CZ411791A3 - Cyclosporins and pharmaceutical compositions in which said cyclosporins are comprised - Google Patents

Description

JULi. j '“Ι'.Α'. ΙΟ'.Ά A ?AR-advokáti·:! a p.vrsNTOv, 170 00 Praha 7, U ?rihoau3g 1 7/7/- '77

Cyklosporiny a farmaceutické kompozice tyto cyklosporiny obsahující

Oblast technikv

Cyklosporiny zahrnují skupinu cyklických poly-N-methy-lovaných undekapeptidú s charakteristickou strukturou, které obecně mají farmakologickou, zejména imunosupresivní, protizáně-tovou a/nebo protiparazitickou účinnost. Tato účinnost se u jednotlivých cyklosporinú projevuje větší či menší měrou. Prvním izolovaným cyklosporinem byl přírodně se vyskytující fungální metabolit Ciclosporin nebo Cyklosporin, rovněž známý jako cyklosporin A a nyní komerčně dostupný pod označením Sandim-mun. Ciclosporin je cyklosporinem obecného vzorce A κ«3β 1 ‘-«Abu-Sar-HeLeu-Val-ííaLeu Z 3 .4 3 6

Ala-CDjAla-MeLau-heLeu-MeVal-j 7 8 9 10 11 | (A)

ve kterém -MeSmt- znamená N-methyl~ ( 4R)-4-but-2E-en-l-yl-4” methyl-(L)threonylový zbytek obecného vzorce a (3') CHj (7') x

-N-—CS—CO-• ! (2') ď) (B)

I v “IJ^d ΑΛ3Γ80 V AZaiVNAA OUd rivgn —1 ' :

Z 6 II 7 Z I •SPr. U 0 T ft t 0

2 ve kterém -x-y- znamená konfiguraci trana skupiny -CH=CH- a poloha 2 ‘, 3" a 4 * má konfiguraci S, R resp. R.

Od prvotního objevu Ciclosporinu bylo izolováno a identifikováno velké množství přírodně se vyskytujících cyklosporinú a mnoho dalších umělých, v přírodě se nevyskytujících cyklosporinú zcela- nebo polosyntetickými postupy anebo použitím modifikovaných kultivačních technik. A tak skupina ^ykloVpO'trnů~ je'~nyní~velm±”početiTá-'a™-za-hrmrje'například~pří-~ - -rodní cyklosporiny A až Z /viz Traber a kol. 1, Helv.Chim.

Acta, 60, 1247-1255 (1977); Traber a kol. 2, Helv. Chim. Acta, 65, 1655-1667 (1982); Kobel a kol., Europ. J. Applied Micro-biology and Biotechnology 14, 273-240 (1982); a von Wartburg a kol., Progress in Allergy, 38, 28-45(1986)/, jakož i různé v přírodě se nevyskytující cyklosporinové deriváty a umělé nebo syntetické cyklosporiny, včetně dihydro- a iso-cyklo- -spor-inů-/-v-e^-kter-ý-ch_g.e^zb.y.tek^MeBmtrzb.y_tku_.(iř.ýJ_e_uyede_ný______ vzorec B) nasycen a takto znamená nebo ve kterých vazba zbytku -MeBmt- ke zbytku v poloze 11 .cyklosporinové molekuly (výše uvedený vzorec A) je realizována přes 3*-0-atom a nikoliv přes alfa-N-atom/; derivatizovaných cyklospo-rinů (například ve kterých je 3-0-atom zbytku -MeBmt- acylován nebo na alfa-uhlíkový atom sarkosylového zbytku v poloze 3 je zaveden další substituent); cyklosporinú, ve kterých je zbytek -MeBmt- přítomen v isomerní formě (například ve kterých je konf igurace poloh 6'a 7' zbytku -MeBmt- cis a nikoliv, trans); a cyklosporinú, ve kterých jsou do specifických poloh peptidové sekvence inkorporovány variantní aminokyseliny, přičemž se například používá zcela syntetických metod pro přípravu cyklosporinú vyvinutých R.Wenger-em; viz například Traber a kol. 1, Traber a kol. 2 a Kobel a kol,(výše zmíněné citace); patenty -US.-41Q8985, 4210581 , 4220641 , 4288431 , 4554351 a 4396542; evropské zveřejněné patentové přihlášky 0034567 a 0056782; mezinárodní patentová přihláška WO 86/02080; Wenger 1, Transpl. Proč. 15, Suppl. 1:2230 (1983); Wenger 2, Angew. Chem. Int. Ed., 24,77 (1985); a Wenger 3, Progress in the Chemistry of Organic Natural Products 50, 123 (1986). 2 3

Skupina zahrnující cyklosporiny je tedy v současné době velmi rozsáhlou skupinou, která například zahrnuje /Thr/ /Val/ -, /Nva/ - a /Nva/ -/Nva/ -Ciclosporin (rovněž známé jako cyklosporiny C, D, G a M), /3-0-acetyl-MeBmt/1-Ciclo- sporin {rovněž znám jako cyklosporin-A-acetát), /Dihydro-

MeBmt/ -/Val/ -Ciclosporin {rovněž znám jako dihydro-cyklo- 12 sporin D), /Iso-MeBmt/ -/Nva/ -Ciclosporin (rovněž znám jako 8 11 isocyklosporin G),/(D)Ser/ -Ciclosporin, /Melle/ -Ciclosporin, /(D)MeVal/11-Ciclosporin (rovněž znám jako cyklosporin H), /MeAla/6-Ciclosporin, /(D)Pro/^-Ciclosporin atd.. V souladu s konvenční nomenklaturou cyklosporinů jsou tyto cyklosporiny v popisné části a nárocích definovány pomocí struktury Ciclosporinu {tj. Cyklosporinů A). To je učiněno jednak vyznačením přítomných aminokyselinových zbytků, které se liší od aminokyselinových zbytků přítomných v Ciclosporinu: (tak například"/{D)Pro/ " znamená, že daný cyklosporin má ·> v poloze 3 zbytek -(D)Pro- a nikoliv zbytek -Sar-) a jednak použitím výrazu “Ciclosporin" pro charakterizaci zbývajících zbytků, které jsou identické se zbytky obsaženými v Ciclosporinu. 4

Zbytek -MeBmt- v poloze 1 Ciclosporinu byl před obje-^ vením cyklosporinů neznám. Tento zbytek a jeho varianty nebo modifikace, které budou například popsané dále, je tudíž obecným charakteristickým znakem cyklosporinů. Obecně jsou uvedené varianty nebo modifikace zbytku /MeBmt/1 definovány vztažením ke struktuře -MeBmt-. Tak například dihydrocyklo-sporiny, ve kterých je zbytek -x-y- (viz výše uvedený vzorec B) redukován na -CH^-CHj, jsou v poloze 1 definovány jako "-dihydro-MeBmt-". U cyklosporinů, ve kterých má zbytek -x-y- konfiguraci cis a nikoliv trans, je odpovídající re-zultující zbytek definován jako "-cis-MeBmt-”. „ . J e stliže.^j sou» některé* části * zbytku*-MeBmt-» vypuštěny potom se označí poloha, ve které došlo k vypuštění,použitím předpony "des" vyznačující toto vypuštění a uvedením skupiny nebo atomu, které byly vypuštěny, a to před symbolem •4·- '.7Τ.ΛΓ m>· jt„r K«t "-MeBmt-", "-dihydro-MeBmt-", “-cis-MeBmt-", atd.. Zbytky "-N-desmethyl-MeBmt-", "-3"-desoxy-MeBmt-" a "-3 -desoxy-4 - 12

des methy i— M e B m-t— -—j -so u—t-ud-í-Ž—zb-y-t-k-y—ob e cn e h o—v.z o.r.ce—B _B_,_ resp. BJ j

CH \ ca

| TíUiNS ca CH; τ (a) ca X / v CH (R)X< (3 1, 8 !, 8 -íf-CH—CO - I (3) ‘

Z a1 - Ϊ » cs,, T - OE , Z = H B3 - .í =! C.1 ] , 7 = c , Z 3 C S3 -5 = 5, ζ 3 s, Z * cs V případě, že polohy nebo skupiny, například v -MeBmt-·* jsou substituované, potom je to vyznačeno konvenčním způsobem tak, že se definuje poloha a povaha substituce. Takto zbytek -3*-0-acetyl-MeBmt- znamená zbytek obecného vzorce B, ve kterém je skupina -OH v.poloze .3" ..acetylována J3 "-O-CQCH^). V případě, že některé skupiny, například v -MeBmt-, jsou nahra ženy jinými skupinami, potom je to vyznačeno i) udáním polohy nahražené skupiny použitím systémů’předpony "des", který již byl popsán výše, a ii) definováním nahrazující skupiny. Takto je zbytek -7"-desmethyl-7"-fenyl-MeBmt-* zbytkem výše uvedeného 5 obecného vzorce B, ve kterém je koncová 8 -methylová skupina nahrazena fenylovou skupinou. 3'-Desoxy-3 -oxo-MeBmt-zbytek je zase zbytkem vzorce B, ve kterém 3 -OH-skupina je nahrazena skupinou =0.

Kromě toho se u aminokyselinových zbytků,uváděných ‘Jř "" | zkratkami, například -Ala-, -MeVal-, -alfaAbu-, atd.. v souladu V s konvenční praxí, rozumí, že mají konfiguraci (L), pokud ne ní výslovně uvedeno jinak, jak je tomu například u "-(D)Ala-“-zbytku. Jestliže se před zkratkou zbytku nachází symbol "Me”, jako například v případě zbytku "-MeLeu-", potom to znamená, že jde o alfa-N-methylované zbytky. Jednotlivé zbytky cyklo-sporinové molekuly jsou očíslovány, jak to obvyklé, ve smyslu otáčení hodinových ručiček, přičemž toto číslování začíná u zbytku -MeBmt-, -dihydro-MeBmt-, atd., který má takto polohu 1. Stejná numerická sekvence se používá v celé popisné části av patentových nárocích.

Dosavadní stav techniky

Vzhledem k jedinečným farmaceutickým vlastnostem upoutaly na sebe c$£\a^oe^orírffi značnou pozornost nejen lékařských a akademických kruhů, nýbrž i laické veřejnosti. Cykiosporin samotný se nyní obecně používá při prevenci odmítnutí organismem alogenních orgánů, jakými 3sou například srdeční, srdečně-plicní, ledvinové a‘ kostnl-dřeňové transplantáty, a také - a to častěji - při léčení různých autoimunitních a odvozených onemocnění a stavů. Rovněž byly vykonány rozsáhlé výzkumné práce majících za úkol vyzkoumat případnou použitelnost cyklo-sporinů při léčení různých onemocnění a infekcí, způsobených parazity, například při léčení malárie, kokcidiomykózy a schistomiazy. V současné době lze v odpovídající odborné literatuře nalézti velké množství výzkumných zpráv o výsledcích potenciálního použití širokého spektra různých cyklospo-rinů při výše uvedených indikacích. 6

Podstata vynálezu

Nyní bylo s překvapením zjištěno, že některé cyklo-sporiny jsou použitelné za účelem zvýšení citlivost organismu vůči jinému typu chemoterapie a zejména za účelem potlačení resistence organismu, a to jak indukované, tak i inherentní, vůči jinému typu chemoterapie.

Zvýšená resistence vůči chemoteraeutické terapii, následující po méně či délitrvajícím léčení, obecně po relativně prolongované chemoterapeutické medikaci, je široce rozšířeným jevem, který je již dlouhou dobu znám a rozsáhle dokumentován v odborné literatuře. Klasický případ takové resistence je zvýšená nebo indukovaná resistence parazitních, zejména bakteriálních, virálních nebo protozoálních organismů, následující po dlouhodobé a široce rozšířené medikaci za použití indivi-duálmch' "f a'r mako log íčky- účihhýcff^átěkT^V^diclito^pripadéch"^ se infikující organismus časem stane vůči takto používané farmakologiekv účinné látce resistentní a to větší či menší měrou a v důsledku toho je uvedeným typem medikace jen obtížně eliminovatelný. Analogický jev byl pozorován při chémote-rapeutickém léčení rakoviny, například při léčení karcinomů, sarkomů nebo jiných nádorů nebo maligních novotvarů.

Chemoterapeutické léčení rakoviny, například podáváním léčiv, zejména antineoplastických nebo cytotoxických léčiv, například colchicinu, etoposidu, tenoposidu, adriamycinu, daunorubicinu a vincristinu, které jsou terapeutickými činidly redukující, inhibující nebo jinak omezující růst nádorů nebo metastáz, představuje prvořadý způsob léčení rakoviny různého typu. Nicméně bylo obecně zjištěno, že i když je nádor vůči chemoterapii zpočátku velmi citlivý, vzniká u něj tou měrou, jak chemoterapeutické léčení pokračuje, určitá resistence vůči podávanému chemoterapeutickému činidlu, což snižuje terapeutickou účinnost tohoto činidla. V případě, že se zejména při léčení pozdního stádia nebo terminálního stádia rakoviny použije pleiotropická nebo multiakční chemoterapie, potom i v tomto případě dochází ke vzniku uvedené resistence. 7 7

K analogickým těžkostem dochází například v případech, kdy jsou dlouhodobě praktikovány určité formy chemoterapeutického léčení a kdy dochází například ke vzniku resistentních kmenů mikroorganismů, které mají vyvinutou inherentní nebo vrozenou resistenci. Stejně tak se často vyskytují formy rakoviny nebo nádorů, které mají vrozenou resistenci nebo sníženou míru citlivosti vůči obecně používaným antineoplastickým nebo cytosta-tickým chemoterapeutickým činidlům. v souladu s vynálezem bylo nyní zjištěno, že dále definované cyklosporiny jsou použitelné při zvyšování citlivosti vůči chemoterapeutickým činidlům nebo při zvyšování účinnosti chemoterapeutických činidel, přičemž jsou zejména použitelné při eliminaci resistence vůči chemoterapeutickým Činidlům různého typu (například získané nebo vrozené resistence) nebo při zvýšení nebo obnovení citlivosti vůči podávanými··· chemoterapeutickým činidlům. Formy terapie chemoterapeutickým mi činidly, pro které je vynález použitelný, zahrnují napři-" klad antiparazitickoi.například antivirální, antibakteriální nebo antiprotozoální chemoterapii, a zejména antineoplastickou nebo cytostatickou terapii.

Cyklosporiny, které jsou použitelné pro použití v rámci vynálezu, lze zařadit do následujících skupin.

Skupina Ί

Do této skupiny patří cyklosporin, ve kterém je 3 uhlíkový atom zbytku v poloze 1 nebo beta-uhlíkový atom zbytku v poloze 2 O-acyl- nebo oxo-substituován. Výhodnými cyklosporiny této skupiny jsou cyklosporiny: 1a) ve kterých je 3"-uhlíkový atom zbytku v poloze i o-acyl-substituován. M M . r. .

Xdyž je 3"-uhlíkový atom zbytku v poloze 1 0-acyl-substituován, potom zbytek v poloze 2 může být rovněž beta-0-acylován.

,35| . tft ·. '..Clí I mi 8 Výhodnou skupinu cyklosporinů typu 1a) jsou cyklosporiny:

1a^) ve kterých zbytek v poloze 1 je zbytkem -3 -Q-acyl-MeBmt- nebo -3 -0-acyl-dihydro~MeBmt obecného vzorce I CK,

y c ACYL1-0

CH

CH (I) CHi -fj—,CE—C0-! (S) i

CH ve kterém -x-y- znamená nebo trans -CH=CH- a ACYL^ znamená acylovou skupinu.

Vhodnými acylovými skupinami ve významu obecného sub-stituentu ACYlJ v obecném vzorci I jsou acylové skupiny obecných vzorců R.j -CO- a R^-O-CO-, kde R1 znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atomy nebo azidoalkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atomy a znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atomy, například aceťylová' skupina, 4-azidobutanoyio-vá skupina nebo methoxykarbonylová skupina. Výhodnou skupinou .ACYL....je ..skupina obecného vzorce R^-CO-, kde R1 výhodně znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atomy. Nejvýhodnější skupinou Rj-CO- je acetylová skupina. 9 ALkylové skupiny zahrnuté v obecných substituentech R1 a R2 mohou být alkylovými skupinami s přímým nebo.rozvětveným uhlíkovým řetězcem. S výhodou jsou tyto skupiny skupinami s přímým uhlíkovým řetězcem.. Rj nejvýhodněji znamená mechy lovou skupinu.

Obzvláště výhodnými cyklosporiny skupiny 1a1 .jsou cyklosporiny obecného vzorce II nebo II#

-A-3-X-HeLeu-Y-MeL0u-Ala-(D)Ala-KeÍe'j-.u.aLeu-,u.eVaI 1-2 3 4 5 6-7 ;8 9 10 11 -A-a-X-HeLeu-T-fíelaii-Ala-V-MeLeu-MeLeu-MaVal- ' 123456789 10 11 j ('!') L—:_,_____i " ve kterých

X Y w znamená zbytek definovaný výše pod la\ znamená -alfaAbu-, -Tnr-, -Val-, ‘-Nva- nebo zbytek beta-o-acyl-alfa-aminokyseliny, znamená -Sar- nebo 2bytek opticky aktivní alfa-N-me-thylované alfa-aminokysaliny mající konfiguraci (0)-znamená -Val- nebo také, když B znamená -Nva-,-Nva-, a' znamená zbytek beta-hydroxy- nebo beta-O-acyl-alfa-aminokyseliny mající konfiguraci (D). ... .......A-..!,..-----^.^^j^j******* i.nmn lií .unii ..........* »«»*Νΐιιι<Μιή)·ίΐιιτΐ 1» .......... .11,"'

Jestliže B je beta-O-acýl-alfa-aminokysalinovým zbytkem, potom má obecně konfiguraci (L). Výhodně je zbytkem obecného vzorce III 10 1.2 [ 3' -O-Acecyl-MeBíis: JL -(Val 13 -Ciclosporin; 1.3 [ 3'-0-Acecyl-MeBmt]1-(Thr]2-Ciclosporin; 1. i [3'-0-Ace tyl-MeBmcI1 -(N'/a]2 -Ciclosporin; 1.5' (3'-0-Ace tyl-Me3mc]1-[Nva]1 -[NvaJs-Ciclosporin; t 1.6 (3'-0-Acecyl-Me3mc)l-[(D)Ala]3-Ciclosporin; 1.. 7 ( 3' -0-Ace tyl-HeBmc | L-[Nva j1 -((O)Ala J3 -Ciclc·í n; 1-8 [3' -0-Acecyl-MeBiňt J1 -((D)MeVal J ’·1 -Ciclosporin; 1.9 (3'-0-Acetyl-HeBmc]l-(Val|u-Ciclosporin; 1.10 (3'-O-Acecyl-dihydro-MeBmt]1-Ciclosporin; 1.11 (3'-O-He choxykarbony1-MeBmt]1-Ciclosporin; 1-12 (3' -Q-(4-Azidobutanoyl)-MeBmc ]1 -Ciclosporin; 1.13 (3'-0-Ace cyl-MeBmc] ^[O-acetyl-Thr j1-Ciclosporin;

(3' -0-Acecyl-N-deáinethyl-MeSmi: J1 -[O-acetyl-Thr J2-Ciclosporin; * - ^ΓΤ' -** - %· a* r 1.15 [3'-0-Acecyl-MeBmc]1-(0-acecyl-(D)Ser]1-Ciclosporin. I ,Výhodnými cyklosporiny .pro použití v rámci vynálezu jsou cyklosporiny 1.1 až 1.10 a 1.15, přičemž nejvýhodnějšími cyklosporiny jsou cyklosporiny 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.10 a 1.15. ~~ - i-- -------Pa 1 ší_,skuDÍmi-cykl-n,qpor i mVt-~m

1a ) ve kterých zbytek v poloze 1 je tvořen zbytkem -3 -O-acetyl-8 '-Cj-Cg-alkoxy- -cis-MeBmt- nebo -dihydro-iMeBnifc-obecného vzorce IV

A*

. Jestliže χ ve vzorci II je jiný než -Sar-, potom vhodně znamená -{D)Ala-. Příklady cykLosporinu této skupiny vhodných pro použití v rámci vynálezu jsou: 1.1 (3'-0-Ace-yl-Me3,7i;j '-Ciciosporin; .1.2. [•3' -O-Acsiyl-říaBtf: J • -[ValJ2 _c iclóspofin; 1.3. (3' -0-Ace tyl-ída3.Ti : J *-[ThrÍ!-Ciciosporin; 1.4 13' '0—A c a ; y 1 -Μ e 3 .τι t j • -[Jíva p -C i clospor i n; 1.5 [3'-0-Acscyl-Me3m;J 1 -[ Jíva [: (Jíva J! -C i clos po:in ; 1.5 (3'-O-Acscyl-Haancl ’-[(□) Ala [3-Ciciosporin; 1.7 [3' -O-Acscyl-heSiií; j [NvaJ2 -[ (D)Ala 13 -Ciciosporin 1.3 E 3'-Q-Acs cyl-Me3mc] -[ (D)Me:/al J1 ’ -Ciciosporin; 1.9 E 3' -Q-Ac2cyi-Me3nK,| 1 -[Val ]1 ’*-Ciciosporin; 1.10 (3'-Q-Acscyl-dihydro-MeSmc]1-Ciciosporin; 1.11 [3'-Q-MechoKykarbonyl-MeSmc]1 -Ciciosporin; 1.12 [3' -0-(4-Azldobu:anoyl)-Me3nic ]1 -Ciclasparin; 1.13 (3'-Q-Ace:yl-He3mcJ--[0-ace:y1-ThrI2-Ciclospocín; l·1-4 [3' -0-AC9Cyl-ří-dasde':hyl-Me3m: P-EO-aescyl-ThrJ2-Ciciosporin; . a . ......... ^ . ................... 1.15 (3'-0-Acecyl-říe3mc|i-(0-acecyl-(0)S«»r]s-Ciclospocin. Výhodnými cyklosporiny pro použití v rámci vynálezu jsou cyklosporiny 1.1 az 1.10 a 1.15, přičemž nejvýhodnějšími 12 cyklosporiny jsou cyklosporiny 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.10 a 1.15.

