DK1185695T4 - Fremgangsmåde med høj kapacitet til analyse af methylering af DNA - Google Patents

Description

Fremgangsmåde med høj kapacitet til analyse af methylering af DNA. Opfindelsens tekniske område

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en forbedret og kvantitativ fremgangsmåde med høj kapacitet til bestemmelse af mønstre for methylering i prøver af genomisk DNA. Specifikt sørger fremgangsmåden ifølge opfindelsen for behandling af prøver af genomisk DNA med natriumbisulfit for at skabe forskelle i sekvens, som er afhængige af methylering, efterfulgt af påvisning med kvantitative PCR-teknikker baseret på fluorescens.

Opfindelsens baggrund I eukaryotiske organismer af højere orden methyleres DNA kun ved cytosiner placeret 5’ i CpG-dinukleotidet. Denne modifikation har vigtige regulerende virkninger på ekspression af gener, overvejende når den involverer områder, som er rige på CpG (CpG-øer), placeret i promotorregionen af en gensekvens. Ekstensiv methylering af CpG-øer har været forbundet med transkriptionel inaktivering af udvalgte, indprægede gener og gener på det inaktive X-chromosom hos kvinder. Afvigende methylering af normalt ikke-methylerede CpG-øer er blevet beskrevet som en hyppig begivenhed hos udødeliggjorte og transformerede celler og er hyppigt blevet forbundet med transkriptionel inaktivering af tumorundertrykkende gener hos former for menneskelig cancer. DNA-methylaser overfører methylgrupper fra en universel methyldonor, såsom et S-adenosylmethionin, til specifikke bindingssteder på DNA’et. Én biologisk funktion af methylering af DNA hos bakterier er beskyttelse af DNA’et imod fordøjelse med beslægtede restriktionsenzymer. Pattedyrceller har methylaser, som methylerer cytosinrester på DNA, som er 5’-naboer til guanin (CpG). Denne methylering kan spille en rolle ved inaktivering af gener, differentiering af celler, skabelse af tumorer, inaktivering af X-chromosom og genomisk indprægning. CpG-Øer forbliver ikke-methylerede i normale celler, bortset fra under inaktivering af X-chromosom og specifik indprægning fra forældre, hvor methylering af regulerende 5’-regioner kan føre til transkriptionel repression. Methylering af DNA er også en mekanisme til ændring af sekvensen af baser i DNA uden at ændre dets kodende funktion. Methylering af DNA er en arvelig, reversibel og epigenetisk forandring. Dog har methylering af DNA potentialet til at ændre ekspressionen af gener, hvilket har dybe, udviklingsmæssige og genetiske konsekvenser.

Reaktionen methylering indebærer, at et mål-cytosin rives ud af en intakt dobbeltspiral for at tillade overføringen af en methylgruppe fra S-adenosylmethionin ind i en kløft i enzym-DNA’et (cytosin-5)-methyltransferase (Klimasauskas et al.. Cell 76:357-369, 1994) til dannelse af 5-methylcytosin (5-mCyt). Denne enzymatiske omdannelse er den eneste epigenetiske modifikation, som er kendt som eksisterende hos hvirveldyr, og er essentiel for normal udvikling af fosteret (Bird, Cell 70:5-8, 1992; Laird og Jaenisch, Human Mol. Genet. 3:1487-1495, 1994; og Li et al., Cell 69:915-926, 1992). Tilstedeværelsen af 5-mCyt ved CpG-dinukleotider har resulteret i et 5 gange så stort forbrug af denne sekvens i genomet under udviklingen af hvirveldyr, formodentlig på grund af spontan deaminering af 5-mCyt til T (Schoreret et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:957-961, 1992). Sådanne områder af genomet, som ikke udviser en sådan undertrykkelse, henvises der til som ”CpG-øer” (Bird, Nature 321:209-213, 1986; og Gardiner-Garden et al., J. Mol. BioI 196:261-282, 1987). Disse regioner med CpG-øer omfatter ca. 1% af hvirveldyrs genomer og tegner sig også for ca. 15% af det totale antal CpG-dinukleotider (Bird, Nature 321:209-213, 1986). CpG-Øer er typisk mellem 0,2 og ca. 1 kb lange og er placeret imod strømmen i mange husholdnings- og vævsspecifikke gener, men mange strækker sig også ind i regioner, som koder gener. Derfor er det methyleringen af cytosinrester inde i CpG-øer i somatiske væv, som antages at påvirke genets funktion ved at ændre transkriptionen (Cedar, Cell 53:3-4,1988).

Methyleringen af cytosinrester, som findes inde i CpG-øer i visse gener, er blevet omvendt korreleret med genaktivitet. Dette ville føre til nedsat ekspression af gener ved flere forskellige mekanismer, som f.eks. indbefatter afbrydelse af lokal struktur af chromatin, inhibering af binding af transkiptionsfaktor-DNA, eller ved rekruttering af proteiner, som vekselvirker specifikt med methylerede sekvenser, hvilket indirekte forhindrer binding af transkriptionsfaktor. Med andre ord er der flere teorier om, hvorledes methylering påvirker transkription af mRNA og ekspression af gener, men den nøjagtige virkningsmekanisme forstås ikke godt. Nogle studier har vist en omvendt korrelation mellem methylering af CpG-øer og ekspression af gener, imidlertid forbliver de fleste CpG-øer på autosomale gener ikke-methylerede i mikrobelinien, og methylering af disse øer er normalt uafhængig af ekspression af gener. Vævsspecifikke gener er sædvanligvis ikke-methylerede i de modtagende målorganer, men er methylerede i mikrobelinien og i, voksne væv, som ikke udtrykker. CpG-Øer i konstitutivt udtrykte husholdningsgener er normalt ikke-methylerede i mikrobelinien og i somatiske væv.

Unormal methylering af CpG-øer forbundet med tumorundertrykkende gener kan også bevirke nedsat ekspression af gener. Forøget methylering af sådanne regioner kan føre til progressiv nedsættelse af normal ekspression af gener, som resulterer i udvælgelsen af en population af celler, som har en selektiv fordel i vækst (f.eks. en ondartethed).

Det menes, at et ændret mønster for methylering af DNA, især methylering af cytosinrester, bevirker ustabilitet af genomet og er mutagent. Dette har, formodentlig, ført til en undertrykkelse på 80% af et bindingssted for en acceptor for CpG-methyl i eukaryotiske organismer, som methylerer deres genomer. Methylering af cytosin bidrager yderligere til skabelse af polymorfi og mutationer af mikrobelinien og til overgangsmutationer, som inaktiverer tumorundertrykkende gener (Jones, Cancer Res. 56;2463-2467, 1996). Methylering er også påkrævet for udvikling af pattedyrs fostre (Li et al., Cell 69:915-926, 1992). Det ser ud til, at methyleringen af promotorregioner, som er rige på CpG, kan være blokerende for transkriptionel aktivitet. Ushijima et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2284-2289) karakteriserede og klonede fragmenter af DNA, som viser forandringer i methylering under hepatocarcinogenese hos mus. Data fra en gruppe af studier af ændrede bindingssteder for methylering i cancerceller viser, at det ikke simpelthen er de totale niveauer af methylering af DNA, som er ændret ved cancer, men forandringer i fordelingen af methylgrupper.

Disse studier antyder, at sekvenser, som er rige på CpG, kendt som CpG-øer, tilvejebringer en alternativ vej til inaktiveringen af tumorundertrykkende midler. Methylering af CpG-oligonukleotider i nærvær af tumorundertrykkende gener kan føre til deres inaktivering. Andre studier tilvejebringer data, at ændringer i den normale proces til methylering er forbundet med genomisk ustabilitet (Lengauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2545-2550, 1997). Sådanne unormale epigenetiske ændringer kan findes i mange typer cancer og kan tjene som potentielle markører for oncogen transformation, forudsat at der findes et pålideligt middel til hurtig bestemmelse af sådanne epigenetiske ændringer. Der findes derfor et behov i teknikken for en pålidelig og hurtig (høj kapacitet) fremgangsmåde til bestemmelse af methylering som den foretrukne epigenetiske forandring.

Fremgangsmåde til bestemmelse af methylering af DNA

Der findes flere forskellige metoder til scanning af genomer, som er blevet anvendt til at identificere ændrede bindingssteder for methylering i cancerceller. F.eks. indebærer én metode genomisk scanning af landemærker for restriktion (Kawai et al., Mol. Cell. Biol. 14:7421-7427, 1994), og et andet eksempel indebærer for methylering følsom, arbitrært primet PCR (Gonzalgo et al., Cancer Res. 57:594-599, 1997). Forandringer i mønstre for methylering ved specifikke bindingssteder for CpG er blevet overvåget ved fordøjelse af genomisk DNA med restriktionsenzymer, som er følsomme for methylering, efterfulgt af Southern analyse af de regioner, som er af interesse (fordøjelse-Southern-metode). Fordøjelse-Southern-metoden er en metode lige ud ad landevejen, men har iboende ulemper ved, at den kræver en stor mængde DNA med høj molekylvægt (mindst eller mere end 5 pg), og har et begrænset omfang for analyse af bindingssteder for CpG (som bestemt ved nærværet af bindingssteder, som restriktionsenzymer, som er følsomme for methylering, kan genkende). En anden metode til analyse af forandringer i mønstre for methylering indebærer en på PCR baseret proces, som indebærer fordøjelse af genomisk DNA med restriktionsenzymer, som er følsomme for methylering, før opformering ved PCR (Singer-Sam et al., Nucl. Acids Res. 18:687, 1990). Imidlertid er det ikke blevet vist, at denne metode er effektiv, på grund af en høj grad af falske signaler (methylering til stede) på grund af ineffektiv fordøjelse med enzym eller overopformering ved en efterfølgende PCR-reaktion.

Genomisk sekventering er blevet forenklet til analyse af mønstre for methylering af DNA og fordeling af 5-methylcytosin ved at anvende behandling med bisulfit (Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). Behandling af DNA med bisulfit skelner methylerede fra ikke-methylerede cytosiner, men oprindelig, genomisk sekventering med bisulfit kræver sekventering i stor målestok af multiple plasmidkloner for at bestemme de samlede mønstre for methylering, hvilket forhindrer denne teknik i at blive kommercielt nyttig til bestemmelse af mønstre for methylering i en hvilken som helst type af diagnostisk rutineafprøvning.

Desuden er der blevet rapporteret andre teknikker, som udnytter behandling med bisulfit af DNA som et udgangspunkt for analyse af methylering. Disse indbefatter PCR, som er specifik for methylering (MSP) (Hermen et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1992), og fordøjelse med restriktionsenzymer af PCR-produkter opformeret fra DNA, som er omdannet med bisulfit (Sadri og Hornsby, Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996); og Xiong og Laird, Nucl. Acids Res. 25:2532-2534,1997).

Der er blevet udviklet PCR-teknikker til påvisning af mutationer i gener (Kuppuswamy et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1143-1147, 1991) og kvantificering af ekspression, som er specifik for alleler (Szabo og Mann., Genes Dev. 9:3097-3108, 1995; og Singer-Sam et al., PCR Methods Appl. 1:160-163, 1992). Sådanne teknikker anvender interne primere, som annealer til et templat skabt ved PCR og afslutter øjeblikkeligt 5’ i det enkelte nukleotid, som skal afprøves. Imidlertid er en for allel specifik teknik til ekspression ikke blevet afprøvet inden for sammenhængen afprøvning for mønstre for methylering af DNA.

De fleste molekylære, biologiske teknikker anvendt til analyse af specifikke loci, såsom CpG-øer, i komplekst genomisk DNA indebærer en eller anden form for sekvensspecifik opformering, uanset om det er biologisk opformering ved kloning i E. coli, direkte opformering ved PCR eller opformering af signal ved hybridisering med en probe, som kan gøres synlig. Da methylering af DNA tilføjes efter replikation med en DNA-methyltransferase, som er tilegnet opretholdelse, og som ikke er til stede i hverken E. coli eller ved reaktionen ved PCR, går en sådan information om methylering tabt under molekylær kloning eller opformering ved PCR. Desuden diskriminerer molekylær hybridisering ikke mellem methyleret og ikke-methyleret DNA, da methylgruppen på cytosinet ikke deltaget i baseparring. Manglen på en let måde til opformering af informationen om methylering i komplekst, genomisk DNA har sandsynligvis været en yderst vigtig hindring for forskning i methylering af DNA. Der findes derfor et behov i teknikken for at forbedre teknikker til påvisning af methylering, især på en kvantitativ måde.

De indirekte metoder til bestemmelse af mønstre for methylering af DNA på specifikke loci, som er blevet udviklet, sætter deres lid til teknikker, som forandrer det genomiske DNA på en måde, som afhænger af methyleringen, før begivenheden opformering. Der er to primære metoder, som er blevet udnyttet til at opnå denne forandring af DNA, som er afhængig af methylering. Den første er fordøjelse med et restriktionsenzym, som i sin aktivitet påvirkes af 5-methylcytosin i en CpG-sekvens-sammenhæng. Spaltningen, eller manglen på denne, kan derefter afsløres ved Southern blotting eller ved PCR. Den anden teknik, som har fået nylig vidtstrakt anvendelse, er behandlingen af genomisk DNA med natriumbisulfit. Behandling med natriumbisulfit omdanne alle ikke-methylerede cytosiner i DNA’et til uracil ved deaminering, men efterlader de methylerede cytosinrester intakte. Efterfølgende opformering ved PCR erstatter uracilresterne med thyminer og 5-methylcytosinresterne med cytosiner. Den resulterende forskel i sekvens er blevet påvist ved at anvende standardteknikker til påvisning af DNA-sekvenser, primært PCR.

