SK411791A3 - Cyclosporines and pharmaceutical agent which containing them - Google Patents

Description

Od prvotního objevu Ciclosporinu bylo izolováno a identifikováno velké množstvi prírodné se vyskytujících cyklosporinu a mnoho dalších umelých, v prírode se nevyskytujících cyklosporínu zcela- nebo polosyntetickými postupy anebo použitím modifikovaných kultivačních technik. A tak skupina cyklosporínu je nyní velmi početná a zahrnuje napríklad prírodní cyklosporiny A až Z /viz Traber a kol. 1, Helv.Chim.

Acta, 60, 1247-1255 (1977); Traber a kol. 2, Helv. Chim. Acta, é‘

65, 1655-1667 (1982); Kobel a kol., Európ. J. Applied Microbiology and Biotechnology 14, 273-240 (1982); a von Wartburg a kol., Progress in Allergy, 38, 28-45(1986)/, jakož i rúzné v prírode se nevyskytující cyklosporinové deriváty a umelé nebo syntetické cyklosporiny, včetné dihydro- a iso-cyklosporinú /ve kterých je zbytek -MeBmt-zbytku (výše uvedený vzorec B) nasycen a takto znamená -CH₂~CH₂- nebo ve kterých vazba zbytku -MeBmt- ke zbytku v poloze 11 cyklosporinové molekuly (výše uvedený vzorec A) je realizována pŕes 3'-Oatom a nikoliv pŕes alfa-N-atom/; derivatizovaných cyklosporinú (napríklad ve kterých je 3-0-atom zbytku -MeBmt- acylován nebo na alfa-uhlíkový atóm sarkosylového zbytku v poloze 3 j je zaveden další substituent); cyklosporinú, ve kterých je zbytek -MeBmt- pŕítomen v isomerní forme (napríklad ve kte 'S' .

rých je konfigurace poloh 6 a l' zbytku -MeBmt- cis a nikoliv trans); a cyklosporinú, ve kterých jsou do špecifických poloh peptidové sekvence inkorporovány variantní aminokyseliny, pŕičemž se napríklad používá zcela syntetických metód pro prípravu cyklosporinú vyvinutých R.Wenger-em; viz napríklad Traber a kol. 1, Traber a kol. 2 a Kobel a kol.(výše zmĺnéné citace); patenty US 4108985, 4210581, 4220641, 4288431,

4554351 a 4396542; evropské zverejnené patentové prihlášky 0034567 a 0056782; mezinárodní patentová prihláška WO 86/02080; Wenger 1, Transpl. Proc. 15, Suppl. 1:2230 (1983); Wenger 2, Angew. Chem. Int. Ed., 24,77 (1985); a Wenger 3, Progress in the Chemistry of Organic Natural Products 50, 123 (1986).

Skupina zahrnující cyklosporiny je tedy v soucasne dobé velmi rozsáhlou skupinou, která napríklad zahrnuje /Thr/ /Val/ /Nva/ - a /Nva/ -/Nva/ -Ciclosporin (rovnéž známé jako cyklosporiny C, D, G a M), /3-0-acetyl-MeBmt/¹-Ciclosporin (rovnéž znám jako cyklosporin-A-acetát), /Dihydro12 - MeBmt/ -/Val/ -Ciclosporin (rovnez znám jako dihydro-cyklo12 - sporin D), /Iso-MeBmt/ -/Nva/ -Ciclosporin (rovnez znám jako 8 11 isocyklosporin G),/(D)Ser/ -Ciclosporin, /Melie/ -Ciclosporin, /(D)MeVal/¹^Ciclosporin (rovnéž znám jako cyklosporín H), /MeAla/ -Ciclosporin, /(D)Pro/ -Ciclosporin atd..

W

V souladu s konvenční nomenklatúrou cyklosporínu jsou tyto cyklosporiny v popisné části a nárocích definovány pomoci štruktúry Ciclosporinu (tj. Cyklosporínu A). To je učinéno jednak vyznačením prítomných amínokyselinových zbytkú, které se liší od amínokyselinových zbytkú prítomných v Ciclosporinu (tak napríklad/(D)Pro/ znamená, že daný cyklosporín má v poloze 3 zbytek -(D)Pro- a nikoliv zbytek -Sar-) a jednak použití™. výrazu Ciclosporin pro charakterizaci zbývajících zbytkú, které jsou identické se zbytky obsaženými v Ciclosporinu.

Zbytek -MeBmt- v poloze 1 Ciclosporinu byl pred objevením cyklosporinú neznám. Tento zbytek a jeho varianty nebo modifikace, které budou napríklad popsané dále, je tudíž « obecným charakteristickým znakem cyklosporinú. Obecné jsou uvedené varianty nebo modifikace zbytkú /MeBmt/¹ definovány « vztažením ke štruktúre -MeBmt-. Tak napríklad dihydrocyklosporiny, ve kterých je zbytek -x-y- (viz výše uvedený vzorec B) redukován na -CHCH jsou v poloze 1 definovány jako -dihydro-MeBmt-. U cyklosporinú, ve kterých má zbytek -x-y- konfiguraci cis a nikoliv trans, je odpovídající rezultující zbytek definován jako -cis-MeBmt-.

Jestliže jsou nékteré části zbytkú -MeBmt- vypuštény, potom se označí poloha, ve které došlo k vypušténí,použitím predpony des vyznačujici toto vypušténí a uvedením skupiny nebo atómu, které byly vypuštény, a to pred symbolem

-MeBmt-, -dihydro-MeBmt-, -cis-MeBmt-, atd.. Zbytky

-N-desmethyl-MeBmt-, -3 -desoxy-MeBmt- a -3 -desoxy-4 12 desmethyl-MeBmt- jsou tudiz zbytky obecného vzorce B , B , n³ resp. B

CHj

CH ί TRANS

CH

CHj

Ϊ (R) CH CH (R)^{V * * * * X}X

I

I

-N'-CH—COI (S)

.. z (B>, B², B²)

3‘	- X = CH, ,	Ϊ = OH,	, Z = H.
B2	- X = CHj,	ϊ = H ,	, Z = CH,
3’	- X = H,	Ϊ = H,	Z = CH,.

V prípade, že polohy nebo skupiny, napríklad v -MeBmt- jsou substituované, potom je to vyznačeno konvenčním zpúsobem tak, že se definuje poloha a povaha substituce. Takto zbytek -3 '-O-acetyl-MeBmt- znamená zbytek obecného vzorce B, ve kterém je skupina -OH v poloze 3* acetylována (3 -O-COCH^). V prípade, že nékteré skupiny, napríklad v -MeBmt-, jsou nahra ženy jinými skupinami, potom je to vyznačeno i) udaním polohy nahražené skupiny použitím systému predpony des, který již byl popsán vyše, a ii) definováním nahrazující skupiny. Takto je zbytek -7'-desmethyl-7'-fenyl-MeBmt- zbytkem vyše uvedeného obecného vzorce B, ve kterém je koncová 8 -methylová skupina nahražena fenylovou skupinou. 3 -Desoxy-3 -oxo-MeBmt-zbytek je zase zbytkem vzorce B, ve kterém 3 -OH-skupina je nahražena skupinou =0.

Kromé toho se u aminokyselinových zbytkú,uvádéných zkratkami, napríklad -Ala-, -MeVal-, -alfaAbu-, atd.. v souladu s konvenční praxi, rozumí, že mají konfigurací (L), pokud není výslovné uvedeno jinak, jak je tomu napríklad u ^M-(D)Ala-zbytku. Jestliže se pred zkratkou zbytku nachází symbol Me, jako napríklad v prípade zbytku -MeLeu-, potom to znamená, že jde o alfa-N-methylované zbytky. Jednotlivé zbytky cyklosporinové molekuly jsou očíslovány, jak to obvyklé, ve smyslu otáčení hodinových ručiček, pŕičemž toto číslování začíná u zbytku -MeBmt-, -dihydro-MeBmt-, atd., který má takto polohu 1. Stejná numerická sekvence se používá v celé popisné části av patentových nárocich.

Dosavadní stav techniky

Vzhledem k jedinečným farmaceutickým vlastnostem upoutaly na sebe cefalosporiny značnou pozornost nejen lékaŕských a akademických kruhu, nýbrž i laické verejnosti. Cyklosporin samotný se nyní obecné používá pri prevenci odmítnutí organismem alogenních orgánu, jakými jsou napríklad srdeční, srdečnéplicní, ledvinové a kostné-dŕeňové transplantáty, a také - a to častéji - pri léčení rúzných autoimunitních a odvozených onemocnéní a stavú. Rovnéž byly vykonány rozsáhlé výzkumné práce majících za úkol vyzkoumat prípadnou použitelnost cyklosporinú pri léčení rúzných onemocnéní a infekcí, zpúsobených parazity, napríklad pri léčení malárie, kokcidiomykózy a schistomiazy. V současné dobé lze v odpovídající odborné literatúre nalézti velké množství výzkumných zpráv o výsledcích potenciálního použití širokého spektra rúzných cyklosporinú pri výše uvedených indikacích.

Podstata vynálezu

Nyní bylo s prekvapením zjišténo, že nékteré cyklosporiny jsou použitelné za účelem zvýšení citlivost organismu vúči jinému typu chemoterapie a zejména za účelem potlačení resistence organismu, a to jak indukované, tak i inherentní, vuči jinému typu chemoterapie.

Zvýšená resistence vuči chemoteraeutické terapii, následující po méné či délitrvajícím léčení, obecné po relatívne prolongované chemoterapeutické medikaci, je široce rozšíreným jevem, který je již dlouhou dobu znám a rozsáhle dokumentován v odborné literatúre. Klasický prípad takové resistence je zvýšená nebo indukovaná resistence parazitních, zejména bakteriálních, virálních nebo protozoálních organismú, následující po dlouhodobé a široce rozšírené medikaci za použití individuálních farmakologicky účinných látek. V téchto pŕípadech se infikující organismus časem stane vúči takto používané farmakologicky účinné látce resistentr.í a to vétší či menší mérou a v dusledku toho je uvedeným typem medikace jen obtížné eliminovatelný. Analogický jev byl pozorován pri chemoterapeutickém léčení rakoviny, napríklad pri léčení karcinomu, sarkomú nebo jiných nádorú nebo maligních novotvaru.

Chemoterapeutické léčení rakoviny, napríklad podávaním léčiv, zejména antineoplastických nebo cytotoxických léčiv, napríklad colchicinu, etoposidu, tenoposidu, adriamycinu, daunorubicinu a vincristinu, které jsou terapeutickými činidly redukující, inhibující nebo jinak omezující rust nádorú nebo metastáz, predstavuje prvoradý zpúsob léčení rakoviny rúzného typu. Nicméne bylo obecné zjišténo, že i když je nádor vuči chemoterapii zpočátku velmi citlivý, vzniká u nej tou mérou, jak chemoterapeutické léčení pokračuje, určitá resistence vúči podávanému chemoterapeutickému činidlu, což snižuje terapeutickou účinnost tohoto činidla. V prípade, že se zejména pri léčení pozdního štádia nebo terminálního štádia rakoviny použije pleiotropická nebo multiakční chemoterapie, potom i v tomto prípade dochází ke vzniku uvedené resistence.

K analogickým téžkostem dochází napríklad v pŕípadech, kdy jsou dlouhodobe praktikovaný určité formy chemoterapeutického léčení a kdy dochází napríklad ke vzniku resistentních kmeňu mikroorganismú, které mají vyvinutou inherentní nebo vrozenou resistenci. Stejné tak se často vyskytují formy rakoviny nebo nádoru, které mají vrozenou resistenci nebo sníženou míru citlivosti vúči obecné používaným antineoplastickým nebo cytostatickým chemoterapeutickým činidlám.

V souladu s vynálezem bylo nyní zjišteno, že dále definované cyklosporiny jsou použitelné pri zvyšování citlivosti vúči chemoterapeutickým činidlám nebo pri zvyšování účinnosti chemoterapeutických činidel, pŕičemž jsou zejména použitelné pri eliminaci resistence vúči chemoterapeutickým činidlúm rúzného typu (napríklad získané nebo vrozené resistence) nebo pri zvýšení nebo obnovení citlivosti vúči podávaným chemoterapeutickým činidlúm. Formy terapie chemoterapeutickými činidly, pro které je vynález použitelný, zahrnují napríklad antiparazitir-krii., napríklad antivirální , antibakteriální nebo antiprotozoální chemoterapii, a zejména antineoplastickou nebo cytostatickou terapii.

Cyklosporiny, které jsou použitelné pro použití v rámci vynálezu, lze zaradit do následujících skupín.

Skupina 1

Do této skupiny patrí cyklosporin, ve kterém je 3 uhlíkový atóm zbytku v poloze 1 nebo beta-uhlíkový atóm zbytku v poloze 2 O-acyl- nebo oxo-substituován.

Výhodnými cyklosporiny této skupiny jsou cyklosporiny:

1a) ve kterých je 3 -uhlíkový atóm zbytku v poloze 1 0acyl-substituován.

Když je 3 -uhlíkový atóm zbytku v poloze 1 0-acylsubstituován, potom zbytek v poloze 2 múže být rovnéž beta-0acylován.

Výhodnou skupinu cyklosporinu typu 1a) jsou cyklosporiny:

1a¹) ve kterých zbytek v poloze 1 je zbytkem -3 -O-acylMeBmt- nebo -3*-Q-acy1-dihydro-MeBmt obecného vzorce I

ACYL--0

(D

-a-Cz-COí (S) .

CH, ve kterém -x-y- znamená -C^-Cí^ nebo trans -CH=CH- a ACYl/ znamená acylovou skupinu.

Vhodnými acylovými skupinami ve významu obecného substituentu ACYl/ v obecném vzorci I jsou acylové skupiny obecných vzorcu R^-CO- a R^-O-CO-, kde R^ znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómy nebo azidoalkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómy a R£ znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómy, napríklad acetylová skupina, 4-azidobutanoylová skupina nebo methoxykarbonylová skupina. Výhodnou skupinou ACYL¹ je skupina obecného vzorce R^-CO-, kde R₁ výhodné znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómy. Nejvýhodnšjší skupinou R^-CO- je acetylová skupina.

Alkylové skupiny zahrnuté v obecných substituentech R₁ a R₂ mohou být alkylovými skupinami s prímým nebo rozvetveným uhlíkovým ŕetezcem. S výhodou jsou tyto skupiny skupinami s prímým uhlíkovým ŕetezcem. Rj nejvýhodnéji znamená methy lovou skupinu.

Obzvlášte výhodnými cyklosporiny skupiny 1a¹ jsou cyklosporiny obecného vzorce II nebo II

-Α-3-X-MeLeu- Y-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-“eVal12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 (H)

-A-a-X-MeLeu-Y-MeLeu-Ala-V-MeLeu-MeLeu-Meval-,

3 4 j 6 7fí9 10 11 J (Iľ ) ve kterých

A znamená zbytek definovaný výše pod 1a\

B znamená -alfaAbu-, -T'nr-, -Val-, -Nva- nebo zbytek beta-O-acyl-alfa-aminokyseliny,

X znamená -Sar- nebo zbytek opticky aktivní alfa-N-methylované alfa-aminokyseliny mající konfiguraci (D)—

Y znamená -Val- nebo také, když B znamená -Nva-, -Nva-, a

W znamená zbytek beta-hydroxy- nebo beta-O-acyl-alfaaminokyseliny mající konfiguraci (D).

Jestliže B je beta-O-acyl-alfa-aminokyselinovým zbytkem, potom má obecné konfiguraci (L). Výhodne je zbytkem obecného vzorce III

1

Jestliže X ve vzorci II je jiný než -Sar-, potom vhodne znamená -(D)Ala-.

Príklady cyklosporinú této skupiny vhodných pro použití v rámci vynálezu jsou:

1.1	[ 3' -0-Ace tyl-Me3njc ]l-Ciclosporin;
1.2	[3'-0-Acetyl-Me3mt[l-[Val]2-Ciclospočin;
1.3	[3' -0-Ace tyl-He3m t ^-[Thrp-Ciclosporin;
1.4	[3'-0-Aceryl—Me3mc11 - [Nva J2-Ciclospočin;
i. 5	[3'-0-Ace tyl-Me3mcJ1 -[NvaJ2 -[Nva]5-Ci c lospor in;
l.ó	[ 3' -0-Ace cyl-Me3iii tl3-[(D)Ala]3-Ciclos počin;
1.7	[ 3 ' -0-Ace ť/l-Me3hit )1 - [Nva ]2 - [ (D)Ala ]3 -CiciostOrin ;
1.3	[3'-0-Ace Cyl-Me3mt]1 -[(D)HeVal]11-Ciclospo c in;
1.9	(3'-0-Ace tyl-Me3m111 -[Val]11-Ciclosporin;
1.10	[3'-0-Acetyl-dihydro-MeBmt J1-Ciclospocin;
1.11	[3'-0-Methoxykarbonyl-MeBmt]1-Ciclospocin;
1.12	[3'-0-(4-Azidobutanoyl)-MeBmc]1-Ciclospocin;
1.13	[ 3' -0-Acetyl-Me3mt]1 -[0-acetyl-Thr]2-Ciclospocin;
1.14	[ 3' -0-Ace tyl-N-des.neChyl-MeSmt]1 -[0-ace tyl-Thr]2-Ciclospocin ; a
1.15	[3'-0-Ace tyl-MeBmt]1 -[0-acetyl-(D)Ser Ja-Ciclosporin .

Výhodnými cyklosporiny pro použití v rámci vynálezu jsou cyklosporiny 1.1 až 1.10 a 1.15, pŕičemž nejvýhodnéjšími

2 cyklosporiny jsou cyklosporiny 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.10 a 1.15.

Ďalší skupinu cyklosporinú typu la tvorí cyklosporiny:

1a²) ve kterých zbytek v poloze 1 je tvoŕen zbytkem -3'-0-acyl

8'-C.-C_o-alkoxy- -cis-MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-obecného 1 o vzorce IV

I x

ACYL¹-0 (R) CH ^X CH CH 3

I (17)

-N - CH - C0I (S) ’ CK₃ ve kterém

-x-y- znamená cis -CH=CH- nebo -CH_-CH~-, R. znamená C_-C_n ^J ₁ 2 2 4 2 9 alkoxymethyl a ACYL znamená acylovou skupinu.

