CZ424297A3 - Makrolidy, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se týká nové třídy makrolidů, které máji cennou farmaceutickou a příbuznou aktivitu. Pro výhodné sloučeniny této nové třídy makrolidů se v předkládaném vynálezu používá společný název „Sanglifehriny.

Dosavadní stav techniky

První ze Sanglifehrinů byl izolován z živného bujónu aktinomycetového kvašení. Toto jsou obecné vzorce Sanglifehrinů A až D

OH

Jak může být zcela novou pozicích 1 karboxylové aromatické α-aminokyseliny, a zřejmé, makrocyklický kruh Sanglifehrinů A až D má strukturu, která je charakterizovaná tím, že i) v až 6 je umístěn kyseliny, ii) v zbytek 3-karboxypiperidazynylpozicích 7 až 9 je zbytek iii) v pozicích 10 až 12 je zbytek alifatické ct-aminokyseliny. Zbytek makrocyklického kruhu se skládá ze zbytku hydroxykarboxylové kyseliny, s podmínkou, že v případě Sanglifehrinů A až D je v základním makrocyklickém kruhu dalších 11 atomů uhlíku.

V souladu s běžným postupem v chemii makrolidů se atomy základního makrocyklického kruhu Sanglifehrinů číslují tak, jak je naznačeno výše pro Sanglifehrin A, přičemž se začíná od • ·

	• 9 9 3 : ··: · 9 9 9 9 9	• 9 · 9 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 99 999 99
atomu uhlíku karbonylové spojky, který má polohu 1.	skupiny makrocyklické	laktonové
Sanglifehriny A až D jsou	také charakterizovány	přítomností

nového bicyklického spirosystému připojeného v poloze 23 makrocyklického kruhu přes uhlovodíkovou spojovací skupinu.

Sanglifehriny A až D mohou být podrobeny značné chemické modifikaci za vzniku dalších makrolidů třídy Sanglifehrinu. Mezi tyto modifikace patří rozštěpení makrocyklického kruhu, především v laktonové oxyskupině, rozštěpení spojovací skupiny mezi makrolidem a spirocyklickým systémem, a obměny, například chránění, derivatizace nebo další chemické úpravy substitučních skupin; například, jak je popsáno níže. Další způsoby zpracování budou odborníkům v této oblasti zřejmé.

V souladu s předkládaným vynálezem bylo zjištěno, že Sanglifehriny, zvláště ty, které obsahují spirocyklický systém, jako je případ Sanglifehrinů A až D, mají charakteristické a zcela nové vlastnosti ve smyslu jejich biologické aktivity. Především bylo zjištěno, že vykazují následující kombinaci účinků:

- vazebná aktivita k cyklofilinu;

- imunosupresivní aktivita;

- inhibice bujení jak buněk B, tak buněk T;

- nemají však vazebnou aktivitu k FK vazebnému proteinu nebo inhibiční aktivitu na kalcineurin.

Sanglifehriny jsou také zajímavou a novou třídou imunosupresivních a protizánětlivých sloučenin. Především, Sanglifehriny mají aktivitní vlastnosti, které se liší od dříve známých imunosupresivních a protizánětlivých sloučenin, jako jsou cyklosporiny a makrolidy, například rampamycin a třída FK 506, což naznačuje, že Sanglifehriny působí jiným způsobem než předchozí sloučeniny. Tedy, Sanglifehriny jsou novou ·· «· · ·· ·· ·· · * · ··· · · · · • · · ·· · ···· • ····· · · · · · · · · • · · · · · · ·

999 99 99 999 99 kategorií léčebných látek jak ve smyslu struktury, tak ve smyslu aktivity, které mohou být vodítkem k očekávání imunosupresivních a/nebo protizánětlivých léčebných schopností; například zabránění nebo snížení nežádoucích vedlejších účinků při předchozích imunosupresivních a protizánětlivých léčbách a/nebo zlepšení nebo rozšíření této terapie na nové skupiny onemocnění nebo na nové kategorie pacientů.

Sanglifehriny, například ve kterých je makrolidový kruh v otevřené formě, ve které jsou obě polohy 26 a 27 v uhlovodíkové spojovací skupině mezi makrolidem a spirocyklickým systémem hydroxylovány, nebo ve kterých byl spiro zbytek připojený k makrocyklickému kruhu rozštěpen nebo oddělen, obecně postrádají některou nebo všechny aktivity charakteristické pro Sanglifehriny. Například, Sanglifehriny, ve kterých je spiro zbytek rozštěpen, typicky mají aktivitu na vazbu cyklofilinu, ale nemají významnou imunosupresivní aktivitu. Jak bude odborníkům v této oblasti však zřejmé, tyto sloučeniny poskytují cenné složky, meziprodukty nebo klíčové stavební bloky pro přípravu dalších nových Sanglifehrinů, a proto dále zvyšují léčebný potenciál třídy Sanglifehrinů.

Protože se bicyklický spiro systém také ukázal jako biologicky aktivní, například u Sanglifehrinů A až D, může být považován za systém poskytující strukturní složku s klíčovým biologickým významem, která je užitečná jako strukturní složka pro další derivatizaci nebo modifikaci, jak ve smyslu přípravy dalších Sanglifehrinů, tak pro použití při obměnách nebo modifikaci dalších léků; například pro modifikaci aktivity jiných imunosupresivních léčebných látek ze třídy makrolidů.

Jak bylo naznačeno, Sanglifehriny představují novou třídu makrolidových sloučenin, které jsou úplně nové a mají zcela charakteristickou strukturu.

Proto první aspekt předkládaného vynálezu poskytuje:

makrolid, ve kterém « · • · c · · · · · ···· c, · ··« · * · · · ··· · ·

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9

i) je v polohách 2 až 6 makrocyklického kruhu připojen zbytek piperidazinylkarboxylové kyseliny; a/nebo ii) je v polohách 7 až 9 makrocyklického kruhu připojen zbytek aromatické a-aminokyseliny; a/nebo iii) je v polohách 10 až 12 makrocyklického kruhu připojen zbytek alifatické ct-aminokyseliny, ve volné nebo chráněné formě, nebo jejich soli.

Vhodné makrolidy podle předkládaného vynálezu obsahují dva, s výhodou všechny tři charakteristické strukturní rysy i), ii) a iii) .

Zbytek piperidazinylkarboxylové kyseliny je vhodný 1,2-piperidazin-3-karboxy-l-yl zbytek, který obsahuje karboxylovou skupinu v poloze 1, a atom dusíku 1 v poloze 6 makrocyklického kruhu, například zbytek obecného vzorce I

kde vyznačená čísla představují polohy atomů zbytku na makrocyklickém kruhu. Tento zbytek může mít kruh substituovaný nebo nesubstituovaný. Vhodný je nesubstituovaný.

ct-aminoskupina aromatické a-aminokyselinového zbytku s výhodou obsazuje polohu 9 makrocyklického kruhu. Vhodnou aromatickou a-aminokyselinou je fenylalaninový, zvláště 3-hydroxy-fenylalaninový zbytek ve volné nebo chráněné formě.

ct-aminoskupina alifatického α-aminokyselinového zbytku s výhodou obsazuje polohu 12 makrocyklického kruhu. Vhodnou alifatickou ct-aminokyselinou je valinový zbytek ve volné nebo chráněné formě.

Zbytek makrocyklického kruhu vhodně obsahuje zbytky hydroxykarboxylových kyselin, oxyskupiny, ze kterých se skládají makrocyklické laktonové spojovací skupiny a karbonylové skupiny, které tvoří amidovou spojovací skupinu s α-aminoskupinou v poloze 12 makrocyklického kruhu. Uvedené zbytky hydroxykarboxylových kyselin mají délku řetězce 6 až 20 atomů uhlíku, vhodněji 11 atomů uhlíku. Řetězec může být substituovaný nebo nesubstituovaný a/nebo obsahovat jednu nebo více nenasycených spojovacích skupin, zvláště kumulovaných dvojných vazeb podél řetězce. Vhodněji zbylý makrocyklický kruh obsahuje 11-oxyendekanoyl-ll-ylový zbytek, s výhodou 11-oxy6,8-endekadienoyl-ll-ylový zbytek, který je vhodně substituovaný, například v polohách 2, 3, 4 a/nebo 5. Vhodněji je uvedený zbytek hydroxykarboxylové kyseliny zbytek obecného vzorce II.

CH* i

•CH£“CH= ^:CH‘ ?3 O I •CH=CH—CH-C CH*

CH, ch₂>₃ •CH—COII kde

Ri a R₂ jsou oba atom vodíku nebo představují zvláštní vazbu; R₃ je atom vodíku;

R₄ je skupina -CO-CH₃ nebo skupina -CH(OH)-CH₃ nebo

R₃ a R₄ společně představují strukturu obecného vzorce III ψΗ₃ ^—IH och₃ ve volné nebo chráněné formě, nebo ve formě jejich solí.

Výhodné makrolidy v souladu s předkládaným vynálezem obsahují makrocyklický kruh obecného vzorce IV

IV kde skupiny X, Y a Z jsou zbytky i), ii) a iii), které jsou definované výše a skupina A je zbytek hydroxykaroxylové kyseliny, který je definován výše ve volné nebo chráněné formě nebo ve formě jejich soli; zvláště vhodný je makrocyklický kruh obecného vzorce V

ve volné formě nebo ve formě soli.

Obecně v Sanglifehrinech, jako jsou Sanglifehriny A až D, je makrocyklický kruh substituován na atomu uhlíku, který je přilehlý oxyskupině laktonového mostu. Tento substituent se typicky skládá z 2-oxy-2'-aza-3'-oxospirobicyklohexan-3-yl zbytku, například obecného vzorce VI

kde ·· • · · · · • · ·

9« <· * · · · · · · • · · «

-a-b- je skupina -(Me)C=CH- nebo skupina -(Me)CH-CH(OHf- *a*

R₅ je H nebo Me (kde Me a Et je methyl a ethyl) ve volné nebo chráněné formě, nebo jejich soli, připojené k makrolidovému kruhu přes spojku obsahující lineární sekvenci o 6 až 11, typicky o 9, atomech uhlíku mezi spiro zbytkem a makrolidovým kruhem.

Spojovací skupina může být substituovaná nebo nesubstituovaná a/nebo obsahovat jednu nebo více nenasycených vazeb zvláště kumulovaných dvojných vazeb po celé délce. Vhodně může být spojovací skupina substituována methylovou skupinou, například dvěma methylovými skupinami. Vhodně může být spojovací skupina dále substituována hydroxylovou skupinou, hydroxylovými substituenty a/nebo může nenasycená, například obsahovat dvě dvojné vazby uhlík-uhlík. Vhodněji spojovací skupina obsahuje zbytky 1-methyl7-methylnonanoyl-9-ylu, zvláště l-methyl-7-methylnonenoyl-9-ylu nebo l-methyl-7-methyl-l,3-nonadienoyl-9-ylu, které jsou případně substituovány, například v polohách 3,

S výhodou má spojovací skupina obecný vzorec VII například třemi být ethylenicky a/nebo

VII

Γ³ c~CH“CH(OH) — CH (CH₃)-(CH₂) ₂-CH—CH—CH= C~ d kde c je vazba na spiro zbytek;

d představuje vazbu k makrocyklickému kruhu a

R₆ a R₇ jsou oba hydroxylové skupiny nebo společně představují další vazbu, ve volné nebo chráněné formě.

Spojovací skupina bude zpravidla připojena k makrocyklickému kruhu na uhlíku, který těsně sousedí s laktonovou oxyskupinou, t.j. když makrocyklický kruh obsahuje zbytek 11-oxyendekanoyl11-yl v poloze 11.

• · · 0 · *» ·· * · ♦ ·* 0 0 0 »000 0 0 0 ··· «· ·· ··· 99 «0

Předkládaný vynález proto poskytuje sloučeniny obecného vzorce VIII

S-L-M vm kde

S představuje spirobicyklo zbytek, jak je definován dříve;

L představuje spojovací skupinu, jak je definována dříve, a M představuje makrocyklický kruh, jak je definován dříve, ve volné nebo chráněné formě, ve formě soli.

Konkrétní sloučeniny podle předkládaného vynálezu mají obecný vzorec IX

48 49

kde

-a-b- je definováno výše;

-e-f je skupina -CH(OH)-CH(OH)- nebo skupina -CH=CH-;

-g-h má stejný význam, jako bylo definováno výše pro skupinu -a-b-, a

R₃, R₄ a R₅ jsou definovány výše, ve volné nebo chráněné formě nebo ve formě soli.

Sloučeniny obecných vzorců I až IX obsahují asymetrické atomy uhlíku a proto mohou existovat v řadě epimerních forem. Všechny možné epimery stejně jako jejich diastereoizomerní směsi jsou zahrnuty v předkládaném vynálezu. Avšak sloučeniny obecných vzorců VIII a IX, ve kterých je makrolidový kruh v uzavřené • fa • fa fa fafa 9 fafafa fafa fa fafafafa fa · fa fa fa fa fa fa * fafafafa fa • fafafafa fafafa fa·· *· fafa fafafa fafa fafa ♦ fa fa formě, a které mají vhodnou stereochemii, mají typickou aktivitu, která je charakteristická pro Sanglifehriny, jak bylo zmíněno výše. Výhodné jsou epimery, které mají aktivitu charakteristickou pro Sagliferiny. Obvykle budou, například pro farmaceutické použití v souladu s předkládaným vynálezem, výhodné epimery, které mají aktivity charakteristické pro Sanglifehriny v čisté nebo značně čisté formě (t.j. prosté nebo téměř prosté epimerů, kterým chybí aktivita charakteristická pro Sanglifehriny), t.j. obsahující nejméně 90 % hmotnostních, například 95 % hmotnostních aktivního epimeru (t.j. obsahující méně než 10 % hmotnostních, například méně než 5 % hmotnostních neaktivního epimeru).