Mange teknikker til påvisning af methylering af DNA udnytter behandling med bisulfit. For øjeblikket efterfølges alle metoder baseret på behandling med bisulfit af en reaktion med PCR for at analysere specifikke loci i genomet. Der findes to principielt forskellige veje, ad hvilke den forskel i sekvens, som er skabt af behandlingen med natriumbisulfit, kan afsløres. Den første er at designe primere til PCR, som særegent annealer med enten methyleret eller ikke-methyleret, omdannet DNA. Denne teknik henvises der til som ”PCR, som er specifik for methylering”, eller ’’MSP”. Den metode, som anvendes ved alle andre teknikker baseret på bisulfit (såsom genomisk bisulfitsekventering, COBRA og Ms-SNuPE), er at opformere det med bisulfit omdannede DNA ved at anvende primere, som annealer på steder, som mangler CpG-dinukleotider i den oprindelige, genomiske sekvens. På denne måde kan primere til PCR opformere sekvensen mellem de to primere, uanset status for methylering af DNA i sekvensen i det oprindelige, genomiske DNA. Resultatet er en pulje af forskellige produkter fra PCR, alle med samme længde og udelukkende afvigende i deres sekvens på bindingsstederne for potentiel methylering af DNA ved CpG’er placeret inde mellem de to primere. Forskellen mellem disse metoder til behandling af den med bisulfit omdannede sekvens er, at ved SMP stammer informationen om methylering fra forekomsten eller manglen på forekomst af et produkt fra PCR, medens der ved den anden teknik altid skabes en blanding af produkter, og blandingen derefter analyseres for at give kvantitativ information om den relative forekomst at de forskellige stadier af methylering. MSP er en kvalitativ teknik. Der er to grunde til, at den ikke er kvantitativ. Den første er, at information om methylering stammer fra sammenligningen af to separate PCR-reaktioner (den methylerede og den ikke-methylerede version). Der findes iboende vanskeligheder ved at gøre kinetiske sammenligninger af to forskellige PCR-reaktioner. Det andet problem med MSP er, at primerne ofte dækker mere end ét CpG-dinukleotid. Konsekvensen er, at der kan skabes flere varianter i sekvens, afhængigt af mønstret for methylering af DNA i det oprindelige, genomiske DNA. F.eks. kunne der, hvis fremad-primeren et en 24- mer-oligonukleotid, som dækker 3 CpG’er, derefter opstå 23 = 8 forskellige, teoretiske permutationer i sekvens i det genomiske DNA efter omdannelse med bisulfit inden for denne sekvens på 24 nukleotider. Hvis der kun køres en fuldt methyleret reaktion, så undersøger man i virkeligheden kun 2 ud af de 8 mulige tilstande af methylering. Situationen kompliceres yderligere, hvis de mellemliggende tilstande af methylering fører til opformering, men med nedsat effektivitet. Derfor er MSP-teknikken ikke-kvantitativ. Der findes derfor et behov i teknikken for at forbedre MSP-teknikken og forandre den til at være mere kvantitativ og lette dens proces til større kapacitet. Den foreliggende opfindelse tager fat på dette behov for en hurtigere og kvantitativ afprøvning for methylering.

Resumé af opfindelsen

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en fremgangsmåde til påvisning afen nukleinsyre, som indeholder methyleret CpG, omfattende: (a) en prøve, som indeholder nukleinsyre, bringes i kontakt med et modificerende middel, som modificerer ikke-methyleret cytosin til frembringelse af en omdannet nukleinsyre; og (b) der gennemføres et trin til opformering og påvisning omfattende opformering af den omdannede nukleinsyre i prøven ved hjælp af oligonukleotid-primere i nærvær af en oligonukleotid-probe, som er specifik for CpG, ved hvilken den probe, som er specifik for CpG, men ikke primerne, skelner mellem modificeret, ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre; og - påvisning af den methylerede nukleinsyre baseret på fortrængning af en probe, som er formidlet af opformering, og kvantitativ reel-tid-PCR baseret på fluorescens. Fortrinsvis omfatter trinet til opformering en polymerasekædereaktion (PCR), og det modificerende middel omfatter bisulfit. Fortrinsvis indeholder den omdannede nukleinsyre uracil i stedet for ikke-methylerede cytosinrester, som findes i den ikke-modificerede prøve, som indeholder nukleinsyre. Fortrinsvis er fremgangsmåden til påvisning ved hjælp af måling af et fluorescens-signal baseret på fortrængning af den probe, som er specifik for CpG, og fremgangsmåden til opformering og påvisning omfatter kvantitativ PCR baseret på fluorescens. Mængderne af methylering i prøven af nukleinsyre bestemmes kvantitativt baseret på reference til en kontrolreaktion for mængde tilført nukleinsyre.

Opfindelsen tilvejebringer endvidere en fremgangsmåde til påvisning af en nukleinsyre, som indeholder methyleret CpG, omfattende: (a) en prøve, som indeholder nukleinsyre, bringes i kontakt med et modificerende middel, som modificerer ikke-methyleret cytosin til frembringelse af en omdannet nukleinsyre; og (b) der gennemføres et trin til opformering og påvisning omfattende opformering af den omdannede nukleinsyre i prøven ved hjælp af oligonukleotid-primere i nærvær af en oligonukleotid-probe, som er specifik for CpG, ved hvilken både primerne og den probe, som er specifik for CpG, skelner mellem modificeret, ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre; og - påvisning af den methylerede nukleinsyre baseret på fortrængning af en probe, som er formidlet af opformering, og kvantitativ reel-tid-PCR baseret på fluorescens. Fortrinsvis er trinet til opformering en polymerasekædereaktion (PCR), og det modificerende middel omfatter bisulfit. Fortrinsvis indeholder den omdannede nukleinsyre uracil i stedet for ikke-methylerede cytosinrester, som findes i den ikke-modificerede prøve, som indeholder nukleinsyre. Fortrinsvis omfatter fremgangsmåden til påvisning måling af et fluorescens-signal baseret på fortrængning af den probe, som er specifik for CpG, og fremgangsmåden til opformering og påvisning omfatter kvantitativ PCR baseret på fluorescens.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer endvidere et prøvesæt til påvisning af methylering, som kan anvendes til påvisning af en nukleinsyre, som indeholder methyleret CpG, omfattende et middel til at bære, som er opdelt i afdelinger til modtagelse i tæt indespærring deri af en eller flere beholdere omfattende: (i) et modificerende middel, som modificerer ikke-methyleret cytosin til frembringelse af en omdannet nukleinsyre; (ii) primere til opformering af den omdannede nukleinsyre; (iii) primere til opformering af ikke-modificeret kontrolnukleinsyre; og (iv) en probe, som er specifik for CpG, hvis påvisning er baseret på fortrængning af en probe formidlet af opformering og kvantitativ reel-tid-PCR baseret på fluorescens, ved hvilken den probe, som er specifik for CpG, skelner mellem modificeret, ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre.

Fortrinsvis omfatter det modificerende middel bisulfit. Fortrinsvis omdanner det modificerende middel cytosinrester til uracilrester. Fortrinsvis er den specifikke oligonukleotid-probe en oligonukleotid-probe, som er specifik for CpG, i hvilken proben, men ikke primerne til opformering af den omdannede nukleinsyre, skelner mellem modificeret, ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre. Alternativt er den specifikke oligonukleotid-probe en oligonukleotid-probe, som er specifik for CpG, i hvilken både proben og primerne til opformering af den omdannede nukleinsyre skelner mellem modificeret, ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre. Fortrinsvis omfatter proben yderligere en fluorescerende del knyttet til oligonukleotid-basen direkte eller gennem en linkerdel, og proben er en specifik, dobbelt mærket TaqMan®-probe.

Kortfattet beskrivelse af tegningen

Figur 1 viser en skitse af MSP-teknologien (kendt teknik) ved at anvende PCR-primere, som til at begynde med diskriminerer mellem methyleret og ikke-methyleret (med bisulfit omdannet) DNA. Den øverste del viser resultatet af MSP-processen, når ikke-methyleret, enkeltstrenget, genomisk DNA indledningsvis underkastes omdannelse med natriumbisulfit (deaminering af ikke-methylerede cysteinrester til uracil) efterfulgt af PCR-reaktioner med det omdannede templat, således at et PCR-produkt kun fremkommer med primere, som specifikt annealer til omdannet (og derfor ikke-methyleret) DNA. Den nederste del viser det kontrasterende resultat, når der anvendes en methyleret, enkeltstrenget, genomisk DNA-prøve. Igen sørger processen først for behandling med bisulfit efterfulgt af PCR-reaktioner, således at et PCR-produkt kun fremkommer med primere, som specifikt annealer til uomdannet (og derfor til at begynde med methyleret) DNA.

Figur 2 viser en alternativ fremgangsmåde til vurdering af methylering af DNA med genomisk DNA behandlet med natriumbisulfit ved at anvende ikke-dis-kriminerende (med hensyn til status for methylering) fremad- og revers-PCR-primere for at opformere et specifikt locus. I denne illustration tilvejebringes denatureret (dvs. enkeltstrenget), genomisk DNA, som har blandet status for methylering, således som det typisk ville blive fundet i en prøve til analyse. Prøven omdannes ved en standardreaktion med natriumbisulfit, og de blandede produkter opformeres ved en PCR-reaktion ved at anvende primere, som ikke overlapper nogen som helst CpG-dinukleotider. Dette frembringer en ikke-skævvreden (med hensyn til status for methylering), heterogen pulje af PCR-produkter. Den blandede eller heterogene pulje kan derefter analyseres ved en teknik, som er i stand til at påvise forskelle i sekvens, herunder direkte sekventering af DNA, subkloning af PCR-fragmenter efterfulgt af sekventering af repræsentative kloner, reaktion til forlængelse af enkelt-nukleotid-primer (MS-SNuPE) eller fordøjelse med restriktionsenzymer (COBRA).

Figur 3 viser et strømningsdiagram for fremgangsmåden ifølge opfindelsen i flere, men ikke alle, alternative udførelsesformer for analyse af PCR-produkt.. Variationer i metodologi til påvisning, såsom anvendelsen af teknologi med dobbelt probe (Lightcycler®) eller fluorescerende primere (Sunrise®-teknologi) er ikke vist i denne figur. Specifikt begynder fremgangsmåden ifølge opfindelsen med en blandet prøve af genomisk DNA, som ved en reaktion med natriumbisulfit omdannes til en blandet pulje af forskelle i sekvens, som er afhængige af methylering, ifølge standardprocesser (processen med bisulfit omdanner ikke-methyleret cytosin til uracil). PCR baseret på fluorescens udføres derefter enten ved en ”ikke-skævvredet” PCR-reaktion med primere, som ikke overlapper kendte bindingssteder for methylering af CpG (venstre arm i figur 3), eller ved en ’’skævvredet” reaktion med PCR-primere, som overlapper kendte bindingssteder for methylering af CpG (højre arm i figur 3). Diskriminering af sekvens kan ske enten på niveauet for processen til opformering (C og D) eller på niveauet for processen til påvisning af fluorescens (B) eller begge (D). En kvantitativ afprøvning for mønstre for methylering i prøven af genomisk DNA er vist på den venstre arm (B), i hvilken diskriminering af sekvens sker på niveauet hybridisering af probe. Ved denne version sørger PCR-reaktionen for ikke-skævvredet opformering i nærvær af en fluorescerende probe, som overlapper et særligt, formodet bindingssted for methylering. En ikke-skævvredet kontrol for mængden af indført DNA tilvejebringes ved en reaktion, ved hvilken hverken primerne eller proben ligger oven på nogen som helst CpG-dinukleotider (A). Alternativt, som vist i den højre arm i figur 3, opnås en kvalitativ afprøvning for genomisk methylering ved afprøvning af den skævvredne PCR-pulje med enten kontrololigonukleotider, som ikke ’’dækker” kendte bindingssteder for methylering (C); en på fluorescens baseret version af MSP-teknikken, som ikke udgør en del af opfindelsen), eller med oligonukleotider, som dækker potentielle bindingssteder for methylering (D).

Figur 4 viser en oversigt som diagram over strømning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen under anvendelse af en ”TaqMan®”-probe ved processen til opformering. Kort fortalt behandles dobbeltstrenget, genomisk DNA med natriumbisulfot og underkastes et af to sæt PCR-reaktioner ved at anvende TaqMan®-prober; nemlig med enten skævvredne primere og TaqMan®-probe (venstre kolonne) eller ikke-skævvredne primere og TaqMan®-probe (højre kolonne). TaqMan®-proben er dobbelt mærket med en fluorescerende ’’rapportør” (mærket ”R” i figur 4) og ’’kvælende” (mærket ”0”) molekyler og er designet til at være specifik for en region med et relativt højt indhold af GC, således at den smelter ud ved ca. 10°C højere temperatur i PCR-cyklussen end fremad- eller revers-primerne. Dette tillader, at den forbliver fuldt hybridiseret under trinet PCR-annealing/forlængelse. Da Taq-polymerasen enzymatisk syntetiserer en ny streng under PCR, vil den i den sidste ende nå den annealede TaqMan®-probe. 5’ til 3’-endonukleaseaktiviteten af Taq-polymerase vil derefter fortrænge TaqMan®-proben ved at fordøje den til frigivelse af det fluorescerende rapportørmolekyle til kvantitativ påvisning af det nu ikke-kvalte signal ved at anvende et fluorescerende reel-tid-system som beskrevet i nærværende beskrivelse.

Figur 5A og 5B viser en sammenligning af afprøvningen ifølge opfindelsen med en traditionel COBRA-afprøvning. Figur 5A (plade A) viser en COBRA-gel anvendt til at bestemme niveauet af methylering af DNA ved locus ESR1 i DNA’er med kendt status for methylering (sperma, ikke-methyleret) og HCT116 (methyleret). De relative mængder af de spaltede produkter er vist under gelen. Et fragment på 56 bp repræsenterer DNA-molekyler, i hvilke Tqal-bindingsstedet proximalt til den hybridiserende probe er methyleret i det oprindelige, genomiske DNA. Fragmentet på 86 bp repræsenterer DNA-molekyler, i hvilke det proximale Tqal-bindingssted er ikke-methyleret, og det distale bindingssted er methyleret. Figur 5B (plade B) opsummerer resultaterne af COBRA med den methylerede og ikke-methylerede version af fremgangsmåden til afprøvning ifølge opfindelsen. Resultaterne er udtrykt som forhold mellem de reaktioner, som er specifikke for methylering, og en kontrol reaktion. For de prøver, som er behandlet med bisulfit, var kontrolreaktionen en MYOD1-afprøvning som beskrevet i eksempel 1. For de ubehandlede prøver blev de ACTB-primere, som er beskrevet for RT-PCR-reaktionerne, anvendt som en kontrol for at verificere indføringen af uomdannede DNA-prøver. (ACTB-Primerne spænder ikke over en intran.) ’’Ingen PCR” angiver, at der intet PCR-produkt blev opnået på uomdannet, genomisk DNA med primere til COBRA designet til at opformere DNA-sekvenser, som er omdannet med bisulfit.

