ES2267535T3 - Procedimiento para analisis de metilacion del adn de alto rendimiento. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para detectar la metilación de la citosina y/ó islas CpG metiladas dentro de una muestra de ADN genómico que comprende: (a) poner en contacto una muestra de ADN genómico con un agente modificante que modifica citosinas no metiladas para producir un ácido nucleico transformado; y (b) realizar una etapa de amplificación y detección que comprende -amplificar el ácido nucleico transformado por medio de cebadores de oligonucleótidos en presencia de una ó una pluralidad de sondas de oligonucleótidos, en la que dicha sonda o pluralidad de cebadores de oligonucelótidos o las sonda(s) específicas son capaces de distinguir entre ácido nucleico metilado y no metilado, con la condición de que al menos una sonda de oligonucleótido es una sonda específica de CpG, capaz de distinguir entre ácido nucleico metilado y no metilado; y -detectar el ácido nucleico metilado basándose en un desplazamiento de la sonda mediado por amplificación y PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia.
Description
Procedimiento para análisis de metilación del
ADN de alto rendimiento.
La presente invención proporciona un
procedimiento de alto rendimiento y cuantitativo mejorado para
determinar patrones de metilación en muestras de ADN genómico.
Específicamente, el procedimiento de la invención trata las muestras
de ADN genómico con bisulfato de sodio para crear diferencias en la
secuencia dependientes de la metilación, seguido de detección por
técnicas de PCR cuantitativa basada en fluorescencia.
En organismos eucariotas de los órdenes más
altos, el ADN se metila sólo en las citosinas situadas en posición
5' respecto a la guanosina en el dinucleótido CpG. Esta modificación
tiene importantes efectos reguladores en la expresión génica
predominantemente cuando implica a regiones ricas en CpG (islas CpG)
situadas en la región promotora de una secuencia génica. Se ha
asociado una metilación extensa de las islas CpG con la inactivación
transcripcional de genes impresos y genes del cromosoma X inactivo
de las hembras. La metilación aberrante de islas CpG normalmente no
metiladas se ha descrito como una suceso frecuente en células
inmortalizadas y transformadas y ha sido frecuentemente asociado
con la inactivación transcripcional de genes supresores de tumores
en cánceres
humanos.
humanos.
Las ADN metilasas transfieren grupos metilo
desde un donador universal de metilos, tal como
S-adenosil metionina, a sitios específicos en el
ADN. Una función biológica de la metilación del ADN en bacterias es
la protección del ADN contra la digestión por enzimas de restricción
afines. Las células de mamíferos poseen metilasas que metilan restos
de citosina en el ADN que son vecinas al extremo 5' de las guaninas
(CpG). Esta metilación puede jugar un papel en la inactivación
génica, diferenciación celular, formación de tumores, inactivación
del cromosoma X, e impresión genómica. Las islas CpG permanecen no
metiladas en las células normales, excepto durante la inactivación
del cromosoma X y la impresión parenteral específica donde la
metilación de las regiones reguladoras 5' pueden conducir a una
represión transcripcional. La metilación del ADN es también un
mecanismo para cambiar la secuencia de bases del ADN sin alterar su
función codificante. La metilación del ADN es un cambio heredable,
reversible y epigenético. Sin embargo, la metilación del ADN tiene
el potencial de alterar la expresión génica, lo cual tiene profundas
consecuencias genéticas y en el desarrollo.
La reacción de metilación implica sacar una
citosina fuera de una doble cadena intacta para permitir la
transferencia de un grupo metilo de la
S-adenosilmetionina en una hendidura de la enzima
ADN (citosina-5)-metiltransferasa
(Klimasauskas y col., Cell 76:357-369, 1994)
para formar 5-metilcitosina
(5-mCyt). Esta conversión enzimática es la única
modificación epigenética del ADN conocida que existe en los
vertebrados y es esencial para el normal desarrollo embrionario
(Bird, Cell 70:5-8, 1992; Laird y Jaenisch,
Human Mol. Genet. 3:1487-1495, 1994; y Li y
col., Cell 69:915-926, 1992). La presencia de
5-mCyt en los dinucleótidos CpG dio como resultado
un agotamiento de 5 veces de esta secuencia en el genoma durante la
evolución de los vertebrados, presumiblemente debido a una
desaminación espontánea de 5-mCyt sobre T.
(Schoreret y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:957-961, 1992). Aquellas áreas del genoma que no
muestran dicha supresión se denominan "islas CpG" (Bird,
Nature 321:209-213, 1986; y
Gardiner-Garden y col. J. Mol. Bio.
196:261-282, 1987). Estas regiones islas CpG
comprenden aproximadamente el 1% de los genomas de los vertebrados y
también representan aproximadamente el 15% de la cantidad total de
dinucleótidos CpG (Bird, Nature 321:209-213,
1986). Las islas CpG tienen típicamente una longitud de entre 0,2 y
1 kb se sitúan cadena arriba de muchos genes constitutivos y
específicos de tejidos, pero muchas se extienden también dentro de
regiones de genes codificantes. Por lo tanto, se piensa que la
metilación de restos de citosina dentro de las islas CpG en tejidos
somáticos afecta a la función génica alterando la transcripción
(Cedar, Cell 53:3-4, 1988).
La metilación de restos de citosina contenida
dentro de las islas CpG se ha correlacionado inversamente con la
actividad génica. Esto podría conducir a disminuir la expresión
génica por una diversidad de mecanismos que incluyen, por ejemplo,
interrupción de la estructura local de la cromatina, inhibición de
factores de transcripción que se unen al ADN, o por reclutamiento de
proteínas que interactúan específicamente con secuencias metiladas y
previniendo indirectamente la unión de factores de transcripción. En
otras palabras, existen varias teorías de cómo la metilación afecta
a la transcripción del ARNm y a la expresión génica, pero el
mecanismo exacto de acción no está bien entendido. Algunos estudios
han demostrado una correlación inversa entre metilación de las islas
CpG y la expresión génica, sin embargo, la mayoría de las islas CpG
de genes autosómicos se mantienen no metilados en la línea germinal
y la metilación de estas islas es normalmente independiente de la
expresión génica. Los genes específicos de tejidos no están
metilados normalmente en los órganos receptores objetivo pero si lo
están en la línea germinal y en tejidos adultos que no se expresan.
Las islas CpG de genes constitutivos que se expresan
constitutivamente están normalmente no metilados en la línea
germinal y en los tejidos somáticos.
La metilación anormal de islas CpG asociadas con
genes supresores de tumores puede también causar disminución de la
expresión génica. La metilación aumentada de dichas regiones podría
conducir a una reducción progresiva de la expresión génica normal,
dando como resultado la selección de una población de células que
tienen una ventaja de crecimiento selectiva (es decir, un tumor
maligno).
Se considera que un patrón de metilación del ADN
alterado, particularmente de restos de citosina, causa inestabilidad
genómica y es mutagénico. Esto, presumiblemente, ha llevado a una
supresión del 80% de un sitio aceptor de metil CpG en organismos
eucariotas, que metila sus genomas. La metilación de la citosina
contribuye además a la generación de polimorfismos y mutaciones en
las líneas germinales y a mutaciones de transición que inactivan los
genes supresores de tumores (Jones, Cancer Res.
56:2463-2467, 1996). Se requiere también la
metilación para el desarrollo embrionario de los mamíferos. (Li y
col., Cell 69:915-926, 1992). Parece que la
metilación de regiones promotoras ricas en CpG podría bloquear la
actividad transcripcional. Ushijima y col. (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 94:2284-2289, 1997) caracterizaron y
clonaron fragmentos de ADN que muestran cambios en la metilación
durante la hepatocarcinogénesis del ratón. Los datos de un grupo de
estudios de sitios de metilación alterados en células cancerígenas
muestran que no es simplemente el conjunto de niveles de metilación
lo que está alterado en el cáncer, sino los cambios en la
distribución de los grupos metilo.
Estos estudios sugieren que la metilación de las
secuencias ricas en CpG, conocidas como islas CpG, proporciona una
vía alternativa para la inactivación de supresores de tumores. La
metilación de oligonucleótidos CpG en los promotores de genes
supresores de tumores puede llevar a su inactivación. Otros estudios
proporcionan datos de que las alteraciones en el procedimiento
normal de metilación están asociadas con inestabilidad genómica
(Lengauer, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:2545-2550, 1997). Tales cambios epigenéticos
anormales pueden encontrarse en muchos tipos de cáncer y pueden
servir como marcadores potenciales para transformación oncogénica, a
condición de que haya medios fiables para determinar rápidamente
dichos cambios epigenéticos. Por lo tanto, existe una necesidad en
la técnica de un procedimiento fiable y rápido (alto rendimiento)
para determinar la metilación como la alteración epigenética
preferida.
