SK498A3

SK498A3 - Macrolides, a method for their preparation and a pharmaceutical composition containing the same

Info

Publication number: SK498A3
Application number: SK4-98A
Authority: SK
Inventors: Theodor Fehr; Lukas Oberer; Ryffel V Quesniaux; Jean-Jacques Sanglier; Walter Schuler; Richard Sedrani
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1995-07-04
Filing date: 1996-07-04
Publication date: 1998-07-08
Also published as: EP0836616A1; HUP9802320A3; CN1193979A; KR19990028724A; JPH11509092A; AU6519396A; NO980016L; NO980016D0; TR199800001T1; BR9609324A; AR006514A1; AU708004B2; CZ424297A3; PL324346A1; MX9800217A; WO1997002285A1; HUP9802320A2; IL122844A0; CO4750713A1; CA2224715A1

Description

Makrolidy, spôsob ich prípravy a farmaceutický prostriedok, kzorý ich obsahuje

Oblasť, techniky

Predložený vynález sa týka novej triedy makrolidov, ktoré majú cennú farmaceutickú a príbuznú aktivitu. Pre výhodné zlúčeniny tejto novej triedy makrolidov sa v predloženom vynáleze použi-, va spoločný názov Sanglifehríny.

Dotera~iší stav techniky

Prvý zo Sanglifehrínov bol mycetového kvasenia. Toto A až D izolovaný zo sú všeobecné živného vzorce bujónu aktinoSanglifehrínov

Ako môže byť zrejmé, makrocyklický kruh Sanglifehrínov A až D má úplne novú štruktúru, ktorá je charakterizovaná tým, že

i) v pozíciách 1 až 6 sa nachádza zvyšok 3-karboxypiperidazynylkarboxylove j kyseliny, ii) v pozíciách 7 až 9 je zvyšok aromatickej α-aminokyseliny a iii) v pozíciách 10 až 12 je zvyšok alifatickej α-aminokyseliny. Zvyšok makrocyklického kruhu sa skladá zo zvyšku hydroxykarboxylovej kyseliny, s podmienkou, že v prípade Sanglifehrínov A až D je v základnom makrocyklickom kruhu ďalších 11 atómov uhlíka.

V súlade s bežným postupom v chémii makrolidov ša atómy základného makrocyklického kruhu Sanglifehrínov číslujú tak, ako je naznačené vyššie pre Sanglifehrín A, pričom sa začína od atómu uhlíka karbonylovej skupiny makrocyklickej laktónovej spojky, ktorý má polohu 1.

Sanglifehríny A až D sú tiež charakterizované prítomnosťou nového bicyklického spirosystému pripojeného v polohe 23 makrocyklického kruhu pomocou uhľovodíkovej spojovacej skupiny.

Sanglifehríny A až D môžu byť podrobené značnej chemickej modifikácii za vzniku ďalších makrolidov triedy Sanglifehrínov. Medzi tieto modifikácie patrí rozštiepenie makrocyklického kruhu, predovšetkým v laktónovej oxyskupine, rozštiepenie spojovacej skupiny medzi makrolidom a spirocyklickým systémom a obmeny, napríklad chránenie, derivatizácia alebo ďalšie chemické úpravy substitučných skupín; napríklad, ako je opísané nižšie. Ďalšie spôsoby spracovania budú odborníkom v tejto oblasti zrejmé.

V súlade s predloženým vynálezom sa zistilo, že Sanglifehríny, predovšetkým tie, ktoré obsahujú spirocyklický systém, ako je prípad Sanglifehrínov A až D, majú charakteristické a úplne nové vlastnosti v zmysle ich biologickej aktivity. Predovšetkým sa zistilo, že vykazujú nasledujúcu kombináciu účinkov:

- väzobná aktivita k cyklofilínu;

- imunosupresívna aktivita;

- inhibícia bujnenia ako buniek B, tak buniek T;

- nemajú však väzobnú aktivitu k FK väzobnému proteínu alebo inhibičný vplyv na kalcineurín.

Sanglifehríny sú tiež zaujímavou a novou triedou imunosupresívnych a protizápalových zlúčenín. Najmä preto, že Sanglifehríny majú aktívne vlastnosti, ktoré sa líšia od predtým známych imunosupresívnych a protizápalových zlúčenín, ako sú cyklosporíny a makrolidy, napríklad rapamycín a trieda FK 506, čo naznačuje, že Sanglif ehríny pôsobia iným mechanizmom ako predchádzajúce zlúčeniny. Teda Sanglifehríny sú novou kategóriou liečebných látok ako v zmysle štruktúry, tak v zmysle aktivity, ktoré môžu byť. predpokladom k očakávaniu imunosupresívnych a/alebo protizápalových liečebných schopností; napríklad zabránenie alebo zníženie nežiadúcich vedľajších účinkov pri predchádzajúcich imunosupresívnych a protizápalových liečbach a/alebo zlepšenie alebo rozšírenie tejto terapie na nové skupiny ochorení alebo na nové kategórie pacientov.

Sanglif ehríny, napríklad v ktorých je makrolidový kruh v otvorenej forme, v ktorej sú obidve polohy 26 a 27 v uhľovodíkovej spojovacej skupine medzi makrolidom a spirocyklickým systémom hydroxylované, alebo v ktorých bol spiro-zvyšok pripojený k makrocyklickému kruhu rozštiepený alebo oddelený, všeobecne postrádajú niektoré alebo všetky aktivity charakteristické pre Sanglifehríny. Napríklad Sanglifehríny, v ktorých je spirozvyšok rozštiepený, majú typicky aktivitu na väzbu cyklofilínu ale nemajú významnú imunosupresívnu aktivitu. Ako však bude odborníkom v tejto oblasti zrejmé, tieto zlúčeniny poskytujú cenné zložky, medziprodukty alebo kľúčové stavebné bloky na prípravu ďalších nových Sanglifehrínov, a preto ďalej zvyšujú liečebný potenciál triedy Sanglifehrínov.

Keďže sa bicyklický spiro-systém tiež ukázal ako biologicky aktívny, napríklad u Sanglifehrínov A až D, môže byť považovaný za systém poskytujúci štruktúrnu zložku s kľúčovým biologickým významom, ktorá je užitočná ako štruktúrna zložka na ďalšiu derivatizáciu alebo modifikáciu, ako v zmysle prípravy ďalších Sanglifehrínov, tak na použitie pri obmenách alebo modifikáciách ďalších liečiv; napríklad na modifikáciu aktivity iných imunosupresívnych liečebných látok z triedy makrolidov.

Ako bolo naznačené, Sanglifehríny predstavujú novú triedu makrolidových zlúčenín, ktoré sú úplne nové a majú úplne charakteristickú štruktúru.

Preto prvý aspekt predloženého vynálezu poskytuje:

makrolid, v ktorom

i) je v polohách 2 a 6 makrocyklického kruhu pripojený zvyšok piperidazinylkarboxylovej kyseliny; a/alebo ii) je v polohách 7 až 9 makrocyklického kruhu pripojený zvyšok aromatickej a-aminokyseliny; a/alebo iii) je v polohách 10 až 12 makrocyklického kruhu pripojený zvyšok alifatickej a-aminokyseliny vo voľnej alebo chránenej forme, alebo vo forme ich soli.

Vhodné makrolidy podľa predloženého vynálezu obsahujú dva, s výhodou všetky tri charakteristické štruktúrne znaky i) , ii) a iii) .

Ako zvyšok piperidazinylkarboxylovej kyseliny je vhodný 1, 2-piperidazin-3-karboxy-l-yl zvyšok, ktorý obsahuje karboxylovú skupinu v polohe 1, a atóm dusíka 1 v polohe 6 makrocyklického kruhu, napríklad zvyšok so všeobecným vzorcom I:

kde vyznačené čísla predstavujú polohy atómov zvyškov na makrocyklickom kruhu. Tento zvyšok môže maú kruh substituovaný alebo nesubstituovaný. Vhodný je nesubstituovaný.

α-aminoskupina aromatického α-aminokyselinového zvyšku s výhodou obsadzuje polohu 9 makrocyklicklického kruhu. Vhodnou aromatickou a-aminokyselinou je fenylalanínový, osobitne 3-hydroxy-fenylalanínový zvyšok vo voľnej alebo chránenej forme.

α-aminoskupina alifatického α-aminokyselinového zvyšku s výhodou obsadzuje polohu 12 makrocyklického kruhu. Vhodnou alifatickou a-aminokyselinou je valínový zvyšok vo voľnej alebo chránenej forme.

Zvyšok makrocyklického kruhu vhodne obsahuje zvyšky hydroxykarboxylových kyselín, oxyskupiny, z ktorých sa skladajú makrocyklické laktónové spojovacie skupiny a karbonylové skupiny, ktoré tvoria amidovú spojovaciu skupinu s α-aminoskupinou v polohe 12 makrocyklického kruhu. Uvedené zvyšky hydroxykarboxylových kyselín majú dĺžku reťazca 6 až 20 atómov uhlíka, vhodnejšie 11 atómov uhlíka. Reťazec môže byť substituovaný alebo nesubstituovaný a/alebo obsahovať jednu alebo viac nenasýtených spojovacích skupín, predovšetkým kumulovaných dvojitých väzieb pozdĺž reťazca. Vhodnejšie zostávajúci makrocyklický kruh obsahuje 11-oxyendekanoyl-11-ylový zvyšok, s výhodou ll-oxy-6,8-endekadienoyl-ll-ylový vhodne substituovaný, napríklad v polohách Vhodnejšie je uvedený zvyšok hydroxykarbozvýšok, ktorý je 2, 3, 4 a/alebo 5 xylovej kyseliny so všeobecným vzorcom II:

R³ R⁴

R¹ R² O (CH₂)₂I I I I CH -ch₂-ch=ch-ch=ch-ch-c- ch-ch-codi:

CHa kde 1 ?

R a R sú atómy vodíka alebo predstavujú zvláštnu väzbu;

R je atóm vodíka;

R⁴ je skupina -CO-CH₃ alebo skupina -CH(OH)-CH₃ alebo

R³ a R⁴ spoločne predstavujú štruktúru so všeobecným vzorcom III :

ch₃

I

C- (III) och₃ vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme ich solí.

Výhodné makrolidy v súlade s predloženým vynálezom obsahujú makrocyklický kruh so všeobecným vzorcom IV:

(IV)

X-y-_Z kde skupiny X, Y a Z sú zvyšky i) , ii) a iii) , ktoré sú definované vyššie a skupina A je zvyšok hydroxykarboxylovej kyseliny, ktorý je definovaný vyššie vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme ich soli; vhodný je predovšetkým makrocyklický kruh so všeobecným vzorcom V:

vo voľnej forme alebo vo forme soli.

Všeobecne je v Sanglifehrínoch, ako sú Sanglifehríny A až D, makrocyklický kruh substituovaný na atóme uhlíka, ktorý je priľahlý k oxyskupine laktónového mosta. Tento substituent sa typicky skladá z 2-oxy-2'-áza-3¹-oxospirobicyklohexán-3-yl zvyšku, napríklad so všeobecným vzorcom VI:

Et kde

-a-b- je skupina -(Me)C=CH- alebo skupina -(Me)CH-CH(OH)- a f“

R³ je H alebo Me (kde Me a Et je metyl a etyl) vo voľnej alebo chránenej forme, alebo vo forme ich soli, pripojenej k makrolidovému kruhu pomocou spojky obsahujúcej lineárnu sekvenciu so 6 až 11, typicky s 9, atómami uhlíka medzi spiro-zvyškom a makroliaovým kruhom.

Spojovacia skupina môže byť substituovaná alebo nesubstituovaná a/alebo môže obsahovať, jednu alebo viac nenasýtených väzieb, predovšetkým kumulovaných dvojitých väzieb po celej dĺžke. Vhodne môže byť spojovacia skupina substituovaná metylovou skupinou, napríklad dvoma metylovými skupinami. Ďalej môže byť spojovacia skupina vhodne substituovaná hydroxylovou skupinou, napríklad troma hydroxylovými substituentmi a/alebo môže byť etylenicky nenasýtená, napríklad môže obsahovať dve dvojité väzby uhlík-uhlík. Vhodnejšie obsahuje spojovacia skupina zvyšky l-metyl-7-metylnonanoyl-9-ylu, najmä l-metyl-7-metylnonanoyl-9-ylu alebo 1-metyl-7-metyl-1,3-nonadienoyl-9-ylu, ktoré sú prípadne substituované, napríklad v polohách 3, 4 a/alebo 8. S výhodou má spojovacia skupina všeobecný vzorec VII:

R⁶ R⁷ CH₃

I I I (VII) c-CH₂-CH(OH)-CH(CH₃) — (CH₂)₂—CH-CH-CH=C-d kde c je väzba na spiro-zvyšok;

d predstavuje väzbu na makrocyklický kruh a R a R su hydroxylové skupiny alebo spoločne predstavujú ďalšiu väzbu vo voľnej alebo chránenej forme.

Spojovacia skupina bude spravidla pripojená k makrocyklickému kruhu na uhlíku, ktorý tesne susedí s laktónovou oxyskupinou, t. j. keď makrocyklický kruh obsahuje zvyšok 11-oxyendekanoyl-11-yl v polohe 11.

Predložený vynález preto poskytuje zlúčeniny so všeobecným vzorcom VIII:

S-L-M (VIII) kde

S predstavuje spirobicyklo-zvyšok, ako je definované vyššie,

L predstavuje spojovaciu skupinu, ako je definované vyššie, a

M predstavuje makrocyklický kruh, ako je definovaný vyššie, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.