Další skupinu cyklosporinů typu 1a tvoří cyklosporiny: 2 _ la ) ve kterých zbytek v poloze 1 je tvpřen zbytkem -3 -O-acyl 8 -Cj-Cg-alkoxy- -cis-MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-obecného

vzorce IV x 'CH,

ACYL1-0 (R) CH

Xck^(r7 (ΞΪ) -N - CH - C0- I (S) CHj ve kterém -x-y- znamená cis -CH=CH- nebo -CH2-CH2~, R4 znamená C^-C^-alkoxymethyl a ACYlJ znamená acylovou skupinu.

Zejména vhodnými acyiovými skupinami v obecném vzorci IV jsou acylové skupiny obecného vzorce R^-CO-, ve kterém R^ znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atomy.

Alkylové skupiny ve významu obecného substituentu Rg, jakož i alkylové skuoiny obsažené v obecném substituentu R. 4 mohou mít přímý nebo rozvětvený uhlíkový řetězec. S výhodou R4 znamená alkoxymethyl_ovouA5kupinu, ve .které^alkoxylový^zby- **· tek obsahuje 2 až 5 uhlíkových atomů. Výhodným významem obecného substituentu ACYL1 v obecném vzorci IV je acetylová skupina. 2 13

Obzvláště výhodnými cyklosporiny skupiny la jsou cyklo sporiny výše uvedeného obecného vzorce II, ve kterém A znamená zbytek výše uvedeného obecného vz'órc"e—IV-; B-má—význám—uvedený pro obecný vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-. 2 Příklady cyklosporinu skupiny 1a , vhodných pro použití v rámci vynálezu, zahrnují: 1.16 [ 3^-0-acecy 1~8Ύ-me thoxy^iy^KeBmTp~CIčlo^pcrřTrr;^ --- ----~ 1.17 [ 3' -0-acety1-8'-1.butoxy-cis-HeBmt]1-Ciclosporin; 1.18 [3' -O-acetyl-8'-methoxy-cís-HeBmt 1 l-(0-acecyl-Thr jJ-Ciclosporin; 1.19 [3' ^0-ace tyl-8'-1.bu coxy-cis-HeBm t ]1 -[0-ace ty1-Thr]5 -Ciclosporin; 1.20 [3'-0-acetyl-8'-me cnoxy-cis-MeBmc) *-[Val]1-Ciclosporin; a , , » v 1.21 [V-O-acetyl-a^niechoxy-cis-MeBíntlMNvaP-Ciclospori;!. ·

Další skupinu cyklosporinu typu 1a tvoří cyklosporiny: 1a^) ve kterých zbytek v poloze 1 je tvořen zbytkem 3-0-acyl-cis-MeBmt-, nebo zbytkem -3'-0-acyl-7'-desmethyl-7 hydrokarbyl- -MeBmt- nebo -cis-MeBmt-, kde hydrokarbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atomy, nebo zbytkem 3*-0-acy1-7 *-desmethyl-7*-hydrokarbyl-dihydro-Me3mt-, kde hydro-karbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atomy, přičemž každá alifatická skupina přítomná v uvedeném hydrokarbylovém zbytku je nasycenou skupinou.

Tyto zbytky mají;.obecný_vzorec V

X 14 X 14

y. ACYL^O.íR) ca. XH (R)XCH3 (V) -N - CH - CO-Ί <S> CH, ve kterém -x-y- znamená cis nebo trans -CH*CH- nebo -CH2~CH2-, R- znamená hydrokarbylovou skuoinu a 0 1 ACYL znamená acylovou skupinu, s výhradou, spočívající v tom, že když -x-y- znamená trans -CH=CH- nebo -CHj-CKj-, potom Rg obsahuje alespoň dva uhlíkové atomy (t.2n. že je jiný než methylová skupina), a když -x-y- znamená potom každá alifatická skupina přítomná v obecném substituentu Rg nebo tvořící obecný substituent Rg je nasycenou skupinou.

Obzvláště vhodnými acylovými skupinami v obecném vzorci V jsou acylové skupiny obecného vzorce R^-CO, ve kterém R^ znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atomy, zejména acetylovou skupinu,

Hydrokarbylové skupiny ve významu obecného substituentu Rc zahrnují aromatické, alifatické^a^araj-ifatické, skupiny, I I.m*.». .«—». imniimmil. **—1'*· 1,1 * přičemž alifatické skupiny mohou mít přímý nebo rozvětvený uhlíkový řetězec. Tyto skupiny mohou rovněž nést další sub-stituenty, jakými jsou například atom halogenu nebo hydroxy-lůvá skupina, nebo mohou být nesubstituované. 15

Vhodnými hydrokarbylovými (uhlovodíkovými) skupinami ve významu obecného substituentu Rg alkylové, alkenylové, “aDčinyiové'; f enylOvé"; fOnytad-kyl^vé—fen-y-l-a-l-k-en-y-l-o-v-é—a—f.eny-1-__ alkinylové, zejména alkylové, alkenylové a alkinylové skupiny, obsahující nejvýše 20, výhodně 8 uhlíkových atomů, a fenylové, fenylalkylové a fenylalkinylové skupiny obsahující nejvýše 12 uhlíkových atomu. 'Obzvláště''výhodnými ~skuplnamř~ ve-významu- obecného—sub·^-stituentu Rg jsou fenylová skupina, fenylalkylové skupina, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, alky-lová skupina s 1 až 10 uhlíkovými atomy, alkenylové skupina se 2 až 10 uhlíkovými atomy a alkinylové skupina se 2 až 10 uhlíkovými atomy, zejména fenylová skupina a alkylové skupina s 1 až 5 uhlíkovými atomy.

Jestliže -χ-y- v obecném vzorci V znamená po- t om~ hydrokari^l^e^lTú^rňaT^vě- vy známu-ob'e cn'éh o-s ub s tř tu ant u—Rg— zahrnují aromatické, nasycené alifatické a aralifatické skupiny .ve kterých je alifatický zbytek ..nasycen., například výše uvedené skupiny tohoto typu.

Obzvláště výhodnými cyklosporiny této skupiny jsou cyklosporiny výše uvedeného obecného vzorce II, ve kterém A znamená zbytek výše uvedeného obecného vzorce V, B mé význam uvedený pro obecný vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-. Příklady cyklosporinú této skupiny vhodných pro použití v rámci vynálezu zahrnují: 1.22 [3'-0-acetyl-7'-desmechyl-7'- fenyl-Me3mc]L-Ciclosporin; 1.23 [ 3' -Q-ace tyl-cis-MeBni t ]1 -Ciclosporin; 1.· 24 [3' -OT-áce.Cyl-7' -desmeEhy1-7' -vinyl-cis-MeBmc]1 -Ciclosporin; 1.25' [3' -0-acetyl-7' -desme thyl-7' -vinyl-cis-Me3mc ] l-[Q-ace:yI-Thr J *·-Ciclosporin; 16 1.25 [ 3' -O-acety 1-7' -descetir/L-7'-i .pencyl-cis-MeBmc j1-Ciclosporin; 1.27 í3'-0-acecyl-7'-desnechyl-7'- fenyl-cis-MeBmt Jl-Ciclosporin; 1.28 (3’ -0-acetyl-7'-des;nechyl-7'-n.propyl-cis-HeBmt J1-Ciclosporin; 1.29 [ 3' -0-acecyl-7' -des.Tiethyl-7'-(|3-allyl)-cis-MeBmt J1 -Ciclosporin; 1.30 [3'-0-acecyL-7'-desnethyl-7'- fenyl-HeBmt]1 -[Val)2-Ciclosporin; 1.31 [3'-O-acsCyl-7'-desaechyl-7'- fenyl-cis-HeBmt31-(ValJ2-Ciclosporin; 1.32 [3'-0-acscyl-7,-desniethyl-7,-vinyl-cis-HeBmti2-[ValjJ-Ciclosporin; 1.33 [3'-Q-acetyL-7'-desmechyl-7'-vinyl-cis-HeBmc]l-[Nva]2-Ciclosporin; a, . 1.3^ [ 3' -0-acaty 1-7' -dasme chyl-7' - (3-bromo-n. propyl)-cis-.Me3mC ]1 -

Ciclosporin. A Φ.

Další skupinu cyklosporinů skupiny 1 tvoří cyklospori-ny: 1b) ve kterých beta-uhlíkový atom zbytku v poloze 2 je O-acyl-substituován, t.zn. ve kterém zbytek v poloze 2 je beta-0-acyl-alfa-aminokyselin.ovým zbytkem, a zbytek v poloze 1 je jiný než zbytek, který byl definován výše pod 1a).

Jestliže zbytek v poloze 2 je beta-O-acyl-alfa-amino-kyselinovým zbytkem, potom tento zbytek bude mít obecně konfiguraci (L). Vhodně je tento zbytek zbytkem obecného.vzorce III'' 17 O-ACYL1 _I___ 0 CH-CHj (ΠΙ") -SH-CH-CO- (L) 2 ve kterém ACYL znamená acylovou skupinu. Výhodné je tento zbytek tvořen O-acyl-(L)-threonylovým zbytkem.

Vhodnými skupinami ve významu obecného substituentu ACYL2 v obecném vzorci III·*" jsou skupiny obecného vzorce R^-CO- nebo R^-CO-Rg-CO-, ve kterém Rg má význam uvedený pro obecný vzorec III, R^ znamená zbytek cykiosporinu mající beta-oxy-(L)-alfa-aminokyselinový zbytek v poloze"^^prTpojěny-ke zbytku -CO-Rg-CO- přes beta-kyslíkový atom uvedeného zbytku a R„ znamená' alkylenový zDytek s 1 až' 8 uhlíkovými atomy.

O

Alkylenové skupiny ve významu obecného, substituentu R- mohou mít přímý nebo rozvětvený'uhlíkový řetězec. S výho-

O dou mají tyto skupiny přímý řetězec. Rg s výhodou znamená alkylenovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atomy. Výhodné acylové skupiny mají obecný vzorec R^-CO-, přičemž výhodné významy pro Rg-CQ- jsou uvedeny výše ve vztahu k obecnému vzorci III,

Zvláštními cyklosporiny této skupiny jsou cyklospori-ny obecného vzorce II, který byl uveden výše a ve kterém A znamená -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-, B znamená zbytek, který byl definován výše pod 1b, například obecného vzorce lil'*, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-. . Příklady takových cyklosporinů vhodných pro použití v rámci vynálezu zahrnují: - 2 1.35 /O-Acetyl-Thr/ -Ciclosporin a 1.36 Diester kyseliny 1,2-ethandikarboxylové-/0-threonyl/2-Ciclosporin.. 18

Ciclosporin 1.36 má vzorec VI

HeBmt-NH-CH-CO-Sar-MeLeu-Val-MaLe^ U) —Ala-(D)Ala-HeLe'j-fíaLau-HeVal-

JU ..Další skupinu cyklosporinu sxupiny 1 tvoři cykloscoriny 1c) ve kterých 3"-uhlíkový atom zbytku v poloze 1 je oxo- substituován.

Jestliže je 3"-uhlíkový atom zbytku v poloze 1 oxo-substituován, potom je vhodně tvořen zbytkem -3 "-desaxy-3 oxo-MeBmt- vzorce VII ....... '1 'lÉ*·· ca3 •Ca

TSLAWS ca (VII)

Hnv n?.ir -íf—CH—C0- I (S) CH] 19

Obzvláště výhodnými cyklosporiny této skupiny jsou cyklosporiny obecného vzorce II, který byl uveden výše a ve k-ter-ém-A—2namená_z.b.vtek výše uvedeného vzorce VII, B má význa-mi uvedené pro vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-.

Ještě další skupinou cyklosporinú skupiny 1 jsou cyklosporiny: 1d) ve kterých beta-uhlíkový atom zbytku v poloze 2 je beta oxo - s ti b š ťi tu o van, t'jve "'!< t e r ém "zbytek - v- poloze 2 je -tvořen -beta-oxo-alfa-aminokyselinovým zbytkem.

Jestliže zbytek v poloze 2 je beta-oxo-alfa-aminokyse-linovým zbytkem, potom tento zbytek bude mít obecně konfiguraci (L). Vhodně je tento zbytek tvořen zbytkem -alfa-methylketo Gly- vzorce VIII

— NK— CH CO- (VIII) (L) Příklady cyklosporinú náležejících do skupin lc a Id a vhodných pro použití v rámci vynálezu zahrnují: 1.37 (3' -Desoxy-3' -oxo-Me3rct ]1-Ciclospocin: 1.33 (3'-Oesoxy-3'-oxo-Meamt]L-(Val]2-Ciciosporín; 1.39 [3' -Desoxy-.3' -oxo-Ma3nc]L-[Mva]2-Ciclospocin; 1.40 {c-Meíhylketo-GlyJ2-CicIosporin; a 1.4L [Dihydro-Me3iTn: j l-[ a-otechylkeco-Gly J 2-Ciclosporin. 20

Obzvláště výhodnými cyklosporiny jsou cyklosporiny 1.37 až 1.39.

Skuoina 2

Cyklosporin, ve kterém: i) 3'-uhlíkový atom zbytku v poloze 1 je C^-C^-alkoxyimino-substituován, například cyklosporin, ve kterém zbytek v poloze 1 jé^tvořen zbytkem-3-désoxy-3'-(C^-C^-alkoxyiminoJ-MeBmt-nebo ii) zbytek v poloze 2 je tvořen (L)-isoleucylovým zbytkem nebo iii) zbytek v poloze 11 je tvořen N-methyl-(L)-alanylovým zbytkem, N-methyl-(L)-isoleucylovým zbytkem nebo N-methyl-{L)-alloisoleucylovým zbytkem nebo N-methyl-(L)-leucylovým zbytkem.

Zbytky -3 -decoxy-3-C. -alkoxyimi.no}-Me3mt- definované pod i) mají obecný vzorec IX

C

Ca c s

X ca. (í:í)

R$-Q-íí CH ^ (R^CS, -N-CH-CO- I (S) ve kterém R^ znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atomy. 21

Alkylové skupiny ve významu obecného substituentu mohou mít přímý nebo rozvětvený uhlíkový řetězec. S výhodou mají přímý uhlíkový řetězec._

Pod výrazem N-methyl-{L)~alloisoleucylový zbytek (-Meallolle), použitým pod iii), se rozumí zbytek vzorce X CHj

CjHs (R>

CK (X) N--CH-CO- (L) CHj

Výhodnými cyklosporiny této třídy jsou cyklosporiny obecného vzorce XI CG)

— A-B-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-CDJAla-MeLeu-MeLeu-Z — 12 3 l 5 6 7' 8 9 10 LI ve kterém A znamená -MeBmt-, -dihydro-MeBmt- nebo zbytek, který byl .. .výše definován pod i), B znamená -alfaAbu-, -Thr-, -Val- nebo -Nva- nebo také -Ile v případě, že A znamená -MeBmt- nebo -dihydro-MeBnit-, a..... ' ' ' ...... když A znamená -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt- a B znamená -alfaAbu-, -Thr-, -Val- nebo -Nva-, potom Z znamená -MeAla-, -Melle-, -Meallolle- nebo -MeLeu-, ‘ 22 když A znamená zbytek, který byl definován výše pod i) nebo když B znamená -Ile-, potom Z znamená -MeVal-. Příklady takových cyklosporinú vhodných pro použití v rámci vynálezu zahrnují: m « 2 .1 [3'-Desoxy-3'-mechoxyimino-HeBmc|1-Ciclosporin; * -5 —— ~''2·2 *m“(-Iiej2-Ciclosporin; ^ * ' 2.3 (MeAla]11-Ciclosporin; 2. f Melle J1L-Ciclosporin; 2.5 [Meallolle]11-Ciclospočin; 2.6 (MeLsuIi:-Ciclosporin. Z této skupiny cyklosporinú jsou výhodné cyklosporiny, ve kterých má zbytek v poloze 2 význam uvedený výše pod ii), zejména cvklosporin 2.2.

Rovněž obvzláště zajímavé jsou cyklosporiny, ve kterých zbytek v poloze 11 má význam uvedený výše pod iii), například cyklosporiny 2.4 a 2.5.

Skuoina 3

Cyklosporiny výše uvedeného vzorce XI, ve kterých: *> Z znamená -Val- nebo -MeVal-: když Z znamená -Val-, -j A znamená -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-, nebp ..i·,,,, λI^dyžZ ^ z n áme ná~-Mevál-~~, ’ " k Znamená -3^-desoxy-MeBmt-, 3*-desoxy-dihydro-MeBmt-, -N-desmethyl-MeBmt-, -N-desmethyl-dihydro-MeBmt-,

23 - když -3ř-desoxy-4'-desmethyl-dihydro-MeBmt- nebo -MeLeu-,a Z znamená -Val-, B znamená -alfaAbu- nebo -Thr-, když Z znamená -MeVal- a A znamená -3 -desoxy-MeBmt-, -3 '-desoxy-dihydro-MeBmt-, V. -3'-desoxy-4'-desmethyl-dihydro-MeBmt- nebo -MeLeu-, B znamená znamená -alfaAbu-, nebo r L m > když Q znamená -MeVal-a A znamená -N-desmethyl-MeBmt- nebo -N-desmethyl-dihydro-MeBmt-, B znamená -Thr-.

Cyklosporiny této skupiny zahrnují: 3.1. /Val/^-Ciclosporin (rovněž znám jako cyklosporin E), 3.2. (Dihydro-MeBmt/1-/Val/11-Ciclosporin (nebo dihydrocyklosporin E), 3.3 /3'rDesoxy-MeBmt/1-Ciclosporin (nebo cyklosporin F), 3.4. /3'-Desoxy-dihydro-MeBmt/^-Cicklosporin (nebo dihydrocyklosporin F), 3.5. 12 /N-Desmethyl-MeBmt/ -/Thr/ -Ciclosporin (nebo cyklosporin P), 3.6. 12 k /N-Desmethyl-dihydro-MeSnit/ -/Thr/ -Cicklosporin (nebo dihydrocyklosporin P), \( T 3.7. 2 11 11 /Thr/ -/Val/ -Ciclosporin (nebo cyklosporin W), 3.8. /Dihydro-MeBmt/1-/Thr/^-/Val/11-Ciclosporin (nebo * dihydrocyklosporin" W), 3.9. /3-Desoxy-4'-desmethyl-dihydro-MeBmt/1-Ciclosporin 24 (nebo cyklosporin 2) a 3.10 /MeLeu/^-Ciclosporin (nebo cyklosporin 28). Různé acylované cyklosporiny skupiny 1a), zejména skupiny 1a1), a skupiny Id) jsou známé. Cyklosporiny 1.1, 1.4, 1.8, 1.9, 1.13, 1.14 a 1.34 jsou takto známé a popsané společně se způsoby jejich výroby, například Traber-em a kol. v Helv. Chim. Acta, 60, 1247 a dále (1977), 65, 1655 a dále (1982), 70, 13 a dále (1987); Kobel-em a kol., Europ. J. Applied ^ Microbiology,'BiotéčKrrolcgy 14, 273 a nasl. ( 1982); a Wartburgem a kol., Progres in Allergy 38, 28 a dále (1986).

