JPH11116577A - 新規化合物ａｍ６８９８ｅ及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 式（Ｉ） 【化１】 で表される化合物、およびシュードアレッシェリア属に
属する微生物による製造方法。 【効果】 ＩｇＥ産生抑制剤、またはＩｇＥの異常産生
に基づく免疫疾患の予防・治療剤等の医薬として有用で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＩｇＥ抗体産生を
抑制する作用を有する新規化合物、その製法と用途、お
よび生産菌に関する。

【０００２】

【従来の技術】アレルギ−反応はその発症の機序、症状
の違いなどによりＩ型アレルギ−反応、ＩＩ型アレルギ
−反応、ＩＩＩ型アレルギ−反応およびＩＶ型アレルギ
−反応に区別されている。アレルギ−反応の代表的なも
のは、即時型アレルギ−反応ともいわれているＩ型アレ
ルギ−反応である。Ｉ型アレルギ−反応においては、生
体内に入った抗原によりＩｇＥが生起し、これが組織の
肥満細胞または血中の好塩基性細胞の細胞膜に固着した
ＩｇＥ抗体が抗原と反応することにより、当該細胞から
ヒスタミン、セロトニン、その他の種々の化学伝達物質
を遊離する。該化学伝達物質は平滑筋の収縮、血管透過
性の亢進など様々な組織反応を引き起こす。Ｉ型アレル
ギ−の病態としては、アトピ−性気管支喘息、アトピ−
性皮膚炎、アレルギ−性鼻炎、花粉症、アナフィラキシ
−、食物アレルギ−などが挙げられる。

【０００３】現在のところ、Ｉ型アレルギ−反応を抑制
する薬剤として、肥満細胞および好塩基性細胞からの化
学伝達物質遊離抑制薬、化学伝達物質拮抗薬が開発され
ている。しかしながら、化学伝達物質の遊離もしくは生
成を特異的に抑制する薬剤または特異的な拮抗薬が知ら
れている化学伝達物質は少なく、また化学伝達物質は多
種多様であるため、Ｉ型アレルギ−反応を抑制するため
には、種々の化学伝達物質の相互作用の解析が必要とさ
れているのが現状である。さらに、上記の薬剤は、アレ
ルギ−反応の根本的原因であるＩｇＥの産生を抑制する
ことではなく、その意味で根本的治療剤にはなり得な
い。

【０００４】また、サイクロスポリンＡのような免疫抑
制剤によってＩｇＥ産生を抑制し、アレルギ−疾患を治
療しようとする試みも行われているが、非特異的免疫抑
制を伴うため、副作用の問題を克服することは困難であ
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従来より、ＩｇＥ産生
を特異的に抑制する免疫抑制剤として有用な新規化合物
の提供が求められている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＩｇＥ抗
体産生を特異的に阻害する新規な生理活性物質を微生物
代謝産物より見出すべく鋭意探索を行った。その結果、
工業技術院生命工学工業技術院にＦＥＲＭ ＢＰ−５５
４３として寄託されているシュードアレッシェリア（Ps
eudallescheria) 属に属するＭ６８９８株の培養液から
ＩｇＥ抗体産生に対して阻害活性を示す新規生理活性物
質が産生されることを見出し本発明を完成させた。

【０００７】即ち、本発明は、式（Ｉ）

【０００８】

【化２】

【０００９】で表される化合物である（以下、本発明の
化合物をＡＭ６８９８Ｅ、またはＡＭ６８９８Ｅ化合物
と称することがある）。本発明のＡＭ６８９８Ｅ化合物
の性状は以下の通りである。 １）外観：無色油状 ２）酸性、塩基性、中性の区別：中性物質 ３）比旋光度：［α］_D ²³−４４°±１０°（Ｃ＝１．
０，ＣＨＣｌ₃ ） ４）分子式：Ｃ₁₅Ｈ₂₄Ｏ₃ ５）分子量：ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ ２５３（Ｍ＋Ｈ）
⁺ ６）元素分析：計算値（％）（Ｃ₁₅Ｈ₂₄Ｏ₃ に対し） Ｃ，７１．３９；Ｈ，９．５８ 実測値（％） Ｃ，６９．７７；Ｈ，９．８４ ７）紫外部吸収スペクトル：末端吸収（ＭｅＯＨ） ８）赤外部吸収スペクトル：（ＫＢｒ、ｃｍ^-1）図１に
示す通りである。