Existen diversos procedimientos de detección
genómica que se han usado para identificar sitios de metilación
alterados en células cancerosas. Por ejemplo, un procedimiento
implica detección genómica por marcado de restricción (Kawai y col.,
Mol. Cell. Biol. 14:7421-7427, 1994), y otro
ejemplo implica PCR arbitrariamente cebada sensible a metilación
(Gonzalgo y col., Cancer Res. 57:594-599,
1997). Se han controlado los cambios en los patrones de metilación
en sitios específicos CpG por digestión de ADN genómico con enzimas
de restricción sensibles a metilación, seguido de análisis Southern
de las regiones de interés (procedimiento de
digestión-Southern). El procedimiento de digestión
Southern es sencillo pero tiene desventajas inherentes en que
requiere una gran cantidad de ADN de alto peso molecular (al menos o
más de 5 \mug) y tiene un alcance limitado para el análisis de
sitios CpG (como se determina por la presencia de sitios de
reconocimiento para enzimas de restricción sensibles a metilación).
Otro procedimiento para analizar cambios en los patrones de
metilación implica un procedimiento basado en PCR que implica
digestión de ADN genómico con enzimas de restricción sensibles a la
metilación antes de la amplificación por PCR
(Singer-Sam y col., Nucl. Acids. Res. 18:687,
1990). Sin embargo, este procedimiento no se ha mostrado eficaz por
el alto grado de falsas señales positivas (metilación presente)
debidas a una ineficaz digestión enzimática o una sobreamplificación
en la posterior reacción de PCR.
Se ha simplificado la secuenciación genómica
para el análisis de los patrones de metilación del ADN y la
distribución de 5-metilcitosina usando tratamiento
con bisulfito (Frommer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:1827-1831, 1992). El tratamiento del ADN con
bisulfito distingue las citosinas metiladas de las no metiladas,
pero originalmente la secuenciación genómica con bisulfito requiere
la secuenciación a gran escala de múltiples clones de plásmidos
para determinar el conjunto de los patrones de metilación, lo que
evita que esta técnica sea útil en el mercado para determinar los
patrones de metilación en cualquier tipo de ensayo de diagnóstico
rutinario.
Además, se ha informado de otras técnicas que
utilizan tratamiento del ADN con bisulfito como un punto de partida
para el análisis de metilación. Estos incluyen PCR específica de
metilación (MSP) (Herman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:9821-9826, 1992); y digestión con enzimas de
restricción de productos de PCR amplificados de ADN convertido con
bisulfito (Sadri y Hornsby, Nucl. Acids. Res.
24:5058-5059, 1996; y Xiong y Laird, Nucl. Acids
Res. 25:2532-2534, 1997).
Las técnicas de PCR se han desarrollado para la
detección de mutaciones génicas (Kuppuswamy y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88:1143-1147, 1991) y la
expresión específica de alelos (Szabo y Mann, Genes Dev.
9:3097-3108, 1995; y Singer-Sam y
col., PCR Methods Appl. 1:160-163, 1992).
Dichas técnicas utilizan cebadores internos, que templan a una
plantilla generada por PCR y terminan inmediatamente en el extremo
5' del nucleótido sencillo a ensayar. Sin embargo no se ha probado
una técnica de expresión de alelos específica dentro del contexto de
detección de patrones de metilación del ADN.
La mayoría de las técnicas de biología molecular
usadas para analizar loci específicos, tales como islas CpG en ADN
genómico complejo, implican alguna forma de amplificación específica
de secuencia, tanto si es una amplificación biológica por clonación
en E. coli, amplificación directa por PCR o amplificación de
señal por hibridación con una sonda que puede visualizarse. Ya que
la metilación del ADN es añadida después de la replicación por una
metiltransferasa dedicada al mantenimiento del ADN que no está
presente tanto en E. coli como en la reacción PCR, dicha
información de metilación se pierde durante la clonación molecular o
la amplificación por PCR. Es más, la hibridación molecular no
discrimina entre ADN metilado y no metilado, ya que el grupo metilo
de la citosina no participa en el apareamiento de bases. La falta de
una forma fácil de amplificar la información de metilación en el ADN
genómico complejo ha sido probablemente el más importante
impedimento en la investigación de la metilación del ADN. Por lo
tanto, existe una necesidad en la técnica de mejorar las técnicas de
detección de la metilación, especialmente de una manera
cuantitativa.
Los procedimientos indirectos para las
determinaciones del patrón de metilación del ADN en loci específicos
que se han desarrollado, dependen de técnicas que alteran el ADN
genómico de una manera dependiente de la metilación, antes del
suceso de amplificación. Hay dos procedimientos primarios que se han
utilizado para conseguir esta alteración del ADN dependiente de la
metilación. La primera en la digestión por una enzima de restricción
que está afectada en su actividad por la
5-metilcitosina en el contexto de una secuencia CpG.
El corte, o la falta de él, puede revelarse posteriormente por
transferencia Southern o por PCR. La otra técnica que ha recibido
recientemente un amplio uso es el tratamiento del ADN genómico con
bisulfito de sodio. El tratamiento con bisulfito de sodio convierte
a todas las citosinas no metiladas en el ADN en uracilo por
desaminación, pero deja los restos de citosina metilados intactos.
La posterior amplificación por PCR reemplaza los restos de uracilo
con timinas y los restos de 5-metilcitosina con
citosinas. La diferencia en la secuencia resultante se detecta
usando técnicas de detección de secuencias de ADN convencionales,
principalmente PCR.
Muchas técnicas de detección de la metilación
del ADN utilizan tratamiento con bisulfito. En la actualidad, a
todos los procedimientos basados en el tratamiento con bisulfito les
sigue una reacción de PCR para analizar loci específicos dentro del
genoma. Existen dos formas principales diferentes por las que puede
revelarse la diferencia de secuencia generada en la secuencia por el
tratamiento con bisulfito de sodio. La primera es diseñar cebadores
de PCR que únicamente templan con ADN convertido metilado o no
metilado. Esta técnica se denomina "PCR específica de
metilación" ó "MSP". El procedimiento usado por todas las
otras técnicas basadas en el bisulfito (tal como secuenciación
genómica con bisulfito, COBRA y MsNuPE) es amplificar el ADN
convertido por el bisulfito usando cebadores que templan en puntos
donde faltan dinucleótidos CpG en la secuencia genómica original. De
esta forma, los cebadores de PCR pueden amplificar secuencias entre
los dos cebadores, a pesar del estado de metilación del ADN de esa
secuencia en el ADN genómico original. Esto da como resultado un
conjunto de diferentes productos de PCR, todos con la misma longitud
y que difieren en su secuencia sólo en los sitios potenciales de
metilación del ADN en CpG situados entre los dos cebadores. La
diferencia entre estos procedimientos de procesamiento de la
secuencia convertida por el bisulfito es que en MSP, la información
de metilación se obtiene de la producción o falta de producción de
un producto de PCR, mientras que en otras técnicas se genera siempre
una mezcla de productos y la mezcla se analiza posteriormente para
producir información cuantitativa del la producción relativa de los
diferentes estados de metilación.
MSP es una técnica cualitativa. No es
cuantitativa por dos razones. La primera es que la información de
metilación se obtiene de la comparación de dos reacciones de PCR
diferentes (la versión metilada y la no metilada). Existen
dificultades inherentes en hacer comparaciones cinéticas de dos
reacciones de PCR diferentes. El otro problema con MSP es que a
menudo los cebadores cubren más de un dinucleótido CpG. La
consecuencia es que se pueden generar múltiples variantes de la
secuencia, dependiendo del patrón de metilación del ADN en el ADN
genómico original. Por ejemplo, si el cebador delantero es un
oligonucleótido de 24 nucleótidos que cubre 3 CpG, entonces 2^{3}
= 8 diferentes secuencias teóricas de permutación podrían surgir en
el ADN genómico con la conversión de bisulfito dentro de esta
secuencia de 24 nucleótidos. Si sólo se hace una reacción
completamente metilada y otra completamente sin metilar, entonces
sólo se está investigando realmente 2 de 8 posibles estados de
metilación. La situación se complica más, si los estados de
metilación intermedia llevan a una amplificación, pero con eficacia
reducida. Por lo tanto, la técnica MSP no es cuantitativa. Por lo
tanto, existe una necesidad en la técnica de mejorar la técnica MSP
y cambiarla para que sea más cuantitativa y facilitar su
procedimiento para una mayor producción. La presente invención se
refiere a esta necesidad de un ensayo de metilación más rápido y
cuantitativo.