Cyklosporiny 1.2, 1.3, 1.5, 1.6, 1.7 a 1.10 jsou nové a tvoří součást vynálezu jako nové sloučeniny. Cyklosporiny 1.2, 1.5 až 1.7 a 1.10 mohou být připraveny pstupy, které jsou analogické s postupy popsanými v odborné literatuře, například prc přípravu cyklosporinu 1.1 acetylací odpovídajících cyklosporinů, ve kterých zbytek v poloze 1 je tvořen zbytkem -MeSmt- nebo zbytkem -dihydro-MeBmt-. Cvklosporinové výchozí látky jsou známé, například v případě cyklosporinů 1.6 a 1.7 ze zveřejněné evropské patentová přihlášky 0 194 972. Cyklosporinové produkty mají následující řysikální charakteristiky:

Fysikální charakteristiky 1.2 [a]o10a -328° (cs0.97 v CHClj) 1.5 -250» (c*L.Q v CHClj) 1.6 [a]aía= -302.6» (c»0.5 v CHClj) —-1.7- . ~ (al5;:a3*-296-.2a-(C30:5-y»CHClT)— 1.10 ta]D:°3 -293a (0=0.55 y CHClj) 25

Jestliže zbytek v poloze 2 cyklosporinové výchozí látky je tvořen beta-hydroxy-alfa-aminokyselinovým zbytkem, napří-

Id-ad—2-b-y-tkem^-T-hr——po-tom-be.t a^iQh^s ku pí n a v této poloze bude _ mít větší tendenci k reakci než 3 -hydroxy-skupina například zbytku -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt- v poloze 1. Cyklosporiny, ve kterých je zbytek v poloze 2, avšak nikoliv zbytek v poloze 1, acylován (jako je tomu v případě skupiny 1b) cyklosporinu, na^xíklad_j/ případě cyklosporinu 1.35), nebo ve kterých jsou oba zbytky v poloze 1 i 2 acylovány (jako je tomu v případě cyklosporinu 1.13 a 1.14 skupiny la^), mohou být takto snadno získány metodami popsanými v odborné literatuře nebo metodami, které jsou analogické s těmito metodami, přičemž se výhodně využívá tohoto relativního rozdílu v reaktivitě. Za účelem přípravy cyklosporinů, ve kterých je poloha 1 3*-0-acylována, avšak ve kterých je v poloze 2 volná beta-OH-skupina (jako je tomu v případě cyklosporinu 1.3) je nejdříve nezbytné chránit uvedenou hydroxy-skupinu v poloze~2—a po acyIaci~zbytku~ v poloze 1 odstranit ochrannou skupinu ze zbytku v poloze 2. V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů je provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací patentových nároků. Příklady provedení vynálezu

Příklad A ' 12 Příprava /3"-O-acetyl-MeBmt/ -/Thr/ -Ciclosporinu (cyklospo-rin 1.3)

Stupeň 1

Zavedení O-ochranné skupiny do zbytku -Thr- v poloze 2 2 /Thr/ -Ciclosporinu · 2 6,09 g /Thr/ -Ciclosporinu se rozpustí ve 25 ml abso- 26 lutního dichlormethanu a 5 ml ethinyletheru, načež se k roztoku přidá 0,2 ml kyseliny trifluoroctové. reakční směs se potom míchá po dobu 20 hodin při okolní teplotě a pod atmosférou dusíku. Reakční směs se vytřepe do chladného 20% vodného roztoku hydrogenuhličitanu draselného, promyje vodou, extrahuje · dichlormethanem, vysuší nad síranem horečnatým, zfiltruje a ^ odpaří. Získaná pěna se přečistí chromatograficky na 440 g silikagelu (0,04-0,06) přičemž se jako eluční soustava použije mm.... směs,.toluenu-a^acetonu· v objemovém poměru 2:1 > ‘a jímá se 500'ml" frakcí. Požadovaný produkt, tj. /Thr-l-methyl-ethoxymethylether/2 Ciclosporin še izoluje z frakcí 26 až 29.

Teplota tání: 76,6 °C.

Stupeň 2 2

Acylace /Thr/ -Ciclosporinu s O-chráneným zbytkem -Thr- v poloze 2

Směs 10,66 g produkru získaného ve stupni 1, 106 ml anhydridu kyseliny octové a 1,22 g 4-dimethylaminopy-ridinu se míchá po dobu 20 hodin při okolní teplotě, načež se vyjme toluenem při teplotě 40 °C. Zbytek se rozpustí ve 400 ml toluenu a extrahuje jednou 250 ml ledové kyseliny octové, jednou 250 ml vody, jednou 200 ml ledového 20% vodného roztoku hydrogenuhličitanu draselného a jednou 250 ml vody. Toluenové extrakty se vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltrují, odpaří a vysuší za vakua, přičemž se získá /3'-O-acetyl-Me-acetyl-MeBmt/ -/Thr-1-methyl-ethoxymethylether/ -Ciclosporin.

Stupeň 3 * 12

Deprotekce /3'-O-acetyl-MeBmt/ -/Thr/ -Ciclosporinu s O-chrá něným zbytkem v poloze 2 . ............... - - 11,38 g produktu získaného ve stupni 2, 80 ml tetra-hydrofuranu a 160 ml 67% kyseliny octové se míchá po dobu 48 • ’% * ·-·<?» Ί ..tfi 4 27 hodin při okolní teplotě pod atmosférou dusíku. Reakční směs se vyjme toluenem, zbytek se rozpustí v toluenu, vytřepe do -2-0=—vod něh o—r-o z.t o ku_hyd rog e n.uh Ličitanu draselného, promvje vodou a toluenové extrakty se vysuší nad síranem hořečnatým a zfiltrují. Filtrát se odpaří a přečistí chromatograficky na 440 g silikagelu (0,04-0,06), přičemž se jako eluční ,, soustava použije směs toluenu a acetonu v objemovém poměru s < 3:j a jímajíse 500 ml frakce. Koncový produkt, tj. /3 -0-acetyl- ,, MeBmt/1-/Thr/^-Ciclosporin se izoluje z frakcí 5 až 9.

Teplota tání: 75,6 °C; * /<£/q°= -275,5 ° (c=0,65 v CHC13).

Cyklosporiny vzorce li' jsou nové a tvoří součást vynálezu jako nové sloučeniny. V souladu s dalším znakem vynálezu tvoří součást vynálezu nová skupina cyklosporinů 1a^ za-hrnující cyklosporiny výše uvedeného vzorce II *. 4 ""

Cyklosporiny skupiny la mohou být připraveny způsoby, které jsou naprosto analogické se způsoby pro přípravu známých cyklosporinů 1.1, 1.4 atd., které již byly uvedeny dříve nebo způsobem, který je analogický se způsobem přípravy cyklospo-rinu 1.3, z odpovídajících cyklosporinů, ve kterých zbytek v poloze 1 je tvořen 2bytkem -MeBmt- nebo zbytkem -dihydro-MeBmt-. Potřebné výchozí látky jsou známé a popsané společně se způsoby jejich přípravy, například v britské patentové přihlášce 2 155 936, patentu US 4 639 434 a ve zveřejněné evropské patentové přihlášce 0 056 782. Jak již bylo uvedeno výše, připraví se cyklosporiny vzorce II', ve kterém W je zbytek beta-hydroxy-(a nikoliv beta-0-acyl-)-alfa-aminokyselinového zbytku, analogicky, například s příkladem A, nejdříve ochranou r polohy 8, potom acylací v poloze 1 a nakonec deprotekcí polohy 8. ' 4

Cyklosporin 1.15 skupiny 1a má následující fysikální charakteristiku: ... „ ......... /<*/«- -272° (0=1,0 v CHCI2) . 28

Cyklosporiny, ve kterých 3'-uhlíkový atom 2bytku v poloze 1 je azidoalkylkarbonyloxy- nebo alkúxykarbonyloxy-sub-stituován, jsou rovněž nové a tvoří součást vynálezu jako nové sloučeniny*

Skupina cyklosporinů tohoto typu zahrnuje cyklosporiny 1a5) ve kterých zbytek v poloze 1 je tvořen zbytkem -3'-0-(C^-C^-alkoxy)-karbony1- nebo -3'-O-tC^-C^-azidoalkyll-karbo-nyl- -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-, tj. zbytkem výše. uvedeného obecného vzorce I, ve kterém ACYL1 znamená skupinu vzorce R^-CO- nebo Rj-O-CO-, ve kterém R'^ znamená -C4-azidoalky-lovou skupinu a R2 znamená C1-C^-alkylovou skupinu. Výhodnými cyklosporiny této skupiny jsou cyklosporiny výše uvedeného vzorce II, ve kterém A znamená zbytek, který byl definován výše pod 1a , B má významy uvedené pro vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-. * Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy cyklospo-rinú skupiny 1a , jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje: a) reakci odpovídajícího cyklospůrinu, ve kterém zbytek v poloze 1 je tvořen zbytkem -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-, se sloučeninou obecného vzorce XII: (XII) (XIII)

R-CO-Q nebo obecného vzorce XIII: r2-o-co-q , » I ilfrÍi wimvmm . — - li· 1« lM«l ^ l ^.......... kde R ^ a R^ mají výše uvedené významy a Q znamená oddělitelnou skupinu.

Obecný substituent Q vhodně znamená atom halogenu nebo i1· 29 skupinu -OH. V případě, Že Q znamená atom halogenu, potom se reakce vhodní provádí například v přítomnosti katalyzátoru, -j-ak-ým—je—n=bu-ty-l-l-i-t hium___Jestliže 0 znamená skupinu -OH, potom se reakce vhodně provádí v přítomnosti aktivačního činidla. Reakce muže být prováděna při teplotách asi -100 až -50 °C, například způsobem popsaným v následujících příkladech B. Příklady B _ _ _ 1) Příprava /3'-O-methoxykarbonyl-MeBmt/1-Ciclosporinu (cyklo-Sporin 1.11) 3,76 ml 1,48M roztoku n-butyllithia ve 3,76 ml hexanu se přidá k 0,87 ml diisopropylaminu v tetrahydrofuranu při teplotě -78 °C a směs se míchá po dobu 30 minut při teplotě -78 °C. Při téže teplotě se přidá 1,0 g Ciclosporinu v 15 ml be z vodého tetrahydrof uranu a~ v míchaní-šě" “pokračuje' _po—dobu~~ dalších 30 minut. Přidá se 0,326 ml methylchlorformiátu a směs se míchá po dobu další hodiny při teplotě -78 °C. Směs se potom nechá ohřát na okolní teplotu. Přidá se 10 ml vody a podstatný podíl tetrahydrofuranu se odstraní odpařením. Zbytek se vyjme 100 ml ethyletheru a 50 ml vody, vodná vrstva se oddělí a extrahuje dvakrát diethyletherem. Sloučené organické extrakty se vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří k suchu. Zbytek se přečistí chromatograficky na silikagelu, přičemž se jako eluční činidlo použije ethylacetát. Z odpovídajících frakcí eluátu se izoluje požadovaná sloučenina. / CC/l° = -234° (c = 1,0 v CHC13). 2) Příprava /3*-0-(4-azidobutanoyl)-MeBmt/^-Cyclosporinu {cyklosporin 1.12) 7,74 g kyseliny gama-azidomáselné, 8,6 g 4-dimethyl-aminopyridinu á 5,11 g Mullayamaova činidla (2-chlor-1-*me-thylpyridiniumjodidj se přidá ke 12,02 g Ciclosporinu ve 200 ml absolutního dichlormethanu a reakční směs se míchá 30 po dobu 90 hodin při okolní teplotě. Získaný produkt se zředí dichlormethanem, vytřepe do 100 ml Ledové vody, 10% rozteku hydroxidu sodného, 200 ml vody a 200 ml 10% vodného roztoku kyseliny octové, promyje vodou a organické fáze se vysuší nad síranem sodným. Filtrát se odpaří a opětovně vysuší. Produkt se přečistí chromatograficky na 1,2 kg silikagelu (0,04-0,06 mm), přičemž se jako eluční směs použije směs hexanu a acetonu v objemovém poměru 3:1 a jímají se -300 ml frakce. Požadovaná sloučenina se izoluje z frakcí 23 až^27. .. „ /o£/*° = -289,8° (c = 0,5 v CHClj). Předmětem vynalezu je rovněž způsob přípravy cyklo-2 sporinú skupiny 1a ), jehož podstata spočívá v tom, že: t

b) se acyluje odpovídající cyklosporin, ve kterém zbytek v poloze 1 je zbytkem -8 -C^-Cg-alkoxy-cis-MeBmt- nebo -8*-C-j-Cg-alkoxy-dihydro-MeBmt obecného vzorce XIV

I

s° (R) ca (217) -M - Ca - CO-I (S) C3j ve kterém -x-y- a mají.významy uvedené výše pro vzorec IV,, přičemž se například acyluje cyklosporin vzorce II, ve - kterém A znamená.zbytek vzorce XIV, B má významy uvedené pro

31

vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-, například reakcí se sloučeninou obecného vzorce XV (XV)

R5-CO-Q ve kterém 2namená alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atomy á~Q znamená' oddělitelnou 'skupinu /‘například atom~hal-oge-nu, nebo

c) za účelem přípravy cyklosporinu 1a , ve kterém je zbytek v poloze 1 tvořen -3 '-O-acyl-8 -C1-Cg-alkoxy-cis-MeBmt-zbytkem výše uvedeného vzorce IV, ve kterém -χ-y- znamená -CH=CH-, R Ί * má význam uvedený pro vzorec IV a ACYL znamená acylovou 0-ochrannou skupinu, například acetylovou skupinu, se cyklospo-rin, ve kterém zbytek v poloze 1 je tvořen zbytkem -3 -0-acyl-5 "-žes~(TrpřdpěňyT)~5~-'fcřrrnyT=M'eBmt-—obe-cného-vzorce —XVI—-—-- 5 CSí

XCH (XVI) -m - ca - co- t (S) CSj ve kterém R,^ znamená acylovou 0-ochrannou skupinu, například acetylovou skupinu, například cyklosporin vzorce II, ve kterém A znamená zbytek výše uvedeného obecného vzorce χνΐ, b má význa my uvedené pro obecný vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená 32

-Val-/ uvede v reakci se sloučeninou obecného vzorce XVII

(XVIIJ a. 5 R: a.. ¥i ve kterém každý ^ znamená fenylovou skupinu nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atomy a má význam uvedený pro o’decný vzorec IV.

Reakce oodle výše uvedeného stupně c) může být prováděna standardními postupy používanými pro provedení Wittigovy reakce, například za bezvodýcn podmínek, například v inertním rozpouštědle nebo ředidle, jakým je‘absolutní benzen, tetra-hydrofuran, diethylether nebo toluen, při teplotě asi -80 až 20 °C, případně v přítomnosti soli, například halogenidu alkalického kovu. Reakce může být vhodně prováděna pod inertní ' atmosférou.

Cyklosporinové výchozí látky potřebné pro stupeň c) mohou být získány z odpovídá jících'cyklospirinú, ve kterých zbytek v poloze 1 je tvořen zbytkem -3'-O-acyl-chráněný-MeBmt-, například -3 "-O-acetyl-MeBmt-zbytkem, d) ozonolýzou a zpracováním bezprostředně získaného ozo-nolýzového produktu mírným redukčním činidlem.

Ozonolýža ve stupni d) může být provedena standardními postupy, například v ozonizátoru v přítomnosti'například ethyl-acetátu nebo dicnlormethanu při teplotě asi -90 až asi -40 °C. Vhodným mírným redukčním činidlem je dimetnylsulfid. Ozono-lýza a zpracování mírným redukčním činidlem se vhodně provádí v jediné reakční nádobě, jak je to například popsáno v násle-" dujících příkladech C.. Výchozími látkami pro stupeň d) jsou cyklosporiny sku- - 33 - piny 1a^, které jsou bud známými sloučeninami nebo mohou být připraveny dříve popsanými postupy.

Reakční stupeň b) může být prováděn analogicky s postupy pro přípravu cyklosporinů skupin 1a^ a 1b, které již byly popsány v předcházejícím textu, například za použití odkazů na příslušnou odbornou literaturu. Obdobně mohou být cyklospo-riny skupiny 1a mající v poloze 2 volný beta-hydroxy-alfa-ami-nokyselinový zbytek, například zbytek - Thr-, připraveny předběžnou ochranou a následnou deprotekcí beta-OH-skupiny, přičemž se například použije postup, který je analogický s postupy , které byly například popsány v souvislosti s výše uvedeným příkladem A. Výchozí látky pro reakční stupeň b) mohou být získány: e) deprotekcí odpovídajícího cyklosporinů, ve kterém zby

Cy-C-g - a-lko xy-c-is-Me Bmt— tek—1v—po-l-oze—'I—j e—tvořen—zbytkem—8- nebo zbytkem -8'-Cl-Cg-alkoxy-dihydro-MeBmt- v 3 '-O-chráněné formě, nebo f) redukcí odpovídajícího cyklosporinů, ve kterém zbytek v poloze 1 je tvořen zbytkem -8-Cg-alkoxy-cis-MeBmt- ve volné nebo 3 -O-chráněné formě a případným provedením stupně e).

Vhodné 3"-O-ochranné skupiny ve výchozích látkách pro reakční stupeň e) zahrnují všechny známé ochranné skupiny používané v chemii peptidů včetně acylových a etherových ochranných skupin. Výchozí látky pro reakční stupeň e) takto zahrnují dříve popsané produkty reakčního stupně .c). Odpovídající výchozí látky, ve kterých 3 -O-oqhranná skupina je jiná než acylová skupina, mohou být získány analogicky s reakčními stupni d) a c) z odpovídajících 3 -O-chráněnných cyklosporinů.

Samotný reakční stupeň e) může být proveden postupy, které jsou obecně používané v oboru chemie peptidů, například hydrolýzou v přítomnosti báze, jakou je alkoxid alkalického kovu nebo uhličitan alkalického kovu, za účelem odstranění acetylových ochranných skupin, nebo hydrolytickým etherovým štěpením, například v přítomnosti kyseliny trifluoroctové nebo 34 kyseliny chlorovodíkové, za účelem odstraní ochranných etherových skupin, reakční stupeň e) se vhodně provádí při teplotě asi -20 až asi 20 °C, jak to bude například popsáno dále v příkladech D.

Reakční stupeň f) může být rovněž proveden analogicky se známými postupy, používanými například pro redukci přírodně se vyskytujících cyklosporinů na odpovídající, dihydrocyklospori-ny, například katalytickou hydrogenaci) například analocky s obecnými postupy, popsanými v britském patentovém spisu ,1 567201. Tato hydrogenace se vhodně provádí za neutrálních hodnot pH při teplotě asi 20 až asi 30 °C a při atmosférickém nebo při mírně zvýšeném tlaku v přítomnosti katalyzátoru, jakým je platina nebo výhodně paladium (například paladium na uhlí), v přítomnosti inertního rozpouštědla nebo ředidla, jakým je ethylacetát nebo nižší alifatický alkanol, jakým je methanol a isopropanol.

Cyklosporinové výchozí látky pro reakční stupeň b) jsou rovněž nové a tvoří takto součást vynálezu jako nové sloučeniny. V rámci dalšího znaku vynálezu jsou předmětem vynálezu rovněž cyklosporiny následující skupiny.

Skupina 4

Cyklosporin, ve kterém je zbytek v poloze 1 tvořen zbytkem -8 -alkoxy-cis-MeBmt- nebo zbytkem -8 -C.-CQ-alkoxy-

i O dihydro-MeBmt- výše uvedeného obecného vzorce XIV. Výhodnými cyklosporiny této skupiny jsou cyklosporiny obecného vzorce II definovaného pro reakční stupeň b).

Kromě toho, že jsou použitelné jako meziprodukty, mají cyklosporiny skupiny 4 rovněž například dále popsanou imuno-supresivní, protizánětovou a protiparazitickou účinnost. Tyto iíiwwii .-a—w;i irilMi-Íinwio—lilium 1 mih tu·»» n mumi—tmu miiuwpiwi^mwwmmu·· cyklosporiny jsou tedy samotné použitelné jako chemoterapeu-tická činidla.

Cyklosporiny skupiny 4 rovněž zvyšují citlivost vůči terapii chemoterapeutickými činindly nebo zvyšují účinnost 35 - terapie chemoterapeutickými činidly a zejména potlačují resis-tenci vůči chemoterapeutickým činidlům, například rasistenci vůči antineoplastické nebo cytostatické chemoterapii, jako je tomu v případě cyklosporinú tříd 1 až 3. Nicméně vzhledem k , jejich vlastním imunosupresivním vlastnostem jsou cyklosporiny skupiny 4 obecně méně vhodné pro použití při takových indika-, cích. ..Cyklosporinové výchozí látky pro reakční stupeň.·c) jsou rovněž nové a tvoří takto součást vynálezu jako nové sloučeniny. Tyto výchozí látky mohou být samozřejmě podrobeny deprotek-ci a/nebo reprotekci, například za účelem-manipulace, transortu nebo skladování, což muže být provedeno postupy, které jsou be ne známé a používané. V rámci dalšího znaku vynálezu jsou předmětem vynálezu rovněž cyklosporiny následující skupiny. Skup?· na 5

JN

Cyklosporin, ve kterém je zbytek v, poloze 1 tvořen zbytkem -5 -des-(1-propenyl)-5'-formyl-MeSmt- ve volné nebo 3 -O-chráněnné formě, například zbytkem obecného vzorce XVIII

0 II C CH:

Rn-0V (3) ,cs\ / X CH (R)XCH3 (XVIII) -n—ch-οο- Ι (S) CH, vherain is hydrojen oř an O-procaccinj jroup. ve kterém R12 znamená atom vodíku nebo O-ochrannou skupinu. 36 - Výhodnými ochrannými skupinami ve významu obecného sub-stituentu Rj2 jsou acylové O-ochranné skupiny, například ace-tylová-skupina. výTiodřTýnri^čylčiošpo^riny-ťé't'o~skupřny—j-sOu-cykl-o-sporiny výše uvedeného obecného vzorce II, ve kterém A znamená zbytek výše uvedeného obecného vzorce XVIII, B má významy uvedené pro obecný vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-. Jestliže 1^2 znamená atom vodíku, potom zbytek obecného vzorce rovněž~existu je~v~cykTícke^TTautorněrrTí "fdřmé~vzorce' "XVTIIt*

OH

CH CH, CH ffn CH3 (XVIII') -N-CH—CO- I (S) C5j

Je samozřejmé, že takové tautomery rovněž spadají do rozsahu vynálezu, například v rámci výše uvedené skupiny 5 cyklospori-nú. Následující příklady se vztahují k výše uvedeným postu- 2 pum pro přípravu cyklosporinú skupiny 1a a skupin 4 a 5. Přiklaď C .......... · Příprava cyklosporinú skupiny 1a 2 Příprava /3"-O-acetyl-8"-methoxy-cis-MeBmt/^-Ciclosporinu .(cyklosporin 1.16) 37 - 16 g methoxymethyltrifenylfosfoniumbromidu se suspenduje ve 270 ml absolutního tetrahydrofuranu pod argonovou atmosférou a získaná suspenze se chladí na teplotu -75 °C. Přidá se roztok 5 g terč.butoxidu draselného ve 200 ml absolutního tetrahydrofuranu, přičemž tento přídavek se provádí po kapkách v průběhu 30 minut. Získaná směs se míchá po dobu dvou hodin, načež se k ní po kapkách a v průběhu 20 minut přidá roztok /3 '-0.-acetyl-5 *-des-( 1-prpenyl)-5 '-formyl-MeBmt/1-Ciclospo-rinu" ve''25 ’ml“ťetrahydrof uranu. Reakční "směs ' se míchá při okolní teplotě po dobu 4 hodin, načež se k ní přidá 400 'ml ethylace-tátu. Extrakty se promyjí 2N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným roztokem solanky. Zahuštěný filtrát se potom chro-matografuje na 1,2 kg a 0,44 kg silikagelu (0,04 až 0,063 mm), přičemž se jako eluční soustava použije směs 10 až 40% roztoku chloroformu v acetonu a ethylacetátu. Z odpovídajících frakcí, eluátu se izoluje požadovaná sloučenina. /cC/q° = "267° (c = 0,53 v CHCl^).