Figur 6A-6C illustrerer en bestemmelse af specificiteten af oligonukleotiderne. Otte forskellige kombinationer af fremad-primer, prabe og revers-primer blev afprøvet på DNA-prøver med kendt methylering eller mangel på methylering ved locus ESR1. Figur 6A (plade A) viser den nomenklatur, som er anvendt for kombinationerne af oligo’erne af ESR1. ”U” refererer til den oligosekvens, som annealer med ikke-methyleret DNA, som er omdannet med bisulfit, medens ”M” refererer til den methylerede version. Position 1 angiver fremad-primeren til PCR, position 2 proben og position 3 revers-primeren. De kombinationer, som er anvendt til de otte reaktioner, er vist under hvert par blokke, idet de repræsenterer dobbelte forsøg. Resultaterne er udtrykt som forhold mellem værdierne for ESR1 og kontrolværdierne for MYOD1. Figur 6B (plade B) repræsenterer en analyse af DNA fra menneskelig sperma. Figur 6C (plade C) repræsenterer en analyse af DNA opnået fra den menneskelige, colorectale cancercellelinie MCT116.

Figur 7 viser en afprøvning af reproducerbarheden af reaktionerne. Afprøvninger blev udført ved otte uafhængige reaktioner for at bestemme reproducerbarheden på prøver af kompleks oprindelse. En primær, menneskelig, colorectal adenocarcinoma og normal slimhinde, som passer dertil, blev anvendt til dette formål (prøver 10N og 10T vist i figur 8). De resultater, som er vist i denne figur repræsenterer de rå værdier, som blev opnået ved afprøvningen. Værdierne er blevet plade-normaliseret, men ikke korrigeret for indført DNA. Blokkene viser de middelværdier, som blev opnået for de otte separate reaktioner. Blokkene for fejl repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien.

Figur 8 illustrerer en sammenligning af ekspression af MLH1, ustabilitet af mikrosatellit og promotor-methylering af MLH1 af 25 menneskelige, coloractale prøver, som var parret således, at de passede sammen. Det øverste diagram viser niveauerne for ekspression af MHL1 målt ved kvantitativ, reel-tid RT-PCR (Taq-Man®) i normale, colorectale prøver (skraverede blokke) og prøver fra tumorer (faste, sort blokke), som passede sammen. Niveauerne for ekspression er afbildet som er forhold mellem målinger for MLH1 og ACTB. Status for ustabilitet af mikrosatelitter (MSI) er angivet ved de cirkler, som er placeret mellem de to diagrammer. En sort cirkel betegner MSI-positivt resultat, medens en åben cirkel angiver, at prøven er MSI-negativ, som bestemt ved analyse af loci for BAT25 og BAT26. Det nederste diagram viser status for methylering af locus for MLH1 som bestemt ved en fremgangsmåde ifølge opfindelsen. Niveauerne for methylering er repræsenteret som forholdet mellem den ved MLH1 methylerede reaktion og reaktionen med MYOD1.

Detaljeret beskrivelse af opfindelsen

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en hurtig, følsom, reproducerbar fremgangsmåde med høj kapacitet til påvisning af mønstre for methylering i prøver af nukleinsyre. Opfindelsen sørger for modifikation af nukleinsyren, som er afhængig af methylering, og anvender derefter fremgangsmåder til opformering, påvisning af nukleinsyre eller begge dele til at skelne mellem methylerede og ikke-methylerede rester, som findes i den oprindelige prøve af nukleinsyre. Ved en foretrukket udførelsesform sørger opfindelsen for bestemmelse af status for methylering af CpG-øer i prøver af genomisk DNA. I modsætning til tidligere metoder til bestemmelse af mønstre for methylering er påvisning af methyleret nukleinsyre relativt hurtig og er baseret på af opformering formidlet fortrængning af specifikke oligonukleotid-prober. Ved en foretrukket udførelsesform sker opformering og påvisning faktisk samtidigt som målt ved kvantitativ reel-tid-PCR baseret på fluorescens (’’RT-PCR”) ved at anvende specifikke, dobbelt mærkede Taq-Man®-oligonukleotid-prober. De prober, som kan fortrænges, kan være specifikt designede til et skele mellem methylerede og ikke-methylerede bindingssteder for CpG, som findes i den oprindelige, ikke-modificerede prøve af nukleinsyre.

Lige som teknikken med PCR, som er specifik for methylering (’’MSP”, US patent nr. 5.786.146), sørger den foreliggende opfindelse for signifikante fordele i forhold til tidligere på PCR baserede eller andre metoder (f.eks. Southern-analyser) anvendt til bestemmelse af mønstre for methylering. Den foreliggende opfindelse er væsentlig mere følsom end Southern-analyse og letter påvisningen af et lavt antal (procentdel) af methylerede alleler i meget små prøver af nukleinsyre samt i prøver indlejret i paraffin. Desuden er analyse, hvor der er tale om genomisk DNA, ikke begrænset til DNA-sekvenser, som genkendes af restriktionsendonukleaser, som er følsomme for methylering, hvilket således tillader fin kortlægning af mønstre for methylering tværs over bredere regioner, som er rige på CpG. Den foreliggende opfindelse eliminerer også hvilke som helst falsk-positive resultater på grund af ufuldstændig fordøjelse med restriktionsenzymer, som er følsomme for methylering, uløseligt forbundet med tidligere metoder til methylering baseret på PCR.

Den foreliggende opfindelse giver også signifikante fordele i forhold til MSP-tek-nologi. Den kan anvendes som en kvantitativ metode til måling af mængder af methylering og er væsentlig hurtigere. Én vigtig fordel i forhold til MSP-teknologi er, at gelelektroforesen ikke alene er et tidkrævende, manuelt arbejde, som begrænser mulighederne for høj kapacitet, men manipulering og åbning af PCR-reaktionsglas forøger chancen for simpel fej I identifikation, og den forøger kraftigt chancen for forurening af fremtidige PCR-reaktioner med spor af PCR-produkter. Standardmetoden til at undgå PCR-forurening ved inkorporering af uracil og anvendelsen af uracil-DNA-glycosylase (AmpErase) er uforligelig med bisulfitteknologi på grund af tilstedeværelsen af uracil i DNA behandlet med bisulfit. Derfor er det at udgå forurening med PCR-produkt ved en anvendelse med høj kapacitet med DNA behandlet med bisulfit en større teknisk udfordring end opformeringen af ikke-modificeret DNA. Den foreliggende opfindelse kræver ikke nogen manipulering eller behandling efter PCR. Dette nedsætter ikke alene den mængde arbejde, som er involveret i analysen af DNA behandlet med bisulfit, men det tilvejebringer også et middel til at undgå håndtering af PCR-produkter, som kunne forurene fremtidige reaktioner.

To faktorer begrænser MSP til, i bedste fald, halvkvantitativ anvendelse. For det første stammer information om methylering ved MSP fra sammenligningen af separate PCR-reaktioner (de methylerede og ikke-methylerede versioner). Der er iboende vanskeligheder ved at foretage kinetiske sammenligninger af to forskellige PCR-reaktioner uden en yderst kvantitativ metode til af følge opformeringsreaktionen, såsom kvantitativ reel-tid-PCR. Det andet problem har relation til det faktum, at der sørges for opformering ved MSP ved hjælp af særlige, for CpG specifikke oligonukleotider, dvs. med skævvredne primere. Ofte indeholder den DNA-sekvens, som dækkes af sådanne primere, mere end ét CpG-dinukleotid med den konsekvens, at den opformerede sekvens kun vil repræsentere én af flere potentielle sekvenser, som er til stede, afhængigt af mønstret for methylering af DNA i det oprindelige, genomiske DNA. F.eks. kunne der, hvis fremad-primeren er et 24-mer oligonukleotid, som dækker 3 CpG’er, derefter opstå 23 = 8 forskellige, teoretiske permutationer af sekvensen i det genomiske DNA efter omdannelse med bisulfit i sekvensen på 24 nukleotider. Hvis der kun køres en fuldt methyleret eller fuldt ikke-methyleret reaktion, så analyseres derefter kun 2 ud af de 8 mulige tilstande for methylering.

Situationen kompliceres yderligere, hvis de mellemliggende tilstande for methylering opformeres ikke-specifikt af de fuldt methylerede eller fuldt ikke-methylerede primere. I overensstemmelse hermed beskriver MSP-patentet eksplicit kun en ikke-kvantitativ teknik baseret på forekomsten eller ikke-forekomsten af et PCR-produkt ved den fuldt methylerede imod den fuldt ikke-methylerede reaktion, snarere end en sammenligning af kinetikken af de to reaktioner. I modsætning hertil sørger én udførelsesform for den foreliggende opfindelse for den ikke-skævvredne opformering af alle mulige tilstande for methylering ved at anvende primere, som ikke dækker nogen som helst CpG-sekvenser i den oprindelige, ikke-modificerede DNA-sekvens. I den udstrækning, hvor alle mønstre for methylering opformeres på lige fod, kan kvantitativ information om mønstre for methylering af DNA derefter udskilles fra den resulterende PCR-pulje ved en hvilken som helst teknik, som er i stand til at påvise forskelle i sekvens (f.eks. ved PCR baseret på fluorescens).

Endvidere er den foreliggende opfindelse væsentlig hurtigere end MSP. Som angivet ovenfor sætter MSP sin lid til forekomsten eller ikke-forekomsten af et produkt fra PCR ved den methylerede imod den ikke-methylerede status af en CpG-sekvens dækket af en primer. Minimalt kræver dette gennemførelse af analyse ved agarose- eller polyacrylamid-gelelektroforese (se US patent 5.786.146, figurerne 2A-2E og 3A-3E). Desuden ville bestemmelse status for methylering af hvilke som helst bindingssteder for CpG i en given, ved MSP opformeret region kræve yderligere analyser, såsom: (a) restriktionsendonuklase-analyse enten før eller efter (f.eks. COBRA-analyse; Xiong og Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997), modifikation og opformering af nukleinsyre, forudsat at enten den ikke-modificerede sekvensregion, som er af interesse, indeholder bindingssteder, som er følsomme for methylering, eller at modifikation (f.eks. bisulfit) resulterer i skabelse eller ødelæggelse af restriktionsbindingssteder: (b) enkelte reaktioner til forlængelse af nukleotidprimer (Ms-SNuPE, Gonzalgo og Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2532, 1997); eller (c) DNA-sekventering af de opformerede produkter. Sådanne yderligere analyser er ikke alene genstand for fejl (ufuldstændig fordøjelse med restriktionsenzymer), men føjer også yderligere tid og omkostninger til fremgangsmåden til bestemmelse af status for methylering af CpG af f.eks. prøver afgenomisk DNA. I modsætning hertil sker, ved en foretrukket udførelsesform forden foreliggende opfindelse, opformering og påvisning samtidig som målt ved kvantitativ reel-tid-PCR baseret på fluorescens, ved at anvende specifikke, dobbelt mærkede oligonukleotid-prober, I princippet kan status for methylering i en hvilken som helst sekvens, som er specifik for proben, i en opformeret region bestemmes samtidig med opformering, uden noget krav om efterfølgende manipulering eller analyse.

Som gjort rede for af opfinderne af MSP, ”Den eneste teknik, som kan tilvejebringe mere direkte analyse end MSP for de fleste bindingssteder for CpG i en afgrænset region er genomisk sekventering”. (US patent 5.786.146, 5, linie 15-17). Den foreliggende opfindelse tilvejebringer faktisk en fremgangsmåde til delvis, direkte sekventering af modificerede bindingssteder for CpG i en kendt (i forvejen sekventeret) region i genomisk DNA. Således konstrueres en serie af TaqMan®-prober, som er specifikke for CpG, hver svarende til et særligt bindingssted for methylering i en given, opformeret DNA-region. Denne serie af prober udnyttes derefter ved parallelle reaktioner til opformering, ved at anvende portioner af en enkelt, modificeret DNA-prøve, til samtidig bestemmelse af det fuldstændige mønster for methylering, som findes i den oprindelige, ikke-modificerede prøve af genomisk DNA. Dette opnås på en brøkdel af den tid og de omkostninger, som kræves til direkte sekventering af prøven af genomisk DNA, og er væsentlig mere følsom. Desuden sørger én udførelsesform for den foreliggende opfindelse for en kvantitativ vurdering af et sådant mønster for methylering.

Beskrevet heri er fremgangsmådeteknikker og dermed forbundne, associerede, prøvesæt ved at anvende et middel (f.eks. bisulfit), som modificerer nukleinsyre, som er afhængigt af methylering, til både kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af status for methylering af CpG i prøver af nukleinsyre (f.eks. genomiske DNA-prøver). De fire processer er skitseret i figur 3 og mærket i bunden med bogstaverne A til D. Samlet er diskriminering af methyleret CpG-sekvens designet til at ske på niveauet opformering, hybridisering af probe eller på begge niveauer. F.eks. udnytter anvendelser C og D ’’skævvredne” primere, som skelner mellem modificeret, ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre og tilvejebringer diskriminering af methyleret CpG-sekvens på niveauet PCR-opformering. Fremgangsmåde B udnytter ”ikke-skævvredne” primere (som ikke dækker bindingssteder for methylering af CpG) til at sørge for ikke-skævvredet opformering af modificeret nukleinsyre, men udnytter snarere prober, som skelner mellem modificeret, ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre, til at sørge for kvantitativ diskriminering af methyleret CpG-sekvens på niveauet påvisning (f.eks. kun på niveauet hybridisering af fluorescerende (eller luminescerende) probe. Fremgangsmåde A sørger ikke som sådan for diskriminering af methyleret CpG-sekvens på hverken niveauet opformering eller påvisning, men understøtter og validerer de andre tre anvendelser ved at tilvejebringe kontrolreaktioner for tilført DNA.