Zejména vhodnými acylovými skupinami v obecném vzorci IV jsou acylové skupiny obecného vzorce R^-CO-, ve kterém R znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómy.

Alkylové skupiny ve významu obecného substituentu R^, jakož i alkylové skupiny obsažené v obecném substituentu R^ mohou mít prímy nebo rozvetvený uhlíkový ŕetézec. S výhodou znamená alkoxymethylovou skupinu, ve která alkoxylový zbytek obsahuje 2 až 5 uhlíkových atomú. Výhodným významem obecného substituentu ACYL^ v obecném vzorci IV je acetylová skupina.

3

Obzvlášté výhodnými cyklosporiny skupiny 1a jsou cyklo sporiny výše uvedeného obecného vzorce II, ve kterém A znamená zbytek výše uvedeného obecného vzorce IV, B má význam uvedený pro obecný vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-.

Príklady cyklosporinú skupiny la , vhodných pro použití v rámci vynálezu, zahrnují:

1.16 [3'-0-aceCyl-8'-me choxy-cis-HeBmcJ¹-Ci clospo r in;

1-17 [3'-0-acecyl-8'-c.bucoxy-cis-MeBmc]¹-Ciclosporin;

1.18 [3'-0-acecy1-8'-mechoxy-cis-MeBmc]¹-[0-acecyl-Thr J¹-Ciclosporin;

1.19 (3'-0-acecyl-8'-c.bucoxy-cis-MeBmc]¹ -[0-acecyl-Thr]²Ciclosporín;

1.20 [3'-0-acecy1-8'-mechoxy-cis-MeBmc]¹ -[Val]²-Ciclospor in; £

1.21 [3'-0-acecy1-8'-mechoxy-cis-MeBmc]¹-[Nva]²-Ciclospor in.

Další skupinu cyklosporinú typu 1a tvorí cyklosporiny:

a3) ve kterých zbytek v poloze 1 je tvoŕen zbytkem 3 -0acyl-cis-MeBmt-, nebo zbytkem -3-0-acyl-7'-desmethyl-7 hydrokarbyl- -MeBmt- nebo -cis-MeBmt-, kde hvdrokarbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atómy, nebo zbytkem 3-0acyl-7 -desmethyl-7'-hydrokarbyl-dihydro-MeBmt-, kde hydrokarbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atómy, pŕičemž každá alifatická skupina prítomná v uvedeném hydrokarbylovém zbytku je nasycenou skupinou.

Tyto zbytky mají obecný vzorec V

4

Ri

CH

ACYL¹-O (R)^CH. CH (R)

CHj (V)

-N - CH - COI (S) ve kterém

-χ-y- znamená cis nebo trans -CH=CH- nebo -Cf^-CL^-,

R, znamená hyarokarbylovou s'kuDinu a θ 1

ACYL znamena acylovpu skupinu, s výhradou, spočívající v tom, že když -x-y- znamená trans -CH=CH- nebo -CK2^_CK2^_ ’ P^{otom R}g obsahuje alespoň dva uhlíkové atómy (t.zn. že je jiný než methylová skupina), a když -x-y- znamená -Cí^-C^-, potom každá alifatická skupina prítomná v obecném substituentu Rg nebo tvoŕící obecný substituent Rg je nasycenou skupinou.

Obzvlášté vhodnými acylovými skupinami v obecném vzorci V jsou acylové skupiny obecného vzorce Rg-CO, ve kterém Rg znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómy, zejména acetylovou skupinu.

Hydrokarbylové skupiny ve významu obecného substituentu Rg zahrnují aromatické, alifatické a aralifatické skupiny, pŕičemž alifatické skupiny mohou mít prímý nebo rozvetvený uhlíkový retezec. Tyto skupiny mohou rovnšž nést další substituenty, jakými jsou napríklad atóm halogénu nebo hydroxylôvá skupina, nebo mohou být nesubstituované.

5

Vhodnými hydrokarbylovými (uhlovodíkovými) skupinami ve významu obecného substituentu Rg alkylové, alkenylové, alkinylové, fenylové, fenylalkylové, fenylalkenylové a fenylalkinylové, zejména alkylové, alkenylové a alkinylové skupiny, obsahujicí nejvýše 20, výhodné 8 uhlíkových atomú, a fenylové, fenylalkylové a fenylalkinylové skupiny obsahujicí nejvýše 12 uhlíkových atomú.

Obzvlášté výhodnými skupinami ve významu obecného substituentu Rg jsou fenylové skupina, fenylalkylové skupina, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, alkylová skupina s 1 až 10 uhlíkovými atómy, alkenylové skupina se 2 až 10 uhlíkovými atómy a alkinylové skupina se 2 až 10 uhlíkovými atómy, zejména fenylové skupina a alkylové skupina s 1 až 5 uhlíkovými atómy.

Jestliže -x-y- v obecném vzorci V znamená , potom hydrokarbylové skupina ve významu obecného substituentu RO zahrnují aromatické, nasycené alifatické a aralifatické skupiny ve kterých je alifatický zbytek nasycen, napríklad výše uvedená skupiny tohoto typu.

Obzvlášté výhodnými cyklosporiny této skupiny jsou cyklosporiny výše uvedeného obecného vzorce II, ve kterém A znamená zbytek výše uvedeného obecného vzorce V, B má význam uvedený pro obecný vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-.

Príklady cyklosporinú této skupiny vhodných pro použití v rámci vynálezu zahrnují:

1.22 [3'-0-acetyl-7'-desinethyl-7'- f enyl-MeBmtJ¹-Ciclosporin;

1.23 [3 -O-acetyl-cis-MeBmt]¹-Ciclosporin;

1.24 (3'-0-acety1-7'-desmethyl-7'-vinyl-cis-MeBmt]¹-Ciclospor in;

125 [3'-0-acetyl-7'-desmethy1-7'-vinyl-cis-MeBmt]^:-[0-ac9tyl-Thr J² Ciclosporin;

1.26 [3'-0-acetyl-7'-desme chy1-7'- i.pentyl-cis-HeBmtp-Ciclosporin;

1.27 [3'-0-ace ty1-7'-desme thyl-7'- fenyl-ci s-MeBmt]¹-C i clos počin;

1.2B [3'-0-acetyl-7'-desmethyl-7'-n.propyl-cis-HeBmt]¹-Ciclosporin;

1.29 [3'-O-acetyl-7'-desmethyl-7'-(0-allyl)-cis-MeBmt]¹-Ciclosporin;

1.30 [3'-O-acetyl-7'-desmethyl-7' - fenyl-MeBmtp-[Valp-Ciclosporin;

1.31 (3'-0-acety 1-7'-desmethyl-7'- fenyl-cis-HeBmt]¹ -(Val]² Ciclosporin;

1.32 (3'-0-ace ty1-7'-desmethyl-7'-vinyl-cis-MeBmtp-[ValpCiclosporin;

1.33 [3'-0-acety1-7'-desme thyl-7'-vinyl-cis-MeBmt]¹ -[Nva]² Ciclosporin; a .

1.3-i [ 3' -0-acety 1-7' -desme thyl-7 ' -(3-bromo-n. propyl)-cis-Me3mt ] Ciclosporin .

Další skupinu cyklosporinú skupiny 1 tvorí cyklospori ny:

1b) ve kterých beta-uhlíkový atóm zbytku v poloze 2 je O-acyl-substituován, t.zn. ve kterém zbytek v poloze 2 je beta-O-acyl-alfa-aminokyselinovým zbytkem, a zbytek v poloze 1 je jiný než zbytek, který byl definován výše pod 1a).

Jestliže zbytek v poloze 2 je beta-O-acyl-alfa-aminokyselinovým zbytkem, potom tento zbytek bude mít obecné konfiguraci (L). Vhodne je tento zbytek zbytkem obecného vzorce III

7

O-ACYL?

CH-CH,

-NH-CH-CO(L) ve kterém ACYL^ znamená acylovou skupinu. Výhodné je tento zbytek tvoŕen O-acyl-(L)-threonylovým zbytkem.

Vhodnými skupinami ve významu obecného substituentu

ACYL^ v obecném vzorci III jsou skupiny obecného vzorce

R^-CO- nebo R^-CO-Rg-CO-, ve kterém Rg má význam uvedený pro obecný vzorec III, R^ znamená zbytek cvkiosporinu mající betaoxy-(L)-alfa-aminokyselinový zbytek v poloze 2 pripojený ke zbytku -CO-R„-CO- pŕes beta-kys1íkový atóm uvedeného zbytku O a Rg znamená alkylenový zbytek s 1 až 8 uhlíkovými atómy.

Alkylenové skupiny ve významu obecného substituentu Rg mohou mít pŕímý nebo rozvetvený uhlíkový ŕetézec. S výhodou mají tyto skupiny pŕímý ŕetézec. Rg s výhodou znamená alkylenovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómy. Výhodné acylové skupiny mají obecný vzorec Rg-CQ-, pŕičemž výhodné významy pro Rg-C0- jsou uvedený výše ve vztahu k obecnému vzorci III.

Zvláštními cyklosporiny této skupiny jsou cyklosporiny obecného vzorce II, který byl uveden výše a ve kterém A znamená -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-, B znamená zbytek, který byl definován výše pod lb, napríklad obecného vzorce Iii,

X znamená -Sar- a Y znamená -Val-.

Príklady takových cvkiosporinu vhodných pro použití v rámci vynálezu zahrnúji:

1.35 /O-Acetyl-Thr/ -Ciclosporin a

1.36 Diester kyseliny 1,2-ethandikarboxylove-/0-threonyl/ Ciclosporin.

Ciclosporin 1.36 má vzorec VI

M e 3m c -NH-ČH-CO-Sar-HeLeu-'/al-HeLeu — (L) —Ala-(D)Ala-MeLeu-HeLeu-MeVal-,

Ďalší skupinu cyklosporinu skupiny 1 tvorí cyklosporiny

1c) ve kterých 3'-uhlíkový atóm zbytku v poloze 1 je oxosubstituován.

Jestliže je 3 -uhlíkový atóm zbytku v poloze 1 oxosubstituován, potom je vhodne tvoŕen zbytkem -3 -desoxy-3 oxo-MeBmt- vzorce VII

CHi ‘CH

TKANS

CH 'CH, (R) CH₃

-N-CH—C0I (S)

CH] (VII)

9

Obzvláštš výhodnými cyklosporiny této skupiny jsou cyklosporiny obecného vzorce II, který byl uveden výše a ve kterém A znamená zbytek výše uvedeného vzorce VII, B má význami uvedené pro vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-.

Ješté další skupinou cyklosporínu skupiny 1 jsou cyklosporiny :

1d) ve kterých beta-uhlíkový atóm zbytku v poloze 2 je beta oxo-substituován, t j. ve kterém zbytek v poloze 2 je .tvoŕen beta-oxo-alfa-aminokyselinovým zbytkem.

Jestliže zbytek v poloze 2 je beta-oxo-alfa-aminokyselinovým zbytkem, potom tento zbytek bude mít obecne konfiguraci (L). Vhodné je tento zbytek tvoŕen zbytkem -alfa-methylketo Gly- vzorce VIII

-Nn— CH — C0(L) <vili)

Príklady cyklosporinú náležejících do skupín 1c a 1d a vhodných pro použití v rámci vynálezu zahrnújí:

1·3~ [3 Desoxy-3' -oxo-MeBíuC ]¹ -Ciclospor in;

1.33 [3'-Desoxy-3'-oxo-M_e3mcp-[Valp-Ciclosporin; 1.39 (3'-Desoxy-3' -oxo-Ke3ac] ‘-[KvaJ²-Ciclosporin;

1.^0 [ <x-He :hylke;o-Gly J²-Ciclospor in; a

l.U (Dihyáro-Mea^cJt-ta-^rhylkeco-GlyJ’-Ciclosporin

Obzvlášté výhodnými cyklosporíny jsou cyklosporíny

1.37 až 1.39.

Skupina 2

Cyklosporin, ve kterém:

i) 3 -uhlíkový atóm zbytku v poloze 1 je C₁-C₄-alkoxyiminosubstituován, napríklad cyklosporin, ve kterém zbytek v poloze 1 je tvoŕen zbytkem-3-desoxy-3 -(C^C^-alkoxyimir.ol-MeSmtnebo ii) zbytek v poloze 2 je tvoŕen (L)-isoleucylovým zbytkem nebo iii) zbytek v poloze 11 je tvoŕen N-methyl-(L)-alanylovým zbytkem, N-methyl-(L)-isoleucylovým zbytkem nebo N-methyl-(L)alloisoleucylovým zbytkem nebo N-methyl-(L)-leucylovým zbytkem.

Zbytky -3 ’-desoxy-3 ' - (C -C -aikoxyimino ) -MeSmc- definované pod i) mají obecný vzorec IX

ch₂ ^R9 / ^C3 (R)^C3_} (IX)

-N-CH—(ΣΟΙ (S)

CHj ve kterém znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómy.

Alkylové skupiny ve významu obecného substituentu mohou mít pŕímý nebo rozvetvený uhlíkový retézec. S výhodou mají pŕímý uhlíkový retézec.

Pod výrazem N-methyl-(L)-alloisoleucylový zbytek (-Meallolle), použitým pod iii), se rozumí zbytek vzorce X

CjH₅ CK₃

- N-CH—CO — (D

CH_}

Výhodnými cyklosporiny této tŕídy jsou cyklosporiny obecného vzorce XI — A-S-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeĹeu-Z_

3 1 5 6 7 8 9 10 11 (XI) ve kterém

A znamená -MeBmt-, -dihydro-MeBmt- nebo zbytek, který byl výše definován pod i),

B znamená -alfaAbu-, -Thr-, -Val- nebo -Nva- nebo také

-íle v prípade, že A znamená -MeBmt- nebo -dihydroMeBmt-, a když A znamená -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt- a

B znamená -alfaAbu-, -Thr-, -Val- nebo -Nva-, potom Z znamená -MeAla-, -Melie-, -Meallolle- nebo -MeLeu-, když A znamená zbytek, který byl definován výše pod i) nebo když B znamená -Ile~, potom

Z znamená -MeVal-.

Príklady takových cyklosporinu vhodných pro použití v rámci vynálezu zahrnují:

. L [3'-Desoxy-3'-me choxyimino-HeBmt)¹-Ci c lospo r in;

2.2 [ ľie ]²-Ciclosporin;

2.3 [MeAla]·-Ciclosporin;

2.[Heliep ¹-Ciclosporin,·

2.3 [MeallolleJ^LL-Ciclosporin; a

2.6 (MeLeu]¹¹-Ciclosporin.

Z této skupiny cyklosporinu jsou výhodné cyklosporiny, ve kterých má zbytek v poloze 2 význam uvedený výše pod ii), zejména cyklosporin 2.2.

Rovnéž obvzlášté zajímavé jsou cyklosporiny, ve kterých zbytek v poloze 11 má význam uvedený výše pod iii), napríklad cyklosporiny 2.4 a 2.5.

Skupina 3

Cyklosporiny výše uvedeného vzorce XI, ve kterých:

Z znamená -Val- nebo -MeVal-:

když Z znamená -Val-,

A znamená -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-, nebp když Z znamená -MeVal-,

A znamená -3 -desoxy-MeBmt-, 3'-desoxy-dihydro-MeBmt-,

-N-desmethyl-MeBmt-, -N-desmethyl-dihydro-MeBmt-,

-3'-desoxy-4 -desmethyl-dihydro-MeBmt- nebo -MeLeu-,a když Z znamená -Val-,

B znamená -alfaAbu- nebo -Thr-, když Z znamená -MeVal- a

A znamená -3 -desoxy-MeBmt-, -3 -desoxy-dihydro-MeBmt-, -3 -desoxy-4 -desmethyl-dihydro-MeBmt- nebo -MeLeu-,

B znamená znamená -alfaAbu-, nebo když Q znamená -MeVal-a

A znamená -N-desmethyl-MeBmt- nebo -N-desmethyl-dihydro MeBmt-,

B znamená -Thr-.

Cyklosporiny této skupiny zahrnújí:

3.1. /Val/¹¹-Ciclosporin (rovnéž znám jako cyklosporin E),

3.2. (Dihydro-MeBmt/^/Val/¹¹-Ciclosporin (nebo dihydrocyklospcrin E),

3.3 /3'-Desoxy-MeBmt/¹-Ciclosporin (nebo cyklosporin F),

3.4. /3 -Desoxy-dihydro-MeBmt/¹-Cicklosporin (nebo dihydrocyklosporin F),

2

3.5. /N-Desmethyl-MeBmt/ -/Thr/ -Ciclosporin (nebo cyklosporin P) ,

2

3.6. /N-Desmethyl-dihydro-MeBmt/ -/Thr/ -Cicklosporin (nebo dihydrocyklosporin P),

11

3.7. /Thr/ -/Val/ -Ciclosporin (nebo cyklosporin W),

3.8. /Dihydro-MeBmt/¹-/Thr/2-/Val/¹¹-Ciclosporin (nebo dihydrocyklosporin W),

3.9. /3-Desoxy-4 '-desmethyl-dihydro-MeBmt/¹-Ciclosporin (nebo cyklosporin Z) a

3.10 /MeLeu/¹-Ciclosporin (nebo cyklosporin 28).

Rúzné acylované cyklosporiny skupiny 1a), zejména skupiny 1a ), a skupiny 1b) jsou známé. Cyklosporiny 1.1,

1.4, 1.8, 1.9, 1.13, 1.14 a 1.34 jsou takto známé a popsané společne se zpúsoby jejich výroby, napríklad Traber-em a kol. v Helv. Chim. Acta, 60, 1247 a dále (1977), 65, 1655 a dále (1982), 70, 13 a dále (1987); Kobel-em a kol·., Európ. J. Applied Microbiology, Biotechnology 14, 273 a násl. (1982); a Wartburgem a kol., Progres in Allergy 38, 28 a dále (1986).