La presente invención proporciona un
procedimiento para detectar la metilación de la citosina y/o islas
CpG metiladas dentro de una muestra de ADN genómico, que
comprende:
(a) poner en contacto una muestra de ADN
genómico con un agente modificante que modifica las citosinas no
metiladas para producir un ácido nucleico transformado; y
(b) realizar una etapa de amplificación y
detección que comprende
- -
- amplificar el ácido nucleico transformado por medio de cebadores de oligonucleótidos en presencia de una o una pluralidad de sondas de oligonucleótidos específicas, en las que dicho cebador o pluralidad de cebadores específicos o sondas específicas son capaces de distinguir entre ácido nucleico metilado y no metilado, con la condición de que al menos una sonda de oligonucleótidos es una sonda específica de CpG capaz de distinguir entre ácido nucleico metilado y no metilado; y
- -
- detectar el ácido nucleico metilado basándose en un desplazamiento de sonda basado en amplificación y PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia. Preferiblemente, la etapa de amplificación es una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el agente modificante es bisulfito. Preferiblemente el ácido nucleico transformado contiene uracilo en lugar de los restos de citosina no metilada presentes en la muestra de ADN genómico no modificado. Preferiblemente, la sonda comprende adicionalmente un resto etiqueta fluorescente y la etapa de amplificación y detección incluye PCR cuantitativa basada en fluorescencia.
La presente invención proporciona un
procedimiento para detectar un ácido nucleico que contiene CpG
metilado, que comprende:
(a) poner en contacto una muestra de ADN
genómico con un agente modificante que modifica las citosinas no
metiladas para producir un ácido nucleico transformado; y
(b) realizar una etapa de amplificación y
detección que comprende
- -
- amplificar el ácido nucleico transformado en la muestra por medio de cebadores de oligonucleótidos en presencia de una sonda de oligonucleótido específica de CpG, donde la sonda, pero no los cebadores, distinguen entre ácido nucleicos modificado metilado y no metilado; y
- -
- detectar el ácido nucleico metilado basándose en un desplazamiento de sonda basado en amplificación y PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia. Preferiblemente, la etapa de amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el agente modificante comprende bisulfito. Preferiblemente el ácido nucleico transformado contiene uracilo en lugar de los restos de citosina no metilada presentes en la muestra que contiene ácido nucleico no modificado. Preferiblemente, el procedimiento de detección es por medio de una medida de una señal fluorescente basada en desplazamiento de la sonda específica de CpG mediado por amplificación y el procedimiento de detección comprende PCR cuantitativa basada en fluorescencia. Las cantidades de metilación en la muestra de ácido nucleico se determinan cuantitativamente basándose en una referencia a una reacción control para cantidad de entrada de ácido nucleico.
La presente invención además proporciona un
procedimiento para detectar un ácido nucleico que contiene CpG
metilada y que comprende:
(a) poner en contacto de una muestra que
contiene ácido nucleico con un agente modificante que modifica las
citosinas no metiladas para producir un ácido nucleico transformado;
y
(b) realizar una etapa de amplificación y
detección que comprende
- -
- amplificar el ácido nucleico transformado en la muestra por medio de cebadores de oligonucleótidos en presencia de una sonda de oligonucleótidos específica de CpG, en la que la sonda, y los cebadores, distinguen entre ácidos nucleicos modificados metilados y no metilados; y
- -
- detectar el ácido nucleico metilado basándose en un desplazamiento de sonda basado en amplificación y PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia. Preferiblemente, la etapa de amplificación es una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el agente modificante es bisulfito. Preferiblemente, el ácido nucleico transformado contiene uracilo en lugar de los restos de citosina no metilada presentes en la muestra que contiene ácido nucleico no modificado. Preferiblemente, el procedimiento de detección comprende la medida de una señal fluorescente basada en desplazamiento mediado por la amplificación de la sonda específica de CpG y el procedimiento de amplificación y detección comprende PCR cuantitativa basada en fluorescencia.
La presente invención proporciona además un kit
de detección de la metilación útil para la detección de ácido
nucleico que contiene CpG metilado, que comprende un medio de
transporte que está compartimentalizado para recibir en
confinamiento cercano en su interior uno o dos recipientes que
contienen:
(i) un agente modificante que modifica la
citosina no metilada para producir un ácido nucleico
transformado;
(ii) cebadores para la amplificación del ácido
nucleico transformado;
(iii) cebadores para la amplificación del ácido
nucleico de control no modificado; y
(iv) una sonda específica de CpG cuya detección
se basa en desplazamiento de la sonda mediada por la amplificación y
PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia, donde la
sonda específica de CpG distingue entre ácido nucleico modificado
metilado o no.
Preferiblemente, el agente modificante comprende
bisulfito. Preferiblemente, el agente modificante convierte los
restos de citosina a restos de uracilo. Preferiblemente, la sonda
específica de oligonucleótidos es una sonda de oligonucleótidos
específica de CpG, en la que la sonda, pero no los cebadores para la
amplificación del ácido nucleico transformado, distingue entre ácido
nucleico modificado metilado y no metilado. Como alternativa, la
sonda específica de oligonucleótidos es una sonda de
oligonucleótidos específica de CpG, en la que la sonda y los
cebadores para la amplificación del ácido nucleico transformado
distinguen entre ácido nucleico modificado metilado o no metilado.
Preferiblemente, la sonda además comprende un resto fluorescente
unido a una base oligonucleótido directamente o a través de un resto
de unión y la sonda es específica, una sonda doblemente etiquetada
TaqMan.
La Figura 1 muestra un resumen de la tecnología
MSP (de la técnica anterior) usando cebadores de PCR que
inicialmente discriminan entre ADN metilado y no metilado
(transformado con bisulfito). La parte superior muestra el resultado
del procedimiento MSP cuando el ADN genómico de cadena sencilla se
somete inicialmente a transformación con bisulfito de sodio
(desaminación de restos no metilados de citosinas a uracilos)
seguido de reacciones de PCR con la plantilla transformada, tal que
sólo aparece un producto de PCR con cebadores que templan con ADN
transformado (y por lo tanto no metilado). La parte inferior muestra
el resultado de contraste cuando se usa una muestra de ADN genómico
metilado de cadena sencilla. De nuevo, el procedimiento proporciona
primero tratamiento con bisulfito de sodio seguido de reacciones de
PCR tales que sólo aparece un producto de PCR con cebadores que
templan específicamente con ADN no transformado (y por tanto
metilado inicialmente).
La Figura 2 muestra un procedimiento alternativo
para evaluar la metilación del ADN en ADN genómico tratado con
bisulfito de sodio usando cebadores de PCR no discriminantes (con
respecto al estado de metilación) directos e inversos para
amplificar un locus específico. En esta ilustración, se proporciona
ADN desnaturalizado (por ejemplo, cadena sencilla), que tiene un
estado de metilación mixto, como se encontraría típicamente en una
muestra de análisis. La muestra se transforma en una reacción
convencional con bisulfito de sodio y los productos mixtos se
amplifican por una reacción de PCR usando cebadores que no se
solapan con ningún dinucleótido CpG. Esto produce un conjunto
imparcial (con respecto al estado de metilación) de productos de
PCR. El conjunto mixto y heterogéneo puede analizarse después con
una técnica capaz de detectar diferencias en la secuencia,
incluyendo la secuenciación directa del ADN, subclonación de
fragmentos de PCR seguido de secuenciación de clones
representativos, reacción de extensión de cebadores de nucleótidos
sencillos (MS-SNuPE), ó digestión con enzimas de
restricción (COBRA).