Fremgangsmåde D. Ved en første udførelsesform (figur 3, anvendelse D) tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til kvalitativ påvisning af en nukleinsyre indeholdende methyleret CpG, idet fremgangsmåden indbefatter: en prøve indeholdende nukleinsyre bringes i kontakt med et modificerende middel, som modificerer ikke-methyleret cytosin til frembringelse af en omdannet nukleinsyre; den omdannede nukleinsyre opformeres ved hjælp af to oligonukleotid-primere i nærvær af en specifik probe til hybridisering af oligonukleotid, ved hvilken både primerne og proben skelner mellem modificeret, ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre, og den ’’methylerede” nukleinsyre påvises baseret på fortrængning af probe, som er formidlet af opformering.

Udtrykket ’’modificerer” betyder som anvendt i nærværende beskrivelse omdannelsen af et ikke-methyleret cytosin til er andet nukleotid af det modificerende middel, idet denne omdannelse skelner ikke-methyleret fra methyleret cytosin i den oprindelige prøve af nukleinsyre. Fortrinsvis modificerer midlet ikke-methyleret cytosin til uracil. Fortrinsvis er det middel, som anvendes til modificering af ikke-methyleret cytosin, natriumbisulfit, imidlertid kan andre ækvivalente, modificerende midler, som selektivt modificerer ikke-methyleret cytosin, men ikke methyleret cytosin, anvendes som erstatning ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Natriumbisulfit reagerer let med 5,6-dobbeltbindingen i cytosin, men ikke med methyleret cytosin, til frembringelse af et sulfoneret cytosinmellemprodukt, som undergår deaminering under alkaliske betingelser til frembringelse af uracil (eksempel 1). Fordi Taq-polymerase genkender uracil som thymin og 5-methylcytidin (m5C) som cytidin, resulterer kombinationen i rækkefølge af behandling med natriumbisulfit og opformering ved PCR i den sluttelige omdannelse af ikke-methylerede cytosinrester til thymin (C—>U—>T) og methylerede cytosinrester (”mC”) til cytosin (mC->nnC->C). Således skaber behandling af genomisk DNA med natriumbisulfit forskelle i sekvens, som er afhængige af methylering, ved at omdanne ikke-methylerede cytosiner til uracil, og efter PCR indeholder det resulterende produkt kun cytosin i positioner, hvor methyleret cytosin forekommer i den ikke-modificerede nukleinsyre.

Oligonukleotid”-primere” betyder som anvendt i nærværende beskrivelse lineære, enkeltstrengede, oligomere deoxyribonuklein- eller ribonukleinsyremolekyler, som er i stand til sekvensspecifik hybridisering (annealing) med komplementære strenge af modificeret eller ikke-modificeret nukleinsyre. Som anvendt i nærværende beskrivelse er de specifikke primere fortrinsvis DNA. Primerne ifølge opfindelsen indbefatter oligonukleotider af hensigtsmæssig sekvens og tilstrækkelig længde, således at der sørges for specifik og effektiv initiering af polymerisation (forlængelse af primer) under opformeringsprocessen. Som anvendt ved fremgangsmåderne ifølge opfindelsen indeholder oligonukleotid-primere typisk 12-30 nukleotider eller mere, selv om de kan indeholde færre nukleotider. Fortrinsvis indeholder primerne fra 18 til 30 nukleotider. Den nøjagtige længde vil afhænge af flere faktorer, herunder temperatur (under opformering), puffer og sammensætning af nukleotid. Fortrinsvis er primere enkeltstrengede, selv om dobbeltstrengede primere kan anvendes, hvis strengene først adskilles. Primere kan fremstilles ved at anvende en hvilken som helst egnet metode, såsom traditionelle phosphotriester- og phosphodiester-metoder, eller automatiserede udførelsesformer, som er almindelig kendt i teknikken.

Som anvendt i udførelsesformerne ifølge opfindelsen i nærværende beskrivelse er de specifikke primere fortrinsvis designet til at være praktisk taget komplementære til hver streng i det genomiske locus, som er af interesse. Typiske er en primer komplementær til den negative (-) streng i locus (den nedre streng i et horisontalt placeret, dobbeltstrenget DNA-molekyle), og den anden er komplementær til den positive (+) streng (’’øvre” streng). Som anvendt i udførelsesformen i anvendelse D er primerne fortrinsvis designet til at overlappe potentielle bindingssteder for methylering af DNA (CpG-nukleotider) og specifikt skelne modificeret, ikke-methyleret fra methyleret DNA. Fortrinsvis er denne diskriminering af sekvens baseret på de forskellige temperaturer til annealing i oligonukleotider, som passer perfekt sammen, imod sådanne, som ikke passer sammen. Ved udførelsesformen i anvendelse D er primere typisk designet til at overlappe fra én til adskillige CpG-sekvenser. Fortrinsvis er de designet til at overlappe fra 1 til 5 CpG-sekvenser og mest foretrukket fra 1 til 4 CpG-sekvenser. I modsætning hertil overlapper primerne ved en kvantitativ udførelsesform for opfindelsen ikke nogen som helst CpG-sekvenser.

Hvor der er tale om fuldt ”ikke-methylerede” (komplementært til modificerede, ikke-methylerede strenge af nukleinsyrer), sæt af primere, indeholder anti-sen-se-primerne adnosinrester (”As”) i stedet for guanosinrester (”Gs”) i sekvensen i den tilsvarende (-)-streng. Disse udskiftede As i anti-sense-primeren vil være komplementære til uracil- og thymidinresterne (”Us” og ”Ts”) i den tilsvarende region i (+)-strengen, som er et resultat af modifikation med bisulfit af ikke-methylerede C-rester og efterfølgende opformering. Sense-primerne er i dette tilfælde fortrinsvis designet til være komplementære til produkterne fra forlængelse med anti-sense-primer og indeholder Ts i stedet for ikke-methyleret Cs i den tilsvarende sekvens i (+)-strenge. Disse udskiftede Ts i sense-primeren vil være komplementære til det As, som er inkorporeret i produkterne fra forlængelse med anti-sense-primer i positioner komplementære til ikke-modificeret Cs (Us) i den oprindelige (+)-streng.

Hvor der er tale om fuldt methylerede primere (komplementære til nukleinsyrestrenge, som indeholder methyleret CpG), vil anti-sense-primerne ikke indeholde As i stedet for Gs i sekvensen i den tilsvarende (-)-streng, som er komplementært til det methylerede Cs (dvs. mCpG-sekvenser) i den oprindelige (+)-streng. På samme måde vil sense-primerne i dette tilfælde ikke indeholde Ts i stedet for methyleret Cs i mCpG-sekvenserne i den tilsvarende (+)-streng. Imidlertid vil Cs, som ikke er i CpG-sekvenser i regioner, som er dækket af de fuldt methylerede primere, og som ikke er methyleret, være repræsenteret i det fuldt methylerede sæt af primere som beskrevet ovenfor for ikke-methylerede primere.

Fortrinsvis sørger processen til opformering, som anvendt ved udførelsesformen for anvendelse D, for opformering af nukleinsyre, som er omdannet med bisulfit, ved hjælp af to oligonukleotid-primere i nærvær af en specifik probe til hybridisering af oligonukleotid. Både primerne og proben skelner mellem modificeret, ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre. Desuden er påvisning af den ’’methylerede” nukleinsyre baseret på fluorescens af probe formidlet af opformering. Ved én udførelsesform skabes fluorescensen af degradering af probe ved 5’ til 3’-exonuklease-aktivitet af polymeraseenzymet. Ved en anden udførelsesform skabes fluorescensen ved overføring af fluorescensenergi mellem to nabostillede, hybridiserende prober (Lightcycler®-teknologi) eller mellem en hybridiserende probe og en primer. Ved en anden udførelsesform skabes fluorescensen af selve primeren (Sunrise®-teknologi). Fortrinsvis er fremgangsmåden til opformering en enzymatisk kædereaktion, som anvender oligonukleotid-primerne til at frembringe eksponentielle mængder af opformeret produkt, fra et mållocus, i relation til antallet af involverede reaktionstrin.

Som beskrevet ovenfor er ét medlem af et sæt af primere komplementært til (-)-strengen, medens det andet er komplementært til (+)-strengen. Primerne er udvalgt til at sammenstille det område af interesse, som skal opformeres, dvs. ’’amplikon”. Hybridisering af primerne til denatureret målnukleinsyre efterfulgt af forlængelse af primeren med en DNA-polymerase og nukleotider resulterer i syntese af nye strenge af nukleinsyrer svarende til amplikon, Fortrinsvis er DNA-polymerasen Taq-polymerase, som gængs anvendt i teknikken. Selv om ækvivalente polymeraser med en 5’- til 3’-nukleaseaktivitet kan anvendes i stedet. Fordi de nye sekvenser i amplikon også er templater for primerne og polymerasen, resulterer gentagne cyklusser af denaturering, annealing og forlængelse i eksponentiel produktion af amplikon. Produktet fra kædereaktionen er en særskilt duplex af nukleinsyre, svarende til sekvensen i amplikon, med termini afgrænset ved enderne af de anvendte, specifikke primere. Fortrinsvis er den anvendte metode til opformering PCR (Mullis et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51:263-273; Gibbs, Anal. Chem. 62:1202-1214,1990) eller mere foretrukket automatiserede udførelsesformer derfor, som er almindelig kendt i teknikken.

Fortrinsvis påvises forskelle i sekvens, som er afhængige af methylering, ved metoder baseret på kvantitativ PCR baseret på fluorescens (kvantitativ reel-tid-PCR, Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996; Gibson et al., Genome Res. 6:995-1001, 1996) (f.eks. ’’TaqMan®”-, ’’Lightcycler®”- og ”Sunrise®”-teknolo-gier). For ’’TaqMan®-” og ”Lightcycler®”-teknologierne kan diskriminering af sekvens ske på et ethvert eller begge af to trin: (1) trinet til opformering eller (2) trinet til påvisning af fluorescens. Hvor der er tale om ”Sunrise®”-teknologien, er trinene til opformering og fluorescens de samme. Hvor der er tale om FRET-hy-bridisering, format af prober på Lightcyclei"®, kan ethvert eller begge FRET-oli-gonukleotiderne anvendes til at skelne forskellen i sekvens. Mest foretrukket er den proces til opformering, som anvendes ved alle udførelsesformer ifølge opfindelsen i nærværende beskrivelse, den med kvantitativ reel-tid-PCR baseret på fluorescens (Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996) ved anvendelse af en dobbelt mærket, fluorescerende oligonukleotid-probe (”TaqMan®-PCR, ved at anvende et ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, Californien).

Reaktionen ”TaqMan®-PCR anvender et par primere til opformering sammen med et udspørgende oligonukleotid, som ikke kan forlænges, kaldt en TaqMan®-probe, som er designet til at hybridisere til en sekvens, som er rig på GC, placeret mellem fremad- og revers-primerne (dvs. sense- og anti-sense-pri-merne). TaqMan®-Proben omfatter yderligere en fluorescerende ”rapportør”del og en ’’kvælende del” covalent bundet til linkerdele (f.eks. phosphoramiditer) knyttet til nukleotider i TaqMan®-oligonukleotidet. Eksempler på egnede, rapporterende og kvælende molekyler er de 5’-fluorescerende, rapporterende farvestoffer 6FAM (”FAM”, 2,7-dimethoxy-4,5-dichlor-6-carboxy-fluorescein) og TET (6-carboxy-4,7,2’,7’-tetrachlorfluorescein) og det 3’-kvælende farvestof TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamin) (Livak et al., PCR Methods Appl. 4:357-362, 1995; Gibson et al., Genome Res. 6:995-1001, 1996); og Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996). Én fremgangsmåde til at designe hensigtsmæssige TaqMan®-prober indebærer udnyttelse af et værktøj, som letter software, såsom ’’Primer Express”, som kan bestemme placering af de variable i CpG-øer i sekvenser, som er rige på CpG, til at sørge for en forskel i smeltetemperatur på mindst 10°C (i forhold til primerens smeltetemperaturer) på grund af enten specifik sekvens (tættere binding af GC, i forhold til basepar AT) eller længde af primer.

TaqMan®-proben kan eller kan ikke dække kendte bindingssteder for methylering af CpG, afhængig af den særlige fremgangsmåde ifølge opfindelsen, som anvendes. Fortrinsvis er TaqMan®-proben designet til at skelne mellem modificeret og methyleret aminosyre ved at overlappe fra 1 til 5 CpG-sekvenser. Som beskrevet ovenfor for de fuldt ikke-methylerede og fuldt methylerede sæt af primere kan TaqMan®-prober være designet til at være komplementære til enten ikke-modificeret nukleinsyre eller, ved hensigtsmæssig udskiftning af baser, til med bisulfit modificerede sekvenser, som var enten fuldt ikke-methylerede eller fuldt methylerede i den oprindelige, ikke-modificerede prøve af nukleinsyre.