Cyklosporiny 1.2, 1.3, 1.5, 1.6, 1.7 a 1.10 jsou nové a tvorí součást vynálezu jako nové sloučeniny. Cyklosporiny

1.2, 1.5 až 1.7 a 1.10 mohou být pripravený pstupy, které jsou analogické s postupy popsanými v odborné literatúre, napríklad pro prípravu cyklosporinu 1.1 acetylací odpovídajících cyklospôrinú, ve kterých zbytek v poloze 1 je tvoŕen zbytkem -MeBmt- nebo zbytkem -dihydro-MeBmt-. Cyklosporinové výchozí látky jsou známé, napríklad v pixuadš cyklosporinú 1.6 a 1.7 ze zverejnené evropské patentové prihlášky 0 194 972. Cyklosporinové produkty mají následujíci ŕysikální. charakteristky:

	Fysikální charakteristiky
1.2	[<x]o 20= -328° (c=0.97 v CHClj)
1.5	(alD 20= -250° (c=1.0 v CHCI])
1.6	[a]o20= -302.6° (c=0.5 v CHClj)
1.7	[<xJD 20 = -296.2° (c=0.5 y CHCI])
1.10	[a]o2O= -293° (c=0.55 v CHCI,)

Jestliže zbytek v poloze 2 cyklosporinové výchozí látky je tvoŕen beta-hydroxy-alfa-aminokyselinovým zbytkem, napríklad zbytkem -Thr-, potom beta-Oh-skupina v této poloze bude mít vétší tendenci k reakci než 3-hydroxyskupina napríklad zbytkú -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt- v poloze 1. Cyklosporiny, ve kterých je zbytek v poloze 2, avšak nikoliv zbytek v poloze 1, acylován (jako je tomu v prípadé skupiny 1b) cyklosporinú, napríklad v prípadé cyklosporínu 1.35), nebo ve kterých jsou oba zbytky v poloze 1 i 2 acylovány (jako je tomu v prípadé cyklosporinú 1.13 a 1.14 skupiny la ), mohou být takto snadno získány metódami popsanými v odborné literatúre nebo metódami, které jsou analogické s térnito metódami, pŕičemž se výhodné využívá tohoto relativního rozdílu v reaktivite. Za účelem prípravy cyklosporinú, ve kterých je poloha 1 3 -O-acylována, avšak ve kterých je v poloze 2 volná beta-OH-skupina (jako je tomu v prípadé cyklosporinú 1.3) je nejdŕíve nezbytné chránit uvedenou hydroxy-skupinu v poloze 2 a po acylaci zbytkú v poloze 1 odstranit ochrannou skupinu ze zbytkú v poloze 2.

V následující části popisu bude vynález blíže objasnén pomoci konkrétních pŕíkladú je provedení, pŕičemž tyto príklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačné vymezen formulací patentových nárokú.

Príklady provedení vynálezu

Príklad A * z * 12

Príprava /3 -O-acetyl-MeBmt/ -/Thr/ -Ciclosporinu (cyklosporin 1.3)

Stupeň 1

Zavedení O-ochranné skupiny do zbytkú -Thr- v poloze 2 2 /Thr/ -Ciclosporinu

6,09 g /Thr/ -Ciclosporinu se rozpustí ve 25 ml abso26 lutního dichlormethanu a 5 ml ethinyletheru, načež se k roztoku pridá 0,2 ml kyseliny trifluoroctové. reakční smés se potom míchá po dobu 20 hodin pri okolní teplote a pod atmosférou dusíku. Reakční smés se vytŕepe do chladného 20% vodného roztoku hydrogenuhličitanu draselného, promyje vodou, extrahuje dichlormethanem, vysuší nad síranem horečnatým, zfiltruje a odparí. Získaná péna se prečistí chromatograficky na 440 g silikagélu (0,04-0,06) pŕičemž se jako eluční soustava použije smés toluénu a acetónu v objemovém poméru 2:1) a jímá se 500 ml frakcí. Požadovaný produkt, t j. /Thr-1-methyl-ethoxymethylether/ Ciclosporin se izoluje z frakcí 26 až 29.

Teplota tání: 76,6 °C.

Stupeň 2

Acylace /Thr/ -Ciclosporinu s O-chránéným zbytkem -Thr- v poloze 2

Smés 10,66 g produkru získaného ve stupni 1, 106 ml anhydridu kyseliny octové _:a 1,22 g 4-dimethylaminopyridinu se míchá po dobu 20 hodin pri okolní teploté, načež se vyjme toluenem pri teploté 40 °C. Zbytek se rozpustí ve 400 ml toluénu a extrahuje jednou 250 ml ledové kyseliny octové, jednou 250 ml vody, jednou 200 ml ledového 20% vodného roztoku hydrogenuhličitanu draselného a jednou 250 ml vody. Toluenové extrakty se vysuší nad síranem horečnatým, zfiltrují, odparí a vysuší za vakua, pŕičemž se získá /3'-O-acetyl-Me1 7 acetyl-MeBmt/ -/Thr-1-methyl-ethoxymethylether/ -Ciclosporin.

Stupeň 3 „ 1 2

Deprotekce /3 -O-acetyl-MeBmt/ -/Thr/ -Ciclosporinu s O-chránéným zbytkem v poloze 2

11,38 g produktu získaného ve stupni 2, 80 ml tetrahydrof uránu a 160 ml 67% kyseliny octové se míchá po dobu 48 hodin pri okolní teplote pod atmosférou dusíku. Reakční smes se vyjme toluenem, zbytek se rozpustí v toluénu, vytŕepe do 20= vodného roztoku hydrogenuhličitanu draselného, promyje vodou a toluenové extrakty se vysuší nad síranem horečnatým a zfiltrují. Filtrát se odparí a prečistí chromatograficky na 440 g silikagélu (0,04-0,06), pŕičemž se jako eluční soustava použije smes toluénu a acetónu v objemovém pomeru 3:1 a jímají se 500 ml frakce. Koncový produkt, t j. /3-0-acetyl MeBmt/ -/Thr/ -Ciclosporin se izoluje z frakci 5 až 9.

Teplota tání: 75,6 °C;

/<Χ/θ°= -275,5 ° (c=0,65 v CHCl.^).

Cyklosporiny vzorce II' jsou nové a tvorí součást vynálezu jako nové sloučeniny. V souladu s dalším znakem vynálezu tvorí součást vynálezu nová skupina cyklosporinú la^ zahrnú jící cyklosporiny výše uvedeného vzorce II

Cyklosporiny skupiny 1a^ mohou být pripravený zpúsoby, které jsoa naprosto analogické se zpúsoby pro príprava známych cyklosporinú 1.1, 1.4 atd., které již byly uvedený dŕíve nebo zpúsobem, který je analogický se zpúsobem prípravy cyklosporinu 1.3, z odpovídájících cyklosporinú, ve kterých zbytek v poloze 1 je tvoŕen zbytkem -MeBmt- nebo zbytkem -dihydroMeBmt-. Potrebné výchozi látky jsou známé a popsané společne se zpúsoby jejich prípravy, napríklad v britské patentové prihlášce 2 155 936, patentu US 4 639 434 a ve zverejnené evropské patentové prihlášce 0 056 782. Jak již bylo uvedeno výše, pripraví se cyklosporiny vzorce IIve kterém W je zbytek beta-hydroxy-(a nikoliv beta-O-acyl-)-alfa-aminokyselinového zbytku, analogicky, napríklad s pŕíkladem A, nejdŕíve ochranou polohy 8, potom acylací v poloze 1 a nakonec deprotekcí polohy

8.

Cyklosporin 1.15 skupiny 1a^ má následující fysikální charakteristiku:

/CÓ/p°= -272° (c=1,0 v CHC1₃).

Cyklosporiny, ve kterých 3 -uhlíkový atóm zbytku v poloze 1 je azidoalkylkarbonyloxy- nebo alkoxykarbonyloxy-substituován, jsou rovnéž nové a tvorí součást vynálezu jako nové sloučeniny.

Skupina cyklosporinu tohoto typu zahrnuje cyklosporiny

1a^) ve kterých zbytek v poloze 1 je tvoŕen zbytkem -3 -0(C₁-C^-alkoxy)-karbonyl- nebo -3'-0-(C₁-C^-azidoalkyl)-karbonyl- -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-, t j. zbytkem výše uvedeného obecného vzorce I, ve kterém ACYI? znamená skupinu vzorce R ' .j -CO- nebo R^-O-CO-, ve kterém R’^ znamená C -C^-azidoalkylovou skupinu a R₂ znamená C-C^-alkylovou skupinu.

Výhodnými cyklosporiny této skupiny jsou cyklosporiny výše uvedeného vzorce II, ve kterém.A znamená zbytek, který byl definován výše pod 1a , B má významy uvedené pro vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-.

Predmetem vynálezu je rovnšž zpúsob prípravy cyklosporinú skupiny 1a\ jshož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

a) reakci odpovídajícího cyklosporinu, ve kterém zbytek v poloze 1 je tvoŕen zbytkem -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-, se sloučeninou obecného vzorce XII:

R^-CO-Q (XII) nebo obecného vzorce XIII:

R₂-O-CO-Q (XIII) kde R ₁ a R₂ mají výše uvedené významy a Q znamená oddélitelnou skupinu.

Obecný substituent Q vhodne znamená atóm halogénu nebo skupinu -OH. V prípade, že Q znamená atóm halogénu, potom se reakce vhodne provádí napríklad v prítomnosti katalyzátoru, jakým je n-butyllithium. Jestliže Q znamená skupinu -OH, potom se reakce vhodne provádí v prítomnosti aktivačního činidla. Reakce muže být provádéna pri teplotách asi -100 až -50 °C, napríklad zpúsobem popsaným v následujících príkladech B.

Príklady B

1) Príprava /3 -O-methoxykarbonyl-MeBmt/' -Ciclosporinu (cyklosporin 1.11)

3,76 ml 1,48M roztoku n-butyllithia ve 3,76 ml hexánu se pridá k 0,87 tni diisopropylaminu v tetrahydrof uránu pri teploté -78 °C a smés se míchá po dobu 30 minút pri teploté -78 °C. Pri téže teploté se pridá 1,0 g Ciclosporinu v 15 ml bezvodého tetrahydrofuránu a v míchání se pokračuje po dobu dalších 30 minút. Pridá se 0,326 ml methylchlorformiátu a smés se míchá po dobu další hodiny pri teploté -78 °C. Smés se potom nechá ohrát na okolní teplotu. Pridá se 10 ml vody a podstatný podíl tetrahydrofuránu se odstráni odparením. Zbytek se vyjme 100 ml ethyletheru a 50 ml vody, vodná vrstva se oddelí a extrahuje dvakrát diethyletherem. Sloučené organické extrakty se’vysuší nad síranem horečnatým a odparí k suchu. Zbytek se prečistí chromatograficky na silikagélu, pŕičemž se jako elučni činidlo použije ethylacetát. Z odpovídajících frakcí eluátu se izoluje požadovaná sloučenina.

/ GC/q° = -234° (c = 1,0 v CHC1₃).

2) Príprava /3'-O-(4-azidobutanoyl)-MeBmt/¹-Cyclosporinu (cyklosporin 1.12)

7,74 g kyseliny gama-azidomáselné, 8,6 g 4-dimethylaminopyridinu a 5,11 g Mullayamaova činidla (2-chlor-1-methylpyridiniumjodid) se pridá ke 12,02 g Ciclosporinu ve 200 ml absolutního dichlormethanu a reakční smés se míchá po dobu 90 hodín pri okolní teploté. Získaný produkt se zŕedí dichlormethanem, vytŕepe do 100 ml ledové vody, 10% roztoku hydroxidu sodného, 200 ml vody a 200 ml 10% vodného roztoku kyseliny octové, promyje vodou a organické fáze se vysuší nad síranem sodným. Filtrát se odparí a opétovné vysuší. Produkt se prečistí chromatograficky na 1,2 kg silikagélu (0,04— 0,06 mm), pŕičemž se jako eluční smés použije smés hexánu a acetónu v objemovém poméru 3:1 a jímají se 300 ml frakce. Po žadovaná sloučenina se izoluje z frakcí 23 až 27.

/ Cé/p° = -289,8° (c = 0,5 v CHC1₃).

Pŕedmétem vynálezu je rovnéž zpúsob prípravy cyklo. 2 - - · « spormu skupiny 1a ), jehoz podstata spočíva v tom, ze:

b) se acyluje odpovídající cyklosporín, ve kterém zbytek v poloze 1 je zbytkem -8-C₁-Cg-alkoxy-cis-MeBmt- nebo -8Ci-Cg-alkoxy-dihydro-MeBmt obecného vzorce XIV

I x

ι (XIV)

-N - Cti - C0I (S) ch₃ ve kterém -x-y- a mají významy uvedené výše pro vzorec IV,.pŕičemž se napríklad acyluje cyklosporín vzorce II, ve kterém A znamená zbytek vzorce XIV, B má významy uvedené pro vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-, napríklad reakcí se sloučeninou obecného vzorce XV

R₅-CO-Q (XV) ve kterém R^ znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómy a Q znamená oddeliteľnou skupinu, napríklad atóm halogénu, nebo

c) za účelem prípravy cyklosporinu 1a , ve kterém je zbytek v poloze 1 tvoŕen -3 -0-acyl-8 -C-Cg-alkoxy-cis-MeBmt-zbytkem výše uvedeného vzorce IV, ve kterém -χ-y- znamená -CH=CH-, R , , . 1 . ⁴ ma vyznám uvedený pro vzorec IV a ACYL znamena acylovou 0ochrannou skupinu, napríklad acetylovou skupinu, se cyklosporin, ve kterém zbytek v poloze 1 je tvoŕen zbytkem -3 -0-acyl5'-des-(1-propenyl)-5-formyl-MeBmt- obecného vzorce XVI

R,_o

CH

(XVI)

-n - ch - σοΙ (S)

CHj ve kterém R_1Q znamená acylovou 0-ochrannou skupinu, napríklad acetylovou skupinu, napríklad cyklosporin vzorce II, ve kterém A znamená zbytek výše uvedeného obecného vzorce XVI, B má význa my uvedené pro obecný vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená

-Val-, uvede v reakci se sloučeninou obecného vzorce XVII í 1

ch-r₄ (XVII) ve kterém každý R^ znamená fenylovou skupinu nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómy a R₄ má význam uvedený pro obecný vzorec IV.

Reakce podie výše uvedeného stupne c) múže být provádéna standardními postupy používanými pro provedení Wittigovy reakce, napríklad za bezvodých podmínek, napríklad v inertním rozpouštédle nebo ŕedidle, jakým je absolútni benzen, tetrahydrofuran', diethylether nebo toluén, pri teploté asi -80 až 20 °C, prípadné v prítomnosti soli, napríklad halogenidu alkalického kovu. Reakce múže být vhodné provádena pod inertní atmosférou.

Cyklosporinové výchozí látky potrebné pro stupeň c) mohou být získány z odpovídajících cyklospirinú, ve kterých zbytek v poloze 1 je tvoŕen zbytkem -3'-O-acyl-chránéný-MeBmt-, napríklad -3 -O-acetyl-MeBmt-zbytkem,

d) ozonolyzou a zpracováním bezprostredné získaného ozonolýzového produktu mírným redukčním činidlem.

Ozonolýza ve stupni d) múže být provedena standardními postupy, napríklad v ozonizátoru v prítomnosti napríklad ethylacetátu nebo dichlormethanu pri teploté asi -90 až asi -40 °C. Vhodným mírným redukčním činidlem je dimethylsulfid. Ozonolýza a zpracování mírným redukčním činidlem se vhodné provádí v jediné reakční nádobé, jak je to napríklad popsáno v následujících pŕíkladech C.

Výchozími látkami pro stupeň d) jsou cyklosporiny sku33

X W piny 1a , které jsou bud známymi siouceninami nebo mohou být pripravený dríve popsanými postupy.

Reakční stupeň b) múže být provádén analogicky s postu_w , . 1 . py pro prípravu cyklosporinu skupín 1a a 1b, ktere jiz byly popsány v pŕedcházejícím textu, napríklad za použití odkazú na príslušnou odbornou literatúru. Obdobné mohou být cyklospo2 . .

riny skupiny 1a majici v poloze 2 volný beta-hydroxy-alfa-aminokyselinový zbytek, napríklad zbytek - Thr-, pripravený predbežnou ochranou a následnou deprotekcí beta-OH-skupiny, pŕičemž se napríklad použije postup, který je analogický s postupy , které byly napríklad popsány v souvislosti s výše uvedeným pŕíkladem A. Výchozí látky pro reakční stupeň b) mohou být získány:

e) deprotekcí odpovídajícího cyklosporinu, ve kterém zbytek v poloze 1 je tvoŕen zbytkem -8’-C₁-Cg-alkoxy-cis-MeBmtnebo zbytkem -8’-C₁-Cg-alkoxy-dihydro-MeBmt- v 3 -O-chránéné formé, nebo

f) redukcí odpovídajícího cyklosporinu, ve kterém zbytek v poloze 1 je tvoŕen zbytkem -8'-C₁-C_g-alkoxy-cis-MeBmt- ve volné nebo 3 -O-chránéné formé a prípadným provedením stupné e)

Vhodné 3 -O-ochranné skupiny ve výchozích látkách pro reakční stupeň e) zahrnují všechny známé ochranné skupiny používané v chémii peptidu včetné acylových a etherových ochranných skupín. Výchozí látky pro reakční stupeň e) takto zahrnují dríve popsané produkty reakčního stupné c). Odpovídající výchozí látky, ve kterých 3’-O-ochranná skupina je jiná než acylová skupina, mohou být získány analogicky s reakčními stupni d) a c) z odpovídajících 3 -O-chránénných cyklosporinu.