La Figura 3 muestra un diagrama de flujo del
procedimiento de la invención en varias, pero no todas,
realizaciones alternativas para análisis de productos de PCR. No se
muestran en esta Figura variaciones en la metodología de detección,
tales como el uso de tecnología de sonda dual (Lightcycler®) o
cebadores fluorescentes (Sunrise® technology). Específicamente, el
procedimiento de la invención comienza con una muestra mixta de ADN
genómico que es transformado con una reacción con bisulfito de sodio
en un conjunto mixto de diferencias de secuencia dependientes de la
metilación de acuerdo con procedimientos convencionales (el
procedimiento del bisulfito transforma los restos no metilados de
citosina en uracilo). Después se realiza una reacción PCR basada en
fluorescencia en una reacción "imparcial" de PCR con cebadores
que no se solapan con sitios conocidos de metilación CpG (parte
izquierda de la Figura 3) o en una reacción "parcial" con
cebadores que se solapan con dinucleótidos CpG conocidos (parte
derecha de la Figura 3). La discriminación de secuencia puede
producirse tanto al nivel del procedimiento de amplificación (C y D)
como al nivel del procedimiento de detección fluorescente (B), ó
ambos (D). En la parte izquierda (B), se muestra un ensayo
cuantitativo para el patrón de metilación en la muestra de ADN
genómico, en el que la discriminación de secuencia ocurre a nivel de
hibridación de la sonda. En esta versión, la reacción de PCR
proporciona una amplificación imparcial en presencia de una sonda
fluorescente que se solapa con un sitio supuesto de metilación
particular. Un control imparcial para la cantidad de ADN aportado lo
proporciona una reacción en la que ni los cebadores, ni las sondas
se superponen sobre ningún dinucleótido CpG (A). Como alternativa,
como se muestra en la parte derecha de la Figura 3, se consigue un
ensayo cualitativo para la metilación genómica utilizando sondas del
conjunto parcial de PCR con oligonucleótidos control que no
"cubren" sitios conocidos de metilación (C; una versión basada
en fluorescencia de la técnica MSP que no forma parte de la
invención), ó con oligonucleótidos que cubren sitos potenciales de
metilación (D).
La figura 4 muestra un organigrama que es una
visión de conjunto del procedimiento de la invención empleando una
sonda "TaqMan®" en el procedimiento de amplificación. En
resumen, El ADN de doble cadena se trata con bisulfito de sodio y es
objeto de uno ó dos conjuntos de reacciones de PCR usando sondas
TaqMan®; concretamente con cebadores parciales y sonda TaqMan®
(columna de la izquierda) ó cebadores imparciales y sonda TaqMan®
(columna de la derecha). La sonda TaqMan® está etiquetada doblemente
con un "informador" fluorescente (etiquetado "R" en la
Figura 4) y con moléculas "interruptoras" (etiquetadas
"O"), y se diseña para ser específica para una región
relativamente rica en contenido de GC, de forma que se funda a una
temperatura aproximadamente 10ºC más alta en el ciclo de PCR que
los cebadores directos e inversos. Esto le permite permanecer
hibridado completamente durante las etapas de templado/extensión de
la PCR. Como la Taq polimerasa sintetiza enzimáticamente una nueva
cadena durante la PCR, alcanzará eventualmente a la sonda TaqMan®
templada. La actividad Taq polimerasa 5' a 3' endonucleasa
desplazará después a la sonda TaqMan® al digerirla, liberando la
molécula informadora fluorescente para detección cuantitativa de su
señal ahora no interrumpida usando un sistema fluorescente en tiempo
real como se describe en este documento.
Las Figuras 5A y 5B muestran una comparación del
ensayo de la invención con un ensayo COBRA convencional. La Figura
5A (Panel A) muestra un gel COBRA usado par determinar el nivel de
metilación del ADN en el locus ESR1 en ADN de estado de metilación
desconocido (esperma, no metilado) y HCT116 (metilado). Las
cantidades relativas de los productos cortados se indican debajo del
gel. Un fragmento de 56 pb representa moléculas de ADN en las cuales
el sitio TaqI proximal a la sonda de hibridación está metilado en el
ADN genómico original. El fragmento de 86 pb representa moléculas de
ADN en las que el sitio proximal TaqI no está metilado y el sitio
distal sí lo está. La figura 5B (Panel B) resume los resultados de
COBRA y los compara con los resultados obtenidos con la versión
metilada y no metilada del procedimiento de ensayo de la invención.
Los resultados se expresan como proporciones entre las reacciones
específicas de metilación y una reacción de control. Para las
muestras tratadas con bisulfito, la reacción de control fue un
ensayo MYOD1 como se describe en el Ejemplo 1. Para las muestras no
tratadas, se usaron como control los cebadores ACTB descritos para
las reacciones RT-PCR para verificar la aportación
de muestras de ADN no transformado. (Los cebadores ACTB no abarcan
un intrón). "No PCR" indica que no se obtuvo producto de PCR en
ADN genómico no transformado con cebadores COBRA diseñados para
amplificar secuencias de ADN transformado con bisulfito.
Las figuras 6A-6C ilustran una
determinación de la especificidad de los oligonucleótidos. Se
analizaron ocho combinaciones diferentes de cebadores directos,
sondas y cebadores inversos en muestras de ADN con metilación
conocida o falta de metilación en el locus ESR1. La figura 6A (Panel
A) muestra la nomenclatura usada para la combinación de los oligos
ESR1. "U" se refiere a la secuencia de oligos que templa con
ADN no metilado transformado con bisulfito, mientras que "M" se
refiere a la versión metilada. La posición 1 indica el cebador
directo de PCR, la posición 2 la sonda, y la posición 3 el cebador
inverso. Las combinaciones usadas para las ocho reacciones se
muestran a continuación representando cada pareja de barras
experimentos duplicados. Los resultados se expresan como
proporciones entre los valores de ESR1 y los valores de control de
MYOD1. La Figura 6B (Panel B) representa un análisis de ADN de
esperma humano. La Figura 6C (Panel C) representa un análisis de ADN
obtenido de la línea celular de un cáncer colorrectal humano
HCT116.
La Figura 7 muestra un ensayo de la
reproducibilidad de las reacciones. Los ensayos se realizaron con
ocho reacciones independientes para determinar la reproducibilidad
en muestras de origen complejo. Se usaron para este propósito un
adenocarcinoma colorrectal primario humano y mucosa normal
emparejada (muestras 10N y 10T mostradas en la Figura 8). Los
resultados mostrados en esta figura representan los valores sin
procesar obtenidos en el ensayo. Los valores se han normalizado en
placa pero no se han corregido para ADN aportado. Las barras indican
los valores medios obtenidos en las ocho reacciones diferentes. Las
barras de error representan el error estándar de la media.
La figura 8 ilustra una comparación de la
expresión de MLH1, la inestabilidad de los microsatélites y la
metilación del promotor de MLH1 de 25 muestras emparejadas
colorrectales humanas. El organigrama superior muestra los niveles
de expresión de MLH1 medido por RT-PCR cuantitativa
en tiempo real (TaqMan®) en muestras emparejadas normales (barras
sombreadas) y muestras de tumor colorrectal (barras negras). Los
niveles de expresión se exponen como una proporción entre las
medidas de MLH1 y ACTB. El estado de inestabilidad de los
microsatélites (MSI) se indica por los círculos situados entre los
dos organigramas. Un círculo negro denota MSI positiva, mientras que
un círculo abierto indica que la muestra es MSI negativa, como se
determina por análisis de los loci BAT25 y BAT26. El organigrama
inferior muestra el estado de metilación del locus MLH1 como se
determina por un procedimiento de la invención. Los niveles de
metilación se representan como la proporción entre la reacción de
MLH1 metilado y la reacción de MYOD1.
La presente invención proporciona un
procedimiento rápido, sensible y reproducible con alta productividad
para detectar los patrones de metilación en muestras de ácido
nucleico. La invención proporciona la modificación dependiente de la
metilación del ácido nucleico, y después usa procedimientos de
amplificación, detección de ácidos nucleicos ó ambos para distinguir
entre restos metilados y no metilados presentes en la muestra
original de ácido nucleico. En una realización preferida, la
invención proporciona la determinación del estado de metilación de
islas CpG dentro de muestras de ADN genómico.
En contraste con procedimientos anteriores de
determinación de patrones de metilación, la detección de los ácidos
nucleicos metilados es relativamente rápida y se basa en un
desplazamiento mediado por amplificación de sondas específicas de
oligonucleótidos. En una realización preferida, la amplificación y
detección, de hecho, se producen simultáneamente según los medido
por una PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia
("RT-PCR") usando sondas TaqMan® de
oligonucleótidos específicas, etiquetadas doblemente. Las sondas
desplazables pueden diseñarse específicamente para distinguir entre
sitios CpG metilados y no metilados presentes en la muestra original
de ácido nucleico no modificado.