Hver primer eller probe af oligonukleotid ved TaqMan®-PCR-reaktionen kan spænde over hvor som helst fra nul til mange forskellige CpG-dinukleotider, som hver kan resultere i to forskellige variationer i sekvens efter behandling med bisulfit (mCpG eller UpG). F.eks. er, hvis et oligonukleotid spænder over 3 CpG-oligonukleotider, derefter antallet af mulige varianter af sekvens, som opstår i det genomiske DNA, 23 = 8 forskellige sekvenser. Hvis fremad- og revers-primeren hver spænder over 3 CpG’er, og oligonukleotidet i proben (eller begge oligonukleotider sammen, hvor der er tale om FRET-format) spænder over andre 3, bliver det totale antal permutationer i sekvens 8 X 8 X 8 = 512. I teorien kunne man designe separate PCR-reaktioner til kvantitativ analyse af de relative mængder af hver af disse 512 varianter i sekvens. I praksis kan en væsentlig mængde kvalitativ information om methylering afledes ud fra analysen af et langt mindre antal varianter i sekvens. Således kan fremgangsmåden ifølge opfindelsen, i sin enkleste form, gennemføres ved at designe reaktioner for de fuldt methylerede og de fuldt ikke-methylerede varianter, som repræsenterer de mest ekstreme varianter i sekvens i et hypotetisk eksempel (se figur 3, anvendelse D). Forholdet mellem disse to reaktioner, eller alternativt forholdet mellem den methylerede reaktion og en kontrolreaktion (figur 3, anvendelse A), ville tilvejebringe et mål for niveauet af methylering af DNA på dette locus. Et mere detaljeret overblik over den kvalitative version er vist i figur 4. Påvisning af methylering ved udførelsesformen i anvendelse D, som ved andre udførelsesformer i nærværende beskrivelse, er baseret på fortrængning af proben formidlet af opformering. I teorien kunne fremgangsmåden med fortrængning af proben være designet til at efterlade proben intakt eller til at resultere i fordøjelse af proben. Fortrinsvis sker, som anvendt i nærværende beskrivelse, fortrængning af proben ved fordøjelse af proben under opformering. Under fasen med forlængelse i PCR-cyklussen spaltes den fluorescerende, hybridiserende probe af den 5’- til 3’-nukleolytiske aktivitet af DNA-polymerasen. Ved spaltning af proben overføres emissionen af den rapporterende del ikke længer effektivt til den kvælende del, hvilket resulterer i en stigning i den rapporterende dels fluorescerende emissionsspektrum ved 518 nm. Den fluorescerende intensitet af den kvælende del (f.eks. TAMRA) ændrer sig meget lidt i løbet af opformeringen ved PCR. Flere faktorer kan øve indflydelse på effektiviteten af TaqMan®-PCR-reaktioner, herunder: koncentrationer af magnesium og salt, reaktionsbetingelser (tid og temperatur), sekvenser i primere og størrelse og sammensætning af målet for PCR (dvs. størrelse af amplikon). Optimering af disse faktorer for at frembringe den optimale intensitet af fluorescens for et givet genomisk locus er indlysende for en fagmand på området PCR, og foretrukne betingelser er yderligere illustreret i ’’eksempler” i nærværende beskrivelse. Amplikon kan variere i størrelse fra 50 til 8.000 basepar, eller større, men kan være mindre. Typisk er amplikon fra 100 til 1000 basepar og er fortrinsvis fra 100 til 500 basepar. Fortrinsvis overvåges reaktionerne i reel tid ved at udføre opformering ved PCR ved at anvende optiske bakker og låg med 96 brønde og anvende en sekvensdetektor (ABI Prism) for at tillade måling af de fluorescerende spektre af alle 96 brønde i den termiske cyklusanordning kontinuerligt under opformeringen ved PCR. Fortrinsvis køres fremgangsmåde D i kombination med fremgangsmåde A (figur 3) for at tilvejebringe kontroller for mængden af indført nukleinsyre og normalisere data fra bakke til bakke.

Anvendelse C. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen som ovenfor kan modificeres for at undgå diskriminering af sekvens på niveauet påvisning af PCR-produkt. Således er, ved en yderligere kvalitativ udførelsesform for fremgangsmåden (figur 3, anvendelse C) beskrevet i nærværende beskrivelse, netop primerne designet til at dække CpG-dinukleotider, og diskriminering af sekvens sker kun på niveauet opformering. Fortrinsvis er den probe, som anvendes ved denne udførelsesform stadigvæk en TaqMan®-probe, men er designet således, at den ikke overlapper nogen som helst CpG-sekvenser, som findes i den oprindelige, ikke-modificerede nukleinsyre. Udførelsesformen i anvendelse C repræsenterer en på fluorescens baseret reel-tid-version af MSP-teknologi med høj kapacitet, ved hvilken en væsentlig forbedring er blevet opnået ved at nedsætte den tid, som kræves til påvisning af methylerede CpG-sekvenser. Fortrinsvis overvåges reaktionerne i reel tid ved at udføre PCR-opformering ved at anvende optiske bakker og låg med 96 brønde og anvende en sekvensdetektor (ABI Prism) for at tillade måling af de fluorescerende spektre af alle 96 brønde i den termiske cyklusanordning under PCR-opformeringen. Fortrinsvis køres fremgangsmåde C i kombination med fremgangsmåde A for at tilvejebringe kontroller for mængden af indført nukleinsyre og normalisere data fra bakke til bakke.

Anvendelse B. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan også modificeres for at undgå diskriminering af sekvens på niveauet PCR-opformering (figur 3, A og B). Ved en kvantitativ udførelsesform for fremgangsmåden (figur 3, anvendelse B) er netop proben designet til at dække CpG-dinukleotider, og diskriminering af sekvens sker udelukkende på niveauet hybridisering af probe. Fortrinsvis anvendes TaqMan®-prober. Ved denne version opformeres varianter i sekvens, som er et resultat af trinet omdannelse med bisulfit, med lige stor effektivitet, når blot der ikke er nogen iboende skævhed i opformering (Warnecke et al., Nucleic Acids Res. 25:4422-4426, 1997). Design af separate prober til hver af de forskellige varianter i sekvens, som er forbundet med et særligt mønster for methylering (f.eks. 23 = 8 prober, hvor der er tale om 3 CpG’er), ville tillade en kvantitativ bestemmelse af hver permutation af sekvens i den blandede pulje af PCR-produkter. Fortrinsvis overvåges reaktionerne i reel tid ved at udføre PCR-opformering ved at anvende optiske bakker og låg med 96 brønde og anvende en sekvensdetektor (ABI Prism) for at tillade måling af de fluorescerende spektre af alle 96 brønde i den termiske cyklusanordning under PCR- opformeringen. Fortrinsvis køres fremgangsmåde B i kombination med fremgangsmåde A for at tilvejebringe kontroller for mængden af indført nukleinsyre og normalisere data fra bakke til bakke.

Anvendelse A. Fremgangsmåde A (figur 3) sørger ikke i sig selv for diskriminering af methyleret CpG-sekvens hverken på niveauerne opformering eller påvisning, men understøtter og validerer de andre tre anvendelser ved at tilvejebringe kontrolreaktioner for mængden af indført DNA og normalisere data fra bakke til bakke. Således repræsenterer, hvis hverken primerne eller proben ligger oven på nogen som helst CpG-dinukleotider, reaktionen derefter ikke-skævvredet opformering, og måling af opformering ved at anvende kvantitativ reel-tid-PCR baseret på fluorescens tjener som en kontrol for mængden af indført DNA (figur 3, anvendelse A). Fortrinsvis mangler fremgangsmåde A ikke alene CpG-dinukleotider i primerne og proben(erne), men indeholder heller ikke nogen som helst CpG’er i amplikon for at undgå hvilke som helst forskelsvirkninger af behandling med bisulfit på fremgangsmåden til opformering. Fortrinsvis er amplikon for fremgangsmåde A er region af DNA, som ikke ofte er underkastet ændringer i antallet af kopier, såsom opformering eller deletion af gen.

Resultater opnået med den kvalitative version af teknologien er beskrevet i nedenstående eksempler. Flere dusin menneskelige tumorprøver er blevet analyseret ved at anvende denne teknologi med fortrinlige resultater. Høj kapacitet ved at anvende en TaqMan®-maskine tillod gennemførelse af 1100 analyser i løbet af tre dage med én TaqMan®-maskine.

Eksempel 1

Et indledende forsøg blev udført for at validere strategien ifølge opfindelsen til vurdering af status for methylering af CpG-øer i genomisk DNA. Dette eksempel viser en sammenligning mellem DNA fra menneskelig sperma (kendt for at være yderst ikke-methyleret) og DNA fra HCT116 (fra en menneskelig, colorectal cellelinie, kendt for at være højt methyleret på mange bindingssteder for CpG) med hensyn til status for methylering af specifikke CpG-øer, som kan hypermethyleres, i fire forskellige gener. COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis; Xiong og Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997) blev anvendt som et uafhængigt mål for status af methylering.

Isolering af DNA og behandling med bisulfit. Kort fortalt blev genomisk DNA isoleret fra menneskelig sperma eller HCT116-celler ved standardmetoden med fordøjelse med proteinase K og ekstraktion med phenol-chloroform (Wolf et al., Am. J. Hum. Genet. 51:478-485, 1992). DNA’et blev derefter behandlet med natriumbisulfit ved indledende denaturering i 0,2 M NaOH efterfulgt af tilsætning af natriumbisulfit og hydroquinon (til slutkoncentrationer på 3,1 M henholdsvis 0,5 M), inkubation i 16 timer ved 55°C, afsaltning (DNA Clean-Up System, Promega), desulfonering med 0,3 M NaOH og til sidst udfældning med ethanol (Xiong og Laird, supra, som citerer Sadri og Hornsby, Nucleic Acids Res. 24:5058-5059, 1996, se også Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). Efter behandling med bisulfit blev DNA’et underkastet enten COBRA-analyse som tidligere beskrevet (Xiong og Laird, supra) eller opformeringen ifølge opfindelsen ved at anvende kvantitativ reel-tid-PCR baseret på fluorescens (Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996; Gibson et al., Genome Res. 6:995-1001, 1996). COBRA og MsSNuPE-reaktioner. Gener ESR1 og APC blev analyseret ved at anvende COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis). Til COBRA-analyse blev forskelle i sekvens, som er afhængige af methylering, indført i det genomiske DNA ved standardbehandling med bisulfit ifølge den metode, som er beskrevet af Frommer et al. {Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992) (1 pg DNA fra laksesperma blev tilsat som et bærestof, før det genomiske DNA blev behandlet med natriumbisulfit). Opformering ved PCR af det med bisulfit omdannede DNA blev udført ved at anvende primere, som er specifikke for de interessante CpG-øer, efterfulgt af fordøjelse med restriktionsendonuklease, gelelektroforese og påvisning ved at anvende specifikke, mærkede hybridiseringsprober. De sæt af fremad- og revers-primere, som blev anvendt til generne ESR1 og APC, er TCCTAAAACTACACTTACTCC [SEQ ID NO: 35], GGTTATTTGGAAAAAGAGTATAG [SEQ ID NO: 36] (promotor for ESR1) henholdsvis AGAGAGAAGT AGTT GT GTTAAT [SEQ ID NO: 37], ACTACACCAATACAACCACAT [SEQ ID NO: 38] (promotor for APC). PCR-Produkter fra ESC1 blev fordøjet med restriktionsendonukleaser Taq1 og BstU1, medens produkterne fra APC blev fordøjet med Taq1 og SfaN1, for at måle methylering af 3 bindingssteder for CpG for APC og 4 bindingssteder for CpG for ESR1. De fordøjede PCR-produkter blev underkastet elektroforese på denaturerende polyacrylamidgel og overført til nylonmembraner (Zetabind, American Bioanalytical) ved elektroblotting. Membranerne blev hybridiseret med et ved 5’-enden mærket oligonukleotid for at gøre både fordøjede og ufordøjede DNA-fragmenter af interesse synlige. De anvendte prober er som følger: ESR1, AAACCAAAACTC [SEQ ID NO: 39]; og APC, CCCACACCCAACCAAT [SEQ ID NO: 40]. Kvantificering blev udført med Phosphoimager 445SI (Molecular Dynamics). Beregninger blev udført i Microsoft Excel. Niveauet af methylering af DNA ved de undersøgte bindingssteder for CpG blev også bestemt ved at beregne procentdelen af de fordøjede PCR-fragmenter (Xiong og Laird, supra). MLH1 og CDNK2A blev analyseret ved at anvende MsSNuPE (Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension Assay), udført som beskrevet af Gonzalgo og Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531). PCR-Opformering af det med bisulfit omdannede DNA blev udført ved at anvende primere, som er specifikke for de interessante CpG-øer, og påvisning blev udført ved at anvende yderligere, specifikke primere (prober til forlængelse). De sæt af fremad- og revers-primere, som blev anvendt til generne MLH1 og CDKN2A, er: G G AG GTT AT AAG AGTAG G GTTAA [SEQ ID NO: 41], CCAACCAATAAAAACAAAAATACC [SEQ ID NO: 42] (promotor for MLH1), GTAGGTGGGGAGGAGTTTAGTT [SEQ ID NO: 43], TCTAATAACCAACCAACCCCTCC [SEQ ID NO: 44] (promotor for CDKN2A) henholdsvis TT GTATTATTTT GTTTTTTTT G GTAGG [SEQ ID NO: 45], CAACTTCTCAAATCATCAATCCTCAC [SEQ ID NO: 46] (CDKN2A, exon 2). Proberne til forlængelse af MsSNuPE er placeret umiddelbart 5’ for det CpG, som skal analyseres, og sekvenserne er: TTTAGTAGAGGTATATAAGTT [SEQ ID NO: 47], TAAGGGGAGAGGAGGAGTTTGAGAAG [SEQ ID NO: 48] (promotor for MLH1, bindingssteder 1 henholdsvis 2), TTTGAGGGATAGGGT [SEQ ID NO: 49], TTTTAGGGGTGTTATATT [SEQ ID NO: 50], TTTTTTTGTTT-GGAAAGATAT [SEQ ID NO: 51] (bindingssteder 1, 2 henholdsvis 3 for promotor) og GTTGGTGGTGTTGTAT [SEQ ID NO: 52], AGGTTATGATGATGGGTAG [SEQ ID NO: 53], TATTAGAGGTAGTAATTATGTT [SEQ ID NO: 54] (exon 2, bindingssteder 1, 2 henholdsvis 3). Et par reaktioner blev sat op for hver prøve ved at anvende enten 32p-dCTP eller 32p-dTTP til enkelte forlængelser af nukleotid. De forlængede MsSNuPE-primere (prober) blev adskilt med denaturerende polyacrylamidgel. Kvantificering blev udført ved af anvende Phosphoimager.