S výhodou má zbytek 3-karboxypiperidazinylkarboxylové kyseliny

i) v polohách 1 až 6 makrocyklického kruhu následující konformaci:

i

S výhodou má aromatická aminokyselina ii) v polohách 7 až 9 makrocyklického kruhu L konfiguraci, například má konfiguraci

S výhodou má alifatická aminokyselina iii) v polohách 10 až 12 makrocyklického kruhu L konfiguraci, například má konfiguraci

44 4« 4 «44 4 4 4 « «

4 4 4 4 4

44444 4 4

4 4 4 Β

4 4 44 4 4 »··

44

4 4 *

4 44

4 4 4 4

4 4

4 4 4

T 12

Pokud zbytek makrocyklického kruhu obsahuje zbytek obecného vzorce II, má s výhodou konfiguraci

nebo

i ^R3

Pokud R₃ a R₄ společně představují <?^H3 och₃ s výhodou mají konfiguraci

Zbytek 2-oxy-2'-azy-3'-oxospirobicyklohexan-3-ylu má konfiguraci

Me

Et kde, pokud -a-b je skupina obecného vzorce - (Me)CH-CH(OH)-, s výhodou má konfiguraci

Když má spojovací skupina obecný vzorec VII, má tato skupina s výhodou konfiguraci
	ch3 R. ch3
c
	OH R6
Když R6 a R? jsou	oba hydroxylová skupina,	konfigurace
v polohách 26 a 27 je	s výhodou buď 26(S), 27 (S)	nebo 2 6(R),
27 (R) . Když R6 a R7	společně představují další	vazbu, je
konfigurace v polohách	26 a 27 s výhodou

H

H

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu obecného vzorce IX mají s výhodou následující konformaci • 0

00 0 0 » 0

0 00

000 0 0

0 0 «0 00

0 » 0 0

000 0 0

kde, když -a-b- je skupina obecného vzorce -(Me)CH-CH(OH)-, má tato skupina s výhodou konfiguraci:

když -e-f- je skupina obecného vzorce -CH(OH)-CH(OH)-, má tato skupina s výhodou konfiguraci (S), (S) nebo (R), (R);

když -g-h- je skupina obecného vzorce -(Me)CH-CH(OH)-, má tato skupina s výhodou konfiguraci:

CH, když -g-h- je skupina obecného vzorce -(Me)C=CH-, má tato skupina s výhodou konfiguraci:

ch₃ a když R₃ a R₄ jsou spojené, mají s výhodou konfiguraci

44 «4 * 44 44

4 4 #· «4 4444

444 44 4 44 44 • 444 · 4 4 4 4 4444 4

4444 444

444 44 44 »44 44 44

CH, och₃

Sanglifehriny A až C mají s výhodou následující konfigurace

ΦΦΦ 99 ·

ΦΦ ΦΦ * Φ Φ Φ • Φ ΦΦ

ΦΦΦΦ Φ

Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦ

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být ve volné nebo chráněné formě, například v chráněných formách, které jsou popsány v „Protective Groups in Organic Synthesys, T. W. Greene a P. G. M. Wuts, druhé vydání, 1991, vyd. John Wiley & synové, New York. Především hydroxylové skupiny mohou být v chráněné formě, například ve formě silyletherů (jak je popsáno například na stranách 68-86 Greene a Wuts, tamtéž), esterů (viz. například strany 87-103 Greene a Wuts, tamtéž), a karbonátů (viz. například strany 104-111) Greene a Wuts, tamtéž). Mezi takové chráněné formy patří také vnitřně chráněné formy; například v případě makrolidu obecného vzorce IX, kde -g-h- je skupina obecného vzorce -CH (CH₃)-CH(OH)-, v chráněné *9

9 • 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9

999 999 9

9 9 9 9

999 99 99 999

9 9 9 · 99

999 9 9

9 9 • 9 99 formě polohy 14 až obecného vzorce X:

makrocyklického kruhu obsahují zbytek

CH,

Také například 1,3-dioly přítomné v Sanglifehrinech mohou být chráněny jako vhodné cyklické struktury, například jak je popsáno na stranách 118-142, Greene a Wuts, výše.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu také existují ve formě solí. Příklady vhodných farmaceuticky přijatelných solí pro použití v souladu s předkládaným vynálezem zahrnují kyselé a zásadité doplňkové soli, které mají vhodný vztah k jednotlivým substituentům přítomným ve sloučenině.

Jak bylo uvedeno dříve, makrocyklický kruh sloučenin podle předkládaného vynálezu může být rozštěpen, zvláště v laktonové oxy skupině, za vzniku sloučenin, kde makrocyklický kruh je v otevřené formě. Obvykle se štěpení laktonové oxyskupiny provádí pomocí hydrolýzy (solvolýzy), například za vzniku sloučenin obecného vzorce XI:

• 9 4 4« 44

4 4 4 4 «4 4 44 4

444 44 4 44 44

444 44 4 4 4 444 4 4

4444 444

444 44 44 44« 44 44

XI , R₆-X-Y-Z-A-OH například obecného vzorce XII

R,0 6 *

XII o

N CO-CH-NH—CO—CH—NH—ΑΠΟ

-OH

CH, CH, například sloučeniny obecného vzorce IX'

kde X, Y, Z, A, R₃, R₄ a R₅ jsou definovány výše a R₆ je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, například methylová skupina.

Tyto formy s otevřeným kruhem poskytují meziprodukty určené pro modifikaci základního makrocyklického kruhu Sanglifehrinu a jsou také součástí předkládaného vynálezu.

Proto další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje:

- makrolid, který byl definován výše, ve formě otevřeného kruhu, uvedený makrocyklus s otevřeným kruhem je ve volné nebo chráněné formě, nebo ve formě soli;

··· 0 · • · · 0 · · 0

0 0 0 00

0 · · · 0 0 0

0 0 0 0 0 0

000 00 00 000 00 00

- sloučeninu obecného vzorce R₆O-X-Y-Z-A-OH, jak byla definována výše, ve volné nebo chráněné formě, nebo ve formě soli;

- sloučeninu obecného vzorce R₆O-X-Y-Z-A'-CH (OH)-L-S, kde skupina obecného vzorce -A'-CH(OH)- je zbytek hydroxykarboxylové kyseliny, například zbytek obecného vzorce II, jak byl definován výše, a další symboly jsou stejné, jak byly definovány výše, ve volné nebo chráněné formě, nebo ve formě soli;

- sloučeninu obecného vzorce XII'

R,0 b *

NH

N-CO-CH-NH—CO—CH—NH~A'

HO

CH, —CH-L-S i

OH

CH,

CH, ve volné nebo chráněné formě, nebo ve formě soli;

- sloučeninu obecného vzorce IX”

ve volné nebo chráněné formě, nebo ve formě soli.

• ·· « e· «· ·· · · «··· · · · · • · · · · · · · ·· • ··· · · · · · ···· · • · · · · ··· *·· ·« ·· ··· ·« ·· Předkládaný vynález také zahrnuje sloučeniny, ve kterých 2-oxy2'-aza-3'-oxo-3'-ylspirobicyklohexanový cyklický systém je ve formě otevřeného kruhu, například sloučenina obecného vzorce XII

kde a, b, L a M jsou definovány výše, ve volné nebo chráněné formě, nebo ve formě soli.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu s otevřeným kruhem mají s výhodou stejnou konformaci jako je konformace výhodných sloučenin s uzavřeným kruhem. Spirobicyklický kruhový systém s otevřeným kruhem sloučenin obecného vzorce XII má s výhodou konformaci:

Me

kde, když -a-b- je skupina obecného vzorce -(Me)CH-CH(OH)-, má tato skupina s výhodou konfiguraci:

• 4 4 ·· 44 • 4 44 4 4 4 4

HO

CH

Makrolidy v souladu s předkládaným vynálezem , které mají spirobicyklo zbytek připojený k makrocyklickému kruhu, mohou také reagovat za štěpení spojovací skupiny, například, pokud jde o sloučeninu obecného vzorce IX, hlavně na vazbě mezi zbytky 26 a 27 za vzniku samostatných nových spirobicyklických sloučenin a dalších makrolidů. Jak bylo také naznačeno dříve, tyto sloučeniny jsou také využitelné jako meziprodukty, spirobicyklické části Sanglifehrinů mají hlavně integrální funkční úlohu při biologické aktivitě Sanglifehrinů jako třídy.

Proto předkládaný vynález poskytuje:

2-oxy-2'-aza-3'-oxo-3'-ylspirobicyklohexan, ve volné nebo chráněné formě, nebo ve formě soli, zejména sloučeninu obecného vzorce VI'

Me

kde skupina R-< je případně chráněná hydroxylová skupina, reaktivní funkční skupina, nebo skupina obecného vzorce -CH₂CH(OH)-CH(CH₃)-CH₂-CH₂-CHO skupina, nebo její delta laktolový ekvivalent, ve volné nebo chráněné formě nebo ve formě soli.

Výhodně má sloučenina obecného vzorce VI' následující konfiguraci • 44 44

4 4 4 4

4 4 44

4 444 4 4

4 4 4

444 44 44 • 44

4 4 • · 4 • ··· • ·

444 44 • 4 • · « 4

4

Me

Me

í kde, pokud -a-b- je skupina obecného vzorce -(Me)CH-CH(OH)má * tato skupina s výhodou konfiguraci:

Předkládaný vynález dále zahrnuje otevřený kruh 2-oxy-2'-aza-3'~ oxo-3'-ylspirobicyklohexanu, ve volné nebo chráněné formě, nebo ve formě soli, zvláště sloučeninu obecného vzorce XII'

kde a, b a R₇ jsou definovány výše, ve volné nebo chráněné formě, nebo ve formě soli. Spirobicyklický kruhový systém s otevřeným kruhem sloučenin obecného vzorce XII' má s výhodou konformaci:

• ·· ·· ·· · · · » • · · · · • fa·· fa · · • · · · ··· ·· ·· • ·· ·· ·· · · · · • · · ·· • · fa·· · · • · · · ··· ·· ··

kde, pokud -a-b- je skupina obecného vzorce -(Me)CH-CH(OH)-, má tato skupina s výhodou konfiguraci:

Předkládaný vynález dále poskytuje makrolid obecného vzorce XIII

CH.

XIII .CO kde M je makrolidový kruh definovaný výše, zejména obecného vzorce XIV

XIV

HO

Me ♦ ·· ·· · ·· ·· • · · · · · · · · ·· · • · · · · · ··· · · • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ·· který má s výhodou konformaci

kde, pokud -g-h- je skupina obecného vzorce -(Me)CH-CH(OH)má tato skupina s výhodou konfiguraci:

a když -g-h- je skupina obecného vzorce -(Me)C=CH-, má tato skupina s výhodou konfiguraci:

ch₃ a když R₃ a R₄ jsou spojené dohromady, mají s výhodou konfiguraci

CH och₃ ve volné nebo chráněné formě otevřeného kruhu, nebo ve formě soli.

Další aspekt předkládaného vynálezu obsahuje makrolidy a sloučeniny podle předkládaného vynálezu, zvláště sloučeniny, • 99 99 ·♦ · 9 9 · ·· · ·· ·

Ο Λ ♦ ···♦· · · 9 9

Z 4 9 999 · 9 · 9 9 9·9· 9 • 999« 999 • 99 99 ·· ··· «· které jsou přírodními produkty v látkově čisté formě, například obsahují nejméně 90 % hmotnostních, s výhodou nejméně 95 % hmotnostních, zejména nejméně 98 % hmotnostních čisté formy.

Kromě předešlého, předkládaný vynález také poskytuje postup pro přípravu všech sloučenin podle předkládaného vynálezu, jak byly definovány dříve, který zahrnuje:

i) pro přípravu Sanglifehrinů A, B, C a D, kultivaci kmene aktinomycet produkujícího Sanglifehrin A, B, C nebo D v kultivačním prostředí a izolaci požadovaného Sanglifehrinů A, B, C nebo D ze získaného roztoku kultury;

ii) pro přípravu Sanglifehrinů C a D cyklizaci Sanglifehrinů A a B v polohách 15 a 16;

iii) pro přípravu Sanglifehrinů A a B otevření laktolového kruhu Sanglifehrinů C a D v polohách 15 a 16;

iv) pro přípravu makrolidů obecného vzorce IX nebo IX', kde -g-h- je skupina C(CH₃)=CH-, dehydrataci sloučeniny obecného vzorce IX nebo IX', kde -g-h- je C (CH₃)-CH (OH)nebo jeho chráněné formy;

v) pro přípravu makrolidů obecného vzorce IX nebo IX', kde

R₄ je CH(OH)-CH₃, hydrogenaci sloučeniny obecného vzorce IX nebo IX', kde R₄ je C(O)-CH₃;

vi) pro přípravu makrolidů obecného vzorce IX nebo IX', kde polohy 14 až 16 makrolidového kruhu obsahují zbytek obecného vzorce X • · • · ·· ·«· «ο ««

CH, ch₂)₂ x« — CH-CH” CH—CH'

14

CH, reakci sloučeniny obecného vzorce IX nebo IX' pro vnitřní chránění;

vii) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', reakci sloučeniny obecného vzorce IX nebo IX', kde polohy 14 až 16 makrolidového kruhu obsahují zbytek obecného vzorce X,

CH,

CH,)

2'2

-CH—CH—CH—CH17 I 15 14

CH, pro odstranění vnitřní chránící skupiny;

viii) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', kde R₅ je methyl, methylaci makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', kde R₅ je atom vodíku;

ix) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', ve kterém je R₄ v O-chráněné formě, reakci makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', ve kterém je R₅ v O-nechráněné formě, pro zavedení O-chránící skupiny;