Como la técnica de PCR específica de metilación
("MSP"; Patente de Estados Unidos Nº 5.786.146), la presente
invención proporciona ventajas significativas sobre procedimientos
previos basados en PCR y otros procedimientos. (por ejemplo,
análisis de Southern) es sustancialmente más sensible que un
análisis Southern, y facilita la detección de un bajo número
(porcentaje) de alelos metilados en muestras de ácidos nucleicos muy
pequeñas, así como las muestras embebidas en parafina. Es más, en el
caso de ADN genómico, el análisis no está limitado a secuencias de
ADN reconocidas por endonucleasas de restricción sensibles a la
metilación, permitiendo de este modo un mapeado fino de los patrones
de metilación a través de regiones ricas en CpG más amplias. La
presente invención elimina también los resultados de cualquier falso
positivo, debido a digestiones incompletas por enzimas de
restricción sensibles a metilación, inherentes en procedimientos
previos de PCR basada en metilación.
La presente invención ofrece también ventajas
significativas sobre la tecnología MSP. Se puede aplicar como un
procedimiento cuantitativo para medir las cantidades de metilación,
y es sustancialmente más rápido. Un avance importante sobre la
tecnología MSP es que el gel de electroforesis no es sólo una tarea
manual que consume tiempo y que limita las capacidades de alto
rendimiento, sino que la manipulación y apertura de los tubos de
reacción de PCR aumenta la posibilidad de no identificación de la
muestra y aumenta enormemente la posibilidad de contaminar futuras
reacciones de PCR con productos traza de PCR. El procedimiento
convencional para evitar la contaminación de la PCR por
incorporación de uracilo y el uso de
Uracilo-ADN-Glicoxilasa (AmpErase)
es incompatible con la tecnología de bisulfito, debido a la
presencia de uracilo en el ADN tratado con bisulfito. Por lo tanto,
el evitar la contaminación por productos de PCR en una aplicación de
alto rendimiento con ADN tratado con bisulfito es un mayor desafío
técnico que la amplificación de ADN no modificado. La presente
invención no requiere ninguna manipulación ó procesamiento
post-PCR. Esto no solo reduce enormemente la
cantidad de trabajo implicado en el análisis de ADN tratado con
bisulfito, sino que proporciona también un medio de evitar la
manipulación de productos de PCR que puedan contaminar futuras
reacciones.
Dos factores limitan a MSP, en el mejor de los
casos, a aplicaciones semi-cuantitativas. Primero,
la información de metilación MSP se obtiene de la comparación de dos
reacciones de PCR diferentes (las versiones metiladas y no
metiladas). Existen dificultades inherentes en hacer comparaciones
cinéticas entre dos reacciones de PCR diferentes sin un
procedimiento altamente cuantitativo de seguimiento de la reacción
de amplificación, tal como la PCR cuantitativa en tiempo real. El
otro problema se refiere a el hecho de que la amplificación MSP se
realiza por medio de oligonucleótidos específicos de CpG; esto es,
por cebadores parciales. A menudo, la secuencia de ADN cubierta por
tales cebadores contiene más de un dinucleótido CpG con la
consecuencia de que la secuencia amplificada representará sólo una
de las múltiples secuencias potenciales variantes presentes,
dependiendo del patrón de metilación de ADN en el ADN genómico
original. Por ejemplo, si el cebador primario es un oligonucleótido
de 24 nucleótidos que cubre 3 CpG, entonces 2^{3} = 8 diferentes
permutaciones teóricas de la secuencia pueden surgir en el ADN
genómico después de la transformación dentro de esta secuencia de 24
nucleótidos. Si sólo se realiza una reacción de metilación completa
y una reacción de no metilación completa, entonces sólo se analizan
2 de 8 estados de metilación posibles.
La situación se complica adicionalmente si los
estados de metilación intermedia se amplifican de forma no
específica por los cebadores completamente metilados ó no metilados.
Por consiguiente, la patente MSP describe explícitamente una técnica
no cuantitativa basada en la existencia ó no existencia de un
producto de PCR en la reacción de metilación completa contra la
reacción de no metilación completa, en lugar de una comparación de
la cinética de las dos reacciones.
En contraste, una realización de la presente
invención proporciona la amplificación imparcial de todos los
posibles estados de metilación usando cebadores que no cubren
ninguna secuencia CpG en la secuencia de ADN original no modificada.
Hasta el punto de que todos los patrones de metilación se amplifican
de igual forma, la información cuantitativa sobre los patrones de
metilación del ADN pueden después distinguirse del conjunto de PCR
resultante por cualquier técnica capaz de detectar diferencias en la
secuencia (por ejemplo, PCR basada en fluorescencia).
Además, la presente invención es sustancialmente
más rápida que MSP. Como se indica anteriormente, MSP depende de la
existencia ó no existencia de un producto de PCR en la reacción
metilada frente a la no metilada para determinar el estado de
metilación de una secuencia CpG cubierta por un cebador.
Mínimamente, esto requiere la realización de un análisis
electroforético en gel de agarosa o poliacrilamida (véase Patente de
Estados Unidos Nº 5.786.146, Figs 2A-2E, y
3A-3E). Es más, la determinación del estado de
metilación de cualquier sitio CpG dentro de una región dada
amplificada por MSP requeriría análisis adicionales tales como: (a)
análisis con endonucleasas de restricción (por ejemplo, análisis
COBRA; Xiong y Laird, Nucleic Acids Res.
25:2532-2534, 1997) antes o después de la
amplificación y la modificación del ácido nucleico, con la condición
de que la región de secuencia no modificada de interés contenga
sitios sensibles a la metilación, ó que la modificación (por
ejemplo, con bisulfito) de cómo resultado la creación o destrucción
de sitios de restricción; (b) reacciones de extensión del cebador de
nucleótidos sencillo (Ms-Snupe; Gonzalgo y Jones,
Nucleic Acids Res 25:2529-2531, 1997); ó (c)
secuenciación del ADN de los productos de amplificación. Dichos
análisis adicionales no solo son sujeto de errores (digestión de
enzimas de restricción incompleta), sino que también añaden un
tiempo sustancial y están a expensas del procedimiento de
determinación del estado de metilación de CpG de, por ejemplo,
muestras de ADN genómico.
En contraste, en una realización preferida de la
presente invención, la amplificación y la detección ocurren
simultáneamente medidas por una PCR cuantitativa en tiempo real
basada en fluorescencia usando sondas específicas de
oligonucleótidos etiquetadas doblemente. En principio, el estado de
metilación de cualquier secuencia específica de una sonda dentro de
una región amplificada puede determinarse contemporáneamente por
amplificación, sin requerimiento de una posterior manipulación ó
análisis.
Como describen los inventores de la MSP, "la
única técnica que puede proporcionar análisis más directo que la MSP
para la mayoría de los sitios CpG dentro de una región definida es
la secuenciación genómica". (Patente de Estados Unidos Nº
5.786.146 en 5, línea 15-17). La presente invención
proporciona, de hecho, un procedimiento para la secuenciación
directa parcial de sitios CpG modificados dentro de una región
conocida (secuenciada previamente) de ADN genómico. De este modo, se
construyen una serie de sondas TaqMan® específicas de CpG, cada una
correspondiente a un sitio de metilación particular en una región
dada de ADN amplificado. Esta serie de sondas se utilizan después en
reacciones de amplificación paralelas, usando alícuotas de una
muestra sencilla y modificada de ADN, para determinar
simultáneamente el patrón completo de metilación presente en la
muestra de ADN genómico original no modificado. Esto se realiza en
una fracción del tiempo y el gasto requeridos para la secuenciación
directa de la muestra de ADN genómico, y es sustancialmente más
sensible. Es más, una realización de la presente invención
proporciona una valoración cuantitativa de dicho patrón de
metilación.
La presente invención describe el procedimiento
de la técnica y el kit de diagnóstico asociado, utilizando un agente
modificante del ácido nucleico dependiente de la metilación (por
ejemplo, bisulfito) para determinar cuantitativa y cualitativamente
el estado de metilación de CpG en muestras de ácidos nucleicos (por
ejemplo, muestras de ADN genómico). Los cuatro procedimientos están
resumidos en la Figura 3 y etiquetados al pie con letras de la A a
la D. En conjunto, la discriminación de secuencias metiladas de CpG
se diseña para que exista a nivel de la amplificación, sonda de
hibridación ó a ambos niveles. Por ejemplo, las aplicaciones C y D
utilizan cebadores "parciales" que distinguen entre ácidos
nucleicos modificados metilados ó no y proporcionan la
discriminación de secuencias metiladas de CpG a nivel de la
amplificación por PCR. El procedimiento B utiliza cebadores
"imparciales" (que no cubren sitios de metilación CpG), para
proporcionar la amplificación imparcial de ácidos nucleicos
modificados, pero utiliza preferentemente sondas que distinguen
entre ácidos nucleicos modificados metilados y no metilados para
proporcionar discriminación cuantitativa de secuencias CpG metiladas
a nivel de detección (por ejemplo, sólo a nivel de hibridación de
sondas fluorescente (ó luminiscente)). El procedimiento A no
proporciona, por sí mismo, discriminación de secuencias metiladas de
CpG tanto a nivel de detección como de amplificación, pero soporta y
valida las otras tres aplicaciones proporcionando reacciones de
control para ADN aportado.
