DK173873B1 - Cyclosporiner og farmaceutiske præparater indeholdende dem - Google Patents

Description

i DK 173873 B1

Den foreliggende opfindelse angår en ny anvendelse, isar en ny farmaceutisk anvendelse, af cyclosporiner samt nye cyclosporiner som hidtil ukendte forbindelser per se.

Cyclosporinerne omfatter en klasse af strukturelt saregne, cykliske, 5 poly-N-methylerede undecapeptider, der generelt besidder farmakologisk, isar immunosuppressiv, anti-inflammatorisk og/eller anti-para-sitisk aktivitet, hvilke aktiviteter hver for sig besiddes i højere eller mindre grad. Den først isolerede af cyclosporinerne var den naturligt forekommende fungale metabolit Ciclosporin eller cyclo-10 sporin, der også kendes som cyclosporin A og som nu er kommercielt

tilgangelig under det registrerede varemærke SANDIMMUNR. Ciclosporin er cyclosporinet med formlen A

-MeBmt-aAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 (A) hvor -MeBmt- betegner N-methyl-(4R)-4-but-2E-en-l-yl-4-methyl-(L)

15 threonylgruppen med formlen B

(8') CH,

(7' ) X

(6') y XCH2 (5') (B)

HO CH

CH CH, -N-CH—C0- | (2') (1') CH3 2 DK 173873 B1 hvor -x-y- betegner trans -CH—CH- og stillingen 2', 3' og 4' henholdsvis har konfigurationen S, R og R.

Efter den oprindelige opdagelse af ciclosporin er en stor mangfoldighed er naturligt forekommende cyclosporiner blevet isoleret og iden-5 tificeret, og mange yderligere ikke-naturlige cyclosporiner er blevet fremstillet på syntetiske eller semisyntetiske måder eller ved anvendelse af modificerede kulturteknikker. Klassen omfattet af cyclospo-rinerne er således nu betydelig og inkluderer fx de naturligt forekommende cyclosporiner A til Z [c.f. Traber et al. 1, Helv. Chim.

10 Acta, 60, 1247-1255 (1977); Traber et al. 2, Helv. Chim. Acta, 65, 1655-1667 (1982); Kobel et al., Europ. J. Applied Microbiology and Biotechnology 14, 273-240 (1982); og von Wartburg et al., Progress in Allergy, 38, 28-45 (1986)], til samt forskellige ikke-naturlige cyclosporinderivater og kunstige eller syntetiske cyclosporiner om-15 fattende de hydro- og isocvclosporiner [hvor delen -x-y- af -MeBmt-gruppen (den ovenfor anførte formel B) er mættet, hvilket giver -x-y- - -CH2-CH2-/bindingen af -MeBmt-gruppen til gruppen i cyclo-sporinmolekylets 11-stilling (den ovenfor anførte formel A) er via 3'-O-atomet i stedet for α-N-atomet]; derivatiserede cyclosporiner 20 (fx hvor 3'-O-atomet af -MeBmt-gruppen er acyleret, eller hvor en yderligere substituent er introduceret ved α-carbonatomet i sarcocyl-gruppen i 3 - stillingen); cyclosporiner, hvor -MeBmt-gruppen er til stede i isomer form (fx hvor konfigurationen omkring stillingernes 6' og 7' i -MeBmt-gruppen er cis i stedet for trans); og cyclosporiner, 25 hvori der er inkorporeret varierende aminosyrer i specifikke stillinger i peptidsekvensen under anvendelse af fx den totalsynteseme-tode til fremstilling af cyclosporiner, der er udviklet af R. Wenger - se fx Traber et al. 1, Traber et al. 2 og Kobel et al. loc. cit.; US 4 108 985, 4 210 581, 4 220 641, 4 288 431, 4 554 351 og 4 396 30 542; EP 0 034 567 og 0 056 782; offentliggjort PCT-ansøgning W0 86/02080; Wenger 1, Transpi. Proc. 15, Suppl. L:2230 (1983);

Wenger 2, Angew. Chem. Int. Ed., 24, 77 (1.985) ; og Wenger 3, Progress in the Chemistry of Organic Natural Products 50, 123 (1986).

Klassen omfattet af cyclosporinerne er derfor nu meget stor og om-35 fatter fx [Thr]2-, [Val]2, [Nva]2- og [Nvaj2-[Nva]5-ciclosporin (der henholdsvis også kendes som cyclosporinerne C, D, G og M), [3-O-ace- 3 DK 173873 B1 tyl-MeBmt ]*-ciclosporin (også kendt som cyclosporin A-acetat), (Dihy-dro-MeBrat] *·-[Val] ^-ciclosporin (også kendt som dihydro-cyclosporin D), {Iso-MeBmt ] [Nva] ^-ciclosporin (også kendt som isocyclosporin G), [(D)Ser]®-ciclosporin, [Melle]^-ciclosporin (også kendt som 5 cyclosporin H), [MeAla]^-ciclosporin, [‘(D)Pro ]*-ciclosporin osv.

(I overensstemmelse med den konventionelle nomenklatur for cyclo-sporiner er disse i nærværende beskrivelse og krav defineret med reference til strukturen af ciclosporin (dvs. cyclosporin A). Dette gøres ved først at indikere de tilstedeværende aminosyregrupper, der 10 adskiller sig fra de i ciclosporin tilstedeværende (fx "[(D)Pro)·*" som indikation af, at det pågældende cyclosporin har en -(D)Pro-snarere end -Sar-gruppe i 3-stillingen), og derefter at anvende betegnelsen "ciclosporin" til at karakterisere de resterende grupper, der er identiske med de i ciclosporin tilstedeværende.

L5 -MeBmt-gruppen i 1-stillingen i ciclosporin var ukendt indtil opdagelsen af cyclosporinerne. Denne gruppe og varianter eller modifikationer deraf, fx som nedenfor beskrevet, er således generelt karakteristiske for cyclosporinerne. Almindeligvis defineres varianter eller alternativer til [MeBmt]^ ved reference til -MeBmt- strukturen.

20 Således defineres gruppen i L-stillingen i dihydrocyclosporiner, hvori delen -x-y- (se ovenstående formel B) er reduceret til -CH2-CH2-, som "dihydro-MeBmt-". Nar konfigurationen omkring delen -x-y-er cis snarere end trans, defineres den resulterende gruppe som "•c is-MeBmt-".

25 Hvor dele af -MeBmt-gruppen er fjernet, indikeres dette ved at definere stillingen for fjernelsen, idet betegnelsen "des” anvendes til at indikere fjernelse, og derefter den udeladte gruppe eller det udeladte atom før det bestemmende "-MeBmt-", "-dihydro-MeBmt-", "-cis-MeBmt-" osv.. Således betegner "-N-desmethyl-MeBmt-", ”-3'-desoxy- 30 MeBmt-" og "-3'-desoxy-A'-desmethyl-MeBmt-"grupperne i henholdsvis formel B^·, og B-^: 4 DK 173873 B1 CH3 \

CH

TRANS

CH

'"''"'CHj * (B1, B2, B3)

Y CR^CH

^ CH (rJ'Nc -N—*CH·—CO-I (S) z B1 - X - CH3, Y - OH, Z - H.

5 B2 - X - CH3, Y - Η, Z - CH3.

B3 - X - Η, Y - Η, Z - CH3.

Når stillinger eller grupper, fx i -MeBmt-, er substituerede, vises dette på konventionel måde ved at definere substitutionens stilling og natur. Således er - 3'-O-acetyl-MeBmt- den gruppe med formlen B, 10 hvor 3’-OH-gruppen er acetyleret (3'-0-C0CH3) . Når substituenter eller grupper, fx i -MeBmt-, erstattes, gøres dette ved i) at indikere den erstattede gruppes stilling ved at anvende "des"-termino -logi som beskrevet ovenfor og ii) at definere den erstattende gruppe, Således er -7'-desmethyl-7'-phenyl-MeBmt- den gruppe med den ovenfor 15 anførte formel B, hvor den terminale (8') methylgruppe er erstattet med phenyl. 3'-Desoxy-3’-oxo-MeBmt- er den gruppen med den ovenfor anførte formel B, hvor 3'-OH-gruppen er erstattet -0.

Endvidere skal aminosyregrupper, der henvises til med forkortelser, fx -Ala-, -MeVal-, -aAbu- osv., i overensstemmelse med konventionel 20 praksis forstås som havende (L)-konfiguration, når intet andet er anført, fx som i tilfældet "-(D)Ala-". Når forkortelser for grupper har "Me" som præfiks, fx som "-MeLeu-", repræsenterer disse a-N-me-thylerede grupper. Som kendt inden for teknikken er cyclosporinmole- 5 DK 173873 B1 kylets individuelle grupper nummererede med uret, idet der startes med gruppen -MeBmt-, -dihydro-MeBmt- osv. ... i stilling 1. Den samme numeriske sekvens anvendes i hele den nærværende beskrivelse og krav.] 5 På grund af deres unikke farmaceutiske potentiale har cyclosporineme tiltrukket sig en betydelig opmærksomhed, ikke kun i medicinske akademiske cirkler, men også i lægpressen. Selve cyclosporin er nu almindelig anvendt til forebyggelse af frastødning, der kan følge efter allogene organtransplantationer, fx hjerte-, hjerte-lunge -, nyre- og 10 benmarvstransplantationer, samt på det seneste til behandling af forskellige autoimmune og relaterede sygdomme og tilstande. Der er også udført omfattende arbejder for at undersøge potentiel brug til behandlingen af forskellige parasitsygdomme og -infektioner, fx cocci-diomycose, malaria og schistosomiasis. Litteraturen er nu rig på 15 rapporter om undersøgelsesarbejder af den potentielle brug af de overordentlig mange andre kendte cyclosporiner til disse eller relaterede indikationer.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse har det nu overraskende vist sig, at visse cyclosporiner er nyttige til at forøge 20 følsomheden over for anden kemoterapi og, især, til at ophæve modstanden mod anden kemoterapi, hvad enten den er induceret eller iboende.

Forøget modstand mod kemoterapeutisk terapi efter behandling i kortere eller længere perioder, hvilken behandling generelt følger efter 25 relativ langvarig kemoterapeutisk lægemiddelindgivelse, er et udbredt fænomen, der længe har været erkendt og som er bredt dokumenteret på området. Det klassiske eksempel er at den forøgede eller inducerede modstand hos parasitiske, især bakterielle, virale eller protozoale organismer, hvilken modstand opstår efter langtidsbrug eller udbredt 30 lægemiddelindgivelse af individuelle lægemiddelstoffer, I sådanne tilfælde bliver den inficerende organisme med tiden resistent overfor lægemiddelstoffet i større eller mindre grad, og den bliver samtidig hermed vanskelig at bekæmpe eller behandle. Et analogt fænomen observeres i relation til den kemoterapeutiske behandling af cancer, fx 6 DK 173873 B1 behandling af carcinoma, sarcoma eller andre rumorer eller maligne vækster.

Kemoterapeutisk behandling af cancer, fx ved administration af lægemiddelstoffer, især anti-neoplastiske eller cytotoksiske lægemidler, 5 fx colchicin, etoposid, tenoposid, adriamycin, daunorubicin og vin-cristin, som en måde til at reducere, inhibere eller på anden måde begrænse tumorvækst eller metastase forbliver en primær måde at behandle forskellige typer af cancer. Imidlertid har det ofte vist sig, at mens tumorer i starten kan være modtagelige for terapi, ud-10 vikler der sig modstande mod sådan terapi under behandlingens frem-skriden, hvilket resulterer i et fald i terapeutisk virkning. Når der, som det er almindeligt især ved behandlingen af sen-fase eller terminal cancer, anvendes pleiotropisk eller multi-lægemiddelterapi, er multi - lægemiddelmodstand almindeligvis resultatet. Tilsvarende L5 vanskeligheder opstår fx i tilfælde, hvor særlige former for kemoterapeutisk behandling længe har været i anvendelse, og fx hvor der opstår resistente stammer af mikroorganismer, der har udviklet en iboende eller medfødt modstand. På samme måde opdages ofte særlige cancer- eller tumorformer, der udviser en medfødt modstand mod, eller 20 reduceret følsomhed for, almindelig anvendt anti-neoplastisk eller cytostatisk lægemiddelterapi.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse har det vist sig, at de cyclosporiner, der er defineret i det følgende, er nyttige til at forøge følsomheden overfor eller til at forøge virkningen af kemo-25 terapeutisk lægemiddelterapi, og de er især nyttige til at ophæve forskellige typer af modstand mod kemoterapeutiske lægemidler (fx opstået eller medfødt modstand) eller til at forøge eller genetablere følsomhed overfor administreret lægemiddelterapi. Den foreliggende opfindelse kan anvendes til former for kemoterapeutisk lægemiddel-30 terapi, der eksempelvis omfatter anti-parasitisk, fx anti-viral, anti-bakteriel eller anti-protozoal kemoterapi og, især, anti-neoplastisk eller cytostatisk kemoterapi.

Hensigtsmæssige cyclosporiner til anvendelse i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse kan defineres i forskellige klasser, som 35 anført i det følgende.

7 DK 173873 B1 KLASSE 1

En cyclosporin, hvor 3'-carbonatomet i gruppen i 1-stillingen eller yø-carbonatomet i gruppen i 2'Stillingen er O-acyl- eller oxosubstitu* eret.

5 Foretrukne cyclosporiner i denne klasse er følgende: la) Hvor 3'-carbonatomet i gruppen i l-stillingen er O-acylsubstitu-eret.

Når 3'-carbonatomet i gruppen i 1-stillingen er O-acylsubstitueret, kan gruppen i 2-stillingen også være £-0-acyleret.

10 En foretrukken gruppe af cyclosporiner af type la) er følgende:

la^·) Hvor gruppen i 1-stillingen er en -3'-O-acyl-MeBmt- eller -3'-O-acyl-dihydro-MeBmt-gruppe med formlen I

CH3 \ I (I)

ACYL1-0 CH

\(Rw\ CH CH3 -N CH—C0- I (S) CHj hvor -x-y- er -CH2-CH2- eller trans -CH-CH-, og ACYL* betegner en 15 acylgruppe.

8 DK 173873 B1

Egnede acylgrupper som ACYI^ i formel I er sådanne med formlen Rj_-CO-og R2-O-CO', hvor Rj_ betegner Cj^-alkyl eller C^^-azidoalkyl, og R2 betegner Cj_.^-alkyl, fx acetyl, 4-azidobutanoyl eller methoxycarbo-nyl. Fortrinsvis er ACYL^· en gruppe med formlen R^-CO-, hvor 5 fortrinsvis betegner C^.^-alkyl. Især foretrækkes, at R^-CO- er ace-tyl.

Alkylgrupper, der er eller omfatter Rj^ og R2, kan være ligekædede eller forgrenede. Fortrinsvis er de ligekædede. R^ er fortrinsvis methyl.

10 Særligt foretrukne cyclosporiner i gruppe la^ er sådanne med formlen II eller II' _A-B-X-MeLeu-Y-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu~MeLeu-MeVal-12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 _A-B-X-MeLeu-Y-HeLeu-Ala-V-MeLeu-MeLeu-MeVal-j ( 123 4 5 6 789 10 11 hvor 15 A betegner en gruppe som ovenfor defineret under la^· B betegner -aAbu-, -Thr-, -Val-, -Nva- eller en £-0-acyl-a-amino-syregruppe, X betegner -Sar- eller en optisk aktiv, α-N-methyleret a-amino-syregruppe med (D)-konfiguration, 20 Y betegner -Val- eller, når B er -Nva-, yderligere -Nva-, og tf betegner en ^-hydroxy- eller £-0-acyl-a-aminosyregruppe med (D)-konfiguration.

Når B er en ^-O-acyl-o-aminosyregruppe, vil denne sædvanligvis have (L)-konfiguration. Hensigtsmæssig er den en gruppe med formlen III

9 DK 173873 B1 0-ACYL2 0 CH-CHj I (III) -NH-CH-CO- (L) hvor ACYL^ betegner en acylgruppe. Fortrinsvis er den en O-acyl-(L)-threonylgruppe.

W er hensigtsmæssigt -(D)Ser- eller -(D)Thr- eller 0-acyl-(D)Ser-5 eller O-acyl-(D)Thr- med formlen III' 0-ACYL2

0 CH-R

( (III') -NH-CH-CO- (D) hvor ACYL^ har samme betydning som anført for formel III, og R betegner hydrogen eller methyl.

Foretrukne acylgrupper som ACYL^ i formel III og 111' er sådanne med 10 formlen R3-CO-, hvor R3 betegner C^.^-alkyl. Alkylgrupper som R3 kan være forgrenede eller ligekædede. Ligekædede foretrækkes. Egnet ACYL.^ er acetyl.

Når X i formel II er forskellig fra -Sar-, er den hensigtsmæssig - (D)Ala-.

15 Eksempler på cyclosporiner i denne klasse, hvilke cyclosporlner er egnede til anvendelse i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, er: 1.1 [3' - 0-Acetyl-MeBmt]*-ciclosporin; i f 10 DK 173873 B1 1.2 [3'-O-Acetyl-MeBmt]* -[Val]^-ciclosporin; 1.3 [ 3 ' -O-Acetyl-MeBmt ] [Thr ] ^ - c ic lospor in; 1.4 [3'-O-Acetyl-MeBmt]^-[Nva]^ - ciclosporin; 1.5 [3 ' -O-Acetyl-MeBmt] [Nva] ^ - [Nva] -^-ciclosporin; 5 1.6 [ 3 '-O-Acetyl-MeBrat ] ^ - [ (D)Ala] ^-ciclosporin; 1.7 [ 3 ' - O-Acetyl - MeBmt ] ^- - [ Nva ] ^ - [ (D) Ala] ^ - ciclosporin; 1.8 [3'-O-Acetyl-MeBmt]^-[(D)MeVal]^-ciclosporin; 1.9 [3'-0-Acetyl-MeBmtj^-[Val:^-ciclosporin; 1.10 [3 ' -0-Acetyl-dihydro-MeBmt] ^--ciclosporin; 10 1.11 [ 3 '-Ο-Me thoxycarbonyl-MeBmt ] - c iclosporin; 1.12 [3'-0-(4-Azidobutanoyl)-MeBmt]^-ciclosporin; 1.13 [3' - O-Acetyl-MeBmt]^- - [O-acetyl - Thr [^-ciclosporin; 1.14 [3'-0-Acetyl-N-desme thyl-MeBmt] [O-acetyl-Thrj^-ciclosporin; og 1.15 [3 ' -0-Acetyl-MeBmt] [0-ace tyl - (D)Ser]®-ciclosporin.

15 Foretrukne cyclosporiner til anvendelse i overensstemmelse med opfindelsen er de ovenfor anførte cyclosporiner 1.1-1,10 inklusive og 1.15, og, især, cyclosporiner 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.10 og 1.15.

En yderligere gruppe af cyclosporiner af type la er følgende:

la^) Hvor gruppen i 1-stillingen er en - 3’-0-acyl-8'-C^-g-alkoxy-20 -cis-MeBmt- eller dihydro-MeBmt-gruppe med formlen IV

DK 173873 B1 u

X

y\ CH* (IV)

ACYL1”0 (R) CH

-N - CH - C0- I (S) CHj hvor -x-y- betegner cis -CH-CH- eller -CH2-CH2-, R4 betegner C2.9-5 alkoxymethyl, og ACYlA betegner en acylgruppe.

Særligt egnede acylgrupper i formlen IV er sådanne med formlen R5-CO-, hvor R5 betegner Cj_„4-alkyl.

Alkylgrupper som R5 samt alkyldele omfattende R4 kan være forgrenede eller ligekædede. Fortrinsvis er de ligekædede. R4 er fortrinsvis i 10 C2-5-alkoxymethyl. ACYlA i formel IV er hensigtsmæssigt acetyl.