Samotný reakční stupeň e) múže být proveden postupy, které jsou obecné používané v oboru chemie peptidu, napríklad hydrolýzou v prítomnosti báze, jakou je alkoxid alkalického kovu nebo uhličitan alkalického kovu, za účelem odstranéní acetylových ochranných skupin, nebo hydrolytickým etherovým štépením, napríklad v prítomnosti kyseliny trifluoroctové nebo terapie chemoterapeutickými činidly a zejména potlačují resistenci vúči chemoterapeutickým činidlúm, napríklad resistenci vúči antineoplastické nebo cytostatické chemoterapii, jako je tomu v prípade cyklosporinú tríd 1 až 3. Nicméné vzhledem k jejich vlastním imunosupresivním vlastnostem jsou cyklosporiny skupiny 4 obecné méne vhodné pro použití pri takových indikacích .

Cyklosporinové výchozí látky pro reakční stupeň c) jsou rovnéž nové a tvorí takto součást vynálezu jako nové sloučeni• ny. Tyto výchozí látky mohou být samozrejme podrobený deprotekci a/nebo reprotekci, napríklad za účelem manipulace, transortu nebo skladování, což múže být provedeno postupy, které jsou bež né známé a používané.

V rámci dalšího znaku vynálezu jsou predmétem vynálezu rovnéž cyklosporiny následující skupiny.

Skupina 5

Cyklosporin, ve kterém je zbytek v poloze 1 tvoŕen zbytkem -5 -des-(1-propenyl)-5'-£ormyl-MeBmt- ve volné nebo 3 -O-chránenné formé, napríklad zbytkem obecného vzorce XVIII

II

-N-CH—C0(XVII (S) vherein R_L2 is hydroge.n oc an 0-pcoceccing group.

ve kterém R

12xznamená atóm vodíku nebo O-ochrannou skupinu.

Výhodnými ochrannými skupinami ve významu obecného substituentu R-j 2 3^SOU acylové O-ochranné skupiny,, napríklad acetylová skupina. Výhodnými cyklosporiny této skupiny jsou cyklosporiny výše uvedeného obecného vzorce II, ve kterém A znamená zbytek výše uvedeného obecného vzorce XVIII, B má významy uvedené pro obecný vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-.

Jestliže R-| 2 znamená atóm vodíku, potom zbytek obecného vzorce rovnéž existuje v cyklické tautomerní forme vzorce XVIII

OH

CH

-N CH—C0I (S)

CHj

Je samozrejmé, že takové tautomery rovnéž spadajú do rozsahu vynálezu, napríklad v rámci výše uvedené skupiny 5 cyklosporinú .

Následujíci príklady se vztahují k výše uvedeným postu- > 2 púm pro prípravu cyklosporinú skupiny 1a a skupín 4 a 5.

Príklad C

Príprava cyklosporinú skupiny

Príprava /3 -0-acetyl-8 -methoxy-cis-MeBmt/ -Ciclosporinu (cyklosporin 1.16) g methoxymethyltrifenylfosfoniumbromidu se suspenduje ve 270 ml absolutního tetrahydrofuránu pod argonovou atmosférou a získaná suspenze se chladí na teplotu -75 C. Pridá se roztok 5 g terc.butoxidu draselného ve 200 ml absolutního tetrahydrofuránu, pŕičemž tento pŕídavek se provádí po kapkách v prúbéhu 30 minút. Získaná smes se míchá po dobu dvou hodin, načež se k ní po kapkách a v prúbéhu 20 minút pridá roztok /3'-O-acetyl-5 '-des-(1-prpenyl)-5 '-formyl-MeBmt/¹-Ciclosporinu ve 25 ml tetrahydrofuránu. Reakční smés se míchá pri okoln teplote po dobu 4 hodin, načež se k ní pridá 400 ml ethylacetátu. Extrakty se promyjí 2N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným roztokem solanky. Zahustený filtrát se potom chromatografuje na 1,2 kg a 0,44 kg silikagélu (0,04 až 0,063 mm), pŕičemž se jako eluční soustava použije smés 10 až 40% roztoku chloroformu v acetónu a ethylacetátu. Z odpovídajících frakcí eluátu se izoluje požadovaná sloučenina., /00/2° = -26;' (c = 0,53 v CĽC1₃).

Cyklosporiny 1.17 až 1.21 mohou být pripravený analogickým zpúsobem. Tyto cyklosporiny mají následující fysikální charakteristiky:

	Fysikální charakteristiky
1.17	[a]0 20 = -283° (c = 0.544 v CHCI,)
1.18	(ctJo20 = -209.1° (c= 0.605 v CHCI,) ί
1.19	[α]ο 20 = -282.96’ (c= 0.405 v CHCI,)
1.20	[<x]0 20 = -268’ (c= 0.615 v CHCI,)
1.21	[a]o 20 = -248.7’ (c= 0.65 v CHCI,)

Výchozi látka pro výše uvedený postup, kterým je cyklosporin skupiny 5, se pripraví následujícím zpúsobem.

- . , - - - ,1 Príprava /3 -0-acetyl-5 -des-(1-propenyl)-5 -formyl-MeBmt/ Ciclosporinu (cyklosporin 5.1)

48,5 g /3 -O-acetyl-MeBmt/¹-cyclosporinu v 70 ml ethylacetátu se ozonizuje po dobu 45 minút pri teplote -70 °C za použití Fischerova ozonového generátoru pri tlaku 0,04 MPa a prú* toku 110 1/h. Získaný roztok se prožene dusíkem, načež se k nemu pridá 9,8 ml dimethylsulfoxidu. Roztok se potom michá pri pokojové teplote po dobu dvou hodin, načež se zahustí odparením, dvakrát promyje benzenem a vysuší za hlubokého vakua, pŕičemž se získa požadovaný produkt. Ten se pŕímo použije k další reakcí bez dalšího čištení.

/ CC/^° = -302° (c = 1,15 v CHC1₃).

Analogickým zpúsobem se získají následujíci cyklosporiny:

5.2 [3'-0-acecyl-5'-des-(l-propenyl)-5'-formyl-HeBnit]^L-[0-acecyl

-Thr]²- Ciclosporin: [e]₀ ²⁰ = -272.6’ (c = 0.504 v CHClj), * t.t.= 156-160° * 5.3 [3' -0-acety1-5'-des-(l-propenyl)-5'-formyl-Me3(nt]¹-[Val]² -Ciclosporin: [a]_c ^{20 3} -306’ (c=1.03 v CHClj), t.t.>

163-170°

5.4 [3'-0-acety1-5'-des-(l-propenyl)-5'-formyl-heBmc]^L-[Nva]² Ciclosporin: [<x]₀ ²⁰ = -291.76’ (c= 0.51 v CHClj).

Príklady D

Príprava cyklosporinú tŕídy 4

Príprava /8'-methoxy-cis-MeBmt/¹-cicklosporinu (cyklosporin 4.1) g cyklosporinú 1.16 (z príkladu C) ve 41 ml smési methanolu a vody v objemovém poméru 5:1 se zahŕivá za míchání s 3,5 g uhličitanu draselného na okolní teplotu. Po 21 hodinách se ochlazený roztok okyselí 10% roztokem kyseliny vinné a trikrát extrahuje chloroformem. Extrakty se promyjí nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou a vysuší nad siranem sodným a zahustí. Po chromatografii na 220 g silikagelu, pri které se jako elučni soustava použije smés ethylacetátu a hexánu ve formé 100 až 20% roztoku hexánu v ethylj. acetátu, se z príslušných frakcí eluátu získá požadovaná sloucenina.

-· /q}/2° = -239° (c = 0,53 v CHC1₃).

Analogickým zpúsobem se získají následující cyklosporiny:

4.2 [8'-1.Butoxy-cis-HeBmt]¹-Ciclosporin: [ a] □²⁰ = —22S³ (c = 0.5 v; CHClj);

4.3 [8'-Methoxy-cis-MeBmt]¹ - [Thr]²-Ciclosporin: [a]₌ ²³ = -220° (c = 0.37 v CHClj);

• 4.4 [8'-t.Butoxy-cis-MeBmt]¹ -[Thr]²-Ciclosporin: [a]₀ ^2a = -221’ (c = 0.43 v CHClj);

. 4.5 (.8' -Me thoxy-cis-MeBmt ]¹ - [Val ]²-Ciclosporin: [aj₃ ²¹ = -241° (c = 0.54 v CHClj);

4.6 [8'-Methoxy-cis-MeBmt]¹-[ Nva]²-Ciclosporin: [a]_D ²³ = -236 ’ (c = 0.634 v CHClj);

Príprava /8'-methoxy-dihydro-MeBmt/¹-Ciclosporinu (cyklosporin 4.7)

302 mg cyklosporinú 4.1 se rozpustí v 10 ml absolutního ethanolu a takto získaný roztok se hydrogenuje pri okolní teplo40 té a za atmosférického tlaku v prítomnosti 5% paladía na uhlí. Po spotrebování teoretického množstvi vodíku (50 minút) se katalyzátor oddelí filtrací pŕes hyflo a filtrát se odparí za sní ž eného tlaku. Zbytek se chromatografuje na 70 g silikagélu (0 = 0,015 mm), pŕičemž se jako eluční soustava použije smés hexánu a acetónu v objemovém poméru 1:1. Z odpovídajících frakcí eluátu se potom izoluje požadovaná sloučenina.

/ CÓ/θ⁰ = -229° (c = 0,52 v CHC1₃).

Analogickým zpúsobem se získají následující cyklospori• ny:

4.8 [3 '-Mechoxy-dihydro-MeSmc]¹-[Thr]²-Ciclosporin: [a]_D ²⁵ =

-217.5° (c =0.32 v CHC1₃);

4.9 (8 ' -MeChoxy-dihydro-MeSmc ]¹ -[ Val J² -Ciclospor in : (<x]₀ ^2í =

-223.6° (c = 0.58 v CHC1₃);

4.10 [8'-Me thoxy-dihydro-MeBinc ]¹ -[Nva]²-Ciclosporin : (α]₀ ^2α =

-221.5° (c = 0.594 _v CHC1₃) * , „ 3

Vyše uvedene cyklosporiny skupiny 1a jsou rovnež nove \ a tvorí takto součást vynálezu jako nové sloučeniny.

Pŕedmétem vynálezu je rovnež zpúsob prípravy cyklosporinú skupiny 1a\ jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

g) acylaci odpovídajícího cyklosporinu, ve kterém zbytek v poloze 1 je tvoren zbytkem -cis-MeBmt-, zbytkem -7'-desmethyl 7 -hydrokarbyl- -MeBmt- nebo -cis-MeBmt-, ve kterém hydrokarbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atómy, nebo zbytkem -7'-desmethyl-7'-hydrokarbyl-dihydro-MeBmt-, ve kterém hydrokarbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atómy a ve kterém každá alifatická skupina prítomná v uvedeném hydrokarbylovém zbytku nebo tvoŕící uvedený hydrokarbylový zbytek je nasycenou skupinou, pŕičemž uvedený zbytek múže mít obecný vzorec XIX

I · (XIX)

-N - CH - C0I (S)

CH ₃ ve kterém -x-y- a Rg mají výše uvedený význam pre obecný vzorec V, napríklad acylaci cyklosporinu výše uvedeného obecného vzorce II, ve kterém A znamená zbytek výše uvedeného obecného vzorce XIX, B má významy uvedené pro obecný vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-, napríklad reakci se sloučeninou výše uvedeného obecného vzorce XV, nebo

h) za účelem prípravy cyklosporinu skupiny 1a\ ve kterém je zbytek v poloze 1 tvoŕen zbytkem -3 '-O-acyl-cis-MeBmt-, kde acylový zbytek je acylovou O-ochrannou skupinou, nebo zbytkem -7^x-desmethyl-7 -hydrokarbyl- MeBmt- nebo -cis-MeBmt-, ve kterém hydrokarbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atómy a ve kterém 0-acylový zbytek je tvoŕen acylovou O-ochrannou skupinou, pŕičemž uvedený zbytek muže mít výše uvedený vzorec V, ve kterém -x-y- znamená cis nebo trans -CH=CH-, R, má význam 1 ° uvedený pro obecný vzorec V a ACYL znamená acylovou O-ochrannou skupinu, napríklad acetylovou skupinu, reakci cyklosporinu, ve kterém je zbytek v poloze 1 tvoŕen zbytkem -3 -0-acyl-5' des-(1-propenyl)-5 -formyl-MeBmt- výše uvedeného vzorce XVI, napríklad cyklosporinu výše uvedeného obecného vzorce II, ve kterém A znamená zbytek výše uvedeného vzorce XVI, B má významy uvedené pro obecný vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-, se sloučeninou obecného vzorce XX

R

(XX) ve kterém každý R^ znamená fenylovou skupinu nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómy a R g znamená hydrokarbylovou skupinu s alespoň 2 uhlíkovými atómy, a prípadnou izolaci požadovaného reakčního produktu.

Reakční stupne g) ah) mohou být provedeny presne analo gicky s výše uvedenými reakčními stupni b) a c), napríklad zpu sobem popsaným v dále uvedených pŕíkladech E. Výchozí látky pro reakční stupeň g) mohou být získaný postupem, který je naprosto analogický s postupem uvedeným ve výše uvedených reakčních stupních e) nebo f) a který zahrnuje:

i) deprotekci odpovídájícího cyklosporinu, ve kterém je zbytek v poloze 1 tvoŕen zbytkem -3 -O-acyl-cis-MeBmt- nebo zbytkem -7 -desmethyl-7-hydrokarbyl- -MeBmt- nebo -cis-MeBmtve kterém hydrokarbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atómy, pŕičemž uvedený zbytek je v 3 -O-chránenné forme, nebo

j) redukci odpovídájícího cyklosporinu, ve kterém je zbytek v poloze 1 tvoŕen zbytkem -7 -desmethyl-7'-hydrokarbyl-MeBmt- nebo -cis-MeBmt-, pŕičemž uvedený zbytek je ve volné nebo 3'-O-chránéné formé, a prípadné provedení reakčního stupne i) .

Vhodné 3 -O-ochranné skupiny jsou popsané výše v souvislosti s reakční stupni e) a f). Pri provádéní stupne j) dôjde k redukci jak nenasycených vazeb hydrokarbylového zbytkú, tak i skupiny -χ-y-. Alternatívne muže být cyklosporinový výchozí produkt, ve kterém je zbytek v poloze 1 tvoŕen zbytkem -cisMeBmt-, získán v souladu s celkovým syntetickým zpúsobem prípravy cyklosporinú, který je napríklad popsán ve zverejnené evropské patentové pŕihlášce 0 034 567 nebo v patentu US 4 369 542.

Výchozí cyklosporinové látky pro reakční stupeň g), ve kterých je zbytek v poloze 1 jiný než -cis-MeBmt-, jsou rovnéž nové a tvorí takto součást vynálezu jako nové sloučeniny.

V rámci dalšího znaku vynálezu jsou pŕedmetem vynálezu rovnéž cyklosporiny následující skupiny.

Skupina 6

Cyklosporín, ve kterém je zbytek v poloze 1 tvoŕen zbytkem -7 -desmethyl-7 -hydrokarbyl- -MeBmt- nebo -cis-MeBmt-, ve kterém hydrokarbylový zbytek obsah·.··.je alespoň dva uhlíkové atómy, nebo zbytkem -7 -desmethyl-7 -hydrokarbyl-dihydro-MeBmt-, ve kterém hydrokarbyl'ový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atómy a ve kterém každá alifatická skupina prítomná v hydrokarby lovém zbytkú nebo tvoŕící hydrokarbylový zbytek je nasycenou skupinou, pŕičemž uvedený zbytek múže mít obecný vzorec XIX

Rs x

HO

-N - CH - C0I (S)

(XIX') ve kterém x-y- znamená cis nebo trans -CH=CH- nebo a R, ' ' znamená hydrokarbylovou skupinu mající alespoň dva uhlíkoU vé atómy, s výhradou spočívající v tom, že -x-y- znamená C^-Ct^-, potom každá alifatická skupina prítomná v obecném substituentu Rg'' nebo tvoŕící obecný substituent Rg' ' je nasycenou skupinou.

Výhodnými cyklosporiny této skupiny jsou cyklosporiny obecného vzorce II, ve kterém A znamená zbytek výše uvedeného obecného vzorce XIX', B má významy uvedené pro obecný vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-.

Kromé toho, že jsou použitelné jako meziprodukty, mají cyklosporiny tŕídy 6 rovnéž výše popsanou imunosupresivní, protizánétovou a antiparazitickou účinnost. Tyto cyklosporiny jsou tedy samotné použitelné jako chemoterapeutická činidla.

Cyklosporiny skupiny 6 rovnéž zvyšují citlivost vúči terapii chemoterapeutickými činidly nebo zvyšují účinnost terapie chemoterapeutickými činidly, zejména potlačují resistenci vúči chemoterapeut5-kým činidlám, napríklad vúči antineoplastickým nebo cytostatickým chemoterapeutickým činidlám, jak to již bylo diskutováno v souvislosti s cyklosporiny skupin 1 až 3. Vzhledem napríklad k jejich vlastním'imunosupresivním vlastnostem však tyto cyklosporiny skupiny 6 jsou méne vhodné pro použití pri téchto indikacích.

Zde popsané a pŕíkladované cyklosporiny, ve kterých je zbytek v poloze 1 tvoŕen zbytkem -cis-MeBmt-, jsou formálne nové, jakkoliv spadají do rozsahu výše uvedené zverejnené evropské patentové prihlášky 0 034 567 a patentu US 4 369 542.

Následující príklady ilustrují výše uvedené zpúsoby pro _z 3 prípravu cyklosporinu skupiny 1a a skupiny 6.

Príklady E „ . . . i

Príprava /3 -O-acetyl-7 -desmethyl-7 -fenyl-MeBmt/ -Cyclosporinu (cyklosporin 1.22) a /3'-O-acetyl-7-desmetyl-7 -fenyl45 cis-MeBmt/^-Ciclosporinu (cyklosporin 1.27)

9,5 g Benzyltrifenylfosfoniumchloridu se rozpustí ve 150 ml bezvodého benzenu a tento roztok se potom zahŕivá na teplotu varu pod zpetným chladičem po dobu 24 hodin s 2,7 g terc.butoxidu draselného, pŕičemž se použije odlučovače vody. Po ochlazení se suspenze zfiltruje do nové banky pod inertní atmosférou. Pridá se 5 g cyklosporinu 5.1 (príklady C) v 50 ml benzenu, pŕičež tento pŕídavek je rozvržen na dobu 5 minút. Po 21 hodinách pri okolní teplote se reakční smés nalije na led, organická fáze se promyje 2N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové, vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou, vysuší nad siranem sodným a odparí. Zbytek se dvakrát chromatografuje na 440 g silikagélu (0,04-0,063 mm), pŕičemž se jako elučni soustava použije chloroform obsahující 8 až 30 objemových dílú acetónu. Frakce 2 obsahuje cyklosporin 1.27, zatímco frakce 5 až 15 obsahují cyklosporin 1.22.