【００１０】主な吸収は次の通りである。３４２３、２
９３７、２８６６、１４４４、１３８１、１０６６、９
２２、８６６、８４１、７９３、６９２ ９） ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣ
ｌ₃ ）図２に示す通りである。 １０）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル：（１００ＭＨｚ，ＣＤ
Ｃｌ₃ ）δ（ｐｐｍ）１３５．０（ｓ）、１１８．２
（ｄ）、６９．４（ｄ）、６４．３（ｄ）６０．５
（ｓ）、５８．５（ｓ）、５０．５（ｔ）、４６．７
（ｄ）３５．１（ｔ）、３２．７（ｔ）、３２．７
（ｔ）、２７．５（ｔ）、２５．７（ｑ）、１８．０
（ｑ），１３．５（ｑ） １１）溶解性：クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、
メタノールに可溶で、水に不溶である。

【００１１】１２）呈色試験：ヨウ素蒸気との反応、過
マンガン酸カリウム脱色反応に陽性を示し、塩化第二鉄
反応、ニンヒドリン反応に陰性を示す。 １３）薄層クロマトグラフィ−：固定相 展開溶媒 Ｒｆ値 シリカゲルｆ Ｓ２０１ ヘキサン：アセトン ０．２１ （東京化成社製） （１０：２．５） １４）高速液体クロマトグラフィ−： 分離カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ｃ１８−５Ａ（カラムサイ
ズ φ４．５×１５０ｍｍ、昭和電工社製） 溶媒：３５％アセトニトリル 流速：１．０ｍｌ／分 検出：ＵＶ ２０５ｎｍ 保持時間：９．８分 また、本発明は、ＡＭ６８９８Ｅ化合物を産生する能力
を有するシュードアレッシェリア属に属する微生物を培
養し、その培養物よりＡＭ６８９８Ｅ化合物を採取する
ことを特徴とするＡＭ６８９８Ｅの製造方法である。

【００１２】本発明のＡＭ６８９８Ｅ化合物を産生する
能力を有するシュードアレッシェリア属に属する微生物
としては、本発明の化合物を生産する能力があれば特に
限定されないが、例えば、工業技術院生命工学工業技術
院にＦＥＲＭ ＢＰ−５５４３として寄託されている下
記のシュードアレッシェリア・エスピー（Pseudallesch
eria sp.) Ｍ６８９８株が例示される。

【００１３】上記Ｍ６８９８株の菌学的性状は次の通り
である。 １．各培地上での生育状態 １）イ−スト・リン酸・可溶性澱粉（ＹｐＳｓ）寒天培
地 ２５℃、７日間の培養でコロニ−の直径は２７ｍｍ以上
に達し、培地上で白色（１Ａ１）、綿毛上のコロニーと
なる。コロニーの裏面は白色（１Ａ１）ないし灰色（１
Ｂ２）である。２５℃、４０日間の培養では、コロニー
は培地全面に広がり、表面はフェルト状で幅の広い環状
模様が認められ、パステル灰色（１Ｃ１）ないし赤褐色
（９Ｅ３）のコロニーとなる。コロニーの最外縁部は灰
褐色（８Ｄ３）である。コロニー裏面は暗褐色（８Ｆ
８）を主体とするが、最外縁部は鈍赤色（８Ｃ３）であ
る。裏面全体に閉子嚢果が粒子状に散在する。３７℃、
７日間の培養でコロニーの直径は２５ｍｍであった。