Særligt foretrukne cyclosporiner af gruppe la^ er sådanne af den ovenfor anførte formel II, hvor A er en gruppe med den ovenfor definerede formel IV, B har samme betydning som anført i formel II, X betegner -Sar-, og Y betegner -Val-.

15 Eksempler på cyclosporiner af gruppe la^, der er hensigtsmæssige til anvendelse i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, er: 1.16 [3' -O-Acetyl-8' -methoxy-cis-MeBmt] ^--ciclosporin; 1.17 [3'-O-Acetyl-8'-t.butoxy-cis-MeBmt]^-ciclosporin; 12 DK 173873 B1 1.18 [3' -O-Acetyl-8' -methoxy-cis -MeBmt] [0-acetyl -Thr ] ^ - c telospor in; 1.19 [3' -0-Acetyl-8' -t.butoxy-cis-MeBmt ] > [0-acetyl - Thr ] ^ -ciclospo -rin; 1.20 [3'-O-Acetyl-8'-methoxy-cis-MeBmt]^-(Val] ^-ciclosporin; og 5 1.21 [3'-0-Acetyl-8'-methoxy-cis-MeBmt]*-[Nva]^-ciclosporin.

En yderligere gruppe af cyclosporiner af type La er sådanne: la·*) Hvor gruppen i 1-stillingen er -3'-O-acyl-cis-MeBmt-; -3'-0-a-cyl-7'-desmethyl-7'-hydrocarbyl-MeBmt- eller -cis-MeBmt-, hvor hydrocarbyldelen omfatter mindst 2 carbonato-10 mer; eller - 3’-0-acyl-7'-desmethyl-7'-hydrocarbyl-dihy- dro-MeBrat-, hvor hydrocarbyldelen omfatter mindst 2 carbonato-mer, og hvor en hvilken som helst alifatisk gruppe eller alifa-tisk del, der er til stede i nævnte hydrocarbyldel, er mættet.

Disse grupper kan anskueliggøres med formlen V

Ri

X

y-.

^CH2 (V) ACYL1-0. (R) CH.

^CH (R) XH3 -N - CH - C0- I (S) CHj hvor -x-y- betegner cis- eller trans- -CH-CH- eller -CH2-CH2-, R6 betegner hydrocarbyl, og 13 DK 173873 B1 ACYlA betegner en acylgruppe, under forudsætning af, at når -x-y- betegner trans -CH-CH- eller -CH2-CH2-, så omfatter Rg mindst 2 carbonatomer (dvs. er forskellig fra methyl), og når -x-y- betegner -CH2-CH2*. så er en hvilken som 5 helst alifatisk gruppe eller alifatisk del, der er til stede som Rg eller i Rg, mættet.

Særligt hensigtsmæssige som acylgrupper i formel V er sådanne med formlen R5-CO-, hvor R5 betegner Cj^-alkyl, især acetyl.

Hydrocarbylgrupper som Rg omfatter aromatiske, alifatiske og ara-10 lifatiske grupper, idet alifatiske grupper og alifatiske dele kan være forgrenede eller ligekædede. Sådanne grupper kan også have yderligere substituenter såsom halogen eller hydroxy eller kan være usubs t i tue re de .

Hensigtsmæssige hydrocarbylgrupper som Rg er alkyl, alkenyl, alkinyl, 15 phenyl, phenylalkyl, phenylalkenyl og phenylalkinyl, især alkyl-, alkenyl- og alkinylgrupper med højst 20, fortrinsvis højst 8, carbonatomer, og phenyl-, phenylalkyl- og phenylalkinylgrupper med højst 12 carbonatomer.

Særligt foretrukne grupper Rg er phenyl, phenyl-(Cj^.4-alkyl), Cj^iQ-20 alkyl, C2_10-alkenyl °S c2-I0'alki-nyl-> iSJEr phenyl og C^.5-alkyl.

Når -x-y- i formel V betegner -CH2-CH2-, så omfatter hydrocarbylgrupper som R6 aromatiske, mættede alifatiske og aralifatiske grupper, hvor den alifatiske del er mættet, fx omfattende hvilke som helst af de ovenfor fremførte grupper af denne type.

25 Særligt foretrukne cyclosporiner 1 denne gruppe er sådanne med den ovenfor anførte formel II, hvor A er en gruppe med den ovenfor anførte formel V, B har samme betydning som anført i formel II, X betegner -Sar-, og Y betegner -Val-,

Eksempler på cyclosporiner i denne gruppe, hvilke cyclosporiner er 30 egnede til anvendelse i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, er: 14 DK 173873 B1 1.22 [3'-O-Ace ty 1-7' -desmethyl - 7 ' - phenyl-Me Brat ] -c 1c lo spor in; 1.23 [3'-O-Ace tyl-cis-MeBmt]'- - c ic lospor in; 1.24 [3’-O-Acetyl-7'-desmethyl-7'-vinyl-cis-MeBmt]^-ciclosporin; 1.25 [3'-0-Acetyl- 7'-desmethyl- 7'-vinyl- cis-MeBmt]^-[O-acetyl-Thr]^- 5 ciclosporin; 1.26 [3'-0-Acety1-7'-desmethyl-7'-i.phenyl-cis-MeBmc]'--ciclosporin; 1.27 [3'-0-Acetyl-7'-desme thyl - 7 ’ -phenyl - cis-MeBmt] ^--ciclosporin; 1.28 [3'-0-Acetyl-7'-desmethyl-7'-n.propvl-cis-MeBmt]'--ciclosporin; 1.29 [3'-0-Acetyl-7'-desme thyl -7l-(/3-allyl)-cis-MeBmt]'--ciclosporin; 10 1.30 [ 3 ' - 0 - Ace tyl - 7' - desme thyl - 7' - phenyl-MeBmt]'- - [Val]^-ciclosporin; 1.31 [3'-O-Ace ty 1-7’- desme thyl - 7 ' -phenyl -cis-MeBmt]'--[Val]^-ciclo-sporin; 1.32 [3'-0-Acetyl-7' - desmethyl - 7 ' - vinyl-c is-MeBmt ] ^ - [Valj^-ciclo-sporin; 15 1.33 [3'-0-Acetyl-7'- desmethyl - 7' - vinyl-cis-Me Brat]'- - [ Nva ] "- c iclo- sporin; og 1.34 [3'-0-Acetyl-7'- desme thyl - 7 1 - (3 - brom - n. propyl) - cis-Me Brat] ciclosporin.

En yderligere gruppe af cyclosporiner af klasse 1 er sådanne: 20 Ib) Hvor β-carbonatomet i gruppen i 2-stillingen er 0-acylsubstitu-eret, dvs. hvor gruppen i 2-stillingen er en -0-acyl-a-amino-syregruppe, og gruppen i i-stillingen er forskellig fra de ovenfor under la) definerede.

15 DK 173873 B1

Nir gruppen i 2-stillingen er en /3-0-acyl-a-aminosyregruppe, vil denne gruppe sædvanligvis være i (L)-konfiguration. Hensigtsmæssigt er den en gruppe med formlen III'' 0-ACYL5 β ch-ch3 ! an") -NH-CH-CO-

(D

5 hvor ACYL2 betegner en acylgruppe. Fortrinsvis er det en O-acyl-(L)-threonylgruppe.

Egnede grupper som ACYL^ i formel III'' er sidanne med formlen R3-CO-eller Ry-CO-Rg-CO-, hvor R3 har samme betydning som anført i formel III, Ry betegner en cyclosporingruppe med en β-oxy-(L)-ct-aminosyre-10 gruppe i 2-stillingen fæstnet til delens -CO-Rg-CO- via ^-oxygenato-raet i den nævnte gruppe, og Rg betegner C^.g-alkylen.

Alkylengrupper som Rg kan være forgrenede eller ligekædede. Fortrinsvis er de ligekædede. Rg er fortrinsvis C^.^-alkylen. Acylgrupper med formel R3-CO- er generelt foretrukne, idet de foretrukne betydninger 15 af R3-CO- er de samme som anført ovenfor i forbindelse med formel III.

Særlige cyclosporiner i denne gruppe er sidanne med den ovenfor beskrevne formel II, hvor A betegner -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-, B betegner en gruppe som ovenfor defineret for lb, fx med formel III'' 20 som defineret ovenfor, X betegner -Sar- og Y betegner -Val-,

Eksempler pi sidanne cyclosporiner, der er egnede til anvendelse i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, er: 1.35 (0-Acetyl-Thr]2-ciclosporin; og 1.36 1,2-Ethandicarboxylsyre [0-threonyl]2-ciclosporin diester.

16 DK 173873 B1

Ciclosporin 1.36 har formlen VI

0 CH3 0-C-CHj- \/ CH (VI) -MeBmt-NH-CH-CO-Sar-MeLeu-Val-MeLeu— (1) —Ala-(D)Ala-MeLeu-HeLeu-MeVal- - 2

En yderligere foretrukken gruppe af cyclosporiner i klasse 1 er sådanne: 5 lc) Hvor 3'-carbonatomet i gruppen I 1-stillingen er oxo-subscitu-eret,

Når 3'-carbonatomeC i gruppen i 1-stillingen er oxo-substitueret, er denne hensigtsmæssigt - 3'-desoxy-3'-oxo-MeBmt- med formel VII

CH3

'^'CH

j TRANS CH

"'""CHj 10 (VII) (R) CHj -N-CH—C0- I (S) CH j 17 DK 173873 B1

Sarligt foretrukne cyclosporiner i denne gruppe er sådanne med den ovenfor beskrevne formel II, hvor A betegner en gruppe med den ovenfor anførte formel VII, B har samme betydning som anført for formel 5 II, X betegner -Sar-, og Y betegner -Val-.

Endnu en yderligere gruppe af cyclosporiner i klasse 1 er sådanne: ld) hvor /i-carbonatomet i gruppen i 2-stillingen er /3-oxo-substitu-eret, dvs. hvor gruppen i 2-stillingen er en β-οχο-α-aminosyre -gruppe.

10 Når gruppen i 2-stillingen er en Ø-oxo-a-aminosyregruppe, vil denne gruppe generelt have (L)-konfiguration. Hensigtsmæssigt er det -a-methylketo-Gly- med formel VIII

_nh_Ih_co- <vm) <L)

Eksempler på cyclosporiner tilhørende grupper lc og ld, hvilke cyclo-15 sporiner er egnede til anvendelse I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, er: 1.37 [3' -Desoxy-3' -oxo-MeBmt]*-ciclosporin; 1.38 [3'-Desoxy-3'-oxo-MeBmt]^-[ValJ^-ciclosporin; 1.39 [3 ’ -Desoxy-3'-oxo-MeBmt][Nva]^-ciclosporin; 20 1.40 (a-Methylketo-Gly]^-ciclosporin; og 1.41 [Dihydro-MeBmt]^-[a-methylketo-Gly]^-ciclosporin.

Cyclosporiner 1.37 til 1.39 er særligt foretrukne.

18 DK 173873 B1 KLASSE 2

En cyclosporin, hvor: i) 3'-Carbonatomet i gruppen i 1-stillingen er ,4-alkaxyimino--substitueret, dvs. en cyclosporin, hvor gruppen i 1-stillingen 5 er en -3'-desoxy-3'-(C^,^-alkoxyamino)-MeBmt-gruppe; eller il) Gruppen i 2-stillingen er en (L)-isoleucyl-gruppe; eller iii) Gruppen i li-stillingen er en N-methyl-(L)-alanyl-, N-raethyl--(L)-isoleucyl- eller N-methyl-(L)-alloisoleucyl- eller N-me-thyl-(L)-leucyl gruppe.

LO - 3 '-Desoxy-3 ' - (Cj_.4-alkoxyimino)-MeBmt-grupper som defineret under (i) ovenfor har formlen IX

CH3

CH

I (IX)

R9-O-N. CH

^ (R^CH, -N—-CH—C0-I (S) CH3 15

Hvor R9 betegner Cj__4-alkyl.

Alkylgrupper som Rg kan vire forgrenede eller ligek*dede. Fortrinsvis er de ligekædede.

19 DK 173873 B1

Ved N-methyl-(L)-alloisoleucyl (-Meallolle-) som anvendt under (iil) ovenfor forstis gruppen med formel X

C 2 H s CH)

CH

I (X) - N-CH-CO- (L) CHj

Foretrukne cyclosporiner i denne klasse af sådanne med formel XI

—A-B-Sar-Meleu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-HeLeu-MeLeu-Z_ 5 1234567 8 9 10 11 (XI) hvor A betegner -MeBmt-, -dihydro-MeBmt- eller en gruppe som defineret ovenfor under (i), B betegner -oAbu-, -Thr-, -Val- eller -Nva- eller, når A betegner 10 -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-, yderligere -Ile-, og når A betegner -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt- og B betegner -aAbu-, -Thr-, -Val- eller -Nva-, så betegner Z -MeAla-, Melle-, -Meallolle- eller -MeLeu-, eller 15 når A betegner en gruppe som defineret ovenfor under (i) eller når B betegner -Ile-, så betegner Z -MeVal-.

Eksempler på sådanne cyclosporiner, der er hensigtsmæssige til an-20 vendelse i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, er: 2.1 [3' -Desoxy-3'-methoxyimino-MeBmt]^- ciclosporin; 20 DK 173873 B1 2.2 [Ile]2-ciclosporin; 2.3 [MeAla]^-ciclosporin; 2.4 [Melle] ^-ciclosporin; og 2.5 [Meallolle] ^-ciclosporin; og 5 2.6 [MeLeu]^-ciclosporin.

I denne klasse er foretrukne cyclosporiner sådanne, hvor gruppen i 2-stillingen har den ovenfor under (ii) anførte betydning, især cyclosporin 2.2.

Cyclosporiner, hvor gruppen i i 1 - stillingen har den under (iii) an-10 førte betydning, fx cyclosporiner 2.4 og 2.5, er også af særlig interesse.

KLASSE 3

Cyclosporiner med formel XI som beskrevet ovenfor, hvor: Z betegner -Val- eller -MeVal-: 15 når Z betegner -Val-, så betegner A -MeBmt- eller dihydro-MeBmt-; eller når Z betegner -MeVal-, så betegner A -3'-desoxy-MeBrat-, 3'-desoxy-dihydro-MeBmt-, -N-desmethyl-MeBmt-, -N-desmethyl-dihydro-MeBmt-, -3'-des- 20 oxy-4'-desraethyl-dihydro-MeBmt- eller -MeLeu-; og når Z betegner -Val-, så betegner B -aAbu- eller -Thr-; når Z betegner -MeVal- og 21 DK 173873 B1 A betegner -3'-desoxy-MeBmt-, -3'-desoxy-dihydro-MeBmt-, -3'-de-soxy-4'-desmethyl-dihydro-MeBmt- eller -MeLeu-, så betegner B -aAbu-; eller når Q betegner -MeVal- og 5 A betegner -N-desmethyl-MeBmt- eller -N-desmethyl-di- hydro-MeBmt-, så betegner B -Thr-.

Cyclosporiner af denne klasse er: 3.1 [Val]11-ciclosporin (også kendt som cyclosporin E); 10 3.2 [Dihydro-MeBmt]1-[Val]^-ciclosporin (eller dihydrocyclosporin E) ; 3.3 [3'-Desoxy-MeBmtJ^-ciclosporin (eller cyclosporin F); 3.4 [3'-Desoxy-dihydro-MeBmt]1-ciclosporin (eller dihydrocyclosporin F) ; 15 3.5 [N-Desmethyl-MeBmt] [Thr ] ^-ciclosporin (eller cyclosporin P) ; 3.6 [N-Desmethyl-dihydro-MeBmt][Thr]^-ciclosporin (eller dihydrocyclosporin P); 3.7 [Thr][Val]^-ciclosporin (eller cyclosporin W); 3.8 [Dihydro-MeBmt]^·-[Thr]^-[Valj^-ciclosporin (eller dihydrocyclo- 20 sporin W); 3.9 [3'-Desoxy-4'-desmethyl-dihydro-MeBmt] ^--ciclosporin (eller cyclosporin Z); 3.10 [MeLeu] ^--ciclosporin (eller cyclosporin 28).

Forskellige acylerede cyclosporiner af gruppe la), især gruppe la1), 25 og gruppe lb) er kendte. Således er cyclosporiner 1.1, 1.4, 1.8, 1.9, 22 DK 173873 B1 1.13, 1.14 og 1.34 kendte fra og beskrevne i, ligesom fremgangsmåder til fremstilling deraf, fx Traber et al., Helv. Chim. Acta, 60, 1247 et seq. (1977), 65, 1655 et seq. (1982), 70, 13 et seq. (1987); Kobel et al., Europ. J. Applied Microbiology, Biotechnology 14, 273 et seq.

5 (1982); og von Wartburg et al., Progress in Allergy, 38, 28 et seq.

(1986).

Cyclosporiner 1.2, 1.3, 1.5, 1.6, 1.7 og 1.10 er hidtil ukendte og udgør del af den foreliggende opfindelse som hidtil ukendte forbindelser per se.. Cyclosporin 1.2, 1.5 - 1.7 og 1.10 kan fremstilles 10 analogt med beskrevne metoder inden for teknikken, fx til fremstilling af cyclosporin 1.1, ved acetylering af de tilsvarende cyclosporiner, hvor gruppen i 1-stillingen er -MeBmt- eller -dihydro--MeBmt-, Cyclosporinudgangsmaterialerne er kendte, for cyclosporin 1.6 og 1.7's vedkommende fra fx EP 194 972. Cyclosporinprodukterne har L5 det følgende fysiske karakteristika: I-1-1 I I Fysiske data: ( I-1--1 I 1.2 I [a]g° - -328° (c-0,97 i CHC13) | 20 |—----I---—-—-——---—1 I 1.5 I [a]J° - -250° (c-1,0 i CHCI3) |

1-1-—- ------H

I 1.6 I [a]g° - -302,6° (c-0,5 i CHCI3) | I-j--_-1 25 I 1.7 I [elg0 - -296,2“ (c-0,5 i CHCl3) | I-1-1 I 1.10 I [et]g° - -293° (c-0,55 i CHC13) j

I__I__J

Når gruppen i 2-stillingen i cyclosporinudgangsmaterialet er en /3-hy-30 droxy-Q-aminosyregruppe, fx -Thr-, vil /?-OH-gruppen i denne stilling sædvanligvis være mere reaktionsvillig end 3'-hydroxy, fx i -MeBmt-eller -dihydro-MeBmt-, i 1-stillingen. Cyclosporiner, hvor gruppen i 2-stillingen, men ikke gruppen i 1-stillingen, er acylerede [som for gruppe lb) cyclosporiner, fx cyclosporin 1.35], eller hvor begge 35 grupperne i 1- og 2-stillingen er acylerede [som for cyclosporiner 23 DK 173873 B1 1.13 og 1.14 i gruppe la^-J, kan således let fås ifølge eller analogt med metoderne, der er kendte i teknikken, idet der drages fordel af den relative forskel i reaktivitet. Til at fremstille cyclosporiner, hvor 1-stillingen er 3'-O-acyleret, men med en fri ^-OH-gruppe i 2-5 stillingen (som for cyclosporin 1.3], er det først nødvendigt at beskytte hydroxygruppen 1 2-stillingen og derefter fjerne beskyttelsesgruppen efter acylering af gruppen i 1-stillingen. Det følgende eksempel illustrerer den almindelige fremgangsmåde:

EKSEMPEL A

10 Fremstilling af [3 '-O-acetyl-MeBmt]*· -[Thr]^-Ciclosporin (Cyclosporin 1.3):

Trin 1: indføring af en 0-beskyttelsesgruppe ved -Thri [Thrj^-ciclosporin 6,09 g [Thr]^-Ciclosporin opløses i 25 ml abs. CH2CI2 og 5 ml ethi-15 nyl-ether, og 0,2 ml trifluoreddikesyre tilsættes. Reaktionsblandingen omrøres i 20 timer ved stuetemperatur under nitrogenatmosfære. Reaktionsblandingen rystes med 20%'s kold KHCO3, vaskes med vand, ekstraheres med CH2CI2, tørres over Mg2S04, filtreres og inddampes.