Konkrétne zlúčeniny podľa predloženého vynálezu majú všeobecný vzorec IX:

xs 49

kde

-a-b- je definované vyššie;

-e-f- je skupina -CH(OH)-CH(OH)- alebo skupina -CH=CH-; -g-h- má rovnaký význam ako je definované vyššie pre skupinu -a-b-, a , R⁴ a r5 sú definované vyššie, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.

Zlúčeniny so všeobecnými vzorcami I až IX obsahujú asymetrické atómy uhlíka a preto môžu existovať v rade epimérnych foriem. Všetky možné epiméry, rovnako ako ich diastereoizomérne zmesi sú zahrnuté v predloženom vynáleze. Avšak zlúčeniny so všeobecnými vzorcami VIII a IX, v ktorých je makrolidový kruh v uzavretej forme a ktoré majú vhodnú stereochémiu, majú typickú aktivitu, ktorá je charakteristická pre Sanglifehríny, ako je spomenuté vyššie. Výhodné sú epiméry, ktoré majú aktivitu charakteristickú pre Saglifehríny. Zvyčajne budú, napríklad pre farmaceutické použitie v súlade s predloženým vynálezom, výhodné epiméry, ktoré majú aktivity charakteristické pre Sanglifehríny v čistej alebo pomerne čistej forme (t. j. bez alebo takmer bez epimérov, ktorým chýba aktivita charakteristická pre Sanglifehríny) , t. j. obsahujúce najmenej 90 % hmotnostných, napríklad 95 % hmotnostných aktívneho epiméru (t. j. obsahujúce menej ako 10 % hmotnostných, napríklad 5 % hmotnostných neaktívneho epiméru) .

S výhodou má zvyšok 3-karboxypiperidazinylkarboxylovej kyseliny

i) v polohách 1 až 6 makrocyklického kruhu nasledujúcu konformáciu:

S výhodou má aromatická aminokyselina ii) v polohách 7 až 9 makrocyklického kruhu L konfiguráciu, napríklad má konfiguráciu:

S výhodou má alifatická aminokyselina iii) v polohách 10 až 12 makrocyklického kruhu L konfiguráciu, napríklad má konfiguráciu:

A. i’ NH kΎ 12'

Ak zvyšok makrocyklického kruhu obsahuje zvyšok so všeobecným vzorcom II, má s výhodou konfiguráciu:

alebo

Ak R³ a R⁴ spoločne predstavujú ch₃

I

-οΙ och₃ majú s výhodou konfiguráciu:

CH_n

Zvyšok 2-oxy-2' ráciu:

ázy-3'-oxospirobicyklohexán-3-ylu

Me má konfiguMe b

t

O

Et kde, ak -a-b- je skupina so všeobecným vzorcom -(Me)CH-CH(OH)-, má s výhodou konfiguráciu:

HO^ ch₃

Ak má spojovacia skupina všeobecný vzorec VII, má táto skupina s výhodou konfiguráciu:

c n

Ak R° a R sú hydroxylové skupiny, konfigurácia v polohách 2 6 a 27 je s výhodou buď 26(S), 27(S) alebo 26(R), 27(R). Ak R^ *7 a R spoločne predstavujú ďalšiu väzbu, je konfigurácia v polohách 26 a 27 s výhodou:

H

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu so všeobecným vzorcom IX majú s výhodou nasledujúcu konformáciu:

«3 kde, ak -a-b- je skupina so všeobecným vzorcom -(Me)CH-CH(OH)-, má táto skupina s výhodou konfiguráciu:

HO.

CH.

ak

-e-f so všeobecným vzorcom je skupina

-CH(OH)-CH(OH)-, má táto skupina s výhodou konfiguráciu (S), (S) alebo (R) , (R) ;

ak -g-h- je skupina so všeobecným vzorcom (Me)CH-CH(OH)-, má táto skupina s výhodou konfiguráciu:

,0H

ch₃ ak -g-h- je skupina so všeobecným vzorcom -(Me)C=CH-, má táto skupina s výhodou konfiguráciu:

.H

CH.

a ak R³ a R⁴ sú spojené, majú s výhodou konfiguráciu:

Sanglifehrín A

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu môžu byú vo voľnej alebo chránenej forme, napríklad v chránených formách, ktoré sú opísané v Protective Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene a P. G. M. Wuts, druhé vydanie, vyd. John Wiley & Sons, New York. Hydroxylové skupiny môžu byú predovšetkým v chránenej forme, napríklad vo forme silyléterov (ako je opísané napríklad na stranách 68-86, Greene a Wuts, tiež tam), esterov (viď. napríklad strany 87-103, Greene a Wuts, tiež tam) a karbonátov (viď. napríklad strany 104-111, Greene a Wuts, tiež tam) . Medzi takéto chránené formy patria tiež vnútorne chránené formy; napríklad v prípade makrolidu so všeobecným vzorcom IX, kde -g-h- je skupina so všeobecným vzorcom -CH(CH₃)-CH(OH)-, v chránenej forme polohy 14 až 7 makrocyklického kruhu obsahujú zvyšok so všeobecný vzorcom X:

CH.

CK₂)₂

1S (X)

CH—CH—CH—CH' 17 I 15 14

CH.

napríklad s konfiguráciou

Takisto napríklad 1,3-dioly prítomné v Sanglifehrínoch môžu byú chránené ako vhodné cyklické štruktúry, napríklad ako je opísané na stranách 118-142, Greene a Wuts, ako je uvedené vyššie.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu existujú tiež vo forme solí. Príklady vhodných farmaceutický prijateľných solí na použitie v súlade s predloženým vynálezom zahrňujú kyslé a zásadité doplnkové soli, ktoré majú vhodný vzúah k jednotil16 vým substituentom prítomným v zlúčenine.

Ako bolo uvedené vyššie, makrocyklický kruh zlúčenín podľa predloženého vynálezu môže bytí rozštiepený, predovšetkým v laktónovej oxyskupine, za vzniku zlúčenín, kde makrocyklický kruh je v otvorenej forme. Zvyčajne sa štiepenie laktónovej oxyskupiny uskutočňuje pomocou hydrolýzy (solvolýzy), napríklad za vzniku zlúčenín so všeobecným vzorcom XI:

R⁶-X-Y-Z-A-OH (XI) napríklad so všeobecným vzorcom XII:

R⁶0 '0

NH

Ň-CO-CH-NH—CO“CH—NH—A OH

HO

CK.

(XII)

CH,

Cľ-k napríklad zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX':

kde X, Y, Z, A, R³, R⁴ a R³ sú definované vyššie a R³ je atóm vodíka alebo alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka, napríklad metylová skupina.

Tieto formy s otvoreným kruhom poskytujú medziprodukty určené na modifikáciu základného makrocyklického kruhu Sanglifehrínu a sú tiež súčasťou predloženého vynálezu.

Preto ďalší aspekt predloženého vynálezu poskytuje:

- makrolid, ktorý bol definovaný vyššie, vo forme otvoreného kruhu; uvedený makrocyklus s otvoreným kruhom je vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli;

- zlúčeninu so všeobecným vzorcom R^O-X-Y-Z-A-OH, ako bola definovaná vyššie, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli;

zlúčeninu so všeobecným vzorcom R^O-X-Y-Z-A'-CH(OH)-L-S, kde skupina so všeobecným vzorcom -A'-CH(OH)- je zvyšok hydroxykarboxylovej kyseliny, napríklad zvyšok so všeobecným vzorcom II, ako bol definovaný vyššie, a ďalšie symboly sú rovnaké, ako boli definované vyššie, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli;

R⁶0 zlúčeninu so všeobecným vzorcom XII'

CO

NH i

N CO-CH-ΝΉ—CO”CH—NH

HO

CH

A' —CH-L i

OH (xii') vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli;

- zlúčeninu so všeobecným vzorcom IX''

vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.

Predložený vynález zahrňuje tiež zlúčeniny, v ktorých 2-oxy-2 ' -áza-3 ' -oxo-3 ¹ -ylspirobicyklohexánový cyklický systém je vo forme otvoreného kruhu, napríklad zlúčenina so všeobecným vzorcom XII:

kde a, b, L a M sú definované vyššie vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu s otvoreným kruhom majú s výhodou rovnakú konformáciu ako je konformácia výhodných zlúčenín s uzavretým kruhom. Spirobicyklický kruhový systém s otvoreným kruhom zlúčenín so všeobecným vzorcom XII má s výhodou konformáciu:

Me

Me'

o nh₂ kde, ak -a-b- je skupina so všeobecným vzorcom -(Me)CH-CH(OH)-, má táto skupina s výhodou konfiguráciu:

Makrolidy v súlade s predloženým vynálezom, ktoré majú spirobicyklo- zvyšok pripojený k makrocyklickému kruhu, môžu tiež reagovať pri štiepení spojovacej skupiny, napríklad, ak ide o zlúčeninu so všeobecným vzorcom IX, hlavne na väzbe medzi zvyškami 26 a 27 za vzniku samostatných nových spirobicyklických zlúčenín a ďalších makrolidov. Ako bolo naznačené vyššie, tieto zlúčeniny sú takisto využiteľné ako medziprodukty; spirobicyklické časti Sanglifehrínov majú najmä integrálnu funkčnú úlohu pri biologickej aktivite Sanglifehrínov ako triedy.

Preto predložený vynález poskytuje:

2-oxy-2 '-áza-3 '-oxo-3 '-ylspirobicyklohexán, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli, predovšetkým zlúčeninu so všeobecným vzorcom VI¹:

Me

Me (vi -)

Et •-7 kde skupina R je prípadne chránená hydroxylová skupina, reaktívna funkčná skupina alebo skupina so všeobecným vzorcom -CH₂-CH(OH)-CH(CH₃)-CH₂-CH₂-CHO alebo jej delta laktonový ekvivalent, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.

Výhodne má zlúčenina so všeobecným vzorcom VI' nasledujúcu konfiguráciu:

kde, ak -a-b- je skupina so všeobecným vzorcom -(Me)CH-CH(OH)-, má táto skupina s výhodou konfiguráciu:

OS

Predložený vynález ďalej zahrňuje otvorený kruh 2-oxy-2'-áza-3'-oxo-3'-ylspirobicyklohexánu, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli, predovšetkým zlúčeninu so všeobecným vzorcom XII':

(XII¹) kde a, b a R⁷ sú definované vyššie vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli. Spirobicyklický kruhový systém s otvoreným kruhom zlúčenín so všeobecným vzorcom XII' má s výhodou konformáciu:

X ^CH3

Predložený vynález ďalej poskytuje makrolid so všeobecným vzorcom XIII:

CH.

.CO (XIII) kde M je makrolidový kruh definovaný vyššie, najmä so všeobecným vzorcom XIV:

(XIV) ktorý má s výhodou konformáciu:

kde, ak -g-h- je -(Me)CH-CH(OH)-, má táto skupina so všeobecným vzorcom skupina s výhodou konfiguráciu:

a keď -g-htáto skupina je skupina so všeobecným vzorcom s výhodou konfiguráciu:

(Me)C=CH-, má

CH, a keď R³ a R⁴ sú spojené, majú s výhodou konfiguráciu:

CHj och₃ vo voľnej alebo chránenej forme otvoreného kruhu alebo vo forme soli.

Ďalší aspekt predloženého vynálezu obsahuje makrolidy a zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, hlavne zlúčeniny, ktoré sú prírodnými produktami v látkovo čistej forme, napríklad obsahujú najmenej 9 0 % hmotnostných, s výhodou najmenej 95 % hmotnostných, predovšetkým najmenej 98 % hmotnostných čistej formy.

Okrem uvedeného, predložený vynález poskytuje tiež postup prípravy všetkých zlúčenín podľa predloženého vynálezu, ako boli definované vyššie, ktorý zahŕňa:

i) na prípravu Sanglifehrínov A, B, C a D, kultiváciu kmeňa aktinomycét produkujúceho Sanglifehrín A, B, C alebo D v kultivačnom prostredí a izoláciu požadovaného Sanglifehrínu A, B, C, alebo D zo získaného roztoku kultúry;

ii) na prípravu Sanglifehrínov C a D cyklizáciu

Sanglifehrínov A a B v polohách 15 a 16;

iii) na prípravu Sanglifehrínov A a B otvorenie laktónového kruhu Sanglifehrínov C a D v polohách 5 a 16;

iv) na prípravu makrolidov so všeobecným vzorcom IX alebo IX', kde -g-h- je skupina CfCH^^CH-, dehydratáciu zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX alebo IX¹, kde -g-hje C(CH^)-CH(OH)- alebo jeho chránenej formy;

v) na prípravu makrolidu všeobecného vzorca IX alebo IX', kde R⁴ je CH(OH)-CH3, hydrogenáciu zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX alebo IX', kde R⁴ je C(O)-CH3;

vi) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', kde polohy 14 a 16 makrolidového kruhu obsahujú zvyšok so všeobecným vzorcom X:

CH

CH,),

I —CH—CH—CH—CHI 15 14

CH(X) reakciu zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX alebo IX'na vnútorné chránenie;

vii) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX¹, reakciu zlúčeniny všeobecného vzorca IX alebo IX', kde polohy 14 až 16 makroliaového kruhu obsahujú zvyšok so všeobecným vzorcom X

CH.