··· · · ·

* ·· 1

x) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', ve kterém je R₄ v O-nechráněné formě, reakci makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', ve kterém je R₅ v O-chráněné formě, pro odstranění O-chránící skupiny;

xi) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', který obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-chráněný hydroxyfenylalaninový zbytek, reakci makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', který obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-nechráněný hydroxyfenylalaninový zbytek, pro zavedení O-chránící skupiny;

xii) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', který obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-nechráněný hydroxyfenylalaninový zbytek, reakci makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', který obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-chráněný hydroxyfenylalaninový zbytek, pro odstranění O-chránící skupiny;

xiii) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', ve kterém -e-f- je skupina CH(OH)-CH(OH)oxidativní hydrolýzu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', ve kterém -e-f- je skupina -CH=CH-;

xiv) pro přípravu sloučeniny obecného vzorce V' nebo sloučeniny obecného vzorce XII, reakci sloučeniny obecného vzorce IX nebo IX' pro rozštěpení spojovací skupiny mezi spirobicyklo-skupinou a makrocyklickým kruhem;

xv) pro přípravu sloučeniny obecného vzorce R₆O-X-Y-Z-A-OH nebo obecného vzorce R_SO-X-Y-Z-A'-CH (OH)-L-S, otevření kruhu laktonového mostu makrocyklu obecného vzorce IV • A A·

AAA · A A AAA •©· «· AA A

AAAA A

A A · ·· « A nebo makrocyklického kruhu sloučeniny obecného vzorce VIII;

xvi) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo XII ve formě uzavřeného kruhu, reakci sloučeniny obecného vzorce R₆O-X-Y-Z-A-OH nebo obecného vzorce R₆O-X-Y-Z-A'-CH (OH)-L-S pro uzavření makrocyklického kruhu;

xvii) pro přípravu sloučeniny obecného vzorce XII nebo XII', reakci sloučeniny obecného vzorce IX nebo VI' pro otevření kruhu uvnitř spiro-bicyklického kruhového systému; a xix) pro přípravu sloučeniny obecného vzorce IX nebo VI', reakci sloučeniny obecného vzorce XII nebo XII' pro uzavření kruhu uvnitř spirobicyklického kruhového systému.

Postupy podle předkládaného vynálezu mohou být provedeny, například jak je popsáno v příkladech. Jak bude oceněno, postupy definované výše mohou být aplikovány v jakémkoli vhodném pořadí nebo kombinaci za získání jiných makrolidů ve volné formě, chráněné formě, ve formě s otevřeným kruhem a ve formě s uzavřeným kruhem, jak bylo popsáno dříve.

Makrolidy podle předkládaného vynálezu, například Sanglifehriny A až D, jsou, nebo jsou odvozené, od přírodních sloučenin, které se typicky získají z různých členů skupiny

Streptomycetaceae.

Mikroorganismy schopné produkovat makrolidy, jak je definováno výše, nebyly dříve identifikovány.

Proto ještě další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje:

- kmen aktinomycet produkující makrolidy, kde makrolidem je makrolid, ve kterém • · · · · · ·· • · · · · · · · · ··· « · · · · ··· · · • * 0' · · · · • · · · · · · £ · · f. 9 « ·

i) je v polohách 2 až 6 makrocyklického kruhu připojen zbytek piperidazinylkarboxylové kyseliny; a/nebo ii) je v polohách 7 až 9 makrocyklického kruhu připojen zbytek aromatické α-aminokyseliny; a/nebo iii) je v polohách 10 až 12 makrocyklického kruhu připojen zbytek alifatické a-aminokyseliny,

- kmen aktinomycet produkující Sanglifehrin A, B, C nebo D.

Vhodně je kmen aktinomycet členem skupiny Streptomycetaceae, vhodněji patří do rodu Streptomyces, zejména do kmene Streptomyces sp. A92308110, jak je popsáno níže, nebo je od nich odvozen, například včetně mutantů, variant, fusantů, kombinací nebo jejich modifikovaných forem.

Vhodně jsou kmeny podle předkládaného vynálezu biologicky čistě oddělené.

Například Streptomyces sp. A92308110 může být mutován nebo modifikován na jiné formy pomocí běžných technik, například pomocí UV záření nebo zpracováním pomocí chemického mutagenu jako je N-methyl-N'-nitronitrosoguanidin. Rekombinované klony mohou být získány pomocí protoplastové fůze. Všichni takoví mutanti a rekombinanti nebo modifikované formy, kteří jsou schopni produkovat Sanglifehriny, včetně mutantů a rekombinantů schopných produkovat zvýšené množství Sanglifehrinů, jsou součástí předkládaného vynálezu.

V konkrétním provedení podle předkládaného vynálezu se

Sanglifehriny A, B, C a D izolují z nové Streptomyces sp. A92308110. Vzorky Streptomyces sp. A92-308110 byly uloženy v Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Německo, 3. 5. 1995 podle Budapešťské smlouvy a byly označeny depozitním číslem DSM 9954. Vzorky Streptomyces sp. A92-308110 mohou být také získány od Sandoz Ltd. CH-4002 Basel, Switzerland.

·· « · • · • · · ·

Jako poznámku zde uvádíme, že přístup ke vzorkům DSM 9985 je omezen v souladu s opatřeními Článku 28 (4) a (5) EPC.

Izolace Sanglifehrinů A, B, C a D z kultur Streptomyces sp. A92-308110 je popsána v Příkladu 2.

Kmen Streptomyces sp. A92-308110 patří do rodu Streptomyces v souladu s popisem v Bergey's Manual (Díl 4, Williams a Wilkins, Baltimore) a The Prokaryotes (1992 Springer Verlag, New York). Buněčné stěny obsahují kyselinu LL-diaminopimelovou Mastné kyseliny jsou iso- a anteiso- rozvětvené, přímé a nenasycené. Spektrum cukru není zřetelné. Růstové podhoubí se nedrtí na kousky. Vzdušné podhoubí tvoří dlouhé řetězce výtrusů.

V souladu s odkazy na knihy, které jsou citovány výše, kmen označený A92-308110 je nový Streptomyces. A92-308110 roste v různých organických a anorganických prostředích a ve většině případů tvoří vzdušné podhoubí. Primární substrát podhoubí roste jako hyfa a obyčejně bývá šedohnědý. Barva vzdušného podhoubí patří do šedé série, číslo 4, a toto podhoubí tvoří dlouhé řetězce výtrusů, které patří do typu spira b.

Schopnost Streptomyces sp. A92-308110 růst v použitelných biologických prostředích, jejich využití odbourávání uhlíku, a jejich fyziologické charakteristiky jsou uvedeny v následujících tabulkách.

Tabulka 1. Růst v různých biologických prostředích

Kultivační prostředí Charakteristika kultury

Kvasničný extrakt/ sladový agar

Ovesný agar

Glukosa-asparagin růst: dobrý substrátové podhoubí: nahnědlý vzdušné podhoubí: šedohnědé rozpustné barvivo: žádné růst: dobrý substrátové podhoubí: tmavě hnědý vzdušné podhoubí: šedohnědé rozpustné barvivo: nahnědlé růst: průměrný substrátové podhoubí: šedý • · · · » · · <··· · ♦ · · « «» • ♦« · ·’· · ·· • * · ♦ · · 9 9 9

9 9 9 9 9

999 99 99 vzdušné podhoubí: šedohnědé rozpustné barvivo: žádné

Anorganické soli/ škrobový agar růst: průměrný substrátové podhoubí: šedý vzdušné podhoubí: šedohnědé rozpustné barvivo: žádné

Sacharosa/ dusičnanový agar růst: velmi špatný substrátové podhoubí: bělavý vzdušné podhoubí: špatné, šedohnědé rozpustné barvivo: žádné

Glycerol/ asparaginový agar růst: průměrný substrátové podhoubí: šedý vzdušné podhoubí: šedohnědé rozpustné barvivo: žádné

Živný agar růst: průměrný substrátové podhoubí: béžový vzdušné podhoubí: žádné rozpustné barvivo: hnědé

Tabulka 2: Využití uhlíku

Střední nebo dobré: glukosa, fruktosa, arabinosa, xylosa, manosa

Špatné: rhamnóza, sacharóza, rafinóza, celulóza, salicín

Negativní: m-inositol

Tabulka 3: Fyziologické charakteristiky

Redukce dusičnanu: Hydrolýza škrobu:

Degradace tyrosinu: Štěpení bílkovin mléka: Tvorba melaninu:

Teplota růstu: 18-37 °C.

pozitivní střední na agaru z anorganických solí-škrobu negativní na ovesném agaru negativní pozitivní pozitivní

Velmi špatný růst při 13 °C.

Žádný růst při 45 °C.

Rozmezí pH: hojný růst při pH 5 a 7, dobrý růst při pH 9 odolnost proti do 6 % hmotnostních, ale snížený růst již při NaCl: 2 % hmotnostních koncentraci.

Makrolidy podle předkládaného vynálezu, zahrnující Sanglifehriny A, B, C a D, mohou být připravovány pomocí kultivace Streptomyces sp. A92-308110 nebo jeho mutantu, rekombinantu nebo modifikovaných forem ve vhodném kultivačním _ *99 99 9 99 99 · ·*· * 9 9 9 9 999 9 9

9 9 9 9 999 <*· 99 99 999 «« (» prostředí. Příklad 1 popisuje postup při kultivaci Streptomyces sp. A92-308110, což pouze ilustruje předkládaný vynález.

Proto další aspekty předkládaného vynálezu zahrnují:

a) izolaci biologicky čistého kmene Streptomyces sp. A92-308110 (DSM 9954) nebo jeho mutantu, rekombinantu nebo modifikované formy, která je schopna produkovat makrolid podle předkládaného vynálezu, a

b) způsob přípravy makrolidů podle předkládaného vynálezu, který zahrnuje kultivaci Streptomyces sp. A92-308110 (DSM 9954) nebo jeho mutantu, rekombinantu nebo modifikované formy ve vhodném kultivačním prostředí, případně za získání Sanglifehrinu.

Makrolidy v souladu s předkládaným vynálezem, například sloučeniny obecného vzorce IX; například Sanglifehriny A, B, C a D a jejich farmaceuticky přijatelné soli, níže obecně nazývané jako „činidla podle předkládaného vynálezu, vykazují aktivity charakteristické pro Sanglifehriny, t.j. následující kombinaci aktivit:

- mají vazebnou aktivitu k cyklofilinu;

- mají imunosupresivní aktivitu;

- inhibují bujení jak buněk B, tak buněk T;

- nemají vazebnou aktivitu k FK vazebnému proteinu, a

- neinhibují aktivitu kalcineurinu.

Tyto aktivity a zkoušky pro zjištění těchto aktivit jsou podrobněji popsány níže. Biologická aktivita makrolidů podle předkládaného vynálezu, například sloučeniny obecného vzorce IX, například Sanglifehrinů A až D, může být demonstrována pomocí standardních in vitro a in vivo testovacích metod, například, jak je popsáno níže.

« fl*· · «· fl* · «♦ ·* • · · · · · · · · · flfl · · · · · · · • flfl fl · » « · · · · · · fl · · · · « fl flfl flfl flflfl * · fl ·

1. Primární humorální imunitní reakce na buňky červených krvinek ovcí

Buňky sleziny myší (OF 1, samice, 8-10 týdnů, 1 x 10') se kultivuji spolu s červenými krvinkami ovcí (SRBC, 3 x 10 ů tři dny v 1 ml celkového objemu na 24 jamkové desce. Lymfocyty se oddělí, promyjí a umístí při hustotě 1 x 10⁶ buněk na měkký agar s čerstvým antigenem (SRBC). Po 60 až 90 minutách inkubace se přidá doplněk (sérum morčete) a inkubace pokračuje dalších 60 minut, po kterých se test vyhodnotí spočítáním (mikroskop) skvrn. V průběhu tří dnů inkubace se lymfocyty zcitliví na antigen (SRBC). Když se inkubují s antigenem znovu, vylučují B-lymfocyty specifickou protilátku, která se váže k antigenu v blízkosti vyměšovacího lymfocytu. Přidání doplňku způsobí prasknutí buněčné membrány červených krvinek obalených protilátkou za vzniku skvrn. Každá skvrna představuje jednu buňku produkující protilátku.

Inhibice tvorby skvrn je jednou z farmaceutických využitelností. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu, například Sanglifehriny A až D, jsou při této zkoušce aktivní

Odkazy:

R. I. Mishell & R. W. Dutton (1966), Immunization of normál mouše spleen cell suspension in vitro. Science 153:1004-1006.

R. I. Mishell & R. W. Dutton (1966), Immunization of dissociated mouše spleen cell culture from normál mice. J. Exp. Med. 126:423-442.

2. Proliferační odezva lymfocytů na alogenní dráždění

Dva způsoby MLR (reakce smíšených myších lymfocytů):

Buňky sleziny (2 x 10⁵) Balb/c myši (samice, 8-10 týdnů) se čtyři dny inkubují spolu s buňkami sleziny CBA myši (2 x 10⁵) (samice , 8-10 týdnů). Alogenní buňky způsobí protilátkovou • ·· · fa • fafafa odezvu populace buněk sleziny, která se měří pomocí inkorporace označeného prekurzoru do DNA. Makrolidy podle předkládaného vynálezu, například sloučeniny obecného vzorce IX a jejich farmaceuticky přijatelné soli, například Sanglifehriny A, B, C a D, mají IC50 v rozmezí od 30 do 200 nM ve srovnání s IC₅₀ okolo 20nM u cyklosporinu A, když se testuje pomocí této zkoušky.