【００１４】２）ポテト・グルコ−ス寒天培地 ２５℃、７日間の培養でコロニ−の直径は２２ｍｍ以上
に達し、表面はフェルト状で白色（１Ａ１）ないし灰色
（１Ｃ１）である。コロニーの裏面は白色（１Ａ１）な
いし黄白色（３Ａ２）である。２５℃、４０日間培養し
た場合、コロニーは培地全面に広がり、表面はフェルト
状で幅の狭い環状模様が認められる。コロニーは褐灰色
（６Ｄ２）で、裏面は淡肌色（６Ｂ３）ないし暗褐色
（６Ｆ７）である。裏面全体に閉子嚢果が粒子状に散在
する。３７℃、７日間の培養でコロニーの直径は１１ｍ
ｍであった。

【００１５】２．生理学的性状 ポテト・グルコ−ス液体培地で培養した場合、生育し得
るｐＨの範囲は、３．０〜９．０であり、最適生育ｐＨ
は、５．０〜８．０である。ポテト・グルコ−ス寒天培
地で培養した場合、生育し得る温度の範囲は、１６．５
〜３９℃であり、最適生育温度は、２７〜３３℃であ
る。

【００１６】３．顕微鏡下における形態的特徴 本菌は、有性世代と無性世代を形成する。有性世代では
暗褐色（７Ｆ６）で球形ないし亜球形で、直径６０〜１
５０μｍの閉子嚢果を形成する。閉子嚢果の殻壁は厚さ
が５〜７μｍ、暗褐色（７Ｆ６）で、多角形の細胞で構
成される。子嚢は消失性で、１３×１５μｍの大きさで
あり、球形ないし亜球形で８胞子性である。子嚢胞子は
単胞子性で５×７〜８μｍの楕円形である。両端に発芽
孔を有するが、発芽孔が不明瞭な胞子もある。子嚢胞子
の表面は滑面で、成熟したものは淡黄色（４Ｂ４）ない
し淡橙色（５Ｃ５）である。

【００１７】無性世代の分生子は、黄白色（３Ａ２）な
いし淡黄色（４Ａ３）で滑面であり、Ｓｃｅｄｏｓｐｏ
ｒｉｕｍ型の分生子を形成する。分生子形成様式は、ア
レウリオ型で、分生子の大きさは、６〜８×３〜５μｍ
である。分生子は単細胞性で球形、亜球形、卵形、楕円
形、棒状と様々な形態のものが認められるが、基部に切
り取った様な跡（truncate base ）が共通して認められ
る。

【００１８】各培地における生育状態の色の表示は、Ko
rnerup A. and Wanscher J.H.1978"Methuen Handbook o
f Colour 3rd ed."Eyre Methuen,London の表示に従っ
た。 参考文献 １）．von Arx,J.A.1973.The Genera petriellidium an
d Pithoascus (Microascaceae).Persoonia 7:365-375 ２）．McGinnis,M.R.,Padhye,A.A.and Ajello,L.1970.P
seudallescheria Negroni et Fischer,1943 and itslat
er synonym petriellidium Malloch.1970.Mycotaxon 1
4:94-102 ． 本発明に係わるＡＭ６８９８Ｅの典型的で好ましい製造
方法は、シュードアレッシェリア属に属する該化合物生
産菌（例えばPseudallescheria sp. Ｍ６８９８）を好
適な培地で培養し、その培養物から分離する方法が例示
される。

【００１９】本発明物質を製造するのに使用される培地
は、液体培地による振盪培養または通気攪拌培養が最も
適しているが、これに限定されない。培地はＡＭ６８９
８Ｅ生産菌が生育して培地中に該化合物を蓄積するもの
であれば特に限定されず、例えば、炭素源としてはグル
コ−ス、シュ−クロ−ス、デキストリン、澱粉、グリセ
リン、糖蜜、有機酸などが使用できる。また窒素源とし
ては、例えばイ−ストエキス、ペプトン、肉エキス、大
豆粉、綿実粉、グルテンミ−ル、小麦胚芽、コ−ンステ
ィ−プリカ−、アミノ酸類、アンモニウム塩、硝酸塩、
その他各種有機あるいは無機窒素化合物が用いられる。
無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸
カルシウム、各リン酸塩、マグネシウム塩、銅塩、コバ
ルト塩等を添加してもよい。また菌の生育及びＡＭ６８
９８Ｅ生産を促進するようなビタミン類、補酵素類等を
添加してもよい。特に、培地が強く発泡するのであれ
ば、必要あるときに液体パラフィン、動物油、植物油、
鉱物油、シリコン等を添加してもよい。