Det vundne skum oprenses kromatografisk under anvendelse af 440 g 20 silicagel (0,04-0,06) og med toluen/acetone (2:1) som elueringsmid-del, idet der opsamles i 500 ml fraktioner. Produktet, [Thr-l-me-thyl-ethoxymethylether]^-Ciclosporin, genvindes fra fraktionerne 26-29: smp. — 76,6“C.

Trin 2: acylering af [Thr]^-Ciclosporin i -Thr·^ O-beskyttet form 25 10,66 g af produktet fra trin 1,106 ml eddikesyreanhydrid og 1,22 g 4-dimethylaminopyridin blandes og omrøres i 20 timer ved stuetemperatur og optages i toluen ved 40°C. Remanensen opløses i 400 ml toluen og ekstraheres 1 x med 250 ml kold eddikesyre, 1 x med 250 ml H2O, 1 x med 200 ral 20%'s kold KHCO3 og 1 x med 250 ml H2O. Toluenekstrak-30 terne tørres over MgSO^, filtreres, inddampes og tørres under vakuum 24 DK 173873 B1 til opnåelse af [3'-O-acetyl-MeBmt][Thr-1-methyl-ethoxyniethyle-ther]2-Ciclosporin.

Trin 3: afbeskyttelse af [3 '-O-acetyl-MeBmt]^-[Thr]2-Ciclosporin 1 -Thr-2 O-beskyttet form 5 11,38 g af produktet fra trin 2, 80 ml tetrahydrofuran og 160 ml 67* eddikesyre omrores i 48 timer ved stuetemperatur under N£· Reaktions -blandingen optages i toluen, remanensen opløses i toluen, rystes med 20%'s KHCOj, vaskes med H2O, og toluenekstrakterne tørres over MgSO^ og filtreres. Filtratet inddampes og oprenses kromatografisk under 10 anvendelse af 440 g silicagel (0,04-0,06) og med toluen/acetone (3:1) som elueringsmidde1, idet der opsamles i 500 ml fraktioner. Slutproduktet, [ 3 '-0-acetyl-MeBmt] [Thr ] 2-Ciclosporin, genvindes fra fraktionerne 5-9: smp- 75,6°C, -275,5° (c-0,65 i CHCI3)·

Cyclosporiner med formlen II' er nye og omfattes af den foreliggende 15 opfindelse som hidtil ukendte forbindelser per se. I overensstemmelse hermed tilvejebringer den foreliggende opfindelse i et yderligere aspekt en hidtil ukendt gruppe cyclosporiner, nemlig sådanne: la4) med formlen IX' som defineret ovenfor.

Cyclosporiner af gruppe la4) kan fremstilles helt analogt med frem-20 gangsmåderne til fremstilling af de kendte cyclosporiner 1.1, 1.4 etc., der er henvist til ovenfor, eller analogt med fremstillingen af cyclosporin 1.3, ud fra de tilsvarende cyclosporiner, hvor gruppen i 1-stillingen er -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt. Påkrævede udgangsmaterialer, samt med fremgangsmåderne til fremstilling deraf er kendte 25 og beskrevet, fx i UK 2 155 936, US 4 639 434 og EP 0 056 782. Som det er anført ovenfor, fremstilles cyclosporiner med formlen II', hvor W er en ^-hydroxy- (snarere end /3-0-acyl-) -q-aminosyregruppe analogt med fx eksempel A ved først at beskytte i 8-stillingen, derefter at acylere i 1-stilling og endelig at afbeskytte i 8-stil-30 lingen.

Cyclosporin 1,15 af gruppe la4) har følgende karakteristiske data: (a]g°- -272° (c- 1,0 i CHCI3).

25 DK 173873 B1

Cyclosporiner, hvor 3' -carbonatomet af gruppen i 1-stillingen er azidoalkylcarbonyloxy- eller alkoxycarbonyloxy-substitueret, er også nye og omfattes af den foreliggende opfindelse som hidtil ukendte forbindelser per se.

5 En gruppe af cyclosporiner af denne type omfatter sådanne: la5) hvor gruppen i 1-stillingen er en -3' -0-(Cj__4-azidoalkyl)-carbo-nyl- eller -3’-0-(C^_4-alkoxy)-carbonyl- -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-gruppe, dvs. med formlen I som illustreret ovenfor, hvor Α,ΟΥΐΛ er en gruppe med formlen Rj^'-CO- eller R2-O-CO-, hvor Rj_' 10 er Cj^ .4-azidoalkyl, og R2 er C^.^-alkyl.

Foretrukne cyclosporiner af denne gruppe er sådanne med formlen II som illustreret ovenfor, hvor A er en gruppe som defineret under la5 ovenfor, B har de betydninger, der er anført for formel II, X er -Sar-, og Y er -Val-.

15 Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde til fremstilling af cyclosporiner af gruppe la5), hvilken fremgangsmåde omfatter: a) at omsætte den tilsvarende cyclosporin, hvor gruppen i 1-stillingen er -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-, med en forbindelse med 20 formlen XII eller XIII.

Ri'-C0-Q (XII) R2-0-C0-Q (XIII)

Hvor Rj/ og R2 har de ovenfor anførte betydninger, og Q er en fraspaltelig enhed.

Q er hensigtsmæssigt halogen eller -OH. Når Q er halogen, udføres 25 reaktionen hensigtsmæssigt fx i nærværelse af en katalysator såsom n-butyllithium. Når Q er -OH, udføres reaktionen hensigtsmæssigt i nærværelse af et aktiverende middel. Reaktion udføres hensigtsmæssigt ved temperaturer på fra ca. -iOO°C til -50°C, fx som beskrevet i de følgende eksempler B: 26 DK 173873 B1

EKSEMPLER B

1. Fremstilling af [3 '-O-methoxycarbonyl-MeBmt]^ -Ciclosporin (cyclosporin 1.11) 3,76 ml af en 1.48M opløsning af n-butyllithium i 3,76 ml hexan 5 sættes til 0,87 ml diisopropylamin i tetrahydrofuran ved -78eC, og det hele omrores i 30 minutter ved -78°C. 1,0 g Ciclosporin i 15 ml tørt tetrahydrofuran tilsættes ved samme temperatur, og omrøring fortsættes i yderligere 30 minutter, 0,326 ml me thyl -chlorformiat tilsættes, og omrøring fortsættes i yderligere 1 10 time ved -78°C. Temperaturen lades derefter stige til stuetem peratur. 10 ml vand tilsættes, og det meste af tetrahydrofuranet fjernes ved inddampning. Remanensen optages i 100 ml ethylether og 50 ml vand, den vandige fase skilles fra og ekstraheres 2 x med ethylether, De samlede organiske ekstrakter tørres over 15 NgSO^ og inddampes til tørhed. Remanensen oprenses kromatogra fisk på silicagel under eluering med ethylacetat til opnåelse af titelforbindeIsen:

Mg0 - -234° (c - 1,0 i CHC13).

2. Fremstilling af [3'-O-(4-azidobutanoyl)-MeBrntj^-Ciclosporin 20 (cyclosporin 1.12) 7,74 g 7-azidosmørsyre, 8,6 g 4-dimethylaminopyridin og 5,11 g Mullayama-reagens (2-chlor-l-methyl-pyridiniumiodid) sættes til 12,02 g Ciclosporin i 200 ml abs. CH2CI2, og reaktionsblandingen omrøres i 90 timer ved stuetemperatur. Det vundne produkt for-25 tyndes med CH2CI2, rystes med 100 ml 10%' s iskold NaOH, 200 ml H2O og 200 ml 10%'s eddikesyre, vaskes med vand, og de organiske faser tørres over Filtratet inddampes og tørres igen.

Produktet oprenses kromatografisk under anvendelse af 1,2 kg silicagel (0,04-0,06 mm) og med hexan/acetone (3:1) som elue-30 ringsmiddel, idet der indtil fraktion 20 opsamles i fraktioner å 250 ml, og derefter med hexan/acetone (7:3), idet der derefter 27 DK 173873 B1 opsamles i fraktioner å 300 ml. Titelforbindelsen genvindes fra fraktionerne 23-27: [a]g° -289,8" (c- 0,5 i CHC13).

Cyclosporiner af gruppe la^ som ovenfor anført er også nye og omfattes af den foreliggende opfindelse som hidtil ukendte forbindelser 5 per se.

Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde til fremstilling af cyclosporiner af gruppe la^), hvilken fremgangsmåde omfatter: b) acylering af den tilsvarende cyclosporin, hvor gruppen i 1-10 stillingen er en -8'-C^.g-alkoxy-cis-MeBmt- eller -8'-C^_g-

alkoxy-dihydro-MeBmt-gruppe med formlen XIV

R<

X

y\ ^ch2 i (XIV)

HO (R) CH

^cr (R)"ch3 -N - CH - C0- I (S) CH j 15 hvor -x-y- og har de betydninger, der er anført ovenfor for formel IV, fx acylering af en cyclosporin med formlen II som illustreret ovenfor, hvor A er en gruppe med formlen XIV som * defineret ovenfor, B har de betydninger, der er anført for

formel II, X er -Sar-, og Y er -Val-, fx ved omsætning med en 20 forbindelse med formlen XV

R5-CO-Q (XV) j 28 DK 173873 B1 hvor R5 er C^-alkyl, og Q er en fraspaltelig enhed, fx et halogenatom; eller c) til fremstilling af en cyclosporin af gruppe la2, hvor gruppen i Instillingen er en -3’-0-acyl-8'-C^.g-alkoxy-cis-MeBmt-gruppe 5 med formlen IV som illustreret ovenfor, hvor -x-y* er cis

-CH-CH-, R^ har den betydning, der er anført for formel IV, og ACYlA er en acyl-O-beskyttelsesgruppe, fx acetyl, omsætning af en cyclosporin, hvor gruppen i i-stillingen er en -3'-O-acyl-5' -des-(1-propenyl)-5formyl-MeBmt-gruppe med formlen XVI

10 0

II

c X \ H CH2 1 (XVI)

R10-O (R) CH

TH (R)^CHj -N - CH - CO-I (S) ch3 hvor Rl0 er en acyl-O-beskyttelsesgruppe, fx acetyl, fx en cyclosporin med formlen II som illustreret ovenfor, hvor A er en 15 gruppe med formlen XVI som defineret ovenfor, B har de betyd

ninger, der er givet for formel II, X er -Sar-, og Y er -Val-, med en forbindelse med formlen XVII

Rn-~P . CH-R« (XVII)

Ril hvor hvert R^ er phenyl eller C^.^-alkyl, og R^ har den be-20 tydning, der er givet for formel IV.

Omsætning i overensstemmelse med ovenstående fremgangsmådetrin (c) kan udføres i overensstemmelse med gængse fremgangsmåder, der an- 29 DK 173873 B1 vendes for at udføre en Wittig-reaktion, fx under vandfri betingelser, fx i et inert opløsningsmiddel eller fortyndingsmiddel såsom absolut benzen, tetrahydrofuran, ethylether eller toluen, ved en temperatur på fra ca. -80^0 til 20°C, eventuelt i nærværelse af et 5 salt, fx et alkali-metalhalogenid. Reaktionen udføres hensigtsmassigt under en inert atmosfære.

De cyclosporinudgangsmaterialer, der anvendes i fremgangsmådetrin (c), kan fås ud fra de tilsvarende cyclosporiner, hvor gruppen i 1-stillingen er -3’-O-acyl-beskyttet-MeBmt-, fx -3’-O-acetyl-MeBmt-, 10 ved: d) ozonolysering og behandling af det øjeblikkeligt vundne ozonoly-seprodukt med et mildt reduktionsmiddel.

Ozonolyse i overensstemmelse med reaktionstrin (d) kan udføres i overensstemmelse med standard teknikker, fx i en ozonisator i nær-15 værelse af fx ethylacetat eller dichlormethan, ved en temperatur på fra ca. -90 til ca. -40eC. Et hensigtsmæssigt mildt reduktionsmiddel er dimethylsulfid. Ozonolyse og behandling med det milde reduktionsmiddel udføres hensigtsmæssigt i et enkelt reaktionskar, fx som beskrevet i de følgende eksempler C.

20 Udgangsmaterialerne for procestrin (d) er cyclosporiner af gruppe la^·, og de er kendte eller kan vindes som beskrevet ovenfor.

Procestrin (b) kan udføres analogt med processer til fremstilling af cyclosporiner af grupper la^-) og lb) som beskrevet ovenfor, fx med reference til litteraturen. På lignende måde kan cyclosporiner af 25 gruppe la^) med en fri ^-hydroxy-a-aminosyregruppe, fx -Thr-, i 2- stillingen fremstilles ved mellemproduktbeskyttelse og efterfølgende afbeskyttelse af β-OH-gruppen, fx ved at gå frem analogt med fremgangsmåderne beskrevet i forbindelse med eksempel A ovenfor. Udgangsmaterialerne for procestrin (b) ovenfor kan vindes ved: 30 e) afbeskyttelse af den tilsvarende cyclosporin, hvor gruppen i 1-stillingen er en -8'-C^.g-alkoxy-cis-MeBmt- eller -8'-Cj_.g-alkoxy-dihydro-MeBmt-gruppe i 3'-0-beskyttet form; eller 30 DK 173873 B1 f) reduktion af den tilsvarende cyclosporin, hvor gruppen i 1- stillingen er en -8 ’-C^.g-alkoxy-cls-HeBmt-gruppe i fri eller 3'-O-beskyttet form og, om nødvendigt, udførelse af procestrin (e).

5 Hensigtsmæssige 3'-O-beskyttelsesgrupper i udgangsmaterialerne for procestrin (e) omfatter hvilke som helst kendte og almindeligt anvendte inden for peptidkemien inkluderende acyl- og etherbeskyttel-sesgrupper. Udgangsmaterialerne for procestrin (e) omfatter således produkterne fra procestrin (c) beskrevet ovenfor. Tilsvarende ud-10 gangsmaterialer, hvor 3'-O-beskyttelsesgruppen er en anden end acyl, kan vindes analogt med procestrin (d) og (c) ud fra de passende 3'-0-beskyttede cyclosporiner.

Procestrin (e) kan i sig selv udføres i overensstemmelse med fremgangsmåder, der almindeligvis anvendes inden for peptidkemien, fx ved 15 hydrolyse i nærværelse af en base såsom en alkalimetalalkoxid eller et -carbonat til fjernelse af acetylbeskyttelsesgrupper eller hydro-lytisk etherspal tning, fx i nærværelse af trifluor-eddikesyre eller HC1 til fjernelse af etherbeskyttelsesgrupper. Procescrin (e) udføres hensigtsmæssigt ved temperaturer på fra ca. -20“C til ca. 20°C, fx 20 som beskrevet nedenfor i eksempler D.

Procestrin (f) kan også udføres analogt med kendte fremgangsmåder, fx til reduktion af naturligt forekommende cyclosporiner til de tilsvarende dihydrocyclosporiner, fx ved katalytisk hydrogenering, fx i overensstemmelse med de sædvanlige fremgangsmåder, der er beskrevet i 25 UK 1 567 201. Hydrogenering udføres hensigtsmæssigt under neutrale pH-forhold ved temperaturer på fra ca. 20°C til ca. 30°C og ved atmosfærisk eller let forhøjet tryk i nærværelse af en katalysator såsom platin eller, fortrinsvis, palladium (fx palladium-på-trækul) i nærværelse af et inert opløsningsmiddel eller fortyndingsmiddel såsom 30 ethylacetat eller lavere alifatiske alkanoler såsom methanol og isopropanol.

Cyclosporinudgangsmacerialerne for procestrin (b) er også nye og omfattes af den foreliggende opfindelse som hidtil ukendte forbindel- 31 DK 173873 B1 ser per se. Således tilvejebringer den foreliggende opfindelse i et yderligere aspekt også: KLASSE 4

En cyclosporin, hvor gruppen i 1-stillingen er en -8' -alkoxy-cis-5 MeBrat- eller -8'-C^.g-alkoxy-dihydro-MeBmt-gruppe med formlen XIV som defineret ovenfor.

Foretrukne cyclosporiner af denne klasse er sådanne med formlen II som defineret for procestrin (b).

Ud over deres nyttighed som mellemprodukter har cyclosporiner af 10 klasse 4 også fx immunosuppressiv, anti-inflammatorisk og anci-para-sitisk aktivitet som beskrevet nedenfor. Cyclosporinerne er således nyttige i sig selv.

Cyclosporiner af klasse 4 udviser også aktivitet ved at forøge følsomhed over for, eller ved at forøge virkningsfuldheden af, kemotera-15 peutisk lægemiddelterapi og især til at ophæve kemoterapeutisk læge-middelmodstand, fx modstand over for anti-neoplastisk eller cytosta-tisk kemoterapi, som beskrevet for cyclosporiner af klasser 1-3. Med hensyn til fx deres iboende immunosuppressive egenskaber er cyclosporiner af klasse 4 imidlertid generelt mindre hensigtsmæssige til 20 anvendelse ved sådanne indikationer.

Cyclosporinudgangsmaterialerne for procestrin (c) er også nye og omfattes af den foreliggende opfindelse som hidtil ukendte forbindelser per se. Disse udgangsmaterialer kan selvfølgelig underkastes mellemliggende afbeskyttelse og/eller gen-beskyttelse, fx med det 25 formål at kunne håndteres, transporteres eller lagres, i overensstemmelse med fremgangsmåder, der er kendte eller som udføres inden * for teknikken. Således tilvejebringer den foreliggende opfindelse i et yderligere aspekt også; f.

i 32 DK 173873 B1 KLASSE 5

En cyclosporin, hvor gruppen 1 1 - stillingen er -5'-des-(l-propenyl)-5'-formyl-MeBmt- i fri eller i 3'-O-beskyttet form, dvs. en gruppe med formlen XVIII

5 0

U

H CH2

Ru-0 (R) CH

^CH (XVIII) -N-CH—CO- I (S) CHj hvor Rj_2 hydrogen eller en O-beskyttelsesgruppe.

Foretrukne beskyttelsesgrupper som R^2 er acyl-O-beskyttelsesgrupper, 10 fx acetyl. Foretrukne cyclosporiner af denne klasse er sådanne med formlen II som illustreret ovenfor, hvor A er en gruppe med formlen XVIII som defineret ovenfor, B har de betydninger, der er givet for formel II, X er -Sar-, og Y er -Val-.

Når Rj_2 er hydrogen, eksisterer gruppen med formlen XVIII også i den 15 cykliske tautomere form med formlen XVIII':

OH

CH

/ ^ch2 o

\<R) .CH

-N CH—C0- I (S) CHj <XVIII') 33 DK 173873 B1 Sådanne tautomerer skal forstås som værende inden for den foreliggende opfindelse rammer, fx omfattet af definitionen for klasse 5 cyclo-sporiner ovenfor.

5 De følgende eksempler illustrerer ovennævnte fremgangsmåder til fremstilling af cyclosporiner af gruppe la^ og af klasser 4 og 5.

EKSEMPLER C

Fremstilling af cyclosporiner af gruppe la^.

Fremstilling af [3 ' -O-acetyl-8' -methoxy- cis-MeBmc] ^ -C ic lospor in 10 (cyclosporin 1.16): 16 g Methoxymethyltriphenylphosphoniumbromid suspenderes i 270 ml absolut tetrahydrofuran (THF) under argonatmosfære og afkøles til -75°C. En opløsning af 5 g kalium-t.butylat i 200 ml absolut THF tilsættes dråbevis i løbet af 30 minutter, og blandingen omrøres 15 igen. Efter 2 timer tilsættes dråbevis en opløsning af 10 g [3'-0- acetyl-5'-des-(1-propenyl)-5'-formyl-MeBmt]^-ciclosporin i 25 ml THF i løbet af 20 minutter. Blandingen omrøres i 4 timer ved stuetemperatur og behandles derefter med 400 ml ethylacetat. Ekstrakterne vaskes med 2N HCl-opløsning, mættet NaHC03 og mættet saltopløsning. Det 20 koncentrerede filtrat kromatograferes på 1,2 kg og 0,44 kg silieagel (0,04 til 0,063 mm) med CHCI3 (10-40%) acetone/ethylacetat til opnåelse af titelforbindelsen: - -267“ (c - 0,53 i CHCI3) .