Odkazy:

T. Meo (1979) The MLR in the mouše. V „Immunological Methods,

L. Lefkovits a B. Pernis, vyd., Acadamic Press, Ν. Y. str. 227-239.

3. B buňky myší drážděné LPS

Buňky sleziny (2 x 10⁵) myši CBA se inkubují 48 hodin s 50 pg/ml LPS plus testovanou sloučeninou. Bujení se měří pomocí inkorporace označeného prekurzoru do DNA. Makrolidy podle předkládaného vynálezu, například sloučeniny obecného vzorce IX a jejich farmaceuticky přijatelné soli, například Sanglifehriny A, B, C a D, inhibují bujení B buněk a mají IC₅₀ v rozmezí 40 až 100 μΜ.

Odkazy:

Greaves, M. a J. Janossy, 1972, Elicitation of selective T and B lymphocyte response by cell surface binding ligands, Transplant Rev., 11:87.

Janossy G, a M. F. Greaves, 1971, Lymphocyte activation, I, Response of T and B lymphocytes to phytomitogens, Clin. Exp. Immunol. 9: 483-498.

4. Cytotoxická a cytostatická aktivita za použití řady THP1 buněk

Cytotoxicita se určí pomocí lidské monocytické řady buněk THP1 (5 x 10⁴ buněk/jamka), které se inkubují v přítomnosti IFNy

4 4

44

4« ♦ 4

4 • 4 • 44 4 4 · · (100 U/ml) a LPS (5 μρ/ιηΐ) plus testované sloučeniny (do 10 μΜ) 24 až 72 hodin při teplotě 37 °C. Množství živých buněk se určí pomocí kolorimetrického odečtení MTT, pomocí kterého se měří enzymatická aktivita mitochondriální dehydrogenázy v živých buňkách (Mossman 1983) . Makrolidy podle předkládaného vynálezu, například sloučeniny obecného vzorce IX a jejich farmaceuticky přijatelné soli, například Sanglif ehriny A, B, C a D, mají IC₅o v rozmezí 1000 až 5000 nM po 24 hodinách inkubace při této zkoušce.

Odkazy

Mossman, T. J. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxic assays, J. Imm. Methods, 65, 55-63.

5. Uvolňování TNF monojadernými buňkami lidské periferní krve

Monojaderné buňky se připraví z periferní krve zdravých dobrovolníků za použití Ficoll-Hypaque hustotního dělení podle postupu Hansella a kol., (1991). Buňky (10⁵ buněk/jamka v 200 μΐ RPMI 10 % objem. FCS) se inkubují s řadou zředění testovaných sloučenin 30 minut při 37 °C před přidáním stimulantu. Interferon γ (100 U/ml) a LPS (5 μg/ml) se používají jako stimulanty pro uvolnění nádorového nekrózního faktoru (TNF) (a) mononukleárními buňkami periferního oběhového systému. Po třech hodinách inkubace se buňky odstředí (1200 ot./minutu po dobu 10 minut) a oddělí se supernatanty. Množství TNF přítomného v supernatantu buněk se určí pomocí komerčně dostupné enzymové imunosorbenční testovací soupravy. Makrolidy podle předkládaného vynálezu, například sloučeniny obecného vzorce IX a jejich farmaceuticky přijatelné soli, například Sanglifehriny A, B, C a D, mají při testování pomocí této zkoušky IC₅₀ v rozmezí 200 až 1000 nM.

6.

Zkouška vázáni cyklofilinu • fl

I · flfl ··· flfl 9 ♦ · ♦ ·♦ »* • fl 99 * · · <

• · ·· • flfl · « » ♦ fl flfl flfl

Vhodná zkouška vázání cyklofilinu je kompetitivní ELISA test popsaný Quesniaux v Eur. J. Immunol. 1987 17 1359-1365. Při tomto testu se testované sloučeniny přidávají v průběhu inkubace cyklofilinu (rekombinant lidského cyklofilinu A) s potaženým BSA-cyklosporinem A a poté se spočítá požadovaná koncentrace pro 50 % inhibici kontrolní reakce bez konkurenta a to je hodnota IC50· Alternativní zkouškou je kompetitivní vazebný test popsaný Schneiderem a kol., v Biochemistry (1994), 33, 8218-8224, který obsahuje přidání testované sloučeniny v průběhu inkubace bíotinylovaného cyklofilinu (rekombinant lidského cyklofilinu A) s potaženým BSA-cyklosporinem A. Množství bíotinylovaného cyklofilinu vázaného v přítomnosti a nepřítomnosti testované sloučeniny se určí pomocí inkubace s alkalickou fosfatázou spojenou se streptavidinem. Makrolidy podle předkládaného vynálezu, například sloučeniny obecného vzorce IX a jejich farmaceuticky přijatelné soli, například Sanglifehriny A, B, C a D, mají při testování pomocí této zkoušky IC50 v rozmezí 10 až 100 nM, ve srovnání s IC₅₀ okolo 80 nM cyklosporinu A, pokud je testován pomocí této zkoušky.

Další in vitro zkoušky, které se mohou použít pro demonstraci biologické aktivity Sanglifehrinů jsou IL-2 referenční genové zkoušky a testy buněk sleziny stimulovaných ConA (udávající účinek na aktivaci T buněk).

Makrolidy podle předkládaného vynálezu, například sloučeniny obecného vzorce IX, například Sanglifehriny A, B, C a D, nemají vazebnou aktivitu na protein FK nebo inhibiční aktivitu a neinhibují aktivitu kalcineurinu, pokud jsou testovány pomocí standardních zkoušek na tuto aktivitu.

7.

Lokalizovaná reakce implantát versus hostitel (GvH) u krys [Ford a kol., TRANSPL. PROČ. 10 (1979) 258].

Buňky sleziny (1 χ 10⁷) šest týdnů starých samic Wistar/Furth (WF) krys byly pomocí injekce podkožně podávány ve dni 0 do levé zadní tlapky samic (F344 x WF) Fi krys vážících asi 100 g.

• ·» *· · «« ♦ ·♦· · · 1*99 ««···· « * «« * ·*· · · * * ♦ »·· « ♦ ^ν · ·*·* t· « *♦» »♦ »· *«♦ «· «·

Zvířata byla léčena po čtyři po sobě následující dny a v sedmém dni jim byla odebrána a zvážena podkolenní lymfatická uzlina. Rozdíl mezi hmotností dvou lymfatických uzlin se považoval za parametr pro zhodnocení reakce.

je příkladem předkládaného IX a jejich

Inhibice GvH reakce ve výše popsaném testu farmaceutické využitelnosti. Makrolidy podle vynálezu, například sloučeniny obecného vzorce farmaceuticky přijatelné soli, například Sanglifehriny A, B, C a D, jsou při podávání dávky asi 1 mg/kg podkožně schopny omezit GvH reakci z maximálně 30 %.

8. DTH vyvolané buňkami SRBC-T_H

Padesát mikrolitrů směsi 1:1 (objem/objem) T_H (buňky červených krvinek ovcí) buněčného klonu (2 x 10^b) a 10 % hmotnostních suspenze buněk červených krvinek ovcí (SRBC) byla pomocí injekce podkožně podávána do chodidla pravé zadní končetiny samicím C57 BL/6 myší (šest až dvanáct týdnů starých) . Do levého zadního chodidla (aby bylo možno měřit nespecifický růst otoku tlapky způsobený injekcí) bylo pomocí injekce podkožně podáváno 50 mikrolitrů suspenze buněk červených krvinek ovcí (SRBC) (zředěných 1:1 objem/objem s PBS). O dvacetčtyři hodin později se změřila tloušťka pravého a levého zadního chodidla.

Byl vypočten procentuální růst tloušťky pravého chodidla proti levému chodidlu (z) . Tloušťka pravého chodidla = x; Tloušťka pravého chodidla - y; procentuální specifický růst = z z = ( (x-y) /y) .100

Makrolidy podle předkládaného vynálezu, například sloučeniny obecného vzorce IX a jejich farmaceuticky přijatelné soli, například Sanglifehriny A, B, C a D, snižují otok DTH myši z maximálně 50 %, při dávkování 5 mg/kg podkožně.

Odkazy:

9 99 99 9 9	99 9 9	9 • 9	• 9 9 9	• 9 6	9
9 999	9 9 *	9 9	99 9	9	9
9 9	9 9	9	9	•	9
«9 9 99	• 9	«99	«9	9 9

A. T. J. Bianchi, H. Hooijkaas, R. Brenner, R. Tees, AA. Nordin a Μ. H. Schreier (1981) Clones of helper T-cells mediate antigen specific, H-2restricted DTH. Nátuře 290:62-63.

P. Hermann, Μ. H. Schreier, J.-F. Borel a C. Freurer (1988) Mast cell degranulation as a major event in the effector phase of delayed-type hypersensitivity iduced by cloned helper T cells. Int. Archs Allergy appl. Immun. 86:102-105.

9. Alotransplantace srdce krysy/myši

In vivo účinek makrolidů podle předkládaného vynálezu se hodnotil při alotransplantaci srdce krysy a myši za použití Alzetovy osmotické minipumpy pro podkožní podávání. Při alotransplantaci srdce myši (BALB/c až C3H), makrolidy podle předkládaného vynálezu, například sloučeniny obecného vzorce IX a jejich farmaceuticky vhodné soli, například Sanglifehriny A,

B, C a D, prodlužují přežití myši po transplantaci při podávání 30 mg/kg/den. Při alotransplantaci srdce krysy (od DA pro Lewis) léčba pomocí méně než optimální dávky cyklosporinu A v kombinaci s makrolidy podle předkládaného vynálezu, například sloučeninami obecného vzorce IX a jejich farmaceuticky vhodnými solemi, například Sanglifehriny A, B, C a D, prodlužuje přežití transplantované krysy, jak je uvedeno v tabulce níže.

Cyklosporin A	Sanglifehrin A	Přežití traspl. krysy
(mg/kg)	(mg/kg)	(dny)
1	-	12, 12, 12, 13, 13, 14
1	10	29, 30, 45, 48, >51,
		>4 6
Kontrola (placebo)	Kontrola (placebo)	Kontrola (placebo)

Činidla podle předkládaného vynálezu jsou využitelná jako farmaceutické prostředky, například jako imunosupresiva stejně jako protizánětlivá činidla.

Především jsou využitelná při prevenci akutního a/nebo chronického odmítnutí orgánu nebo tkáně při alo- nebo xenotransplantaci, například při léčbě příjemce po transplantaci srdce, plic, spojení srdce a plic, jater, ledvin, slinivky břišní, kůže nebo rohovky. Jsou také vhodná pří ·* «« t « « « t · ·· »·· ♦ · • · · *· ♦ · ·· * · ♦ · ·♦· «

♦ ♦ ·· • · prevenci onemocnění transplantát versus hostitel, jako jsou následky po transplantaci kostní dřeně.

Činidla podle předkládaného vynálezu jsou také využitelná při léčbě autoimunního onemocnění a zánětlivých stavů, zejména zánětlivých stavů s ethiologií obsahující autoimunní složky jako je arthritida (například revmatoidní arthritida, postupující chronická arthritida a deformující arthritida) a revmatická onemocnění. Specifická autoimunní onemocnění, pro která mohou být využita činidla podle předkládaného vynálezu zahrnují autoimunní hematologické poruchy (mezi které patří například hemolytická anemie, aplastická anemie, čistá anemie červených krvinek a idiopatický nedostatek krevních destiček v periferní krvi), systémové erytematózní vředy, polychondritida, sklerodomie, Wegenerova granulamatóza, dermatomyozitida, chronická aktivní hepatitida, myastenie gravis, lupénka, Steven-Johnsonův syndrom, idiopatický syndrom malabsorpce, autoimunní zánětlivé onemocnění střev, (včetně například vředovatý zánět tračníku a Crohnova nemoc), endokrinní oftalmopatie, Gravesovo onemocnění, sarkoidóza, cirhóza, mladická (přední a zadní), a/nebo alergická vícenásobná skleróza, primární biliární cukrovka (diabetes mellitus I), uveitida keratokonjuktivitida suchá a jarní keratokonjuktivitida, intersticiální fibróza plic, psoriatická arthritida, glomerulonefritida (s a bez nefrotického syndromu, například zahrnující idiopatický nefrotický syndrom nebo nefropatie s minimální změnou) a astma.

Při těchto a jiných využitích mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu podávány samotné nebo ve směsi s jiným imunosupresantemy nebo protizánětlivými látkami, zahrnujícími cyklosporiny, rampamyciny, FK 506, a steroidy.

Pro výše uvedené indikace se bude vhodná dávka a výběr činidla podle předkládaného vynálezu samozřejmě měnit v závislosti například na léčeném pacientovi, způsobu podávání a povaze a závažnosti stavu pacienta. Obvykle bylo uspokojivých výsledků • 00 00

0 0 0 0 ·· 0 0 0

000 00 ·

0 0 0 »00 00 00 • 00 00 0* · 0 0 0

0 0 00 » 000 0 0 0 0 0 0

000 00 «0 u zvířat dosaženo při denních dávkách od přibližně 0,01 do 10 mg/kg/den při orálním podávání. U větších savců, například u člověka, se indikovaná denní dávka pohybuje v rozmezí od 0,5 do 500 mg Sanglifehrinu podávaného orálně jednou, nebo vhodně vícekrát, v rozdělených dávkách dvakrát až čtyřikrát denně.