Analogickým zpúsobem·mohou být pripravený cyklosporíny 1.23 až 1.26 a 1.23 až 1.34. Tyto cyklosporíny mají následující fysikální charakteristiky:

	-- Fysikální charakteristiky
1.22	[aJD 20= -21O.9°(c= 1.37 v CHC13)
1.23	[<x]0 20= -234.9°(c= 0.89 v CHCl3)
1.24	Mo20 = -248.97a(c= 1.17 v CHC13)
1.25	[α]0 2α= -237.3°(c= 0.39 v CHC13)
1.26	Ester 1740 nmr.ir v Ch2ci2
	(.Acecát 1230

1.27	t oc J o 2 0 = -235.8°(c= 1.0 v CHCI,) ‘ 1
1.28	(a]0 20= -22O°(c= 1.75 v CHCI,) | 1
1.29	(a]0 J°= -239.07°(c= 0.97 v CHCI,) í í
1.30	(a]0 JO= -2O7.8°(c= 1.25 v CHCI,) |
1.31	[a]o 20= -239.6°(c= 0.91 v CHC13) j !
1.32	Ester 1746 ' 1 NHR.IR2 Acetát 1228 v CC14 j l MH- 1271 !
1.33	f Ester 1745 ί NMR.IrJ Acetát 1225 v CCl, j | HH* 1271 !
1.34	[a]0 2C= -22ó.23°.(c= 1.447 v CHClj) j 1 ! 1

Príklady F

Príprava cyklosporinú tŕídy 6

Príprava /7'-desmethyl-7'-£enyl-MeBmt/¹-Ciclosporinu (cyklosporin 6.1)

2,29 g cyklosporinu 1,22 získaného výše uvedeným zpúsobem se rozpustí ve 20 ml smšsi vody a methanolu v objemovém pomeru 1:4,5) obsahujúci 1,67 g uhličitanu draselného. Po 20 hodinách pri okolní teplote se reakční smés nalije na led obsahujúci 10¾ kyselinnu vinnou a extrahuje chloroformem. Surový extrakt se chromatografuje na 120 g silikagélu ( 0,04-0,063mm), pŕičemž se jako eluční soustava použije dichlormethan obsahujúci vzrústající množství (20 až 30 %) acetónu. Z príslušných frakcí eluátu se izoluje požadovaná sloučenina.

/OÍ/20 = -209° (c = 0,99 v CHClg).

/<Χ/θ°= 235 (c = 0,9 v CHC1₃).

Príprava /7'-desmethyl-7'-fenyl-dihydro-MeBmt/¹-Ciclosporinu (cyklosporin 6.13)

796 mg smesi cyklosporinu 6.1 a 6.2 se hydrogenuje v 50 ml ethanolu v prítomnosti 100 mg 10% paladia na uhlí pri okolní teplote po dobu 6 hodin. Po odfiltrovaní hydrogenační smesi pŕes Hyflo za účelem odstránení katalyzátoru se získá požadovaná sloučenina.

/CC/20 ₌ -210° (c = 0,7 v CHC1₃).

Analogickým zpúsobem se získajú následující cyklosporiny :

6.14 [7'-Desmethyl-7'-n.propyl-dihydro-MeBmt]¹-Ciclosporin: [a|₃ ²⁰ = -188° (c = 6.16 v CHCI,), získaný z cyklosporinu 6. ónebo 6.7;

6.15 [7'-Desme thy1-ľ -ethyl-dihydro-MeBmt ]¹-[Thr]²-Ciclosporin:

[aj_o ²⁰ = -224° (c = 0.4 v CHC.l₃), získaný z cyklosporinu ó.4;

6.16 [ 7' -Desme thyl-7'-(3-me thy 1-n. butyl ).-dihyd ro-MeBm t ]¹-Ciclospor in: [a]o³⁰ = -222° (c = 0.995 v CHClj), získaný z cyklosporinu 6.5;

6.17 [7'-Desmethyl-7'-i.propyl-dihydro-Me3mc]¹-Ciclosporin : [aj₃ ²⁰ = -229° (c = 1.32 v CHClj);

6.18 [7'-Desmethyl-7'-ethyl-dihydro-Me3mt]^L-[Val]²-Ciclosporin:

(«Ιο²⁰ = -232.9° (c = 0.48 v CHCI3), získaný z cyklosporinu 6.10;

6.19 [7'-Desme chy1-7'-e thy1-d i hyd ro-MeBm c ]¹ -[NvaJ²-C i c lospo r in :

[a]₀ ²⁰ - -227.29° (c = 0.54 v CHClj), získaný z cyklosporinu 6.11;

- 49 6.20 [ 7 ' -Des,ne chyl-7' - f enyl-dihydro-Me3,Tic J - - [ Val ]² -C i c los po r in :

[a]₂ ²⁰ = -214° (c = 1.19 v CHClj), získaný z cyklosporinú 6 · 8 neboó. 9;

6.21 [ 7 '-Desme chyl-7'-e chyl-dihydro-MeBmc ]’--Ciclosporin: [«χ 1₀ ²³ -233° (c =. 1.15 v CHClj), získaný z cyklosporinú ó . 3;

3

Jak bude zrejme, jsou cyklosporiny skupín la a 1a a skupin 4, 5 a 6, které jsou všechny novými sloučeninami, štruktúrne podobné a mohou být takto za účelem zjednodušení zarazený do sjednocených kategórií, napríklad do kategórie cyklosporinú, ve kterých má zbytek v poloze 1 obecný vzorec XXI

R,

CH,

R= - 0 (R)

CH

CH (XXI)

-N - CH - C0I (S)

CH, ve kterém

i) R znamená formylovou skupinu a

R^ má významy uvedené pro R^ ^v souvislosti s vzorcem XVIII, nebo ii) R znamená -x -y -R , pŕičemž -x -y -R má významy uve3 C C dené pro -χ-y-R^, x-y-R^ nebo -x-y-R^ v souvislosti se vzorci IV, V, XIV a XIX a

Rj_> znamená atóm vodíku nebo acylovou skupinu.

.23.

Stejné tak cyklosporiny skupin 1a a 1a a skupín 4 a 6, které jsou všechny novými sloučeninami a mají i jinou použitelnost než jako meziprodukty, mohou být zarazený do sjednocujících podkategorií, napríklad do podkategorie zahrnújící cyklosporiny, ve kterých je zbytek v poloze 1 tvoŕen zbytkem výše uvedeného obecného vzorce XXI, ve kterém R^ a R^ mají významy uvedené pod ii) pro obecný vzorec XXI.

Acylovými skupinami ve významu obecného substituentu jsou výhodné skupiny ACYl/ , které byly definovány v souvislosti s vzorci III a IV, zejména alkylkarbonylová skupina, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, napríklad acetylová skupina.

Výhodnými cyklosporiny takových kategórií a podkategorií jsou cyklosporiny výše uvedeného obecného vzorce II, ve kterém A znamená zbytek vzorce XXI, který byl definován výše a B má významy uvedené pro obecný vzorec II, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-.

Rúzné cyklosporiny výše uvedené skupiny 1b), napríklad cyklosporiny, ve kterých zbytek v poloze 2 je tvoŕen zbytkem 3 výše uvedeného vzorce III , ve kterém ACYL znamená acetylovou skupinu, jsou známé. Tak napríklad cyklosporin 1.35 je znám a byl společné se zpusoby jeho prípravy popsán Traber-em a kol. v Helv. Chim. Acta, 60, 1247 a dále (1977). Ostatní cyklosporiny skupiny 1b mohou být pripravený analogickým zpúsobem. Cyklosporin 1.36 je však zcela nového typu.

V souladu s dalším znakem vynálezu je pŕedmétem vynálezu ješté další následující skupina cyklosporinú.

Skupina le)

i) Diester dikarboxylové kyseliny cyklosporinu majícího beta-hydroxy-(L)-alfa-aminokyselinový zbytek v poloze 2, zejména :

ii) diester dikarboxylové kyseliny cyklosporinu majícího (L)-threonylový zbytek v poloze 2, a zejména iii) diester dikarboxylové kyseliny obecného vzorce XXII

CO- CY (XXI i)

CO- CY ve kterém znamená alkylenovou skupinu s 1 až 8 uhlíkovými atómy a každý(cy)znamená výše uvedený zbytek obecného vzorce II, ve kterém

A znamená -MeBmt- nebo -aihydro-MeBmt-,

B znamená (L)-threonylový zbytek obecného vzorce XXIII

— NK—Cn — CO— (XXIII) (L)

X znamená -Sar- a Y znamená -Val-.

R]3 ^s výhodou znamená alkylenovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómy.

Pŕedmétem vynálezu je rovnež zpúsob prípravy cyklosporinu ze skupiny 1e, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje

k) reakci beta-O-poloesteru cyklosporínu, ve kterém je zbytek v poloze 2 tvoŕen beta-hydroxy-(L)-alfa-aminokvselinovým zbytkem, napríklad beta-O-poloesteru obecného vzorce XXIV (c?) -C0-R₁₃-C0-0H (XXIV) ve kterém (cy) a mají výše uvedené významy, nebo jeho reaktívneho funkčního derivátu, s cyklosporinem, ve kterém je zbytek v poloze 2 tvoŕen beta-hydroxy-(L)-alfa-aminokyselinovým zbytkem, napríklad s cyklosporinem obecného vzorce II, ve kterém A znamená -MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-, B znamená -Thr-, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-.

Tato reakce múže být vhodné provedena obecnými postupy následujícího príkladu G.

Príklad G _ 2

Príprava /0-(L)-threonyl/ -Cicklosporin-diesteru kyseliny 1 ,2-ethandikarboxylové (cyklosporin 1.36)

0,255 g 2-chlor-1-methylpyridiniumjodidu a 0,244 g 4„ - 2 dimethylaminopyridinu se pridá k 1,318 g /(O-hemisukcinyl)-Thr/ Ciclosporinu v 5 ml absolutního dichlormethanu pri teploté 0 °C. Potom se pridá 1,218 g /Thr/ -Cicklosporinu a reakční smés se míchá po dobu 3 hodin pri teploté 0 ° C, načež se teplota reakční smési nechá za míchání vystoupit na 20 °C. Reakční smés se potom zŕedí dichlormethanem a vytŕepe do 10 ml 0,1N vodného roztoku hydroxidu sodného s ledem. Smés se potom dvakrát promyje vodou a organická fáze se vysuší nad síranem sodným, zfiltruje a odparí. Surový produkt se prečistí chromatograficky na silikagélu, pŕičemž se jako eluční soustava použije smés hexánu a acetónu v objemovém poméru 1:1. Z odpovídající frakce eluátu se potom izolujr požadovaná sloučenina.

/ «7θ° = -209,4° (c = 0,5 v CHClg.

Výchozí /(O-hemisukcinyl)Thr/ -Ciclosporin je známou sloučeninou, napríklad z príkladu 5 mezinárodní patentové prihlášky W086/02080. Ostatní poloesterové výchozí produkty vhodné pro prípravu cyklosporinú skupiny 1e mohou být pripravený analogickým zpúsobem.

Cyklosporiny výše uvedené skupiny 1c jsou nové a tvorí takto součást vynálezu jako nové sloučeniny.

Predmétem vynálezu je rovnéž zpúsob prípravy cyklosporinú skupiny 1c, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

1) oxidaci cyklosporinu, ve kterém je zbytek v poloze

3'-hydroxy-substituován a je tvoŕen napríklad zbytkem -MeBmt-.

Reakční stupeň 1) múže být proveden napríklad reakcí s N-chlorsukcinimidem a dimethylsulfidem pri teplote napríklad -30 až 10 °C, napríklad postupem podie následujícího príkladu H.

Príklad H

Príprava /3-desoxy-3 ’-oxo-MeBmt/-Ciclosporinu (cyklosporin 1.37)

K roztoku 12,8 g N-chlorsukcinimidu ve 400 ml toluénu se pridá 8,48 ml dimethylsulfidu. Smés se míchá po dobu 5 minút pri teplote 0 °C, načež se ochladí na teplotu -12 °C a k takto ochlazené smési se pridá 9,62 g Ciclosporinu ve 40 ml toluénu. Takto získaná suspenze se potom míchá po dobu 1,5 hodiny pri teploté -10 °C a potom ješté po dobu jedné hodiny pri teploté -10 až -5 °C. Pridá se 19,4 g triethylaminu, načež se vyloučí svetlá sraženina. Reakční smés se míchá po dobu 5 hodin pri teploté 0 °C, načež se zŕedí 250 ml diethyletheru. Pridá se 192 ml 1N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a po extrakci se organická vrstva dvakrát promyje 500 ml vody, vytŕepe do 250 ml 10% chladného vodného roztoku hydrogen uhličitanu sodného a promyje dvakrát 500 ml vody, 250 ml 10= kyseliny vinné a opétovné vodou. Kyselé a bázické vodné roztoky se reextrahují 2 x 500 ml diethyletheru. Sloučené organické fáze se vysuší nad síranem sodným a odparí k suchu v w O w w >

pri teplote 40 C. Zbytek se prečisti chromatograficky na 300 g silikagélu, pŕičemž se jako elučni činidlo použije nasycený vodný roztok ethylacetátu. Z odpovídající frakce eluátu se získá požadovaná sloučenina.

/ί£/θ° ₌ -241,3° (c = 0,531 v CHCip a -169,5°(c = 0,5 v CHgOH).

Analogickým zpúsobem mohou být pripravený cyklosporiny 1.38 a 1.39:

	Fyzikálni charakteristiky
1.38	[a]D J0= -255.1°(c= 0.5 v CHClj)
1.39	[a]D J0= -235.4°(c= 0.5 v CHClj)

Cyklosporiny výše uvedená skupiny 1d jsou rovnéž nové a tvorí takto součást vynálezu jako nové sloučeniny.

rŕedmétem vynálezu je rovnéž zpúsob prípravy cyklosporinú skupiny 1d, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

m) oxidaci, napríklad selektívni oxidaci cyklosporinú, ve kterém je zbytek v poloze 2 tvoŕen beta-hydroxy-alfa-aminokyselinovým zbytkem, napríklad (L)-threonylovým zbytkem.

reakční stupeň m) múže být proveden naprosto analogicky š výše uvedeným reakčním stupnén 1) , napríklad obecným postupem popsaným v následujícím príkladu I.

Príklad I

Príprava /alfa-methylketo-Gly/ -Ciclosporinu (cyklosporín 1.40)

K 868 mg N-chlorsukcinimidu ve 26 ml toluénu o teplote 0 °C se pridá 484 mg dimethylsulfidu. Po deseti-minutovém míchá ní pri teploté 0 °C se suspenze ochladí na teplotu -30 °C a k této suspenzi se pridá 1584 mg /Thr/ -Ciclosporinu v 6,5 ml toluénu. Reakční smés se potom míchá po dobu jedné hodiny pri teploté 26 až 30 °C a ke smési se potom pridá 1,81 ml triethylaminu. Chlazení se odstaví a po dalšich 5 minutách se pridá 25 ml diethyletheru. Reakční smés se potom nalije do 150 ml ledové vody a 10 ml 1N kyseliny chlorovodíkové, načež se pridá dalšich 100 ml diethyletheru. Organická fáze se trikrát promyje 150 ml ledové vody a extrahuje dvakrát diethyletherem. Sloučené organické fáze se vysuší nad siranem sodným a zahustí, zbytek se rozpustí v 10 ml dichlormethanu, zfiltruje pŕes Hyflo, zŕedí hexanem a odparí, pŕičemž se získá požadovaná sloučenina.

/ có/p° = -229° (c = 1,0 v CHC1₃) a -184° (c = 1,0 v CH₃OH).

Analogickým zpúsobem muže být pŕipraven cyklosporin

1.41:

/cC/2° = -226,7° (c = 1,0 v CHC1₃).

Cyklosporiny tŕídy 2i) a tŕídy 2ii) jsou rovnéž nové a tvorí takto součást vynálezu jako nové sloučeniny.

Pŕedmétem vynálezu je rovnéž zpúsob prípravy cyklosporinú tŕídy 2i) a 2ii), jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

m) za účelem prípravy cyklosporinu tŕídy 2i) reakci cyklosporinu, ve kterém je 3-uhlíkový atóm zbytku v poloze 1 oxo-substituován, napríklad cyklosporinu, ve kterém je zbytek v poloze 1 tvoŕen -3 -desoxy-3 -oxo-MeBmt-zbytkem, s alkoxyaminem s 1 až 4 uhlíkovými atómy nebo

n) za účelem prípravy cyklosporinu tŕídy 2ii) cyklizaci peptidu s otevŕeným ŕetézcem obsahujícího sekvenci cyklosporinu obsahujícího v poloze 2 (L)-isoleucylový zbytek, pŕičemž uvedený peptid s otevŕeným ŕetézcem začíná zbytkem odpovídajícím zbytku 8 uvedeného cyklosporinu a plnícím úlohu N-konce a končí zbytkem odpovídajícím zbytku 7 uvedeného cyklosporinu a plnícím úlohu C-konce, napríklad cyklizaci peptidu s otevŕeným ŕetézcem obsahujícího sekvenci

-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Ile-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala8' 9 10 11 12 3 4 5 6 7

Výše uvedený reakční stupeň m) môže být proveden napríklad reakcí se zvoleným alkoxyaminem s 1 až 4 uhlíkovými atómy, vhodne ve forme adiční soli s kyselinou, v prítomnosti báze, jakou je pyridin, pri teplote.asi -10 až asi 80 °C, napríklad obecným postupem dále uvedeného príkladu J..