【００２０】ＡＭ６８９８Ｅ生産菌の培養における培養
温度、培養時間、攪拌速度、通気量、培養液のｐＨなど
の条件は、ＡＭ６８９８Ｅの蓄積量が最大となるように
適当に選択、調節される。例えば、通常の通気攪拌培養
の場合、培養温度２７〜３０℃、２〜５日間の培養が好
ましく、また培養液のｐＨはｐＨ５．０〜８．０に調節
するのが好ましい。

【００２１】培養の経過に伴って培養液中に蓄積される
ＡＭ６８９８Ｅの量の経時的変化は後述の産生阻害活性
あるいは逆相ＨＰＬＣにより測定することができる。通
常は、４８時間から９６時間の培養でその生産量は最大
に達する。培養終了後、主としてその液体部分に蓄積す
るＡＭ６８９８Ｅは、菌体その他の固形部分を濾過操作
または遠心分離によって除去し、その濾液または上清液
から分離するのが好ましいが、必要に応じて菌体を除去
することなく培養液から該化合物を分離することも可能
である。培養液からのＡＭ６８９８Ｅの分離、精製に
は、その物理化学的特性に基づく種々の方法を用いるこ
とができる。例えば、濾液または上清液中に存在するＡ
Ｍ６８９８Ｅは、中性ｐＨ条件下で水と混和しない有機
溶媒、例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノ−ル、ク
ロロホルム、ジクロルメタン、塩化メチレン、塩化エチ
レンなどの単独またはそれらの組み合わせにより抽出精
製することができる。あるいは吸着剤として例えばダイ
ヤイオンＨＰ−２０（三菱化成社製）等が使用される。
ＡＭ６８９８Ｅを含む画分を上記の吸着剤の層を通過さ
せて不純物を吸着させて取り除くか、または、ＡＭ６８
９８Ｅを吸着させた後、メタノ−ル水、アセトン水など
を用いて溶出させることにより該化合物を得ることがで
きる。更にシリカゲル、アルミナ、フロリジルのような
担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィ−、セファデ
ックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）、トヨパ−ルＨ
Ｗ−４０（東ソ−社製）などを用いた分配カラムクロマ
トグラフィ−、および順相、逆相カラムを用いた高速液
体クロマトグラフィ−などでＡＭ６８９８Ｅを精製する
ことができる。

【００２２】また、本発明は、ＡＭ６８９８Ｅ化合物を
有効成分とする医薬である。本発明の医薬は、通常、Ａ
Ｍ６８９８Ｅ化合物の他に、薬学的に許容される担体と
からなることができる。担体としては、公知のものが使
用でき、その性質によっては賦型剤、結合剤、崩壊剤、
潤沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コ−ティン
グ剤等と分類されることもあるが、例えば、ラクト−
ス、コ−ンスタ−チ、ステアリン酸マグネシウム等が挙
げられる。

【００２３】本発明の医薬は、例えば免疫抑制剤であ
り、さらに詳しくは、ＩｇＥ産生抑制剤、あるいは、Ｉ
ｇＥの異常産生に基づく免疫疾患の予防治療剤であり、
例えば、抗アトピ−性気管支喘息剤、抗アトピ−性皮膚
炎剤、抗アレルギ−性鼻炎剤、抗花粉症剤、抗アナフィ
ラキシ−剤または抗食物アレルギ−剤が例示される。本
発明の医薬は、種々の形態で投与され得るが、例えば錠
剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与
または注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点眼剤、坐
薬、軟膏、スプレ−、ロ−ション等による非経口投与を
挙げることができる。