Při transplantaci orgánů u člověka se denní dávky sloučenin podle předkládaného vynálezu podávané orálně pohybují v rozmezí 0,1 až 100, s výhodou 0,3 až 30, výhodněji 0,5 až 10 mg/kg. Když se činidlo podle předkládaného vynálezu podává společně s jiným imunosupresivem (například s kortikosteroidy nebo se sloučeninami třídy cyklosporinu nebo rampamycinu jako součást dvojné, trojné nebo čtverné léčebné terapie) mohou se použít nižší dávky (například 0,1 mg/kg/den injekčně; 3 mg/kg/den orálně). Činidla podle předkládaného vynálezu mohou být podávána zejména s jinými nesteroidními imunosupresivy, například s cyklosporinem A, rampamycinem nebo FK 506, s ohledem na částečné nebo úplné nahrazení steroidu.

Činidla podle předkládaného vynálezu mohou být podávána jakýmkoli běžným způsobem, zejména vnitřně, například orálně, například ve formě roztoků na pití, tablet nebo kapslí, nebo nitrožilněm například ve formě injekčních roztoků nebo suspenzí. Běžně je pro systémové podávání výhodná orální forma podávání, ačkoli v některých případech, například při prevenci odmítnutí transplantovaných jater je vhodná nitrožilní injekční forma. Sloučeniny mohou být také podávány místně nebo kožně, například ve formě kožního krému nebo gelu nebo podobnými prostředky, pro účely oční aplikace ve formě očního krému, gelu nebo očních kapek.

Vhodná jednotka dávkovačích forem pro ústní podávání obsahuje 0,5 až 100 mg sloučeniny na dávku.

V souladu s předchozí částí, sloučeniny podle předkládaného vynálezu poskytují další řadu provedení:

• 0 ♦ 0 • 0

000 • 00

0·

0

0 «0 • 0 0 4

0 00

0 0 0 0

0 0

00

A. Způsob účinku imunosuprese u pacientů, kteří potřebují takovou léčbu, který zahrnuje podávání účinného množství činidla podle předkládaného vynálezu pacientovi.

B. Způsob:

1) prevence akutního a/nebo chronického odmítnutí orgánu po alo- nebo xenotransplantaci, například pro léčbu příjemce transplantovaného orgánu všech konkrétních typů popsaných výše; nebo

2) prevence onemocnění transplantovaná tkáň versus příjemce, například u příjemců transplantované kostní dřeně; nebo

3) pro léčbu onemocnění autoimunitní reakce nebo pro léčbu všech takových onemocnění nebo stavů uvedených výše; nebo

4) pro léčbu astmatu u pacientů, kteří potřebují takovou léčbu, který zahrnuje podávání účinného množství činidla podle předkládaného vynálezu pacientovi.

C. Činidlo podle předkládaného vynálezu pro použití jako farmaceutický prostředek, například pro použití jako imunosupresivum nebo léčbu jakýchkoli onemocnění nebo stavů, které byly uvedeny pod B výše.

D. Farmaceutický prostředek obsahující činidlo podle předkládaného vynálezu ve spojení š farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem.

E. Použití činidla podle předkládaného vynálezu pro přípravu léků využitelných jako imunosupresivum nebo využitelných pro léčbu jakýchkoli onemocnění nebo stavů, které byly uvedeny pod B výše.

Dále makrolidy podle předkládaného vynálezu, které mají aktivitu na vazbu cyklofilinu, mohou být využitelné jako činidla při substitučních imunitních zkouškách pro cyklosporiny • ·· 4 · ·

9 9

9·

99

9 9 «

9 99

9 9 « • « I ·· 99 a jiné sloučeniny vážící cyklofilin, například v provedení testu popsaném v patentové přihlášce WO 95/07468. Tato patentová přihláška se týká provedení testu pro určení koncentrace farmaceutických prostředků vážících imunofilin, například cyklosporin, konkurenčně se vážící prostředek v komplexu v krvi; postup se skládá z přidání látky, která nahradí farmaceutický imunosupresivum-imunofilin v krvi;

přidání receptorů, který se váže k farmaceutickému prostředku, ale ne významně k vážícímu se konkurentovi; oddělení komplexu receptor-farmaceutický prostředek ze vzorku; a určení množství farmaceutického prostředku. Sanglifehriny mohou být při těchto testech použity jako konkurenční látky; například, nahradit cyklosporiny z cyklofilinů, a tak uvolnit cyklosporin a určit jeho množství, například pomocí monoklonální protilátky, která je specifická pro cyklosporin.

Předkládaný vynález je dále popsán pomocí následujících Příkladů, které jsou pouze ilustrační, a které se vztahují k doprovodným obrázkům:

ve kterých Obrázek 1 ukazuje hmotnostní spektrum sloučeniny Sanglifehrinů B;

Obrázek 2 ukazuje hmotnostní spektrum sloučeniny Sanglifehrinů A;

Obrázek 3 ukazuje hmotnostní spektrum sloučeniny Sanglifehrinů D;

Obrázek 4 ukazuje hmotnostní spektrum sloučeniny Sanglifehrinů C;

Obrázek 5 ukazuje IČ spektrum sloučeniny Sanglifehrinů B;

Obrázek 6 ukazuje IČ spektrum sloučeniny Sanglifehrinů A;

Obrázek 7 ukazuje IČ spektrum sloučeniny Sanglifehrinů D;

Obrázek 8 ukazuje IČ spektrum sloučeniny Sanglifehrinů C;

Obrázek 9 ukazuje NMR spektrum sloučeniny Sanglifehrinů A; Obrázek 10 ukazuje NMR spektrum sloučeniny Sanglifehrinů D;

Obrázek 11 ukazuje NMR spektrum sloučeniny Sanglifehrinů B; a

Obrázek 12 ukazuje NMR spektrum sloučeniny Sanglifehrinů C.

• 99

999 99 99 999 99 99

Příklady provedení vynálezu

Vlastnosti kultur

Streptomyces sp. A 92-308110 se kultivují při vhodné teplotě v různých kultivačních prostředích za použití vhodných živin a minerálních látek a postupů pro aerobní kultivaci nebo kultivaci za ponoření. Fermentační médium typicky obsahuje vhodný zdroj uhlíku, zdroje dusíku a minerální soli včetně solí obsahujících stopové prvky, kteréžto lze všechny přidat ve formě jednotlivých látek nebo jako komplexní směsi, například vyskytující se v biologických produktech z různých zdrojů.

Příklad 1 popisuje původní podmínky, za kterých byly získány sloučeniny obecného vzorce I. Zlepšeného výtěžku lze dosáhnout optimalizací kultivace množství zdrojů uhlíku stopových prvků) a bioreaktořech.

(aerace, teplota, pH, vlastnosti a a dusíku, množství minerálních solí změnami fermentačních podmínek v

Příklad 1

Kultivace druhu A 92-308110.

a) počáteční kultivace na agaru

Agarové kultury druhu A 92-308110 se kultivují 10 až 14 dní při teplotě 27 °C na následujícím agarovém médiu:

glukosa rozpustný škrob extrakt z kvasnic

NZ-amin, type A (Sheffield) uhličitan vápenatý agar (Bacto) deminaralizovaná voda

10, 0 g

20, 0 g

5,0 g (Gistex, Gist Brocades

5, 0 g

1/0 g

150,0 g do 1000 ml pH média se upraví na 6,6-6,8 pomocí NaOH/H₂SO₄, sterilizuje 20 min při 121 °C.

a pak se rt· ·· rt ·· rt • « ·· ·· • rt · #· • rt ·· ·· rt · • · ·· ··· ·· · • rtrt ··· «· ·

Kultury lze skladovat při -25° až -70 °C. Suspenzi ve směsi glycerol-pepton lze skladovat v kapalném dusíku.

b) předkultivace

Spory a mycélium 10 výchozích kultur se suspenduje ve 100 ml 0,9% roztoku soli. Pak se 50 ml tohoto roztoku naočkojí dvě 2000 ml Erlenmeyerovy baňky, z nichž každá obsahuje 1 litr předkultivačního média.

Složení předkultivačního média:

glukosa technická glycerin kvasnicový extrakt (BBL) tekutý sladový extrakt (Waer) rozpustný škrob

NZ-amin, typ A (Sheffield) sójová bílkovina

L(—) asparagin

CaCO₃

NaCl

KH₂PO₄

K₂HPO₄

MgSO₄’7H₂O roztok stopových prvků A agar (Bacto) demineralizovaná voda pH média se upraví na 6,6-6,8 sterilizuje 20 min při 121 °C.

7,50 g

7,50 g 1,35 g 7, 50 g

7.50 g

2.50 g

2,50 g 1,00 g 0, 050 g 0,050 g 0,250 g 0,500 g 0,100 g 1 ml i g do 1000 ml pomocí NaOH/H₂SO₄, a pak se

Složení roztoku stopových prvků A:

FeSO₄'7H₂O 5,0 g

ZnSO₄'7H₂O 4,0 g

MnC12'4H₂O 20, g

CuSO₄'5H₂O 0,2 g

CoCl₂'6H₂O 2,0 g

H₃BO₃

ΚΙ

H₂SO₄ (95% o, i g 0,05 g 1 ml demineralizovaná voda do 1000 ml

Předkultivované buňky se fermentují 24 h při 27 °C na rotační třepačce při 200 ot/min s excentricitou 50 mm.

c) první meziprodukt

Dva 75 litrové bioreaktory obsahující po 50 litrech předkultivačního média se každý naočkují 1 litrem meziproduktu a fermentují se 96 hodin při 270 °C. Zařízení se otáčí rychlostí 150 ot/min. Vzduch je zaváděn rychlostí 0,5 1/min na litr média.

d) druhý meziprodukt

Dvě 750 litrové fermentační nádoby obsahující po 500 litrech předkultivačního média se každá naočkují 50 litry prvního meziproduktu. Druhý meziprodukt se inkubuje 70 hodin při 27 °C. Zařízení se otáčí rychlostí 100 ot/min. Vzduch je zaváděn rychlostí 0,8 1/min na litr média.

e) hlavní kultivace

Dva 5000 litrové bioreaktory obsahující po 3000 litrů hlavního média se každý naočkují 250 respektive 300 litry druhého meziproduktu a inkubují se 96 hodin při 24 °C. Zařízení se otáčí rychlostí 45 ot/min. Vzduch je zaváděn rychlostí 0,5 1/min na litr média.

Složení média pro hlavní kultivaci je následující:

glukosa techn. 20 g tekutý sladový extrakt (Waer) 2 g kvasnicový extrakt (Bacto) 2 g

Soytone (Bacto) 2 g

KH₂PO₄

0,2 g

4 ·· 44 • 4 4 4 • 4 * 4 • · 4 4 4 « • 4 4 • *4 4 4

K₂HPO₄ 0,4 g

MgSO₄'7H₂O 0,2 g

NaCl 0,05 g

CaCl₂’6H₂O 0,05 g roztok stopových prvků Β 1 ml agar (Bacto) 1 g demineralizovaná voda do 1000 ml.

pH se upraví pomocí KOH/HCl na 6,3. Médium se sterilizuje 20 min při 121 °C.

Složení roztoku stopových prvků B je následující:

FeSO₄'7H₂O

ZnSO₄'7H₂O

MnCl₂'4H₂O

CuSO₄'4H₂O (NH₄) ₆Mo₇0₂₄

CoC1₂’6H₂0

H3BO3

KI

H₂SO₄ (95%) demineralizovaná

5, 0 g 4,0 g 2,0 g 0,2 g 0,2 g 1,0 g 0, 1 g 0,05 g 1 ml voda do 1000 ml

Optimalizované kultivační médium pro hlavní kultivaci:

sojová mouka glycerol

MES demineralizovaná voda

20,0 g

40,0 g

0, 1 M do 1000 ml při pH 6,8

Příklad 2

Izolace sanglifehrinu A, B, C a D z kultury streptomyces sp. A92-308110

První izolace a charakterizace 4 nových CBA aktivních metabolitů byla provedena z dvou 3000 1 fermentačních tanků pomocí aktivitní frakcionace a HPLC a chromatografické analýzy

00 • 0 0 0

0»

0 00 ·

»0 0 0»

0

0 » »

0 • 0 4 0»

0» »00» 0 0 0 00 0 0 000 0 0 0 0 0 0 »0» » » »» na tenké vrstvě. Pro testování biologické aktivity byl použit výše popsaný CBA (test vazby cyklofilinu).

Odděleně se provedou dvě fermentace po 3000 litrech. 1500 litrů z každé fermentace se 20 hodin míchá s 2000 1 ethylacetátu ve 4000-litrové nerezové nádobě. Oddělení organické fáze se provede pomocí zařízení Westfalia-Separator, typ SA-20. Ethylacetátový extrakt se dvakrát promyje 80 litry vody a odpaří do sucha za sníženého tlaku. Získá se 1,64 resp. 2 kg extraktu. Oba surové extrakty se zbaví tuku pomocí třístupňové extrakce 40 litry směsi methanol/voda 9:1 a 40 litry hexanu. Odpaření do sucha za sníženého tlaku poskytne 1,34 kg extraktu.

Extrakt zbavený tuku se chromatograficky čistí na dvakrát (po 670 g) na 10 kg sloupci Sefadexu H v methanolu. Každý podíl se při nanášení na kolonu rozpustí v 3,3 litru methanolu. Po oddělení prvních 15 litrů eluátu jako frakce 1 pokračuje chromatografie odebíráním 2 litrových frakcí. Nejaktivnější frakce byly 2,3 a 4, a proto byly spojeny za získání 146 g. Tento materiál se dále chromatografuje na 1 kg silikagelu (Merck 0,04-0063 mm) s eluentem: methyl-t.butylether (MTBE), MTBE/ 5 % methanolu a MTBE/ 10 % methanol. Odebírají se frakce po 2 litrech. Nej aktivněj ší jsou frakce 5 až 9, a proto se spojí a získá se 43,8 g. Tento materiál se dále dělí na 1 kg sloupci silikagelu (Merck) 0,04-0,063 mm s gradientem hexan/aceton 7:3 až aceton. Z této chromatografie se dále dělí frakce 6 (7,0 g) , a to na sloupci 3 kg Lichroprep RP18 (Merck) 40-63 μιη s eluentem methanol/voda 94:6 (frakce 4-7 —> 2,16 g) , a pak na sloupci 100 g silikagelu H s eluentem methylenchlorid a 3 % methanol (733 mg) , sloupci 3 kg Lichroprep RP18 s eluentem methanol/voda 9:1 (621 mg) a pak na 100 g Lichroprep RP18 s eluentem acetonitril/voda 1:1 za získání 324 mg čistého sanglifehrinu A (teplota tání 142-145 °C (amorfní materiál), (cc)D25 = -67,30 (c=0-988, methanol)).