Výše uvedený reakční stupeň múže být proveden naprosto analogicky s obecnými postupy pro celkovou syntézu cyklosporinú, napríklad postupem popsaným v patentu US 4 554 531 nebo ve zverejnené evropské patentové pŕihlášce 0 098 456. Cyklosporin 2.2 se takto napríklad pripraví substitucí BOC-Ile-OH za BOC-alfaAbu-QH ve stupni a) príkladu 1 uvedeného patentu a uvedené patentové prihlášky a následným provedením postupu, který je zcela analogický se stupni b) až x), popsanými v uvedeném patentu a uvedené patentové pŕihlášce.

Cyklosporin 2.2 má následujíci fyzikálni charakteristiky:

teplota tání: 151 °C;

/ cC/2° = -224° (c = 1,0 v CHC1₃).

Príklad J

Príprava /3 -desoxy-3 -methoxyimino-MeBmt/¹-Ciclosporinu (cyklosporin 2.1)

600 mg produktu z príkladu H a hydrochloridu v 2,5 ml ethanolu a 2,5 po dobu 14 hodin pri teploté 50°C pod Pyridin se odparí a zbytek se zfiltru

835 mg methoxylaminml pyridinu se michá atmosférou argónu, je. Filtrát se vyjme dichlormethanem a promyje solankou. Solanka se potom nškolikrát extrahuje dichlormethanem a sloučené organické fáze se opétovné promyjí solankou, vysuší a odparí, zbytek se prečistí chromatograficky, pŕičemž se z odpovídající frakce eluátu izoluje požadovaná sloučenina.

/ <Χ/θ° = -214° (c = 1,09 v CHC1₃).

Jak bude zŕejmé^ohou být cyklosporiny skupiny 1c a skupiny 2i), které jsou všechny novými sloučeninami a které mají i jinou použitelnost než jako meziprodukty, zarazený do sjednocujících podkategorií, napríklad do podkategorie obsahující cyklosporiny, ve kterých má zbytek v poloze 1 obec ný vzorec XXV

CH;

-t (R) ca A (R) (XXV)

-n—ca—coI (S) ca₃ ve kterém znamená atóm kyslíku nebo skupinu obecného vzorce R^N=, ve kterém R^ znamená alkoxylovou skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómy.

Cyklosporiny skupiny 2iii) jsou známé. Cyklosporiny 2.3 až 2,6 jsou takto popsány napríklad Wenger-em v Transplantation Proc., XVIII (6) Supp.5 (dec.), 213 a dále (1986).

Tyto cyklosporiny, jakož i ostatní cyklosporiny skupiny 2iii) mohou být pripravený obecnými postupy pro celkovou syntézu cyklosporinú, napríklad postupem, popsaným v patentu US 4554531 a v ve zverejnené evropské patentové pŕihlášce 0 098 456, napŕí klad náhradou H-Melle-Bzl nebo H-MeAloIle-Bzl za H-MeVal-Bzl ve stupni g) príkladu 1 uvedeného patentu nebo uvedené patentové prihlášky. Cyklosporiny 2.3 až 2.5 mají následující fyzikálni charakteristiky:

Cyklosporin	T.t.(°O	[a]oJ0 = -; (c = - v CHClj)
2.3	162 - 163	- 178°; 1.0
2.4	144 - 146	- 221’; 1.0
2.5	146 - 146	- 225’; 1.0
2.6	148	- 170’; 1.0 - - - - J

Cyklosporiny 3.1 až 3.5, 3.7 a 3.9 skupiny 3 jsou známe /viz napríklad traber a kol., Helv. Chim. Acta, 65, 1655 a dále (1982) a 70, 13 a dále (1987)/.

Cyklosporiny 3.6, 3.8 a 3.10 jsou nové a tvorí takto součást vynálezu jako nové sloučeniny. Cyklosporiny 3.6 a 3.8 mohou být pripravený postupy, které jsou zcela analogické s postupy, použitými pro prípravu ostatních známých dihydrocyklosporinú, napríklad popsanými v souvislosti s reakčním stupném f).

Cyklosporin 3.10 múže být pripraven analogicky s postupy pro separaci cyklosporinových minoritních metabolitú, napríklad postupem, popsaným v Helv. Chim. Acta 65, 1655 a dále (1982), napríklad minoritní metabolické frakce z fermentační .

brečky použité pro prípravu /(D)Ser/ -Ciclosporinu (viz evropská zverejnená patentová prihláška 0 056 782), napríklad postúpení popsaným v následujícím príkladu K.

Príklad K

Príprava /MeLeu/¹-Cicklosporinu (cyklosporin 3.10)

Biomasa získaná kultivací podie príkladu 3 zverejnené evropské patentové prihlášky 0 056 782 se odstredí v čeŕícím i separátoru (Westfalia) a vodná fáze (kultivační filtrát) se trikrát extrahuje pokaždé ekvivalentním množstvím ethylacetátu.

• Ethylacetátové extrakty se zahustí za vakua. Pevný podíl (mycelium) se zpracuje methanolem a homogenizuje, načež se pevná a kapalná fáze oddelí v čeŕícím separátoru. Tento extrakční postup se opakuje dvakrát za použití 90% methanolu. Methanolické extrakty se sloučí, pridá se voda a extrakty se zahustí za vakua. Tbývající vodný extraktový koncentrát se trikrát extrahuje ekvivalentním množstvím ethylacetátu a ethylacetátové extrakty se zahustí ,za vakua. Oba surové extrakty (z kultivačného filtrátu a mycelia) se chromatografují na silikagélu (0,040-0,063 mm), pŕičemž se jako eluční činidlo použije vodou nasycený ethylacetát. Nejdŕíve tekoucí frakce obsahují preváž* _v 2 ne /Val/ -Ciclosporin (cyklosporin D) a následne tekoucí frakζ ce eluátu obsahují pŕevážné /MeLeu/¹-Ciclosporin (cyklosporin

3.10) a Ciclosporin (cyklosporin A). Takto získané pikové frakce se znovu chromatografují na silikagélu (0,020-0,045 mm), pŕičemž se tentokrát jako eluční činidlo použije smés acetónu a hexánu v objemovém poméru 1:1. Frakce obsahující /MeLeu/¹Ciclosporin se opétovné chromatografují na LiChoprep RP-18 (0,040-0,063 mm), pŕičemž se jako eluční soustava použije smés methanolu a vody v objemovém poméru 85:15, a potom na silikagélu (0,020-0,045 mm), kdy se jako eluční soustava použije vodou nasycený ethylacetát. Z odpovídající frakce eluátu se získá požadovaná sloučenina.

Teplota tání: 142-148 °C;

/QS/2° = -303° (c = 0,54 v CHC1₃).

Cyklosporin 3.6 má následující fyzikálni charakteristiky: teplota tání = 180-182 °C;

/<£/θ°= -211° (c = 0,64 v CHC1₃).

Príklad 1

Použitelnost pri obnovení citlivosti vúči antineoplastickýmcytotoxickým protinádorovým chemoterapeutickým látkám (in vitro1 )

Rakovinné bunečné rady (CCL -cancer celí lines), napríklad tvorené buňkami malého lidského karcinomu plic, resistentní vúči jedné nebo více chemoterapeutickým látkám (CTDS - cancer therapeutic drug substances), zvoleným ze skupiny zahrnújící Daunorubicin (DR, Vincristine (VC), Adriamycin (AM), Etoposide (ET), Tenoposide (TE) a Colchicine (CC), se kultivují postupy, popsanými Twentyman-em a kol. v Br. J. Cancer, 54, 253 (1986).

Citlivost resistentních sublinií (CCL-R) se srovná s citlivostí matečných bunečných sensitivních rad (CCL-S) vyhodnocením inhibice bunečného rustu v prúbehu kontinuálni expozice protirakovými chemoterapeutickými látkami, napríklad v prípade bunečné rady resistentní vúči Daunorubicinu (CCL-DRR) srovnáním rústu bunečných rad CCL-DRS a CCL-DRR v prítomnosti DR, obsaženého v k.ultivačním prostredí ab initio. Za tímto účelem se méŕí proliferace bunek počítaním bunek pomoci elektronického čítače bunek, pŕičemž počítání bunek je provedeno bezprostredné po ukončení exponenciálni rústové fáze. Byly vybrány takové resistentní bunečné rady CCL-R, pro které je koncentrace IC_on (tj. koncentrace chemoterapeutické látky, na príklad koncentrace DR, potrebná ke snížení finálního počtu bunek na 20 % hodnoty finálního počtu bunek u kontrolní bunečné rady, která nebyla vystavená expozici chemoterapeutického činidla, napríklad DR) více než 80x, výhodné více než 100x vyšší než koncentrace odpovídájících matečných citlivých rad CCL-S.

Potom se vyhodnotí citlivost vybraných resistentních bunečných rad CCL-R vúči chemoterapeutickým látkám (napríklad vúči DR) v prítomnosti a neprítomnosti testovaného cyklosporinu, pŕičemž se počty bunék, které jsou mírou bunečné proliferace, stanoví výše uvedeným zpúsobem. Za tímto účelem se bunky kultivují ab initio v prítomnosti rúzných koncentrací jak chemoterapetické látky, tak i testovaného cyklosporinu. V rámci skreenování se volí takové koncentrace testovaného cyklosporinu, které samotné nezpúsobí výrazné snížení proliferace rakovinných bunék. Tyto vhodné koncentrace se stanoví kultivací citlivých a resistentních bunečných rad CCL-S a CCL-R v prítomnosti rúzných koncentrací cyklosporinu a v neprítomnosti chemoterapeutické látky. Cyklosporiny se rutinné testují pri koncentrací 0,01 až 50, zejména 0,1 až 10, yug/ml, napríklad pri koncentracích 0,01,

0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 a 50/Ug/ml. Pomér množství chemoterapeutického činidla (napríklad DR) potrebného k inhibici bunečné proliferace o 50 % v neprítomnosti testovaného cyklosporinu (IC_5Q-CS) k množství chemoterapeutického činidla potrebnému k inhibici bunečné proliferace o 50 % v prítomnosti testovaného cyklosporinu (IC^q+CS) je vzat jako míra zvýšení citlivosti resistentrií bunečné rady CCL-R vúči chemoterapeutické látce, které bylo indukováno testovaným cyklosporinem (sensibilační pomér). Stabilita bunéčné rady CCL-R je zajišténa kontrolou její citlivosti vúči chemoterapeutické látce a srovnáním zjišténé citlivosti s citlivostí stanovenou na počátku testu.

Pri výše uvedeném modelovém testu jsou cyklosporiny skupin 1 až 3, zejména špecifické citované cyklosporiny, účinné pri zvyšování citlivosti vúči chemoterapeutickým látkám (napríklad vúči DR, VC, AM atd.) pri výše vymezených koncentracích, zejména pri koncentracích asi 10/Ug/ml nebo pri koncentracích ješté nižších.

Pri vyšších koncentracích, napríklad pri koncentracích 50/ug/ml, je inhibice proliferace jak citlivých, tak i resistentních bunéčných rad CCL-S a CCL-R v nékterých pŕípadech zpúsobena testovanými cyklosporiny v neprítomnosti chemoterapeutické látky, pŕičemž v pŕípadech, kdy k tomu dochází, je tento jev obecne méné výraznejší u resistentních bunečných rad CCL-R než u citlivých bunečných rad CCL-S. Daleko výraznéji jsou testované cyklosporiny účinné pri zvyšovaní citlivosti vúči chemoterapeutickým látkám resistentních bunečných rad CCL-R pri koncentracích, které v neprítomnosti chemoterapeutické nemají vliv na proliferaci rakovinných bunek.

Pri jedné ze série testu, provádéné za použití bunéčné rady lidského malého karcinomu plic resistentní vúči AM a cyklo sporinu 2.4, 1.1 a 1.32, byl stanoven sensibilační pomer pro AM _f (AM IC^q-CS/AM IC^q+CS), jehož hodnoty pro uvedené koncentrace testovaných cyklosporinú jsou uvedený v následující tabulce * (výzkum a data: P.R. Twentyman, MRC Clinical Oncology and

Radiotharapeutic Unit, Hills road, Cambridge, GB - srovn. Br. J Cancer 57, 254-258 (1988)/.

•f %

	Sensibilační pomér
Koncentrace cyklosporinú
Cyklosporín	50.0 ug/ml	5.0 ug/ml
2.4	>30	>30
1.1	___	>20
1.35	12	3.3
-	1.0	1.0

Príklad 2

Použitelnost pri obnovení citlivosti vúči antineoplastickýmcytotoxickým protinádorovým chemoterapeutickým látkám (in vitro

2)

Tento test múže být proveden za použití libovolné vhodné bunéčné rady resistentní vúči chemoterapeutickým látkám a kontrolní (matečné) bunéčné rady, které se získají napríklad zpúsobem popsaným Ling-em a kol. v J. Celí. Physiol. 83, 103-116 (1974) a Bech-Hansen-em a kol. v J. Celí. Psysiol. 88, 23-32 (1976). Špecifickými zvolenými klony jsou globálne resistentní (napríklad resistentní vúči colchicinu) rada CHR (subklon C5S3.2) a matečná citlivá rada AUX B1 (subklon AB1 SI 1) - srovn. Ling a , Biochim. Biophys.Acta, 455, Biochim. Biophys. Acta. 455, , Proc. Natl. Acad. Sci., 78 (1), , Science 221, 1285-1288 (1983);

Kartner a kol., Náture, 316, 820-823 (1985); Riordan a kol., Náture, 316, 817-819 (1985); Van der Blick a kol., Mol. Celí. Biol. 6, 1671-1678 (1968); Endicolt a kol., Mol. Celí Biol.,7, 4075-4081 (1987); Deuchars a kol., Mol. Celí. Biol., 7, 718-724 kol. loc.cit. a Juliano a kol. 152-162 (1976); Carlsen a kol, 900-912 (1976); Lalande a kol, 363-367 (198i); Kartner a kol (1987); a Gerlach a kol., Náture,. 324, 485-489 (1986).

Bunečné rady se kultivují v médiu alfaMEM obohacenému 0,02 mg/ml (L)-asparaginu, MEM-vitaminy (IX), 100 U/ml penicilin-strptomycinu, 2mM (L)-glutaminu a 10% tepelné inaktivovaným fetálním telecím sérem. Test se provádí za použití testovacích ploten s 96 jamkami. Roztok colchicinu o koncentrací 50/Ul se pŕidává ke kultivačnímu prostredí tak, aby byly získány finálni koncentrace 30-10-3-1-0,3-0,l^ug/ml pro resistentní radu (RL) a finálni koncentrace 0,3-0,1-0,03-0,01-0,0030,001-0/Ug/ml pro citlivou radu (SL). Mohou být použitý i nižší koncentrace v prípade potreby, kdy testovaný cyklosporin velmi výraznou mérou snižuje IC^g-odezvu na colchicine.

Testované cyklosporiny se rozpustí v koncentrací 1mg/ml v absolutním ethanolu. Každý testovaný cyklosporin se rutinné screenuje pri 0,1 a 1,0/Ug/ml, pŕičemž pri kontrolních pokusech jsou použitý pouze odpovídající zŕedéní ethanolového rozpouštédla. Testované cyklosporinové roztoky nebo kontrolní roztoky (50/Ul) se pridájí do každé jamky, kde se promísí s již prítomnými colchicinovými roztoky. Potom se pridá 100-ul· bunéčných suspenzi s koncentrací 4x10 bunék/ml pro citlivou radu (400 bunék/jamka) a 8x10^ bunék/ml pro resistentní radu RL.

Proliferace se vyhodnocuje kolorimetricky /Mosman, J.

J. Immunol. Methods, 65, 55-63 (1983)/ za použití 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromidu (MMT). Nejdŕíve se odstráni 100/Ul bunek-prostý supernatant, načež se do každé jamky pridá 1O^ul roztoku MTT o koncentraci 5 mg/ml v prostredí RPMI 1640 (Gibco) a plotna se inkubuje po dobu 3 hodin pri teplote 37 °C. Pridá se 100/Ul smési butanol/isopropanol/1N kyselina chlorovodíková v objemovém poméru 192:96.12 ml), načež se plotna trepe až k dosažení úplného rozpustení pevného podílu. Optická hustota se odečítá pri vlnové délce 540 nm.

Bunečný rust (méŕený MTT-dependentní optickou hustotou) se graficky vynese v závislosti na koncentraci colchicinu, pŕičemž se krivka dávka-odezva vynese pro každý testovaný cyklosporin a stanoví se colchicinová inhibiční koncentrace 50 (ΟΙΟ^θ), což je koncentrace colchicinu potrebná k omezení proliferace bunek o 50 %.

Zvýšení citlivosti vúči colchicinu, indukované každým testovaným cyklosporinem pri koncentraci 0,1 a 1,0 ,ug/ml, se stanový jako:

CIC_5Q v neprítomnosti testovaného cyklosporinu CICj-q v prítomnosti testovaného cyklosporinu

CIC^q- sensibiCIC(-q+ lační zisk

Testované cyklosporíny mohou ovlivňovat citlivost vúči colchicinu jak resistentní bunečné rady RL, tak i citlivé bunečné rady SL. Relatívni vliv na obe tyto bunečné rady múže být stanoven jako

CICj-q+ pro rady RL ΟΙΟ,-θ + RL

CIC(-q+ pro rady SL CICgg+ SL relatívni resistence.

Cyklosporíny tŕíd 1 až 3 zvyšují citlivost resistentní bunečné rady RL vúči colchicinu pri výše uvedených koncentracích. Obecné lze pozorovat i zvýšení citlivosti citlivé bunečné rady SL pri ekvivalentních koncentracích, i když toto zvýšení je méné výrazné než u bunečné rady RL. Pro použití v rámci vynálezu jsoú obecné považovány za vhodnéjší cyklosporiny vykazující vyšší relatívni resistenci, která byla definována výše.

Pri jedné sérii pokusu byly získány pro bunečné rady RL a SL sensibilační zisky, které jsou uvedený v následující tabulce.