Procedimiento D. En una primera
realización (Figura 3, Aplicación D), la invención proporciona un
procedimiento cualitativo para la detección de un ácido nucleico que
contiene CpG metiladas, incluyendo el procedimiento: poner en
contacto una muestra que contiene ácido nucleico con un agente
modificante que modifica las citosinas no metiladas para producir un
ácido nucleico transformado; amplificar el ácido nucleico
transformado por medio de dos cebadores de oligonucleótidos en
presencia de una sonda de hibridación de oligonucleótidos
específica, en la que ambos cebadores y sonda distinguen entre ácido
nucleico modificado metilado y no metilado; y detectar el ácido
nucleico "metilado" basado en la amplificación mediada por el
desplazamiento de la sonda.
El término "modifica" como se utiliza en
este documento significa la transformación de una citosina no
metilada en otro nucleótido por el agente modificante, dicha
conversión distinguiendo citosinas metiladas de las no metiladas en
la muestra original de ácido nucleico. Preferiblemente, el agente
transforma la citosina no metilada en uracilo. Preferiblemente, el
agente usado para la modificación de la citosina no metilada es
bisulfito de sodio, sin embargo, puede ser sustituido en el
procedimiento de la invención por otros agentes modificantes que
modifiquen selectivamente las citosinas no metiladas, pero no las
citosinas metiladas. El bisulfito de sodio reacciona fácilmente con
el doble enlace 5, 6 de la citosina, pero no con la citosina
metilada, para producir una citosina sulfonatada intermedia que
sufre desaminación en condiciones alcalinas para producir uracilo
(Ejemplo 1). Ya que la Taq polimerasa reconoce el uracilo como
timina y 5 metilcitidina (m5C) como citidina, la combinación
secuencial del tratamiento con bisulfito de sodio y la amplificación
por PCR da como resultado la conversión última de restos de citosina
no metilada en timina (C\rightarrowU\rightarrowT) y restos de
citosina metilada ("mC") en citosina
(mC\rightarrowmC\rightarrowC). Por lo tanto, el tratamiento del
ADN genómico con bisulfito de sodio crea diferencias en la secuencia
dependientes de la metilación por conversión de citosinas no
metiladas en uracilo y al hacer la PCR el producto resultante
contiene citosina sólo en las posiciones donde existe citosina
metilada en el ácido nucleico no modificado.
Los "cebadores" de oligonucleótidos, como
se usa en este documento, significa moléculas de ácidos
ribonucleicos o desoxirribunucleicos lineales, de cadena sencilla y
oligoméricos capaces de hibridación específica de secuencia
(templado) con cadenas complementarias de ácido nucleico modificado
ó no. Como se usa en este documento, los cebadores específicos son
preferiblemente ADN. Los cebadores de la invención se adhieren a
oligonucleótidos de secuencia apropiada y suficientemente largos
para proporcionar una eficiente y específica iniciación de la
polimerización (extensión del cebador) durante el procedimiento de
la amplificación. Como se usa en el procedimiento de la invención,
los cebadores de oligonucleótidos contienen típicamente
12-30 nucleótidos ó más, aunque pueden contener
menos. Preferiblemente, el cebador contiene 18-30
nucleótidos. La longitud exacta depende de múltiples factores
incluyendo la temperatura (durante la amplificación), el tampón y la
composición de nucleótidos. Preferiblemente, los cebadores son de
cadena sencilla aunque pueden usarse cebadores de doble cadena si
las cadenas se separan primero. Los cebadores pueden prepararse
usando cualquier procedimiento adecuado, tal como procedimientos
fosfotriéster ó fosfodiéster convencionales o realizaciones
automáticas que son comúnmente conocidas en la
técnica.
técnica.
Como se usa en las realizaciones de la invención
de este documento, los cebadores específicos se diseñan
preferiblemente para que sean sustancialmente complementarios a cada
cadena del locus genómico de interés. Típicamente, un cebador es
complementario a la cadena negativa (-) del locus (la cadena
"inferior" de una molécula de ADN de doble cadena situada
horizontalmente) y el otro el complementario a la cadena positiva
(+) (cadena "superior"). Como se usa en la realización de la
aplicación D, los cebadores se diseñan preferiblemente para solapar
sitios potenciales de metilación del ADN (nucleótidos CpG) y
distinguir específicamente el ADN modificado metilado del no
metilado. Preferiblemente, esta discriminación de secuencias se basa
en temperaturas de templado diferentes de oligonucleótidos
perfectamente emparejados frente oligonucleótidos desemparejados. En
la realización de la aplicación D, los cebadores se diseñan
típicamente para solapar de 1 a 5 secuencias CpG, y más
preferiblemente de 1 a 4. En contraste, en una realización
cuantitativa de la invención, los cebadores no se solapan con
ninguna secuencia CpG.
En el caso de conjuntos de cebadores
completamente "no metilados" (complementarios a cadenas de
ácidos nucleicos modificados no metilados), los cebadores
anti-sentido contienen restos de adenosina
("As") en lugar de restos de guanosina ("Gs") en la
correspondiente secuencia de la cadena (-). Estas As sustituidas en
el cebador anti-sentido serán complementarias a los
restos de uracilo y timidina ("Us" y "Ts") en la región
correspondiente de cadena (+) resultante de la modificación con
bisulfito de los restos de C no metilados ("Cs") y la posterior
amplificación. Los cebadores sentido, se diseñan preferiblemente
para sean complementarios a los productos de extensión del cebador
anti-sentido, y contienen Ts en lugar de Cs no
metilada en la secuencia correspondiente de la cadena (+). Estas Ts
sustituidas en el cebador con sentido serán complementarias a la As,
incorporada en los productos de extensión del cebador
anti-sentido en posiciones complementarias a Cs (Us)
modificadas en la cadena (+) original.
En el caso de cebadores completamente metilados
(complementarios a cadenas de ácidos nucleicos que contienen CpG
metilados), los cebadores anti-sentido no contienen
As en lugar de Gs en la correspondiente secuencia de la cadena (-)
que son complementarias a Cs metiladas (es decir, secuencias mCpG)
en la cadena (+) original. De forma similar, los cebadores sentido
en este caso no contendrán Ts en lugar de Cs metilada en la
correspondiente secuencia de mCpG de la cadena (+). Sin embargo, las
Cs que no están en las secuencias CpG en regiones cubiertas por los
cebadores completamente metilados, y que no están metiladas, se
representarán en el juego de cebadores completamente metilados como
se describe anteriormente para los cebadores no metilados.
Preferiblemente, como se emplea en la
realización de la aplicación D, el procedimiento de amplificación
proporciona la amplificación de ácido nucleico modificado con
bisulfito por medio de dos cebadores de oligonucleótidos en
presencia de una sonda específica de hibridación de
oligonucleótidos. Ambos cebadores y sonda distinguen entre ácidos
nucleicos modificados metilados y no metilados. Es más, la detección
del ácido nucleico metilado se basa en fluorescencia de sonda
mediada por amplificación. En una realización, la fluorescencia se
genera por la degradación de la sonda por la actividad 5' a 3'
exonucleasa de la enzima polimerasa. En otra realización, la
fluorescencia se genera por transferencia de energía fluorescente
efectuada entre dos sondas de hibridación adyacentes (Lightcycler®
technology) o entre una sonda de hibridación y un cebador. En otra
realización, la fluorescencia se genera por el mismo cebador
(Sunrise® technology). Preferiblemente, el procedimiento de
amplificación es una reacción en cadena enzimática que usa los
cebadores de oligonucleótidos para producir cantidades exponenciales
del producto de amplificación, de un locus objetivo, relativo al
número de etapas involucradas en la reacción.