Cyklosporiny 1.17 až 1.21 mohou být připraveny analogickým způsobem. Tyto cyklosporiny mají následující fysikální charakteristiky:

' Fysikální charakteristiky 1.17 (o]D30 = -283° (c= 0.544 v CHClj) j 1.18 [a]o20 =-209.1° (c= 0.605 ;v CHCI,) 1.19 [a]0í0 = -282.96° (c= 0.405 v CHClj) | 1 J 1.20 ía]D2C => -268° (c= 0.615 v CHClj) 1..... 1.21 [ctJo20 = -248.7“ (C= 0.65 v CHClj) 38 Výchozí látka pro výše uvedený postup, kterým je cyklo-sporin skupiny 5, se připraví následujícím způsobem. Příprava /3 -O-acetyl-5 -des-(1-propenyl)-5 -formyl-MeBmt/1~ Ciclosporinu {cyklosporin 5.1) 48,5 g /3 -O-acetyl-MeBmt/1-cyclosporinu v 70 ml ethyl-a-eet-á-t-tt--s-e-O2-on-i-z-u4e-po--dobu ~4.5-..niinat-při.. .t.e?I.o.ta_r:7 0.. °C. za _ užití Fischerova ozonového generátoru oři tlaku 0,04 MPa a průtoku 110 1/h, Získaný roztok se prožene dusíkem, načež se k němu přidá 9,8 ml dimethylsulfoxidu. Roztok se potom míchá při pokojové teplotě po dobu dvou hodin, načež se zahustí odpaře- . ním, dvakrát promyje benzenem a vysuší za hlubokého vakua, při-čemž se získá požadovaný produkt. Ten se přímo použije k další reakci bez dalšího čištění, /-Ct/|--=-—3-0-2— (-c-=-1-,-1-3.~v^CHC-ly)----------------

Analogickým způsobem se získají následující cyklospori-ny: 5.2 ' (3'-0-acecyl-5'-des-(I-propenyl)-5' -fornyl-Mearatl^-tO-acscyl -Thr]1- Ciclosporin: (aja2a s -272.6’ (c* 0.504 v CHCI]), t.t.= 156-160’ 5.3 [3'-Q-acecyl-S'-des-(l-propenyl)-5' -ťoruyl-Meamc11 - [Val ]:--Ciclosporin: [ala2a -306’ (c=l-Q3 v CHC13), t.t.» 163-170’ 5.4 (3'-0-acecyl-5' -des-(l-propenyl)-5' - £0 rmyl-fíeBnt c ] - [Nva. 12 -Ciclosporin: [a]02° = -291.76’ (c= 0.51 v CHClj).

Příklady D Příprava cyklosporinů třídy 4 Příprava /8"-methoxy-cis-MeBmt/^-cicklosporinu (cyklosporin 4.1) 39 4 g cyklosporinu 1.16 (z příkladu C) ve 41 ml směsi methanolu a vody v objemovém poměru 5:1 se 2ahřívá za míchání s 3/5 g uhličitanu draselného na okolní teplotu. Po 21 hodinách se ochlazený roztok okyselí 10% roztokem kyseliny vinné a třikrát extrahuje chloroformem. Extrakty se promyjí nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou a vysuší nad síranem sodným a zahustí. Po chromatografii na 220 g sili-kagelu, při které se jako eluční soustava použ.ije směs ethyl.-ďcetátu"a'‘hexanu ve'formě'100 až 20% roztoku hexanu v* ethvl- - i * acetátu, se z příslušných frakcí eluátu získá požadovaná sloučenina, /CL/p° =’ -239° (c = 0/53 v CHCl-j).

Analogickým způsobem se získají následující cyklospori-

V ny; 4.2 (8'-c.Butoxy-cis-HeBn!:]'--Ciclosporin: (ajj25 = -228* (c = 0.5 V; CHCI,); * 4.3 [8'-Hethoxy-cis-Me3mc]l-[Thr]2-Ciclospocin: [ajan = -220’ (c = 0.37 v CHCI]); 4.4 [8'-t.Bucoxy-cis-Me3mE]l-tThr]2-Cicíospocin: (alaja * -221’ (c - 0.43 v CHCI]); 4.5 18'-HeChoxy-cis-HeBmtJ1-[Val|2-Ciclosaorin: [ala20 * -241’ (c = 0.54 v CHCI]); 4.6 [8'-Hethoxy-cis-He3nt]1-[říva]I-Ciclosporin: [ala23 = -236’ (c = 0-634 v CHCI]);

302 mg cyklosporinu 4.1 se rozpustí v 10 ml absolutního ethanolu a takto získaný roztok se hydrogenuje při okolní teplo- 40 - tě a 2a atmosférického tlaku v přítomnosti 5% paladia na uhlí. Po spotřebování teoretického množství vodíku (50 minut)· se ka- ta 1 y z a tcrr —odděl·!-fi~l· trac í—p řes-h y-H-o-a—f-i-l-tHT-á-t—s e-od paří _z.a- sníženého tlaku. Zbytek se chromatografuje na 70 g silikagelu (0 = 0,0 T 5 mm), přičemž se jako eluční soustava použije směs hexanu a acetonu v objemovém poměru 1:1, Z odpovídajících frakcí eluátu se potom izoluje požadovaná sloučenina. 7^7 Q —2'9’°”( c~=' Ό T5'2 ~v~C HCly)*.— r--------------------—

Analogickým způsobem se získají následující cyklospori- ny: 4.0 [3 -Machoxy-dihydco-Heamc]1-[TheJz-Ciclosporin: (aj02° = -217.5° (c = 0.32 v CHClj); -223.6° (c * 0.53 v CHClj); t 4.10 [8' -Mechoxy-dihydra-MeBini: ]1-[Nva]2-Ciclosporin: (a]oí0 = ‘ -221.5° (c - 0.594 v CHClj) Výše uvedené cyklosporiny skupiny 1a jsou rovněž nové a tvoří takto součást vynálezu jako nové sloučeniny,. Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy cyklospo-rinú skupiny la^, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje: g) acylaci odpovídajícího cyklosporinu, ve kterém zbytek v poloze 1 je tvořen zbytkem -cis-MeBmt-, zbytkem -7 "-desmethyl 7'-hydrokarbyl- -MeBmt- nebo -cis-MeBmt-, ve kterém hydrokarby-lový zbytek obsahuje alespoň'dva uhlíkové atomy, nebo zbytkem *7 * -desmethyl-7 '-hydrokarbyl-dihydro-MeBmt-, ve kterém hydro-..karbyl.ový. zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atomy a ve kterém každá alifatická skupina přítomná v uvedeném hydrokar-bylovém zbytku nebo tvořící uvedený hydrokarbylový zbytek je nasycenou skupinou, přičemž uvedený zbytek může mít obecný

41 vzorec XIX a*

min i i o UK . CHj 'CK, C<IX) (R)

I -N - CS - C0- I (S) CHj ve kterém -x-y- a Rg mají výša-uvedený význam·pro obecný vzorec V, například acylaci cyklosporinu výše uvedeného obecného vzorce II, ve kterém A znamená zbytek výše uvedeného obecného vzorce XIX, B má významy uvedené pro obecný vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-, například reakcí se sloučeninou výše uvedeného obecného vzorce XV, nebo h) za účelem přípravy cyklosporinu skupiny 1a^, ve kterém je zbytek v poloze 1 tvořen zbytkem -3"-O-acyl-cis-MeBmt-, kde acylový zbytek je acylovou O-ochrannou skupinou, nebo zbytkem -7"-desmethyl-7'-hydrokarbyl- MeBmt- nebo -cis-MeBmt-, ve kterém hydrokarbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atomy a ve kterém Q-acylový zbytek je tvořen acylovou O-ochrannou skupinou, přičemž uvedený zbytek-může mít výše.uvedený vzorec v, ve kterém -x-y- znamená cis nebo trans -CH=CH~, R, má význam 1 ® a.uvedený .projpbecný vzorec^V^a,, AČYL^znamená(lacylovqu».0rochrany nou skupinu, například acetylovou skupinu, reakci cyklosporinu, ve kterém je zbytek v poloze 1 tvořen zbytkem -3 -0-acyl-5 des-(l-propenyl)-5^-formyl-MeBmt- výše uvedeného vzorce XVI, například cyklosporinu výše uvedeného obecného vzorce II, ve 42 kterém A znamená zbytek výše uvedeného vzorce XVI, B má významy uvedené pro obecný vzorec II,,X znamená -Sar- a Y znamená -Val-, se sloučeninou o'becné'h"o—vzorce-XX---- CH-Rs' (XX)

Ru—P = -Rri-- ve kterém každý R^ znamená fenylovou skupinu nebo alkylovou skupinu s.l až 4 uhlíkovými atomy a R*g znamená hydrokarbylo-vou skupinu s alespoň 2 uhlíkovými atomy, a případnou izolaci .p_ozadovaného reakčníno produktu.

Reakční stupně g) a h) mohou být provedeny přesně analogicky s výše uvedenými reakčními stupni b) a c), například způsobem popsaným v dále uvedených příkladech E. Výchozí látky pro reakční stupeň g) mohou být získány postupem, který je naprosto analogický s postupem uvedeným ve výše uvedených re-akčních stupních e) nebo f) a který zahrnuje: i) deprotekci odpovídajícího cyklosporinu, ve kterém je zbytek v poloze 1 tvořen zbytkem -3 -O-acyl-cis-MeBmt- nebo zbytkem -7"-desmethyl-7^-hydrokarbyl- -MeBmt- nebo -cis-Me3mt-, ve kterém hydrokarbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atomy, přičemž uvedený zbytek je v 3 '-O-chráněnné formě, nebo j) redukci odpovídajícího cyklosporinu, ve kterém je zby tek v poloze 1 tvořen zbytkem -7y-desmethyl-7'-hydrokarbyl--MeBmt- nebo -cis-MeBmt-, přičemž uvedený zbytek je ve volné nebo 3’-O-chráněné formě, a případné provedení reakčníno stupně i). -..... _ .......

Vhodné 3 -O-ochranné skupiny jsou popsané výše v souvislosti s reakční stupni e) a f). Při provádění stupně j) 43 dojde k redukci jak nenasycených vazeb hydrokarbylového zbytku, tak i skupiny -x-y-. Alternativně může být cyklosporinový výchozí produkt, ve kterém je zbytek v poloze 1 tvořen zbytkem -cis-MeBmt-, získán v souladu s celkovým syntetickým způsobem přípravy cyklosporinú, který je například popsán ve zveřejněné evropské patentové přihlášce 0 034 567 nebo v patentu US 4 369' 542 . Výchozí cyklosporinové látky pro reakční stupeň g), ve kterých je zbytek- v poloze 1 jiný než -cis-MeBmt-, jsou rovněž ^ nové a tvoří takto součást vynálezu jako nové sloučeniny. V rámci dalšího znaku vynálezu jsou předmětem vynálezu rovněž cyklosporiny následující skupiny.

Skupina 6

Cyklosporin, ve kterém je zbytek v poloze 1 tvořen zbytkem -7 -desmethyl-7’-hydrokarbyl-· -Me3mt- nebo -cis-MeBmt—, ve kterém hydrokarhylový zbytek obsah··;·je alespoň dva uhlíková' atomy, nebo zbytkem -7 -desmethyl-7"-hydrokarbyl-dihydro-MeBmt-, ve kterém hydrokarhylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atomy_ a ve kterém každá alifatická skupina přítomná v hydrokarby-lovám zbytku nebo tvořící hydrokarhylový zbytek je nasycenou skupinou, přičemž uvedený zbytek může mít obecný vzorec XIX x

ao (R) CH

-M - CH - C0- I (5) ca'3 (XIX') 44 ve kterém x-y- znamená cis nebo trans -CH=CH- nebo a_Rg/ znamená hydrokarbylovou skupinu mající alespoň dva uhlíkové atomy, s výhradou spočívající v tom, že -x-y- znamen"á~CH~- C Hy potom každá alifatická skupina přítomná v obecném substituentu Rg"" nebo tvořící obecný substituent Rg" * je nasycenou skupinou. Výhodnými cyklosporiny této skupiny jsou cyklosporiny obecného vzorce II, ve kterém A znamená zbytek výše uvedeného obecného vzorce XIX, B má významy uvedené prčTobečný'vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-.

Kromě toho, že jsou použitelné jako meziprodukty, · mají cyklosporiny třídy 6 rovněž výše popsanou imunosupresivní, pro-tizánětovou a antiparazitickou účinnost. Tyto cyklosporiny jsou' tedy samotné použitelné jako chemoterapeutická činidla;

Cyklosporiny skupiny 6 rovněž zvyšují citlivost vůči tera p ři—c h emot- er-a-ρeu-tickými—činidl.y__nebo zvyšují účinnost tera pie chemoterapeutickými činidly, zejména potlačují resistenci vůči chemoterapeutickým činidlům, například /vůči antineoplas-tickým nebo cytostatickým chemoterapeutickým činidlům, jak to již bylo diskutováno v souvislosti s cyklosporiny skupin 1 až 3. Vzhledem například k jejich vlastním imunosupresivním vlastnostem však tyto cyklosporiny skupiny 6 jsou méně vhodné pro použití při těchto indikacích. 3de popsané a příkladované cyklosporiny, ve kterých je zbytek v poloze 1 tvořen zbytkem -cis-MeBmt-, jsou formálně nové, jakkoliv spadají do rozsahu výše uvedené zveřejněné evropské patentové přihlášky 0 034 567 a patentu US 4 .369 542. Následující příklady ilustrují výše uvedené způsoby pro 3 přípravu cyklosporinů skupiny 1a a skupiny 6.

Příklady E Příprava /3'-O-acetyl-7"-desmethyl-7 '-fenyl-MeBmt/^-Cyclospo-rinu (cyklosporin 1.22) a /3"-O-acetyl-7"-desmetyl-?‘-fenyl- 45 cis-MeBmt/1-Ciclosporinu (cyklosporin 1.27) 9,5 g Benzyltrifenylfosfoniumchloridu se rozpustí ve 150 ml bezvodého benzenu a tento roztok se potom zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 24 hodin s 2,7 g terc.bu-toxidu draselného, přičemž se použije odlučovače vody. Po ochlazení se suspenze zfiltruje do nové baňky pod inertní atmosférou. Přidá se 5 g cyklosporinu 5.1 (příklady C) v 50 ml benzenu, přičež-tento přídavek je rozvržen na^dobu 5~minut. Po 21' hodinách při okolní teplotě se reakční směs nalije na led, organická fáze se promyje 2N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové, vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou, vysuší' nad síranem sodným a odpaří. Zbytek se dvakrát chroma-tografuje na 440 g silikagelu (0,04-0,063 mm), přičemž se jako eluční soustava použije chloroform obsahující 8 až 30 1. objemových dílů acetonu. Frakce 2 obsahuje cyklosporin 1.27, zatímco frakce 5 až 15 obsahují cyklosporin 1.22. 'analogickýmzpůsobem mohou být připraveny cyklosporiny 1.23 až 1.26 a 1.28 až 1.34. Tyto cyklosporiny mají následující fysikální charakteristiky:

Fysikální charakteristiky 1-22- - Mo20 = -2lQ.9e(c= 1.37 .v CSClj) 1-23 [aj0*0= -234.9°(c> 0.89 v CHClj) 1-24 (a|02<J= -243.97°(C= 1.17 v CHClj) 1.25 (a]oí0= -237.3a(c- 0.39 v CSC13) ^ 1* 26*1*1*1* laster 1740 NMR.IR j v CSjCLz .Ucecát 1230 -46- 1.27 (a]o10= -235.8°(c= 1.0 v CHClj) . J i 1.28 (a|o30 -220°(c= 1.75 v CHClj) l l i * • * 1.29 [a|330« -239.07a(c= 0.97 v CHClj) 1.30 {a]oí0= -207.-8°(c= 1.25 v CHClj) .. . \ 1.31 (a|0í0= -239.6°(c= 0.91 v CHClj) 1.32 ma.iR, Escac 1746 Acecát 1228 v CC14 , MH" 1271 - 1.33 ř Escer 1745 ma.IRj Acecác 1225 v CC14 1 MH- 127.1 1.34 [<=] 0 23 = -226.23°(c= 1.447 v CHClj) -—-----------------j

Příklady F Příprava cyklosporinů třídy 6 Příprava-/7"-desmethyl-7 "-fenyl-MeEmt/^-Ciclosporinu (cykio-sporin 6.1) 2,29 g cyklosporinů 1,22 získaného výše uvedeným způsobem se rozpustí ve 20 ml směsi vody a methanolu v objemovém poměru 1:4,5) obsahující 1,67 g uhličitanu draselného. Po 20 hodinách^při. okolní _teplotě^se reakcní směs nalije na led obsahující 10% kyselinnu vinnou a extrahuje chloroformem. Surový extrakt se chromatografuje na 120 g silikagelu (0,04-Q,063mm), přičemž se jako'"eTuční soustava'použije-dichlonnethan obsahu- - -

I jící vzrůstající množství (20 až 30 %) acetonu. 2 příslušných frakcí eluátu se izoluje požadovaná sloučenina. /0Í/D° = “209° (c = 0,99 v chc13 1 * 47

Analogickým způsobem se získají následující cyklosporiny; 6.2 ^'-Desmethyl^-fenyl-cis-MeBmt^-Ciclosporin: [oe]020 =. -236® (c - 1 v CHClj); 6.3 [7'-Desmethyl-7'-vinyl-cis-HeBmt]l-CÍclosporin: [a]D20 - -249° í’ (c -1.17 v CHClj); .... *·(.**-* II i·* 01* » I*· Ί*· - I* ιι>·'' 6.4 (7,-Desmethyl“7'-vinyl-cis-HeBmtJl-[Thr]:-Ciclosporin: [a]D20 * -248° (c - 1.44 v CHClj); 6.5 [7'-Desmethyl-7'-(3-methyl-n.bucyl)-cis-KeBrat]1-Ciclosporin: [a]D20 - -240° (c - 1.15 v CHClj); 6.6 [7'-Desmethyl-7'-n.propyl-cis-MeBmt]l-Ciclosporin: [a]D20 » -220° (c'- 1.75 v CHClj); 6.7 [7,-Desmethyl-7,-(B-allyl)-cis-HeBnitJl-Clclosporin: [a)020 --239° (c - 0.97 v CHClj); 6.8 [7'-Desmethyl-7'·- fenyl-MeBmt] l-[Val]2-Ciclosporin: [a]D:o --208° (c « 1.025 v CHClj); 6.9 [7'-Desmethyl-7'-f en,yl -cis-HeBmtlMVal^-Ciclosporin:' [a]D20 =. -240° (c - 0.91 v CHClj); -«MMk -i: ^ *«·- — - i 6.10 (7'-Desmethyl-7'“Vinyl-cis-HeBrat]'l“[Val]2-Ciclosporin: [ct|020 - > -254.8° (c - 0.48 vCHClj); -1 i [7,-Desmethyl-7'-vinyl-cis-HeBmt]1-INva]2-Ciclosporin: [a]D20 = -246.1° (c - 0.52 v CHClj); 6.12 [7'-Desmethyl-7'-(3-brom -n.propyl)-cis-HeBmt^-Ciclosporin: jr Λ -^Ki inirtiiiiitrii I*·»—.[--«Id 1S-"· -r-2261» (c.°> 1.44 fc-V*» CHClj ) j I ' —«- ............... "*'*"*- ‘'ιιρ|1*·

Deprotekce cyklosporinu 1.23 vede k získání [cis-MeBmt^-Ciclosporinu: 48 / 0C/D = -235 (c = 0,9 v CHCl^). Příprava /7 -desmethyl-7*-fenyl-dihydro-MeBmt/^-Ciclosporinu (cyklosporin 6.13) 796 mg směsi cyklosporinú 6.1 a 6.2 se hydrogenuje v 50 ml ethanolu v přítomnosti 100 mg 10% paladia na uhlí při okolní teplotě po dobu- 6 -hodin. Po odfiltrování hydrogenační ' „ «*· J. W * jm Μ *· *“ —'!m - směsi přes Hyflo za účelem odstranění katalyzátoru se získá požadovaná sloučenina. /CC/20 = -210° (c = 0,7 v CHC13).