Cyklosporin		SL		RL
0.lug/ml	1.0ug/ml	0.lug/ml	1.0ug/ml
1!	4.0	8.0	1.4	30.8
1.2	4.4	8!	2.0	59.8
1.3	5.3	10.7	1.8	97.9
1.4	6.7	11.7	1.7	97.6
1.10	3.6	11.6	1!	28.9
1.11	6.3	17.6	1!	36.7
1.15	4.7	12.9	1.5	38.3
1.37	5.8	12!	1.4	82.4
2.2	7.9	15!	1.5	97.3
Z . 4	4.7 '	15.7	1.2	34.5

Príklad 3

Použitelnost pri obnovení citlivosti vuči antineoplastickýmcytostatickým protinádorovým chemoterapeutickým látkám (in vivo)

Sublinie Ehrlichova ascitického karcinómu (EA) resistentní vuči chemoterapeutickým látkám DR, VC, AM, ET, TE nebo CC se rozvíjí sekvenčním pŕenosem bunék EA na následné generace hostitelských myší BABB/c postupem, popsaným Slater-em a kol. v J. Clin. Invest, 70, 1131 (1982). Za tímto účelem se chemoterapeutická látka podává pri dávkování 0,2 až 0,5 mg/kg/den, i.p. v 5 dávkách počínaje 24 hodin po zaočkování hostitelských myší 0,2 ml neŕedéné maligní bŕišní tekutiny (ascitu), odebrané z preterminálních zvíŕat.

Za účelem testu pŕijmou hostitelské myši výše uvedené resistentní bunečné rady Ehrlichova ascitického karcinomu EA-R nebo citlivé (matečné) bunečné rady Ehrlichova ascitického karcinomu EA-S. Myší, které pŕijaly resistentní bunečnou radu EA-R byly rozdelený do skupín, které pŕijaly:

1) žádnou chemoterapeutickou látku / žádný cyklosporin,

2) chemoterapeutickou látku / žádný cyklosporin,

3) žádnou chemoterapeutickou látku / testovaný cyklosporin,

4) chemoterapeutickou látku + testovaný cyklosporin.

Antineoplastická chemoterapeutická látka je podávána v dávkáeh použitých pri generování bunečných rad EA-R. Cyklosporinová testovaná látka je podána v celkové testovací dávce 1 až 80 mg/kg, zejména v dávce 5 nebo 25 nebo až 40 mg/kg v péti dílčích denních dávkáeh za použití intraperitoneálního podání (ve smési ethanolu a olivového oleje; počínaje 24 hodin po zaočkování bunečné rady EA-R. Potom se srovná strední doba prešití ve skupinách 2, 3 a 4 se strední dobou prežití ve skupine 1 a toto srovnání predstavuje míru účinnosti použité terapie.

Získané výsledky neukazuj! žádný výrazný rozdíl mezi dobami prežití ve skupinách 1, 2 a 3. Ve skupine 4, pŕijímající cyklosporin skupín 1 až 3 ve výše uvedeném dávkování, dochází k podstatnému zvýšení doby prežití (napríklad k dvojnásobnému až trojnásobnému nebo k ješte vétšímu) ve srovnání s obéma skupinami 1 a 2.

Ekvivalentní výsledky mohou být získaný použitím cyklosporinú skupin 1 až 3 pri modelových testech srovnatelné koncepce, napríklad in vitro, nebo použitím pokusných zvíŕat infiko vaných kmeny virú resistentních vúči chemoterapeutickým činidlúm, fungálními kmeny resistentními vúči antimykotikúm, jakož i protozoálními kmeny resistentními vúči chemoterapeutickým činidlúm, napríklad plasmodiálními kmeny, napríklad v prírode se vyskytujícími subkmeny kmene Plasmodium falciparum, které vykazují získanou resistenci vúči chemoterapeutickým pro- 67 timalariovým činidlám.

Použitelnost cyklosporinú skupin 1 až 3 v souladu s vynálezem múže být rovnéž demonštrovaná klinickými testy, napríklad preliminárními testy, které se provádí následujícím.zpúsobem.

Klinický test 1

Subjekty (ženského i mužského pohlaví) pro tento klinický test jsoupacienti s diagnosou maligního rakovinného rústu, kterým je indikována antineoplastická-cytostastická terapie.

U každého subjektu podrobujicího se tomuto testu je vypracována detailní zpráva o genezi nemoci, stavu a štádiu onemocnéní, odhadnuté rýchlosti prúbéhu nemoci a prognose nemoci.

Typ podaného antineoplastického-cytostatického terapeutického činidla požadované dávkování v neprítomnosti cyklosporinové terapie jsou stanovený ošetrujúcim lékaŕem podie typu a štádia pokročilosti rakovinného onemocnení.

Testovaný cyklosporín se podáva perorálne v dávce 1,0 až 20,0 mg/kg/den nebo parenterálné, napríklad intravenózné nebo intramuskulárné v dávce 0,5 až 5,0 mg/kg/den. Pokud to stav onemocnení dovolí, započne se s podáním testovaného cyklosporinu alespoň 1 nebo 2 dny, výhodné 10 až 14 dní, pred počátkem antineoplastické terapie, aby bylo možné postupné zvyšovat dávku až k dosažení prúbéžné terapeutické hladiny cyklosporinú. V téchto prípadech se počáteční cyklosporinové dávky pohybují v blízkos ti spodní meze výše uvedených dávkovacích rozmezi (napríklad pri perorálním podáni: 1,0 až 5,0 mg/kg/den nebo pri parenterálním podáni: 0,5 až 1,5 mg/kg/den) a stoupají k vyšší dávkovací hladiné (napríklad pri perorálním podáni: 5,0 až 15,0 nebo až 20,0 mg/kg/den, nebo pri parenterálním podáni: 2,0 až 5,0 mg/kg/den), pŕičemžpresný režim takového zvyšování dávkování je stanovem ošetrujícím lékaŕem v závislosti na stavu pacienta na vstupu klinického testu, v nékterých prípadech múže být žádoucí, aby cyklosporinová a antineoplastická-cytostatická terapie byly započaty a ukončený současné, i když i v tomto prípade je výhodné započít s nižším výchozím dávkováním cyklosporinu a postupné zvyšovat dávku cyklosporinu až k uvedenému maximu.

Počáteční antineoplastická-cytostatická terapie se započne s dávkami, které odpovídaji jedné tretine odhadnuté dávky v neprítomnosti cyklosporinové terapie, pŕičemž presná volba počáteční dávky cytostatické terapie opét závisí na rozhodnutí ošetŕujícího lékaŕe. Antineoplastické-cytostatické dávkování se potom zvyšuje podie potreby v závislosti na pozorované odezvé.

V prubéhu tohoto klinického testu jsou monitorovány všechny relevantní klinické parametry, včetné podávaných dávek cyklosporinu a antineoplastického-cytostatického chemoterapeutického činidla. Pacienti jsou monitorování za účelem kontroly redukce nádorového rústu, výskytu metastáz a prípadné nádorové regrese. V prúbéhu klinického testu jsou zaznamenávána srovnání očekávané prognosy onemocnení s jeho skutečným stavem a prúbéhem.

Vyhodnocení výsledkú klinických testú ukazuje, že u pacientú, kteŕí se podrobili tomuto klinickému testu docházi k účinné kontrole nebo zlepšení stavu nemoci, včetné omezení nádorového rústu nebo nádorové regrese a omezení výskytu metastáz, a to pri dávkách antineoplastického-cytostatického terapeutického činidla, které jsou nižší než dávky, kterých by bylo zapotŕebí k dosažení ekvivalentní účinnosti bez cyklosporinové terapie. Rovnéž je zaznamenána snížená resistence vuči antineoplastickému-cytostatickému chemoterapeutickému činidlu ve srovnání s výsledky dosaženými u skupiny, která je léčena pouze antineoplastickou-cytostatickou terapií, jakož i snížení nežádoucí toxické reakce na podávané antineoplastické-cytostatické chemoterapeutické činidlo.

Klinický test II

Subjekty pro tento klinický test jsou hospitalizovaní nebo ambulantní pacienti (ženského i mužského pohlaví) trpící pokročilým stádiem maligního rakovinného rústu ruzného typu.

Subjekty vybrané pro tento test jsou pacienti, kteŕí absolvovali celou antineoplasticko-cytostatickou chemoterapii a ktefí jsou v poslední fázi globálního léčení komplexem chemoterapeutických činidel, pŕičemž se u téchto pacientu obnovil nádorový rust a výskyt metastáz, což znamená, že jejich rakovina je evident né identifikovatelná jako resistentní vúči globálni léčbé komplexem chemoterapeutických činidel.

Pro každého pacienta podrobujícího se tomuto klinickému testu vypracuje podrobná zpráva, kladoucí dúraz zejména na popis léčení, který byl u pacienta použit v prúbéhu pŕedcházejících 6 až 18 mésícú, geneze ze nemoci a současný stav nemoci, napríklad pŕedpokládaná rychlost postupu nemoci a odhadnutá prognóza.

Pri tomto klinickém testu jsou pacienti udržovaní na pŕedem stanoveném dávkování a programu antinoeplasticko-cytostatické chemoterapie, pŕičemž touto terapií je terapie aplikovaná pri identifikaci resistence vúči chemoterapeutickým činidlúm a na vstupu klinického testu. Antineoplastická chemoterapie je udržována v prúbéhu celého testu na preresistenčné determinační hladiné a programu. Tento chemoterapeutický režim je doplnén podáváním testovaného cyklosporinú v perorální dávce asi 1 až 20, napríklad asi 5 až 15 mg/kg/den nebo v parenterální , napríklad intravenózni, dávce asi 0,5 až 7,5, napríklad asi 2,0 až 5,0, mg/kg/den. U nékterých pacientú múže cyklosporinová terapie započít 1 až nejvýše 14 dnú pred započetím antineoplastické terapie, pŕičemž se v ní pokračuje v prúbéhu celé léčebné periódy.

V jiných pŕípadech múže být žádoucí, aby se s cyklosporinovou a antineoplastickou terapií započalo současné.

Pacienti jsou monitorováni za účelem zjišténí omezení nádorového rústu, výskytu metastáz a možné nádorové regrese.

Ve stanovených intervalech tohoto klinického testu se zaznamenávajú srovnání skutečného stavu nemoci s pŕedpokládanou prognózou. V pŕípadech, kdy u pacienta není zaznamenáno žádné zlepšení stavu nemoci nebo alespoň restrikce zhoršování nemoci za určitou dobu, je v kompetenci ošetŕujícího lékaŕe modifikovat nebo zménit bazálni antineoplasticko-cytostatickou chemoterapii.

V prúbehu celého klinického testu jsou monitorovány všechny relevantní klinické parametry, včetne hladín antineoplasticko-cytostatických chemoterapeutických činidel a cyklosporinu v krevním séru a rýchlosti jejich vylučování.

Vyhodnocení výsledkú tohoto klinického testu ukazuje, že u pacientú, kteŕí se tomuto testu podrobili, došlo k výraznému zlepšení kondice, k restrikci nádorového rústu nebo k nádorové regresi a k omezení výskytu metastáz po zavedení cyklosporinové terapie neustálém zlepšování prognózy nemoci.

Cyklosporiny tŕídy 1 až 3 jsou v souladu s výše zjištenými skutečnostmi indikovány pro použití pri léčení morbidního stavu nemoci, pri kterém došlo k získané resistenci vúči chemoterapeutickým činidlúm, nebo pro použití jako doplňující chemoterapie .

Vzhledem k výše uvedenému vynález tedy poskytuje:

1.1 zpúsob zlepšení nebo zvýšení účinnosti chemoterapeutické terapie nebo zvýšení citlivosti vúči chemoterapeutické terapii, nebo

1.2 zpúsob snížení efektivních dávek chemoterapeutických činidel u pacientú, kteŕí takovou terapii potrebujú, pŕičemž podstata tohoto zpúsobu spočívá v tom, že se pacientovi současné podáva cyklosporin skupín 1 až 3, které byly výše definované, nebo

2.1 zpúsob léčení morbidního stavu nemoci výkazujícího nebo charakterizovaného získanou, indukovanou nebo vrozenou resistenci vúči chemoterapeutickým činidlúm, nebo

2.2 zpúsob zlepšení chemoterapeutické léčby morbidních stavú nemoci vykazujúcich nebo charakterizovaných získanou, indukovanou nebo vrozenou resistenci vúči uvedené chemoterapeutické léčbé, nebo

2.3 zpúsob potlačení nebo snížení získané, indukované nebo vrozené resistence vúči chemoterapeutické léčbé, nebo

2.4 zpúsob obnovení citlivosti vúči chemoterapeutické léčbé u pacienta, který takovou léčbu potrebuje, pŕičemž podstata tohoto zpúsobu spočíva v tom, že se pacientovi podává účinné množstvi cyklosporinu z nékteré z výše definovaných skupín 1 až 3.

Alternatívne vynález poskytuje:

3. zpúsob chemoterapeutického léčení pacienta, který takové léčení potrebuje, jehož podstata spočívá v tom, že se pacien tovi podá vhodná chemoterapeuticky účinná látka společné s cykl sporinem z nekteré z výše definovaných skupín 1 až 3, který plní funkci doplnkového léčiva k uvedené chemoterapeuticky účin né látce.

Vynález rovnéž poskytuje:

4. cyklosporin z, nékteré z výše uvedených skupín 1 až 3 pro použití pri zpúsobu definovaném pod nékterým z výše uvedených odstavcú 1.1, 1.2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 nebo 3, nebo

5. cyklosporin z nekteré z výše uvedených skupín 1 až 3 pro použití pri príprave farmaceutické kompozice pro použití pri zpúsobu definovaném pod nékterým z výše uvedených odstavcú 1.1, 1.2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 nebo 3.

Vzhledem k tomu, že žádný z cyklosporinú skupín 1 až 3 nebyl dŕíve navržen nebo doporučen pro farmaceutické nebo terapeutické použití, a k tomu, že špecifické cyklosporiny skúpin 1 až 3 jsou skutečné novými sloučeninami nebo cyklosporiny zcela nového typu, vynález rovnéž poskytuje:

6. výše špecifikované cyklosporiny skupín 1 až 3, napríklad včetne individuálních cyklosporinú, o kterých bylo výše uvedeno, že jsou novými sloučeninami, jakož i cyklo

3 4 5 sporinú skupin 1a , 1a , la , 1a , 1d, 1e a skupin 2i) a 2iii), pro použití jako farmaceutický účinné látky.

Jednotlivé stavy a formy chemoterapeutického léčení, pri kterých mohou být zpúsoby podie vynálezu použitý, zahrnují stavy zpúsobené mikrobiálni, napríklad virální, bakteriálni, fungální nebo protozoální, infekcí zahrnujících kmeny resistentní vúči jedné nebo nékolika antimikrobiálním nebo antibiotických chemoterapeutickým látkám, napríklad vúči antivirálním, antibakte riálním, antif dijálním nebo antiprotozoálním chemoterapeutickým látkám.

Zpúsoby podie vynálezu jsou obzvlášté použitelné pro léčení rakovin, napríklad karcinomú nebo sarkomú nebo jiných nádorú nebo maĽgních nárústu, vykazujících indukovanou nebo získanou resistenci vúči jedné nebo nékolika protirakovinným chemoterapeutickým látkám, napríklad vúči antineoplastickým nebo cytostatickým činidlúm, napríklad vúči anthracyklinúm nebo chemoterapeuckým látkám na bázi vinkaalkaloidú nebo vúči špecifickým chemoterapeutickým látkám, mezi které patrí daunorubicin, vincristine, adriamycin, etojioside, tenoposide a/nebo colchicin, napríklad za účelem omezení nebo potlačení nádorového rústu, výskytu metastáz atd..

Výhodnými cyklosporiny pro použití v rámci vynálezu jsou cyklosporiny, mající pomérné malou imunosupresivní účinnost, napríklad nemajúci v podstaté žádnou imunosupresivní účinnost pri pŕedpokládaných dávkách, nebo výkazují imunosupresivní účinnost, která je podstatné nižší, napríklad menší než 50 %, než imunosupresivní účinnost Ciclosporinu (cyklosporin A). Špecifickými cyklosporiny, které jsou vhodné pro použití pri zpúsobech podie vynálezu, jsou cyklosporiny, které byly výše definované v rámci skupin 1 až 3.

Dávkování cyklosporinú, použité pri provádéní výše uvedených zpúsobú, se bude samozrejme ménit v závislosti na typu nemoci, která má být léčena (včetné charakteru resistence), na specifickém použitém cyklosporinu a na zpúsobu podání.

Obecne však bude uspokojivých výsledku dosaženo pri perorálních dávkách asi 1 až 20 nebo až asi 50 mg/kg/den, napríklad asi 5 až 10 nebo až asi 15 mg/kg/den, podaných najednou nebo ve 2 až 4 dílčích dávkách, nebo pri parenterálních, napríklad intravenózních, dávkách (napríklad intravenózni kapačkou nebo infuzí) asi 0,5 až 7,5 nebo až asi 10 mg/kg/den, napríklad asi 1,5 nebo 2,0 až 5,0 mg/kg/den.

Vhodné denní dávky podávané pacientúm jsou takto asi 50 až 1000 nebo až asi 2500 mg, napríklad asi 250 až 500 nebo až 600 mg pri perorální aplikaci nebo asi 25,0 až 375,0 nebo až 500 mg, napríklad asi 75 až asi 100 nebo až 250 mg pri intravenózni aplikaci.

Alternatívne a dokonce výhodné múže být dávkování pacientovi upraveno špecifickým zpusobem, aby se dosáhlo prubežné pŕedem stanovené hladiny chemoterapeuticky účinné látky v krvi, napríklad za použití techniky RIA. Tímto zpúsobem múže být pacientovo dávkování nastaveno tak, že se dosáhne pravidelné hladiny účinné látky v krvi, méŕené technikou RIA, asi 50 nebo 150 až asi 500 nebo ‘1000 ng/ml, tj. analogicky se zpúsoby dávkování bežné používanými pro obvyklou Ciclosporinovou imunosupresivní terapii.