Cyclosporiner 1.17 til 1.21 kan fremstilles på analog måde. Disse har følgende fysiske karakteristika: 34 DK 173873 B1 i-1 ' ' i I I Fysiske data: | I 1.17 I [a]jj° - -283° (c- 0,544 i CHCI3) | 5 ,-1-i I 1.18 I [elg0 - -209,1“ (c- 0,605 i CHCI3) | (-1-1 I 1.19 I [a]5° - -282,96“ (c- 0,405 i CHCI3) | I-h---1 10 I 1.20 [ [e)8° - -268” (c- 0,615 i CHCl3) |

,-1——----———I

I 1.21 I [q)5° - -248,7“ (c- 0,65 i CHCI3) | i_L_-—-—---1

Udgangsmaterialet for ovennævnte fremgangsmåde, hvilket materiale er 15 en cyclosporin af klasse 5, fremstilles som følger:

Fremstilling af [3 ' -O-acetyl-5 ' -des - (1 - property 1)-5' - formyl - MeBmC ]1 -ciclosporin (cyclosporin 5.1): 48,5 g (3'-O-acetyl-MeBmt] ^--ciclosporin i 70 ml ethylacetat ozoni-seres i 45 minutter ved -70°C under anvendelse af en Fischer-ozonge-20 nerator ved 0,4 atm. med en strømningshastighed på 110 1/time. Den vundne opløsning beluftes med N2. og 9,8 ml dimethylsulfid tilsættes. Opløsningen omrøres i 2 timer ved stuetemperatur, koncentreres ved inddampning, vaskes 2 x med benzen og tørres under højvakuum til opnåelse af det ønskede produkt. Dette anvendes direkte til yderli-25 gere reaktion uden yderligere oprensning: - -302° (c - 1,15 i CHCI3).

De følgende cyclosporiner fås på analog måde 5.2 [3'-0-acetyl- 5’-des - (1 -propenyl) - 5 ' - formyl-MeBmt ] ^- - [ 0- acetyl -Thr]^-ciclosporin: [ajj^ - -272,6° (c- 0,504 i CHCI3) ,

30 smp. - 156-160°C

5.3 [3'-O-acetyl-5’-des-(1-propenyl)- 5'- formyl- MeBmt][Valj ^-ciclosporin: [alf5° - -306° (c-1,03 i CHCI3) , smp. - 168-170“C

35 DK 173873 B1 5.4 [3' - O-acetyl-5 ' - des - (1-propenyl)- 5' - formyl-MeBmtJ [Nva] 2_ciclo- sporin: [ajfj0 - -291,768 (c- 0,51 i CHC13).

EKSEMPLER D

Fremstilling af cyclosporiner af klasse 4.

5 Fremstilling af [8' -methoxy-ds-MeBmc]*·-ciclosporin (cyclosporin 4.1): 4 g cyclosporin 1.16 (fra eksempler C) i 41 ml methanol/vand (5:1) opvarmes med 3,5 g kaliumcarbonat og omrøres ved stuetemperatur.

Efter 21 timer gøres den afkølede opløsning sur med 10% vinsyreopløs -10 ning og ekstraheres 3 gange med CHCI3. Ekstrakterne vaskes med mættet NaHCOj og vand, tørres over Na2SO^ og koncentreres. Kromatografi på 220 g silicagel med ethylacetat og ethylacetat/hexan (100 til 20%) giver titelforbindelsen: [a]j§0 - -239° (c - 0,53 i CHCI3) . Følgende cyclosporiner fås på analog måde: 15 4.2 [8 ' -1. Butoxy-cis-MeBmt] ^--ciclosporin: [a]§® - -228° (c - 0,5 i CHCI3): 4.3 f8'-Methoxy-cis-MeBmt]-[Thr]^-ciclosporin: [aj^0 - -220° (c - 0,37 i CHCI3) ; 4.4 [ 8' -1. Butoxy-cis-MeBmt ] ^ - f Thr ] ^-ciclosporin: [o.- -221° 20 (c - 0,43 i CHCI3) : 4.5 [8'-Methoxy-cis-MeBmt]^-[Val]^-ciclosporin: [o]^ - -241° (c - 0,54 i CHCI3); 4.6 [8'-Methoxy-cis-MeBmt] [Nva] ^-ciclosporin: - -236* (c - 0,634 i CHCI3).

36 DK 173873 B1

Fremstilling af [8 '-methoxy-dihydro-MeBmc)^-ciclosporin (cyclosporin 4.7).

302 mg af cyclosporin 4.1 opløses i 10 ml abs. ethanol og hydrogeneres ved stuetemperatur og atmosfærisk tryk over 5% Pd på trækul.

5 Efter opsamling af den teoretiske mængde hydrogen (50 minutter) skilles katalysatoren fra ved filtrering gennem hyflo, og opløsningsmidlet inddampes ved reduceret tryk. Remanensen kromatograferes på 70 g silicagel (0 - 0,015 mm) med hexanacetone (1:1), hvilket giver titelforbindelsen: ” -229° (c - 0,52 i CHCI3).

10 De følgende cyclosporiner fås på analog måde: 4.8 [8'-Methoxy-dihydro-MeBmt]^-[Thr]^-ciclosporin: [ajj^ - -217,5° (c - 0,32 i CHCI3) ; 4.9 [8'-hethoxy-dihydro-MeBmt·^-[Val]^-ciclosporin: [q]^ - -223,6° (c - 0,58 i CHCI3); 15 4.10 [8'-Methoxy-dihydro-MeBmt]3-[Nva]^-ciclosporin: [a]]}*3 - -221,5° (c - 0,594 i CHCI3)

Cyclosporiner af gruppe la3 som beskrevet ovenfor er også nye og omfattes af den foreliggende opfindelse som hidtil ukendte forbindelser per se .

20 Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde til fremstilling af cyclosporiner af gruppe la3, hvilken fremgangsmåde omfatter : g) acylering af den tilsvarende cyclosporin, hvor gruppen i 1-stillingen er -cis-MeBmt-; en -7'-desmethyl-7'-hydrocarbyl- 25 -MeBmt- eller -cis-MeBmt-gruppe, hvor hydrocarbyldelen omfatter mindst to carbonatomer; eller en - 7'-desmethyl-7'-hydrocarbyl-dihydro-MeBmt-gruppe, hvor hydrocarbyldelen omfatter mindst to carbonatomer, og hvor en hvilken som helst alifatisk gruppe eller alifatisk del, som udgør eller er til stede i nævnte 37 DK 173873 B1

hydrocarbyldel, et måttet, hvilken gruppe kan anskueliggøres ved formlen XIX

R« x y*.

CH2 (XIX) HO (R) ,CH ^Cli <R)^CHj -N - ca - co- I (S) CHj 5 hvor -x-y- og Rg har de betydninger, der er givet ovenfor for formel V, fx acylering af en cyclosporin med formlen II som illustreret ovenfor, hvor A er en gruppe med formlen XIX som defineret ovenfor, B har de betydninger, der er givet for formel 10 II, X er -Sar-, og Y er -Val-, fx ved omsætning med en forbin delse med formlen XV som defineret ovenfor; eller h) fremstilling af en cyclosporin af gruppe la\ hvor gruppen i 1-stillingen er en -3'-O-acyl-cis-MeBrat-, hvor acyldelen er en acyl-O-beskyttelsesgruppe, eller en -7'-desmethyl-7'-hydrocar-15 byl- -MeBmt- eller -cis-MeBmt-gruppe, hvor hydrocarbyldelen omfatter mindst to carbonatomer, og hvor O-acyldelen er en acyl-O-beskyttelsesgruppe, hvilken gruppe kan vmre til sted ved formlen V som illustreret ovenfor, hvor -x-y- er cis eller trans -CH-CH-, Rg har den betydning, der er givet for formel V, og 20 ΑΟΥΐΛ er en acyl-O-beskyttelsesgruppe, fx acetyl, ved at omsætte en cyclosporin, hvor gruppen i 1-stillingen er en -3'-0-acyl-5'-des-(l-propenyl)-5*-formyl-MeBmt-gruppe med formlen XVI som defineret ovenfor, fx en cyclosporin med formlen II som illustreret ovenfor, hvor A er en gruppe med formlen XVI som defi- 38 DK 173873 B1 neret ovenfor, B har de betydninger, der er givet for formel II,

X er -Sar-, og Y er -Val-, med en forbindelse med formlen XX

Ri i..

- CH-R*' hi hvor hver enkelt er phenyl eller C^.^-alkyl, og Rg' er hydrocar-5 byl med mindst 2 carbonatomer og, om nødvendigt, at isolere det ønskede reaktionsprodukt.

Fremgangsmådetrin (g) og (h) kan udføres på en måde, der er nøjagtig analog til fremgangsmåde trin (b) og (c) ovenfor, fx som beskrevet nedenfor i eksempler E. Udgangsmaterialerne for fremgangsmåde trin (g) 10 kan vindes helt analogt med fremgangsmådetrin (e) eller (f) ovenfor ved: i) afbeskyttelse af den tilsvarende cyclosporin, hvor gruppen i 1-stillingen er -3'-O-acyl-cis-MeBmt- eller en -7'-desmethyl-7'-hydrocarbyl- -MeBmt- eller -cis-MeBmt-gruppe, hvor hydrocarbyl- 15 delen omfatter mindst to carbonatomer, og hvor gruppen er i 3'- O-beskyttet form; eller j) reduktion af den tilsvarende cyclosporin, hvor gruppen i 1-stillingen er en - 7'-desmethyl-7'-hydrocarbyl- -MeBmt- eller -cis-MeBmt-gruppe, og hvor gruppen er i fri eller 3'-O-beskyttet 20 form og, om nødvendigt, ved udførelse af fremgangsmådetrin (i).

Hensigtsmæssige 3'-O-beskyttelsesgrupper er som beskrevet ovenfor i forbindelse med fremgangsmådetrin (e) og (f) . Ved udførelse af fremgangsmådetrin (j) vil umættede bindinger i hydrocarbyldelen undergå reduktion sammen med gruppen -x-y-. Alternativt kan cyclosporinud-25 gangsmaterialer, hvor gruppen i i-stillingen er -cis-MeBmt-, vindes i overensstemmelse med den fuldstændigt syntetiske fremgangsmåde til fremstilling af cyclosporiner, fx som beskrevet i EP 0 034 567 eller US 4 369 542.

39 DK 173873 B1

Cyclosporinudgangsmaterialerne for fremgangsmåde trin (g), hvor gruppen i 1-stillingen er forskellig fra -cis-HeBmt-, er også nye og omfattes af den foreliggende opfindelse som hidtil ukendte forbindelser per se. Således angår den foreliggende opfindelse i et yderligere 5 aspekt også: KLASSE 6

En cyclosporin, hvor gruppen i 1-stillingen er en -7'-desmethyl-7'-hydrocarbyl- -MeBmt- eller -cis-MeBmt-gruppe, hvor hydrocarbyldelen omfatter mindst to carbonatomer, eller en -7-'desmethyl-7'-hydrocar-10 byl-dihydro-MeBmt-gruppe, hvor hydrocarbyldelen omfatter mindst 2 carbonatomer, og hvor en hvilken som helst alifatisk gruppe eller alifatisk del, som udger eller er til stede i hydrocarbyldelen, er mættet, hvilken gruppe kan anskueliggøres med formel XIX'

X

y.

15 ( (XIX')

HO (R) CH

-N - CH - C0- I (S) CHj hvor -x-y- er cis- eller trans -CH-CH- eller -CH2-CH2-, og R^'' er hydrocarbyl med mindst 2 carbonatomer, under forudsætning af, at når -x-y-20 er -CH2-CH2-, så er en hvilken som helst alifatisk gruppe eller alifatisk del, der er til stede som eller i R6", mættet.

40 DK 173873 B1

Foretrukne cyclosporiner af denne klasse er sådanne med formlen II som illustreret ovenfor, hvor A er en gruppe med formlen XIX' som defineret ovenfor, B har de betydninger, der er givet for formel II, X er -Sar-, og Y er -Val-.

5 Ud over deres nyttighed som mellemprodukter har cyclosporiner af klasse 6 også fx immunosuppressiv, anti-inflammatorisk og anti-para-sitisk aktivitet som beskrevet nedenfor. De nævnte cyclosporiner er således nyttige I sig selv.

Cyclosporiner af klasse 6 udviser også aktivitet ved forøget følsora-10 hed over for eller forøget virkning af kemoterapeutisk lægemiddelterapi og især til at ophæve kemoterapeutisk lægemiddelmodstand, fx anti-neoplastisk eller cytostatisk kemoterapi, hvilket er beskrevet ovenfor for cyclosporiner af klasser 1-3. Med hensyn til fx deres iboende immunosuppressive egenskaber er cyclosporiner af klasse 6 15 imidlertid generelt mindre hensigtsmæssige til anvendelse ved sådanne indikationer.

Cyclosporiner som beskrevet og eksemplificeret i nærværende beskrivelse og krav, hvor gruppen i 1-stillingen er -cis-MeBmt-, er formelt hidtil ukendte, skønt de er inden for rammerne af ovennævnte 20 EP 0 03 4567 og US 4 369 542.

De følgende eksempler illustrerer ovennævnte fremgangsmåder til fremstilling af cyclosporiner af gruppe la-^ og af klasse 6.

EKSEMPLER E

Fremstilling af [3 ' -O-acetyl - 7 ' -desmechyl - 7' -phenyl-MeBmc]1· -ciclo-25 sporin (cyclosporin 1.22) og af [3'-O-acetyl-7 '-desmethyl-7'-phenyl-cis-MeBmt]^·-ciclosporin (cyclosporin 1.27): 9,5 g Benzyltriphenylphosphoniumchlorid opløses i 150 ral tørt benzen og omsættes med 2,7 g kalium-t.buylat i 24 timer under tilbagesvaling på en vandadskiller. Efter afkøling filtreres suspensionen ned i en 30 ny kolbe under inert atmosfære. 5 g cyclosporin 5.1 (jf eksempler C) 41 DK 173873 B1 i 50 ml benzen tilsættes i løbet af 5 minutter. Efter 21 timer ved stuetemperatur hældes reaktionsblandingen på is, den organiske fase vaskes med 2N HC1, hydrogencarbonat og vand, tørres over natriumsulfat og inddampes. Remanensen kromatograferes 2 gange på 440 g sili-5 cagel (0,04-0,063 mm) med chloroform indeholdende 8-30 p.p.vol. acetone. Fraktion 2 indeholder cyclosporin 1.27 fraktioner 5-15 cyclosporin 1.22. Cyclosporiner 1.23-1.26 og 1.28-1.34 kan fremstilles på analog måde. Disse cyclosporiner har følgende fysiske karakteristika : 10 42 DK 173873 B1 i-1- 1 | ] Fysiske data: ] I-1-1 | 1.22 I [o]8°- -210,9°(c- 1,37 i CHC13) [ 5 (-1-1 I 1.23 I [a]5°- -234,9°(c- 0,89 i CHCI3) | 1-1--- — -——1 [ 1.24 I [q]§°- -248,97°(c- 1,17 i CHCI3) | )-j--1 10 I 1.25 I [q]J°- -237,3°(c- 0,39 i CHCI3) |

I-μ---—H

I I f Es ter 1740 | I 1.26 I NMR.IR J i CH2C12 | I j Acetat 1230 | 15 1-—h----\ I 1.27 I [a]§°- -235,8°(c- 1,0 i CHCI3) | I 1.28 I [O]g0- -220°(c- 1,75 i CHC13) |

j-_|-—----——H

20 j 1.29 I [a]f5°- -239,07° (c- 0,97 i CHCI3) | I-j---—-1 I 1.30 1 [cc]§°- -207,8° (c- 1,25 i CHCI3) | (-|—---—-^ I 1.31 [ [a]§°- -239,6°(c- 0,91 i CHCI3) | 25 1—-H-----1 [ 1.32 I I^Ester 1746 | I j NMR.IR < Acetat 1228 i CC14 |

I I (mh+ 1271 I

\—-H---—-----1 30 I 1.33 I /Ester 1745 | I I NMR.IR <Acetat 1225 i CC14 |

I I MH+ 1271 I

j-1-H

I 1.34 I [o)g°- -226,23°(c- 1,447 i CHCI3) | 35 1-1- —1 43 DK 173873 B1

EKSEMPLER F

Fremstilling af cyclosporiner af klasse 6,

Fremstilling af [7'-desmethyl-7'-phenyl-MeBmt-ciclosporin (cyclo-5 sporin 6,1) 2,29 g cyclosporin 1.22 vundet som ovenfor opløses i 20 ml methanol : vand (4,5 : 1) indeholdende 1,67 g kaliumcarbonat. Efter 20 timer ved stuetemperatur haldes reaktionsblandingen på is indeholdende 10% vinsyre og ekstraheres med chloroform. Det rå ekstrakt kromatogra-10 feres på 120 g silicagel (0,04-0,063 mm) med dichlormethan, der indeholder stigende mængder (20-30%) af acetone, til opnåelse af titel-forbindelsen: (a]§° - -209° (c - 0,99 i CHC13).

De følgende cyclosporiner fås på analog måde: 6.2 [7'-Desmethyl-7'-phenyl-cis-MeBmt] ^--ciclosporin: (a]§® - -236* 15 (c - 1 i CHCI3); 6.3 [7'-Desmethyl-7'-vinyl-cis-MeBmt] ^--ciclosporin: [a]$® - -249“ (c - 1,17 i CHCI3); 6.4 [7'-Desmethyl-7'-vinyl-cis-MeBmt]^-[Thr]^-ciclosporin: [a]j° - -248* (c - 1,44 i CHCI3); 20 6.5 [7' - Desmethyl-7' - (3-methyl-n.butyl) -cis-MeBmt] -ciclosporin: [e]J° - -240“ (c - 1,15 i CHCI3); 6.6 (7'-Desmethyl-7'-n.propyl-cis-MeBmt]*-ciclosporin: (α]§° - -220° (c - 1,75 i CHCI3); 6.7 [7' - Desmethyl-7' - (/?-allyl) - cis-MeBmt] ciclosporin: 25 [o]J° - -239* (c - 0,97 i CHCI3); 6.8 [7'-Desmethyl-7'-phenyl-MeBmt]^-[Val]^-ciclosporin: [e]8° - -208* (c - 1,025 i CHCI3); 44 DK 173873 B1 6.9 [7'-Desmethyl-7'-phenyl-cis-MeBmt] *-[Val)^-ciclosporin: [o]g° - -240® (c - 0,91 i CHC13); 6.10 [7'-Desmethyl-7'-vinyl-cis-MeBmt][Val]ciclosporin:

Mi° - -254,8® (c - 0,48 i CHCI3); 5 6.11 [7'-Desmethyl-7'-vinyl-cis-MeBmt]*·-[Nva]^-ciclosporin: [ajj>° - -246,1" (c - 0,52 i CHCI3) ; 6.12 [7'-Desmethyl-7'-(3-brom-n.propyl)- cis-MeBmt]^-ciclosporin: I-18° - -226® (c - 1,44 i CHCI3);

Afbeskyttelse af cyclosporin 1.23 fører til fremstilling af [cis-10 MeBmt] ^--ciclosporin: [os]§® - -235® (c- 0,9 i CHCI3) .