CH.J₂ (X) lá

-CH“ CH—CH—CH' 17 I 15 u

CH.

na odstránenie vnútornej chrániacej skupiny;

viii) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', kde R⁵ je metyl, metyláciu makrolidu so

C všeobecným vzorcom IX alebo IX', kde R je atóm vodíka;

ix) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', v ktorom je R⁴ v O-chránenej forme, reakciu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX' , v ktorom je r5 v O-nechránenej forme, na zavedenie O-chrániacej skupiny;

x) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX,'v ktorom je R⁴ v O-nechránenej forme, reakciu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX¹, v ktorom je R⁵ v O-chránenej forme, na odstránenie O-chrániacej skupiny;

xi) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX' , ktorý obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-chránený hydroxyfenylalanínový zvyšok, reakciu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', ktorý obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-nechránený hydroxyfenylalanínový zvyšok, na zavedenie O-chrániacej skupiny;

xii) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX' , ktorý obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-nechránený hydroxyf enylalanínový zvyšok, reakciu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', ktorý obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-chránený hydroxyf enylalanínový zvyšok, na odstránenie O-chrániacej skupiny;

xiii) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', v ktorom -e-f- je skupina CH(OH)-CH(OH) -, oxidatívnu hydrolýzu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', v ktorom -e-f- je skupina -CH=CH-;

xiv) na prípravu zlúčeniny so všeobecným vzorcom V alebo zlúčeniny so všeobecným vzorcom XII, reakciu zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX alebo IX'na rozštiepenie spojovacej skupiny medzi spirobicyklo-skupinou a makrocyklickým kruhom;

xv) na prípravu zlúčeniny so všeobecným vzorcom

R^O-X-Y-Z-A-OH alebo so všeobecným vzorcom R^O-X-Y-Z-A' -CH(OH)-L-S, otvorenie kruhu laktónového mostu makrocyklu so všeobecným vzorcom IV alebo makrocyklického kruhu zlúčeniny so všeobecným vzorcom VIII;

xvi) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo XII vo forme uzavretého kruhu, reakciu zlúčeniny so

C všeobecným vzorcom R O-X-Y-Z-A-OH alebo so všeobecným vzorcom R⁶O-X-Y-Z-A'-CH(OH)-L-S na uzavretie makrocyklického kruhu;

xvii) na prípravu zlúčeniny so všeobecným vzorcom XII alebo XII', reakciu zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX alebo VI¹ na otvorenie kruhu vo vnútri spirobicyklického kruhového systému; a xviii) na prípravu zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX alebo VI¹, reakciu zlúčeniny so všeobecným vzorcom XII alebo XII' na uzavretie kruhu vo vnútri spirocyklického kruhového systému

Postupy podľa predloženého vynálezu môžu byť uskutočnené napríklad ako je opísané v príkladoch. Ako bude vyzdvihnuté ďalej , vyššie definované sa môžu aplikovať v akomkoľvek vhodnom poradí alebo kombinácii pričom sa získajú iné makrolidy vo voľnej forme, chránenej forme, vo forme s otvoreným kruhom a vo forme s uzavretým kruhom, ako bolo opísané vyššie.

Makrolidy podľa predloženého vynálezu, napríklad Sanglifehríny A až D sú prírodné zlúčeniny, alebo sú od nich odvodené, ktoré sa typicky získavajú z rôznych zástupcov skupiny Streptomycetaceae.

Mikroorganizmy schopné produkovať makrolidy, ako je definované vyššie, neboli predtým identifikované.

Preto ešte ďalší aspekt predloženého vynálezu poskytuje:

- kmeň aktinomycét produkujúcich makrolidy, kde makrolidom je zlúčenina, v ktorej

i) je v polohách 2 až 6 makrocyklického kruhu pripojený zvyšok piperidazinylkarboxylovej kyseliny; a/alebo ii) je v polohách 7 až 9 makrocyklického kruhu pripojený zvyšok aromatickej α-aminokyseliny; a/alebo iii) je v polohách 10 až 12 makrocyklického kruhu pripojený zvyšok alifatickej a-aminokyseliny

- kmeň Aktinomycét produkujúci Sanglifehrín A, B, C alebo D.

Vhodne je kmeň aktinomycét zástupcom skupiny Streptomycetaceae, vhodnejšie patrí do rodu Streptomyces, predovšetkým do kmeňa Streptomyces sp. A92308110, ako je opísané nižšie, alebo je od nich odvodený, napríklad vrátane mutantov, variantov, fúzantov, kombinácií alebo ich modifikovaných foriem.

Vhodne sú kmene podľa predloženého vynálezu biologicky čisto oddelené.

Napríklad Streptomyces sp. A92308110 môže byt podrobený mutácii alebo môže byť modifikovaný na iné formy pomocou bežných technológií, napríklad pomocou UV žiarenia alebo spracovaním pomocou chemického mutagénu ako je N-metyl-N¹-nitronitrózo-guanidín. Rekombinované klony sa môžu získať pomocou protoplastovej fúzie. Všetky takéto mutanty a rekombinanty alebo modifikované formy, ktoré sú schopné produkovať. Sanglifehríny, vrátane mutantov a rekombinantov schopných produkovať zvýšené množstvo Sanglifehrínov, sú súčasťou predloženého vynálezu.

V konkrétnom uskutočnení podľa predloženého vynálezu sa Sanglif ehríny A, B, C a D izolujú z nového Streptomyces sp. A92308110. Vzorky Streptomyces sp. A92308110 boli uložené v Deutche Sammlung von Mikroorganizmen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, SRN, 3. 5. 1995 podľa Budapeštianskej zmluvy a boli označené depozitným číslom DSM 9954. Vzorky Streptomyces sp. A92308110 sa môžu tiež získať od Sandoz Ltd. CH-4002 Basel, Switzerland.

Ako poznámku uvádzame, že prístup k vzorkám DSM 9985 je obmedzený v súlade s opatreniami článku 28 (4) a (5) EPC.

Izolácia Sanglif ehrínov A, B, C a D z kultúr Streptomyces sp. A92308110 je opísaná v Príklade 2.

Kmeň Streptomyces sp. A92308110 patrí do rodu Streptomyces v súlade s opisom v Bergey's Manual (Diel 4, Williams a Wilkins, Baltimore) a The Prokaryotes (1992 Springer Verlag, New York). Bunkové steny obsahujú kyselinu

LL-diaminopimelovú. Mastné kyseliny sú izo- a anteizo- rozvetvené, priame a nenasýtené. Spektrum cukru nie je zreteľné.

Rastové podhubie sa nedrví na kúsky. Vzdušné podhubie tvorí dlhé reťazce výtrusov.

V súlade s odkazmi na knihy, ktoré sú citované vyššie, kmeň označený v rôznom oríoadov

A92308110 je organickom a tvorí vzdušné nový Streptomyces. A92308110 rastie anorganickom prostredí a vo väčšine podhubie. Primárny substrát podhubia rastie ako hýfa a býva obyčajne sivohnedý. Farba vzdušného podhubia patrí do sivej série, číslo 4, a toto podhubie tvorí dlhé reťazce výtrusov, ktoré patria do typu spira b.

Schopnosť Streptomyces sp. A92308110 rásť v použiteľných biologických prostrediach, využitie ich schopnosti odbúravať uhlík a ich fyziologické charakteristiky sú uvedené v nasledujúcich tabuľkách.

Tabuľka 1. Rast v rôznych biologických prostrediach

Kultivačné prostredie__ Charakteristika kultúry

Kvasnicový extrakt/ sladový agar

Ovsený agar rast: dobrý substrátové podhubie: tmavohnedé vzdušné podhubie: sivohnedé rozpustné farbivo: žiadne rast: dobrý substrátové podhubie: tmavohnedé vzdušné podhubie: sivohnedé rozpustné farbivo: hnedasté

Glukóza-asparagín

Anorganické soli/ škrobový agar

Sacharóza/ dusičnanový agar rast: priemerný substrátové podhubie: sivé vzdušné podhubie: sivohnedé rozpustné farbivo: žiadne rast: priemerný substrátové podhubie: sivé vzdušné podhubie: sivohnedé rozpustné farbivo: žiadne rast: veľmi zlý substrátové podhubie: belavé vzdušné podhubie: zlé, sivohnedé rozpustné farbivo: žiadne

Glycerol/ asparagínový agar rast: priemerný substrátové podhubie: sivé

Živný agar vzdušné podhubie: sivohnedé rozpustné farbivo: žiadne rast: priemerný substrátové podhubie: béžové vzdušné podhubie: žiadne rozpustné farbivo: hnedé

Tabuľka 2: Využitie uhlíka

Stredné alebo dobré: glukóza, fruktóza, arabinóza, xylóza, manóza

Zlé: ramnóza, sacharóza, rafinóza, celulóza, salicín

Negatívne: m-inozitol

Tabuľka 3: Fyziologické charakteristiky

Redukcia dusičnanu: Hydrolýza škrobu:

Degradácia tyrozínu Štiepenie bielkovín mlieka:

Tvorba melanínu: Teplota rastu:

pozitívna stredná na agare z anorganických solí - škrobu negatívna na ovsenom agare negatívna pozitívne pozitívna

18-37 °C

Veľmi zlý rast pri 13 °C. Žiadny rast pri 45 °C.

Rozmedzie pH: bohatý rast pri pH 5 a 7, dobrý rast pri pH 9 NaCl: odolnosť proti do 6 % hmotnostných, ale znížený rast už pri 2 % hmotnostných koncentrácie

Makrolidy podľa predloženého vynálezu, zahrňujúce Sanglifehríny A, B, C a D, sa môžu pripravovať pomocou kultivácie Streptomyces sp. A92308110 alebo jeho mutanta, rekombinanta alebo modifikovaných foriem vo vhodnom kultivačnom prostredí. Príklad 1 opisuje postup kultivácie Streptomyces sp. A92308110, čo iba ilustruje predložený vynález.

Preto ďalšie aspekty predloženého vynálezu zahrňujú:

a) izoláciu biologicky čistého kmeňa Streptomyces sp. A92308110 (DSM 9954) alebo jeho mutanta, rekombinanta alebo modifikovanej formy, ktorá je schopná produkovat makrolid podľa predloženého vynálezu, a

b) spôsob prípravy makrolidu podľa predloženého vynálezu, ktorý zahrňuje kultiváciu Streptomyces sp. A92308110 (DSM 9954) alebo jeho mutanta, rekombinanta alebo modifikovanej formy vo vhodnom kultivačnom prostredí, prípadne so získaním Sanglifehrínu.

Makrolidy v súlade s predloženým vynálezom, napríklad zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX; napríklad Sanglifehríny A, B, C a D a ich farmaceutický prijateľné soli, ďalej všeobecne nazývané ako činidlá podľa predloženého vynálezu, vykazujú aktivity charakteristické pre Sanglifehríny, t.j. nasledujúcu kombináciu aktivít:

- majú väzobnú aktivitu k cyklofilínu

- majú imunosupresívnu aktivitu inhibujú bujnenie ako buniek B, tak aj buniek T;

- nemajú väzobnú aktivitu k FK väzobnému proteínu, a

- neinhibujú aktivitu kalcineurínu

Tieto aktivity a testy na zistenie týchto aktivít šú podrobnejsie opísané nižšie, predloženého vynálezu, vzorcom IX, napríklad

Biologická aktivita makrolidov podľa napríklad zlúčeniny so všeobecným Sanglifehrínov A až D, môže byt:

demonštrovaná pomocou štandardných in vitro a in vivo testovacích metód, napríklad,·ako je opísané nižšie.

1. Primárne humorálne imunitné reakcie na bunky červených krviniek oviec

Bunky sleziny myší (OF l, samice, 8-10 týždňov, l x 10⁷) sa kultivujú spolu s červenými krvinkami oviec (SRBC, 3 x 10⁷) tri dni v 1 ml celkového objemu na 24-jamkovej doske. Lymfocyty sa oddelia, premyjú a umiestnia na mäkký agar s čerstvým antigénom (SRBC) pri hustote 1 x 10^ buniek. Po 60 až 90 minútach sa pridá doplnok (sérum morčaťa) a inkubácia pokračuje ďalších 60 minút, po ktorých sa test vyhodnotí spočítaním škvŕn (mikroskop). V priebehu troch dní inkubácie sa lymfocyty znecitlivia na antigén (SRBC). Keď sa inkubujú s antigénom znova, vylučujú B-lymfocyty špecifickú protilátku, ktorá sa viaže k antigénu v blízkosti vylučujúceho lymfocytu. Pridanie doplnku spôsobí prasknutie bunkovej membrány červených krviniek obalených protilátkou, pričom vzniknú škvrny. Každá škvrna predstavuje jednu bunku produkujúcu protilátku.

Inhibícia tvorby škvŕn je jedným z farmaceutických využití. Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, napríklad Sanglifehríny A až D, sú pri tejto skúške aktívne.

Odkazy:

R. I. Mishell & R. V. Dutton (1996): Immunization of normál mouse spleen celí suspension in vitro. Science 153:1004-1006.

R. I. Mishell & R. V. Dutton (1996): Immunization of dissociated mouse spleen celí culture from normál mice. J. Exp. Med. 126:423-442.

. Proliferačná odozva lymfocytov na alogénne dráždenie

Dva spôsoby MLR (reakcia zmiešaných myších lymfocytov):

Bunky sleziny (2 x 10^) Balb/c myši (samice, 8 až 10 týždňov) sa štyri dni inkubujú spolu s bunkami sleziny CBA myši (2 x 10⁵; samice, 8 až 10 týždňov) . Alogénne bunky spôsobia protilátkovú odozvu populácie buniek sleziny, ktorá sa meria pomocou inkorporácie označeného prekurzoru do DNA. Makrolidy podľa predloženého vynálezu, napríklad zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX a ich farmaceutický prijateľné soli, napríklad

Sanglifehríny A, B, C a D, majú IC₅₀ v rozmedzí od 30 do 200 nm v porovnaní s IC_5Q okolo 20 nm u cyklosporínu A, keď sa testuje pomocou tohto testu.