【００２４】これらの医薬は、症状、年齢、体重、投与
方法および剤形等によって異なるが通常は成人に対して
１日２０ｍｇ乃至１０００ｍｇを投与することができ
る。

【００２５】

【実施例】次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこの実施例によって限定されるもの
ではない。

【００２６】

【実施例１】 （１）ＡＭ６８９８Ｅ化合物の醗酵生産 グルコ−ス２％、可溶性澱粉２％、大豆粉２％、イ−ス
トエキス０．５％、ＮａＣｌ０．２５％、ＣａＣＯ
₃ ０．３５％およびセライト１％を含有する水性培地
（ｐＨ６．５）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ
に分注し、１２０℃で２０分間滅菌した。これにＭ６８
９８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５５４３）のスラントを一白
金耳接種し、２８℃で３日間ロ−タリ−シェ−カ−（毎
分２００ｒｐｍ）で培養を行い１次種培養液とした。得
られた１次種培養液を、３０ｌ容ジャ−ファ−メンタ−
中の上記と同じ滅菌培地２０ｌ中へ接種した。ファ−メ
ンタ−を２０ｌ／分の通気および２００ｒｐｍ、２８℃
で４８時間通気攪拌培養し、２次種培養液とした。

【００２７】こうして得た２次種培養液４ｌをさらに、
グルコ−ス２％、綿実粉０．５％、乾燥酵母０．２％、
ペプトン０．１％、ＮａＮＯ₃ ０．５％、ＭｇＳＯ₄ ・
７Ｈ ₂ Ｏ０．１％、ＣｏＣｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ０．００１
％、ＣａＣＯ₃ ０．２％およびアンチフォームＦＳ−０
２８（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｋ．Ｋ社製）０．０３
％を含有する３００ｌ容ステンレス製ファ−メンタ−中
の滅菌培地２００ｌに接種した。２８０ｌ／分の通気お
よび３００ｒｐｍの攪拌のもとに、２８℃で７２時間培
養を行った。

【００２８】（２）ＡＭ６８９８Ｅ化合物の精製 上記の培養方法で得られたブロス２００ｌに珪藻土（５
ｋｇ）を添加後濾過し、濾液（１８０ｌ）を得た。得ら
れた濾液を塩酸でｐＨ７．０に調製した後、酢酸エチル
（９０ｌ）を添加し、抽出操作を行った。この酢酸エチ
ル層を減圧下に濃縮し、約１００ｍｌのシロップ状物質
を得た。このシロップ状物質にヘキサン約１ｌを添加
し、不溶物を濾過により除き、濾液を減圧濃縮した。濃
縮物を予めベンゼン−酢酸エチル（１０：２）混合溶媒
で作製したシリカゲルカラム（８５０ｍｌ）に付し、同
溶媒で６．８ｌ溶出を行った後、ベンゼン−酢酸エチル
（１０：４）混合溶媒で溶出を行い、２０ｍｌずつ分画
した。精製過程に於ける活性物質の検出には、シリカゲ
ル薄層クロマトグラフィ−［ＴＬＣ：東京化成社製、シ
リカゲルｆ Ｓ２０１；展開系：ベンゼン−酢酸エチル
＝１０：３でＲｆ値０．２０の物質］を用いた。