Fremstilling af [7'- desmethyl-7'-phenyl-dihydro-MeBmt]^-ciclosporin (cyclosporin 6.13) 796 mg af en blanding af cyclosporiner 6.1 og 6.2 hydrogeneres i 50 ml ethanol over 100 mg 10% Pd på trækul ved stuetemperatur i løbet 15 af 6 timer. Filtrering gennem Hyflo giver den rene titelforbindelse: [e]§° - -210° (c - 0,7 i CHCI3).

De følgende cyclosporiner fås på analog måde: 6.14 [7'-desmethyl-7'·n.propy1-dihydro-MeBmt]*-ciclosporin: [α]β® - -188® (c - 6,16 i CHCI3), vundet fra cyclosporin 6.6 20 eller 6.7; 6.15 [7' - desmethyl-7' -ethyl-dihydro-MeBmt]^-- [Thr] ^-ciclosporin: [a)j}0 - -224® (c - 0,4 i CHCI3), vundet fra cyclosporin 6.4; 6.16 [7'-desmethyl-7'-(3-methyl-n.butyl)-dihydro-MeBmt]*--ciclosporin: [q]§® - -222® (c - 0,995 i CHCI3) , vundet fra cyclosporin 6.5; 25 6.17 (7'-desraethyl-7'-i.propyl-dihydro-MeBmt]^--ciclosporin: [e]g° - -229® (c - 1,32 i CHCI3); 45 DK 173873 B1 6.18 [7'-desmethyl-7'-ethyl-dihydro-MeBmt][Valj^-ciclosporin: [ajjj0 - -232,9" (c - 0,48 i CHCI3), vundet fra cyclosporin 6.10; 6.19 [7'-desmethyl-7'-ethyl-dihydro-MeBmt] [Nva]^-ciclosporin: [<a]jj® - -227,29® (c - 0,54 i CHCI3) , vundet fra cyclosporin 5 6.11; 6.20 [7*-desmethyl-7'-phenyl-dihydro-MeBmt] [Val]^-ciclosporin: [α]β® - -214" (c - 1,19 1 CHCI3), vundet fra cyclosporin 6.8 eller 6.9; 6.21 [7*-desmethyl-7'-ethyl-dihydro-MeBmt]^-ciclosporin: 10 [or]§® - -233® (c - 1,15 1 CHCI3), vundet fra cyclosporin 6.3.

Det er klart, at cyclosporiner af grupper la^· og la^ og af klasser 4,

5 og 6 beskrevet ovenfor, der alle er hidtil ukendte, er strukturelt beslagtede, og de kan for nemheds skyld let indordnes i samlede kategorier, fx omfattende cyclosporiner, hvor gruppen i 1-stillingen 15 er en gruppe med formlen XXI

R.

Rb - 0t*)CB

ca <R^Ca’ (XXI) r -N - CH - C0- I (S) CH3 hvor 20 (i) Ra er formyl, og

Rb har de betydninger, der er givet for Rj^ i forbindelse med formel XVIII;eller (ii) Ra er -x'-y'-Rc, idet -x'-y'-Rc har de betydninger, der er givet ./ / / 46 DK 173873 B1 for -x-y-R3, -x-y-Rs eller -x-y-Rs'' i forbindelse med formlerne IV, V, XIV og XIX' ovenfor, og Rjj er hydrogen eller acyl.

På lignende måde kan cyclosporiner af grupper la^ og la·* og af klas- 5 ser 4 og 6, der alle er hidtil ukendte og har anden anvendelse end som mellemprodukter, indordnes under samlede underkategorier, fx omfattende cyclosporiner, hvor gruppen i I-stillingen er en gruppe med formlen XXI som illustreret ovenfor, hvor Ra og har de betydninger, der er givet under (ii) for formel XXI.

10 Acylgrupper som er fortrinsvis ACYL^·-grupper som defineret i forbindelse med formlerne III og IV, især (Cj^-alkyl)-carbonyl, fx acetyl.

Foretrukne cyclosporiner af sådanne kategorier/underkategorier er sådanne med formlen II som illustreret ovenfor, hvor A er en gruppe 15 med formlen XXI som defineret ovenfor, og B har de betydninger, der er givet for formel II, X er -Sar-, og Y er -Val-.

Forskellige cyclosporiner af gruppe lb) som beskrevet ovenfor, fx hvor gruppen i 2-stillingen er en gruppe med formlen III' som illustreret ovenfor, hvor ACYL·* er acetyl, er kendte. Cyclosporin 1.35 er 20 således kendt og er blevet beskrevet sammen med fremgangsmåder til fremstilling deraf i Traber et al., Helv. Chim. Acta, 60, 1247 et seq./(1977). Andre cyclosporiner af gruppe lb kan fremstilles på analog måde. Cyclosporin 1.36 er dog af en hidtil helt ukendt type.

Endnu en yderligere gruppe cyclosporin i overensstemmelse med den 25 foreliggende opfindelse omfatter således: GRUPPE le) i) En dicarboxylsyre-diester af en cyclosporin med en )3-hydroxy-(L)-a-aminosyregruppe i 2-stillingen; især: ii) En dicarboxylsyre-diester af en cyclosporin med en (L)-threonyl- 30 gruppe i 2-stillingen; og især \ \ \ 47 DK 173873 B1

ili) En dicarboxylsyre-diester med formlen XXII

,co-(cr) s' (XXII)

Ri 3 NNSvC0-(cy) hvor Rj^3 er C^.g-alkylen, og hver ^CY^ betegner en gruppe med formlen II som illustreret ovenfor, hvor 5 A er -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-,

B er en (L) -threonylgruppe med formlen XXIII

CH, ^0- I (XXIII) -NH—CH—CQ- (L) X er -Sar-, og Y er -Val-.

Rj_3 er fortrinsvis Cj^-alkylen.

10 Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde til fremstilling af en cyclosporin af gruppe le, hvilken fremgangsmåde omfatter

k) omsætning af en £-0-hemiester af en cyclosporin, hvor gruppen i 2-stillingen er en ^-hydroxy-(L)-α-aminosyregruppe, fx en β-0-15 hemiester med formlen XXIV

Θ - CO-R]^3-CO-OH (XXIV) hvor Θ og Ri3 har de betydninger, der er givet ovenfor, eller et reaktivt funktionelt derivat deraf, med en cyclosporin, hvor gruppen i 2-stillingen er en Ø-hydroxy-(L) -ct-arainosyregruppe, fx 48 DK 173873 B1 en cyclosporin med formlen II som illustreret ovenfor, hvor A er -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-, B er -Thr-, X er -Sar-, og Y er -Val-.

Omsætning kan hensigtsmæssigt udfores i overensstemmelse med den 5 sædvanlige fremgangsmåde ifølge nedenstående eksempel G.

EKSEMPEL G

Fremstilling af 1,2-ethandicarboxylsyre [0-(L)threonyl]^-ciclosporin diester (cyclosporin 1.36) 0,255 g 2-chlor-l-methyl-pyridiniumiodid og 0,244 g 4-dimethylamino 10 pyridin sættes til 1,318 g [(O-hemisuccinyl)-Thrl^-ciclosporin i 5 ml absolut CH2CI2 ved 0°C. 1,218 g [Thr]^-ciclosporin tilsættes, reaktionsblandingen omrøres i 3 timer ved 0°C, og temperaturen lades stige til 20eC under yderligere omrøring. Reaktionsblandingen fortyndes med CH2CI2 og rystes med 10 ml 0,1 NaOH med tilsat is. Blan-15 dingen vaskes 2 x med H2O, og den organiske fase tørres over i^SO^, filtreres og inddampes. Råproduktet oprenses kromatografisk under anvendelse af silicagel og hexan/acetone (1:1) som elueringsmiddel til opnåelse af titelforbindelsen: [a]^: -209,4° (c- 0,5 i CHCI3).

Det [(O-hemisuccinyl)Thr]^-Ciclosporin, der er nødvendigt som ud-20 gangsmateriale, er kendt - se fx PCT-ansøgning nr. PCT/EP85/00501, offentliggjort PCT-skrift nr. W086/02080, eksempel 5. Andre hemi-esterudgangsmaterialer, der er hensigtsmæssige til fremstilling af cyclosporiner af gruppe le, kan fremstilles på analog måde.

Cyclosporiner af gruppe lc som beskrevet ovenfor er nye og omfattes 25 af den foreliggende opfindelse som hidtil ukendte forbindelser per se.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også en fremgangsmåde til fremstilling af cyclosporiner af gruppe lc, hvilken fremgangsmåde omfatter.

il 49 DK 173873 B1 1) oxidation af en cyclosporin, hvori gruppen i 1-stillingen er 3'-hydroxy substitueret, fx er -MeBmt-.

Trin 1) ovenfor kan fx udføres ved omsætning med N-chlor-succinimid/-dimethylsulfid ved en temperatur på fra fx -30eC til 10eC, fx i 5 overensstemmelse med fremgangsmåderne af eksempel H nedenfor.

EKSEMPEL H

Fremstilling af [3 '-desoxy-3'-oxo-MeBmt]^-cyclosporin (Cyclosporin 1.37) 8,48 ml dimethylsulfid sættes ved 0®C til en opløsning af 12,8 g N-10 chlorsuccinimid i 400 ml toluen. Blandingen omrøres i 5 minutter ved 0°C, afkøles til -12eC, og 9,62 g ciclosporin i 40 ml toluen tilsættes. Den vundne suspension omrøres i 1,5 timer ved -10“C og i 1 time ved -10°C til -5®C. 19,4 g triethylarain tilsættes, hvorefter et let bundfald dannes. Blandingen omrøres i 5 timer ved 0®C og for-15 tyndes med 250 ml ethylether. 192 ml IN HC1 tilsættes koldt og eks-traheres. Den organiske fase vaskes 2 x med 500 ml H2O, rystes med 250 ml 10% koldt NaHC03 og vaskes 2 x med 500 ml H20, 250 ml 10% vinsyre og igen med H20. De sure og basalt vandige opløsninger gen-ekstraheres med 2 x 500 ml ethylether. De samlede organiske faser 20 tørres over Na2S04 og inddampes til tørhed ved 40°C. Remanensen oprenses kromatografisk under anvendelse af 300 g silicagel og mættet vandig ethylacetat til opnåelse af titelforbindelsen: [a]§° - -241,3« (c - 0,531 i CHCI3) og -169,5* (c - 0,5 i CH3OH).

Cyclosporiner 1.38 og 1.39 kan fremstilles på analog måde: 25 1—-1-, I I Fysiske data: | 1-1-i

I 1.38 I [o]J° -255,1“(c- 0,5 i CHCI3) I

J 1 H

30 I 1.39 i [a]J°- -235,4e(c- 0,5 i CHC13) |

I-1_I

50 DK 173873 B1

Cyclosporiner af gruppe Id som beskrevet ovenfor er også nye og udgør også en del af den foreliggende opfindelse som hidtil ukendte forbindelser per se.

Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde til frera-5 stilling af cyclosporiner af gruppe id, hvilken fremgangsmåde omfatter: m) oxidation af, fx selektiv oxidation af, en cyclosporin, hvor gruppen i 2-stillingen er en j3-hydroxy-a-aminosyregruppe, fx en (L) -threonylgruppe.

10 Fremgangsmådetrin (m) kan udføres helt analogt med fremgangsmådetrin (1) ovenfor, fx i overensstemmelse med de sædvanlige fremgangsmåder ifølge nedenstående eksempel I.

EKSEMPEL I

Fremstilling af [α-Methylketo-Gly]^·-ciclosporin (Cyclosporin 1 Λ0) 15 484 mg dimethylsulfid sættes til 868 mg N-chlorsuccinimid i 26 ml toluen ved 0eC. Efter omrøring i 10 minutter ved 0°C afkøles suspensionen til -30°C, og 1584 mg [Thr]^-ciclosporin i 6,5 ml toluen tilsættes. Reaktionsblandingen omrøres i 1 time ved 26-30°C, og 1,81 ml triethylamin tilsættes. Afkøling fjernes, og efter yderligere 20 5 minutter tilsættes 25 ml ethylether. Reaktionsblandingen hældes på 150 ml isvand/10 ml IN HC1 og omrøres, og yderligere L00 ml ethylether tilsættes. Den organiske fase vaskes 3 x med 150 ml isvand og ekstraheres 2 x med ethylether. De samlede organiske faser tørres over Na2S04 og koncentreres. Remanensen opløses i 10 ml CH2CI2, 25 filtreres gennem Hyflo, fortyndes med hexan og inddampes til opnåelse af titelforbindelsen: [a]^® - -229° (c - 1,0 i CHCI3) °S *184,8° (c - 1,0 i CH3OH).

Cyclosporin 1.41 kan fremstilles på analog måde: [o]g°= -226,7“ (c- 1,0 i CHCI3).

51 DK 173873 B1

Cyclosporiner af klasse 2(i) og af klasse 2(ii) som beskrevet ovenfor er også nye og omfattes af den foreliggende opfindelse som hidtil ukendte forbindelser per se.

Desuden angår den foreliggende opfindelse også en fremgangsmåde til 5 fremstilling af cyclosporiner af klasse 2(i) og 2(ii), hvilken fremgangsmåde omfatter: m) fremstilling af en cyclosporin af klasse 2(i), omsætning af en cyclosporin, hvor 3'-carbonatomet af gruppen i 1-stillingen er oxo-substitueret, fx en cyclosporin, hvor gruppen i Instillingen LO er -3'-desoxy-3'-oxo-MeBmt- med en C^.^-alkoxyamin, eller n) fremstilling af en cyclosporin af klasse 2 (ii), ved at cykli-sere et åbenkædet peptid omfattende en cyclosporin-sekvens omfattende en (L)-isoleucylgruppe i 2-stillingen, idet nævnte åbenkædede peptid begynder med gruppen svarende til gruppe 8 i L5 nævnte cyclosporin som N-terminal og slutter med gruppen svaren de til gruppe 7 i nævnte cyclosporin som C-terminal, fx ved at cyklisere et åbenkædet peptid omfattende sekvensen - (D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Ile-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala- 89 LO 11 1 23456 7 20 Trin (m) ovenfor kan fx udføres ved omsætning med den valgte C^.^- alkoxyamin, hensigtsmæssigt i form af syreadditionssalt, i nærværelse af en base såsom pyridin ved temperaturer på fra ca. -10®C til ca.

80®C, fx i overensstemmelse med de sædvanlige fremgangsmåder ifølge eksempel J nedenfor.

25 Fremgangsmådetrin (n) ovenfor kan udføres helt analogt med de sædvanlige fremgangsmåder for den samlede cyclosporinsyntese, fx som beskrevet i US 4 554 531 eller EP 0 098 456. Cyclosporin 2.2 fremstilles således fx ved erstatning af BOC-oAbu-OH med B0C-Ile-0H ifølge trin a) i eksempel 1 i nævnte patent/patentpublikation og derefter at 52 DK 173873 B1 gå frem på en måde helt analog med trin (b) til og med (x) som be-. skrevet i navnte patent/patentpublikation.

Cyclosporin 2.2 selv har følgende karakteristiske data: smp. - 151°C / [a]8° - -224° (c - 1,0 i CHC13)

5 EKSEMPEL J

Fremstilling af [3 '-Desoxy-3 '-methoxyimino-HeBmt]^·-ciclosporin (Cyclosporin 2.1) 600 mg af produktet fra eksempel H og 835 mg methoxylaminhydrochlorid i 2,5 ml ethanol/2,5 ml pyridin omrøres i 14 timer ved 50°C under 10 argonatmosfære. Pyridin afdarapes, og remanensen filtreres. Filtratet optages i CH2CI2 og vaskes med saltopløsning. Saltopløsningen eks-traheres adskillige gange med CH2CI2, og de samlede organiske faser vaskes igen med saltopløsning, tørres og inddampes. Remanensen op* renses kromatografisk til opnåelse af titelforbindelsen: -214° 15 (c- 1,09 i CHCI3),

Det er klart, at cyclosporiner af gruppe le og af klasse 2(i) beskrevet ovenfor, der alle er hidtil ukendte og har anden anvendelse end som mellemprodukter, kan indordnes under samlede underkategorier, fx omfattende cyclosporiner, hvor gruppen i 1-stillingen er en 20 gruppe med formlen XXV

53 DK 173873 B1 CHj N'S\h

| TRANS CH

^CH: i (XXV)

Ru (R) .CH ^c (Rj^cHj -N-CH—CO- I (S) CHj hvor R4 er oxygen eller en gruppe med formlen R^N-, hvor R15 er 5 C^.^-alkoxy.

Cyclosporiner af klasse 2(ill) er kendte. Cyclosporiner 2.3 til 2.6 er således beskrevet i fx Wenger, Transplantation Proc., XVIII (6)

Supp. 5 (December), 213 et seq. (1986), Disse cyclosporiner samt andre cyclosporiner af klasse 2(Ii i) kan fremstilles 1 overensstem-10 melse med de sædvanlige fremgangsmåder for den samlede cyclosporin-syntese, fx som beskrevet i US 4 554 531 og EP 0 098 456, fx ved erstatning af H-MeVal-Bzl med H-Melle-Bzl eller H-MeAloIle-Bzl i trin (g) i eksempel 1 deraf. Cyclosporiner 2.3-2.5 har følgende karakteristiske data:

15 ,-1-,--I

I CYCLOSPORIN | smp. <eC) | [e]J° - (c - - i CHCI3) | 1-1-1-1 I 2.3 I 162 - 163 1 - 178*; 1,0 | I-1-1-1 20 I 2.4 I 144 - 146 I - 221"; 1,0 | I-1-1-1 I 2.5 I 146 - 146 I - 225°; 1,0 | 54 DK 173873 B1

Cyclosporiner 3.1-3.5, 3.7 og 3.9 af klasse 3 er kendte [se fx Traber et al., Helv. Chim. Acta, 65, 1655 et seq. (1982) og 70, 13 et seq.

(1987)].

Cyclosporiner 3.6, 3.8 og 3.10 er nye og omfattes af den foreliggende 5 opfindelse som hidtil ukendte forbindelser per se. 3.6 og 3.8 kan fremstilles på en måde, der er helt analog med den, der er anvendt til fremstilling af andre, kendte dihydrocyclosporiner, fx som beskrevet ovenfor i forbindelse med fremgangsmådetrin (f).

Cyclosporin 3.10 kan fremstilles i overensstemmelse med de sædvanlige 10 fremgangsmåder til fraskillelse af cyclosporin bi-metabolitter, fx som beskrevet i Helv. Chim. Acta 65, 1655 et seq. (1982), som en bi-metabolitfraktion fra gæringsvæsker anvendt i fremstillingen af [(D)Ser]8-ciclosporin (se EP 0 056 782), fx som beskrevet i følgende eksempel K.

15 EKSEMPEL K

Fremstilling af [MeLeu]^~ciclosporin (cyclosporin 3.10)

Den biomasse, der er vundet ved kultivering i overensstemmelse med eksempel 3 i EP 0 056 782, fracentrifugeres i en klaringscentrifuge (Westfalia), og væskefasen (kulturfiltrat) ekstraheres 3 x, hver gang 20 med den ækvivalente mængde ethylacetat. Ethylacetatekstrakterne koncentreres under vakuum. Den faste fase (mycelium) behandles med methanol og homogeniseres, og fast stof og væskefaser adskilles i en klaringscentrifuge. Denne ekstraktionsfremgangsmåde gentages 2 x under anvendelse af 90X methanol. De methanoliske ekstrakter samles, 25 vand tilsættes, og ekstrakterne koncentreres under vakuum. Det resterende vandige ekstraktkoncentrat ekstraheres 3 x med den ækvivalente mængde ethylacetat, og ethylacetatekstrakterne koncentreres under vakuum. Begge rå-ekstrakter (fra kulturfiltratet og myceliet) kromatograferes under anvendelse af silicagel (0,040-0,063 mm) og 30 H20-mættet ethylacetat. Tidlige elueringsfraktioner indeholder hovedsageligt [Val]2-ciclosporin (cyclosporin D) efterfulgt af fraktioner 55 DK 173873 B1 hovedsageligt indeholdende [MeLeu]^-ciclosporin (cyclosporin 3.10) og Ciclosporin (cyclosporin A). Topfraktioner kroinatograferes igen under anvendelse af silicagel (0,020-0,045 nun) og med acecone/hexan (1:1) som elueringsmiddel. [MeLeu] ^--ciclosporin indeholdende fraktioner 5 gen-kroraatograferes under anvendelse af LiChoprep®RP-18 (0,04-00,063 mm) og med methanol/l^O (85:15) som elueringsmiddel og derefter på silicagel (0,020-0,045 ram) og med l^O-mættet ethylacetat som elueringsmiddel til opnåelse af titelforbindelsen: smp. - 142-148eC, [o]§°- -303° (c- 0,54 i CHC13).