Como se describe anteriormente, un miembro del
conjunto de cebadores es complementario a la cadena (-), mientras
que el otro es complementario a la cadena (+). Los cebadores se
eligen para agrupar el área de interés a ser amplificada; esto es,
el "amplicon". La hibridación de los cebadores con los ácidos
nucleicos objetivo desnaturalizados seguido de la extensión del
cebador con una ADN polimerasa y nucleótidos, da como resultado la
síntesis de nuevas cadenas de ácidos nucleicos correspondientes al
amplicon. Preferiblemente, la ADN polimerasa es Taq polimerasa, como
se usa comúnmente en técnica. Aunque puede sustituirse por otras
polimerasas con actividad 5' a 3' nucleasa. Ya que las nuevas
secuencias del amplicon son también plantillas para los cebadores y
la polimerasa, los repetidos ciclos de desnaturalización, templado
del cebador y extensión resultan en una producción exponencial del
amplicon. El producto de la reacción en cadena es un dúplex de ácido
nucleico separado, correspondiente a la secuencia del amplicon, con
un final definido por los extremos de los cebadores específicos
empleados. Preferiblemente, el procedimiento de amplificación
utilizado es la PCR (Mullis y col., Cold Spring Harb. Symp.
Quant. Biol. 51:263-273; Gibbs, Anal.
Chem. 62:1202-1214, 1990), o más
preferiblemente, realizaciones automatizadas que son comúnmente
conocidas en la técnica.
Preferiblemente, las diferencias en la
secuencias dependientes de metilación se detectan por procedimientos
basados en PCR cuantitativa basada en fluorescencia (PCR
cuantitativa en tiempo real, Heid y col., Genome Res.
6:986-994, 1996; Gibson y col., Genome Res.
6:995-1001, 1996) (por ejemplo, "TaqMan®",
"Lightcycler®", y "Sunrise®" technologies). Para las
tecnologías "TaqMan®", y "Lightcycler®", la discriminación
de las secuencias puede producirse por alguna ó ambas de estas dos
etapas: (1) etapa de amplificación, ó (2) etapa de detección de
fluorescencia. En el caso de la tecnología "Sunrise®", las
etapas de amplificación y fluorescencia son las mismas. En el caso
de la hibridación FRET, se pueden usar sondas de formato
Lightcycler® y uno ó ambos oligonucleótidos FRET para distinguir la
diferencia en la secuencia. Más preferiblemente, el procedimiento de
amplificación de los empleados en todas las realizaciones de la
invención de este documento, es aquel que utiliza PCR cuantitativa
en tiempo real basada en fluorescencia (Heid y col., Genome
Res. 6:986-994, 1996) y que emplea una sonda de
oligonucleótidos fluorescente doblemente etiquetada (TaqMan® PCR,
usando un sistema de detección de la secuencia ABI Prism 7700,
Perkin Elmer Applied Biosystem, Foster City, California).
La reacción PCR "TaqMan®" usa un par de
cebadores de amplificación junto con un oligonucleótido
monoextensible interrogante, llamado sonda "TaqMan®", que se
diseña para hibridar con una secuencia rica en GC localizada entre
los cebadores directo e inverso (por ejemplo, sentido y
anti-sentido). La sonda "TaqMan®" además
comprende un "resto informador" fluorescente y un "resto
interruptor" covalentemente unidos a restos de unión (por
ejemplo, fosforoamidas) sujetadas a nucleótidos del oligonucleótido
"TaqMan®". Ejemplos de moléculas interruptoras e informadoras
adecuadas son: los colorantes 6FAM informadores fluorescentes 5'
("FAM"; 2,7
dimetoxi-4,5dicloro-6-carboxi-fluoresceína)
y TET
(6-carboxi-4,7,2',7'-tetraclorofluoresceína);
y el colorante TAMRA informador 3'
(6-carboxitetrametilrodamina) (Livak y col., PCR
Methods Appl. 4:357-352, 1995; Gibson y col.,
Genome Res. 6:995-1001; 1996, y Heid y col.,
Genome Res. 6:986-994, 1996).
Un procedimiento para diseñar sondas TaqMan®
apropiadas implica utilizar una herramienta de software
facilitadora, tal como "Primer Expres", que puede determinar
las variables de situación de islas de CpG dentro de secuencias
ricas en GC para proporcionar diferencias en la temperatura de
fusión de al menos 10ºC (relativas a las temperaturas de fusión del
cebador), debido tanto a secuencia específica (unión mas fuerte de
GC, en relación a los pares de bases AT), ó a la longitud del
cebador.
La sonda "TaqMan®" puede cubrir o no sitios
de metilación conocidos CpG, dependiendo del procedimiento de
invención particular usado. Preferiblemente, en la realización de la
aplicación D la sonda "TaqMan®" se diseña para que distinga
entre ácido nucleico modificado metilado o no metilado por
solapamiento de 1 a 5 secuencias CpG. Como se describe anteriormente
para los conjuntos de cebadores completamente metilados y
completamente no metilados, las sondas "TaqMan®" pueden
diseñarse para que sean complementarias tanto a ácidos nucleicos no
modificados, ó, por las apropiadas sustituciones de bases, a
secuencias modificadas con bisulfito que estaban completamente
metiladas o completamente no metiladas en la muestra de ácido
nucleico original no modificado.
Cada cebador de oligonucleótidos ó sonda en la
reacción PCR "TaqMan®" puede extenderse en cualquier lugar
desde ninguno a muchos dinucleótidos CpG que dan como resultado cada
uno dos variaciones de secuencia diferentes siguiendo el tratamiento
con bisulfito (^{m}CpG, ó UpG). Por ejemplo, si un oligonucleótido
se extiende por 3 dinucleótidos CpG, entonces el número de posibles
variantes de la secuencia que surgen en el ADN genómico es de
2^{3} = 8 secuencias diferentes. Si los cebadores directos e
inversos se extienden cada uno por 3 CpG y la sonda de
oligonucleótidos (ó ambos oligonucleótidos juntos en el caso del
formato FRET) se extiende por otros 3, entonces el número total de
permutaciones de la secuencia se convierte en 8 x 8 x 8 = 512. En
teoría, se podrían diseñar reacciones de PCR separadas para analizar
cuantitativamente las cantidades relativas de cada una de estas 512
variantes de secuencia. En la práctica, se puede obtener una
cantidad sustancial de información de metilación del análisis de un
número mucho menor de variantes de secuencia. Por lo tanto, en su
forma más simple, el procedimiento de la invención puede realizarse
diseñando reacciones para las variantes completamente metiladas y no
metiladas que representan las variantes de secuencia más extremas en
un ejemplo hipotético (véase Figura 3, aplicación D). La proporción
entre estas dos reacciones, ó como alternativa la proporción entre
la reacción metilada y una reacción de control (Figura 3, Aplicación
A), pueden proporcionar una media del nivel de metilación del ADN en
ese locus. En la Figura 4 se muestra un resumen más detallado de la
versión cualitativa.
La detección de la metilación en la realización
de la Aplicación D, como en otras realizaciones de este documento,
se basa en el desplazamiento mediado por amplificación de la prueba.
En teoría, el procedimiento de desplazamiento de la sonda puede
diseñarse para dejar la sonda intacta, o que tenga como resultado la
digestión de la sonda. Preferiblemente, como se usa en este
documento, el desplazamiento de la sonda se produce por digestión de
la sonda durante la amplificación. Durante la fase de extensión del
ciclo de PCR, la sonda de hibridación fluorescente se corta por la
actividad nucleolítica 5' a 3' de la ADN polimerasa. En el corte de
la sonda, la emisión del resto informador ya no se transfiere
eficazmente al resto interruptor, dando como resultado en un aumento
del espectro de emisión fluorescente del resto informador a 518 nm.
La intensidad de fluorescencia del resto interruptor (por ejemplo
TAMRA), cambia muy poco durante el curso de la amplificación por
PCR. Pueden influir varios factores sobre la eficacia de las
reacciones de PCR "TaqMan®", incluyendo: concentraciones de
magnesio y sal, condiciones de la reacción (tiempo y temperatura),
secuencias del cebador; y tamaño del objetivo de PCR (es decir,
tamaño del amplicon) y la composición. La optimización de estos
factores para producir una óptima intensidad de fluorescencia para
un locus genómico dado es obvia para un especialista en la técnica
de PCR, y las condiciones preferidas se ilustran más adelante en los
"Ejemplos" de este documento. El amplicon puede variar en
tamaño entre 50 a 8.000 pares de bases, o mayor, pero puede ser más
pequeño. Típicamente, el amplicon es de 100 a 1000 pares de bases, y
preferiblemente es de 100 a 500 pares de bases. Preferiblemente, la
reacción se controla en tiempo real realizando una amplificación por
PCR que utiliza placas y tapas ópticas de 96 pocillos, y un detector
de secuencia (Prisma ABI) para permitir la medida continua de los
espectros fluorescentes de los 96 pocillos del ciclador térmico
durante la amplificación por PCR. Preferiblemente, el procedimiento
D se realiza en combinación con el procedimiento A (Figura 3) para
proporcionar controles de la cantidad de ácido nucleico aportado, y
normalizar datos de placa a placa.