【００２９】フラクションＮｏ．５１−Ｎｏ．１５０に
主としてＲｆ値０．２０を示すＡＭ６８９８Ｅ成分が溶
出された。ＡＭ６８９８Ｅ成分を含むフラクションを集
め、減圧下濃縮した。ＡＭ６８９８Ｅ成分を含む濃縮物
はさらに予めヘキサン−酢酸エチルで作製したシリカゲ
ルカラム（５００ｍｌ）に付し、同溶媒で溶出を行い、
１８ｍｌずつ分画した。フラクションＮｏ．７２−９３
にＡＭ６８９８Ｅ成分が溶出された。このフラクション
を集め、減圧濃縮した。ＡＭ６８９８Ｅ成分を含む濃縮
物はさらに予めクロロホルム−メタノール＝１０：０．
１で作製したシリカゲルカラム（３００ｍｌ）に付し、
クロロホルム−メタノール（１０：０．１）混合溶媒で
溶出を行い、１５ｍｌずつ分画した。フラクションＮ
ｏ．４９〜Ｎｏ．５４にＡＭ６８９８Ｅ成分が溶出され
た。ＡＭ６８９８Ｅ成分を含むフラクションを集め減圧
下濃縮し、濃縮物をさらに分取液体クロマトグラフィー
にて精製を行った。即ち、カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ｃ１
８−５Ｆ、移動相：４５％メタノール、流速：６ｍｌ／
分でクロマトグラフィーを実施し、９ｍｌずつ分画し
た。フラクションＮｏ．３４〜Ｎｏ．５０にＡＭ６８９
８Ｅ成分が溶出された。ＡＭ６８９８Ｅ成分を含むフラ
クションを集め減圧下濃縮し、無色油状のＡＭ６８９８
Ｅ（１３７ｍｇ）を得た。

【００３０】

【実施例２】 （１）ＡＭ６８９８ＥのＩｇＥ抗体産生抑制活性 実施例１で得られたＡＭ６８９８Ｅについて、ＩｇＥ抗
体産生抑制活性の測定を次のようにして行い、該活性を
確認した。６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾臓を
無菌的に摘出し、ステンレスメッシュを通過させ大きな
細胞塊を除いた後、１０％牛胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ
社）、２ｍＭグルタミン、５ｘ１０^-5Ｍ２−メルカプト
エタノ−ル、０．２％ＮａＨＣＯ₃ 、ペニシリンＧ（５
０ＩＵ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍ
ｌ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ社）に細胞を懸濁して脾臓細胞浮遊液を得た。この液
を１２００ｒｐｍで１０分間遠心後、１４０ｍＭＮＨ₄
Ｃｌ−１５ｍＭトリス溶液で赤血球を破壊し、ＰＢＳ
（−）（２．７ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＫＨ₂ ＰＯ₄ 、
０．１４ＭＮａＣｌ，８．１ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄ ・７Ｈ
₂ Ｏを含有する）溶液にて２回洗浄後、更に抗Ｔｈｙ−
１抗体及びウサギ補体を用いてＴ細胞を死滅させＢ細胞
源とした。このＢ細胞源をＰＢＳ（−）溶液にて２回洗
浄し、上記ＲＰＭＩ−１６４０培地にて５ｘ１０⁶ 細胞
／ｍｌに調製し、Ｂ細胞浮遊液を得た。このＢ細胞浮遊
液に、Ｂ細胞刺激剤としてＬＰＳ（Ｄｉｆｃｏ社；Ｅ．
ｃｏｌｉ由来）を５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、
２４時間、３７℃、５％ＣＯ₂ 下で前培養した。その
後、細胞を回収し、ＰＢＳ（−）溶液で２回洗浄した。
再度細胞を上記ＲＰＭＩ−１６４０培地にて５ｘ１０⁶
細胞／ｍｌに調製し、この細胞浮遊液１００μｌを９６
穴プレ−トの各ウェル（５ｘ１０⁵ 細胞／ウェル）に入
れ、これに上記のＬＰＳを５μｇと市販マウスＩＬ−４
（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）１００Ｕを添加した。次いで各種
濃度のＡＭ６８９８Ｅ化合物５０μｌを加え、２００μ
ｌ／ウェルとし、５％ＣＯ₂ インキュベ−タ−を用いて
３７℃で７日間培養した後、培地中のＩｇＥ量を測定し
た。尚、ＡＭ６８９８Ｅ化合物は水に不溶性なので、Ｄ
ＭＳＯに溶解した後、上記培地で希釈した。コントロ−
ルとして、ＡＭ６８９８Ｅ化合物を添加しなかった他は
上記の操作を繰り返した。