Odkazy:

T. Meo (1979) : The MLR in the mouse. V Immunological Methods, L. Lefkovits a B. Pernis, vyd. Academic Press, N. Y., str. 227-239.

3. B bunky myší dráždené LPS

Bunky sleziny (2 x 10$) myši CBA sa inkubujú 48 hodín s 50 gg/ml LPS s testovanou zlúčeninou. Bujnenie sa meria pomocou inkorporácie označeného prekurzoru do DNA. Makrolidy podľa predloženého vynálezu, napríklad zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX a ich farmaceutický prijateľné soli, napríklad Sanglifehríny A, B, C a D, inhibujú bujnenie B buniek a majú ICgQ v rozmedzí 40 až 100 μΜ.

Odkazy:

M. F. Greaves, J. Janossy (1972): Elicitation of selective T and B lymphocyte response by celí surface binding ligands. Transplant Rev., 11:87.

G. Janossy, M. F. Greaves (1971): Lymphocyte activation I, Response of T and B lymphocytes to phytomitogens. Clin. Exp. Immunol. 9:483-498.

4. Cytotoxická a cytostatická aktivita pri použití radu THP1 buniek

Cytotoxicita sa určí pomocou ľudského monocytového radu buniek THP1 (5 x 10⁴ buniek/jamka), ktoré sa inkubujú v prítomnosti IFNt (100 U/ml) a LPS (5 μg/ml) a testovanej zlúčeniny (do 100 μΜ) 24 až 72 hodín pri teplote 37 °C. Množstvo živých buniek sa určí pomocou kalorimetrického odčítania MTT, pomocou ktorého sa meria enzymatická aktivita mitochOndriálnej dehydrogenázy v živých bunkách (Mossman, 1983) . Makrolidy podľa predloženého vynálezu, napríklad zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX a ich farmaceutický prijateľné soli, napríklad Sanglifehríny A, B, C a D majú ICg₀ v rozmedzí 1000 až 5000 nM po 24 hodinách inkubácie pri tomto teste.

Odkazy:

Mossman, T. J. (1983): Rapid calorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxic assays. J. Imm. Methods 65, 55-63.

5. Uvoľňovanie TNF mnoho jadrovými bunkami ľudskej periférnej krvi

Mnoho jadrové bunky sa pripravia z periférnej krvi zdravých dobrovoľníkov pri použití Ficoll-Hypaque hustotného delenia podľa postupu Hansella a koľ., 1991. Bunky (ZLO⁴ buniek/jamka v 200 μΐ RPMI 10 % objem. FCS) sa inkubjú s radom riedení testovaných zlúčenín 30 minút pri 37 °C pred pridaním stimulantu. Interferón r (100 U/ml) a LPS(5 gg/ml) sa používajú ako stimulanty na uvoľnenie nádorového nekrózneho faktoru (TNF) (oi) mononukleárnymi bunkami periférneho obehového systému. Po troch hodinách inkubácie sa bunky odstredia (10 minút pri 1200 ot./minútu) a oddelia sa supernatanty. Množstvo TNF prítomného v supernatante buniek sa určí pomocou komerčne dostupnej enzýmovej imunosorbčnej testovacej súpravy. Makrolidy podľa predloženého vynálezu, napríklad zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX a ich farmaceutický prijateľné soli, napríklad Sanglif ehríny A, B, C a D majú pri testovaní pomocou tejto skúšky IC₅₀ ^{v rozm}edzí 200 až 1000 nm.

. Skúška viazania cyklofilínu

Vhodná skúška viazania cyklofilínu je kompetitívny ELISA test opísaný Quesniaux v Eur. J. Immunol. 17, 1987,. 1359-1365. Pri tomto teste sa testované zlúčeniny pridávajú v priebehu inkubácie cyklofilínu (rekombinant ľudského cyklofilínu A) s potiahnutým BSA-cyklosporínom A a potom sa vypočíta požado34 vaná koncentrácia pre 50 % inhibiciu kontrolnej reakcie bez konkurenta a to je hodnota IC₅q. Alternatívnou skúškou je kompetitívny väzobný test opísaný Schneiderom a kol. v Biochemistry 33, 1994, 8218-8224, ktorý zahŕňa pridanie testovanej zlúčeniny v priebehu inkubácie biotinylovaného cyklofilínu (rekombinant ľudského cyklofilínu A) s potiahnutým BSA-cyklosporínom A. Množstvo biotinylovaného cyklofilínu viazaného v prítomnosti a neprítomnosti testovanej zlúčeniny sa určí pomocou inkubácie s alkalickou fosfatázou spojenou so streptaviaínom. Makrolidy podľa predloženého vynálezu, napríklad zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX a ich farmaceutický prijateľné soli, napríklad Sanglif ehríny A, B, C a D, majú pri testovaní pomocou tejto skúšky IC^q v rozmedzí 10 až 100 nm, v porovnaní s IC₅₀ cyklosporínu A okolo 80 nm, ak je testovaný pomocou tejto skúšky.

Ďalšie in vitro skúšky, ktoré sa môžu použiť na demonštráciu biologickej aktivity Sanglifehrínov sú IL-2 referenčné génové skúšky a testy buniek sleziny stimulovaných ConA (vykazujúcim účinok na aktiváciu T buniek).

Makrolidy podľa predloženého vynálezu, napríklad zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX, napríklad Sanglif ehríny A, B, C a D, nemajú väzobnú aktivitu na proteín FK alebo inhibičnú aktivitu a neinhibujú aktivitu kalcineurínu, ak sú testované pomocou štandardných skúšok na túto aktivitu.

7. Lokalizovaná reakcia implantát versus hostiteľ (GvH) u potkanov [Ford a kol., TRANSPL. PROC. 10 (1989), 258]

Bunky sleziny (1 x 10⁷) šesť týždňov starých samíc potkanov Wistar/Furth (WF) boli pomocou injekcie podkožné podávané v 0. dni do ľavej zadnej tlapky samíc potkanov (F344 x WF) Fvážiacich asi 100 g. Zvieratá boli liečené štyri po sebe nasledujúce dni a v 7. dni sa im odobrala a odvážila lymfatická uzlina. Rozdiel medzi hmotnosťou dvoch lymfatických uzlín sa považoval za parameter na zhodnotenie reakcie.

Inhibícia GvH reakcie vo vyššie opísanom teste je príkladom farmaceutického využitia. Makrolidy podľa predloženého vynálezu, napríklad zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX a ich farmaceutický prijateľné soli, napríklad Sanglifehríny A, B, C a D sú pri podávaní dávky asi 1 mg/kg podkožné schopné obmedziť GvH reakciu maximálne o 30 %.

8. DTH vyvolané bunkami SRBC-T_H μΐ zmesi 1:1 (objem/objem) Tjj (bunky červených krviniek

Zľ oviec) bunkového klonu (2 x 10 ) a 10 % hmotnostných suspenzie buniek červených krviniek oviec (SRBC) sa pomocou injekcie podávalo podkožné do chodidla pravej zadnej končatiny samiciam myší C57 BL/6 (šesť až dvanásť-týždňových). Do ľavého zadného chodidla (aby bolo možné merať nešpecifický rast opuchu labky spôsobeného injekciou) sa pomocou injekcie podalo podkožné 50 μΐ suspenzie buniek červených krviniek oviec (SRBC) (zriedených 1 : 1 objem/objem s PBS). 0 24 hodín neskôr sa zmerala hrúbka pravého a ľavého zadného chodidla.

Vypočítal sa percentuálny rast hrúbky pravého chodidla oproti ľavému chodidlu (z). Hrúbka pravého chodidla = x; hrúbka ľavého chodidla = y; percentuálny špecifický rast = z z = ((x-y)/y).100

Makrolidy podľa predloženého vynálezu, napríklad zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX a ich farmaceutický prijateľné soli, napríklad Sanglifehríny A, B, C a D, znižujú opuch DTH myší o maximálne 50 % pri dávkovaní 5 mg/kg podkožné.

Odkazy:

A.T.J. Bianchi, H. Hooijkaas, R. Brenner, R. Tees, A.A. Nordin a M.H. Schreier (1981): Clones of helper T-cells mediate antigén specific, H-2 restricted DTH. Náture 290:62-63.

P. Herrmann, M.H. Schreier, J.-F. Borel a C. Freuer (1988) : Mast celí degranulation as a major event in the effector phase of delayded-type hypersensitivity induced by cloner helper T cells. Int. Archs Allergy appl. Immun. 86:102-105.

. Alotransplantácia srdca potkana/myši

In vivo účinok makrolidov podľa predloženého vynálezu sa hodnotil pri alotransplantácii srdca potkana a myši pri použití osmotickej minipumpy na podkožné podávanie. Pri alotransplantácii srdca myši (BALB/c až C3H), makrolidy podľa predloženého vynálezu, napríklad zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX farmaceutický vhodné soli, napríklad Sanglifehríny

A, B, C a D, predlžujú prežívanie myší po transplantácii pri podávaní 30 mg/kg/deň. Pri alotransplantácii srdca potkana (od DA pre Lewis) liečenie pomocou menej ako optimálnej dávky cyklosporínu A v kombinácii s makrolidmi podľa predloženého vynálezu, napríklad zlúčeninami so všeobecným vzorcom IX a ich farmaceutický prijateľnými solárni, napríklad Sanglifehrínmi A,

B, C a D, predlžuje prežívanie transplantovaného potkana, ako je uvedené v tabuľke nižšie.

Cyklosporín A Sanglifehrín A Prežívanie transpl. potkana (mg/kg) (mg/kg) (dni)

- 12, 12, 12, 13, 13, 14

10 29, 30, 45, 48, >51 , >46

Kontrola (placebo) Kontrola (placebo) Kontrola (placebo)

Činidlá podľa predloženého vynálezu sú využiteľné ako farmaceutické prostriedky, napríklad ako imunosupresíva rovnako ako protizápalové činidlá.

Využiteľné sú predovšetkým pri prevencii akútneho a/alebo chronického odmietnutia orgánu alebo tkaniva pri alo- alebo xenotransplantácii, napríklad pri liečení príjemcu po transplantácii srdca, pľúc, kombinácie srdca a pľúc, pečene, obličiek, pankreasu, kože alebo rohovky. Sú tiež vhodné pri prevencii ochorenia transplantát versus hostiteľ, ako sú následky po transplantácii kostnej drene.

artritída, artritída) ochorenia, predloženého

Činidlá podľa predloženého vynálezu sú tiež využiteľné pri liečení autoimúnneho ochorenia a zápalových stavov, predovšetkým zápalových stavov s etiológiou obsahujúcou autoimúnne zložky ako je artritída (napríklad reumatická postupujúca chronická artritída a deformujúca a reumatické ochorenia. Špecifické autoimúnne pre ktoré môžu byt využité činidlá podľa vynálezu zahrňujú autoimúnne hematologické poruchy (medzi ktoré patria napríklad hemolytická anémia, aplastická anémia, čistá anémia červených krviniek a idiopatický nedostatok krvných doštičiek periférnej krvi), systémové erytematózne vredy, polychondritída, sklerodermia, Wegenerova granulomatóza, dermatomyozitida, chronická aktívna hepatitída, myasténia gravis, lupienka, Steven-Johnsonov syndróm, idiopatický syndróm malabsorbcie, autoimúnne zápalové ochorenie čriev (vrátane napríklad vredovitého zápalu časti hrubého čreva a Crohnovej choroby), endokrinná oftalmopatia, Gravesove ochorenie, sarkoidóza, viacnásobná skleróza, primárna biliárna cirhóza, diabetes mellitus I, uveitída (predná a zadná), keratokonjuktivitída (suchá a jarná) a/alebo alergická keratokonjuktivitída, intersticiálna fibróza, psoriatická artritída, glomerulonefritída (s a.bez nefrotického syndrómu, napríklad zahrňujúca idiopatický nefrotický syndróm alebo nefropatie s minimálnou zmenou) a astma.

Pri týchto a iných využitiach môžu predloženého vynálezu podávané osobitne imunosupresívami alebo protizápalovými bytí zlúčeniny podľa alebo v zmesi s inými látkami, zahrňujúcimi cyklosporíny, rapamycíny, FK 506 a steroidy.

Pre vyššie uvedené indikácie sa bude vhodná dávka a výber činidla podľa predloženého vynálezu samozrejme menití v závislosti napríklad od liečeného pacienta, spôsobu podávania a povahe a závažnosti stavu pacienta. Zvyčajne sa uspokojivé výsledky u zvierat dosiahli pri denných dávkach od približne 0, 01 do 10 mg/kg/deň pri orálnom podávaní. U väčších cicavcov, napríklad u človeka, sa indikovaná denná dávka pohybuje v rozmedzí od 0,5 do 500 mg Sanglifehrínu podávaného orálne jedno38 rázovo alebo vhodne viackrát, v rozdelených dávkach dvakrát až štyrikrát denne.