Farmaceutické kompozice vhodné pro perorální podání cyklosporinú výše uvedených skupín 1 až 3 v rámci provádéní zpúsobu podie vynálezu mohou být napríklad pripravený následujícím zpúsobem:

Prísada

Relatívni množství (g)

i) Labrafil M 1944 CS 150 ii) Cyklosporin (napríklad cyklosporin 1.1, 1.2, 1,3,

1.11 nebo 1.36) 25 (sušina) iii) Ethanol (absolútni) 50 iv) Olivový olej asi 237

Celkem asi 462,0

4

Všechny prísady se naváží pŕímo do míchané nádobky.

Prísady i) a iii) se odváži jako první. Potom se pridá prísada ii) za neustálého míchání, ve kterém se pokračuje až do okamžiku, kdy se dosáhne rozpustení pevného podílu. Potom se pridá prísada iv) a smés se míchá ješté po dobu 10 minút. Získaný roztok se zfiltruje (Gelman Preflow Filter, 400/um) pri tlaku asi 0,05 až 0,08 MPa a plní do 50 ml lahviček typu Rexo. Lahvičky se tésné uzavŕou pryžovou zátkou a vĺčkem. Celý tento postup se provede za bezvodých podmínek pri okolní teploté a všechny stupné se provádí pod dusíkovou atmosférou (0,025'MPa). Roztok v lahvičce, který je vhodný pro perorální podání, obsahuje 50 mg (sušina) cyklosporinu v každém mililitru. Alternativné muže být uvedený roztok plnén do mékkých nebo tvrdých želatínových tobolek za účelem maskování chuti uvedeného preparátu.

Cyklosporiny skupín 4 a 6, zejména individuálni cyklosporiny téchto skupín, které byly výše špecificky vyjmenovány, mají rovnéž farmaceutickou účinnost. Tyto cyklosporiny zejména výkazují imunosupresivní, protizánétovou a protiparazitickou účinnost, jak to bylo prokázáno pri testech in vitro a in vivo, napríklad pri dále popsaných testech. Uvedené cyklosporiny jsou rovnež účinné vúči experimentálni alergické encefalomyelitide (EAE) u krýs, což je rovnéž popsáno dále.

Príklad 4

Imunosupresivní účinnost

4.1 Lokálni hemolýza in vitro v gélu /R.I. Mishell a R.W.

Dutton, J. Exp. Medicíne, 126, 423-442 (1976)/. Cyklosporiny skupín 4 a 6 inhibují hemolytické zóny ve srovnání s kontrolními vzorky bez aplikace cyklosporinu pri koncentracích 0,03 až 10,0/ug/ml.

4.2 Test na stimulaci lymfocytu podie Janossy-ho a Greaves-a /Clin. Exp. Immunol., 9, 483 (1971) a 10, 525 (1972)/.

Cyklosporiny skupín 4 a 6 inhibují concanavalinem A sti75 mulovanou DNA-syntézu (inhibice H^-thymidinové inkorporace), bunečnou profiferaci a blastogenezi v lymfocytech myší sleziny ve srovnání s kontrolními vzorky bez aplikace cyklosporinú v koncentracích 0,001 až 3,0/Ug/ml.

4.3 Smíšená lýmf ocitni reakce /Bach a kol., J.Exp. Med.

136, 1430 (1972)/. Vyhodnocuje se smíšená reakce (tj. (proliferační a diferenciační) lymfocytu (slezinové buňky myší Balb/c) po 5 denní společné inkubaci s allogenními slezinovými buňkami z ozárené myši (CBA) v prítomnosť a neprítomnosti testované látky. Reakce v neprítomnosti testované látky slouží jako kontrolní reakce a je vzata za 100 %. Reakce v prítomnosti testované látky se vyjádrí jako procentická zmena ve srovnání se 100% kontrolní reakcí. Je pozorována inhibice uvedené reakce použitím cyklosporinú skupín 4 a 6 v koncentracích 0,001 až 3,0/Ug/ml.

Príklad 5

Protizánetová účinnost

Tato protizánetová účinnost múže být prokázána testem na adjuvantní artritídu u krýs. Za účelem tohoto testu se uvedená adjuvantní artritída indukuje postupem podie Pearson-a a Wood-a, popsaným v Arthr. Rheum. 2, 440 (1959). Cyklosporiny skupín 4 a 6 vykazují pri tomto testu účinnost vúči rozvíjející se a stabilizované artritíde pri dávkách 5 až 30 mg/kg/den podávaných perorálne.

Príklad 6

Protiparazitická (protimaláriová) účinnost

Protimaláriový test podie L. Rane-a, popsaný v Chemotherapy and Drug Resistance, nakl. W. Peters, Academic Press, New York, 1970. Myši (samečkové, OF1) se v den 0 infikují 0,2 ml

- 76 suspenze obsahující 10^ parazitických bunek druhu Plasmodium berghei (kmeň NK 65), podané intraperitoneálné. Testovaná látka se podává subkutánne tretí den v proménné dávce, pŕičemž se použije 5 až 10 myší na každou dávku. Zaznamenává se doba prežití a minimálni účinná látka se výpočte srovnáním doby prežití s dobou prežití pokusných zvíŕat, kterým nebyla podána testovaná látka. U kontrolní skupiny pokusných zvíŕat činí doba prežití asi 7 dnu. Minimálni účinná dávka je dávka, pri které se dosáhne dvojnásobné doby pŕežiti oproti dobe prežití kontrolní skupiny pokusných zvíŕat. Cyklosporiny skupin 4 a 6 jsou pri tomto testu účinné pri dávkách 10 až 100 mg/kg/den.

Príklad 7

Účinek na experimentálni alergickou encefalomyelitidu (EAE) u krýs

1) Účinek na stabilizovanou EAE

Ve skupinách 8 až 12 jinak zdravých krysích samečku s telesnou hmotností 150 až 200 g se indukuje experimentálni alergická encefalomyelitida technikou, popsanou Borel-em a kol. v Agents and Actions 6, 468 (1976). krysy se prechovávajú za laboratorních podmínek a mají volný prístup k potrave a vodé, kterou mohou konzumovat ad libitum. Rozvoj EAE je pozorován po 10 až 13 dnech, kdy se objevují symptómy ochrnutí, napríklad zadních behu. Testovaná sloučenina se podává pokusným zvíŕatu perorálné v dávce 25 až 50 mg/kg každý den po dobu péti po sobe jdoucích dnu následujícím po pozorovaném rozvoji nemoci. Krysy se denné pozorují za účelem zjišténí chorobných symptómu a počtu zotavených krýs, jakož i doby zotavení. Toto pozorování se provádí potom ješté po dobu dalších 5 až 8 týdnu po propuknutí nemoci za účelem zjišténí prípadného návratu onemocnéní. I v tomto prípadé se zaznamená počet krýs s recidívou onemocnéní a doba, kdy k této redicivé došlo.

Po podávání cyklosporinú skupin 4 a 6 ve výše vymeze77 ných dávkach se dosáhne ve srovnání s kontrolní skupinou pokusných zvíŕat, které bylo podáno pouze placebo (olivový olej), zkrácení doby zotavení pokusných zvíŕat.

2) Účinek pri prevenci výskytu EAE

Tento test se provádí zpúsobem, který je analogický s výše popsaným zpúsobem provádení test 1. V tomto prípade se však testovaná sloučenina podává v dávkách 25 až 50 mg/kg perorálne každý den, pŕičemž se s podávaním testované sloučeniny začíná v den sensibilace (indukce EAE) a pokračuje se v nem po dobu 14 dnu. Krysy se denné pozorují za účelem zjišténí symtomú ochrnutí, pŕičemž se doba propuknutí EAE u jednotlivých postižených pokusných zvíŕat. V pozorování se pokračuje po dobu nékolika mésícú za účelem zjišténí prípadného zpoždéného propuknutí nemoci.

Pri podávání cyklosporinu skupin 4 a 6 ve výše vymezených dávkách se dosáhne ve srovnání s kontrolní skupinou pokusných zvíŕat, které bylo podáváno pouze placebo (olivový olej), zabránéní propuknutí uvedené experimentálni alergické encefalomyelitidy.

Vzhledem k jejich imunosupresivní účinnosti jsou cyklosporiny skupin 4 a 6 indikovány pro použití pri profylaxi a léčení nemocí a stavu vyžadujících snížení imunitní odezvy.

Tyto cyklosporiny mohou být takto použitý pro potlačení proliferace lymfocytu a imunocytu, napríklad pri léčení autoimunitních onemocnéní, nebo pri zabránéní odmítání organismem orgánových transplantátu, jakými jsou napríklad srdeční, srdečne-plicní, kožní, rohovkové, kostné-dŕeňové, slinivkové a ledvinové transplantáty.

S ohledem na jejich protizánétovou účinnost a účinnost vúči EAE jsou cyklosporiny skupin 4 a 6 rovnéž indikovány pro použití pri léčení zánétových stavu, zejména zánétových stavu s etiologií zahrnující autoimunitní složku, napríklad pro léčení artritídy (napríklad revmatoidní artritídy, chronické artritídy progredientní, jakož i deformující artritídy) a reumatických onemocnení, jakož i autoimunitních hematologických porúch (včetne hemolytické anémie, aplastické anémie a idiopathické trombocytopenie) , systemického lupusu erythematodes, polychondritidy, sklerodému, Wegenercvy granulamatosy, dermatomyositidy, chronické aktivní hepatitídy, mvastenie gravis, psoriasy, Steven-Johnsonova syndrómu, idiopathické sprue, autoimunit nich zánétových stŕevních onemocnení (včetne napríklad ulcerativní kolitidy a Crohnovy nemoci), endokrinní oftalmopatie, Graveovy nemoci, sarkoidosy, primárni biliární cyrhosy, primárni juvenilní diabetes (diabetes mellitus typu I), uveitidy (anteriorní i posteriorní), intersticiální plieni fibrosv, psoriatické artritídy, glomerulonefritidy (s a bez nsfrotickáho syndrómu, napríklad včetne idiopathického neurotického syndrómu nebo minimálni modifikované nefrepatie) a roztroušené skierosy.

Vzhledem k jejich antiparazitické účinnosti jsou cyklosporiny skupín 4 a 6 'rovnéž indikovány pr·:· použití pri lúčení parazitických onemocnení, napríklad kokcidiomykosy a senistosomiasy a zejména protozoálníc'n infekcí , zejména malárie.

Pri výše uvedených aplikacích se bude podávaná dávka samozrejmé ménit v závislosti na konkrétním použitém cyklosporinu, zpusobu podání a zejména na typu léčené'no onemocnení a požadované terapii. Obecne se však dosánne uspokojivých výsledkú pri perorálním podání denní dávky asi 1 až 100, výhodne asi 5 až 50, nejvýhodnéji 10 až 20 mg/kg telesné hmotnosti pacienta. Celková denní dávka vhodné činí asi 75 až asi 2000, výhodné asi 200 až asi 1000, nejvýhodnéji asi 300 až asi 700 mg. Dávkové formy vhodné pro perorální podání proto vhodne obsahují asi 20 až asi 2000, výhodné asi 50 až asi 1000, nejvýhodnéji asi 75 až 700 mg cyklosporinu ve smési s pevným nebo kapalným farmaceutickým ŕedidlem nebo nosičem, pŕičemž je uvedené množství účinné látky podáno v jediné denní dávce nebo ve 2 až 4 čílčích denních dávkách.

Jak již bylo uvedeno výše bude uvedená denní dávka mezi jiným záviset i na konkrétním zvoleném cyklosporinu, pŕičemž se bere v úvahu jeho relatívni potence účinku. Pro výhodné cyklosporiny skupín 4 a 6 byly pri sérii experimentu provedených v rámci výše uvedených príkladu 4 získány výsledky /hodnoty ICgg (/ug/ml), které jsou uvedený v následující tabulce:

Cyklosporin	Metoda	testu podie príkladu
	4 . 1	4.2	4.3
4.8	0,1	0,16	0,09
6.4	0,03	menší než 0,0 08 menší než	0,008
6,15	0,057	menší než 0,0 08 menší než	0,008

Výhodným cyklosporinem pro použití pri antiparazických indikacích je cyklosporin 4.7. Pri testu podie príkladu 6 byla pro tento cyklosporin ziskána hodnota = asi 15,0 mg/kg.

Vzhledem k výše uvedenému vynález rovnéž poskytuje:

i

7. farmaceutickou kompozici obsahujúci cyklosporin výše uvedených skupín 4 nebo 6 ve smési s farmaceutický pŕijatelným ŕedidlem nebo nosičem;

8. zpúsob indukce imunosupresivní účinnosti za účelem léčení zánétových onemocnení nebo stavu nebo za účelem léčení parazitických infekcí u pacienta, který takové léčení potrebuje, jehož podstata spočívá v tom, že se uvedenému pacientovi podá účinné množstvi cyklosporinu výše definované skupiny 4 nebo 6, jakož i cyklosporin skupiny 4 a 6 pro použití jako farmaceutické činidlo, napríklad jako imunosupresivní činidlo, jako protizánétové činidlo nebo jako protiparazitické činidlo.

Špecifickými imunosupresivními, protizánétovými a protiparazitickými použitími, pro která jsou indikovány cyklosporiny skupín 4 a 6, jsou libovolná z výše popsaných použití, zahrnující špecifické formy orgánových transplantací, zánétová onemocnení, autoimunitní onemocnení nebo parazitické infekce, jejicbž výčet již byl uveden výše.

Claims (3)

1. Cyklosporiny

i) obecného vzorce II

-A-8-X-MeLeu-Y-MeLeu-Ala-(D)Ala-Me Leu-MeLeu-HeVal- (II) ve kterém

A znamená -3 -0-acetyl-Me3mtB znamená -alfaAbu-, -Thr-, -Val- nebo -Nva-, a

když B znamená -alfaAbu-, X znamená -(D)Ala- a Y znamená -Val-, když B znamená -Thr- nebo -Val-, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-, nebo když B znamená -Nva-, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-, nebo X znamená -(D)Ala- a Y znamená -Val·-, nebo

ve kterém

A znamená -3 O-acetyl-dihydro-MeBmt- nebo -cis-MeBmt-,

B znamená -alfaAbu, X znamená -Sar- a Y znamená -Val-, nebo ii) obecného vzorce II

-Α-Β-Χ-HeLeu-Y-HeLeu-Ala-V-MeLeu-MeVal-, (Iľ ) i

L_____ __ ve kterém

A znamená -3'-O-acyl-MeBmt- nebo -3 '-O-acyl-dihydro-MeBmtzbytek,

B znamená -alfaAbu-, -Thr-, -Val-, -Nva- nebo beta-O-acylalf a-aminokyselinový zbytek,

X znamená -Sar- nebo opticky aktivní alfa-N-methylovaný alfa-aminokyselinový zbytek mající konfiguraci (D),

Y znamená beta-hydroxy- nebo beta-O-acyl-alfa-aminokyselinový zbytek mající konfiguraci (D), nebo iii) ve kterém zbytek v poloze 1 je -8 -C-Cg-alkoxy-cisMe3mt- nebo -dihydro-MeBmt- nebo -3 -O-acyl-8 -C^-Cgalkoxy-cis-MeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-zbytkem, -3 -O-acylcis-MeBmt-zbytkem, -7 -desmethyl-7 -hydroxykarbvl- -Me3mtnebo -cis-MeBmt- nebo -3 '-0-acyl-7 -desmethyl-7 -hydrokarbyl- -MeBmt- nebo -cis-MeBmt-zbytkem, ve kterém hydrokarbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atómy, nebo -7-desmethyl-7'-’nydrokarbyl-dihydro-MeBmt- nebo

-3 '-0-acetyl-7 '-desmethyl-7’-hydrokarbyl-dihydro-MeBmtzbytkem, ve kterém hydrokarbylový zbytek obsahuje alespoň dva uhlíkové atómy a ve kterém každá alifatická skupina, která je obsažena v uvedeném hydrokarbylovém zbytku nebo která tento zbytek tvorí, je nasycenou skupinou, nebo iv) ve kterém 3 -uhlíkový atóm zbytku v poloze 1 je .oxo-,

C-C^-alkoxyimino-, azidoalkylkarbonyloxy- nebo alkoxykarbonyloxy-substituován, nebo ve kterém beta-uhlíkový atóm zbytku v poloze 2 je beta-oxo-substituován, nebo znamená (L)-isoleucylový zbytek, nebo

v) obecného vzorce XI r-A-B-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-Z-i (XI) ve kterém vi) vi)

2.

1 je

2.

1 je znamená -N-desmethyl-dihydro-MeBmt-, B znamená -Thr- a Z znamená -MeVal-, nebo znamená -dihydro-MeBmt-, B znamená -Thr- a Z znamená -Val-, nebo znamená -MeLeu-, B znamená -alfaAbu- a Z znamená -Val·-, nebo který znamená diester dikarboxylové kyseliny cyklosporinú majícího beta-hydroxy-(L)-alfa-aminokyselinový zbytek v poloze 2 .

Cyklosporín podie nároku 1, ve kterém zbytek v poloze zbytkem obecného vzorce XXI

-N-CH-C0(S)

ČHj (xxi) ve kterém

R znamená -x - y -R , kde a _z c

-x-y- znamená -CH=CH- nebo a R^ znamená

C2^-Cg-alkoxymethylovou skupinu nebo -x -y - znamená cis nebo trans -CH=CH- nebo -CH_-CH₀- a R znamená 2 2 c hydrokarbylovou skupinu mající alespoň dva uhlíkové atómy, pŕičemž znamená-li -x -y - skupinu -Cb^-C^^-, potom je každá alifatická skupina obsažená v R_c nebo tvoŕící R_c nasycenou skupinou, a znamená atóm vodíku nebo acylovou skupinu.

3.

1 je

Cyklosporin podie nároku 1, ve kterém zbytek v poloze 3 -desoxy-3 -oxo-MeBmt-zbytkem, -3 -desoxy-3 -(C^-C^alkoxyimino)-MeBmt-zbytkem, -3 -0-( C -C^-azidoalkyl)-kar'oonylMeBmt- nebo -dihydro-MeBmt-zbytkem nebo -3 -0-(C-C_Λ-alkoxy)karbonyl- -Me3mt- nebo -dihydro-MeBmt-zbytkem, nebo ve kterém zbytek v poloze 2 je -alfa-methylketo-Glý- nebo -íle-zbytkem.