Frakce 5 a 7 ze sloupce hexan/aceton se spojí (7,1 g) a čistí na sloupci 3 kg Lichroprep RP18 40-63 μη s eluentem ·· · ·· ·· ♦ ·· · · · · • · · · ·· • · · ··· · · • · · · · · ·· ··· ·· ·· ·· • · • · ··· • »· methanol/voda 9:1 (769 mg), na sloupci 100 g silikagelu H s eluentem MTBE/ 3 % methanol (309 mg) a nakonec na 100 g silikagelu H s eluentem methylenchlorid a 3 % methanol za získání 90 mg čistého Sanglifehrinu B (teplota tání 117-121 °C (amorfní látka), (a)D25=-52,80 (0=1-128 v methanolu)).

Frakce 9 a 10 (2,147 g) z chromatografie se směsí methanol/voda 94:6 na 3 kg Lichroprep RP18 se pak čistí na 100 g silikagelu H směsí methylenchlorid/5 % methanol (800 mg) a nakonec na 3 kg Lichroprep RP18 se směsí methanol/voda 9:1 za získání 480 mg Sanglifehrinu C (teplota tání 165-170 °C, ( (ot) D25=-35, 60 (c=0-736 v methanolu).

Frakce 11 a 12 (835 mg) z chromatograf ie s eluentem methanol/voda 94:6 na 3 kg Lichroprep RP18 se čistí na 100 g silikagelu H směsí MTBE/5 % methanol za získání 140 mg Sanglifehrinu D (teplota tání 137-142 °C, amorfní látka).

Sanglifehriny A, B, C a D pak byly charakterizovány pomocí UV, IR, hmotnostní a NMR spektroskopie. Získané výsledky jsou uvedeny v Tabulce 4 níže a na připojených obrázcích 4.

Tabulka 4

Sanglifehrin A sumární vzorec: C₆oH₉iN₅Oi3 (1090, 4)

UV (MeOH): 275 (1962), 242 (54500), 197 (75755) H⁺: 275 (1635), 242 (51884),

OH“: 292 (1973),242 (60495)

IR-spektrum: obrázek 6 hmotnostní spektrum: FAB 1096[MH+Li]⁺: obrázek 2 NMR spektrum: obrázek 9 • ·

• · · · · · • · · · · • · ··· · · • · · · ··· ·· ··

Sanglifehrin Β sumární vzorec: C60H90N5O12 (1072, 4)

UV (MeOH): 273 (4395), 242 (50600), 197 (78577)

IR-spektrum: obrázek 5 hmotnostní spektrum: FAB 1098[MH+Li]⁺: obrázek 1

NMR spektrum: obrázek 11

Sanglifehrin C sumární vzorec: C₆iH₉3N₅0i3 (1104,4)

UV (MeOH): 275 (1876)), 242 (51557), 197 (72643) H⁺: 275 (1391), 242 (50120)

OH: 292 (1832), 242 (57960)

IR-spektrum: obrázek 8 hmotnostní spektrum: FAB 1110[MH+Li]⁺: obrázek 4 NMR spektrum: obrázek 12

Sanglifehrin D sumární vzorec: C61H91N5O12 (108 6, 4)

UV (MeOH): 273 (3194), 242 (47584), 197 (73766) H⁺: 273 (3237), 242 (46389)

OH: 285 (2600), 242 (52907)

IR-spektrum: obrázek 7 hmotnostní spektrum: FAB 1092[MH+Li]⁺: obrázek 3 NMR spektrum: obrázek 10 • · • ·

Δ . Příklad 3 - Transformace Sanglifehrinu A na Sanglifehrin C

K míchajícímu se, chladnému (0 °C) roztoku 20 mg (18,3 pmol) Sanglifehrinu A v 0,5 ml methanolu se přidá jeden krystal monohydrátu kyseliny paratoluensulfonové. Vzniklý žlutý roztok se míchá jednu hodinu a reakční směs se rozloží nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Vzniklá směs se dvakrát extrahuje ethylacetátem. Organický roztok se dvakrát promyje nasyceným roztokem solanky, suší nad bezvodým síranem sodným, filtruje a odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se čistí pomocí kolonové chromatografie na silikagelu (95:5 methylterc.butylether: methanol) za získání Sanglifehrinu C a jeho C53 epimeru, Sanglifehrin C má (S) konfiguraci, jak je popsáno níže (R=Me).

směs diastereomerů 4:1

HO ·· · · · · • ·· ··

Alternativně se tato transformace provádí za použití jiné protické kyseliny (jako je pyridiniumparatoluensulfonát, kyselina chlorovodíková nebo kyselina sírová) nebo pomocí Lewisovy kyseliny (jako je chlorid zinečnatý, bromid nebo chlorid horečnatý, tetraisopropoxid titaničitý nebo fluorid boritý) v methanolu. Použití jiných alkoholických rozpouštědel nebo přídavných rozpouštědel jako je ethanol, isopropanol, butanol, allylalkohol, propargylalkohol, benzylakohol vede stejným způsobem k analogům, kde R ve vzorci výše je ethylová skupina, isopropylová skupina, butylová skupina, allylová skupina, propargylová skupina, benzylová skupina.

Stejným způsobem, jako je popsáno výše, se může transformovat Sanglifehrin B na Sanglifehrin D.

Příklad 4 - Transformace Sanglifehrinu C na Sanglifehrin A

Roztok 550 mg (0,50 mmol) Sanglifehrinu C v 5 ml roztoku THF-voda 4:1 se reaguje s 0,5 ml 2 N vodné kyseliny sírové a míchá se 1,5 hod. Reakce se rozloží nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vzniklá směs se dvakrát extrahuje ethylacetátem. Organický roztok se promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a dvakrát nasyceným roztokem solanky, suší se nad bezvodým síranem hořečnatým, filtruje a odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se čistí pomocí kolonové chromatografie na silikagelu (90:10 methylterc.butylether: methanol) za získání Sanglifehrinu A jako bílého amorfního prášku.

Na nosiči obsahujícím vodu se mohou použít další anorganické a organické kyseliny, s výhodou organické přídavné kyseliny. Vhodnými kyselinami jsou kyselina chlorovodíková, kyselina paratoluensulfonová nebo další sulfonové kyseliny, pyridiniumparatoluensulfonát, kyselina octová, kyselina trifluoroctová, kyselina mravenčí. Vhodnými organickými přídavnými rozpouštědly jsou acetonitril, dimethylformamid, dimethylsulfoxid, dioxan.

• · ·· · ·· ·· • ···· · · · · • · · · · · · · ····· · · ····· · • · · · · · · • · ·· ··· · · · ·

Tyto reakce jsou doprovázeny tvorbou různého množství sloučeniny obecného vzorce XV, mimo jiné v závislosti na reakčním čase (vhodnější postup vedoucí ke sloučenině vzorce XV viz. Příklad 5 níže).

Analogicky se může transformovat Sanglifehrin D na Sanglifehrin

B.

Příklad 5 - Transformace Sanglifehrinu A na sloučeninu obecného vzorce XV

K míchajícímu se, chladnému (0 °C) roztoku 50 mg (46 pmol)

Sanglifehrinu A v 1,9 ml acetonitrilu se přidá 0,1 ml fluorovodíku v pyridinu. Vzniklý žlutý roztok se míchá 1 hodinu a reakční směs se rozloží nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Vzniklá směs se dvakrát extrahuje ethylacetátem. Organický roztok se dvakrát promyje nasyceným roztokem solanky, suší nad bezvodým síranem sodným, filtruje a odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se čistí pomocí kolonové chromatografie na silikagelu (95:5 methylterc.butylether: methanol) za získání sloučeniny obecného vzorce XV jako bílého amorfního prášku.

Analogickým způsobem se může Sanglifehrin B převést na sloučeninu obecného vzorce XVI. Tyto látky existují jako jeden epimer na C53, ale absolutní konfigurace nebyla jednoznačně určena.

• ·

• · < ·· ··

Sloučenina obecného vzorce XV: MS m/z 1078 [M+Li]⁺ (rel

intensita	100); 4H	NMR	(DMSO)	(uvedeny jsou	pouze
charakteristické signály)	δ 0,40 (3H, d	, H-50), 1,20	(3H,	s,	H-
54) ,	1, 69	(3H, s, H-49),	4,20	(IH, t,	H-15), 4,58 i	UH,	dd,	H-
17),	5, 19	(IH, dd, H-18),	. 5,28	(IH, dd,	H-23), 5,62	(IH,	m,	H-
21) ,	5, 67	(IH, m, H-27),	5, 99	(IH, d,	H-25), 6, 03 l	:ih,	dd,	H-
19) ,	6, 14	(IH, dd, H-20),	6, 22	(IH, dd,	H-26).
Příklad 6	- Transformace sloučeniny	obecného vzorce	XV	na

Sanglifehrin A

K míchajícímu se roztoku 54 mg (50 pmol) sloučeniny obecného vzorce XV v 0,5 ml směsi THF-voda 4:1 se přidá 50μ1 2 N vodného roztoku kyseliny sírové. Vzniklý roztok se míchá při teplotě okolí 12 hodin a reakční směs se rozloží nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Tato směs se dvakrát extrahuje ethylacetátem. Spojený organický roztok se promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, suší nad bezvodým síranem sodným, filtruje a odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se čistí pomocí kolonové chromatografie na silikagelu (90:10 methylterc.butylether: methanol) za získání sloučeniny Sanglifehrinu A jako bílé amorfní pevné látky.

·· ·· • · · · 0 0 00 • · · · · · • · · • 00 00

Analogicky se může sloučenina obecného vzorce XVI převést na Sanglifehrin B.

Postupy popsané v příkladech 3 až 6 se mohou použít jako selektivní sled intramolekulárních chránících reakcí a reakcí, pomocí nichž se chránící skupiny odstraňují. Tedy, pomocí reakce popsané v příkladu 5 se hydroxylová skupina v poloze 15 může selektivně chránit, což umožňuje selektivní manipulaci se zbylými volnými hydroxylovými skupinami. Postup popsaný v příkladu 5 umožňuje selektivní chránění hydroxylových skupin jak v poloze 15, tak v poloze 17. Oba postupy se mohou také použít při intramolekulárním chránění ketonu C53. Hydroxylové a ketonické skupiny mohou regenerovat pomocí reakcí popsaných v příkladech 4 a 6. Sanglifehriny C a D, stejně jako sloučeniny vzorců XV a XVI, jsou proto významnými meziprodukty tvorbu dalších Sanglifehrinů.

Příklad 7 - Příprava 16-dehydro-17-dehydroxySanglifehrinu A (Sloučenina obecného vzorce XVII)

Roztok 54 mg (50 μπιοί) sloučeniny obecného vzorce XV a krystal monohydrátu kyseliny paratoluensulfonové v 1 ml směsi acetonitril-voda 4:1 se zahřívá 1,5 hodiny na 80 °C. Reakční směs se rozloží nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu • 4

4

444

44

4 4 4

4 44

44 sodného. Vzniklá směs se dvakrát extrahuje ethylacetátem. Organický roztok se promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným, filtruje a odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se čistí pomocí kolonové chromatografie na silikagelu (90:10 methylterc.butylether: methanol), a pomocí chromatografie na reverzní fázi (RP18, 50:50 acetonitril-voda až acetonitril po dobu 45 min) za získání čisté jmenované sloučeniny jako bílé amorfní pevné látky.

MS m/z 1078 [M+Lil⁺ (rel. intensita 100), ^XH NMR (DMSO) (uvedeny jsou pouze charakteristické signály) δ 1,58 (3H, s, H50), 1,71 (3H, s, H-49), 2,08 (3H, s, H-54), 4,03 (2H, d, H-l 5 a C31-OH), 5,57 (2H, m, H-21 a C35-OH) , 5,72 (1H, dt, H-27),

5,96 (1H, d, C15-OH), 6,03 (1H, d, H-25), 6,09-6,28 (4H, m, H18, H-19, H-20 a H-26), 6,37 (1H, d, H-17).

Příklad 8 - Příprava 42-N-methyl-Sanglifehrinu A (Sloučenina obecného vzorce XVIII)

K míchajícímu se, chladnému (-15 °C) roztoku 109 mg (0,1 mmol) Sanglifehrinu A a 67 μΐ (0,3 mmol) 2,6-diterc.butylpyridinu v 1 ml CH₂C1₂ se přidá 16,5 μΐ methyltriflátu. Směs se nechá zahřát na teplotu místnosti a míchá se dalších 6 hodin, poté se rozloží pomocí přidání nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Vzniklá směs se dvakrát extrahuje

·· ·· ethylacetátem. Organický roztok se promyje solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným, filtruje a odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se čistí pomocí dvou úspěšných kolonových chromatografii na silikagelu (90:10 methylterc.butylether: methanol, potom 95:5 methylterc.butylether: methanol), za získání čisté jmenované sloučeniny jako bílé amorfní pevné látky.