Pri transplantácii orgánov u človeka sa denné dávky zlúčenín podľa predloženého vynálezu podávané orálne pohybujú v rozmedzí 0,1 až 100, s výhodou 0,3 až 30, výhodnejšie 0,5 až 10 mg/kg. Ak sa činidlo podľa predloženého vynálezu podáva spoločne s iným imunosupresívom (napríklad s kortikosteroidmi alebo so zlúčeninami triedy cykiosporínu alebo rapamycínu ako súčasť: dvojitej, trojitej alebo štvoritej liečebnej terapie), môžu sa použiť, nižšie dávky (napríklad 0,1 mg/kg/deň injekčné, mg/kg/deň orálne). Činidlá podľa predloženého vynálezu môžu byť. podávané najmä s inými nesteroidnými imunosupresívami, napríklad s cyklosporínom A, rapamycínom alebo FK 506, s ohľadom na čiastočné alebo úplné nahradenie steroidov.

Činidlá podľa predloženého vynálezu môžu byt podávané akýmkoľvek bežným spôsobom, najmä vnútorne, napríklad orálne, napríklad vo forme roztokov na pitie, tabliet alebo kapsúl, alebo vnútrožilovo, napríklad vo forme injekčných roztokov alebo suspenzií. Bežne je pre systémové podávanie výhodná orálna forma podávania, i keď v niektorých prípadoch, napríklad pri prevencii odmietnutia transplantovanej pečene je vhodná vnútrožilová injekčná forma. Zlúčeniny sa môžu podávať, tiež miestne alebo kožou, napríklad vo forme krému alebo gélu alebo podobnými prostriedkami, na účely očnej aplikácie vo forme očného krému, gélu alebo očných kvapiek.

Vhodná jednotka dávkovacích foriem na orálne podávanie obsahuje 0,5 až 10 0 mg zlúčeniny na dávku.

V súlade s predchádzajúcou časťou, zlúčeniny podľa predloženého vynálezu poskytujú ďalší rad uskutočnení:

A. Spôsob účinku imunosupresie u pacientov, ktorí potrebujú také liečenie, ktoré zahrňuje podávanie účinného množstva činidla podľa predloženého vynálezu pacientovi.

B. Spôsob:

1) prevencia akútneho a/alebo chronického odmietnutia orgánu po alo- alebo xenotransplantácii, napríklad na liečenie príjemcu transplantovaného orgánu všetkých konkrétnych typov opísaných vyššie; alebo

2) prevencia ochorenia transplantované tkanivo versus príjemca, napríklad u príjemcov transplantovanéj kostnej drene; alebo

3) na liečenie ochorení autoimunitnej reakcie alebo na liečenie všetkých takýchto ochorení alebo stavov uvedených vyššie; alebo

4) na liečenie astmy u pacientov, ktorí potrebujú také liečenie, ktoré zahrňuje podávanie účinného množstva činidla podľa predloženého vynálezu pacientovi.

C. Činidlo podľa predloženého vynálezu na použitie ako farmaceutického prostriedku, napríklad na použitie ako imunosupresívum alebo na liečenie akýchkoľvek ochorení alebo stavov, ktoré boli uvedené v bode B.

D. Farmaceutický prostriedok obsahujúci činidlo podľa predloženého vynálezu v spojení s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.

E. Použitie činidla podľa predloženého vynálezu na prípravu liekov využiteľných ako imunosupresívum alebo využiteľných na liečenie akýchkoľvek ochorení alebo stavov, ktoré boli uvedené v bode B.

Makrolidy podľa predloženého vynálezu, ktoré majú aktivitu na väzbu cyklofilínu, môžu byť využiteľné ako činidlá pri substitučných imunitných skúškach na cyklosporín a iné zlúčeniny viažuce cyklofilín, napríklad v uskutočnení testu opísa40 nom v patentovej prihláške WO 95/07468. Táto patentová prihláška. sa týka uskutočnenia testu na určenie koncentrácie farmaceutických prostriedkov viažucich imunofilín, napríklad cyklosporín, v krvi; postup sa skladá z pridania konkurenčne sa viažucej látky, ktorá nahradí farmaceutický prostriedok v komplexe imunosupresívum-imunofilín v krvi; pridania receptora, ktorý sa viaže k farmaceutickému prostriedku ale nie významne k viažucemu sa konkurentovi; oddelenie komplexu receptor-farmaceutický prostriedok zo vzorky; a určenia množstva farmaceutického prostriedku. Sanglifehríny môžu byť pri týchto testoch použité ako konkurenčné látky; napríklad môžu nahradiť cyklosporíny z cyklofilínov, a tak uvoľniť cyklosporín a určiť jeho množstvo, napríklad pomocou monoklonálnej protilátky, ktorá je špecifická pre cyklosporín.

Predložený vynález je ďalej opísaný príkladov, ktoré sú iba ilustračné, k sprievodným obrázkom, v ktorých:

pomocou nasledujúcich a ktoré sa vzťahujú

Oois priložených obrázkov

Obrázok 1	zobrazuj e	hmotnostné	spektrum	zlúčeniny
Sanglifehrínu	B;
Obrázok 2	zobrazuje	hmotnostné	spektrum	zlúčeniny
Sanglifehrínu	A;
Obrázok 3	zobrazuj e	hmotnostné	spektrum	zlúčeniny
Sanglifehrínu	D;
Obrázok 4	zobrazuje	hmotnostné	spektrum	zlúčeniny
Sanglifehrínu	C;

Obrázok

Obrázok zobrazuje IČ spektrum zlúčeniny Sanglifehrínu B;

zobrazuje IČ spektrum zlúčeniny Sanglifehrínu A;

zobrazuje IČ spektrum zlúčeniny Sanglifehrínu D;

zobrazuje IČ spektrum zlúčeniny Sanglifehrínu C;

zobrazuje NMR spektrum zlúčeniny Sanglifehrínu A;

zobrazuje NMR spektrum zlúčeniny Sanglifehrínu D;

zobrazuje NMR spektrum zlúčeniny Sanglifehrínu B; a zobrazuje NMR spektrum zlúčeniny 'Sanglifehrínu C.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vlastnosti kultúr

Streptomyces sp. A 92308110 sa kultivuje pri vhodnej teplote v rôznych kultivačných prostrediach pri použití vhodných živín a minerálnych látok a postupov anaeróbnej kultivácie a kultivácie pri ponorení. Fermentačné médium typicky obsahuje vhodný zdroj uhlíka, zdroje dusíka a minerálne soli vrátane solí obsahujúcich stopové prvky, ktoré sa všetky môžu pridať vo forme jednotlivých látok alebo ako komplexné zmesi, napríklad vyskytujúce sa v biologických produktoch z rôznych zdrojov.

Príklad 1 zlúčeniny dosiahnuť, vlastnosti opisuje pôvodné podmienky, pri ktorých sa získali so všeobecným vzorcom I. Zlepšenie výťažku sa dá optimalizáciou kultivácie (aerácia, teplota, pH, a množstvo zdrojov uhlíka a dusíka, množstvo minerálnych solí a stopových prvkov) podmienok v bioreaktoroch.

a zmenami fermentačných

Príklad 1

Kultivácia druhu A 92308110.

a) počiatočná kultivácia na agare

Agarové kultúry druhu A 92308110 sa kultivujú 10 až 14 dní pri teplote 27 °C na nasledovnom agarovom médiu: ,

glukóza	ii,o g
rozpustný škrob	20,0 g
extrakt z kvasníc	5,0 g (Gistex, Gist Brocades)
NZ-amín, typ A (Sheffield) 5,0 g
uhličitan vápenatý	1,0 g
agar (Bacto)	150,0 g
demineralizovaná voda	do 1000 ml
pH média sa upraví na	6,6-6,8 pomocou NaOH/H₂SO₄ a potom sa

sterilizuje 20 min pri 121 °C.

Kultúry sa môžu skladovať pri -25 °C až -70 °C. Suspenzia sa v zmesi glycerol-peptón môže skladovať v kvapalnom dusíku.

b) predkultivácia

Spóry a mycélium desiatich východiskových kultúr sa suspendujú v 100 ml 0,9 % roztoku soli. Potom sa 50 ml tohto roztoku naočkuje do dvoch 2000 ml Erlenmeyerových baniek, z ktorých každá obsahuje 1 liter predkultivačného média.

Zloženie predkultivačného média:

glukóza technická	7,50	g
glycerín	7,50	g
kvasnicový extrakt (BBL)	1,35	g
tekutý sladový extrakt (Waer)	7,50	g
rozpustný škrob	7,50	g
NZ-amín, typ A (Sheffield)	2,50	g
sójová bielkovina	2,50	g
L(-) asparagín	1,00	g
CaCO₃	0,05	g
NaCl	0,05	g
kh₂po₄	0,25	g
k₂hpo₄	0,50	g
MgSO₄.7H₂O	0,10	g
roztok stopových prvkov A	1	ml
agar (Bacto)	1	g
demineralizovaná voda	do 1000	ml

pH média sa upraví na 6,6-6,8 pomocou NaOH/H₂SO₄ a potom sa sterilizuje 20 min pri 121 °C.

Zloženie roztoku stopových prvkov A:

FeSO₄.7H₂O ZnSO₄.7H₂O MnCl₂.4H₂O CuSO₄.5H₂O CaCl₂-6H₂O

5,0 g 4,0 g

20,0 g 0,2 g 2,0 g

Η₃ΒΟ₃

ΚΙ

H₂SO₄ (95 %) ο,ι g

0,05 g 1 ml demineralizovaná voda do 1000 ml

Predkultivované bunky sa fermentujú 24 h pri 27 °C na rotačnej trepačke pri 200 ot/min s excentricitou 50 mm.

c) prvý medziprodukt

Každý z dvoch 75 litrových bioreaktorov obsahujúcich po 50 litrov predkultivačného média sa naočkuje 1 litrom medziproduktu a fermentuje sa 96 hodín pri 270 °C. Zariadenie sa otáča rýchlosťou 150 ot/min. Vzduch je privádzaný rýchlosťou 0,5 1/min na liter média.

d) druhý medziprodukt

Každá z dvoch 750 litrových fermentačných nádob obsahujúcich po 500 litrov predkultivačného média sa naočkuje 50 litrami prvého medziproduktu. Druhý medziprodukt sa inkubuje 70 hodín pri 27 °C. Zariadenie sa otáča rýchlosťou 100 ot/min. Vzduch je privádzaný rýchlosťou 0,8 1/min na liter média.

e) hlavná kultivácia

Každý z dvoch 5000 litrových bioreaktorov obsahujúcich po 3000 litrov hlavného média sa naočkuje 250 resp. 300 litrami druhého medziproduktu a inkubuje sa 96 hodín pri 24 °C.Zariadenie sa otáča rýchlosťou 45 ot/min. Vzduch je privádzaný rýchlosťou 0,5 1/min na liter média.

Zloženie média pre hlavnú kultiváciu je nasledovné:

glukóza technická 20 g tekutý sladový extrakt (Waer) 2 g kvasnicový extrakt (Bacto) 2 g

Soytone (Bacto) 2 g

KH₂PO₄

0,2 g κ₂ηρο₄

MgSO₄.7Η₂Ο

NaCl

CaCl₂.6H₂O roztok stopových prvkov B agar (Bacto) demineralizovaná voda pH sa upraví pomocou K0H/HC1 20 min pri 121 °C.

0,4 g 0,2 g

0,05 g 0,05 g ml i g do 1000 ml na 6,3. Médium sa sterilizuje

Zloženie roztoku stopových prvkov B

FeS0₄.7H₂O

ZnSO₄.7H₂O

MnCl₂.4H₂0

CuSO₄.4H₂O (NH₄) gMO-y0₂₄

CaCl₂·6H₂O h₃bo₃

KI

H₂SO₄ (95 %) demineralizovaná voda

Optimalizované kultivačné sójová múka glycerol

MES demineralizovaná voda je nasledovné:

5,0 g 4,0 g 2,0 g 0,2 g 0,2 g 1/0 g 0,1 g

0,05 g 1 ml do 1000 ml médium pre hlavnú kultiváciu

20,0 g

40,0 g 0,1 M do 1000 ml pri pH 6,8

Príklad 2

Izolácia Sanglifehrínov A, B, C a D z kultúry Streptomyces sp. A 92308110

Prvá izolácia a charakterizácia 4 nových CBA aktívnych metabolitov sa uskutočnila z dvoch 3000 1 fermentačných tankov pomocou aktívneho frakcionovania a HPLC a chromatografickej analýzy na tenkej vrstve. Na testovanie biologickej aktivity sa použil vyššie opísaný CBA (test väzby cyklofilínu).

Osobitne sa uskutočnia dve fermentácie po 3000 litroch. 1500 litrov z každej fermentácie sa 20 hodín mieša s 2000 litrov etylacetátu v 4000-litrovej nerezovej nádobe. Oddelenie organickej fázy sa uskutoční pomocou zariadenia

Westfalia-Separator, typ SA-20. Etylacetátový extrakt sa dvakrát premyje 80 litrami vody a odparí do sucha pri zníženom tlaku. Získa sa 1,64 resp. 2 kg extraktu. Oba surové extrakty sa zbavia tuku pomocou trojstupňovej extrakcie 40 litrami zmesi etanol/voda 9 : 1 a 40 litrami hexánu. Odparenie do sucha pri zníženom tlaku poskytne 1,34 kg extraktu.