【００３１】培養上清中のＩｇＥ量は以下の方法により
測定した。１次抗体として市販のラット抗マウスＩｇＥ
モノクロナ−ル抗体（ヤマサ醤油（株））を２μｇ／ｍ
ｌとなるようにＰＢＳ（−）溶液に溶解し、９６穴ＥＬ
ＩＳＡプレ−ト（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社）に５０μｌ／ウ
ェルの割合で分注し、室温で１．５時間保持した。その
後ＰＢＳ（−）溶液を捨て、３００μｌ／ウェルの割合
で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−）溶液を加
えることにより各ウェルを洗浄した。この洗浄操作を４
回繰り返し行った。洗浄後、２００μｌ／ウェルの割合
でブロッキング溶液［１％ＢＳＡ（Ｍｉｌｅｓ社；ｆｒ
ａｃｔｉｏｎＶ）含有ＰＢＳ（−）溶液］を加え、４℃
で一昼夜保持し、ブロッキングを行った。次いで、ブロ
ッキング溶液を捨て、先に述べた０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０含有ＰＢＳ（−）溶液による洗浄操作を４回繰り返
した。次に予め用意しておいた活性測定用の一連のサン
プル希釈液を５０μｌ／ウェルの割合で加え、室温で１
時間保持した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ
（−）溶液による洗浄操作を４回繰り返した。次に２次
抗体として市販のビオチン標識ラット抗マウスＩｇＥモ
ノクロナ−ル抗体（ヤマサ醤油（株））を２μｇ／ｍｌ
となるようにＰＢＳ（−）溶液で溶解し、５０μｌ／ウ
ェル加え、室温で１時間保持した。０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０含有ＰＢＳ（−）溶液による洗浄操作を４回繰り
返した後、ＰＢＳ（−）溶液を用いて２０００倍に希釈
したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
Ａｖｉｄｉｎ Ｄ（Ｖｅｃｔｏｒ社、Ａ２００４）を５
０μｌ／ウェル加えて室温で１時間保持した。０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−）溶液による洗浄操作
を４回繰り返した後、ＡＢＴＳ溶液［０．１２９ｇクエ
ン酸；０．２７６ｇＮａ₂ ＨＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏ；３０
％Ｈ₂ Ｏ₂ １μｌ；３ｍｇ２，２−Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ
（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６
−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ
ｓａｌｔ（和光純薬（株））；１０ｍｌ蒸留水］を５
０μｌ／ウェル加えて室温で１０分間保持し、５％（ｗ
／ｖ）のシュウ酸を５０μｌ／ウェル加えて反応を停止
した。その後、４１５ｎｍの吸光度を測定することによ
りＩｇＥ量の測定を行った。

【００３２】ＩｇＥ抗体産生抑制活性は、ＩｇＥ抗体産
生量がコントロ−ルの５０％に減少した濃度をＩＣ
₅₀（μｇ／ｍｌ）として求め、ＡＭ６８９８Ｅの活性を
算出した。 （２）ＡＭ６８９８Ｅ化合物の
細胞毒性 この研究では、マウスリンパ腫Ｐ３８８Ｄ１細胞（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ−４６）を用いた。細胞生存率は、Ｍｉｃ
ｈａｅｌ Ｃ，Ａｌｌｅｙらの方法［Cancer Res.,48,5
89-601(1988)］に準じ、ＭＴＴ［３−（４，５−ｄｉｍ
ｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉ
ｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄ］試
薬（ＳＩＧＡＭＡ社）を用いたＭＴＴ法で測定した。即
ち、１０％牛胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、２ｍＭグ
ルタミン、５μＭ２−メルカプトエタン−ル、０．２％
炭酸水素ナトリウム、ペニシリンＧ（５０ＩＵ／ｍｌ）
及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する
ＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）にて
マウスリンパ腫Ｐ３８８Ｄ１細胞を１ｘ１０⁵ 細胞／ｍ
ｌに調製した。この細胞浮遊液１００μｌを９６穴プレ
−トの各ウェル（１ｘ１０⁴ 細胞／ウェル）に入れた。
これに上記培地を用いて作製した各種濃度のＡＭ６８９
８Ｅ化合物溶液１００μｌ／ウェルを加え、５％ＣＯ₂
インキュベ−タ−を用いて３７℃で３日間培養した。そ
の後、上記ＭＴＴ試薬をＰＢＳ（−）溶液にて１ｍｇ／
ｍｌになるように溶解し、５０μｌを各ウェルに添加
し、５％ＣＯ₂ インキュベ−タ−を用いて３７℃で４時
間培養した。培養終了後、生細胞によって生じた青色素
を５７０ｎｍで測定した。尚、ＡＭ６８９８Ｅ化合物は
水に不溶性なので、ＤＭＳＯに溶解した後、上記培地で
希釈した。コントロ−ルとして、ＡＭ６８９８Ｅ化合物
を添加しなかった他は上記の操作を繰り返した。細胞数
がコントロ−ルの５０％に減少した濃度をＩＣ₅₀（μｇ
／ｍｌ）としてＡＭ６８９８ＥのＩＣ₅₀値を測定した。
以上の結果を表１に示した。