Analyse af methvlerinq ifølge opfindelsen. Med bisulfit omdannet, genomisk DNA blev opformeret ved at anvende for locus specifikke PCR-primere, som flankerede en oligonukleotid-probe med et fluorescerende, rapporterende 5’-far-vestof (6FAM) og et kvælende 3’-farvestof (TAMRA) (Livak et al., PCR Methods Appl. 4:357-362, 1995) (primere og prober anvendt til analyse af methyleringen er opregnet under ’’Gener, MethyLight-primere og sekvenser for prober” i nærværende beskrivelse, infra). I dette eksempel blev fremad- og reversprimerne og de tilsvarende, fluorogene prober designet til at diskriminere mellem enten fuldt methylerede eller fuldt ikke-methylerede molekyler af med bisulfit omdannet DNA (se diskussion af design af primere under ’’Detaljeret beskrivelse af opfindelsen, fremgangsmåde D” i nærværende beskrivelse). Primere og en probe blev også designet til en strækning af genet MYOD1 (Myogenic Differentiation Gene), fuldstændig berøvet for CpG-dinukleotider som en kontrol reaktion for mængden af indført DNA. Parallelle reaktioner blev udført ved at anvende fremgangsmåderne med de methylerede og ikke-methylerede (D) eller kontrol-oligo’erne (A) på de med bisulfit behandlede prøver af DNA fra sperma og HCT116. De værdier, som blev opnået for de methylerede og ikke-methylerede reaktioner, blev normaliseret til værdierne for kontrolreaktionerne med MYOD1 for at give de forhold, som er vist i tabel 1 (nedenfor).

Ved en TaqMan®-protokol spaltede 5’- til 3’-nukleaseaktiviteten af Taq-DNA-polymerase proben og frigav rapportøren, hvis fluorescens blev påvist med laserdetektoren i ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA). Efter at have krydset en tærskel for påvisning af fluorescens, resulterede opformeringen ved PCR i et fluorescerende signal proportionalt med mængden af produkt skabt ved PCR. Indledende mængde af templat kan udledes ud fra nummeret på den cyklus, ved hvilken det fluorescerende signal krydser en tærskel i den eksponentielle fase af PCR-reaktionen. Flere referenceprøver blev medtaget på hver prøveplade for at verificere overensstemmelse plade-til-plade. Plader blev normaliseret indbyrdes ved at anvende disse referenceprøver. Opformeringen ved PCR blev udført ved at anvende optiske bakker og låg med 96 brønde med en afsluttende reaktionsblanding på 25 pi bestående af 600 nM af hver primer, 200 nM probe, 200 μΜ af hver af dATP, dCTP, dGTP, 400 μηη dUTP, 5,5 mM MgCh, 1X TaqMan®-puffer A indeholdende et referencefarvestof og med bisulfit omdannet DNA eller uomdannet DNA ved følgende betingelser: 50°C i 2 minutter, 95°C i 10 minutter efterfulgt af 40 cyklusser ved 95°C i 15 sekunder og 60°C i 1 minut.

Gener, MethyLight-primere og sekvenser af probér. Fire menneskelige gener blev udvalgt til analyse: (1) APC (adenomatøs polyposis coli) (Hiltunen et al., Int. J. Cancer 70:644-648, 1997), (2) ESR1 (receptor for estrogen) (Issa et al., Nature Genet. 7:536-540, 1994), (3) CDKN2A (p16) (Ahuja, Cancer Res 57:3370-3374, 1997) og (4) hMLH1 (reparation, som ikke passer sammen) (Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6870-6875, 1998; Veigl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8698-8702,1998). Disse gener blev udvalgt, fordi de indeholder CpG-øer, som kan hypermethyleres, og som er kendt for at undergå methylering de novo i menneskeligt, colorectalt væv i alle normale prøver og prøver fra tumorer. Det menneskelige gen APC er f.eks. blevet forbundet med udviklingen af colorectal cancer, og det er kendt, at bindingssteder for CpG i de regulerende sekvenser i genet bliver tydeligt mere methyleret i carcinomaer i colon, men ikke i adenomaer før ondartethed, i forhold til normal slimhinde i colon (Hiltunen et al., supra). Det menneskelige gen ESR indeholder en CpG-ø ved 5’-enden, som bliver i stigende grad methyleret i colorectal slimhinde med alderen og er kraftigt methyleret i alle analyserede, colorectale tumorer (Issa et al., supra). Hypermethylering af med promotor associerede CpG-øer i genet CDKN2A (p16) er blevet fundet i 60% af colorectale former for cancer, som viser ustabilitet af mikrosatelitter (Ml) på grund af defekter i et af flere gener med reparation, som ikke passer sammen (Ahuja et al., supra). Genet MLH1 med reparation, sok ikke passer sammen, spiller en central rolle ved udviklingen af sporadiske tilfælde af colorectale tumorer, som er defekte på reparation, som ikke passer sammen (Thibodeau et al., Science 260:816-819, 1993). Det er blevet rapporteret, at MLH1 kan blive bragt transkriptionelt til tavshed ved hypermethylering af DNA i dets promotorregion, hvilket fører til ustabilitet af mikrosatelitter (MSI) (Kane et al., Cancer Res. 57:808-811, 1997, Ahuja et al., supra,; Cunningham et al., Cancer Res. 58:3455-3460,1998; Herman et al., supra; Veigl et al., supra).

Fem sæt PCR-primere og -prober, designet specifikt til DNA-sekvenser omdannet med bisulfit, blev anvendt: (1) et sæt, som repræsenterer fuldt methyleret og fuldt ikke-methyleret DNA til genet ESR1; (2) et fuldt methyleret sæt til genet MLH1; (3) er fuldt methyleret og fuldt ikke-methyleret sæt til genet APC; og (4) et fuldt methyleret og fuldt ikke-methyleret sæt til genet CDNK2A (p16); og (5) et internt referencesæt til genet MYOD1 til kontrol for indført DNA. De methylerede og ikke-methylerede primere og tilsvarende prober blev designet til at overlappe 1 til 5 potentielle bindingssteder for CpG-dinukleotider. De interne MYOD1-referenceprimere og -probe blev designet til at dække en region i genet MYOD1, som er fuldstændig frit for hvilke som helst CpG-dinukleotider for at sørge for ikke-skævvredet opformering af det genomiske DNA ved PCR, uanset status for methylering. Som ovenfor angivet blev parallelle TaqMan®-PCR-reaktioner udført med primere, som er specifikke for de med bisulfit omdannede, methylerede og/eller ikke-methylerede gensekvenser og med MYOD1-referenceprimerne. Sekvenserne af primer og probe er opregnet i det følgende. I alle tilfælde er den først opregnede primer fremad-primeren, den anden er TaqMan®-proben, og den tredje er revers-primeren til PCR. Methyleret ESR1 (GGCGTTCGTTTTGGGATTG [SEQ ID NO 1], 6FAM 5’-CGATAAAACCGAACGACCCGACGA-3’ TAMRA [SEQ ID NO 2], GCCGACACGCGAACTCTAA [SEQ ID NO 3]); ikke-methyleret ESR1 (ACACATAT CCCACCAAC ACACAA [SEQ ID NO 4], 6FAM 5’- CAACCCTACCCCAAAAACCTACAAATCCAA-3’ TAMRA [SEQ ID NO 5], AGGAGTTGGTGGAGGGTGTTT [SEQ ID NO 6]; methyleret MLH1 (CTATCGCCGCCTCATCGT [SEQ ID NO 7], 6FAM 5’- CGCGA- CGTCAAACGCCACTACG-3’ TAMRA [SEQ ID NO 8], CGTTAT AT AT CGTTCGT AGTATT CGT GTTT [SEQ ID NO 9]); methyleret APC (TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT [SEQ ID NO 10], 6FAM 5’-CCCGTCGAAAACCCGCCGATTA-3’ TAMRA [SEQ ID NO 11],

G AACCAAAACGCT CCCCAT [SEQ ID NO 12]); ikke-methyleret APC (GGGTTGTGAGGGTATATTTTTGAGG [SEQ ID NO 13], 6FAM 5’-CCC ACCCAACCACAC AACCT ACCT AACC-3’ TAMRA [SEQ ID NO 14], CCAACCCACACTCCACAATAAA [SEQ ID NO 15]); methyleret CDKN2A (AACAACGT CCGCACCT CCT [SEQ ID NO 16], 6FAM 5’-ACC-CGACCCCGAACCGCG-3’ TAMRA [SEQ ID NO 17], TGGAATTTTCGGTTGATTGGTT [SEQ ID NO 18]); ikke-methyleret CDKN2A CAACCAAT CAACCAAAAATT CC AT [SEQ ID NO 19], 6FAM 5’- CCACCACCCACTATCTACTCTCCCCCTC-3’ TAMRA [SEQ ID NO 20], G GTG GATT GT GT GT GTTT GGTG [SEQ ID NO 21]); og MYOD1 (CCAACTCCAAATCCCCTCTCTAT [SEQ ID NO 22], 6FAM 5’- T CCCTTCCT ATT CCTAAAT CCAACCTAAATACCT CC-3 TAMRA [SEQ ID NO 23], TGATTAATTTAGATTGGGTTTAGAGAAGGA [SEQ ID NO 24]).

Tabel 1 og 2 viser resultaterne af analysen af DNA’er fra menneskelig sperma og HCT116 for status for methylering af CpG-øer i de fire gener APC, ESR1, CDKN2A (p16) og hMLH1. Resultaterne er udtrykt som forhold mellem de methylerede og ikke-methylerede reaktioner og en kontrol reaktion (MYOD1). Tabel 1 viser, at DNA fra sperma kun gav et positivt forhold med de ’’ikke-methylerede” primere og probe, i overensstemmelse med den kendte, ikke-methylerede status for DNA fra sperma og i overensstemmelse med de værdier for procent methylering, som er bestemt ved COBRA-analysen. Dvs., priming på det med bisulfit behandlede DNA skete fra regioner, som indeholdt ikke- methyleret cytosin i CpG-sekvenser i det tilsvarende, genomiske DNA, og derfor blev deamineret (omdannet til uracil) ved behandling med bisulfit.

Tabel 1

* Værdierne repræsenterer ikke procenter, men værdier i en arbitrær enhed, som kan sammenlignes kvantitativt mellem forskellige prøver af DNA for den samme reaktion efter normalisering med et kontrolgen. ** Baseret på Ms-SNuPE.

Tabel 2 viser resultaterne af en analyse af DNA fra HCT116 for status for methylering af CpG-øer i de fire gener: APC, ESR1, CDKN2A (p16) og hMLH1. Resultaterne er udtrykt som forhold mellem de reaktioner, som er specifikke for methylering og en kontrol reaktion (MYOD1). For genet ESR blev et positivt forhold kun opnået med de ’’methylerede” primere og probe, i overensstemmelse med den kendte, methylerede status af DNA fra HCT116 og COBRA-analysen. For genet CDKN2A gav DNA fra HCT116 positive resultater med både de ’’methylerede” og ”ikke-methylerede” primere og probe, i overensstemmelse med den kendte, methylerede status af DNA fra HCT116 og med COBRA-analysen, som viste kun delvis methylering af denne region af genet. I modsætning hertil gav genet APC kun positive resultater med den ikke-methylerede reaktion. Imidlertid er dette helt i overensstemmelse med COBRA-analysen og viser, at denne region af genet APC er ikke-methyleret i DNA fra HCT116. Dette kan indikere, at status for methylering af denne særlige regulerende region i genet APC i DNA’etfra cellelinien HCT116 er mere lig den i normal slimhinde i colon eller adenomaer før ondartethed snarere end den i carcimomaer fra colon (kendt for at være tydeligt mere methylerede).

Tabel 2

* Værdierne repræsenterer ikke procenter, men værdier i en arbitrær enhed, som kan sammenlignes kvantitativt mellem forskellige prøver af DNA for den samme reaktion efter normalisering med et kontrolgen. ** Baseret på Ms-SNuPE.

Eksempel 2

Dette eksempel er en sammenligning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen (A og D i figur 3) med en uafhængig COBRA-metode (se ’’Fremgangsmåder” ovenfor) for at bestemme status for methylering af en CpG-ø forbundet med receptorgenet for estrogen (ESR1) i den menneskelige, colorectale cellelinie HCT116 og i DNA fra menneskelig sperma. Det er blevet rapporteret, at denne CpG-ø er højt methyleret i HCT116 og ikke-methyleret i DNA fra menneskelig sperma (Xiong og Laird, supra, Issa et al., supra). COBRA-Analysen er beskrevet ovenfor. To bindingssteder for Taq1 i denne CpG-ø bekræftede dette, idet der blev vist en mangel på methylering i DNA’et fra sperma og næsten komplet methylering i DNA fra HCT116 (figur 5A). Desuden blev resultater ved at anvende DNA, som var behandlet og ubehandlet med bisultfit, sammenlignet.

Til en analyse blev primere og prober af fuldt ’’methyleret” og fuldt ’’ikke-methyleret” ESR1 og kontrol-MYOD1 designet som beskrevet ovenfor under ’’Eksempel 1”. Tre separate reaktioner ved at anvende enten de ’’methylerede”, ”ikke-methylerede” eller kontrol-oligo’er eller DNAfra både sperma og HCT116 blev udført. Som i ovenstående eksempel 1 blev de værdier, som blev opnået for de methylerede og ikke-methylerede reaktioner, normaliseret til værdierne for kontrolreaktionerne med MYOD1 for at give de forhold, som er vist i figur 5B. DNA fra sperma gav kun et positivt forhold med de ikke-methylerede primere og probe, i overensstemmelse med dets ikke-methylerede status. I modsætning hertil skabte DNA fra HCT116, med dets overvejende methylerede ESR1-alleler, kun et positivt forhold ved den methylerede reaktion (figur 5B). DNA fra både sperma og HCT116 gav positive værdier ved reaktionerne med MYOD1, hvilket indikerede, at der var tilstrækkeligt indført DNA for hver prøve. Som forventet blev det DNA, som ikke var omdannet med bisulfit, ikke opformeret med hverken de methylerede eller ikke-methylerede oligonukleotider (figur 5B). Disse resultater er i overensstemmelse med fundene fra COBRA (figur 5A), hvilket antyder, at afprøvningen ifølge opfindelsen kan diskriminere mellem de methylerede og ikke-methylerede alleler i genet ESR1. Desuden er reaktionerne specifikke for DNA, som er omdannet med bisulfit, hvilket udelukker skabelsen af falske, positive resultater på grund af ufuldstændig omdannelse med bisulfit.