Extrakt zbavený tuku sa chromatograficky čistí na dvakrát (po 670 kg) na 10 kg stĺpci Sefadexu H v metanole. Každý podiel sa pri nanášaní na kolónu rozpustí v 3,3 litra metanolu. Po oddelení prvých 15 litrov eluátu ako frakcie 1 pokračuje chromatograf ia odoberaním 2 litrových frakcií. Najaktívnejšie frakcie boli 2, 3a 4, a preto boli spojené pričom sa získalo 146 g. Tento materiál sa ďalej chromatografuje na 1 kg silikagélu (Merck 0,04-0,063 mm) s eluentom: metyl-t.butyléter (MTBE), MTBE/5 % metanol a MTBE/10% metanol. Odoberajú sa frakcie po dvoch litroch . Najaktívnejšie sú frakcie 5 až 9, a preto sa spoja a získa sa 44,8 g. Tento materiál sa·ďalej delí na 1 kg stĺpci silikagélu (Merck) 0,04-0,063 mm s gradientom hexán/acetón 7 : 3 až acetón. Z tejto chromatografie sa ďalej delí frakcia 6 (0,7 g), a to na stĺpci 3 kg Lichroprep RP18 (Merck) 40-63 μπι s eluentom metanol/voda 94 : 6 (frakcie 4-7 -» 2,16 g) a potom na stĺpci 100 g silikagélu

H s eluentom metylénchlorid a 3 % metanol (733 mg), stĺpci 3 kg Lichoprep RP18 s eluentom metanol/voda 9 : 1 (621 mg) a potom na 100 g Lichoprep RP18 s eluentom acetonitril/voda 1 : 1 pričom sa získa 324 mg čistého Sanglifehrínu A (teplota topenia 142-145 °C (amorfný materiál) (a)D25 = -67,30 (c=0-988, metanol)).

Frakcie 5 a 7 zo stĺpca hexán/acetón sa spoja (7,1 g) a čistia na stĺpci 3 kg Lichoprep RP18 40-63 μπι s eluentom metanol/voda 9:1 (769 mg), na. stĺpci 100 g silikagélu H s eluentom MTBE/3 % metanol (309 mg) a nakoniec na 100 g silikagélu H s eluentom metylénchlorid a 3 % metanol za získania 90 mg čistého Sanglifehrínu B (teplota topenia 117-121 °C (amorfná látka), (o:)D25 = -52,80 (c = 1-128 v metanole) ) .

Frakcie 9 a 10 (2,147 g) z chromatografie so zmesou metanol/voda 94:6 na 3 kg Lichoprep RP18 sa potom čistia na 100 g silikagélu H zmesou metylénchlorid/5 % metanol (800 mg) a nakoniec na 3 kg Lichoprep RP18 so zmesou metanol/voda 9:1 pri získaní 480 mg Sanglifehrínu C (teplota topenia 165-170 °C, (a)D25 = -35,60 (c = 0-736 v metanole)).

Frakcie 11 a 12 (835 mg) z chromatografie s eluentom metanol/voda 94:6 na 3 kg Lichoprep RP18 sa čistia na 100 g silikagélu H zmesou MTBE/5 % metanol za získania 140 mg Sanglifehrínu D (teplota topenia 137-142 °C, amorfná látka)

Sanglifehríny A, B, C a D sa potom charakterizovali pomocou UV, IR, hmotnostnej a NMR spektroskopie. Získané výsledky sú uvedené v tabuľke 4 a na priložených obrázkoch 4.

Tabuľka 4

Sanglifehrín A sumárny vzorec: CgQH₉₁N₅O₁₃ (1090,4).

UV (MeOH): 275 (1962), 242 (54500), 197 (75755)

H⁺: 275 (1635), 242 (51884)

OH': 292 (1973), 242 (60495)

IR-spektrum: obrázok 6 hmotnostné spektrum: FAB 1096[MH+Li]⁺: obrázok 2

NMR spektrum: obrázok 9

Sanglifehrín B sumárny vzorec: ^c6o^H9O^N5°12 (¹⁰⁷²/4)

UV (MeOH) : 273 (4395) , 242 (50600) , 197 (78577)

IR-spektrum: obrázok 5 hmotnostné spektrum: FAB 1098 [MH+Li] ⁺: obrázok 1 NMR spektrum: obrázok 11

Sanglifehrín C sumárny vzorec: ^cgi^H93^N5°i3 (1104,4)

UV (MeOH): 275 (1876), 242 (51557), 197 (72643) H⁺: 275 (1391), 242 (50120)

OH: 292 (1832), 242 (57960)

IR-spektrum: obrázok 8 hmotnostné spektrum: FAB 1110 [MH+Li]⁺: obrázok 4 NMR spektrum: obrázok 12

Sanglifehrín D sumárny vzorec: Cg₁Hg]_Ν₅Ο₁₂ (1086,4)

UV (MeOH): 273 (3194), 242 (47584), 197 (73766) H⁺: 273 (3237), 242 (46389)

OH: 285 (2600), 242 (52907)

IR-spektrum: obrázok 7 hmotnostné spektrum: FAB 1092[MH+Li]⁺: obrázok 3 NMR spektrum: obrázok 10

Sanglifehrín A

Príklad 3 - Transformácia Sanglifehrínu A na Sanglifehrín C

K miešajúcemu sa chladnému (0 °C) roztoku 20 mg (18,3 μιηοΐ) Sanglifehrínu A v 0,5 ml metanolu sa pridá 1 kryštál monohydrátu kyseliny paratoluénsulfónovej. Vzniknutý žltý roztok sa mieša 1 hodinu a reakčná zmes sa rozloží nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Vzniknutá zmes sa dvakrát extrahuje etylacetátom. Organický roztok sa dvakrát premyje nasýteným roztokom soľanky, suší nad bezvodým síranom sodným, prefiltruje a odparí pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistí pomocou kolónovej chromatografie na silikagély (95:5 metylterc-butyléter:metanol) pri získaní Sanglifehrínu C a jeho C53 epiméru, Sanglifehrín C má (S) konfiguráciu, ako je opísané nižšie (R = Me).

zmes diastereomérov 4:1

HO

Alternatívne sa táto transformácia uskutočňuje s použitím inej protidovej kyseliny (ako je pyridíniumparatoluénsulfonát, kyselina chlorovodíková alebo kyselina sírová), alebo pomocou Lewisovej kyseliny (ako je chlorid zinočnatý, bromid alebo chlorid horečnatý, tetraizopropoxid titaničitý alebo fluorid boritý) v metanole. Použitie iných alkoholických rozpúšťadiel alebo prídavných rozpúšťadiel ako je etanol, izopropanol, butanol, alylalkohol, propargylalkohol, benzylalkohol vedie rovnakým spôsobom k analógom, kde R vo vzorci uvedenom vyššie je etylová skupina, izopropylová skupina, butylová skupina, alylová skupina, propargylová skupina, benzylová skupina.

Rovnakým spôsobom, ako je opísané vyššie, sa môže transformovať Sanglifehrín B na Sanglifehrín D.

Príklad 4 - Transformácia Sanglifehrínu C na Sanglifehrín A

Roztok 550 mg (0,50 mmol) Sanglifehrínu C v 5 ml roztoku THF-voda 4:1 reaguje s 0,5 ml 2N vhodnej kyseliny sírovej a mieša sa 1,5 hodiny. Reakcia sa rozloží nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a vzniknutá zmes sa dvakrát extrahuje etylacetátom. Organický roztok sa premyje nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a dvakrát nasýteným roztokom soľanky, suší sa nad bezvodým síranom horečnatým, prefiltruje a odparí pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistí pomocou kolónovej chromatografie na silikagély (90:10 metylterc-butyléter:metanol) za získania Sanglifehrínu A ako bieleho amorfného prášku.

Vhodnými kyselinami paratoluénsulfónová

Na nosiči obsahujúcom vodu sa môžu použiť ďalšie anorganické a organické kyseliny,, s výhodou organické prídavné kyseliny.

sú kyselina chlorovodíková, kyselina alebo ďalšie sulfónové kyseliny, pyridíniumparatoluénsulfonát, kyselina octová, kyselina trifluóroctová, kyselina mravčia. Vhodnými organickými prídavnými rozpúšťadlami sú acetonitril, dimetylformamid, dimetylsulfoxid, dioxan.

Tieto reakcie sú doprevádzané tvorbou rôzneho množstva zlúčeniny so všeobecným vzorcom XV, okrem iného v závislosti na reakčnom čase (vhodnejší postup, ktorý vedie k zlúčenine so vzorcom XV viď. príklad 5 nižšie) .

Analogicky sa môže transformovať Sanglifehrín D na Sanglifehrín B.

Príklad 5 - Transformácia Sanglifehrínu A na zlúčeninu so všeobecným vzorcom XV

K miešajúcemu sa chladnému (0 °C) roztoku 50 mg (46 gmol) San50 glifehrínu Αν 1,9 ml acetonitrilu sa pridá 0,1 ml fluorovodíka v pyridíne. Vzniknutý žltý roztok sa mieša 1 hodinu a reakčná zmes sa rozloží nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Vzniknutá zmes sa dvakrát extrahuje etylacetátom. Organický roztok sa dvakrát premyje nasýteným roztokom soľanky, suší nad bezvodým síranom sodným, prefiltruje a odparí pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistí pomocou kolónovej chromatografie na silikagély (95:5 metylterc-butyl- -éter:metanol) za získania zlúčeniny so všeobecným vzorcom XV ako bieleho amorfného prášku.

(XV)

Sanglifehrín B previesť na XVI. Tieto látky existujú ako absolútna konfigurácia nebola

Analogickým spôsobom sa môže zlúčeninu so všeobecným vzorcom jeden epimér na C53, ale jednoznačne určená.

HO ti (xvi)

Zlúčenina so všeobecným vzorcom XV: MS m/z 1078 [M+Li]⁺ (rel.

intenzita	100) ;	¹H NMR (DMSO) (uvedené sú	iba	charakteristické
signály) δ	0,40	(3H,	d, H-50), 1,20 (3H,	s,	H-54) ,	1,69	(3H,
s, H-49),	4,20	(1H,	t, H-15), 4,58 (1H,	dd,	H-17) ,	5,19	(1H,
dd, H-18),	5,28	(1H,	dd, H-23), 5,62 (1H,	m,	H-21) ,	5,67	(1H,
m, H-27), dd, H-20),	5, 99 6,22	(1H, (1H,	d, H-25) , 6,03 (1H, dd, H-26) .	dd,	H-19) ,	6,14	(1H,

Príklad 6 - Transformácia zlúčeniny so všeobecným vzorcom XV na Sanglifehrín A

K miešajúcemu sa roztoku 54 mg (50 μιηοΐ) zlúčeniny so všeobecným vzorcom XV v 0,5 ml zmesi THF-voda 4:1 sa pridá 50 μΐ 2N vodného roztoku kyseliny sírovej. Vzniknutý žltý roztok sa mieša pri teplote okolia 12 hodín a reakčná zmes sa rozloží nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Vzniknutá zmes sa dvakrát extrahuje etylacetátom. Spojený organický roztok sa premyje nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného, suší nad bezvodým síranom sodným, prefiltruje a odparí pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistí pomocou kolenovej chromatograf ie na silikagély (90:10 metylterc-butyléter:metanol) za získania Sanglifehrínu A ako bielej amorfnej pevnej látky.

Analogickým spôsobom sa môže zlúčenina so všeobecným vzorcom XVI previesl na Sanglifehrín B.

Postupy opísané v príkladoch 3 až 6 sa môžu použil, ako selektívny sled intramolekulárnych chrániacich reakcií a reakcií, pomocou ktorých sa chrániace skupiny odstraňujú. Teda pomocou reakcie opísanej v príklade 5 sa hydroxylová skupina v polohe 15 môže selektívne chránil, čo umožňuje selektívnu manipuláciu so zostávajúcimi voľnými hydroxylovými skupinami. Postup opísaný v príklade 5 umožňuje selektívne chránenie hydroxylových skupín ako v polohe 15, tak v polohe 17. Obidva postupy sa môžu tiež použil pri intramolekulárnom chránení ketónu C53. Hydroxylové a ketonické skupiny môžu regeneroval pomocou reakcií opísaných v príkladoch 4 a 6. Sanglifehríny C a D, rovnako ako zlúčeniny so všeobecnými vzorcami XV a XVI, sú preto výz52 namné medziprodukty tvorby ďalších Sanglifehrínov.

Príklad 7 - príprava 16-dehydro-17-dehydroxySanglifehrínu A (Zlúčenina so všeobecným vzorcom XVII)

Roztok 54 mg (50 /xmol) zlúčeniny so všeobecným vzorcom XV a kryštál monohydrátu kyseliny paratoluénsulfónovej v 1 ml zmesi acetonitril-voda 4:1 sa zahrieva 1,5 hodiny na 8 0 °C. Reakčná zmes sa rozloží nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Vzniknutá zmes sa dvakrát extrahuje etylacetátom. Organický roztok sa premyje nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a soľankou, suší nad bezvodým síranom sodným, prefiltruje a odparí pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistí pomocou kolónovej chromatografie na silikagély (90:10 metylterc-butyléter:metanol) a pomocou chromatografie na reverznej fáze (RP18, 50:50 acetonitril-voda až acetonitril počas 45 minút) za získania čistej menovanej zlúčeniny ako bielej amorfnej pevnej látky.

MS m/z 1078 [M+Li]⁺ (rel. intenzita 100), 'H NMR (DMSO) (uvedené sú iba charakteristické signály) δ 1,58 (3H, s, H-50), 1,71 (3H, s, H-49), 2,08 (3H, s, H-54), 4,03 (2H, d, H-15 a C31-OH), 5,57 (2H, m, H-21 a C35-OH), 5,72 (1H, dt, H-27),

5,96 (1H, d, C15-OH), 6,03 (1H, d, H-25), 6,09-6,28 (4H, m,

H-18, H-19, H-20 a H-26), 6,37 (1H, d, H-17).