【００３３】

【表１】

【００３４】以上の結果から明らかなように、ＡＭ６８
９８Ｅ化合物は、細胞毒性の低い化合物であり、低濃度
でＩｇＥ抗体産生抑制作用を有する事が確認された。従
って、本発明の化合物が、免疫抑制剤であること、更
に、ＩｇＥの異常産生に基づく免疫疾患の予防治療剤で
あり、例えば、抗アトピ−性気管支喘息剤、抗アトピ−
性皮膚炎剤、抗アレルギ−性鼻炎剤、抗花粉症剤、抗ア
ナフィラキシ−剤または抗食物アレルギ−剤に使用でき
る可能性が確認された。

【００３５】（３）ＡＭ６８９８Ｅ化合物の急性毒性 ＡＭ６８９８Ｅ化合物をＤＭＳＯに溶解した後、生理的
食塩水溶液で希釈し、３０ｍｇ／ｋｇを１日１回５日間
ＩＣＲ系マウス５匹（雌性、５週齢）に腹腔内投与し
た。結果としてマウスの異常な症状は何ら観察されず、
本化合物は安全性も高いことが確認された。 実施例３ 経口用カプセル剤 実施例１で製造したＡＭ６８９８Ｅの３０ｍｇを、ラク
ト−ス１７０ｍｇ、コ−ンスタ−チ１４０ｍｇ、ステア
リン酸マグネシウム２ｍｇと良く混合し、この粉末３５
０ｍｇをゼラチンカプセルに入れ、カプセル剤とした。

【００３６】

【発明の効果】本発明は、新規な化合物を提供するもの
であり、これらの化合物は、一般的免疫抑制作用を示さ
ず、優れたＩｇＥ抗体産生抑制作用を示す。したがっ
て、特に、ＩｇＥの産生異常で惹起される病気、例えば
アトピ−性気管支喘息、アトピ−性皮膚炎、アレルギ−
性鼻炎、花粉症、アナフィラキシ−、食物アレルギ−等
の治療薬または予防薬あるいはそれらへの変換素材とし
て非常に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＡＭ６８９８Ｅの臭化カリウム錠剤中で
の赤外部吸収スペクトルを示す。

【図２】図２はＡＭ６８９８Ｅの重クロロホルム溶液中
での４００ＭＨｚ ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 で表される化合物。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の化合物を産生する能力
   を有するシュードアレッシェリア属に属する微生物を培
   養し、その培養物より該化合物を採取することを特徴と
   する該化合物の製造方法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の化合物を有効成分とす
   る医薬。
4. 【請求項４】 医薬が、ＩｇＥ産生抑制剤、またはＩｇ
   Ｅの異常産生に基づく免疫疾患の予防・治療剤である請
   求項３に記載の医薬。