri. fosfato entre a posição 5' do referido resíduo pentose e a re ferida porção lípido.
17. 21 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por se preparar fosfatidi1(3 *-azido—3 ’-desoxi)timidina

    69 570

    -67z *55?» (pAZT) .
18. 22 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por se preparar fosfatidilf2*,3·-didesoxi)citidina (pddC) ·
19. 23 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por se preparar fosfatidil(2',3 *-didesoxi)timidina (pddT).
20. 24 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte. rizado por se preparar (3 *-azido-3‘-desoxi)timidina difosfato diglicérido (AZTdpdg).
21. 25 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por se preparar fosfatidilaciclovir (pACV).
22. 26 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por se preparar l-0-Sstearoilglicero-rac-3-fosfo-5‘-(3‘-az ido-3·-desoxi)timidina.
23. 27 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado por o composto compreender ainda uma ponte alifática compreendendo dois grupos funcionais e possuindo 0 a 10 átomos de carbono entre os referidos grupos funcionais, unindo a referida ponte o referido lípido e resíduo pentose.
24. 28 — Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado por a referida porção de lípido ser um ácido gordo.
25. 29 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado por a referida porção de lípido ser um raonoacilglicerol ou um diacilglicerol.
26. 30 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado por a referida porção de lípido ser um ácido fosfatídico.
27. 31 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o referido lípido ser um fosfolípido possuindo um grupo de cabeça compreendendo um açúcar ou álcool poli-hídri69 570

    -68 — co.
28. 32 - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por a referida porção de lípido compreender bis(diacilglicero)fosfato.
29. 33 - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por a referida porção de lípido compreender um difosfatidílglicerol.
30. 34 - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 19, caracterizado por a referida porção/jLípído ser um grupo D,L— 2_r3-diaciloxipropíl(dimetil)-beta-hidroxietílamónio.
31. 35 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por a referida porção de lípido compreender 1 a 4 porções ácido gordo, compreendendo cada porção de 2 a 24 átomos de carbono.
32. 36 - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por pelo menos uma porção ácido gordo da referida porção lípido ser insaturada e ter 1 a 6 ligações duplas.
33. 37 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o referido composto compreender 1,2-diacilglicerof osf 0-5’—C 2·,3*-dides oxi)timidina.
34. 38 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o composto possuir a fórmula;

    (L) -CW) -A-Q-Z rrt n onde

    Z ê a porção base do referido análogo de nucleósido;

    Q é o resíduo pentose;

    A é C, C ou S;

    W é fosfato;

    n = 0 a 3 ;

    e L é uma porção lípido, onde m = la 5, e onde cada l está ligado directamente a um W excepto guando n = C, caso em gue L está ligado directamente a A.
35. 39 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte

    69 570

    -69rizado por o composto ter a fórmula:

    -í*—',-—

    OU

    L—W—L^-W—L

    L-W-L^-W—L

    L-W-L onde

    Z é o grupo purina ou pirimidina substituído ou não substituí do do referido análogo de nucleósido^

    Ω é o resíduo pentose;

    A é 0, CouS;

    W é fosfato;

    Lj é (CH₂CHOH-CH₂) ; e

    L é uma porção lípido.
36. 40 - Processo de acordo com a reivindicação 38 ou 39 caracterizado por cada L ser seleccionado independentemente do grupo consistindo em R;

    ch=ch-(ch₂)₁₂-ch₃ ^k2<:-R₇ ^H2^-^R2

    KC OH

    I

    RC (C)NH -CH ^K2?-^Rl

    HC-R.

    H —C 2~ ^H2^C(ck₃)₂-m(ch₂)₂onde R, R^ e R₂ são independentemente grupos alifáticos C^ a ^C24 *
37. 41 - Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por R, R^ e R₂ terem, independentemente uns dos outros, de 0 a 6 locais de insaturação e terem a estrutura CH₃-(^CH2)_a-(^cH = ^cHCK₂)_b-(CH₂)_c-Y onde a soma deaecédela 23; e b é 0 a 6; e onde Y é C(C)O-, C-C—, C=C—O—, C(O)S-, C-S-, ou C=C-S-,
38. 42 - Processo para sintetizar um derivado lípido de um nucleósido antiviral, caracterizado por compreender os passos

    BAD ORIGINAL

    6 9 5 70

    -70de :

    fazer reagir um nucleósido monofosfato antiviral com um reagente KL, onde L representa um grupo que se despede, para formar um nucleósido PC^-L;

    fazer reagir o referido nucleósido PO^-L com um ácido fosfatídico para unir o referido ácido ao referido nucleósido atra vés de uma ligação pirofosfato.
39. 43 - Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por o referido nucleósido monofosfato ser AZT 5‘-monof osfato.
40. 44 - Processo para sintetizar um derivado glicérido de um análogo nucleósido, caracterizado por compreender o pa£ so de unir um monoglicérido ou diglicérido e um nucleósido mo nofosfato antiviral com um agente de acoplamento na presença de um catalisador básico.
41. 45 - Processo de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por o referido glicérido ser 1-0-estearoilglicerol e o referido nucleósido ser AZT monofosfato.
42. 46 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações, 1, 42 ou 44, onde o referido análogo de nucleósido compreende uma porção adenina ou citidina, caracterizado por compreender os passos de:

    bloquear os grupos amino reactivos da referida porção antes da reacção de acoplamento; e desbloquear os referidos grupos após o referido análogo de nucleósido ser unido a um lipido.
43. 47 - Processo para a preparação de uma suspensão de li possomas para o tratamento de infecções virais num mamífero, caracterizado por compreender:

    proporcionar um agente antiviral lipofílico compreendendo pelo menos uma espécie lipido ligada a um análogo nucle ósido;

    combinar o agente antiviral lipofílico e um solvente aquoso farmacologicamente aceitável para formar uma mistura; e formar lipossomas a partir do agente lipofílico antiviral

    69 570

    -7148®. - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se misturar um composto preparado de acordo com as reivindicações 1-46, com um veículo farmaceuticamente aceitável.
44. 49®. - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se misturar um composto preparado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-46, com pelo menos outro composto antiviral.
45. 50®. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-41, caracterizado por Q ser um resíduo pentose compreenf dendo ribose, didesoxirribose, didesidrorribose ou uma ribose azido-ou halo-substituída e por a referida pentose estar ligada à posição 9 da referida purina ou à posição 1 da referida pirimi. dina.
46. 51®. - Processo de preparação de um lipossoma constituído pelo menos em parte por um derivado lípido de um nucleósido anti virai, caracterizado por compreender os passos de :

    proporcionar uma fase de lípido compreendendo pelo menos um nucleósido antiviral preparado de acordo com qualquer das reivin dicações 1-26, 31-33, 35-41 ou 50;

    proporcionar uma solução de hidratação; e contacto da referida fase de lípido com a referida solução de hidratação, formando-se lipossomas primários.
47. 52®. - Processo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por a referida fase de lípido compreender adicionalmente, um fosfolípido neutro, um fosfolípido carregado negativamente, um lípido catiónico,um esterol ou suas misturas.
48. 53®. - Processo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por compreender adicionalmente o passo de tratamento dos referidos lipossomas primários por sonicação ou extrusão.