Príklad 8 - Príprava 42-N-metyl-Sanglifehrínu A (Zlúčenina so všeobecným vzorcom XVIII)

K miešajúcemu sa chladnému (-15 °C) roztoku 109 mg (0,1 mmol) Sanglifehrínu A a 67 μΐ (0,3 mmol) 2,6-diterc-butylpyridínu v 1 ml CH₂C1₂ sa pridá 16,5 μΐ metyltriflátu. Zmes sa nechá zahriať na teplotu miestnosti a mieša sa ďalších 6 hodín a potom sa rozloží nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Vzniknutá zmes sa dvakrát extrahuje etylacetátom. Organický roztok sa premyje sol'ankou, suší nad bezvodým síranom sodným, prefiltruje a odparí pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistí pomocou dvoch úspešných- kolónových chromatografii na silikagély (90:10 metylterc-butyléter:metanol, potom 95:5 metylterc-butyléter:metanol) , pri získaní čistej menovanej zlúčeniny ako bielej amorfnej pevnej látky.

MS m/z 1110 [M+Li]⁺ (rel. intenzita 100), •'H NMR (DMSO) (uvedené sú iba charakteristické signály) δ 1,70 (3H, s, H-49), 2,06 (3H, s, H-54), 3,53 (3H, s, 42 N-Me), 3,98 (1H, d,

C31-OH), 4,50 (1H, d, H-65), 4,77 (1H, d, C17-OH), 5,43 (1H, d, C15-OH), 5,49 (1H, d, C35-OH), 7,50 (1H, d, H-12), 8,11 (1H, d, H-9), 9,22 (1H, s, C61-OH).

Príklad 9 - Príprava 53-dihydro-Sanglifehrínu A (Zlúčenina so všeobecným vzorcom XIX) (XIX)

Η(

K miešajúcemu sa chladnému (O °C) roztoku 54 mg (50 gmol) Sanglifehrínu A v 0,5 ml metanolu sa pridá 2,8 mg (75 μπιοί) tetrahydridoboritanu sodného. Miešanie pokračuje 1 hodinu a pridá sa nasýtený vodný roztok hydrogénuhličitanu sodného. Vzniknutá zmes sa dvakrát extrahuje etylacetátom. Organický roztok sa dvakrát premyje soľankou, suší sa nad bezvodým síranom sodným, prefiltruje a odparí pri zníženom tlaku. Zvyšok sa čistí pomocou kolónovej chromatografie na silikagély (95:5 metylterc-butyléter:metanol, potom 90:10 metylterc-bu-tyléter:metanol), za získania čistej menovanej zlúčeniny ako bielej amorfnej pevnej látky. Izolovaný produkt zodpovedá približne zmesi diastereoizomérov 1:1 na C-53.

MS m/z 1098 [M+Li]⁺ (rel. intenzita 63), 1104 [M+2Li-H]⁺ (rel. intenzita 100) ; ¹H NMR (DMSO) (uvedené sú iba charakteristické signály) δ 0,62 (3H, d, H-50), 1,02 (3H, d, H-54),· 3,55 a 3,59 (1H, 2m, H-53).

Príklad 10 - Príprava 53-tozylohydrazon-Sanglifehrínu A (Zlúčenina so všeobecným vzorcom XX)

HC

(XX)

Zmes 55 mg (50 μπιοί) Sanglifehrínu A a 23 mg (125 μπιοί) tozylhydrazidu v 0,5 ml dichlórmetánu sa mieša pri teplote miestnosti 6 hodín. Rozpúšťadlo sa odstráni a zvyšok sa čistí pomocou kolónovej chromatografie na silikagély (90:10 metylterc-butyléter:metanol) , za získania menovanej zlúčeniny ako bieleho amorfného prášku.

MS m/z 1264 [M+Li]⁺ (rel. intenzita 100), ¹H NMR (DMSO) (uvedené sú iba charakteristické signály) δ 1,70 (3H, s, H-49) , 1,77 (3H, s, H-54), 2,37 (3H, s, -NSO₂C_gH₄CH₃), 6,51 (1H, s, H-60), 6,59 (2H, 2d, H-62 aH-64), 7,06 (1H, dd, H-63), 7,35 (2H, d, tozyl metá protóny), 7,73 (2H, d, tozyl para protóny) .

Príklad 11 - Príprava 26S, 27S-dihydroxy-Sanglifehrínu A (Zlúčenina so všeobecným vzorcom XXI) a 26R,27R-dihydroxy-Sanglifehrínu A (Zlúčenina so všeobecným vzorcom XXII)

(XXII)

K miešajúcemu sa chladnému (O °C) roztoku 495 mg (1,5 mmol) kyanoželezitanu draselného, 207 mg (1,5 mmol) uhličitanu draselného, 19,5 mg (0,025 mmol) (DHQ)₂ PHAL, 65 μΐ (0,005 mmol)

0,08 M oxidu osmičelého v t-butanole a 95 mg (1 mmol) metylsulfonamidu v 2,5 ml t-butanolu a 5 ml vody sa pridá roztok 545 mg (0,5 mmol) Sanglifehrínu A v 2,5 ml t-butanolu. Vzniknutá dvojfázová zmes sa nechá zahriať na teplotu miestnosti a mieša sa 3 hodiny. Potom sa pridá 1,08 g (8,6 mmol) siričitanu sodného, ďalej etylacetát a voda, a zmes sa prudko mieša 15 minút. Vrstvy sa oddelia a vodná vrstva sa dvakrát extrahuje etylacetátom. Spojené organické vrstvy sa premyjú nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a sol'ankou, sušia sa nad bezvodým síranom sodným, prefiltrujú a odparia. Zvyšok sa čistí pomocou chromatografie na reverznej fáze (RP18, 30:70 acetonitril-voda až acetonitril počas 60 minút) za získania 26S,27S-diolu ako amorfného prášku.

Zodpovedajúci 26R,27R-diol sa získa pomocou vyššie uvedeného postupu, ale pri použití (DHQD) ₂PHAL namiesto (DHQ)₂PHAL.

26S,27S-diol: MS m/z 1130 [M+Li]⁺ (rel. intenzita 100), ¹H NMR (DMSO) (uvedené sú iba charakteristické signály) δ 1,64 (3H, s, H-49), 2,06 (3H, s, H-54), 3,20 (1H, širokým, H-27), 3,45 (1H, širokým, H-31), 3,94 (3H, m, H-17, H-26 a C31-OH), 4,30 (1H, d, C27-OH), 4,57 (1H, d, C26-OH), 5,20 (1H, t, H-23),

5,33 (1H, d, H-25), 5,57 (3H, m, H-18, H-21 a C35-OH), 6,03 (1H, dd, H-19), 6,14 (1H, dd, H-20).

26R,27R-diol: MS m/z 1130 [M+Li] ⁺ (rel. intenzita 100), ¹H NMR (DMSO) (uvedené sú iba charakteristické signály) δ 1,64 (3H, s, H-49), 2,06 (3H, s, H-54), 3,16 (1H, širokým, H-27), 3,48 (1H, širokým, H-31), 3,94 (3H, m, H-17, H-26 a C31-OH), 4,30 (1H, d, C27-OH) , 4,57 (1H, d, C26-OH) , 5,20 (1H, dd, H-23),

5,35 (1H, d, H-25), 5,57 (3H, m, H-18, H-21 a C35-OH), 6,03 (1H, dd, H-19), 6,14 (1H, dd, H-20).

Príklad 12 - Rozštiepenie diolu v 26S,27S-dihydroxy- -Sanglifehrínu A

K roztoku 90 mg (79 gmol) 26S, 27S-diolu v 0,9 ml zmesi

THF-voda 2:1 sa pridá 33 mg (157 gmol) jodistanu sodného miešanie pokračuje 1 hodinu a pridá sa nasýtený vodný roztok hydrogénuhličitanu sodného. Zmes sa dvakrát extrahuje etylacetatom. Organický bezvodým síranom pomocou čisti roztok sa premyje soľankou, suší sa nad sodným, prefiltruje a odparí. Zvyšok sa chromatografie na silikagély (95:5 metylterc-butyléter:metanol) za získania zlúčenín so všeobecným vzorcom XXIII (pena) a XXIV (prášok).

(XXIII)

(XXIV)

Zlúčenina so všeobecným vzorcom XXIII: MS m/z 366 [M+H-H₂O]⁺(rel. intenzita 100), ¹H NMR (DMSO) (2:1 zmes OH_ax:OH_eg epimérov na anomérnom centre) (uvedené sú iba charakteristické signály) δ 3,54 a 4,08 (1H, 2m, H-31), 3,57 (1H, široký m,

H-35), 3,66 (1H, m, H-33), 4,38 (0,67H, ddd, H-27_ax), 4,95 (0,33H, širokým, H-27_eg), 5,40 (0,33H, d, C27-OH_eg), 5,59 (0,33H, d, C35-OH), 5,61 (0,67H, d, C35-OH), 5,96 (0,67H, d, C27-OH_ax), 7,89 (0,67H, s, NH-42), 7,91 (0,33H, s, NH-42).

Zlúčenina so všeobecným vzorcom XXIV: MS m/z 745 [M-t-Li]^{+ 1}H NMR (DMSO) (uvedené sú iba charakteristické signály) δ 0,64 (3H, d, H-50), 0,81 (6H, d, H-56 a H-57), 2,06 (3H, s, H-54),

2,17 (4Η, s, H-14 a H-49), 3,80 (1H, široký m, H-15), 3,94 (1H, dd, H-17), 5,33 (1H, široký d, H-23), 5,62 (2H, m, H-18 a H-21), 6,89 (1H, d, H-25), 6,10 (1H, dd, H-19), 6,18 (1H, dd, H-20), 10,0 (1H, d, H-26).

Príklad 13 - Acetylácia Sanglifehrínu A pri vzniku 61-0-acetyl-Sanglifehrínu A (Zlúčenina so všeobecným vzorcom XXV)

K miešajúcemu sa chladnému (0 °C) roztoku 54 mg (50 μπιοί) Sanglif ehrínu A a 50 μΐ pyridínu v 0,5 ml dichlórmetánu sa pridá 5,2 μΐ (55 μπιοί) anhydridu kyseliny octovej. Reakčná zmes sa udržuje 1 hodinu pri 0 °C, potom sa nechá zahriať na teplotu miestnosti a mieša sa ďalších 12 hodín. Pridá sa nasýtený vodný roztok hydrogénuhličitanu sodného a vzniknutá zmes sa extrahuje etylacetátom. Organická vrstva sa suší nad bezvodým síranom sodným, prefiltruje a odparí. Zvyšok sa čistí pomocou chromatografie na reverznej fáze (RP18, 40:60 acetonitrílvoda až acetonitril počas 45 minút) za získania menovanej zlúčeniny ako amorfného prášku.

MS m/z 1132 [M+H] ⁺ (rel. intenzita 100), ¹H NMR (DMSO) (uvedené sú iba charakteristické signály) δ 1,68 (3H, s, H-49),

2,06 (3H, s, H-54), 2,25 (3H, s, CH₃CO₂), 4,04 (1H, d,

C31-OH), 4,67 (1H, d, C2-NH), 4,76 (1H, d, C17-OH), 5,42 (2H, m, H-8 a C15-OH), 5,57 (3H, m, H-18, H-21 a C35-OH), 6,85 (1H, s, H-60), 6,98 (1H, d, H-62), 7,06 (1H, d, H-64), 7,31 (1H, dd, H-63), 7,51 (1H, d, H-12), 7,89 (1H, s, H-42), 8,23 (1H, d, H-9).

Priemyselná využiteľnosť

Sú využiteľné predovšetkým pri prevencii akútneho a/alebo chronického odmietnutia orgánu alebo tkaniva pri alo- alebo xenotransplantácii, napríklad pri liečení príjemcu po transplantácii srdca, pľúc, kombinácie srdca a pľúc, pečene, obličiek, pankreasu, kože alebo rohovky. Sú tiež vhodné pri prevencii ochorení transplantát versus hostiteľ, ako sú následky po transplantácii kostnej drene.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Makrolid, v ktorom

i) je v polohách 2a 6 makrocyklického kruhu pripojený zvyšok piperidazinylkarboxylovej kyseliny; a/alebo ii) je v polohách 7 až 9 makrocyklického kruhu pripojený zvyšok aromatickej α-aminokyseliny; a/alebo iii) je v polohách 10 až 12 makrocyklického kruhu pripojený zvyšok alifatickej a-aminokyseliny, vo voľnej alebo chránenej forme, alebo vo forme jeho soli.
2. Makrolid podľa nároku 1 obsahujúci dva alebo výhodne všetky tri charakteristické štruktúrne znaky i), ii) a iii) .
3. Makrolid podľa nároku 1 alebo 2, v ktorom zvyšok makrocyklického kruhu obsahuje zvyšok hydroxykarboxylovej kyseliny, ktorého dĺžka reťazca je od 6 do 20, výhodne 11 atómov uhlíka.
4. Makrolid podľa nároku 3, v ktorom zvyšok hydroxykarboxylovej kyseliny je zvyšok so všeobecným vzorcom II:

R³ R⁴

R¹ R² 0 (CH₂)₂

I I I I

CH -CH₂-CH=CH-CH=CH-CH-C- CH-CH-CO- (II)

I I o ch₃ kde

R¹ a R² sú atómy vodíka alebo spolu predstavujú väzbu;

Q

R je atóm vodíka;

R⁴ je skupina -CO-CH-j alebo skupina -CHĺOíO-CH^ alebo R^J a R⁴ spoločne predstavujú zvyšok so všeobecným vzorcom III:

ch₃

I

C“ (III)

OCH₃ vo voľnej alebo chránenej forme, alebo vo forme

Makrolid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, makrocyklický kruh so všeobecným vzorcom IV:

soli.

obsahujúci (IV) kde skupiny X, Y a Z sú zvyšky i) , ii) a iii), ktoré sú definované v nároku 1 a A je zvyšok hydroxykarboxylovej kyseliny, ktorý je definovaný v nároku 3 alebo 4, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo·forme soli.