Analogickým způsobem se získají následující cyklospo- riny: 6.li (7,-OesnieCÍiyl-7'-r\.pcopyl-<iihydro-He3nt]l-Ciclosporin: [0)3?’ = -138° (c =» 6.16 v CHCI3), získaný z cyklosporinuó.6nán6.7; 6.15 [7'-pesÍnechyl-7'-echyI-dlhydro-MeBmt p-fThrJ^Ciclosporin: [a].:30 = -224° (c = 0.4 v CHCI]), získaný z cyklosporinú 6.4; 6.16 [T -0esmet:hyl-7' -(3-<iiethyl-n.bucyl)-dihydro-ř.e8(sic ]-Ciclosporin: [al3:í 3 -222” (c = 0.995 v CHCI]), získaný z cyklosporinú 6.5; 6.17 [7'-Desniethyl-7,-i.prapyl-dihydro-Meflmc]l-Ciclosporin: [a|321 3 -229° (c * 1.32 v CHClj); 6.13 [V -Desmechyl-7'-achy1-dihydro-MeBmc]L-[Val]3-Ciclosporin: fct1020 = -232-9® (c = 0.43 v CHCI]), získaný z cyklosporinú 6.10; * -’**6t,L9“-'[7'tDesáechýl-7'-ěchyl^dihýdřó-MeBmt I l-'fNva] 3^0Ϊς1ο3ροΓίη: * 'r”T' [aJ3Ifl - -227.29® (c * 0.54 v CHClj), získaný z cyklosporinú 6.11; - 49 - 6.20 (7'-Oes.'nachyl-7' - f ariy l-d ihydro-Me3.7. c j * -J Val ]1 -Ciclosporin: [a|:25 = -214° (c - 1.19 v CHCI]), získaný z cyklosporinu 6-3 ndboó.9; 6.2L [7' -Das-^echy 1-7' - echyl-dihydro-HeBnu ]1 -Ciclosporin: [ajaJa - -233a (c - 1.15 v CHCI]), získaný z cyklosporinu6.3; 2 3

Jak bude zřejmé, jsou cyklosporiny skupin la a 1a a skupin 4, 5 a 6, které jsou všechny novými sloučeninami, strukturně podobné a mohou být takto za účelem zjednodušení zařazeny do sjednocených kategorií, například do kategorie cyklosporinu, ve kterých má zbytek v poloze 1 obecný vzorec XXI (XXI) 50 - 2 3

Stejne tak cyklosporiny skupin 1a a 1a a skupin 4 a 6, které jsou všechny novými sloučeninami a mají i jinou použitelnost než jako meziprodukty, mohou být zařazeny do sjednocujících podkategorií, například do podkategorie zahrnující cyklosporiny, ve kterých je zbytek v poloze 1 tvořen zbytkem výše uvedeného obecného vzorce XXI, ve kterém R& a mají významy uvedené pod ii) pro obecný vzorec XXI. 1 Acylovými,skupinami, ve^významu .obecného substituentu*·* -*"**·» jsou výhodně skupiny ACYL , které byly definovány v souvislosti s vzorci III a IV, zejména alkylkarbonylová skupina, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, například ace-tylová .skupina. Výhodnými cyklosporiny takových kategorií a podkategorií jsou cyklosporiny výše uvedeného obecného vzorce II, ve kterém A znamená zbytek vzorce XXI, který byl definován výše a B má významy uvedené pro obecný vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-. Různé cyklosporiny výše uvedené skupiny 1b), například cyklosporiny, ve kterých zbytek v poloze 2 je tvořen zbytkem φ *5 výše uvedeného vzorce III, ve kterém ACYIT znamená acetylovou skupinu, jsou známé. Tak například cyklosporin Ί.35 je znám a byl společně se způsoby jeho přípravy popsán Traber-em a kol. v Helv. Chim. Acta, 60, 1247 a dále (1977). Ostatní cyklosporiny skupiny 1b mohou být připraveny analogickým způsobem. Cyklo- -sporin 1.36 je však zcela nového typu. V souladu s dalším znakem vynálezu je předmětem vynálezu ještě další následující skupina cyklosporinú.

Skupina 1e) i) Diester dikarboxylové kyseliny cyklosporinú majícího beta-hydroxyr(L)^lfa-ami_nokyselinový„. zbytek^.v^polozew2,. ze- * jména: ii) diester dikarboxylové kyseliny cyklosporinú majícího (L)-threonylový zbytek v poloze 2, a zejména 51 iii) diester dikarboxylové kyseliny obecného vzorce χχττ

CO -Θ"

Ru

(XX ) CO- C': ve kterém znamená alkylenovou skupinu s 1 až 8 uhlíkovými atomy a každý(cy)znamená výše uvedený zbytek obecného vzorce II, ve kterém A znamená -MeBmt- nebo -dihyaro-MeBmt-, B znamená (L)-threonylový zbytek obecného vzorce xxm CHj 0-

CS —nk—cs—co— cani) (L) X znamená -Sar- a Y znamená -Val-. s výhodou znamená alkylenovou skupinu s 1 až 4 uhlí kovými atomy. Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy cyklospo-rinu ze skupiny 1e, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje k) reakci beta-O-poloesteru cyklosoorinu, ve kterém je zbytek v poloze 2 tvořen beta-hydroxy-(L)-al£a-aminokyselino-vým zbytkém, například beta-O-poloesteru obecného -vzorce XXIv (mvj

C’M -CO-au-CO-OB 52 ve kterém 0a 8n mají výše uvedené významy, nebo jeho reaktivního funkčního derivátu, s cyklosporinem, ve kterém je 2bytek v poloze 2 tvořen beta-hydroxy-(L)-alfa-aminokyselino-vým zbytkem, například s cyklosporinem obecného vzorce II, ve kterém A znamená -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-, B znamená -Thr~, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-.

Tato reakce může být vhodně provedena obecnými postupy následujícího příkladu G.

Příklad G Příprava /0-(L)-threonyl/^-Cícklosporin-diesteru kyseliny 1,2-ethandikarboxylové (cyklosporin 1.36) 0,255 g 2-chlor-1-methylpyridiniumjodidu a 0,244 g 4- n dimethylaminopyridinu se přidá k 1,318 g /{O-hemisukcinyl)-Thr/ Ciclosporinu v 5 ml absolutního dichlormethanu při teplotě 0 C. Potom se přidá 1,218 g /Thr/ ~>Cicklosporinu a reakční směs se míchá po dobu 3 hodin při teplotě 0 ° C, načež se teplota reakční směsi nechá za míchání vystoupit na 20 °C. Reakční směs se potom zředí dichlormethanem a vytřepe do 10 ml Q,1N vodného roztoku hydroxidu sodného s ledem. Směs se potom dvakrát promyje vodou a organická fáze se vysuší nad síranem sodným, zfiltruje a odpaří. Surový produkt se přečistí chroma-tograficky na silikagelu, přičemž se jako eluční soustava použije směs hexanu a acetonu v objemovém poměru 1:1. Z odpovídající frakce eluátu se potom izolujr požadovaná sloučenina. /or/2° - -209,4° (c = 0,5 v CHClr 2 Výchozí /(O-hemisukcinyl)Thr/ -Ciclosporin je známou sloučeninou, například z příkladu 5 mezinárodní patentové přihlášky WO86/Q2Q80. Ostatní poloesterové výchozí produkty vhodné pro přípravu cyklosporinů skupiny 1e mohou být při- «Μ» V » V- · ·.* '“'-O*·*-'-·1 1 J ^ ‘ " praveny analogickým způsobem.

Cyklosporiny výše uvedené skupiny 1c jsou nové a tvoří takto součást vynálezu jako nové sloučeniny. - 53 - Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy cyklospo-rinů skupiny 1c, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje: 1} oxidaci cyklosporinu, ve kterém je zbytek v poloze 1 3*-hydroxy-substituován a je tvořen například zbytkem -MeBmt-.

Reakční stupeň 1) může být proveden například reakcí s N-chlorsukcinimidem a dimethylsulfidem při teplotě například -30 až 10 °C, například postupem podle následujícího při-kládu H.

Příklad H Příprava /3'-desoxy-3"-oxo-MeBmt/1-Ciclosporinu (cyklosporin 1.37) K roztoku Γ278-g~N~chlo'rs'u'k'cin'imi"du“ve~4Otoluenu-- se přidá 8,48 ml dimethylsulfidu. Směs se míchá po dobu 5 minut při teplotě 0 °C, načež se ochladí na teplotu -12 °C a k takto ochlazené směsi se přidá 9,62 g Ciclosporinu ve 40 ml toluenu. Takto získaná suspenze se potom míchá po dobu 1,5 hodiny při teplotě -10 °C a potom ještě po dobu jedné hodiny při teplotě -10 až -5 °C. Přidá se 19,4 g triethylaminu, načež se vyloučí světlá sraženina. Reakční směs se míchá po dobu 5 hodin při teplotě 0 °C, načež se zředí 250 ml diethylethe-ru. Přidá se 192 ml 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a po extrakci se organická vrstva dvakrát promyje 500 ml vody, vytřepe do 250 ml 10% chladného vodného roztoku hydrogen-uhlicitanu sodného a promyje dvakrát 500 ml vody, 250 ml 10= kyseliny vinné a opětovně vodou. Kyselé a bázické vodné roztoky se reextrahují 2 x 500 ml diethyletheru. Sloučené organické fáze se vysuší nad šíraném sodným a odpaří k suchu při teplotě 40 °C. Zbytek se přečistí chromatograficky na .3.0.0 g silikagelu,. přičemž se ..jako .e luční činidlo použije nasycený vodný roztok ethylacetátu. Z odpovídající frakce eluátu se získá požadovaná sloučenina. 54 / cC/q = -241,3° (c = 0,531' v CHC13) a -169,5°{c = 0,5 v ch3oh).

Analogickým způsobem mohou být připraveny cyklosporiny 1.38 a 1.39: 1 1 Fyzikální, charakteristiky i * -1 .-38*—* -~[a|020 = -255; 1°(c=T0.5 v CHCI]} j i 1.39 (a]0 J 0 = -235.40 Cc» 0.5 V CHCI]) j

Cyklosporiny výše uvedené skupiny Id jsou rovněž nové a tvoří takto součást vynálezu jako nové sloučeniny. Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy cyklospo-rinú skupiny Id, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje: m) oxidaci, například selektivní oxidaci cyklosporinu, ve kterém je zbytek v poloze 2 tvořen beta-hydróxy-alfa-aminokyse-linovým zbytkem, například (L)-threonylovým zbytkem. reakční stupeň m) může být proveden naprosto analogicky Š výše uvedeným reakčním stupněn 1 ), například obecným postupem popsaným v následujícím příkladu I.

Příklad I Příprava /alfa-methylketo-Gly/ -Ciclosporinu (cyklosporin Ί.40) K 868 mg N-chlorsukcinimidu ve 26 ml toluenu o teplotě 0 °C se přidá 484 mg dimethylsulfidu. Po^desetirminutovém míchá--ní při teplotě 0 °c se suspenze ochladí na teplotu -30 °C a k této suspenzi se přidá 1584 mg /Thr/ -Ciclosporinu v 6,5 ml toluenu. Reakční směs se potom míchá po dobu jedné hodiny při 55 teplotě 26 až 30 °C a ke směsi se potom přidá 1,81 ml tri-ethylaminu. Chlazení se odstaví a po dalších 5 minutách se přidá—2-5-m-l—di-e-th-y-l-e-theru—Rea.kčn.í_smě.s. se potom naliie do 150 ml ledové vody a 10 ml 1N kyseliny chlorovodíkové, načež se přidá dalších 100 ml diethyletheru. Organická fá2e se třikrát promyje 150 ml ledové vody a extrahuje dvakrát diethyletherem.. Sloučené organické fáze se vysuší nad síranem sodným a zahustí. zbytek se rozpustí v 10 ml dichlormethanu, zfiltruje přes . Hyflo, zředí hexanem a odpaří, přičemž se získá požadovaná sloučenina. /cC/^° = -229° (c = 1,0 v CHC13) a -184° (c = 1,0. v CH3OH). Analogickým způsobem může být připraven cyklpsporin 1.41: /0C/p° = -226,7° (c = 1,0 v CHC13).

Cyklosporiny třídy 2i) a tř"ídy~2iT) jsou rovněz~riové a tvoří takto součást vynálezu jako nové sloučeniny. Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy cyklospo-rinů třídy 21) a 2ii), jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje: m) za účelem přípravy cyklosporinu třídy 2i) reakci cyklosporinu, ve kterém je 3#-uhlíkový atom zbytku v poloze 1 oxo-substituován, například cyklosporinu, ve kterém je zbytek v poloze 1 tvořen -3'-desoxy-3"-oxo-MeBmt-zbytkem, s alkoxy-aminem s 1 až 4 uhlíkovými atomy nebo n) za účelem přípravy cyklosporinu třídy 2ii) cyklizaci peptidu s otevřeným řetězcem obsahujícího sekvenci cyklosporinu obsahujícího v poloze 2 (L)-isoleucylový zbytek, přičemž uvedený peptid s otevřeným řetězcem.začíná zbytkem odpovídajícím zbytku 8 uvedeného cyklosporinu a plnícím úlohu N-konce a končí zbytkem odpovídajícím zbytku 7 uvedeného cyklosporinu a plnícím úlohu’C-ko'ňce, například' cyklizaci peptidu s otevře-· ným řetězcem obsahujícího sekvenci 56 -(Q)Aia-MeLeu~Meleu-Me7al-Me3mc-Ile-Sar-MeLeu-Val-HeLeu-Ala- 3 9 10 U 12 3^567 Výše uvedený reakční stupeň m) může být proveden například rea-kcí sa· zvoleným alkoxyaminem s 1 .až 4 uhlíkovými _ u

I Φ lil ·<^· NN V u """ *F atomy, vhodně ve formě adicní soli s kyselinou, v přítomnos-' ti báze, jakou je pyridin, při teplotě asi -10' až asi 80 °C, napríkLad obecným postupem dále uvedeného příkladu J.. Výše uvedený reakční stupeň může být proveden naprosto analogicky s obecnými postupy pro celkovou syntézu cyklospori-nů, například postupem popsaným v patentu US 4 554 531 nebo ve zveřejněné evropské patentové přihlášce 0 098 456. Cyklosporin 2.2 se takto například připraví substitucí BOC-Ile-OH za BOC-alfaAbu-OH ve stupni a) příkladu 1 uvedeného patentu.a . uvedené patentová přihlášky a následným provedením postupu, který je zcela analogický se stupni b) až x), popsanými v uvedeném patentu a uvedené patentové přihlášce.

Cyklosporin 2.2 má následující fyzikální charakteristiky : teplota tání: 151 °C; / cC/q° = -224° (c — 1,0 v CHCI3) .

Příklad J Příprava /3'-desoxy-3'-methoxyimino-MeBmt/^-Ciclosporinu (cyklosporin 2.1) 600 mg- produktu z příkladu H a 835 mg methoxylamin-"'"hydrochlorrdďv 2,5" ml' ethanolu 'a 2‘, 5 ml""pyridinu "se mícha po dobu 14 hodin při teplotě 50°C pod atmosférou argonu. Pyridin se odpaří a zbytek se zíiltruje. Filtrát se vyjme 57 dichlormethanem a promyje solankou. Solanka se potom několikrát extrahuje dichlormethanem a sloučené organické fáze se_opětov-ně_pr-omy-j.í_solankou-,—vy-suš-í—a—odpaiř-í-—z-by-tek—se—přečistí chromatograficky, přičemž se z odpovídající frakce eluátu izoluje požadovaná sloučenina. /<X/£° = -214° (c = 1,09 v CHC13).

Jak bude-zřejmétmohou být cyklosporiny skupiny 1c a 'skupiný 2D~T~1čteré~jsou všechny novými sloučeninami a které mají i jinou použitelnost než jako meziprodukty, zařazeny do sjednocujících podkategorií, například do podkategorie obsahující cyklosporiny, ve kterých má zbytek v poloze 1 obec ný vzorec XXV CHj

CK

TRANS

a CH CHj

I 8u (R) . CS . cc<V) -N—cg—co- I (S) ca, ve kterém R^ znamená atom kyslíku nebo skupinu obecného vzorcedR~yyN=,· ve kterém -Ry znamená alkoxylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atomy. -Cyklosporiny-skupiny 2i-ii)--jsou známé. Cyklosporiny-2.3 až 2,6 jsou takto popsány například Wenger-em v Trans-plantation Proč., XVIII (6) Supp.5 (dec.), 213 a dále (1986). 58

Tyto cyklosporiny, jakož i ostatní cyklosporiny skupiny 2 i i i} mohou být připraveny obecnými postupy pro celkovou syntézu cyklosporinu, například postupem, popsaným v patentu US 4554531 a v ve zveřejněné evropské patentové přihlášce 0 098 456, například náhradou H-Melle-Bzl nebo H-MeAloIle-Bzl za H-MeVal-Bzl ve stupni g) příkladu 1 uvedeného patentu nebo uvedené patentové přihlášky. Cyklosporiny 2.3 až 2.5 mají následující fyzikální charakteristiky:

Cyklosporin T.t. (ac> [a]DJ0 - (C = - V chci3) * 2.3 162 - 163 - 178·; 1.0 | 2.4 144 - 146 - 221®; 1.0 2.5 146 - 146 - 225®; 1.0 i 2.6 148 - 170®; 1.0 1

Cyklosporiny 3.1 až 3.5, 3.7 a 3.9 skupiny 3 jsou známé /viz například Vraber a kol., Helv. Chim. Acta, 65, 1655 a dále (1982) a 70, 13 a dále (1987)/.

Cyklosporiny 3.6, 3.8 a 3.10 jsou nové a tvoří takto součást vynálezu jako nové sloučeniny. Cyklosporiny 3.6 a 3.8 mohou být připraveny postupy, které jsou zcela analogické s postupy, použitými pro přípravu ostatních 2námých dihydro-cyklosporinu, například popsanými v souvislosti s reakčním stupněm f). “***"* - "*Cyklo‘sporin 3.10 může^být^připraven^analogicky^s-postu-py pro separaci cyklosporinových minoritních metabolitů, například postupem, popsaným v Helv. Chim. Acta 65, 1655 a dále ¢ 1982), například minoritní metabolické frakce z fermentační . 59 ^ 8

břečky použité pro přípravu /(D)Ser/ -Ciclosporinu (viz evropská zveřejněná patentová přihláška 0 056 782), například postupem—pop sáným-v-ná'sl'e'd u' j'í"c'í"nf"příkTadiTlC

Příklad K Příprava /MeLeu/^-Cicklosporinu (cyklosporin 3.10)

Biomasa získaná kultivací podle příkladu 3 zveřejněné evropské patentové přihlášky 0 056 782 se odstředí v čeřícím separátoru (Westfalia) a vodná fáze (kultivační filtrát) se třikrát extrahuje pokaždé ekvivalentním množstvím ethylacetátu. Ethylacetátové extrakty se zahustí za vakua. Pevný podíl (myce-lium) se zpracuje methanolem a homogenizuje, načež se pevná a kapalná fáze oddělí v čeřícím separátoru. Tento extrakční postup se opakuje dvakrát za použití 90% methanolu· Methanolic-ké extrakty se sloučí, přidá se voda a extrakty se zahustí za vakua. Tbývající vodný extraktový koncentrát se třikrát extrahuje ekvivalentním množstvím ethylacetátu a ethylacetátové extrakty se zahustí za vakua. Oba surové extrakty (z kultivačního filtrátu a mycelia) se chromatografují na silikagelu (0,040-0,063 mm), přičemž se jako eluční činidlo použije vodou nasycený ethylacetát. Nejdříve tekoucí frakce obsahují převaž-ně /Val/ -Ciclosporin (cyklosporin D) a následně tekoucí frakce eluátu obsahují převážně /MeLeu/^-Ciclosporin (cyklosporin 3.10) a Ciclosporin (cyklosporin A). Takto získané píkové frakce se znovu chromatografují na silikagelu (0,020-0,045 mm), přičemž se tentokrát jako eluční činidlo použije směs acetonu a hexanu v objemovém poměru 1:1. Frakce obsahující /MeLeu/1-Ciclosporin se opětovně chromatografují na LiChoprep RP-18 (0,040-0,063 mm), přičemž se jako eluční soustava použije směs methanolu a vody v objemovém poměru 85:15, a potom na silikagelu (0,020-0,045 mm), kdy se jako eluční soustava použije vodou nasycený -ethylacetát. Z odpovídající" frakce eluátu se získá požadovaná sloučenina.