10 Fysiske karakteristika for cyclosporin 3.6 er: smp. - 180-182’C; [<*]g° - -211° (c- 0,64 i CHCI3).

Som allerede antydet har det nu, i overensstemmelse med foreliggende opfindelse, vist sig, at cyclosporiner af klasse 1 (herunder cyclo-sporiner af grupper la^-la-* og lb-le, 2 og 3 og især individuelle 15 cyclosporiner af disse klasser, hvilke er særskilt nævnt ovenfor,) er i stand til at forøge eller forhøje virkningen af eller forøge eller forhøje følsomheden over for anden kemoterapeutisk lægemiddelterapi, især anti-mikrobiel (fx anti-bakteriel, anti-viral, anti-fungal eller anti-protozoal) kemoterapi og især anti-cancer- eller anti-tumor- (fx 20 anti-neoplastisk eller cytostatisk) kemoterapi. I overensstemmelse hermed indikeres de til anvendelse fx som en måde til at reducere almindelige kemoterapeutiske dosisniveauer, fx i tilfælde af anti-neoplastisk eller cytostatisk lægemiddelterapi, som et middel til at formindske total lægemiddeltoksicitet og især som et middel til at 25 ophæve eller reducere modstand, der omfatter både iboende og erhvervet modstand, over for kemoterapi.

EKSEMPEL 1

Anvendelse til at genvinde følsomhed over for anti-neoplastiske/cyto-Coksiske, anti·tumor-lægemiddelstoffer (in vitro -1) 30 Cancercellelinier (CCL), fx fra humane små cellecarcinoma fra lunge, hvilke er resistente over for én eller flere cancerterapeutiske lægemiddelstoffer (CTDS) valgt blandt gruppen omfattende Daunorubicin 56 DK 173873 B1 (DR); Vineristin (VC); Adriamycin (AH); Etoposid (ET); Tenoposid (TE); og Colchicin (CC) er blevet udviklet i overensstemmelse med fremgangsmåderne beskrevet af Twentyraan et al., Br. J. Cancer, 54, 253 (1986) .

5 Sensitivitet af resistente sublinier (CCL-R) sammenlignes med paren-talt sensitive linier (CCL-S) ved assay af inhibering af cellevækst under kontinuerlig CTDS-påvirkning, fx i tilfælde af en DR-resistent linie (CCL-DRR) ved sammenligning af vækst af CCL-DRS- og CCL-DRR-linier i nærværelse af DR indeholdt i vækstmediet ab initio. Celle -10 proliferation måles i dette tilfælde ved celletælling under anvendelse af en elektronisk celletæller, hvor tælling udføres tæt ved afslutning af den eksponentielle vækstfase. Der udvælges CCL-R-linier, hvor den nødvendige ICgg (lægemiddelkoncentration fx DR-koncentra-tion til at reducere det endelige celletal til 20% af tallet for 15 ikke-CTDS- (fx DR)) behandlede kontroller er >80 X, fortrinsvis >100 X, større end for parentale CCL-S-linier.

Derefter udføres sensitivitet af udvalgte CCL-R-linier over for CTDS (fx DR) under tilstedeværelse og fravær af testcyclosporin ved at anvende celletal som et mål for proliferation som beskrevet ovenfor.

20 Til dette formål er celler kultiveret ab initio i nærværelse af forskellige koncentrationer af både CTDS og testcyclosporin. Til screening er valgt koncentrationer af sidstnævnte, hvilke koncentrationer ikke i sig selv forårsager en signifikant reduktion i proliferation. Passende koncentrationer fastsættes ved at kultivere CCL-25 S og CCL-R i nærværelse af forskellige koncentrationer af cyclosporin under fravær af CTDS. Cyclosporiner testes rutinemæssigt ved koncentrationer på fra 0,01 til 50, især 0,1 til 10, ^g/ml, fx ved koncentrationer af 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 og 50 μg/ml. Det CTDS-forhold (fx DR), der er nødvendigt for at 30 inhibere celleproliferation med 50% under fravær af testcyclosporin (ICjø-CS) i sammenligning med, hvad der fås ved tilstedeværelse af testcyclosporin (IC50+CS), tages som et mål for forøget sensitivitet af CCL-R-linien over for CTDS, hvilken sensitivitet er blevet induceret af cyclosporinet. Den anvendte CCL-R-linies stabilitet sikres 35 ved at krydschecke dens sensitivitet over for CTDS med det tidligere fastsatte.

57 DK 173873 B1 I den ovennævnte testmodel er cyclosporiner af klasser 1-3, især nævnte specifikke cyclosporiner, effektive til at forøge sensitivitet over for CTDS (fx DR, VC, AM etc.) ved de ovenstående indikerede koncentrationer, især ved koncentrationer på ca. 10 ^g/ml eller 5 derunder.

Ved højere koncentrationer, fx ca. 50 pg/ml, er inhibering af proliferation af både CCL-S- og CCL-R-linier i særlige tilfælde tilvejebragt af testcyclosporiner under fravær af CTDS, selvom dette fænomen, når det forekommer, generelt er mindre markant hos CCL-R-10 end hos CCL-S-liner. Mere bemærkelsesværdigt har det vist sig, at testcyclosporiner er effektive til at forøge sensitivitet over for CTDS i CCL-R-linier ved koncentrationer, der ikke har nogen indflydelse på celleproliferation under fravær af CTDS.

I én forsøgsserie, hvor der anvendtes en AM-resistent human lille 15 lungecancercellelinie og cyclosporiner 2.4, 1.1 og 1.32, var de fastsatte AM-sensitiviseringsforhold (AM IC50 -CS/AM ICjq + CS) således som følger*: 1-1 I SENSITIVISERINGSFORHOLD | 20 1-1 I CYCLOSPORINKONCENTRATION |

i-1 I

I CYCLOSPORIN | 50,0 /ig/ral 5,0 pg/ml j 25 I 2.4 I >30 >30 | I-1-1

j 1.1 I --- >20 I

,-1-1

I 1.35 I 12 3,3 I

30 1-1-1

I INTET I 1,0 1,0 I

I—.-1-1 58 DK 173873 B1 [★Undersøgelse og data fra P.R. Twentyman, MRC Clinical Oncology and Radiotherapeutic Unit, Hills road, Cambridge, England * jf Br. J.

Cancer, 57, 254-258 (1988)] EKSEMPEL 2 5 Anvendelse til at genvinde følsomhed over for anti-neoplastiske/-cytotoksiske, anti-tumor-lægemiddelstoffer (in vitro -2).

Testen kan udføres ved at anvende en hvilken som helst lægemiddelresistent cellelinie og kontrol- (parental) celleline, der er genereret, fx som beskrevet af Ling et al., J. Cell. Physiol. 83, 103-10 116 (1974) og Bech-Hansen et al. J. Cell. Physiol. 88, 23-32 (1976).

Særligt valgte kloner er den multi-lægemiddelresistente (fx colchi-cinresistente) linie CHR (subklon C5S3.2) og den parentale, sensitive linie AUX Bl (subklon ABI Sil) - jf Ling et al. loc. cit. og Juliano et al. Biochim. Biophys. Acta, 455, 152-162 (1976); Carlsen et al.

15 Biochim. Biophys. Acta. 455, 900-912 (1976); Lalande et al., Proc.

Natl. Acad. Sci., 78 (1), 363-367 (1981); Kartner et al., Science 221, 1285-1288 (1983); Kartner et al., Nature, 316, 820-823 (1985);

Riordan et al., Nature, 316, 817-819 (1985); Van der Blick et al.,

Mol. Cell. Biol. 6, 1671-1678 (1968); Endicolt et al., Mol. Cell 20 Biol., 7, 4075-4081 (1987); Deuchars et al., Mol. Cell. Biol., 7, 718-724 (1987); og Gerlach et al., Nature, 326, 485-489 (1986).

Cellelinier dyrkes i et oMEM-medium, der suppleres med (L)-asparagin 0,02 mg/ral, MEM-vitaminer (IX), penicillin-streptomycin 100 UT/ml, (L)-glutamin 2 mM og 10X varmeinaktiveret føtal kalveserum. Assay 25 udføres med plader med 96 brønde. 50 pi colchicinopløsning tilsættes i kulturmediet in triplo til opnåelse af slutkoncentrationer på 30-10-3-1-0,3-0,1-0 pg/ml for den resistente linie (R^) og på 0,3-0,1-0,03-0,01-0,003-0,001-0 pg/ml for den sensitive linie (SL). Yderligere udvidelse af dosisområde nedadtil udføres om nødvendigt, dvs.

30 når testcyclosporin meget udpræget nedsætter IC5ø-responset over for colchicin.

59 DK 173873 B1

Testcyclosporiner opløses ved 1 mg/ml i abs. C2H5OH. Hver testcyclo-sporin screenes rutinemæssigt ved 0,1 og 1,0 /ig/ml, idet kontroller behandles med tilsvarende C2H50H-opløsningsmiddelfortyndinger. Test-cyclosporin eller kontrol tilsattes (50 μΐ) hver brønd og blandes med 5 allerede tilstedeværende colchicinopløsninger. 100 μΐ cellulære suspensioner med 4 x 10^ celler/ml for SL (400 celler/brønd) og 8 x 10^ celler/ml for R]_ tilsættes.

Proliferation måles ved colorimetrisk assay [Nosman, J. Immunol.

Methods, 65, 55-63 (1983)] under anvendelse af 3-(4,5-dimethylthia-10 zol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT). Først fjernes 100 μΐ cellefrit supernatant, og derefter tilsættes 10 μΐ MTT- opløsning ved 5 mg/ml i RPMI 1640-medium (Gibco) til hver plade, og pladen inkuberes i 3 timer ved 37°C. 100 μΐ butanol/isopropanol/ΙΝ HC1 (192:96:12 ml) tilsættes derefter til hver plade, og pladerne rystes 15 godt indtil fuldstændig opløsning. Optisk densitet (OD) aflæses ved 540 nm.

Omfanget af cellevækst (målt ved MTT-afhængig OD) anskueliggøres som en funktion af colchicinkoncentration, en dosisresponskurve udarbejdes for hver enkelt testcyclosporin, og colchicin IC50 (CIC50) (dvs.

20 den koncentration af colchicin, der er nødvendig for at reducere proliferation med 50%) bestemmes.

Forøgelsen af colchicinsensitivitet, der er induceret af hver enkelt testcyclosporin ved både 0,1 og 1,0 μg/ral bestemmes som: CIC50 under fravær af testcyclosporin - CICjq- - sensitivitets- 25 - - CIC50 ved tilstedeværelse af testcyclosporin CIC5Q+ forøgelse

Testcyclosporiner kan indvirke på colchicinsensitivitet både for RL og SL. Den relative indflydelse på de to linier bestemmes som: CIC50+ for RL-linier - CIC50 + RL - relativ 30 - - CIC50+ for SL-linier CIC50 + SL modstand 60 DK 173873 B1

Cyclosporiner af klasser 1-3 forøger sensitivitet af RL over for colchicin ved de ovenfor indikerede koncentrationer. Sensitivitets -forøgelse af SL ses almindeligvis ved ækvivalente koncentrationer, selvom den generelt er mindre end for RL. Cyclosporiner udvisende 5 højere relativ modstand som defineret ovenfor anses generelt for mere egnede til anvendelse ifølge den foreliggende opfindelse. I én serie af eksperimenter noteredes fx de følgende sensitivitetsforøgelser hos RL og SL over for colchicin, hvilken sensitivitetsforøgelse er defineret overfor.

10 I i- 1 I CYCLOSPORIN | SL RL j I I-1 I I 0,i/ig/ml 1,0^g/ml O.ljxg/ml l.O^g/ml | 15 1-μ--,-1-,-1 I 1.1 I 4,0 I 8,0 I 1,4 I 30,8 |

I I I I I I

I 1.2 I 4,4 I 8,1 1 2,0 I 59,8 | I I I I I i 20 I 1.3 I 5,3 I 10,7 | 1,8 | 97,9 |

I I I I I I

I 1.4 I 6,7 I 11,7 I 1,7 | 97,6 |

I I i I I I

I 1-10 I 3.6 I 11,6 I 1,1 I 28,9 |

25 I I I I I I

I 1.11 I 6.3 I 17,6 I 1,1 | 36,7 |

I I I I I I

I 1.15 I 4,7 I 12,9 I 1,5 | 38,3 |

I I I I I I

30 I 1.37 I 5,8 I 12,1 | 1,4 | 82,4 | I I I I I ] I 2.2 I 7,9 I 15,1 I 1,5 | 97,3 |

! I I I I I

I 2.4 [ 4,7 I 15,7 I 1,2 | 34,5 |

35 I-L-J-i-L-_J

61 DK 173873 B1 EKSEMPEL 3

Anvendelse til at genvinde følsomhed over for and-neoplastiske/cyto-toksiske, and-tumor-lægemiddelstoffer (in vivo)

Ehrlich ascicer carcinoma (EA) sub-linier, der er resistente over for 5 lægemiddelstoffer DR, VC, AM, ET, TE eller CC, udvikles ved sekventiel overførsel af EA-celler til efterfølgende generationer af BALB/c værtsmus i overensstemmelse med fremgangsmåderne beskrevet af Slater et al., J. Clin. Invest, 70, 1131 (1982). Til dette formål administreres lægemiddelstof i en dosis på 0,2-0,5 mg/kg. i.P·. dagligt i 10 5 doser, startende 24 timer efter inokulation af værtsmus med 0,2 ral ufortyndede maligne ascicer, der er udtaget fra præ-terminale dyr.

1 testen modtager behørige værtsmus resistente EA-R- eller sensitive (parent) EA-S-, EA-linier som beskrevet ovenfor. Mus, der modtager EA-R, er inddele i grupper, der modtager: 15 1. Intet lægemiddel/intet cyclosporin 2. Lægemiddelstofterapi/intet cyclosporin 3. Intet lægemiddel/testcyclosporin 4. Lægemiddelstof + testcyclosporin.

Anti-neoplastisk lægemiddelstof administreres i doser, der anvendes 20 til at frembringe EA-R-linier. Cyclosporinteststof administreres i en samlet testdosis i området fra 1 til 80 mg/kg, især 5 eller 25 eller op til 40 mg/kg i 5 delte daglige doser, i.p. (i ethanol/olivenolie) startende 24 timer efter inokulation med EA-R. Gennemsnitsoverlevelsestiden i grupper 2, 3 og 4 sammenlignes med gruppe 1 som mål for 25 virkning af anvendt terapi.

De fundne resultater viser ingen signifikant forskel i gennemsnitsoverlevelsestid mellem grupper 1, 2 og 3. 1 gruppe 4, der modtager cyclosporin af klasser 1-3 i doser som vist ovenfor, observeres 62 DK 173873 B1 væsentlig forøgelse af overlevelsestid, (fx i størrelsesorden 2-3 gange eller større) i sammenligning med begge grupper 1 og 2.

Ækvivalente resultater kan opnås ved at anvende cyclosporiner af klasser 1-3 i testmodeller af lignende tilsnit, fx in vitro, eller 5 ved at anvende forsøgsdyr, der er inficeret med lægemiddel-resistente virale stammer, anti-biotisk (fx penicillin) resistente bakteriestammer, anti-mycotisk resistente fungale stammer samt lægemiddelresistente protozoale stammer, fx Plasmodialstammer, fx naturligt forekommende substammer af Plasmodium falciparum udvisende erhvervet 10 kemoterapeutisk, anti-malarial lægemiddelresistens.

Anvendelse af cyclosporiner af klasser 1-3 i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse kan også demonstreres i kliniske forsøg, fx præliminære forsøg, der udføres som følger: KLINISK FORSØG 1 15 Patientemner (& og J ) er valgt blandt patienter diagnosticeret som havende malign cancervækst og som skal underkastes anti-neoplastisk/-cytostatisk lægemiddelterapi. En detaljeret rapport fremlægges for hvert patientemne, der indgår i forsøget, hvilken rapport detaljerer sygdomshistorie, sygdomsstatus, estimeret hastighed af sygdomsfrem-20 skriden og estimeret prognose.

Type af anti-neoplastisk/cytostatisk lægemiddelterapi, der skal anvendes, og estimeret dosishastighed, der er nødvendig under fraværet af cyclosporinterapi, bestemmes af den behandlende læge under hensyn til typen og omfanget af cancer.

25 Forsøgscyclosporin administreres oralt i en dosishastighed på fra 1,0 til 20,0 mg/kg/dag eller parenteralt, fx i.v. eller i.m., i en dosishastighed på fra 0,5 til 5,0 mg/kg/dag. Hvor sygdomsstatus tillader det, begynder behandling med forsøgscyclosporin mindst 1 eller 2 dage, fortrinsvis 10-14 dage, før der påbegyndes anti-neoplastisk 30 terapi for at tillade opbygning til fortsatte terapeutiske dosisniveauer. I sådanne tilfælde er begyndelsescyclosporindoser i den lavere ende af de ovenfor indikerede dosisområder (fx: p.o. af stør- 63 DK 173873 B1 relsesorden på fra 1,0 til 5,0 mg,kg/dag; eller parenteralt i størrelsesorden på fra 0,5 til 1,5 mg/kg/dag) stigende til højere dosisniveau (fx p.o. i størrelsesorden på fra 5,0 til 15,0 eller op til 20,0 mg/kg/dag eller parenteralt i størrelsesorden på fra 2,0 til 5 5,0 mg/kg/dag), idet den faktiske kur fastsættes af den behandlende lage under hensyn til patientemnets tilstand ved forsøgsstart, I visse tilfælde kan det være nødvendigt, at cyclosporin- og anti-neoplastisk/cytostatisk terapi påbegyndes og afsluttes samtidige, selvom der også her foretrækkes lavere begyndelsesdosering af cyclo-10 sporin, hvilken dosering dagligt stiger til det indikerede maksimum.

Begyndelses-anti-neoplastisk/cytostatisk terapi startes ved ca. 1/3 af den estimerede dosishastighed, der er nødvendig under fravær af cyclosporinterapi, idet det nøjagtige valg af startdosis atter fastsættes af den behandlende læge. Anti-neoplastisk/cytostatisk dosis 15 forøges, som det nødvendiggøres af observeret respons.

Alle relevante kliniske parametre overvåges gennem forsøgsforløbet, hvilket omfatter cyclosporin- og anti-neoplastiske/cytostatiske læge-raiddeladministrationshastigheder. Patientemner overvåges for kon-trol/reduktion i tumorvækst forekomst af metastaser og mulig tumorre-20 gression. Rapporter over sygdomsstatus og estimerec prognose fremlægges med mellemrum under forsøgsforløbet.

Evaluering af forsøgsresultater indikerer, at indgåede patientemner udviser effektiv kontrol af eller forbedring af tilstand med restriktion af tumorvækst eller turoorregression og reduktion af metastaser 25 ved anti-neoplastiske/cytostatiske lægemiddeldosishastigheder under de, der er estimeret at være nødvendige for ækvivalent virkning under fravær af cyclosporinterapi. Der noteres reduceret incidens af anti-neoplastisk/cytostatisk lægemiddelresistens i sammenligning med rapporter for grupper, der kun modtager anti-neoplastisk/cytostatisk 30 terapi, samt reduceret incidens af omvendt toksisk reaktion på administreret anti-neoplastisk/cytostatisk terapi.