Makrolid podľa nároku 5 obsahujúci makrocyklický kruh so všeobecným vzorcom V:

KO (V) kde skupina A je definovaná v nároku 5, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme jeho soli.
7. Makrolid podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorý je substituovaný na atóme uhlíka, susediacom s oxyskupinou laktónového mostíka, 2-oxy-2'-áza-3'-oxospirobicyklohexán-3-ylovým zvyškom.
8. Makrolid podľa nároku 7, v ktorom má spirobicyklohexylový zvyšok všeobecný vzorec VI kde

-a-b- je skupina -(Me)C=CH- alebo skupina -(Me)CH-CH(OH)a R₅ je vodík alebo metyl, vo voľnej alebo chránenej forme, alebo jeho soli, prípoje ný k makrolidovému kruhu cez spojovaciu skupinu obsahujúcu lineárnu sekvenciu s 6 až 11, typicky s 9 atómami uhlíka medzi spiro-zvyškom a makrolidovým kruhom.
9. Makrolid podľa nároku 8,, v ktorom spojovacia skupina medzi spiro-zvyškom a makrolidovým kruhom je skupina so všeobecným vzorcom VII

R⁶ R⁷ CH₃ c-CH₂-CH(OH)-CH(CH₃) — (CH₂)₂— CH-CH-CH=C-d (VII) kde c je väzba na spiro-zvyšok;

d predstavuje väzbu k makrocyklickému kruhu a R a R sú hydroxy-skupiny alebo spoločne predstavujú ďalšiu väzbu, vo voľnej alebo chránenej forme.
10. Zlúčenina so všeobecným vzorcom VIII

S-L-M (VIII) kde

S predstavuje 2-oxy-2'-áza-3'-oxospirobicyklohexán-3-ylový zvyšok

L predstavuje spojku obsahujúcu lineárnu sekvenciu so 6 až 11, typicky s 9 atómami uhlíka, a

M predstavuje makrolidový kruh definovaný v ktoromkoľvek nároku 1 až 6, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.
11. Zlúčenina podľa nároku 10 so všeobecným vzorcom IX kde skupina -a-b- je definovaná vyššie;

-e-f- je skupina -CH(OH)-CH(OH)- alebo skupina -CH=CH-; -g-h- má rovnaký význam ako je definované vyššie pre skupinu -a-b-, a

R³, R⁴ a R⁵ sú definované vyššie, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.

2. Zlúčenina podľa nároku 11, ktorá má nasledujúcu konformáciu :

kde, ak -a-b- je skupina -(Me)CH-CH(OH)-, má táto skupina s výhodou konfiguráciu:

X

CHj ak -e-f- je skupina -CH(OH)-CH(OH)-, má táto skupina s výhodou konfiguráciu (S) , (S) alebo (R) , (R) ; ak -g-h- je skupina -(Me)CH-CH(OH)-, má táto skupina s výhodou konfiguráciu:

CH₃ ak -g-h- je skupina -(Me)C=CH-, má táto skupina s výhodou konfiguráciu:

a ak a R- sú spojené, majú s výhodou konfiguráciu:

13 .

14 .

,,v' ock₃

Sanglifehrín vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje Sanglifehrín A, B, C a D.

Makrolid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 4 až 9 alebo zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 12, kde polohy 14 až 17 makrocyklického kruhu obsahujú zvyšok so všeobecným vzorcom X:

CH,

CH (X)
16 I — CH—CH—CH—CH17 I 15 1<

CH napríklad s konfiguráciou:

15 .

Zlúčenina so všeobecným vzorcom XI:

R⁶-X-Y-Z-A-OH (XI) napríklad zlúčenina so všeobecným vzorcom XII:

(XII) napríklad zlúčenina so všeobecným vzorcom IX' kde X, Y, Z, A, R³, R⁴ a R⁵ sú definované vyššie a R⁶ je atóm vodíka alebo alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka, napríklad metylová skupina, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.

16. Makrolid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9 vo forme otvoreného kruhu, pričom tento otvorený makrocyklický kruh je vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.
17. Zlúčenina so všeobecným vzorcom R^O-X-Y-Z-A-OH, kde X, Y,

Z a A sú definované v nároku 5 a R⁶ je atóm vodíka alebo alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme jej soli.
18. Zlúčenina so všeobecným vzorcom R⁶O-X-Y-Z-A'-CH(OH)-L-S, kde skupina A'-CH(OH)- je zvyšok hydroxykarboxylovej kyseliny definovaný v nároku 3 a ostatné symboly sú definované v nároku 17, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.
19. Zlúčenina so všeobecným vzorcom XII':

R?O :o r v* k .N-CO-CH-NH—CO-CH—NH—A' —CH-L S . i °« nO C H₂ t lf ch₃ ck₃ (XII') vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.
20. Zlúčenina so všeobecným vzorcom IX'':

vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.

Zlúčenina, v ktorej je 2-oxy-2'-áza-3'-oxo-3¹-ylspirobicyklohexánový kruhový systém vo forme otvoreného kruhu,
21.

napríklad zlúčenina so všeobecným vzorcom XII

M (XII) kde a, b, L a M sú definované vyššie, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.

2-oxy-2'-áza-3'-oxo-3'-ylspirobicyklohexán vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli, predovšetkým zlúčenina so všeobecným vzorcom VI¹:

(VI - ) kde R₇ je atóm vodíka, prípadne chránená hydroxylová skupina, reaktívna funkčná skupina, alebo skupina -CH₂-CH(OH)-CH(CH₃)- -CH₂-CH₂-CHO, alebo jej delta laktolový ekvivalent, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.
23. 2-oxy-2'-áza-3'-oxo-3¹-ylspirobicyklohexán s otvoreným kruhom, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli, predovšetkým zlúčenina so všeobecným vzorcom XII':

kde a, b a R sú definované vyššie, vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.
24. Makrolid so všeobecným vzorcom XIII:

CH_zC0 .r, v '-'ť M (XIII) kde M je makrolidový kruh je definovaný vyššie, najmä makrolid so všeobecným vzorcom XIV:

(XIV) vo voľnej alebo chránenej forme alebo vo forme soli.
25. Spôsob prípravy vyššie definovaných zlúčenín, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje:

ΊΟ

i) na prípravu ktoréhokoľvek Sanglifehrínov A, B, C a D, kultiváciu kmeňa aktinomycét produkujúceho Sanglifehrín A, B, C alebo D v kultivačnom médiu a izoláciu požadovaného Sanglifehrínu A, B, C, alebo D zo získaného roztoku kultúry ;

ii) na prípravu Sanglifehrínov C a D cyklizáciu Sanglifehrínov A a B v polohách 15 a 16;

iii) na prípravu Sanglif ehrínov A a B otvorenie laktonového kruhu Sanglif ehrínov C a D v polohách 5 a 16;

iv) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', kde -g-h- je skupina C(CH^)=CH-, dehydratáciu zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX alebo IX', kde -g-hje C(CH₃)-CH(OH)- alebo jej chránenej formy;

v) na prípravu makrolidu všeobecného vzorca IX alebo IX', kde R* je ΟΗ(ΟΗ)-ΟΗβ, hydrogenáciu zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX alebo IX', kde R₄ je C(O)-CH₃;

vi) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', kde polohy 14 a 16 makrolidového kruhu obsahujú zvyšok so všeobecným vzorcom X:

CH

CH ) ^^Λ2 ¹ 2 (X)

CH—CH“CH—CH—

15 14

CHreakciu spôsobujúcu vnútorné chránenie zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX alebo IX';

vii) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX¹, reakciu zlúčeniny všeobecného vzorca IX alebo

IX', kde polohy 14 až 16 makrolidového kruhu obsahujú zvyšok so všeobecným vzorcom X

CH.

J o-o is i — CH—CH“CK 17 | 15 ch₃ (X) •CH· na odstránenie vnútornej chrániacej skupiny;

viii) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', kde R⁵ je metyl, metyláciu makrolidu so c všeobecným vzorcom IX alebo IX' , kde R je atóm vodíka;

ix) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX' , v ktorom je R⁴ v O-chránenej forme, O-chránenie makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', v ktorom je R⁵ v O-nechránenej forme;

x) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX,'v ktorom je R⁴ v O-nechránenej forme, odstránenie O-chrániacej skupiny makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX' , v ktorom je R⁵ v O-chránenej forme;

xi) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', ktorý obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-chránený hydroxyfenylalanínový zvyšok,

O-chránenie makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', ktorý obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-nechránený hydroxyfenylalanínový zvyšok;

xii) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX' , ktorý obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-nechránený hydroxyfenylalanínový zvyšok, odstránenie O-chrániacej skupiny makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', ktorý obsahuje v polohách 7 až 10 makrocyklického kruhu O-chránený hydroxyfenylalanínový zvyšok;

xiii) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', v ktorom -e-f- je skupina CH(OH)-CH(OH)-, oxidatívnu hydrolýzu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo IX', v ktorom -e-f- je skupina -CH=CH-;

xiv) na prípravu zlúčeniny so všeobecným vzorcom V alebo zlúčeniny so všeobecným vzorcom XII, reakciu zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX alebo IX'na rozštiepenie spojovacej skupiny medzi spirobicyklo-skupinou a makrocyklickým kruhom;

xv) na prípravu zlúčeniny so všeobecným vzorcom R^SO-X-Y-Z-A-OH alebo so všeobecným vzorcom R^O-X-Y-Z-A' -CH(OH)-L-S, otvorenie kruhu makrocyklu so všeobecným vzorcom IV alebo makrocyklického kruhu zlúčeniny so všeobecným vzorcom VIII;

xvi) na prípravu makrolidu so všeobecným vzorcom IX alebo XII vo forme uzavretého kruhu, reakciu zlúčeniny so r všeobecným vzorcom R O-X-Y-Z-A-OH alebo so všeobecným vzorcom R⁶O-X-Y-Z-A'-CH(OH)-L-S na uzavretie makrocyklického kruhu;

xvii) na prípravu zlúčeniny so všeobecným vzorcom XII alebo XII', reakciu zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX alebo VI' na otvorenie kruhu vo vnútri spirobicyklického kruhového systému; a xviii) na prípravu zlúčeniny so všeobecným vzorcom IX alebo VI', reakciu zlúčeniny so všeobecným vzorcom XII alebo XII' na uzavretie kruhu vo vnútri spirocyklického kruhového systému
26. Kmeň Aktinomycétes, ktorý produkuje makrolid, v ktorom

i) je v polohách 2a 6 makrocyklického kruhu pripojený zvyšok piperidazinylkarboxylovej kyseliny; a/alebo ii) je v polohách 7 až 9 makrocyklického kruhu pripojený zvyšok aromatickej α-aminokyseliny; a/alebo iii) je v polohách 10 až 12 makrocyklického kruhu pripojený zvyšok alifatickej a-aminokyseliny
27. Biologicky čistý izolát kmeňa Streptomyces sp. A92308110 (DSM 9954) alebo mutanta, rekombinanta alebo ich modifikovanej formy, ktorá je schopná produkovať makrolid podľa predloženého vynálezu.
28. Spôsob prípravy makrolidu podľa predloženého vynálezu vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu kmeňa Streptomyces sp. A92308110 (DSM 9954) alebo mutanta, rekombinanta alebo ich modifikovanej formy, vo vhodnom kultivačnom prostredí a prípadne izoláciu Sanglinfehrínu.
29. Spôsob vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie účinného množstva činidla podľa predloženého vynálezu pacientom.
30. Spôsob:

i) prevencie akútneho a/alebo chronického odmietnutia orgánu po alo- alebo xenotransplantácii, napríklad na liečenie príjemcu transplantovaného orgánu všetkých konkrétnych typov opísaných vyššie; alebo ii) prevencie ochorenia transplantované tkanivo versus príjemca, napríklad u príjemcov transplantovanéj kostnej drene; alebo iii) liečenia ochorení autoimunitnej reakcie alebo liečenia všetkých takýchto ochorení alebo stavov uvedených vyššie; alebo

4) liečenia astmy u pacientov, ktorí potrebujú také liečenie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie účinného množstva zlúčeniny podľa predloženého vynálezu pacientom.
31. Látka podľa predloženého vynálezu na použitie ako liečivo, napríklad na použitie ako imunosupresívum alebo na liečenie všetkých ochorení alebo stavov, ktoré boli uvedené v časti B vyššie.
32. Farmaceutický prostriedok vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinnú látku podľa predloženého vynálezu v spojení s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.
33. Použitie látky podľa predloženého vynálezu na prípravu liekov na použitie ako imunosupresívum alebo na použitie na liečenie všetkých ochorení alebo stavov, ktoré boli uvedené v bode B vyššie.
34. Použitie zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6,

8 až 10, 15 alebo 16 ako činidla na substitučný imunologický test zlúčenín, ktoré viažu cyklosporíny alebo iné cyklofilíny.