Teplota tání: 142-148 °C; /C6/q° = -303° (c = 0,54 v CHCI3). 60

Cyklosporin 3.6 má následující fyzikální charakteristiky: teplota tání = 180-182 °C; / cC/p°= -211° (c = 0,64 v CHC13). Příklad 1

Použitelnost při obnovení citlivosti vůči antineoplastickým-cytotoxickým-protinádorovým chemoterapeutickým látkám (in-vitror * 1)

Rakovinné buněčné řady (CCL -cancer cell lineš), například tvořené buňkami malého lidského karcinomu plic, resistentní vůči jedné nebo více chemoterapeutickým látkám (CTDS - cancer the-rapeutic drug substances), zvoleným ze skupiny zahrnující Dauno-rubicin (DR, Vincristine (VC), Adriamycin (AM), Etoposide (ET), Tenoposide (TE) a Colóhicine (CC), se kultivují postupy, popsanými Twentyman-em a kol. v Br. J. Cancer, 54, 253 (1986).

Citlivost resistentních sublinií (CCL-R) se srovná s citlivostí matečných buněčných sensitivních řád (CCL-S) vyhodno-' cením inhibice buněčného růstu v průběhu kontinuální expozice protirakovými chemoterapeutickými látkami, například v případě .buněčné řady resistentní vůči Daunorubicinu (CCL-DRR) srovnáním růstu buněčných řad CCL-DRS a CCL-DRR v přítomnosti DR, obsaženého v.kultivačním prostředí ab.initio. Za tímto účelem se měří proliferace buněk počítáním buněk pomocí elektronického čítače buněk, přičemž počítání buněk je provedeno bezprostředně po ukončení exponenciální růstové fáze. Byly vybrány takové resistentní buněčné řady CCL-R, pro které je koncentrace ICgg (tj. koncentrace chembterapeutické látky, na příklad koncentrace DR, potřebná ke.snížení finálního počtu buněk na 20 % hodnoty finálního počtu buněk u kontrolní buněčné řady, která *nebyla»vystavena expozici*chemoterapeutického.rčinidla/#.napří-. .·,. klad DR) více než 80x, výhodně více než 100x vyšší než koncentrace odpovídajících matečných citlivých řad CCL-S.

Potom se vyhodnotí citlivost vybraných resistentních 61 buněčných řad CCL-R vůči chemoterapeutickým látkám (například vůči DR} v přítomnosti a nepřítomnosti testovaného cy.klo.spor.i-... nu, přičemž se počty buněk, které jsou mírou buněčné prolife-race, stanoví výše uvedeným způsobem. Za tímto účelem se buňky kultivují ab initio v přítomnosti různých koncentrací jak chemo-terapetické látky, tak i testovaného cyklosporinu. V rámci skree-nování se volí takové koncentrace testovaného cyklosporinu, které samotné nezpůsobí výrazné snížení proliferace rakovinných buněk. Tyto vhodné koncentrace se stanoví kultivací citlivých a resis-tentních buněčných řad CCL-S a CCL-R v přítomnosti různých koncentrací cyklosporinu a v nepřítomnosti chemoterapeutické látky. Cyklosporiny se rutinně testují při koncentraci 0,0] až 50, zejména 0,1 až 10, ^,ug/ml, například při koncentracích 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 a 50^ug/ml. Poměr množství chemoterape.utického činidla (například DR) potřebného' k inhibici” buněčné proliferace' o-50”% ”v_népřítomnosti”............ testovaného cyklosporinu (IC^q-CS) k množství chemoterapeutic-kého činidla potřebnému k inhibici buněčné proliferace o 50 % v přítomnosti testovaného cyklosporinu (IC5q+CS) je vzat jako míra zvýšení citlivosti resistentní buněčné řady CCL-R vůči chemoterapeutické látce; které bylo indukováno testovaným cyklo-sporinem (sensibilační poměr). Stabilita buněčné řady CCL-R je zajištěna kontrolou její citlivosti vůči chemoterapeutické látce a srovnáním zjištěné citlivosti s citlivostí stanovenou na počátku testu. Při výše uvedeném modelovém testu jsou cyklosporiny skupin 1 až 3, zejména specifické citované cyklosporiny, účinné při zvyšování citlivosti vůči chenioterapeutickým látkám (například vůči DR, VC, AM atd.) při výše vymezených koncentra-

V cích, zejména při koncentracích asi 10/ug/ml nebo při koncen-tracích ještě nižších. . Při vyšších koncentracích, například při koncentracích SÓ^ug/mi, je inhibice proliferace jak citlivých, tak i resis-tentních buněčných řad CCL-S a CCL-R v některých případech . způsobena testovanými cyklosporiny v nepřítomnosti chemoterapeutické látky, přičemž v případech, kdy k tomu dochází, je tento jev obecně méně výraznější u resistentních buněčných řad CCL-R než u citlivých buněčných řad CCL-S. Daleko výrazněji jsou testované cyklosporiny účinné při zvyšování citlivosti vůči chemoterapeutickým látkám resistentních buněčných řad CCL-R při koncentracích, které v nepřítomnosti chemotera-peutické nemají vliv na proliferaci rakovinných buněk. Fři jedné ze série testů, prováděné za použití buněčné řady lidského malého karcinomu plic resistentní vůči AM a cyklo-sporinů 2.4, 1.1 a 1.32, byl stanoven sensibilační poměr pro AM (AiM IC-q-CS/AM IC^q+CS), jehož hodnoty pro uvedené koncentrace testovaných cyklosporinů jsou uvedeny v následující tabulce (výzkum a data: P.R. Twentyman, MRC Clinical Oncology and Radiotharapeutic Unit, Hills road, Cambridge, GB - srovn. Br. J-Cancer 57, 254-258 (1988)/. • Sensibilační poměr Koncentrace cyklosporinů Cvklosporin 50.0 ug/ml 5.0 ug/nil 2.4 >30 >30 1.1 _,__ >20 1.35 12 3.3 S 1.0 1.0 Příklad 2

Použitelnost při obnovení citlivosti vůči antineoplastickým-cytotoxickým protinádorovým chemoterapeutickým látkám (in vitro-2)

Tento test může být proveden za použití libovolné vhodné buněčné řady resistentní vůči chemoterapeutickým látkám a kontrolní (matečné) buněčné řady, které se získají například 63 způsobem popsaným Ling-em a kol. v J. Cell. Physiol. 83, 103-116 (19.74) a Bech-Hansen-em a kol. v J. Cell. Psysiol. 88, 23-32 (1976). Specifickými zvolenými klony jsou globálně resistentní (například resistentní vůči colchicinu) řada CHR (subklon C5S3.2) a matečná citlivá řada AUX B1 (subklon AB1 S11) - srovn. Ling a kol. loc.cit. a Juliano a kol., Biochim. Biophys.Acta, 455, 152-162 (1976); Carlsen a kol. Biochim. Biophys. Acta. 455, 900-9 1 2 ( 1 976); Lalande a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., 78 (1 )7 363-367 ( 1 9 8 i ); Kartner a kol., Science 221 , 1285-1288 (1983);

Kartner a kol., Nátuře, 316, 820-823 (1985); Riordan a kol., Nátuře, 316, 817-819 (1985); Van der Blick a kol., Mol. Cell.

Biol. 6, 1671-1678 (1968); Endicolt a kol., Mol. Cell Biol.,7, 4075-4081 (1987); Deuchars a kol., Mol. Cell. Biol., 7, 718-724 (1987); a Gerlach a kol., Nátuře,. 324, 485-489 (1986).

Buněčné řady se kultivují v médiu alfaMEM obohacenému 0,02 mg/ml (L)-asparaginu, MEM-vitaminy (IX), 166 U/ml penici-lin-strptomycinu, 2mM (L)-glutaminu a 10% tepelně inaktivova-ným fetálním telecím sérem. Test se provádí za použití testovacích ploten s 96 jamkami. Roztok colchicinu o koncentraci 50yUl se přidává ke kultivačnímu .prostředí tak, aby byly získány finální koncentrace .30-10-3-1-0,3-0,1^,ug/ml pro resistentní řadu (RL) a finální koncentrace 0,3-0,1-0,03-0,01-0,003-0,001-0yug/ml pro citlivou řadu (SL). Mohou být použity i nižší koncentrace v případě potřeby, kdy testovaný cyklosporin velmi výraznou měrou snižuje IC5Q-odezvu na colchicine. .

Testované cyklosporiny se rozpustí v koncentraci -1mg/ml v absolutním ethanolu. Každý testovaný cyklosporin se rutinně screenuje při 0,1 a 1,D^,ug/ml, přičemž při kontrolních pokusech jsou použity pouze odpovídající zředění ethanolového rozpouš- -- —t-ěd-l-a-. —T-estované-cy-klosporinové^r-oztoky-nebo-. kontrolní .rozto-. ky (50^.ul) se přidají do každé jamky, kde se promísí s již přítomnými colchicinovými roztoky. Potom se přidá 100yUl buněčných suspenzí s koncentrací 4x1Ó^buněk7ml pro citlivou řádu (400 buněk/jamka) a 8x10^ buněk/ml pro resistentní řadu RL.

Proliferace se vyhodnocuje kolorimetricky /Mosman, J. 64 64 •t J. Immunol. Methods, 65, 55-63 (1983)/ za použití 3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromidu (MMT). Nejdříve se odstraní lOO^ul buněk-prostý supernatant, načež se do každé jamky přidá 10^ul roztoku MTT o koncentraci 5 mg/ml v prostředí RPMI 1640 (Gibco) a plotna se inkubuje po dobu 3 hodin při teplotě 37 °C. Přidá se 100^,ul směsi butanol/isopropa-nol/lN kyselina chlorovodíková v objemovém poměru 192:96.12 ml), načež se plotna třepe až k dosažení úplného rozpuštění pevného ........ • · 4 * .at* aiu r m. ^ podílu. Optická hustota se odečítá při vlnové délce 540 nm.

Buněčný růst (měřený MTT-dependentní optickou hustotou) se graficky vynese v závislosti na koncentraci colchicinu, přičemž se křivka dávka-odezva vynese pro každý testovaný cyklosporin a stanoví se colchicinová inhibiční koncentrace 50 (CIC^q), což je koncentrace colchicinu potřebná k omezení proliferace buněk o 50 %. $

Zvýšení citlivosti vůči colchicinu, indukované každým ”· testovaným cyklosporinem při koncentraci 0,1 a 1,0^ug/ml, se stanový jako: * CIC5q v nepřítomnosti testovaného cyklosporinu CIC^q- sensibi-CICjq v přítomnosti testovaného cyklosporinu CIC50+ lační zisk

Testované cyklosporiny mohou ovlivňovat citlivost vůči colchicinu jak resistentní buněčné řady RL, tak i citlivé buněčné řady SL. Relativní vliv na obě tyto buněčné řady může být stanoven jako CIC5q+ pro řady RL CICgQ+ RL relativní CIC50'+ pro řady SL CIC5Q+ SL resistence. - ^Cyklospórinytříd^l^áž^l-zvysují^čitlivost resistentní buněčné řady RL vůči colchicinu při výše uvedených koncentracích. Obecně lze pozorovat i zvýšení citlivosti citlivé buněčné řady SL při ekvivalentních koncentracích, i když toto zvýšení je méně výrazné než u buněčné řady RL. Pro použití v rámci * * l*t ň

*1 65 vynále2u jsou obecně považovány za vhodnější cyklosporiny vykazující vyšší relativní resistenci, která byla definována výše. Při jedné sérii pokusu byly získány pro buněčné řady RL a SL sensibilační zisky, které jsou uvedeny v následující tabulce. -Gy-k-lo spor-i n_ SL RL 0.lu?/ml 1.0uR/ml 0.lug/ml 1.0uR/ml 1.1 4.0 8.0 1.4 30.8 1.2 4.4 8.1 2.0 59.8 l.j 5.3 10.7 1.8 97.9 1.4 6.7 11.7 1.7 97.6 1.10 3.6 11.6 1.1 28.9 1.11 6.3 17.6 1.1 36.7 1.15 4.7 12.9 • 1.5 38.3 1.37 5.8’ ' "'Ϊ2.Τ"” 1.4 " ' 82.4 2.2 7.9 15.1 1.5 97.3 2.4 4.7 i 15.7 ' 1-2' 34.5 Příklad 3

Použitelnost při obnovení citlivosti vůči antineoplastickým-cytostatickým protinádorovým chemoterapeutickým látkám fin vivo)

Sublinie Ehrlichova ascitického karcinomu (EA) resistent-ní vůči chemoterapeutickým látkám DR, VC, AM, ET, TE nebo CC se rozvíjí sekvenčním přenosem buněk EA na následné generace hos-.·. -titelský.ch.jnyJi-BABB./c,_pjo.s.tupem. popsaným Slater-qm ,a r kol.. ^ J. Clin. Invest, 70, 1131 (1982). Za tímto účelem se chemote-rapeutická látka podává při dávkování 0,2 až 0,5 mg/kg/děn, i.p. v 5"dávkách počínaje'2'4"'hodin po zaočkování hostitelských" myší 0,2 ml neředěné maligní břišní tekutiny (ascitu), odebrané z preterminálních zvířat.

Za účelem testu přijmou hostitelské· myši výše uvedené 66 resistentní buněčné řady Ehrlichova ascitického: karcinomu EA-R nebo citlivé (matečné) buněčné řady Ehrlichova ascitického karcinomu EA-S. Myši, které přijaly resistentní buněčnou řadu EA-R byly rozděleny do skupin, které přijaly: „ . t * 1) žádnou chemoterapeutickou látku / žádný cyklosporin, 2) chemoterapeutickou látku / žádný cyklosporin, 3) žádnou chemoterapeutickou látku / testovaný cyklosporin, 4) chemoterapeutickou látku + testovaný cyklosporin. Ántineoplastická chemoterapeutická látka je podávána v dávkách použitých při generování buněčných řad EA-R. Cyklospo-rinová testovaná látka je podána v celkové testovací dávce 1 až ’ -ř· · .* 80 mg/kg, zejména v dávce S nebo 25 nebo až 40 mg/kg v pěti dílčích denních dávkách za použití intraperitoneálního podání

Uf. (ve směsi ethanolu a olivového oleje) počínaje 24 hodin' po za-očkování buněčné řady EA-R. Potom se srovná střední doba přežití ve skupinách 2, 3 a 4 se střední dobou přežití ve skupině 1 a toto srovnání představuje míru účinnosti použité terapie. Získané výsledky neukazují žádný výrazný rozdíl mezi dobami přežití ve skupinách 1, 2 a 3. Ve skupině 4, přijímající cyklosporin skupin 1 až 3 ve výše uvedeném dávkování, dochází k podstatnému zvýšení doby přežití (například k dvojnásobnému až trojnásobnému nebo k ještě většímu) ve srovnání s oběma skupinami 1a 2. »i Ekvivalentní výsledky mohou být získány použitím cyklo- sporinú skupin 1 až 3 při modelových testech srovnatelné kon- ► * cepce, například in vitro, nebo použitím pokusných zvířat infikovaných kmeny virů resistentních vůči chemoterapeutickým či-

' nidlům,4,fungálními-kmeny>resistentními vůči”aňtimykotikům, jakož i protozoálními kmeny resistentními vůči chemoterapeutickým činidlům, například plasmodiálními kmeny, například v přírodě se vyskytujícími subkmeny kmene Plasmodium falciparum, které vykazují získanou resistenči vůči chemoterapeutickým pro- 67 timalariovým činidlům.

Použitelnost cyklosporinů skupin 1 až-3 v souladu, s vynálezem muže být rovněž demonstrována klinickými testy, například preliminárními testy, které se provádí následujícím způsobem. -,-Klini.ck-ý_te.s±. J___________,________________________s ____ __

Subjekty (ženského i mužského pohlaví) pro tento klinický test jsou pacienti s diagnosou maligního rakovinného růstu, kterým je indikována antineoplastická-cytostastická terapie. 0 každého subjektu podrobujícího se tomuto testu je vypracována detailní zpráva o genezi nemoci, stavu a stádiu onemocnění, odhadnuté rychlosti průběhu nemoci a prognose nemoci. .....---------Typ., podaného..antineoplastického-cytostatického terapeutic- kého činidla požadované dávkování v nepřítomnosti cyklosporino-vé terapie jsou stanoveny ošetřujícím lékařem podle typu a stádia pokročilosti rakovinného onemocnění.

Testovaný cyklosporin se podává perorálnš v dávce 1,0 až . 20,0 mg/kg/den nebo parenterálně, například intravenózně nebo intramuskulárne v dávce 0,5 až 5,0 mg/kg/den. Pokud to stav onemocnění dovolí, započne se s podáním testovaného cyklospori-nu alespoň 1 nebo 2 dny, výhodně 10 až 14 dní, před počátkem antineoplastické terapie, aby bylo možné postupně zvyšovat dávku až k dosažení průběžné terapeutické hladiny cyklosporinů. V těchto případech se počáteční cyklosporinové dávky pohybují v blízkos ti spodní meze výše uvedených dávkovačích rozmezí (například při perorálním podání: 1,0 až 5,0 mg/kg/den nebo při parente-rálním podání: 0,5 až 1,5 mg/kg/den) a stoupají k vyšší dávko-* vací ^radině_("napřikiad ^^“péror^álhím-po“dán"í“r'"5“,'0_'a'ž'" 1'5γ0._η'θ·~-· ’ -bo až 20,0 mg/kg/den, nebo při parenterálním podání: 2,0 až .5.,.0 mg/.kg/.den.).,.. přičemž„přesný, režim takového zvyšování dávkování je stanovém ošetřujícím lékařem v závislosti na stavu pacienta na vstupu klinického testu, v některých případech může být žádoucí, aby cyklosporinová'a antineoplastická-cytostatická terapie byly započaty a ukončeny současně, i když i v tomto 68 případě je výhodné započít s nižším výchozím 'dávkováním cyklosporinu a postupně zvyšovat dávku cyklosporinu až k uvedenému maximu.

Počáteční antineoplastická- cytostaticka terapie se započne

s dávkami, které odpovídají jedné třetině odhadnuté dávky v nepřítomnosti cyklosporinové terapie, přičemž přesná volba počáteční dávky cytostatické terapie opět závisí na rozhodnutí ošetřují-. čího .lékařeAntineoplastické-cytostatické dávkování* se* potom '" zvyšuje podle potřeby v závislosti na pozorované odezvě. V průběhu tohoto klinického testu jsou monitorovány všechny relevantní klinické parametry, včetně podávaných dávek cyklosporinu a antineoplastického-cytostátického chemoterapeu-tického činidla. Pacienti jsou monitorování za účelem kontroly redukce nádorového růstu, výskytu metastáz 'a případné nádorové regrese. V průběhu klinického testu jsou zaznamenávána srovnání očekávané prognosy onemocnění s jeho skutečným stavem a průběhem.

Vyhodnocení výsledků klinických testů ukazuje, že· u pacientů, kteří, se podrobili tomuto klinickému testu dochází k účinné kontrole nebo zlepšení stavu nemoci, včetně omezení nádorového růstu nebo nádorové regrese a omezení výskytu meta-stáz, a to při dávkách antineoplastického-cytostatického terapeutického činidla, které jsou nižší než dávky, kterých by bylo zapotřebí k dosažení ekvivalentní účinnosti bez cyklosporinové terapie. Rovněž je zaznamenána snížená resistence vůči antineoplas-tickému-cytostatickému chemoterapeutickému činidlu ve srovnání s výsledky dosaženými u skupiny, která je léčena pouze anti-neoplastickou-cytostatickou terapií, jakož i snížení nežádoucí toxické reakce na podávané antineoplastické-cytostatické chemo-terapeutické činidlo.

Klinický* tesť*II"

Subjekty pro tento klinický test jsou hospitalizovaní nebo ambulantní pacienti (ženského i mužského pohlaví) trpící pokročilým stádiem maligního rakovinného růstu různého typu. 69

Subjekty vybrané pro ténto test jsou pacienti, kteří absolvovali celou antineoplasticko-cytostatickou chemoterapii a kteří jsou v poslední fázi globálního léčení komplexem chemoterapeu-tických činidel, přičemž se u těchto pacientu obnovil nádorový růst a výskyt metastáz, což znamená, že jejich rakovina je evident ne identifikovateiná jako resistentní vůči globální léčbě komplexem chemoterapeutických Činidel.

Pro každého pacienta podrobujícího se tomuto klinickému testu vypracuje podrobná zpráva, kladoucí důraz zejména na popis léčení, který byl u pacienta použit v průběhu předcházejících 6 až 18 měsíců, geneze ze nemoci a současný stav nemoci, například předpokládaná rychlost postupu nemoci a odhadnutá prognóza. Při tomto klinickém testu jsou pacienti udržováni na předem stanoveném dávkování a programu antinoeplasticko-cytostatické — ...chemoterapie,..přičemž touto terapií je terapie aplikovaná při -identifikaci resistence vůči chemoterapeutickým, činidlům a na vstupu klinického testu. Antineoplastická chemoterapie je udržována v průběhu celého testu na preresistenčně determinační hladině a programu.·Tento chemoterapeutický režim je doplněn podáváním testovaného cyklosporinu v perorální dávce asi.1 až 20, například asi 5 až 15 mg/kg/den nebo v parenterální , například intravenózní, dávce asi 0,5 až 7,5, například asi 2,0 až 5,0, mg/kg/den. U některých pacientů múze cyklosporinová terapie započít 1 až nejvýše 14 dnů před započetím antineoplastická terapie, přičemž se v ní pokračuje v průběhu celé léčebné periody. V jiných případech může být žádoucí, aby se s cyklosporinovou a antineoplastickou terapií započalo současně.