64 DK 173873 B1

KLINISK FORSØG II

Patientemner valgtes blandt hospitaliserede eller ambulante patientsubjekter (</* og ^ ) udvisende sen fase, malign cancervækst af en hvilken som helst type. Patientemner udvalgt til forseg er patienter, 5 der har gennemløbet en hel anti-neoplastisk/cytostatisk lægemiddelterapibehandling, og som generelt er i sen fase af multipel lægemiddelbehandling og udvisende fornyet anfald af tumorvækst/metastaser osv., dvs. hvis cancer er prima facie identificerbar som multipel lægeoiddelresistent.

10 En detaljeret rapport fremlægges for hvert enkelt patientemne, der indgår i forsøget, givende detaljer især om lægemiddelterapi, der er anvendt i løbet af de foregående 6-18 måneder, foregående historie og nuværende sygdomsstatus, fx estimeret hastighed af sygdomsfremskriden og estimeret prognose.

15 Til forsøgsformålet bibeholdes de indgående patientemner på forudbestemt dosis og skema for anti-neoplastisk/cytostatisk lægemiddelterapi, idet den valgte terapi er den, der anvendes ved identifikation af lægemiddelresistens og indgåelse i forsøget. Anti-neoplastisk lægemiddelterapi bibeholdes igennem hele forsøget på samme niveauer og 20 skema, som før resistensbestemmelsen. Kemoterapikuren suppleres med administration af forsøgscyclosporin i oral dos isform i en daglig dosishastighed på fra ca. 1 til ca. 20, fx ca. 5 til ca. 15, mg/kg/dag eller administreres parenteralt, fx i.v., i en daglig dosishastighed på fra ca. 0,5 til ca. 7,5, fx fra ca. 2,0 til ca. 5,0, 25 mg/kg/dag. Hos visse patienter kan cyclosporinterapi starte 1 til op til 14 dage før anti-neoplastisk terapi påbegyndes og fortsættes i løbet af hele behandlingsperioden. I andre tilfælde kan det være nødvendigt, at cyclosporin- og anti-neoplastisk terapi startes og afsluttes samtidigt.

30 Patientemner overvåges for reduktion af tumorvækst/forekomst af metastaser og mulig tumorregression. Rapporter over sygdomsstatus og estimeret prognose på undersøgelsestidspunktet fremlægges jævnligt under forsøgsforløbet. I det tilfælde, at der ikke rapporteres forbedring i tilstand eller begrænsning af nedbrydning inden for en 65 DK 173873 B1 passende periode, varieres grundlæggende anti-neoplastisk/cytostatisk lægemiddelterapi under foranledning af den ansvarlige læge til alternativ, tidligere anvendt terapi. Alle relevante kliniske parametre overvåges under forsøgsforløbet, omfattende især anti-neoplastiske/-5 cytostatiske lægemiddel- og cyclosporinserumniveauer samt clearan-cehastigheder.

Evaluering af forsøgsrapporter indikerer, at de indgående, patientemner udviser markant forbedring i tilstand med begrænsning af tumor-vækst eller tumorregression og formindskelse af metastaser efter 10 introduktion af cyclosporinterapi med vedvarende forbedring i sygdomsprognosen.

Cyclosporiner af klasser 1-3 er i overensstenanelse hermed indikeret til anvendelse i behandlingen af morbide tilstande udvisende erhvervet resistens over for kemoterapeutisk lægemiddelbehandling eller som 15 adjuvans til kemoterapeutisk lægemiddelbehandling.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer i overensstemmelse hermed: 1.1 En fremgangsmåde til forbedring eller forøgelse af virkningen af, eller af forøgelse af sensitivitet over for, kemoterapeutisk lægemiddelterapi; eller 20 1.2 En fremgangsmåde til at reducere effektiv kemoterapeutisk læge middeldos ishas tighed; i et patientemne med behov derfor, hvilken fremgangsmåde omfatter co-administration af en cyclosporin af klasser 1-3 som ovenfor defineret: eller 25 2.1 En fremgangsmåde til at behandle morbide tilstande udvisende eller karakteriseret ved modstand, hvadenten erhvervet, induceret eller iboende, over for kemoterapeutisk behandling; eller 2.2 En fremgangsmåde til at forøge eller forbedre kemoterapeutisk behandling af morbide tilstande udvisende eller karakteriseret 66 DK 173873 B1 ved modstand, hvadenten erhvervet, induceret eller iboende, over for nævnte behandling; eller 2.3 En fremgangsmåde til at ophæve eller reducere modstand, hvadenten erhvervet, induceret eller iboende, over for kemoterapeutisk 5 behandling; eller 2.4 En fremgangsmåde til at genetablere sensitivitet over for kemoterapeutisk behandling; hos et patientemne med behov derfor, hvilken fremgangsmåde omfatter administration til nævnte patientemne af en effektiv mængde af en 10 cyclosporin af en hvilken som helst af klasserne 1-3 som defineret ovenfor.

Alternativt tilvejebringer den foreliggende opfindelse: 3. En fremgangsmåde til kemoterapeutisk behandling af et patientemne med behov derfor, hvilken fremgangsmåde omfatter administra-15 tion af et passende kemoterapeutisk aktivt lægemiddelstof sammen med en cyclosporin af en hvilken som helst af klasserne 1-3 som defineret ovenfor som hjælpebehandling til nævnte lægemiddelstof.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også: 20 4, En cyclosporin af en hvilken som helst af klasserne 1-3 som defineret ovenfor til anvendelse i en fremgangsmåde som defi neret under et hvilket som helst af pkt. 1.1, 1.2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 eller 3 ovenfor; eller 5. En cyclosporin af en hvilken som helst af klasserne 1-3 som 25 defineret ovenfor til anvendelse i fremstillingen af et farma ceutisk præparat til anvendelse i en fremgangsmåde som defineret under et hvilket som helst af pkt. 1.1, L.2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 eller 3 ovenfor.

67 DK 173873 B1

Idet ingen af cyclosporinerne af klasser 1-3 tidligere er blevet foreslået eller anbefalet til farmaceutisk eller terapeutisk anvendelse, og idet særligt cyclosporiner af klasser 1-3 faktisk er hidtil ukendte forbindelser eller cyclosporiner af fuldstændig hidtil ukendt 5 type, tilvejebringer den foreliggende opfindelse også: 6. Cyclosporiner af klasser 1-3 som specificeret ovenfor, fx omfattende individuelle cyclosporiner, der ovenfor er indikeret at være hidtil ukendte, samt cyclosporiner af grupper la2, la^, la\ la^, ld, le og af klasse 2(i) og 2(iii) til anvendelse som 10 farmaka.

Særlige tilstande/former for kemoterapeutisk behandling, hvortil fremgangsmåderne ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes, omfatter tilstande, der er forårsaget af mikrobiel, fx viral, bakteriel, fungal eller protozoal infektion, der involverer stammer, der 15 er resistente over for én eller flere anti-mikrobielle eller anti-bi-otiske lægemiddelstoffer, fx anti-virale, anti-bakterielle, anti-fungale eller anti-protozoale lægemiddelstoffer.

Fremgangsmåderne ifølge den foreliggende opfindelse er især anvendelige i behandlingen af cancere, fx af carcinoma, sarcoma eller andre 20 tumorer eller maligne vækster, der udviser induceret eller erhvervet modstand over for én eller flere anti-cancer-kemoterapeutiske lægemiddelstoffer, fx anti-neoplastiske eller cytostatiske midler, fx anthracycliner eller vinca alkaloidlægemiddelstoffer eller de specifikke lægemiddelstoffer daunorubicin, vineristin, adriamycin, etopo-25 sid, tenoposid og/eller Colchicin, fx som en måde til at reducere eller ophæve tumorvækst, forekomst af metastaser osv.

Foretrukne cyclosporiner til anvendelse i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse er sådanne, der udviser relativt lav immu-nosuppressiv aktivitet, fx uden væsentlig immunosuppressiv aktivitet 30 ved beregnede dosisniveauer eller som udviser immunosuppressiv aktivitet i en størrelsesorden, der er væsentligt mindre, fx <50%, end Ciclosporins. Særlige cyclosporiner, der er egnede til anvendelse i overensstemmelse med fremgangsmåderne ifølge den foreliggende op- 68 DK 173873 B1 findelse, er cyclosporiner, der ovenfor er specielt defineret eller nævnt under klasser 1-3.

Cyclosporindoser, der skal anvendes ved udøvelse af de ovenstående fremgangsmåder, vil naturligvis variere, fx afhængig af den tilstand, 5 der skal behandles, (fx sygdomstypen og modstandens natur), den særlige cyclosporin, der skal anvendes, den ønskede virkning og administrationsmåden.

Sædvanligvis opnås tilfredsstillende resultater ved oral administration i doser i størrelsesorden fra 1 til 20 eller op til 10 50 mg/kg/dag, fx i størrelsesorden på fra 5 til 10 eller op til 15 mg/kg/dag administrere én gang eller i delte doser 2-4 gange pr. dag, eller ved parenteral administration, fx intravenøst, fx ved i.v. drop eller infusion i doser i størrelsesorden på fra 0,5 til 7,5 op til 10 mg/kg/dag, fx i størrelsesorden på fra 1,5 eller 2,0 op til 15 5,0 mg/kg/dag.

Hensigtsmæssige daglige doser for patienter er således i størrelsesorden på fra 50 til 1000 op til 2500 mg p.o,, fx i størrelsesorden på fra 250 til 500/600 mg p.o. eller i størrelsesorden på fra 25,0 til 375,0 op til 500 mg i.v., fx i størrelsesorden på fra 75,0 til 20 100/250 mg i.v.

Alternativ og endda foretrukken dosering kan foranstaltes på patientspecifik måde for at tilvejebringe forudbestemte minimunsblodniveau-er, fx som bestemt ved hjælp af RlA-teknik. Således kan patientdosering indstilles for at opnå konstante vedvarende minimumsblodni-25 veauer som målt ved hjælp af RIA i størrelsesorden på fra 50 eller 150 op til 500 eller 1000 mg/ml, dvs. analogt til fremgangsmåder, der for tiden anvendes til regelmæssig Ciclosporinimmunosuppressiv terapi.

Farmaceutiske sammensætninger, der er egnede til oral administration 30 af cyclosporiner af klasser 1-3 ovenfor under udførelse af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan fx fremstilles som følger: 69 DK 173873 B1 BESTANDDEL RELATIV MÆNGDE (g) i) Labrafil H 1944 CS 150 ii) Cyclosporin (fx 5 Cyclosporin 1.1,1.2,1.3, 1.11 eller 1.36) 25 (tarvægtsværdi) ill) Ethanol (absolut) 50 iv) Olivenolie ca. 237 op til 10 totalt ca. 462,0

Alle bestanddels indvej es direkte i en omrøringsbeholder. Bestanddele (i) og (iii) indvej es først. Bestanddel (ii) tilsættes derefter under konstant omrøring, indtil det er opløst. Bestanddel (iv) tilsættes 15 derefter under omrøring 1 yderligere 10 minutter. Den vundne opløsning filtreres gennem et Gelman Preflow Filter (400 /*m) ved ca. 0,5-0,8 bar (0,5 x 10-> - 0,8 x 10^ Pa) og fyldes i 50 ml Rexo-flasker.

Flaskerne forsegles med en gummiprop og hætte. Hele proceduren udføres under vandfrie betingelser ved stuetemperatur med nitrogen-20 beluftning (0,25 bar (0,25 x 10^ Pa)) i alle trin. Den påfyldte opløsning, der er egnet til oral administration, omfatter 50 mg cyclosporin (tør vægt)/ml. Opløsningen kan alternativt fyldes i gelatine, fx hård- eller blødgelatinekapsler, som en måde til at maskere smag.

25 Cyclosporiner af klasser 4 og 6 og især ovenfor specifikt nævnte individuelle cyclosporiner af disse klasser udviser også farmaceutisk aktivitet. Især udviser de immunosuppressiv, anti-inflammatorisk og anti-parasitisk aktivitet som indikeret i in vicro og in vivo tests, fx som beskrevet nedenfor. De nævnte cyclosporiner besidder også 30 aktivitet med hensyn til eksperimentel allergisk encephalomyelitis (EAE) hos rotte, hvilket beskrives nedenfor.

70 DK 173873 B1 EKSEMPEL 4

Immunosuppressiv aktivitet: 4.1 Lokal hæmolyse in vitro i gel [R.I. Mishell og R.W. Dutton, J.

Exp. Medicine, 126, 423-442 (1976)]. Cyclosporiner af klasser 4 5 og 6 inhiberer haanolysezoner i sammenligning med ubehandlede kontroller ved koncentrationer på fra 0,03 til 10.0 μ§/ιη1.

4.2 Lymfocytstimuleringstest ifølge Janossy og Greaves [Clin. Exp.

Immunol., 9, 483 (1971) og 10, 525 (1972)]: - cyclosporiner af klasser 4 og 6 inhiberer concanavalin A-stimuleret DNA-syntese 10 (inhibering af H^-thymidininkorporering), celleproliferation og blastogenese i muse-miltlymfocytter i sammenligning med ubehandlede kontroller ved koncentrationer på fra 0,OOL-3,0 Mg/ml.

4.3 Blandet lymfocytreaktion ("mixed lymphocyte reaction") [Bach et al., J. Exp. Med. 136, 1430 (1972)]: - reaktionen (dvs. pro- , 15 liferation og differentiering) af lymfocytter (muse- (Balb/c) railtceller] i co-inkubering i 5 dage med allogene miltceller fra bestrålede mus (CBA) måles i nærvær og under fravær af teststof. Reaktion under fravær af teststof tjener som kontrol og regnes for at være 100X. Reaktion i nærværelse af teststof 20 udtrykkes som den procentvise ændring i sammenligning med 100% kontrolreaktion. Inhibering af reaktionen observeres ved anvendelse af cyclosporiner af klasser 4 og 6 ved en koncentration på fra 0,001 til 3,0 Mg/ral.

EKSEMPEL 5 v 25 Anti·inflammatorisk aktivitec

Anti-inflammatorisk aktivitet kan vises i adjuvansarthritistesten hos rotte. Til denne test induceres adjuvansarthrltis ifølge metoden i

Pearson og Wood, "Arthr. Rheum." 2, 440 (1959). Cyclosporiner af

M

71 DK 173873 B1 klasser 4 og 6 er aktive i denne test over for udviklende og fastslået arthritis i doser på fra 5 til 30 mg/kg/dag p.o.

EKSEMPEL 6

Anti-parasicisk (anei-malarial) aktivitet 5 Anti-malariatest ifølge L. Rane, "Chemoterapi and Drug Resistance in Malaria" ed. W. Peters, Academisk Press, New York, 1970. Mus (0F1: hanner) inficeres på dag 0 med 0,2 ml af en suspension indeholdende 10? parasitiske celler af arten Plasmodium berghei (stamme NK 65) administreret i.p. Teststof administreres s. c. på dag 3 i varierende 10 doser med 5-10 mus/dosis. Overlevelsestiden noteres, og den mindste effektive dosis (MED) beregnes ved sammenligning af overlevelsestiden med den tilsvarende for ubehandlede kontroller. For kontroller er overlevelsestiden - ca. 7 dage. MED er den dosis, ved hvilken overlevelsestiden fordobles. Cyclosporiner af klasser 4 og 6 er 15 effektive i denne test i doser på fra 10 til 100 mg/kg/dag.

EKSEMPEL 7

Virkning på EAE hos rotte 1. Virkning på fastslået EAE

EAE induceres i grupper af 8-12 i øvrigt sunde hanrotter med en vægt 20 på 150-200 g i overensstemmelse med teknikken beskrevet af Borel et al. Agents and Actions 6, 468, (1976). Rotterne holdes under laboratoriebetingelser og tillades ad libitum adgang til føde og vand.

Angreb af EAE observeres efter 10-13 dage og ses som paralysesymptomer, fx i baglemmerne. Testforbindelsen administreres til forsøgs -25 dyrene i en dosis på fra 25 til 50 mg/kg p.o. hver dag i 5 efter hinanden følgende dage efter EAE-angrebet. Rotterne undersøges dagligt for sygdomssymptomer, og antallet af rotter, der er kommet sig, samt dagen herfor noteres. Observation fortsættes yderligere i 5-8 uger efter behandlingsstart for at detektere ethvert tilfælde af 72 DK 173873 B1 tilbagefald. Antallet af rotter med tilbagefald og tilbagefaldsdagen noteres.

Ved administration af cyclosporiner af klasser 4 og 6 i dosisområdet indikeret ovenfor observeres en nedsat helbredelsestid i satnmenlig-5 ning med kontrolgrupper, der kun fik placebo (olivenolie).

7.2 Virkning til at forebygge forekomsten af EAE

Testen udføres analogt med, hvad der blev beskrevet under ovenstående 4.1. Imidlertid blev testforbindelsen i dette tilfælde administreret i en dosis på fra 25 til 50 mg/kg p.o. hver dag i 14 dage startende 10 på sensitiviseringsdagen (induktion af EAE). Rotterne observeres dagligt for paralysesymptomer, og dagen for EAE-angreb i berørte individer noteres. Observation fortsættes i et antal måneder for at detektere muligt forsinket angreb af EAE.

Ved administration af Cyclosporiner af klasser 4 og 6 i dosisområdet 15 indikeret ovenfor observeres forebyggelse af angreb af EAE i observationsperioden i sammenligning med kontroller, der kun blev behandlet med placebo (olivenolie).

I lyset af deres immunosuppressive aktivitet er cyclosporiner af klasser 4 og 6 indikeret til anvendelse i profylakse og behandling af 20 sygdomme og tilstande, der nødvendiggør reduktion af immunresponset.

Således kan de anvendes til at undertrykke proliferationen af lymfocytter og imraunocyter, fx i behandlingen af auto-immune sygdomme eller til forebyggelse af udstødelse af organtransplantater, fx hjerte-, hjertelunge-, hud-, comeal-, benmarvs-, pancreas- og 25 nyretransplantater.

I lyset af deres anti-inflammatoriske aktivitet og aktivitet med hensyn til EAE er cyclosporiner af klasser 4 og 6 også indikeret til anvendelse af behandlingen af inflammatoriske tilstande, især inflammatoriske tilstande med en aetiologi omfattende en autoimmun 30 komponent, fx i behandling af arthritis (fx rheumatoid arthritis, arthritis chronica progrediente og arthritis deformans) og rheumati-ske sygdomme samt autoimmune hematologiske forstyrrelser (omfattende 73 DK 173873 B1 fx hemolytisk anæmi, aplastisk anæmi, ren rød blodlegemeanæmi og idiopatisk thrombocytopæni), systemisk lupus erythematosus, polychondritis, sclerodoma, Wegener granulamatose, dermatomyositis, kronisk aktiv hepatitis, myasthenia gravis psoriasis, Steven-Johnson 5 syndrom, idiopatisk psilosis, autoimmune inflammatoriske tarmsygdomme (omfattende fx ulcerativ colitis og Crohn's sygdom) endocrin opthal-mopati, Grave's sygdom, sarcoidosis, primær billiær cirrhose, primær juvenil diabetes (diabetes mellitus type I), uveitis (anterior og posterior), interstitiel lungefibrose, psoriatisk arthritis, 10 glomerulonephritis (med og uden nephrotisk syndrom, fx omfattende idiopatisk nephrotisk syndrom eller minimal change nephropati) og multipel sclerose.

I lyset af deres anti-parasitiske aktivitet er cyclosporiner af klasser 4 og 6 også indikeret til anvendelse i behandlingen af para-15 sitisk infektion. Fx coccidiomycose og schistosomiasis og især protozoal infektion, især malaria.