MS m/z 1110 [M+Li]⁺ (rel. intensita 100); ^ΧΗ NMR (DMSO) uvedeny jsou pouze charakteristické signály) δ 1,70 (3H, s, H-49), 2,06 (3H, s, H-54), 3,53 (3H, s, 42 N-Me) , 3,98 (1H, d, C31-OH) ,

4,50 (1H, d, H-65), 4,77 (1H, d, C17-OH), 5,43 (1H, d, C15-OH), 5,49 (1H, d, C35-OH) , 7,50 (1H, d, H-12) , 8,11 (1H, d, H-9) ,

9,22 (1H, s, C61-OH).

Příklad 9 - Příprava 53-dihydro-Sanglifehrinu A (Sloučenina obecného vzorce XIX)

HO

K míchajícímu se, chladnému (0 °C) roztoku 54 mg (50 μπιοί) Sanglifehrinů A v 0,5 ml methanolu se přidá 2,8 mg (75 μπιοί) tetrahydridoboritanu sodného. Míchání pokračuje 1 hodinu a přidá se nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Směs se dvakrát extrahuje ethylacetátem. Organický roztok se promyje solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným, filtruje a odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se čistí pomocí kolonové chromatografie na silikagelu (95:5 methylterc.butylether:

• · · · · ··· ·· ·· ··· methanol, potom 90:10 methylterc.butylether: methanol), za získání čisté jmenované sloučeniny jako bílé amorfní pevné látky. Isolovaný produkt odpovídá přibližně směsi diastereoizomerů 1:1 na C-53.

MS m/z 1098 [M+Li]⁺ (rel. intensita 63), 1104 [M+2Li-H]⁺ (rel.

intensita 100); NMR (DMSO) (uvedeny jsou pouze • charakteristické signály) δ 0,62 (3H, d, H-50), 1,02 (3H, d, H• 54), 3,55 a 3,59 (1H, 2m, H-53).

» Příklad 10 - Příprava 53-tosylhydrazon-Sanglifehrinu A . (Sloučenina obecného vzorce XX)

Směs 55 mg (50 gmol) Sanglifehrinů A tosylhydrazidu v 0,5 ml dichlormethanu místnosti šest hodin. Rozpouštědlo se čistí pomocí kolonové chromatografie methylterc.butylether: methanol) za sloučeniny jako bílého amorfního prášku.

a 2 3 mg (12 5 gmol) se míchá při teplotě odstraní a zbytek se na silikagelu (90:10 získání jmenované

MS m/z 1264 [M+Lil⁺ (rel. intensita 100); ^XH NMR (DMSO)(uvedeny jsou pouze charakteristické signály) δ 1,70 (3H, s, H-49), 1,77 (3H, s, H-54), 2,37 (3H, s, -NSO₂C₆H₄CH3) , 6,51 (1H, s, H-60) , 6,59 (2H, 2d, H-62 a H-64), 7,06 (1H, dd, H-63) , 7,35 (2H, d, tosyl meta protony), 7,73 (2H, d, tosyl para protony).

·· ·« • · · · • · ·· • » · · ·

A · · ·· ··

Příklad 11 - Příprava 26S,27S-dihYdroxy-Sanglifehrinu A (Sloučenina obecného vzorce XXI) a 26R,27R-dihydroxySanglifehrinu A (Sloučenina obecného vzorce XXII)

K míchajícímu se, chladnému (0 °C) roztoku 495 mg (1,5 mmol) kyanoželezitanu draselného, 207 mg (1,5 mmol) uhličitanu draselného, 19,5 mg (0,025 mmol) (DHQ)₂PHAL, 65 μΐ (0,005 mmol) 0,08 M oxidu osmičelého v t-butanolu a 95 mg (1 mmol) methylsulfonamidu v 2,5 ml t-butanolu a 5 ml vody se přidá roztok 545 mg (0,5 mmol) Sanglifehrinu A v 2,5 ml t-butanolu. Zniklá dvoufázová směs se nechá zahřát na teplotu místnosti a míchá se tři hodiny. Poté se přidá 1,08 g (8,6 mmol) siřičitanu sodného, který následuje ethylacetát a voda, a směs se prudce míchá 15 minut. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se dvakrát extrahuje ethylacetátem. Spojené organické vrstvy nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu se promyji sodného a solankou, suší nad bezvodým síranem sodným, filtrují a odpaří.

. 9 · • 9

99 ·♦ • * • <

• · « · · • · ·· ··· »· »· • · · * • 9 ··

9·9 9 9

9 9

99

Zbytek se čistí pomocí chromatografie na reverzní fázi (RP18, 30:70 acetonitril-voda až acetonitril během 60 minut) za získání 26S,27S-diolu jako amorfního prášku.

Odpovídající 26R,27R-diol se získá pomocí výše uvedeného postupu, ale za použití (DHQD)₂PHAL místo (DHQ)₂PHAL.

26S,27S-diol: MS m/z 1130 [M+Li]⁺ (rel. intensita 100); *H NMR (DMSO) (uvedeny jsou pouze charakteristické signály) δ 1,64 (3H, s, H-49), 2,06 (3H, s, H-54), 3,20 (1H, široký m, H-27), 3,45 (1H, široký m, H-31), 3,94 (3H, m, H-17, H-26 a C31-OH) , 4,30 (1H, d, C27-OH), 4,57 (1H, d, C26-OH), 5,20 (1H, t, H-23), 5,33 (1H, d, H-25), 5,57 (3H, m, H-18, H-21 a C35-OH) , 6,03 (1H, dd, H-19), 6,14 (1H, dd, H-20).

26R,27R-diol: MS m/z 1130 [M+Li]⁺ (rel. intensita 100); ^ΣΗ NMR (DMSO) (uvedeny jsou pouze charakteristické signály) δ 1,64

(3H,	s, H-	-49), 2,06	(3H,	s, H-54	), 3,16 (1H,	širo	ký m, H-27 ) ,
3,48	(1H,	široký m,	H-31	), 3,94	(3H, m, H-17	, H-2	6 a C31-OH),
4,30	(1H,	d, C27-OH	), 4,	57 (1H,	d, C26-OH),	5, 20	(1H, dd, H-
23) ,	5,35	(1H, d, H-	25) ,	5,57 (3H,	m, H-18,	H-21	a C35-OH),
6, 03	(1H,	dd, H-19),	6, 14	(1H, dd	, H-20).

·· ·· · ·· ·· ·· · · · · ···· ····* · · · · · · · · • · · · · · · • · ·· · ·· ·· ··

Příklad 12 - Rozštěpení diolu v 26S,27S-dihydroxY-Sanglifehrinu A

K roztoku 90 mg (79 μπιοί) 26S,27S-diolu v 0,9 ml směsi THF-voda 2:1 se přidá 33,7 mg (157 μπιοί) jodistanu sodného. Míchání pokračuje 1 hodinu a přidá se nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Směs se dvakrát extrahuje ethylacetátem. Organický roztok se promyje solankou, suší nad bezvodým síranem sodným, filtruje a odpaří. Zbytek se čistí pomocí chromatografie na solikagelu (95:5 methylterc.butylether:methanol) za získání sloučenin obecného vzorce XXIII (pěna) a XXIV (prášek).

XXIII

XXIV

Sloučenina obecného vzorce XXIII: MS m/z 366 [M+H-H₂0]⁺ (rel. intensita 100); NMR (DMSO) (2:1 směs OH_ax:OH_eq epimerů na anomerním centru) (uvedeny jsou pouze charakteristické signály) δ 3,54 a 4,08 (1H, 2m, H-31) , 3,57 (1H, široký m, H-35) , 3,66 (1H, m, H-33) , 4,38 (0,67H, ddd, H-27_ax) , 4,95 (0,33H, široký m, H-27_eq) , 5,40 (0,33H, d, C27-OH_eq) , 5, 59 (0, 33H, d, C35-OH) ,

5,61 (0, 67H, d, C35-OH) , 5,96 (0,67H, s, NH-42), 7, 91 (0, 33H, s, • flfl ·· fl flfl flfl ··· · · ··· · flfl · ··· · · · ·«·· • · flfl · · · · < · · · · · • · ··· ··· fl·· flfl flfl ··· flfl ·· (0,67H, d, C2 7-OH,_X), 7,8 9

NH-42).

Sloučenina obecného vzorce XXIV: MS m/z 745 [M+Lil⁺; ^XH NMR (DMSO) (uvedeny jsou pouze charakteristické signály) Ó 0,64 (3H, d, H-50), 0,81 (6H, d, H-56 a H-57) , 2,06 (3H, s, H-54), 2,17 (4H, s, H-14 a H-49), 3,80 (1H, širokým, H-15), 3,94 (1H, dd, H-17), 5,33 (1H, široký d, H-23) , 5, 62 (2H, m, H-18 a H21), 6,89 (1H, d, H-25) , 6,10 (1H, dd, H-19),6,18 (1H, dd, H20), 10,0 (1H, d, H-26).

Příklad 13 - Acetylace Sanglifehrinů A za vzniku 61-O-acetylSanglifehrinu A (Sloučenina obecného vzorce XXV)

přidá 5,2 μΐ (55 μιηοΐ) anhydridu kyseliny octové. Reakční směs se udržuje 1 hodinu při 0 °C, poté se nechá zahřát na teplotu místnosti a míchá se dalších dvanáct hodin. Přidá se nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného a vzniklá směs se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se suší nad bezvodým síranem sodným, filtruje a odpaří. Zbytek se čistí pomocí chromatografie na reverzní fázi (RP18, 40:60 acetonitril-voda až acetonitril během 45 minut) za získání jmenované sloučeniny jako amorfního prášku.

MS m/z 1132 [M+H] ⁺ (rel. intensita 100); ^XH NMR (DMSO) (uvedeny jsou pouze charakteristické signály) δ 1,68 (3H, s, H-49), 2,06

(3H, s, H-54), 2,25 (3H, s, CH₃CO₂) , 4,04 (1H, d, C31-OH) , 4,67 (1H, d, C2-NH, 4,76 (1H, d, C17-OH) , 5,42 (2H, m, H-8 a C15OH), 5,57 (3H, m, H-18, H-21 a C35-OH), 6,85 (1H, s, H-60), 6,98 (1H, d, H-62), 7,06 (1H, d, H-64) , 7,31 (1H, dd, H-63) ,

7,51 (1H, d, H-12), 7,89 (1H, s, H-42), 8,23 (1H, d, H-9).

Průmyslová využitelnost

Činidla podle předkládaného vynálezu jsou využitelná jako farmaceutické prostředky, například jako imunosupresiva stejně jako protizánětlivá činidla.

Především jsou využitelná při prevenci akutního a/nebo chronického odmítnutí orgánu nebo tkáně při alo- nebo xenotransplantaci, například při léčbě příjemce po transplantaci srdce, plic, spojení srdce a plic, jater, ledvin, slinivky břišní, kůže nebo rohovky. Jsou také vhodná při prevenci onemocnění transplantát versus hostitel, jako jsou následky po transplantaci kostní dřeně.

Claims (16)

1. Makrolid, ve kterém

i) je v polohách 2 až 6 makrocyklického kruhu připojen zbytek piperidazinylkarboxylové kyseliny; a/nebo ii) je v polohách 7 až 9 makrocyklického kruhu připojen zbytek aromatické α-aminokyseliny; a/nebo iii) je v polohách 10 až 12 makrocyklického kruhu připojen zbytek alifatické a-aminokyseliny, ve volné nebo chráněné formě, nebo jeho soli.

2. Makrolid podle nároku 1 obsahující dva, nebo výhodně všechny tři charakteristické strukturní rysy i) , ii) a iii) .

3. Makrolid podle nároku 1 nebo 2, ve kterém zbytek makrocyklického kruhu obsahuje zbytek hydroxykarboxylové kyseliny, jehož délka řetězce je od 6 do 20, výhodně 11 atomů uhlíku.

4. Makrolid podle nároku 3, ve kterém zbytek hydroxykarboxylové kyseliny je zbytek obecného vzorce II

R.

R ' <j> p^H2>2

CH—CH=CH—CH=CH~CH-C CH CH—CO~ ² I ch₃

II

CHi

O kde

Ri a R₂ jsou oba atom vodíku nebo dohromady představují vazbu;

R₃ je atom vodíku;

0 00 • 0

R₄ je skupina -CO-CH₃ nebo skupina -CH(OH)-CH₃ nebo R₃ a R₄ společně představují zbytek obecného vzorce III

9*3 och₃ t

ve volné nebo chráněné formě, nebo jeho sůl.

5. Makrolid podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, obsahující makrocyklický kruh obecného vzorce IV

-AIV

X-Y-2 kde X, Y a Z jsou zbytky i), ii) a iii) , které jsou definovány v nároku 1, a A je zbytek hydroxykarboxylové kyseliny, který je definován v nároku 3 nebo 4, ve volné nebo chráněné formě nebo ve formě jeho soli.

Makrolid podle nároku 5 obsahující makrocyklický kruh obecného vzorce V kde skupina A je definována v nároku ve volné nebo chráněné formě nebo ve

5, formě jeho soli.

7. Makrolid podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, který je substituován na atomu uhlíku, který sousedí s oxyskupinou ·· ·· i · · « » · ·» • · · · « • · « c · ·· laktonového mostu, 3-ylovým zbytkem.

2-oxy-2'-aza-3'-oxospirobicyklohexan

8, Makrolid podle nároku 7, ve kterém má spirobicyklohexylový zbytek obecný vzorec VI kde

-a-b- je skupina -(Me)C=CH- nebo skupina -(Me)CH-CH(OH)- a

R₅ je vodík nebo methyl, ve volné nebo chráněné formě, nebo jeho soli, připojené k makrolidovému kruhu přes spojovací skupinu mezi spirozbytkem a makrolidovým kruhem obsahující lineární sekvenci o 6 až 11, typicky o 9 atomech uhlíku.