Pacienti jsou monitorováni za účelem zjištění omezení nádorového růstu, výskytu metastáz a možné nádorové· regrese. 'Ve ’ stanovených"'intervalech ^tohoto—ki-i-hi-ckého -testu—se - za-znamená-..... vají srovnání skutečného stavu nemoci s předpokládanou prognózou. V případech, kdy u pacienta není zaznamenáno žádné zlepšení stavu nemoci nebo alespoň restrikce zhoršování nemoci za určitou dobu, je v kompetenci ošetřujícího lékaře modifikovat nebo změnit bazální antineoplasticko-cytostatickou chemoterapii. 70 V průběhu celého klinického testu jsou monitorovány všechny relevantní klinické parametry, včetně hladin antineoplasticko-cy-tostatických chemoterapeutických činidel a cyklosporinu v krevním séru a rychlosti jejich vylučování.

Vyhodnocení výsledků tohoto klinického testu ukazuje, že u pacientů, kteří se tomuto testu podrobili, došlo k výrazné-~mu-zlepšení-kondice-,- -k-restrikci. nádor.pyého_ růstu nebo k nádorové regresi a k omezení výskytu metastáz po zavedení cyklospori-nové terapie neustálém zlepšování prognózy nemoci. * &

Cyklosporiny třídy 1 až 3 jsou v souladu s výše zjištěnými skutečnostmi indikovány pro použití při léčení morbidního stavu nemoci, při kterém došlo k získané resistenci vůči chemo-terapeutickým činidlům, nebo pro použití jako doplňující chemoterapie.

Vzhledem k výše uvedenému vynález tedy poskytuje: a. i 1.1 způsob zlepšení nsbo zvýšení účinnosti chemoterapeutic-ké terapie nebo zvýšení citlivosti vůči chemoterapeutic- _ 3rér~terapii-,—nebo------------------------_--- — ---—-gj 1.2 způsobsnížení efektivních dávek chemoterapeutických Činidel u pacientů, kteří takovou terapii potřebují, přičemž podstata tohoto způsobu spočívá v tom, že se pacientovi současně podává cyklo-sporin skupin 1 až 3, které byly výše definované, nebo 2.1 způsob léčení morbidního stavu nemoci vykazujícího, nebo charakterizovaného získanou, indukovanou nebo . vrozenou resistenci vůči chemoterapeutickým činidlům, -nebo_ 2.2 způsob zlepšení chemoterapeutické léčby morbidních stavů nemoci vykazujících nebo charakterizovaných získanou, indukovanou nebo vrozenou resistenci vůči uvedené chemoterapeutické léčbě, nebo' 2.3 způsob potlačení nebo snížení získané, indukované nebo 71 vrozené resistence vůči chemoterapeutické léčbě, nebo 2.4 způsob obnovení citlivosti vůči chemoterapeutické léčbě u pacienta, který takovou léčbu potřebuje, přičemž podstata tohoto způsobu spočívá v tom, že se pacientovi podává účinné množství cyklosporinu z některé z výše definovaných skupin 1 až 3.

Alternativně vynález poskytuje: 3. způsob chemoterapeutického léčení pacienta, který takové léčení potřebuje, jehož podstata spočívá v tom, že se pacientovi podá vhodná chemoterapeuticky účinná látka společně s cyklo-sporinem z některé z výše definovaných skupin 1 až 3, který plní funkci doplňkového léčiva k uvedené chemoterapeuticky účinné látce.

Vynález rovněž poskytuje: 4. ' cyklosporin z některé z výše uvedených skupin 1 až 3 pro použití při způsobu definovaném pod některým z výše uvedených odstavců 1.1, 1.2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 nebo 3, nebo ------—--——-- 5. cyklosporin z některé z výše uvedených skupin 1 az 3 pro použití při přípravě farmaceutické kompozice pro použití při způsobu definovaném pod některým z výše uvedených odstavců 1.1, 1.2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 nebo 3.

Vzhledem k tomu, že žádný z cyklosporinu skupin 1 až 3 nebyl—dříve_n'avfžen nebo doporučen pro farmaceutické nebo terapeutické použití, a k tomu, že specifické cyklosporiny skupin 1 až 3 jsou skutečně novými sloučeninami nebo cyklosporiny zcela nového typu, vynález rovněž poskytuje: 6. výše specifikované cyklosporiny skupin 1 až 3, například včetně individuálních cyklosporinu, o kterých bylo výše uvedeno, že jsou novými sloučeninami, jakož i cyklo- 72 2 3 4 5 sporinů skupin 1a , 1aJ, 1aq, 1a3, Id, le a skupin 2i) a 2iii), pro použití jako farmaceuticky účinné látky.

Jednotlivé stavy a formy chemoterapeutického léčení, při kterých mohou být způsoby podle vynálezu použity, zahrnují stavy způsobené mikrobiální, například virální, bakteriální, fun-gální nebo protozoální, infekcí zahrnujících kmeny resistentní Vůči ""jedné" 'nebo- několika- antimikrobi-á-ln-ím nebo- antibiotických... chemoterapeutickým látkám, například vůči antivirálním, antibakte riálním, antifJ^álním nebo antiprotozoálním chemoterapeutickým látkám.

Způsoby podle vynálezu jsou obzvláště použitelné pro léčení rakovin, například karcinomů nebo sarkomů nebo jiných nádorů nebo maligních nárůstů, vykazujících indukovanou nebo získanou resistenci vůči jedné nebo několika protirakovinným chemoterapeutickým látkám, například vůči antineoplastickým nebo cytostatickým činidlům, například vůči anthracyklinům nebo chemoterapeuckým látkám n?. ..bázi vinkaalkaloidů nebo vůči specifickým chemoterapeutickým látkám, mezi které patří daunorubi--ci-η-,-v-i-ncr-istine,- .adriamycin^et_0pp3j.de ,___tenocoside a/nebo colchicin, například za účelem omezení nebo potlačení nádorového růstu, výskytu metastáz atd.. Výhodnými cyklosporiny pro použití v rámci vynálezu jsou cyklosporiny, mající poměrně malou imunosupresivní účinnost, například nemající v podstatě žádnou imunosupresivní účinnost při předpokládaných dávkách, nebo vykazují imunosupresivní účinnost, která je podstatně nižší, například menší než 50 %, než imunosupresivní účinnost Ciclosporinu (cyklosporin k). Specifickými cyklosporiny, které jsou vhodné pro použití při způsobech podle vynálezu, jsou cyklosporiny, které byly výše jteflnované v rámoi skupin 1 až 3.--- Dávkování cyklosporinů, použité při provádění výše uvedených způsobů, se bude samozřejmě měnit v závislosti na typu nemoci, která má být léčena {včetně charakteru resisten-ce), na specifickém použitém cyklosporinů a na způsobu podání. 73

Obecně však.bude uspokojivých výsledků dosaženo při perorálních dávkách asi 1 až 20 nebo až asi 50 mg/kg/den, například asi 5 až 10 nebo až asi 15 mg/kg/den, podaných najednou nebo ve 2 až 4 dílčích dávkách, nebo při parenterálních, například intravenózních, dávkách (například intravenózní kapačkou nebo infuzí) asi 0,5 až 7,5 nebo až asi 10 mg/kg/den, například asi 1,5 nebo 2,0 až 5/0 mg/kg/den.

Vhodné denní dávky podávané pacientům jsou takto asi 50 až 1000 nebo až asi 2500 mg, například asi 250 až 500 nebo až 600 mg při perorální aplikaci nebo asi 25,0 až 375,0 nebo až 500 mg, například asi 75 až asi 100 nebo až 250 mg při intravenózní aplikaci.

Alternativně a dokonce výhodně může být dávkování pacientovi upraveno specifickým způsobem, aby se dosáhlo průběžné předem stanovené hladiny chemoterapeuticky účinné látky v krvi, například, za použití techniky RIA. Tímto způsobem, může být pacientovo dávkování nastaveno tak, že se dosáhne pravidelné hladiny účinné látky v krvi, měřené technikou RIA, asi 50 nebo 150 až asi 500 nebo 1000 ng/ml, tj. analogicky se způsoby dávkování běžně .používanými pro obvyklou Ciclosporinovou imuno-supresivní terapii. _ . _. _„

Farmaceutické kompozice vhodné pro perorální podání cyklosporinů výše uvedených skupin 1 až 3 v rámci provádění způsobu podle vynálezu mohou být například připraveny následujícím způsobem: Přísada Relativní množství (g) i) Labrafil M 1944 CS 150 ii) Cyklosporin (například cyklosporin 1.1, 1.2, 1,3, * 1.11 nebo 1.36) 25 (sušina) iii) Ethanol (absolutní) 50 . iv) Olivový olej asi 237

Celkem asi 462,0 74 Všechny přísady se naváží přímo do míchané nádobky.

i. ·+· < B Přísady i) a iii) se odváží jako první. Potom se přidá přísada ii) za neustálého míchání, ve kterém se pokračuje až do okamžiku, kdy se dosáhne rozpuštění pevného podílu. Potom se přidá přísada iv) a směs se míchá ještě po dobu 10 minut. Získaný roztok se zfiltruje (Gelman Preflow Filter, 400y.um) při tlaku asi 0,05 až 0,08 MPa a plní do 50 ml lahviček typu Rexo. Lahvičky se těsně uzavřou pryžovou zátkou a víčkem. Celý tento postup ^ se provede za bezvodých podmínek při okolní teplotě a všechny stupně se provádí pod dusíkovou atmosférou (0,025 MPa). Roztok v lahvičce, který je vhodný pro perorální podání, obsahuje 50 mg (sušina) cyklosporinu v každém mililitru. Alternativně může být uvedený roztok plněn do měkkých nebo tvrdých želati-nových tobolek za účelem maskování chuti uvedeného preparátu.

Cyklosporiny skupin 4 a 6, zejména individuální cyklo-;. sporiny těchto skupin, které byly výše specificky vyjmenovány, mají rovněž farmaceutickou účinnost. Tyto cyklosporiny zejména vykazují imunosupresivní, protizánětovou a protiparazitickou účinnost, jak to bylo prokázáno při testech in vitro a in vivo, například při dále popsaných testech. Uvedené cyklosporiny jsou rovněž účinné vůči experimentální alergické encefalomyelitidě.. (EAE) u krys, což je rovněž popsáno dále. Příklad 4

Imunosupresivní účinnost 4.1 Lokální hemolýza in vitro v gelu /R.I. Mishell a R.W. Dutton, J. Exp. Medicine, 126, 423-442 (1976)/. Cyklosporiny skupin 4 a 6 inhibují hemolytické zóny ve srovnání s kontrolními vzorky bez aplikace cyklosporinu při koncentracích 0,03 až 10,0/Ug/ml. t , in r Ί .I,· tm. ./j -Λ !*» ni twmmI '>* 1" 4.2 Test na stimulaci lymfocytů podle Janossy-ho a Greaves-a /Clin. Exp. Immunol., 9, 483 (1971) a 10, 525 (1972)/. Cyklosporiny skupin 4 a 6 inhibují concanavalinem A sti- 75 mulovanou DNA-syntézu (inhibice H^-thymidinové inkorporace), buněčnou profiferaci a blastogenezi v lymfocytech myší sleziny ve srovnání s kontrolními vzorky bez aplikace cyklosporinú v koncentracích 0,001 až 3,0^ug/ml. 4.3 Smíšená lymfocitni reakce /Bach a kol., J.Exp. Med. 136, 1430 ¢1972)/. Vyhodnocuje se smíšená reakce (tj. —-----—- fpro-l-i-f-erač n í- a~d if .er.en cla č n i,).,I.ymf.ocyt.ů_( s 1 ez inové buň- ky myší Balb/c) po 5 denní společné inkubaci s allogen-ními slezinovými buňkami z ozářené myši (CBA) v přítomnost a nepřítomnosti testované látky. Reakce v nepřítomnosti testované látky slouží jako kontrolní reakce a je vzata za 100 %. Reakce v přítomnosti testované látky se vyjádří jako procentická změna ve srovnání se 100% kontrolní reakcí. Je pozorována inhibice uvedené reakce ___________použitím cyklosporinú skupin 4 a 6 v koncentracích 0,001 až 3,0yug/ml. Příklad 5

Protizánětová účinnost

Tato protizánětová účinnost muže být prokázána testem na adjuvantní artritidu u krys. Za účelem tohoto testu se uvedená adjuvantní artritida indukuje postupem podle Pearson-a a Wood-a, popsaným v "Arthr. Rheum." 2, 440 (1959). Cyklosporiny skupin 4 a 6 vykazují při tomto testu účinnost vůči rozvíjející se a stabilizované artritidě při dávkách 5 až 30 mg/kg/den podávaných perorálně. -Přiklad,...6__________,__________________________________

Protiparazitická (protimaláriová) účinnost

Protimaláriový test padle L. Rane-a, popsaný v "Chemotherapy and Drug Resistance", nakl. W. Peters, Academie Press, New York, 1970. Myši (samečkové, 0F1) se v den 0 infikují 0,2 ml 76 suspenze obsahující 10^ parazitických buněk druhu Plasmodium berghei (kmen NK 65), podané intraperitoneálne. Testovaná látka se podává subkutánně třetí den v proměnné dávce, přičemž se použije 5 až 10 myší na každou dávku. Zaznamenává se doba přežití a minimální účinná látka se vypočte srovnáním doby přežití s dobou přežití pokusných zvířat, kterým nebyla podána testovaná *látka. U kontrolní skupiny pokusných zvířat činí doba přežití asi 7 dnů. Minimální účinná dávka je dávka, při které se dosáhne dvojnásobné doby přežiti oproti době přežití kontrolní skupiny pokusných zvířat. .Cyklosporiny skupin 4 a 6 jsou při tomto testu účinné při dávkách 10 až 100 mg/kg/den. Příklad 7 Účinek na experimentální alergickou enceřalomyelitidu (EAE) u.v |ř krys

1) Účinek na stabilizovanou EAE

Ve skupinách 8 až 12 jinak zdravých krysích samečků s tělesnou hmotností 150 až 200 g se indukuje experimentální alergická encefalomyelitida technikou, popsanou Borel-em a kol. v Agents and Actions 6, 468 (1976). krysy se přechovávají za laboratorních podmínek a mají volný přístup k potravě a .vodě, kterou mohou konzumovat ad libitum. Rozvoj EAE je pozorován po 10 až 13 dnech, kdy se objevují symptomy ochrnutí, například zadních běhů. Testovaná sloučenina se podává pokus-ným zvířatů perorálně v dávce 25 až 50 mg/kg každý den po dobu pěti po sobě jdoucích dnů následujícím po pozorovaném rozvoji nemoci. Krysy se denně pozorují za účelem zjištění chorobných symptomů a počtu zotavených krys, jakož i doby zotavení. Toto pozorování se provádí potom ještě po dobu dalších 5 až 8 týd-nů»po-propuknutí nemoci za účelemrzjištění^pří^adného^návra^tu*^ onemocnění. I v tomto případě se zaznamená počet krys s recidivou onemocnění a doba^kdy k této redicivě došlo.

Po podávání cyklosporinů skupin 4 a 6 ve výše výmeze- 5 77 5 77

ných dávkách se dosáhne ve srovnání s kontrolní skupinou pokusných zvířat, které bylo podáno pouze placebo (olivový olej), zkrácení doby zotavení pokusných zvířat.

2) Účinek při prevenci výskytu EAE

Tento test se provádí způsobem, který je analogický s výše popsaným způsobem^řo^dení^tešf^TT ~ V ~tomt cn~pří padě^se------- však testovaná sloučenina podává v dávkách 25 až 50 mg/kg per-orálně každý den, přičemž se s podáváním testované sloučeniny 2ačíná v den sensibilace (indukce EAE) a pokračuje se v něm po dobu 14 dnů. Krysy se denně pozorují 2a účelem zjištění symtomů ochrnutí, přičemž se doba propuknutí EAE u jednotlivých posti- . zených pokusných zvířat. V pozorování se pokračuje po dobu několika měsíců za účelem zjištění případného zpožděného propuk-"'"nutí"nemocř........- --- - - ·--.................... ..---------- ---- ---- -------- Při podávání cyklosporinů skupin 4 a 6 ve výše vymezených dávkách se dosáhne ve srovnání s kontrolní skupinou pokusných zvířat, které bylo podáváno pouze placebo (olivový olej), zabránění propuknutí uvedené experimentální alergické encefalo-myelitidy.

Vzhledem k jejich imunosupresivní účinnosti jsou cyklo-sporiny skupin 4 a 6 indikovány pro použití při profylaxi a léčení nemocí a- stavů vyžadujících snížení imunitní odezvy.

Tyto cyklosporiny mohou být takto použity pro potlačení pro-liferace lymfocytů a imunocytů, například při léčení autoimu-nitních onemocnění, nebo při zabránění odmítání organismem orgánových transplantátů, jakými jsou například srdeční, srdeč-ně-plicní, kožní, rohovkové, kostně-dřeňové, slinivkove a led-- v vinové·, .transplantáty*..___________ ... , S ohledem na jejich protizánětovou účinnost a účinnost ...vůči. EAE. jsou.cyklgsporiny. .skupin 4.a. 6. rovněž indikovány pro použití při léčení zánětových stavů, zejména zánětových stavu s etiologií zahrnující autoimunitní složku, například pro %

78 78 "l léčení artritidy (například revmatoidní artritidy, chronické artritidy progredientní, jakož i deformující artritidy) a revmatických onemocnění, jakož i autoimunitních hematologických poruch (včetně hemolytické anémie, aplastické anémie a idiopa-thické trombocytopenie), systemickéhc lupusu erythematoces, polychondritidy, sklerodému, Wegenerovy granulamatosy, dermato-myositidy, chronické aktivní hepatitiay, myastenie gravis,, pso-riasy, Steven-Johnsonova syndromu, idiopathické sprue, autoimunit nich zánětových ,střevních-onemocnění (včetně například ulcera-”-' tivní kolitidy a Crohnovy nemoci), endokrinní oftalmopatie, Graveovy nemoci, sarkoidosy, primární biliární cyrhosy, primární juvenilní diabetes (diabetes mellitus typu I), uvsitidy (anteriorní i posteriorní), intersticiální plicní fibrosy, pso-riatické artritidy, glomerulonefritidy (s a bez nefrotickáho syndromu, například včetně idiopathického nefrotickáho. syndromu nebo minimální modifikované nefrcpatie) a roztroušená sklercey.

Vzhledem k jejich antiparazitické účinnosti jsou cyklo-sporiny skupin 4 a 6 "rovněž indikovány pro použití při léčení parazitických onemocnění, například kokcidiomykosy a schisto-somiasy a zejména protozoálních infekcí , zejména malárie. Při výše uvedených aplikacích se bude podávaná dávka samozřejmě měnit v závislosti na konkrétním použitém cyklospo-rinu, způsobu podání a zejména na typu léčeného onemocnění a požadované terapii. Obecně se však dosáhne uspokojivých vý-.^sledků při perorálním podání denní dávky asi 1 až 100, výhodně asi 5 až 50, nejvýhodněji 10 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta. Celková denní dávka vhodně činí asi 75 až asi 2000, výhodně asi 200 až asi 1 000 ,' nejvýhodněji asi 300 až asi 700 mg. Dávkové formy vhodné pro perorální podání proto vhodně obsahují asi 20 až asi 2000, výhodně asi 50 až asi 1000, nejvýhodněji asi 75 až 700 mg cyklosporinu ve směsi s pevným nebo .kapalným farmaceutickým ředidlem nebo nosičem, přičemž je.*uvedené*mnozství účinné^látký podano"v*"jectine~den"ní dávce nebo ve 2 až 4 čílčích denních dávkách.

Jak již bylb uvedeno výše bude uvedena denní dávka & *··. . ·.· ·*> , --i·: * /

79 mezi jiným záviset i na konkrétním zvoleném cyklosporinu, přičemž se bere v úvahu jeho relativní potence účinku. Pro výhodné cyklosporiny skupin 4 a 6 byly při sérii experimentů provedených v rámci výše uvedených příkladů 4 získány výsledky /hodnoty IC^Q (^,ug/ml), které jsou uvedeny v následující tabulce:

Cyki-ospori-n---------Metoda— testu -podle-pxíkladu. 4.1 • ΓΟ 4.3 4.8 0,1 0,16 0,09 6.4 0,03 menší než 0,008 menší než 0,008 6,15 0,057 menší než 0,008 menší než 0,008 Výhodným cyklosporinem pro použití při antiparazických indikacích je cyklosporin 4.7. Při testu podle příkladu 6 byla pro tento cyklosporin získána hodnota ED^ = asi 15,0 mg/kg.