Til den ovenfor nævnte anvendelse vil dosis selvfølgelig variere afhængig af valgte cyclosporin, administrationsmåden, den særlige tilstand, der skal behandles, og den ønskede terapi. Sædvanligvis er 20 tilfredsstillende resultater imidlertid opnået ved administration i en oral daglig dosis på fra 1 til 100, fortrinsvis fra 5 til 50, især 10 til 20, mg/kg dyrekropsvægt. Den samlede daglige dosis er passende i området på fra ca. 75 til ca. 2000, fortrinsvis fra ca. 200 til ca.

1000, især fra ca. 300 til ca. 700 mg. Dosisformer, der er egnede 25 til oral administration, omfatter i overensstemmelse hermed hensigtsmæssigt fra ca. 20 til ca. 2000, fortrinsvis fra ca. 50 til ca. 1000, især ca, 75 til 700, mg cyclosporin blandet sammen med et fast eller flydende farmaceutisk fortyndingsmiddel eller bærestof, hensigtsmæssigt administreret ad én gang eller i delte doser 2-4 x/dag.

30 Som indikeret ovenfor vil hensigtsmæssige daglige doser afhænge inter al af den særlige cyclosporin, der er valgt, fx under hensyn til dens relative virkningskraft. For foretrukne cyclosporiner af klasser 4 og 6 er opnåede resultater [IC5ø-værdier (^g/ml)] i én serie af eksperimenter i overensstemmelse med ovenstående eksempler 4 som følger: 74 DK 173873 B1

I-1-H

) CYCLOSPORIN | Hetode ifølge eksempel |

] | | I

! | 4,1 I 4,2 I 4,3 I

5 1-b—-1-1-H

I 4.8 I 0,1 I 0,16 1 0,09 | I 6.4 I 0,03 I <0,008 I <0,008 | I-i-1-1-i 10 I 6.15 I 0,057 I <0,008 | <0,008 |

I_I_I_I___J

Den foretrukne cyclosporin til anvendelse ved anti-parasitiske indikationer er cyclosporin 4.7. En ED50-værdi, der er opnået for denne cyclosporin ved fremgangsmåden ifølge eksempel 6, er ca. 15,0 mg/kg.

15 I overensstemmelse med det foregående tilvejebringer den foreliggende opfindelse også: 7. En farmaceutisk sammensætning omfattende en cyclosporin af klasse 4 eller 6 som defineret ovenfor sammen med et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel eller bærestof derfor; 20 8. En fremgangsmåde til at inducere immunosuppression til behand ling af inflammatoriske sygdomme eller tilstande eller til behandling af parasitisk infektion i et patientemne med behov for sådan behandling, hvilken fremgangsmåde omfatter administration til nævnte patientemne af en effektiv mængde af en cyclosporin 25 af klasse 4 eller 6 som defineret ovenfor; samt 9. En cyclosporin af klasse 4 eller 6 til anvendelse som et farma-kon, fx til anvendelse som et immunosuppressivt middel, som et anti-inflammatorisk middel eller som et anti-parasitisk middel,

Især immunosuppressive, anti-inflammatoriske og anti-parasitiske 30 anvendelser, hvortil cyclosporineme af klasser 4 og 6 er indikeret, omfatter enhver af de ovenfor beskrevne, fx omfattende en hvilken som 75 DK 173873 B1 helst af de særlige former af organtransplant, inflammatorisk sygdom, autoimmun sygdom eller parasitisk infektion, der er anført ovenfor.

Claims (14)

1. 2. Cyclosporin ifølge krav 1, kendetegnet ved, at gruppen i 1-stillingen er en gruppe med formlen XXI R. Rb-0 (R) CH. 10 ^-CHj (XXI) -N—. ca— co-(S) ch3 hvor Ra er -x'-y'-Rc, hvor -x'-y'- er cis -CH-CH- eller -CH2-CH2-, og Rc er C2-9-alkoxyme-15 thyl, eller -x'-y'- er cis eller trans -CH-CH- eller -CH2-CH2-, og Rc er hydrocarbyl oed mindst to carbonatomer, således at en hvilken som helst alifatisk gruppe eller del, som er eller omfatter Rc, er mættet, når -x'-y'- er -CH2-CH2-, og Rb er hydrogen eller acyl.
2. 3. Cyclosporin ifølge krav 1, kende tegne t ved, at gruppen i 1-stillingen er -3'-desoxy-3 ’ -oxo-MeBmt-, -3' -desoxy-3' - (Ci^-alkoxyimino) -MeBmt-, -3'-0-(C]^4* DK 173873 B1 azidoalkyl)-carbonyl- -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt- eller -3'-0-(Cj^-alkoxy)carbonyl- -MeBmc- eller -dihydro-MeBmt-, eller hvor gruppen i 2-stillingen er -a-methylketo-Gly- eller -Ile-,
3. 4. Cyclosporin ifølge krav 1 valgt blandt gruppen bestående af: 5 1.2 [3'-O-acetyl-MeBmt]^-[Val]2-Ciclosporin; 1.3 [3' -0-acetyl-MeBmt][Thr]2-Ciclosporin; 1.5 [3' -O-acetyl-MeBmt]^·- [Nva]2- [Nva]^-Ciclosporin; 1.6 {3' -O-acetyl-MeBmt] *· [ (D)Ala)^-Ciclosporin; 1.7 (3'-0-acetyl-MeBmt]^-[Nva]2.[(D)Ala]·*-Ciclosporin; 10 1.10 [ 3' -O-acetyl-dihydro-MeBmt] ^-Ciclosporin; 1.11 [3' -O-methoxycarbonyl-MeBmt]-Ciclosporin; 1.12 [3'-0-(4-azidobutanoyl)- MeBmt )^·-Ciclosporin; 1.15 [3' -0-acetyl-MeBmt ] *·- [0-acetyl - (D)Ser]®-Ciclosporin; 1.16 [3' -0-acetyl-8' -methoxy-cis-MeBmt )^--Ciclosporin; 15 1.17 [3'-0-acetyl-8'-t.butoxy-cis*MeBmt)l-Ciclosporin; 1.18 [3' -0-acetyl-8 ' -methoxy-cis-MeBmt] 1- [0-acetyl-Thr]2-Ciclosporin; 1.19 (3' -O-acetyl- 8' -1 .butoxy-cis -MeBmt] ^ - [0-acetyl-Thr ] 2-Ciclosporin; 1.20 [3'-0-acetyl-8'-methoxy-cis-MeBmt][Val]2-Ciclosporin; 20 1.21 [3' -O-acetyl-8' -methoxy-cis-MeBrat] (Nva]2-Ciclosporin; 1.22 [3' -0-acetyl-7' -desmethyl-7' -phenyl-MeBmt]^--Ciclosporin; 1.23 [3'-0-acetyl-cis-MeBmt)2-Ciclosporin; 1.24 [3' -O-acetyl-7' -desmethyl-7' -vinyl-cis-MeBmt] ^--Ciclosporin; 1.25 [ 3' -O-acetyl-7' - desmethyl-7' -vinyl-cis-MeBmt]^ - [0-acetyl-Thr]2-
4. 25 Ciclosporin; 1.26 [3* -O-acetyl-7' -desmethyl-7' -i. pen tyl-cis-MeBmt) *·-Ciclosporin; 1.27 [3' -O-acetyl-7' -desmethyl-7' -phenyl-cis-MeBmt]^--Ciclosporin; 1.28 [3' -O-acetyl-7' -desmethyl-7' -n.propyl-cis-MeBmt]^--Ciclosporin; 1.29 [3' -O-acetyl-7' -desmethyl-7' -(j9-allyl) -cis-MeBmt]*--Ciclosporin; 30 1.30 [3' -O-acetyl-7' -desmethyl-7' -phenyl-MeBmt] 1-[Val]2-Ciclosporin; 1.31 [3' -O-acetyl-7' -desmethyl-7' -phenyl-cis-MeBmt] [Val]2-Ciclo-sporin; 1.32 [3' -O-acetyl-7' - desmethyl-7' - vinyl-cis-MeBmt] ^ - [Val]2-Ciclosporin; 35 1.33 [3'-0-acetyl*7'-desmethyl-7'-vinyl-cis-MeBmt] [Nva]2-Ciclo- sporin; DK 173873 B1 1.34 [3' -0-acetyl-7' -desmethyl-7' - (3-brom-n.propyl)-cis-MeBmt]^-Ciclosporin; 1.36 1,2-ethandicarboxylsyre-[0-threonyl]2-Ciclosporin diester; 1.37 [3'-desoxy-3'-oxo-MeBrat]^-Ciclosporin; 5 1.38 [ 3'-desoxy-3 '-oxo-MeBrat] *·-(Val] 2-Ciclosporin; 1.39 [3'-desoxy-3'-oxo-MeBmt][Nva]2-Ciclosporin; 1.40 [a-methylketo-Gly]^-Ciclosporin; 1.41 [ dihydro-MeBmt ] ^ - [a-methylketo-Gly ] 2-Ciclosporin; 2.1 [3' -desoxy-3' -methoxyimino-MeBmt]^-Ciclosporin; 10 2.2 [Ile]^-Ciclosporin; 3.6 [N-desmethyl-dihydro-MeBmt] *·- [Thr]2-Ciclosporin; 3.8 [dihydro-MeBmt]^-- [Thr]2- [Val] ^-Ciclosporin; 3.10 [MeLeu]^-Ciclosporin; 4.1 [8' -methoxy-cis-MeBmt] ^--Ciclosporin; 15 4.2 [8'-t.butoxy-cis-MeBmt] ^--Ciclosporin; 4.3 [8' -methoxy-cis-MeBmc]*-- [Thr]2-Ciclosporin; 4.4 [8' -t.butoxy-cis-MeBmt] *·- [Thr]^-Ciclosporin; 4.5 [8' -methoxy-cis-MeBmc]*·- [Val]2-Ciclosporin; 4.6 [8' -methoxy-cis-MeBmt] [Nva]2-Ciclosporin; 20 4.7 [8'-methoxy-dihydro-MeBmt] ^--Ciclosporin; 4.8 [ 8' - me thoxy-dihydro-MeBmt ] [Thr]2-Ciclosporin; 4.9 [ 8' - me thoxy-dihydro-MeBmt] ^-- [Val]2-Ciclosporin; 4.10 [8' -methoxy-dihydro-MeBmt][Nva]2-Ciclosporin; 6.1 [7' - desmethyl-7' -phenyl-MeBmt]^-Ciclosporin; 25 6.2 [7'-desmethyl-7'-phenyl-cis-MeBmt] ^--Ciclosporin; 6.3 [7' -desmethyl-7' -vinyl-cis-MeBmt]^-Ciclosporin; 6.4 [7' - desmethyl-7' -vinyl-cis-MeBmt]^--[Thr]2-Ciclosporin; 6.5 [7' -desmethyl-7' - (3-methyl-n. butyl)-cis-MeBmt] -Ciclosporin; 6.6 [7' -desmethyl-7’ -n.propyl-cis-MeBmt]*·-Ciclosporin; 30 6.7 [7' -desmethyl-7' - (Ø-allyl)-cis-MeBmt] *-Ciclosporin; 6.8 [7' -desmethyl-7' - phenyl-MeBmt] *-[Val] ^-Ciclosporin; 6.9 [7' -desmethyl-7' -phenyl-cis-MeBmt]*-- [Val]2-Ciclosporin; 6.10 [7' -desmethyl-7' -vinyl-cis-MeBmt}*-[Val]2-Ciclosporin; 6.11 [7' - desmethyl-7' -vinyl-cis-MeBmt]*-[Nva]2-Ciclosporin; 35 6.12 [7' -desraethyl-7' -(3-brom-n.propyl)-cis-MeBmt)*--Ciclosporin; 6.13 [7' -desmethyl-7' -phenyl-dihydro-MeBmt]^--Ciclosporin; 6.14 [7'-desmethyl-7'-n.propyl-dihydro-MeBmt] ^--Ciclosporin; 6.15 [7' - desmethyl-7' - ethyl-dihydro-MeBmt] *- [Thr]2- Ciclosporin; DK 173873 B1 6.16 [7' -desmethyl-7' - (3-me thyl-n. butyl) -dihydro-MeBmt] -Ciclosporin; 6.17 [7'-desmethyl-7'-i. propyl-dihydro-MeBmt]^-Ciclosporin; 6.18 [7'-desmethyl-7'-ethyl-dihydro-MeBmt][Val]^-Ciclosporin; 6.19 [7' -desmethyl-7' - ethyl-dihydro-MeBmt] [Nva]^-Ciclosporin; 5 6.20 [7'-desmethyl-7'-phenyl-dihydro-MeBmt][Val]^-Ciclosporin; 6.18 [7'-desmethyl-7'-ethyl-dihydro-MeBmt]^--Ciclosporin; og [cis-MeBmt] ^--Ciclosporin.
5. 5. Farmaceutisk præparat omfattende en cyclosporin ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4 sammen med et farmaceutisk acceptabelt for- 10 tyndingsmiddel eller en farmaceutisk acceptabel bærer derfor.
6. 6. Cyclosporin ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4 til anvendelse som farmakon.
7. 7. Cyclosporin (i) hvor 3'-carbonatomet i gruppen i 1-stillingen eller y3-carbonato- 15 roet i gruppen i 2-stillingen er 0-acyl- eller oxosubstitueret, eller (ii) hvor 3’-carbonatomet i gruppen i 1-stillingen er C^_4-alkoxyimi-nosubstitueret, hvor gruppen i 2-stillingen er en (L)-isoleucyl-gruppe, eller gruppen i 11-stillingen er N-methyl-(L)-alanyl-,
8. 20 N-methyl-(L)-isoleucyl- eller N-methyl-(L)-alloisoleucyl; eller (iii) med formlen XI som illustreret i krav 1, hvor: Z er -Val- eller -MeVal-; når Z er -Val-, så er A -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-; eller 25 når Z er -MeVal-, så er A -3'-desoxy-MeBmt-, -3'-desoxy-dihydro-MeBmt-, -N-desmethyl-MeBmt-, -N-desmethyl-dihydro-MeBmt, -3'-desoxy-4'-desmethyl-dihydro-MeBmt- eller -MeLeu-: og 30 når Z er -Val-, så er B -aAbu- eller -Thr-; DK 173873 B1 når Z er -MeVal-, og A er -3'-desoxy-MeBmt-, -3'-desoxy-dihydro-MeBmt-, -3'-desoxy-4'-desmethyl-dihydro-MeBmt- eller -MeLeu-, så er B er -oAbu-; eller 5 når Z er -MeVal-, og A er *N-desmethyl-MeBmt- eller -N-desraethyl-dihydro-MeBmt-, så er B -Thr-; til anvendelse som farmakon, især til anvendelse til at forbedre eller forøge virkningen af, eller 10 forøge sensitiviteten over for, anden kemoterapeutisk lægemid delterapi, eller til anvendelse til at nedsætte den effektive kemoterapeutiske dosishastighed for et yderligere kemoterapeutisk lægemiddelstof, eller til anvendelse som et hjælpestof til behandling af morbide til-15 stande karakteriseret ved modstand over for et andet kemotera peutisk lægemiddelstof, eller til anvendelse til at forstærke eller forbedre kemoterapeutisk behandling af morbide tilstande, der udviser eller er karakteriseret ved modstand mod nævnte behandling, eller 20 til anvendelse til at ophæve eller formindske modstand over for kemoterapeutisk behandling, eller til anvendelse til at genskabe sensitivitet over for kemoterapeutisk behandling, eller til anvendelse som et hjælpestof til anden kemoterapeutisk 25 lægemiddelterapi.
9. 8. Cyclosporin ifølge krav 7, hvilket er en cyclosporin som defineret i et hvilket som helst af pkt. (i), (ii), (iv), (v) eller (vi) i krav i eller et cyclosporin som defineret i (iii) i krav i, hvor gruppen i 1-stillingen er 3'-O-acylsubstitueret.
10. 9. Cyclosporin ifølge krav 7 valgt blandt gruppen bestående af: 1.1 [3'-O-acetyl-MeBmt] ^--Ciclosporin; 1.4 [3' -0-acetyl-MeBmt] *-[NvaJ^-Ciclosporin; 1.8 [3' -0-acetyl-MeBmt][(D)MeVal]^-Ciclosporin; 1.9 [3’-0-acetyl-MeBmt](Valj ^-Ciclosporin; DK 173873 B1 1.13 [3' -O-acetyl-MeBmt] [O-acetyl-Thr]^-Ciclosporin; 1.14 [ 3' -O-acetyl-N-desmethyl-MeBmt] [O-acetyl-Thr]^-Ciclosporin; I. 35 [O-acetyl-Thr]^-Ciclosporin; 2.3 [MeAla] ^-Ciclosporin; 5 2.4 [Melle]-Ciclosporin; 2.5 [Meallolle] ^-Ciclosporin; 2.6 [MeLeu] ^-Ciclosporin; 3.1 [Val] ^-Ciclosporin; 3.2 [dihydro -MeBmt ] *· - [Val] *-*-Ciclosporin; 10 3.3 [3'-desoxy-MeBmt]*--Ciclosporin; 3.4 [3' -desoxy-dihydro-MeBmt]!·-Ciclosporin; 3.5 [N-desmethyl-MeBmt] *- [Thr]^-Ciclosporin; 3.7 [Thr]^-[Val] ^-Ciclosporin; 3.9 [3' -desoxy-4' -desmethyl-dihydro-MeBmtl^-Ciclosporin; 15 og de enkelte cyclosporiner 1.2 til og med 1.41, 2.1 og 2.2, samt 3.6 til og med 3.10 ifelge krav 4.
11. 10. Farmaceutisk præparat omfattende en cyclosporin med struktur som defineret i et hvilket som helst af kravene 7-9 sammen med et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel eller en farmaceutisk accepta-20 bel bærer derfor. II. Cyclosporin ifølge krav 1, hvor gruppen i 1-stillingen er cis- -MeBmt-; -8'-C^.g-alkoxy-cis-MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-; -7'-des-methyl-7'-hydrocarbyl-MeBmt- eller -cis-MeBmt-, hvor hydrocarbyl-gruppen omfatter mindst to carbonatomer; -7'-desmethyl-7'-hydrocar-25 byl-dihydro-MeBmt - , hvor hydrocarbylgruppen omfatter mindst to carbo natomer og hvor en hvilken som helst alifatisk gruppe eller del, som er eller omfatter nævnte hydrocarbylgruppe, er mættet; til anvendelse som et immunosuppressivt middel, til anvendelse som et anti-inflammatorisk middel eller til anvendelse som et anti-parasitisk middel.
12. 12. Cyclosporin ifølge krav 11 valgt blandt gruppen bestående af cyclosporiner 4.1 til og med 4.10 og 6.1 til og med 6.21 ifølge krav 4 og [cis-MeBmt]^-clclosporin. DK 173873 B1
13. 13. Cyclosporin, hvor gruppen i 1-stillingen er -5'-des(1-propenyl) -5'-formyl-MeBmt- i fri eller 3'-O-beskyttet form.
14. 14. Cyclosporin ifelge krav 13 valgt blandt gruppen bestående af: 5.1 [3' -0-acetyl-5'-des-(l-propenyl)-5' - formyl -MeBmt]L-Ciclospor In; 5 5.2 [3' -O-acetyl-5' -des-(1-propenyl)-5' - formyl-MeBmt] 1- [O-acetyl- Thr]^-Ciclosporin; 5.3 [3' -0-acetyl-5' - des- (1-propenyl) - 5' - formyl-MeBmt]1- [Val] ^-Ciclo-sporin; og 5.4 [3' -0-acetyl - 5 ’ - des - (1-propenyl) - 5' - formyl-MeBmt) 1- [Nva] 2-Ciclo- 10 sporin.