Eksempel 3

Dette eksempel bestemte specificiteten af primerne og proberne ifølge opfindelsen. Figur 6 viser en afprøvning af alle mulige kombinationer af primere of prober til yderligere undersøgelse af specificiteten af de methylerede og ikke-methylerede oligonukleotider på DNA’er med kendt status for methylering. Otte forskellige kombinationer af ’’methylerede” og ’’ikke-methylerede” ESR1-fremad-og -revers-primere og -prober (som beskrevet ovenfor i ’’Eksempel 1” blev afprøvet i forskellige kombinationer ved afprøvninger på DNA fra sperma og HCT116. Afprøvningerne blev udført som beskrevet ovenfor i eksempel 1. Plade A (figur 6) viser den nomenklatur, som er anvendt kombinationerne i ESR1-oligo’erne. ”U” refererer til den oligosekvens, som annealer med ikke-methyleret DNA, som er behandlet med bisulfit, medens ”M” refererer til den methylerede version. Position 1 angiver fremad-primeren til PCR, position 2 proben og position 3 revers-primeren. De kombinationer, som blev anvendt til de otte reaktioner, er vist under hvert par blokke, idet de repræsenterer dobbelte forsøg. Resultaterne er udtrykt som forhold mellem værdier for ESR1 og kontrolværdier for MYOD1. Plade B repræsenterer en analyse af DNA fra menneskelig sperma. Plade C repræsenterer en analyse af DNA opnået fra den menneskelige, colorectale cancercellelinie HCT116.

Kun de fuldt ikke-methylerede (reaktion 1) eller fuldt methylerede kombinationer (reaktion 8) resulterede i en positiv reaktion for sperma henholdsvis HCT116. De andre kombinationer var negative, hvilket viser, at PCR-betingelserne ikke sørger for svag annealing af de oligonukleotider, som ikke passer sammen. Denne selektivitet viser, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan diskriminere mellem fuldt methylerede og ikke-methylerede alleler med en høj grad af specificitet.

Eksempel 4

Dette eksempel viser, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen er reproducerbar. Figur 7 illustrerer en analyse af status for methylering af locus for ESR1 i prøver af DNA stammende fra en primær, colorectal adenocarcinoma og normal slimhinde, som passer sammen dermed, stammende fra samme patient (prøver 10N og 10T i figur 8) for at studere en heterogen population af methylerede og ikke-methylerede alleler. Prøverne af colorectalt væv blev indsamlet som beskrevet i nedenstående eksempel 5. Desuden blev reproducerbarheden af fremgangsmåden ifølge opfindelsen afprøvet ved at udføre otte uafhængige reaktioner for hver afprøvning. Resultaterne for ESR1-reaktionerne og for MYOD1-kontrolreaktionen repræsenterer rå, absolutte værdier opnået for disse reaktioner snarere end forhold, således at standardafvigelser af de individuelle reaktioner kan vurderes. Værdierne er blevet plade-normaliseret, men ikke korrigeret for indført DNA. Blokkene angiver de gennemsnitlige værdier opnået for de otte separate reaktioner. Blokken for afvigelser repræsenterer standardafvigelsen fra middel.

Figur 7 viser, at middelværdien for den methylerede reaktion var højere i tumoren sammenlignet med det normale væv, medens den ikke-methylerede reaktion viste det modsatte resultat. De standardafvigelser, som er iagttaget for de otte uafhængige målinger, var relativt beskedne og var sammenlignelige med dem, som er rapporteret for andre studier under udnyttelse af teknologien TaqMan® (Fink et al., Nature Med. 4:1329-1333, 1998). Noget af foranderligheden af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan have været resultatet af stochastisk PCR-opformering (skævvridning af PCR), som kan forekomme ved lave koncentrationer af templat (Warnecke et al., Nucleig Acids Res. 25:4422-4426, 1997). Sammenfattet indikerer disse resultater, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan give reproducerbare resultater for komplekse, heterogene prøver af DNA.

Eksempel 5

Dette eksempel viser en sammenligning af ekspression af MLH1, ustabilitet af mikrosatelitter og methylering af promotor for MLH1 i 25 menneskelige, colorectale prøver, som er parret således, at de passer sammen. Hovedfordelen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er evnen til hurtigt at screene menneskelige tumorer for status for methylering for et særligt locus. Desuden er analysen af methylering af DNA som en surrogatmarkør for ekspression af gen en hidtil ukendt vej til at opnå klinisk værdifuld information om tumorer. Vi afprøvede anvendeligheden af fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved at undersøge status for methylering af MLH1-promotoren. Genet MLH1 med reparation, som ikke passer sammen, spiller en central rolle ved udviklingen af sporadiske tilfælde af colorectale tumorer defekte på reparation, som ikke passer sammen (Thibodeau et al., Science 260:816-819, 1993). Det er blevet rapporteret, at MLH1 kan blive bragt transkriptionelt til tavshed ved hypermethylering af DNA i dets promotorregion, hvilket fører til ustabilitet af mikrosatelitter (MSI) (Kane et al., Cancer Res. 57:808-811, 1997, Ahuja et al., Cancer Res. 57:3370-3374, 1997; Cunningham et al., Cancer Res. 58:3455-3460,1998; Herman, J.G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6870-6875, 1998; Veigl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8698-8702, 1998).

Ved at anvende fremgangsmåden ifølge opfindelsen med høj kapacitet, som beskrevet i eksempel 1, anvendelse D, blev 50 prøver bestående af 25 par af menneskelige, colorectale adenosarcinomaer og normale slimhinder, som er parret således, at de passer sammen, analyseret for status for methylering af CpG-øen i MLH1. Kvantitative RT-PCR-analyser (TaqMan®) af niveauerne for ekspression af MLH1 normaliseret til ACTB (β-actin) blev undersøgt. Endvidere blev status for ustabilitet af mikrosatelitter (MSI) af hver prøve analyseret ved PCR af loci BAT25 og BAT26 (Parsons et al..Cancer Res. 55:5548-5550, 1995). De femogtyve parrede prøver af tumor og normalt væv fra slimhinder blev fremskaffet fra 25 patienter med primær, colorectal adenocarcinoma. Patienterne omfattede 16 mænd og 9 kvinder, som i alder varierede fra 39 til 88 år med en gennemsnitlig alder på 68,8. Afstanden i slimhinden fra tumor til normale prøver var mellem 10 og 20 cm. Ca. 2 g af det kirurgisk fjernede væv blev øjeblikkelig frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80°C indtil isolering af RNA og DNA.

Kvantitativ RT-PCR-analvse og analyse af ustabilitet af mikrosatelitter. Kvantificeringen af niveauer af mRNA blev udført ved at anvende påvisning af reel-tid-fluorescens. TaqMan®-Reaktionerne blev udført som beskrevet ovenfor for afprøvningen, men med tilsætning af 1 U AmpErase (uracil-N-glycosylase). Efter isolering af RNA blev DNA fremstillet ud fra hver prøve som tidligere beskrevet (Bender et al., Cancer Res., 58:95-101, 1998). Kort fortalt blev RNA isoleret ved at lysere væv i puffer indeholdende guanidinisothiocyanat (4 M), N-laurylsarcosin (0,5%), natriumcitrat (25 mM) og 2-mercaptoethanol (0,1 M) efterfulgt af standardekstraktion med phenol-chloroform og udfældning i 50% isopropanol/50% lysepuffer. Til fremstilling af cDNA blev prøver af RNA revers-transkriberet ved at anvende tilfældige hexamerer, deoxynukleotidtriphosphater og revers-transkriptase Superscript II® (Life Technologies, Inc., Palo Alto, CA). Det resulterende cDNA blev derefter opformeret med primere, som er specifikke for MLH1 og ACTB. Forurening af prøverne af RNA blev udelukket ved analyse af alle prøver af RNA uden forudgående cDNA-omdannelse. Relativ ekspression af gen blev bestemt baseret på tærskelcyklusserne (antal PCR-cyklusser, som kræves til påvisning med en specifik probe) af genet MLH1 og af det interne referencegen ACTB. Sekvenser i fremad-primer, probe og reversprimer i generne ACTB og MLH1 er: ACTB (TGAGCGCGGCTACAGCTT [SEQ ID NO: 25], 6FAM 5’-ACCACCACGGCCGAGCGG-3’ TAMRA [SEQ ID NO: 26], CCTTAAT GT CACACACG ATT [SEQ ID NO: 27]); og (GTTCTCCGGGAGAT GTT GCATA [SEQ ID NO: 28], 6FAM 5’- CCT CAGT GGGCCTTGGCACAGC-3’ TAMRA [SEQ ID NO: 29], TGGTGGTGTTGAGAAGGTATAACTTG [SEQ ID NO: 30]).

Forandringer af talrige sekvenser af polyadenin (”pA”), fordelt vidtgående gennem hele genomet, er et nyttigt karaktertræk til at definere tumorer med ustabilitet af mikrosatelitter (lonov et al., Nature 363, 558-561, 1993). Ustabilitet af mikrosatelitter (MSI) blev bestemt ved PCR og sekvensanalyse af loci BAT25 (pA-område 25 basepar fra en intron i c-prøvesættet for oncogen) og BAT26 (pA-område 26 basepar fra en intron i genet hMSFI2 med reparation, som ikke passer sammen) som tidligere beskrevet (Parsons et al., Cancer Res. 55:5548-5550,1995). Kort fortalt segmenter af loci BAT25 og BAT26 opformeret i 30 cyklusser ved at anvende én primer mærket med 32P og én umærket primer til hvert locus. Reaktioner blev opløst på geler af urinstof-formaldehyd og eksponeret til film. De fremad- og revers-primere, som blev anvendt til opformeringen af BAT25 og BAT26, var: BAT25: (TCGCCT CCAAGAAT GT AAGT [SEQ ID NO: 31], TCTG C ATTTT AACT ATG GCTC [SEQ ID NO: 32]); og BAT26 (T GACTACTTTT GACTT CAGCC [SEQ ID NO: 33], AACCATT CAACATTTTT AACCC [SEQ ID NO: 34]).

Figur 8 viser korrelationen mellem ekspression af gen MLH1, status for MSI og methylering af promotor i MLH1, som bestemt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Det øverste diagram viser niveauer for ekspression af MLH1 målt med kvantitativ reel-tid-PCR (TaqMan®) i normale, colorectale prøver (skraverede blokke) og colorectale prøver af tumorer (udfyldte, sorte blokke), som passer sammen. Niveauerne for ekspression er afbildet som et forhold mellem målinger af MLH1 og ACTB. Status for ustabilitet af mikrosatelitter (MSI) er angivet ved cirklerne placeret mellem de to diagrammer. En sort cirkel betegner positiv MSI, medens en åben cirkel angiver, at prøven er MSI-negativ, som bestemt ved analyse af loci for BAT25 og BAT26. Det nederste diagram viser status for methylering af loci MLH1 som bestemt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Niveauerne af methylering er repræsenteret som forholdet mellem den methylerede MLH1-reaktion og MYOD1-reaktionen.

Fire colorectale tumorer havde signifikant forhøjede niveauer af methylering sammenlignet med det tilsvarende normale væv. Én af disse (tumor 17) udviste en særlig høj grad af methylering af MLH1, som tildelt score ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Tumor 17 var den eneste prøve, som var både MSI-positiv (sort cirkel) og viste, at den transkriptionelt gjorde MLH1 tavs. De resterende, methylerede tumorer udtrykte MLH1 ved moderate niveauer og var MSI-negative (hvide cirkler). Disse resultater viser, at MLH1 blev biallelt methyleret i tumor 17, hvilket resulterede i, at den blev gjort epigenetisk tavs og deraf følgende ustabilitet af mikrosatelitter, medens de andre tumorer viste ringere grader af hypermethylering af promotoren for MLH1 og kunne have netop én methyleret allel, hvilket tillader ekspression fra den uændrede allel. I overensstemmelse hermed var fremgangsmåden ifølge opfindelsen i stand til hurtigt at skabe signifikant biologisk information, såsom hypermethylering af promotoren for CpG-øer i menneskelige tumorer, hvilket er forbundet med, at gener, som er relevante for cancerprocessen, gøres transkriptionelt tavse. SEKVENSLISTE. (1) ALMEN INFORMATION: (i) OPFINDERE: Peter W. Laird, Cindy A. Eads og Kathleen D. Danenberg.