Vzhledem k výše uvedenému vynález rovněž poskytuje: 7. farmaceutickou kompozici obsahující cyklosporin výše uvedených skupin 4 nebo 6 ve směsi s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem; 8. způsob indukce imunosupresivní účinnosti za účelem léčení zánětových onemocnění nebo stavů nebo za účelem léčení parazitických infekcí u pacienta, který takové léčení potřebuje, jehož podstata spočívá v tom, že se uvedenému'~pa'ci‘en‘tovi---p0dá"-účinné~množ-s-tví- -cy-kl-ospo-r-inu—-výše definované skupiny 4 nebo 6, jakož i cyklosporin ‘skupiny1 4' a '6' pro použití' jako· farmaceu-...... tické činidlo, například jako imunosupresivní činidlo, jako protizánětové činidlo nebo jako protiparazitické 80 činidlo.

Specifickými imunosupresivními, protizánětovými a proti-parazitickými použitími, pro která jsou indikovány cyklosporiny skupin 4 a 6, jsou libovolná z výše popsaných použití, zahrnující specifické formy orgánových transplantací, zánětová onemocnění, autoimunitní onemocnění nebo parazitické infekce, jejichž výčet již byl uveden výše.

3DDr. Jarmila Traplová

Claims (10)

1. - 81 - lili t / .patentové nároky 1 , Cyklosporiny i) obecného vzorce II -A-B-X-MeLeu-Y-MeLeu-Ala-(D) Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-, ve kterém

   (Π) A znamená -3 -0-acetvl-Me3mt- B znamená -alfaAbu-, -Thr-, -Val- nebo -Nva-, a když B znamená -alfaAbu-, X znamená -(D)Ala- a Y znamená -Val-, když B znamená -Thr- nebo -Val-, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-, nebo když B znamená -Nva-, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-, nebo X znamená -(D)Ala- a Y znamená -Val-, nebo ve kterém _A_ znamená -3 "O-acetyl-dihydro-MeBmt- nebo -cis-Me3mt-, B znamená -alfaAbu, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-, nebo ii) obecného vzorce II' li « á i 82 i 82 <Π') -A-B-X-MeLeu-Y-HeLeu-Ala-V-MeLeu-MeVal-i ι «h * , i s ve kterém A znamená -3 -O-acyl-MeBmt- nebo -3’-0-acyl-dihydro-MeBmt- zbytek, B znamená -alfaAbu-, -Thr-, -Val-, -Nva- nebo beta-O-acyl- alfa-aminokyselinový zbytek, X znamená -Sar- nebo opticky aktivní alfa-N-methylovaný alfa-aminokyselinový zbytek mající kbnfiguraci {D>, y znamená beta-hydroxy- nebo beta-O-acyl-alfa-aminokysali- nový zbytek mající konfiguraci (D), nebo iii) ve kterém zbytek v poloze 1 je -8 -C^-Cg-arlkoxy-cis-MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt- nebo -3‘-0-acyi-8 "-C^-Cg-alkoxy-cis-MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-zbytkem, ^^-O-acyl-cis-MeBmt-zbytkem, -7 ’-desmethyl-7 '-hydrcxykarbyl- -MeBmt-nebo -cis-MeBmt- nebo -3"-O-acyl-7*-dssmethyl-7 '-hydro-karbyl- -MeBmt- nebo -cis-MeBmt-zbytkem, ve kterém hvdro-karbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atomy, nebo -7"-desmethyl-?"-hydrokarbyl-dihydro-MeBmt- nebo -3 -0-acetyl-7 -desmethyl-7"-hydrokarbyl-dihydro-MeBmt-zbytkem, ve kterém hydrokarbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atomy a ve kterém každá alifatická skupina, která je obsažena v uvedeném hydrokarbylovém zbytku nebo která tento zbytek tvoří, je nasycenou skupinou, nebo iv) ver kterém 3 -uhlíkový atom zbytku v poloze 1 je oxo-, C^-C^-alkoxyimino-, azidoalkylkarbonyloxy- nebo alkoxy-karbonyloxy-substituován, nebo ve kterém beta-uhlíkový atom zbytku v poloze 2 je beta-oxo-substituován, nebo 83 znamená (L)-isoleucylový zbytek, nebo v) obecného vzorce XX (XI) rA-3-Sar-říeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-HeLeu-KeLeu-2n ve kterém A znamená -N-desmethyl-dihydro-MeBmt-, B znamená -Thr- a Z znamená -MeVal-, nebo A znamená -dihydro-MeBmt-, B znamená -Thr- a Z znamená -Val-, nebo A znamená -iheLeu-, B znamená -alfaAbu- a Z znamená -Val-, ...nebo který znamená vi) diester dikarboxylové kyseliny cyklosporinu majícího beta-hydraxy-(L)-alfa-aminokyselinový zbytek v poloze 2.
2. 2. Cyklosporin podle nároku 1, ve kterém zbytek v poloze 1 je zbytkem obecného vzorce XXI R. 'ch3 8b-0 (R) CH -CH-C0- ......(S)"" CHj 84 ve kterém R znamená -x'- y'-R , kde a C znamená -CH=CH- nebo -CH.-CH, a R znamená 4ě L· ^ C C2~Cg-alkoxymethylovou skupinu nebo -x'-y'- znamená ^ čis nebo trans -CK=CH- nebo -CH,-CH-- a R znamená á í í C Í hydrokarbylovou skupinu mající alespoň dva uhlíkové fé atomy, přičemž znamená-li -x'-y'- skupinu -CH2-CK2-, potom je každá alifatická skupina obsažená v R nebo i , .v v * *.··- C ’ tvořící Rc nasycenou skupinou, a znamená atom vodíku nebo acylovou skupinu.
3. 3. Cyklosporin podle nároku 1, ve kterém zbytek v poloze 1 je -3 -desoxy-3"-oxo-MeBmt-zbytkem, ~3*-desoxy-3'-(ci-C4-alkoxyimino)-MeBmt~zbytkem, -3 '-O-ÍC^-C^-azidoalkyl)-karbony1-MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-zbytkem nebo -3'-O-f^-C^-alkoxv) -karbonyl- -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-zbytkem, nebo ve kterém zbytek v poloze 2 je -alfa-methylketo-Gly- nebo -Ile-zbvtkem.
4. 4. Cyklosporin podle nároku 1 zvolený z množiny zahrnující: 1.2 • 1.3 1-5 1.6 1.7 1.10 1.11 1.12 1.15 1.16 17- 1.13 1.19 1-20 0 * Ě [3'-Q-acacyl-heBnc j1-[ValJ1-Ciclosporin; [ 3'-O-acs cyi-MeSac^-iThr]3-Ciclosporin; [3'-Q-ac2Cyl-Me3mc J1-(MvaJ2-(NvaJ ^Ciclosporin; [3'-Q-ac2Cyl-Me3rcc ] l-((D)Ala]3-Ciclosporin; [ 3' -O-aca :yl-íie3iii: I - - [Jíva ]2 - [ (D) Ala J3 -Ciclosporin; [3'-0-ac2Cyl-dihydro-Me3mt]1-Ciclosporin; [ 3' -Q-aie choxycarbony 1-He3ni c j1 -Ci closoo r in; [3'-0-(4-azidobucanoyl)-Me3incJl-Ciclosporin; [3' -0-acscyl-Ha3(nc 11 - (O-aca eyl-(D)Sšrj1 -Ciclosporin; [3'-O-acsty1-3' -iiier.hoxy-cis-Me3mc] '-Ciclosporin; [3'‘-Q-acety 1-3'-k-bútoxy-cis-MeBmi:]1-Ciclosporin; (3' -O-acaty1-3' -mecÍiaxy-cis-Me3mt ] L-[0-acetyl-Thr 12-Ciclosporin; [ 3' -O-acs cy 1-3' -c. butoxy-cis-MeSmt ]1 -[O-acs tyl-Thr 11 -Ciclosporin; [3'-0-aceCyl-8' -nechor/-cis-Me3mc j ^(Valp-Ciclospocin; 85 1.21 (3'-O-ace cyl-8'-methoxy-cis-MeBmt}1-[Nva]2-Ciclosporin;

   1.22 [3'-O-acetyl-7'-desmethyl-7'- fenyl-MeBmt p-Ciclosporin; 1.23 (3'-O-acetyl-cis-MeBmt]l-Ciclosporin; 1.2A (3'-O-acetyl-7'-desmethyl-7'-vinyl-cis-MeBmt]1-Ciclosporin; 1.25 [3'-O-acetyl-7'-desmethyl-7'-vinyl-cis-Me3mt]1-[O-ace:yl-Thr|2 - Ciclosporin; -1-.-26—[.3i-0^ace.tyl-.7.1-.de sme.thy.lr2L-i.._.p_en ty_l - c i s-MeBm t 11 -Ciclosporin; 1.27 [3'-O-acety1-7'-desmethyl-7'- fenyl-cis-MeBmtjlrCiclosoorin; 1.28 [3'-0-acetyl-7'-desmethyl-7'-n.propyl-cis-«eBmt]1-Ciclosporin; 1.29 [3' -O-acety 1-7' -desmethyl-7' -(£5-allyl)-cis-MeBmC ]^Ciclosporin; 1.30 (3'-O-acetyl-7'-desmethyl-7' - £ enyl-MeBmt]l-(Val]3-Ciclosporin; 1.31 [3'-O-acety 1-7'-desmethyl-7' - f enyl-cis-MeBmtp-lVaip-Ciclosporin; 1.32 [3' -O-acety1-7'-desmethyl-7'-vinyl-cis-HeBmt]L-[Vall2-Ciclospocin; 1.33 {3'-O-acetyl-7'-desmethyl-7'-vinyl-cis-MeSmc]1-[Nva]1-Ciclosporin; 1.34 [3'-O-acetyl-7'-desmethyl-7'-(3-brom -n.propyl)-cis-Me3mc11 - Ciclosporin; ....... 1.36 /o-threonyl/2-Ciclosporin-diester kyseliny 1,2-ethandikarboxylové; 1.37 [ 2' -desoxy-3' -oxo-MeBmt "j * -Ciclosporin; 1.38 (3'-desoxy-3'-oxo-MeBmt]l-(Val]2Ciclosporin; 1.39 [3'-desoxy-3'-oxo-MeBmt)l-[Nva]2Ciclosporin; 1.40 [o-methylketo-Gly]2-Ciclosporin; 1.41 [dihydro-HeBm t]1-[α-me thylke to-GlyJ2-Ciclosporin; 2.1 [3'-desoxy-3'-methoxyimino-MeBmt J1-Ciclosporin; 2.2 [Ile]2-Ciclosporin; 3.6 [N-desmethyl-dihydro-MeBmt]1-[Thr]2-Ciclosporin; 3.8 [dihydro-HeBmt]l-[Thr]2-[Val]11-Ciclosporin; 3.10 [MeLeu^-Ciclosporin; ř· 4.1 ^'-methoxy-cis-HeBmt^-Ciclosporin; ^ 4.2 ^'-t.butoxy-cis-HeBmt^-Ciclosporin; 4.3 (8'-methoxy-cis-HeBmt]l-lThr]2-Ciclosporin; * 4.4 [8'-t.butoxy-cis-MeBmt]1-[ThrI2-Ciclosparin; ~ 4.5 (8'-methoxy-cis-HeBmtl1-(ValI2-Ciclasporin; ^ 4;6 - -t8'--met-hoxy-cis-MeBiBt-l-1--[Nva.]?-Ci.clospo.r.in;. ........__............ 4.7 [8'-methoxy-dihydro-HeBratl1-Ciclosporin; 4.8 [8' -methoxy-dihyd:o-Me3mc ] L-[Thr) ^Ciclosporin; 4.9 [8'-me thoxy-d ihydro-MeBmc]1 -(ValJ2-Ciclosporin; 4.10 (8' -methoxy-dihydro-Meflmc)1 -[NvaJ *-Ciclosporin; 6.1 (7'-desmethyl-7'- f.enyl-MeBmt]1-Ciclosporin; 6.2 [7'-desmethy1-7'-f enyl-cis-MéBmt11-Ciclosporin; 6.3 [7'-desme thy1-7'-vinyl-cis-Me3mt]1-CicLospocin; 6.4' [7' -desmethyl-7' -vinyl-cis-MeBmc J1-[ThrJ3-Ciclosporin; 6.5 [ 7' -desmechyl-r7' -(3-mechyl-n. bu tyl)-eis-Me3mt ]1-Ciclosporin; — (7'-desme chyl-7'-n.p copy l-cis-He3mc]1-Ciclosporin; 6.7 [7'-desme thyl-7'-(f}-allyl )-cis-Meflmc Jl -Ciclosporin; •6.8 [7'-desmethyl-7'- fenyl-MeBmt]x-(Valj^-Ciclosporin; 6.9 [7'-desmethyl-7'- fenyl-cis-Me3mcjL-(Val]^Ciclosporin; 6 -10 [7'-desmeChyl-7'-vinyl-cis-MeBmc]·-[Val 11-Ciclosporin; 6.11 [T -desme thyl-7' -vinyl-cis-MeBmc]1 - [Jíva J * -Ciclosporin ; 6.12 (7'-desmethyl-7'-(3-brani -n.propyll-cis-MeBmc]1-Ciclosporin; 6-13 (7'-desmethyl-7'- f enyl-dihydro-MeBmc]:-Ciclosporin; 6.14 [7'-desmethyl-7'-n.propyl-dihydro-MeSrat J1-Ciclosporin; 6.15 [7'-desmethyl-7'-sthyl-dihydro-Me3mcJl-[Thrj7 Ciclosporin; 6.16 {7'-desmethyl-7'-(3-mechyl-n.butyl)-dihydro-Me3mt]1-Ciclosporin 6.17 [7'-desme thyl-7'- i.propyl-díhydro-MeBm:]1-Ciclosporin; 6.13 [7'-desmethyl-7'-ethyl-dihydro-Me3mc J--[ValJí-Ciclospocih; 6.19 [7'-desme thyl-7'-echyl-dihydro-MeBmc]1 -[NvaJ:-Ciclosporin; 6.20 [7'-desmethyL-7'- fenyl-dihydro-HeSmt];-[Val11-Ciclosporin; 6.13 [7'-desmethyl-7'-echyl-dihydro-Me3mtJ1-Ciclosporin; and [cis-y.e3mc]1-Ciclosporin. # Cyklosporin ve kterém 3"-uhlíkový atcm zbytku v poloze 1 nebo beta-uhlí kový atom zbytku v poloze 2 je O-acyl- nebo oxo-substi tuován, nebo ve kterém 3 "-uhlíkovým atom z by tku jv,_ poloze 1 *>je C^-C^ alkoxyimino-substituován, ve kterém zbytek v poloze 2 je (L)-isóleucylovým zbytkem, nebo zbytek v poloze 11 je N-methyl-(L)-alanylovým, . N-methyl-(L)-isoleucylovýtn nebo N-methyl-(L)-alloisolaucylovým zbytkem, nebo 87 i i i) obecného vzorce XI uvedeného v nároku 1, ve kterém Z znamená -Val- nebo -MeVal-: ..... - · když Z znamená -Val-, A znamená -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-, nebo „ íjj když Z znamena -MeVal-, £ A znamená -3'-desoxy-MeBmt-, -3'-desoxy-dihydro-MeBmt-, - ---—---------- -—N-d-e sme t-h-y-1 -MeBmt-·,~^.Ν-ά esmethylcd-ihyd r o - MeBmt-,___%_ -3-desoxy-4'-desmethyl-dihydro-MeBmt- nebo -MeLeu, a když Z znamená -Val, B znamená -alfaAbu- nebo -Thr-, I když Z znamená -MeVal- a A znamená -3'-desoxy-MeBmt-, -3'-desoxy-dihydro-MeBmt-, -3'-desoxy-4'-desmethyl-dihydro-MeBmt- nebo -MeLeu-, .............. ...... .......... B znamená -alfaAbu-, nebo když Z znamená -MeVal- a A znamená -M-desmethyl-MeBmt- nebo -N-desmethyl-dihydro MeBmt-, B znamená -Thr-, ť 1 - ,V ΐ-, % 2;, pro použití jako farmaceutické činidlo, zejména pro použití při zlepšení nebo zvýšení účinnosti jiné chemoterapeutické léčby nebo citlivosti vůči jiné chemoterapeutické léčbě, nebo pro použití při snížení účinné chemoterapeutické dávky druhého che-moterapeutického činidla, nebo pro použití jako přísada při léčení morbidních stavů, charakterizovaných resistencí vůči druhému chemoterapeutickému činidlu, nebo pro použití při zlepšení chemoterapeutické léčby morbidních stavů vykazujících rěsT stene I ”vůci~ u vedené" l~éčbě- ne bo-c h-a-rakt-eri z© va-nýeh-t akovou— resistencí, nebo pro použití při potlačení nebo omezení resis-tence vůči chemoterapeutické léčbě, nebo pro použití při obnovení citlivosti vůči chemoterapeutické léčbě, nebo pro použití jako přísada k jiné chemoterapeutické léčbě. 8. Cyklosporin podle nároku 7, který je tvořen cyklosporinem definovaným pod některým z odstavců i), ii), iv), v) nebo ví) nároku 1 nebo cykLosporinem definovaným pod odstavcem iii) nároku 1, ve kterém je zbytek v poloze 1 3 -0-acyl“5ubstituován.
5. 9. Cyklosporin podle nároku 7 zvolený z množiny zahrnující 1*1 [3'-O-acetyl-HeBmt]1-Ciclosporin; "'1“4‘ ^'-Q-acetyl-HeBaitp-tNvá]2-Ciclosporin; 1.8 [3'-O-acetyl-HeBnK ]l-[(D)MeVal]11-Ciclosporin; 1.9 [3'-0-ace cyl-MeBmc ]1-(Val ]11-Ciclosporin; 1.13 [3'-0-acetyl-HeBínt]L-[0-acetyl-Thr]2-Ciclosporin; 1.14 [3'-0-acetyl-N-desmethyl-MeBrat]1 -[0-acecyl-Thr|2-Ciclosporin 1.35 [0-acetyl-Thr]J-Ciclosporin; 2.3 [HeAla]1l-Ciclosporin; . . .. 2.4 [Melle]11-Ciclosporin; 2.5 (MealloIlejL^-Ciclosporin; 2.6 [MeLeu]1 ^Ciclosporin;· 3.1 ~p/aij11-Ciclosporin; 3.2 [dihydro-HeBmc]1-[Val]ll-Ciclosporin; 3.3 [ 3'-desoxy-Me3m c]1-Ciclosporin; 3.4 [3'-desoxy-dihydro-MeBmc]1-Ciclosporin; 3 - 5 [N-desmethyl-HeBmc J1-[Thr]2-Ciclosporin; 3.7 [Thr]J-{Val]ll-Ciclosporin; 3.9 [3'-desoxy-4'-desmathyl-dihydro-říe3in:]l-Ciclospocin; . a individuální cyklosporiny 1.2 až 1.41, 2.1 a 2,2 a 3,6 až 3.10 podle nároku 4.
6. 10. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje cyklos.porin mající strukturu definovanou v některém z nároků 7 až 9 společně s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem.
7. 11. Cyklosporin podle nároku 1, ve kterém zbytek v poloze 1 89 je -cis-Me3mt-zbytkem, -8 -C.-Cfl-alkoxy-cis-MeBmt-zbytke;n 1 o

   nebo -dihydro-MeBmt-zbytkem, -7 '-desmethyl-7Í-hydrokarbyl-MeBmt-* nebo -cis-MeBmt-zbytkem, ve kterém hydrokarbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atomy, -7 "-desmsthyl"? -hydrokarbyl-dihydřo-MeBmt-zbytkem, ve kterém hydrokarbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atomy a ve kterém každá alifatická skupi-na obsažená v tomto hvdrokarbylovem zbytku nebo tvořící tento hydrokarbylový zbytek je nasycenou skupinou, pro použití jako imunosupresivní činidlo, pro použití jako protizánětové činidlo nebo pro použití jako protiparazitické činidlo.
8. 12. Cyklosporin podle nároku 11 zvolený z množiny zahrnující cyklosporiny 4.1 až 4.10 a 6.1 "až 6;21 podle nároku 4 a /cis-MeBmt/"*-Ciclosparin.
9. 13. Cyklosporin, ve kterém zbytek v poloze 1 je -5 -des~(l-propenyl)-5 -formyl-MeBmt-zbytkem ve volné nebo 3 -O-chráněné formě.
10. 14. Cyklosporiíi podle nároku 13 zvolený z množiny zahrnující: 5.1 5.2 5.3 5.4 ^'-O-acetyl-S^des-U-pcopenylJ-S^focinyl-HeBmc ] L-Ciclosporin; [3' -O-acaryU:' -das-(l-propenyl)-5'-focÍnyl-He3nc J^fO-acetyl-Thr 1 !-Ciciasparín; [3'-0-ac2:yL-3'-des-(l-pcooenyl)-5'-£or3iyl-He3int J1 -[Val JJ-Ciciosaocin; a (3' -0-acs-yl-3'-des-(l-pcooenyl)-5'-fornyl-He3int lL-(Nvap- f Ciclosaoriíi-

    Zastupme: jj. Mí/>y 3UDr. Jarmila Traplavá