9. Makrolid podle nároku 8, ve kterém spojovací skupina mezi spiro-zbytkem a makrolidovým kruhem je skupina obecného vzorce VII

VII l‘ I

CH, c-CH₂—CH(OH) —CH(CHj (CH,)

2’ 2 'CH—CH—CH—C-d kde c je vazba na spiro-zbytek;

d představuje vazbu k makrocyklickému kruhu a • ·· · * 0 β · ··

0« · 0 0 000 0 00 0

000 000 00 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 000 00 00 000 00 00

R_S a R₇ jsou každý skupina OH nebo společně představují další vazbu, ve volné nebo chráněné formě.

10. Sloučenina obecného vzorce VIII

S-L-M vin kde

S představuje 2-oxy-2'-aza-3'-oxospirobicyklohexan-3-ylový zbytek;

L představuje spojku obsahující lineární sekvencí o 6 až 11, typicky o 9 atomech uhlíku, a

M představuje makrolidový kruh definovaný v kterémkoli z nároků 1 až 6, ve volné nebo chráněné formě nebo ve formě soli.

11. Sloučenina podle nároku 10 obecného vzorce IX kde skupina -a-b- je definována výše;

-e-f je skupina -CH(OH)-CH(OH)- nebo skupina -CH=CH-; skupina -g-h má stejný význam, jak bylo definováno výše pro skupinu -a-b-, a

R₃, R₄ a R₅ jsou definovány výše,

4 · 4 4 4 4

4 4 4

4 4 44 ve volné nebo chráněné formě nebo ve formě soli.

12. Sloučenina podle nároku 11, která má následující konformaci kde, pokud -a-b- je skupina -(Me)CH-CH(OH)-, má tato skupina s výhodou konfiguraci:

CH, pokud -e-f- je skupina -CH(OH)-CH(OH)-, má tato skupina s výhodou konfiguraci (S), (S) nebo (R), (R);

pokud -g-h- je skupina -(Me)CH-CH(OH)-, má tato skupina s výhodou konfiguraci:

pokud -g-h- je skupina -(Me)C=CH-, má tato skupina s výhodou konfiguraci • * · · ·

4 · 4 • 4 4 4

CH, a pokud R₃ a R₄ jsou spojené, mají s výhodou konfiguraci ch₃^ OCH₃

13. Sanglifehrin vybraný ze skupiny, která obsahuje Sanglifehrin A, B, C a D.

14. Makrolid podle kteréhokoli z nároků 4 až 9 nebo sloučenina podle kteréhokoli z nároků 10 až 12, kde polohy 14 až 17 makrocyklického kruhu obsahují zbytek obecného vzorce X:

CH,

CH.

2'2 —CH—CH—CH—CH* 17 I 15 14

CH, například o konfiguraci

00 00 0 00 0·

00 0 0 00 0000

0 0 0 0 0 0 0 00

00000 · 0 0 00000

0 0 0 0 0 0 0

000 00 000 00 00

15. Sloučenina obecného vzorce XI r₆-x-y-z-a-oh XI například sloučenina obecného vzorce XII

XII

CO-CH-NH—CO—CH—NH—A OH

HO^.CH₂ ch₃ ch₃ například sloučenina obecného vzorce IX' kde X, Y, Z, A, R₃, R₄ a R₅ jsou definovány výše a R₆ je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, například methylová skupina, ve volné nebo chráněné formě nebo ve formě své soli.

16. Makrolid podle kteréhokoli z nároků 1 až 9 ve formě otevřeného kruhu, který je ve volné nebo chráněné formě, nebo jeho sůl.

• · • · • · ··· • rtrt • rt · · • · · • rt·· • · ··· ·· • <

• · • « • * rt· ·· • · ·· • rt • · ··

Sloučenina obecného vzorce R₆O-X-Y-Z-A-OH, kde X, Y, Z a A jsou definovány v nároku 5 a R_é je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, ve volné nebo chráněné formě, nebo ve formě jeho soli.

18. Sloučenina obecného vzorce RgO-X-Y-Z-A'-CH (OH) -L-S, kde skupina A'-CH(OH)- je zbytek hydroxykarboxylové kyseliny definovaný v nároku 3 a ostatní symboly jsou definovány v nároku 17, ve volné nebo chráněné formě, nebo ve formě soli.

19. Sloučenina obecného vzorce XII'

R_fiO 6 * :o

XII

NH .N CO-CH-NH—CO-CH—NH—A ‘

CH,

CH, ve volné nebo chráněné formě nebo ve

CH-L-S i

OH formě soli.

20. Sloučenina obecného vzorce IX'

Me ·· ·· • · · 9

9 9 99

999 9 9

9 9 9

9 9 9 9

ΊΟ • ·* 99

99 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 999 9 9 9 • 9 · 9

999 99 99 9 ve volné nebo chráněné formě, nebo ve formě soli.

21. Sloučenina, ve které je 2-oxy-2'-aza-3'-oxo-3'-ylspirobicyklohexanový kruhový systém ve formě otevřeného kruhu, například sloučenina obecného vzorce XII kde a, b, L a M jsou definovány výše, ve volné nebo chráněné formě, nebo ve formě soli.

22. 2-Oxy-2'-aza-3'-oxo-3'-ylspirobicyklohexan ve volné nebo chráněné formě nebo ve formě soli, zejména sloučenina obecného vzorce VI' kde R? je atom vodíku, případně chráněná hydroxylová skupina, reaktivní funkční skupina, nebo skupina -CH₂-CH(OH)CH (CH₃) -CH₂-CH₂-CHO, nebo její delta laktolový ekvivalent, ve volné nebo chráněné formě nebo ve formě soli.

A AAAA

AA AAAA

23.

2-oxy-2'-aza-3'-oxo-3'-ylspirobicyklohexan s otevřeným kruhem, ve volné nebo chráněné formě nebo ve formě soli, zejména sloučenina obecného vzorce XII'

Me

XII *

24 .

kde a, b a R? jsou definovány výše, ve volné nebo chráněné formě nebo ve formě soli.

Makrolid obecného vzorce XIII

CH

XIII ^co

H kde M je makrolidový kruh definovaný výše, zejména makrolid obecného vzorce XIV

XIV ve volné nebo chráněné formě nebo ve formě soli.

·· • 9 9

9 9

9 999 9

9 9 *· 99

9 9 9 9 9

9 9 9 9

999 99 9

9 9 9

99 99 9

99 99

25. Způsob přípravy shora definovaných sloučenin definovaných výše, vyznačující se tím, že zahrnuje:

i) pro přípravu Sanglifehrinů A, B, C a D, kultivaci kmene aktinomycet produkujícího Sanglifehrin A, B, C .nebo D v kultivačním prostředí a izolaci požadovaného Sanglifehrinů A, B, C nebo D ze získaného roztoku kultury;

ii) pro přípravu Sanglifehrinů C a D cyklizaci Sanglifehrinů A a B v polohách 15 a 16;

iii) pro přípravu Sanglifehrinů A a B otevření laktolového kruhu Sanglifehrinů C a D v polohách 15 a 16;

iv) pro přípravu makrolidů obecného vzorce IX nebo IX', kde -g-h- je skupina C(CH₃)=CH~, dehydrataci sloučeniny obecného vzorce IX nebo IX', kde -g-h- je C (CH₃) -CH (OH) nebo jeho chráněné formy;

v) pro přípravu makrolidů obecného vzorce IX nebo IX', kde

R₄ je CH(OH)-CH₃, hydrogenaci sloučeniny obecného vzorce IX nebo IX', kde R₄ je C(O)-CH₃;

vi) pro přípravu makrolidů obecného vzorce IX nebo IX', kde polohy 14 až 16 makrolidového kruhu obsahují zbytek obecného vzorce X

CH

OCH.

2’ 2 —CH—CH—CH—CH' 17 I 15 14

CH, • 00 00 0 00 00 • 0 00 00 00 0000

000 00 0 00 00

7 0 0 000 000 00 000 0 0 ' 0 0000 000

000 00 00 000 00 40 reakci sloučeniny obecného vzorce IX nebo IX' pro vnitřní chránění;

vii) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', reakci sloučeniny obecného vzorce IX nebo IX', kde polohy 14 až 16 makrolidového kruhu obsahují zbytek obecného vzorce X,

CH

CH₂)_:

-CH-CH—CH—CH*

17 I 15 14

CH, pro odstranění vnitřní chránící skupiny;

viii) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', kde R₅ je methyl, methylaci makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', kde Rs j e atom vodíku;

ix) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', ve kterém j e R₄ v O-chráněné formě, reakci makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', ve kterém je R₅ v O-nechráněné formě, pro zavedení O-chránící skupiny;

x) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', ve kterém je R₄ v O-nechráněné formě, reakci makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', ve kterém je R₅ v O-chráněné formě, pro odstranění O-chránící skupiny;

xi) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', který obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-chráněný hydroxyfenylalaninový zbytek, reakci makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', který obsahuje

0 00 00 · 00 00

00 0 0 0 0 00 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 00 • ··· 0 · · 9 9 000 0 0

0 0000 000

000 00 00 00» 00 00 v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-nechráněný hydroxyfenylalaninový zbytek, pro zavedení O-chránící skupiny;

xii) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', který obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-nechráněný hydroxyfenylalaninový zbytek, reakci makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', který obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-chráněný hydroxyfenylalaninový zbytek, pro odstranění O-chránící skupiny;

xiii) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', ve kterém -e-f- je skupina CH(OH)-CH(OH)-, oxidativní hydrolýzu makrolidu obecného vzorce IX nebo IX', ve kterém -e-f- je skupina -CH=CH-;

xiv) pro přípravu sloučeniny obecného vzorce V' nebo sloučeniny obecného vzorce XII, reakci sloučeniny obecného vzorce IX nebo IX' pro rozštěpení spojovací skupiny mezi spirobicyklo-skupinou a makrocyklickým kruhem;

xv) pro přípravu sloučeniny obecného vzorce R₆O-X-Y-Z-A-OH nebo obecného vzorce R₆O-X-Y-Z-A'-CH (OH) -L-S, otevření kruhu laktonového mostu makrocyklu obecného vzorce IV nebo makrocyklického kruhu sloučeniny obecného vzorce VIII;

xvi) pro přípravu makrolidu obecného vzorce IX nebo XII ve formě uzavřeného kruhu, reakci sloučeniny obecného vzorce R₆O-X-Y-Z-A-OH nebo obecného vzorce R₆O-X-Y-Z-A'-CH (OH)-L-S pro uzavření makrocyklického kruhu;

xvii) pro přípravu sloučeniny obecného vzorce XII nebo XII', reakci sloučeniny obecného vzorce IX nebo VI' pro • ·· 4« * 44 44

44 4 4 4 4 44 · 4 4 ·

4 44444 4 4 4 444 4 4

4 4 444 444

444 44 44 444 44 «4 otevření kruhu uvnitř spiro-bicyklického kruhového systému; a xiii) pro přípravu sloučeniny obecného vzorce IX nebo VI', reakci sloučeniny obecného vzorce XII nebo XII' pro uzavření kruhu uvnitř spirobicyklického kruhového systému.

26. Kmen aktinomycetes, který produkuje makrolid, ve kterém

i) jev polohách 2 až 6 makrocyklického kruhu připojen zbytek piperidazinylkarboxylové kyseliny; a/nebo ii) jev polohách 7 až 9 makrocyklického kruhu připojen zbytek aromatické a-aminokyseliny; a/nebo iii) je v polohách 10 až 12 makrocyklického kruhu připojen zbytek alifatické a-aminokyseliny.

27. Biologicky čistý izolát kmene Streptomyces sp. A92-308110 (DSM 9954) nebo mutantu, rekombinantu nebo jejich modifikované formy, která je schopna produkovat makrolid podle předkládaného vynálezu.

28. Způsob pro přípravu makrolidu podle předkládaného vynálezu vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci kmene Streptomyces sp. A92-308110 (DSM 9954) nebo mutantu, rekombinantu nebo jejich modifikované formy ve vhodném kultivačním prostředí a popřípadě izolaci Sanglifehrinu.

29. Způsob vyvolání imunosuprese u pacientů, kteří potřebují tuto léčbu, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání účinného množství činidla podle předkládaného vynálezu pacientům.

30. Způsob:

i) prevence akutního a/nebo chronického odmítnutí orgánu po alo- nebo xenotransplantaci, například pro léčbu • · • · • · • ··· • · příjemce transplantovaného orgánu všech konkrétních typů popsaných výše; nebo ii) prevence onemocnění transplantovaná tkáň versus příjemce, například u příjemců transplantované kostní dřeně; nebo iii) pro léčbu onemocnění autoimunitní reakce nebo pro

léčbu všech výše; nebo takových onemocnění nebo stavů uvedených ív) pro léčbu astmatu u pacientů, kteří takovou léčbu potřebují, vyznačuj i c i se tím, že zahrnuje podávání

účinného množství činidla podle předkládaného vynálezu pacientům.

31. Látka podle předkládaného vynálezu pro použití jako lék, například pro použití jako imunosupresiva nebo pro použití při léčbě všech onemocnění nebo stavů, které jsou uvedeny v části B výše.

32. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje činidlo podle předkládaného vynálezu ve spojení s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem.

33. Použití činidla podle předkládaného vynálezu pro přípravu léků pro použití jako imunosupresiva nebo pro použití při léčbě všech onemocnění nebo stavů, které jsou uvedeny pod B výše.

34. Použití sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, 8 až

10, 15 nebo 16 jako činidla pro substituční imunologický test sloučenin, které váží cyklosporiny nebo jiné cyklofiliny.