(ii) OPFINDELSENS BENÆVNELSE: Fremgangsmåde med høj kapacitet til analyse af methylering af DNA (iii) ANTAL SEKVENSER: 54 (iv) KORRESPONDANCEADRESSE:

(A) ADRESSAT: Davis Wright Tremaine LLP (B) GADE: 1501 Fourth Avenue 2600 Century Square (C) BY: Seattle (D) STAT: Washington

(E) LAND: USA (F) POSTNUMMER: 98101-1688 (v) COMPUTERLÆSELIG FORM: (A) MEDIUMTYPE: Diskette-3,5 tommer, 1,44 MB lager (B) COMPUTER: PC compatible (C) DRIFTSSYSTEM: Windows 95 (D) SOFTWARE: Word 97 (vi) NUVÆRENDE ANSØGNINGSDATA: (A) ANSØGNING NUMMER: (B) INDLEVERINGSDATO: (C) KLASSIFIKATION:

(vii) TIDLIGERE ANSØGNINGSDATA: N/A

(A) ANSØGNING NUMMER: N/A

(B) INDLEVERINGSDATO: N/A (viii) INFORMATION OM FULDMÆGTIG/AGENT: (A) NAVN: Jeffrey B. Oster (B) REGISTRERINGSNUMMERS.585

(C) REFERNCE/SAGSNUMMER: 47675-9WO (ix) INFORMATION OM TELEKOMMUNIKATION: (A) TELEFON: (206) 628-7711 (B) TLELFAX: (206) 628-7699 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:1: (i SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 19 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:1: GGCGTTCGTT TTGGGATTG 19 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:2: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 24 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (ix) EGENSKABER: (A) NAVN/KODE: 5’-Substitution med fluorescerende, rapporterende farvestof 6FAM (2,7-dimethoxy-4,5-dichlor-6-carboxyfluorescein-phosphoramidit-cytosin; 3’-substitution med kvælende farvestof TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamin) (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:2: CGATAAAACC GAACGACCCG ACGA 24 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:3: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 19 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:3: GCCGACACGC GAACTCTAA 19 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:4: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 23 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:4: ACACATATCC CACCAACACA C AA 23 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:5: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 30 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (ix) EGENSKABER: (A) NAVN/KODE: 5’-Substitution med fluorescerende, rapporterende farvestof 6FAM (2,7-dimethoxy-4,5-dichlor-6-carboxyfluorescein-phosphoramidit-cytosin; 3’-substitution med kvælende farvestof TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamin) (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:5: CAACCCTACC CCAAAAACCT ACAAATCCAA 30 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:6: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 21 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:6: AGGAGTTGGT GGAGGGTGTT T 21 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:7: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 18 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:7: CTATCGCCGC CTCATCGT 18 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:8: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 22 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (ix) EGENSKABER: (A) NAVN/KODE: 5’-Substitution med fluorescerende, rapporterende farvestof 6FAM (2,7-dimethoxy-4,5-dichlor-6-carboxyfluorescein-phosphoramidit-cytosin; 3’-substitution med kvælende farvestof TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamin) (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:8: CGCGACGTCA AACGCCACTA CG 22 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:9: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 30 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:9: CGTTATATAT CGTTCGTAGT ATTCGTGTTT 30 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:10: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 27 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:10: TTATATGTCG GTTACGTGCG TTTATAT 27 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:11: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 22 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (ix) EGENSKABER: (A) NAVN/KODE: 5’-Substitution med fluorescerende, rapporterende farvestof 6FAM (2,7-dimethoxy-4,5-dichlor-6-carboxyfluorescein-phosphoramidit-cytosin; 3’-substitution med kvælende farvestof TAMFRA (6-carboxytetra methyl rhoda min) (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:11: CCCGTCGAAA ACCCGCCGAT TA 22 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:12: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 19 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:12: GAACCAAAAC GCTCCCCAT 19 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:13: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 25 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:13: GGGTTGTGAG GGTATATTTT TG AG G 25 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:14: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 28 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (ix) EGENSKABER: (A) NAVN/KODE: 5’-Substitution med fluorescerende, rapporterende farvestof 6FAM (2,7-dimethoxy-4,5-dichlor-6-carboxyfluorescein-phosphoramidit-cytosin; 3’-substitution med kvælende farvestof TAMRA (6-ca rboxytetra methyl rhoda min) (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:14: CCCACCCAAC CACACAACCT ACCTAACC 28 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:15: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 22 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:15: CCAACCCACA CTCCACAATA AA 22 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:16: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 19 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:16: AACAACGTCC GCACCTCCT 19 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:17: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 18 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (ix) EGENSKABER: (A) NAVN/KODE: 5’-Substitution med fluorescerende, rapporterende farvestof 6FAM (2,7-dimethoxy-4,5-dichlor-6-carboxyfluorescein- phosphoramidit-cytosin; 3’-substitution med kvælende farvestof TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamin) (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:17: ACCCGACCCC GAACCGCG 18 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:18: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 22 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:18: TGGAATTTTC GGTTGATTGG TT 22 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:19: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 24 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:19: CAACCAATCA ACCAAAAATT CCAT 24 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:20: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 28 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (ix) EGENSKABER: (A) NAVN/KODE: 5’-Substitution med fluorescerende, rapporterende farvestof 6FAM (2,7-dimethoxy-4,5-dichlor-6-carboxyfluorescein-phosphoramidit-cytosin; 3’-substitution med kvælende farvestof TAMRA (6-ca rboxytetra m ethyl rhoda min) (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:20: CCACCACCCA CTATCTACTC TCCCCCTC 28 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:21: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 22 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:21: GGTGGATTGT GTGTGTTTGG TG 22 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:22: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 23 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:22: CCAACTCCAA ATCCCCTCTC TAT 23 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:23: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 36 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (ix) EGENSKABER: (A) NAVN/KODE: 5’-Substitution med fluorescerende, rapporterende farvestof 6FAM (2,7-dimethoxy-4,5-dichlor-6-carboxyfluorescein-phosphoramidit-cytosin; 3’-substitution med kvælende farvestof TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamin) (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:23: TCCCTTCCTA TTCCTAAATC CAACCTAAAT ACCTCC 36 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:24: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 30 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:24: TGATTAATTT AGATTGGGTT TAGAGAAGGA 30 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:25: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 18 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:25: TGAGCGCGGC TACAGCTT 18 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:26: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 18 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (ix) EGENSKABER: (A) NAVN/KODE: 5’-Substitution med fluorescerende, rapporterende farvestof 6FAM (2,7-dimethoxy-4,5-dichlor-6-carboxyfluorescein-phosphoramidit-cytosin; 3’-substitution med kvælende farvestof TAMRA (6-ca rboxytetramethyl rhoda min) (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:26: ACCACCACGG CCGAGCGG 18 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:27: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 20 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:27: CCTTAATGTC ACACACGATT 20 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:28: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 22 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:28: GTTCTCCGGG AGATGTTGCA TA 22 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:29: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 22 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (ix) EGENSKABER: (A) NAVN/KODE: 5’-Substitution med fluorescerende, rapporterende farvestof 6FAM (2,7-dimethoxy-4,5-dichlor-6-carboxyfluorescein-phosphoramidit-cytosin; 3’-substitution med kvælende farvestof TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamin) (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:29: CCTCAGTGGG CCTTGGCACA GC 22 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:30: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 26 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:30: TGGTGGTGTT GAGAAGGTAT AACTTG 26 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:31: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 20 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (x) INFORMATION OM PUBLIKATION: (A) FORFATTERE: Parsons, et al. (B) TITEL: Microsatellite Instability and Mutations of the Transforming Growth Factor B Type II Receptor Gene in Colorectal Cancer (C) TIDSSKRIFT: Cancer Res. (D) BIND: 55 (F) SIDER: 5548-5550 (G) DATO: 1. december 1995 (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:31: TCGCCTCCAA GAATGTAAGT 20 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:32: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 21 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (x) INFORMATION OM PUBLIKATION: (A) FORFATTERE: Parsons, et al. (B) TITEL: Microsatellite Instability and Mutations of the Transforming Growth Factor B Type II Receptor Gene in Colorectal Cancer (C) TIDSSKRIFT: Cancer Res. (D) BIND: 55 (F) SIDER: 5548-5550 (G) DATO: 1. december 1995 (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:32: TCTGCATTTT AACTATGGCT C 21 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:33: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 21 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (x) INFORMATION OM PUBLIKATION: (A) FORFATTERE: Parsons, et al. (B) TITEL: Microsatellite Instability and Mutations of the Transforming Growth Factor B Type II Receptor Gene in Colorectal Cancer (C) TIDSSKRIFT: Cancer Res. (D) BIND: 55 (F) SIDER: 5548-5550 (G) DATO: 1. december 19 (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:33: TGACTACTTT TGACTTCAGC C 21 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:34: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 22 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (x) INFORMATION OM PUBLIKATION: (A) FORFATTERE: Parsons, et al. (B) TITEL: Microsatellite Instability and Mutations of the Transforming Growth Factor B Type II Receptor Gene in Colorectal Cancer (C) TIDSSKRIFT: Cancer Res. (D) BIND: 55 (F) SIDER: 5548-5550 (G) DATO: 1. december 199 (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:34: AACCATTCAA CATTTTTAAC CC 22 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:35: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 21 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:35: TCCTAAAACT ACACTTACTC C 21 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:36: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 23 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:36: GGTTATTTGG AAAAAGAGTA TAG 23 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:37: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 22 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:37: AGAGAGAAGT AGTTGTGTTA AT 22 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:38: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 21 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:38: ACTACACCAA TACAACCACA T 21 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:39: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 12 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:39: AAACCAAAAC TC 12 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:40: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 16 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:40: CCCACACCCA ACCAAT 16 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:41: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 23 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:41: GGAGGTTATA AGAGTAGGGT TAA 23 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:42: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 24 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:42: CCAACCAATA AAAACAAAAA TACC 24 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:43: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 22 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:43: GTAGGTGGGG AGGAGTTTAG TT 22 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:44: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 23 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:44: TCTAATAACC AACCAACCCC TCC 23 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:45: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 27 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:45: TTGTATTATT TTGTTTTTTT TGGTAGG 27 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:46: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 26 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:46: CAACTTCTCA AATCATCAAT CCTCAC 26 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:47: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 21 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:47: TTTAGTAGAG GTATATAAGT T 21 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:48: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 26 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:48: TAAGGGGAGA GGAGGAGTTT GAGAAG 26 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:49: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 15 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:49: TTTGAGGGAT AGGGT 15 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:50: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 18 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:50: TTTTAGGGGT GTTATATT 18 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:51: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 21 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:51: TTTTTTTGTT TG G AAAG ΑΤΑ T 21 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:52: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 16 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:52: GTTGGTGGTG TTGTAT 16 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:53: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 19 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:53: AGGTTATGAT GATGGGTAG 19 (2) INFORMATION OM SEQ. ID NO:54: (i) SEKVENSENS EGENSKABER: (A) LÆNGDE: 22 basepar (B) TYPE: Nukleinsyre (C) BESKAFFENHED: Enkeltstrenget (D) TOPOLOGI: Lineær

(ii) MOLEKYLTYPE: DNA (iii) HYPOTETISKE SEKVENSER: Nej (xi) SEKVENSBESKRIVELSE: SEQ. ID NO:54: TATTAGAGGT AGTAATTATG TT 22

Claims (16)

1. Fremgangsmåde til påvisning af en nukleinsyre, som indeholder methyleret CpG, omfattende: (a) en prøve, som indeholder nukleinsyre, bringes i kontakt med et modificerende middel, som modificerer ikke-methyleret cytosin til frembringelse af en omdannet nukleinsyre; og (b) der gennemføres et trin til opformering og påvisning omfattende opformering af den omdannede nukleinsyre i prøven ved hjælp af oligonukleotid-primere i nærvær af en oligonukleotid-probe, som er specifik for CpG, ved hvilken den probe, som er specifik for CpG, men ikke primerne, skelner mellem modificeret, ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre; og - påvisning af den methylerede nukleinsyre baseret på fortrængning af en probe, som er formidlet af opformering, og kvantitativ reel-tid-PCR baseret på fluorescens.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, ved hvilken proben yderligere omfatter en eller flere dele med fluorescensmærke.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, ved hvilken den probe, som er specifik for CpG, er en FRET-Lightcycler®-probe, eller en Taq-Man®-probe med dobbelt mærke omfattende en del, som rapporterer fluorescens, og en del, som kvæler fluorescens.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, ved hvilken mængder af methylering i prøven af nukleinsyre bestemmes kvantitativt baseret på en reference til en kontrolreaktion for mængde indført nukleinsyre.

5. Fremgangsmåde til påvisning af en nukleinsyre, som indeholder methyleret CpG, omfattende: (a) en prøve, som indeholder nukleinsyre, bringes i kontakt med et modificerende middel, som modificerer ikke-methyleret cytosin til frembringelse af en omdannet nukleinsyre; og (b) der gennemføres et trin til opformering og påvisning omfattende opformering af den omdannede nukleinsyre i prøven ved hjælp af oligonukleotid-primere i nærvær af en oligonukleotid-probe, som er specifik for CpG, ved hvilken både primerne og den probe, som er specifik for CpG, skelner mellem modificeret, ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre; og - påvisning af den methylerede nukleinsyre baseret på fortrængning af en probe, som er formidlet af opformering, og kvantitativ reel-tid-PCR baseret på fluorescens.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, ved hvilken proben, som er specifik for CpG, yderligere omfatter en eller flere dele med fluorescensmærke.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, ved hvilken proben, som er specifik for CpG, er en FRET-Lightcycler®-probe, eller en Taq-Man®-probe med dobbelt mærke omfattende en del, som rapporterer fluorescens, og en del, som kvæler fluorescens.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 7, ved hvilken fremgangsmåden er en fremgangsmåde med høj kapacitet.

9. Prøvesæt til påvisning af methylering, som kan anvendes til påvisning af en nukleinsyre, som indeholder methyleret CpG, omfattende et bærende middel, som er opdelt i afdelinger til modtagelse i tæt indespærring deri af en eller flere beholdere omfattende: (i) et modificerende middel, som modificerer ikke-methyleret cytosin til frembringelse af en omdannet nukleinsyre; (ii) primere til opformering af den omdannede nukleinsyre; (iii) primere til opformering af umodificeret kontrolnukleinsyre; (iv) en probe, som er specifik for CpG, hvis påvisning er baseret på fortrængning af en probe, som er formidlet af opformering, og kvantitativ reel-tid-PCR baseret på fluorescens, ved hvilken den probe, som er specifik for CpG, skelner mellem modificeret, ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre, og ved hvilken primerne kan eller ikke kan skelne mellem ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre.

10. Prøvesæt ifølge krav 9, i hvilket det modificerende middel omdanner cytosin rester til uracilrester.

11. Prøvesæt ifølge krav 9, i hvilket den probe, som er specifik for CpG, men ikke primerne for opformeringen af den omdannede nukleinsyre, skelner mellem modificeret, ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre,

12. Prøvesæt ifølge krav 9, i hvilket både den probe, som er specifik for CpG, og primerne for opformeringen af den omdannede nukleinsyre, skelner mellem modificeret, ikke-methyleret og methyleret nukleinsyre,

13. Prøvesæt ifølge krav 9, i hvilket den probe, som er specifik for CpG, omfatter en eller flere dele med fluorescensmærke.

14. Prøvesæt ifølge krav 13, i hvilket proben, som er specifik for CpG, er en FRET-Lightcycler®-probe, eller en Taq-Man®-probe med dobbelt mærke omfattende en del, som rapporterer fluorescens, og en del, som kvæler fluorescens.

15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 eller 5, ved hvilken trinet til opformering omfatter en polymerasekædereaktion (PCR).

16. Fremgangsmåde eller prøvesæt ifølge et hvilket som helst af kravene 1, 5 eller 9, ved hvilken det modificerende middel omfatter bisulfit.