Aplicación C. El procedimiento de la
invención, como se describe anteriormente, puede ser modificado para
evitar la discriminación de la secuencia a nivel de la detección del
producto de PCR. Por lo tanto, en una realización adicional
cualitativa del procedimiento (Figura 3, Aplicación C), sólo se
diseñan los cebadores para cubrir dinucleótidos CpG, y la
discriminación de la secuencia ocurre solamente a nivel de la
amplificación. Preferiblemente, la sonda usada en esta realización
es todavía una sonda TaqMan®, pero se diseña para que no se solape
con ninguna secuencia CpG presente en el ácido nucleico original no
modificado. La realización de la Aplicación C representa una versión
de alto rendimiento basada en fluorescencia y en tiempo real de la
tecnología MSP, en la que se consigue una mejora sustancial
reduciendo el tiempo requerido para la detección de secuencias
metiladas de CpG. Preferiblemente, las reacciones se controlan en
tiempo real realizando una amplificación por PCR que utiliza placas
y tapas ópticas de 96 pocillos y un detector de secuencia (prisma
ABI) para permitir una medida continua de los espectros de
fluorescencia de los 96 pocillos del ciclador térmico durante la
amplificación por PCR. Preferiblemente, el procedimiento C se
realiza en combinación con el procedimiento A para proporcionar
controles de la cantidad de ácido nucleico aportado y para
normalizar datos de placa en placa.
Aplicación B. El procedimiento de la
invención puede también modificarse para evitar la discriminación de
la secuencia a nivel de la amplificación PCR (Figura 3, A y B). En
una realización cuantitativa del procedimiento (Figura 3, Aplicación
B), la sonda se diseña sólo para cubrir dinucleótidos CpG, y la
discriminación de la secuencia ocurre únicamente a nivel de la
hibridación de la sonda. Preferiblemente, se utilizan sondas
TaqMan®. En esta versión, las variantes de la secuencia que resultan
de la etapa de transformación con bisulfito se amplifican con igual
eficacia; siempre que no existan sesgos de amplificación inherentes
(Warnecke y col. Nucleic Äcids Res.
25:4422-4426, 1997). El diseño de sondas diferentes
para cada una de las diferentes variantes de secuencia asociadas con
un patrón de metilación particular (por ejemplo 2^{3} = 8 sondas
en el caso de 3 CpG) permitiría una determinación cuantitativa de la
prevalencia relativa de cada permutación de secuencia en el conjunto
mixto de productos de PCR. Preferiblemente, las reacciones se
controlan en tiempo real realizando una amplificación por PCR usando
placas y tapas ópticas de 96 pocillos y un detector de secuencia
(Prisma ABI) para permitir una medida continua de los espectros
fluorescentes de los 96 pocillos del ciclador térmico durante la
amplificación por PCR. Preferiblemente, el procedimiento B se
realiza en combinación con el procedimiento A para proporcionar
controles de la cantidad de ácido nucleico aportado y para
normalizar datos de placa en placa.
Aplicación A. El procedimiento A (Figura
3), no proporciona, por sí mismo, discriminación de la secuencia de
CpG metilada tanto a nivel de amplificación como de detección, pero
da soporte y validez a las otras tres aplicaciones proporcionando
reacciones de control de la cantidad de ADN aportado, y para
normalizar datos de placa a placa. Por lo tanto, ni los cebadores ni
la sonda recubren ningún dinucleótido CpG, luego la reacción
representa una amplificación imparcial y la medida de la
amplificación usando PCR cuantitativa en tiempo real basada en
fluorescencia sirve como un control para la cantidad de ADN aportado
(Figura 3, Aplicación A). Preferiblemente, el procedimiento A no
solo carece de los dinucleótidos CpG en los cebadores y la
sonda(s), sino que tampoco contiene ningún CpG dentro del
amplicon para evitar cualquier efecto diferencial del tratamiento
con bisulfito en el procedimiento de amplificación. Preferiblemente,
el amplicon para el procedimiento A es una región de ADN que no es
frecuentemente objeto de alteraciones en el número de copias, tales
como amplificación ó deleción de genes.
Los resultados obtenidos con la versión
cualitativa de la tecnología se describen en los ejemplos a
continuación. Se han analizado con excelentes resultados docenas de
muestras de tumores humanos usando esta tecnología. La alta
productividad usando una máquina TaqMan® permite la realización de
1100 análisis en tres días con una máquina TaqMan®.
Se realizó un experimento inicial para validar
la estrategia de la invención y valorar el estado de metilación de
islas CpG en ADN genómico. Este ejemplo muestra una comparación
entre ADN de esperma humano (conocido por estar altamente no
metilado) y ADN HCT116 (de una línea celular colorrectal humana,
conocida por estar altamente metilada en muchos sitios CpG) con
respecto al estado de metilación de islas CpG específicas
hipermetiladas de cuatro genes diferentes. Se utilizó el análisis
COBRA (análisis de restricción combinado con bisulfito; Xiong y
Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997)
como una medida independiente del estado de metilación.
Aislamiento del ADN y tratamiento con
bisulfito. En resumen, el ADN genómico se aisló de esperma
humano o de células HCT116 con el procedimiento convencional de la
digestión con la proteinasa K y extracción con fenolcloroformo (Wolf
y col., Am. J. Hum. Genet. 51:478-485, 1992).
El ADN se trató después con bisulfito de sodio por desnaturalización
inicial en NaOH 0,2 M, seguido de adición de bisulfito de sodio e
hidroquinona (a una concentración final de 3,1 M y 0,5 M
respectivamente), incubación durante 16 h a 55ºC, desalinización
(sistema de lavado de ADN, Promega), desulfonación con NaOH 0,3 M y
precipitación final con etanol. (Xiong y Laird, supra, siting
Sadri y Hornsby, Nucleic Acids Res. 24:5058.5059, 1996;
véase también Fronmer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:1827-1831, 1992). Después el tratamiento con
bisulfito, el ADN fue objeto de un análisis COBRA como el descrito
previamente (Xiong y Laird, supra) ó del procedimiento de
amplificación de la invención usando PCR cuantitativa en tiempo real
basada en fluorescencia (Heid y col., Genome Res.
6:986-994, 1996; Gibson y col. Genome Res.
6:995-1001, 1996).
Reacciones COBRA y MsNuPE. Los genes ESR1
y APC se analizaron usando COBRA (Análisis combinado de restricción
de Bisulfito). Para el análisis COBRA, se introdujeron en el ADN
genómico diferencias en la secuencia dependientes de metilación por
tratamiento convencional con bisulfito, de acuerdo con el
procedimiento descrito por Frommer y col. (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89:1827-1831, 1992). (se añadió 1
\mug de ADN de esperma de salmón como un vehículo antes de que el
ADN genómico se tratara con bisulfito de sodio). La amplificación
por PCR del ADN transformado por el bisulfito se realizó usando
cebadores específicos para las islas CpG de interés, seguido de
digestión con enzimas de restricción, electroforesis en gel y
detección usando sondas de hibridación etiquetadas. El conjunto de
cebadores directos e inversos usados para los genes ESR1 y APC son:
TCCTAAAACTACACTTACTCC [SEC ID Nº 35], GGTTATTTGGAAAAAGAGTATAG [SEC
ID Nº 36] (promotor ESR1); y AGAGAGAAGTAGTTGTGTTAAT [SEC ID Nº 37],
ACTACACCAATACAACCACAT [SEC ID Nº 38] (promotor APC),
respectivamente. Los productos de PCR de ESR1 se digirieron con
endonucleasas de restricción TaqI y BstUI, mientras que los
productos de APC se digirieron con TaqI y SfaN I, para medir la
metilación de 3 sitios de metilación CpG para APC y 4 sitios CpG
para ESR1. Se hizo una electroforesis con los productos de PCR
digeridos en gel de poliacrilamida desnaturalizante y se
transfirieron a una membrana de nylon (Zetabind; American
Bioanalytical) por electrotransferencia. Las membranas se hibridaron
con un oligonucleótido etiquetado en el extremo 5' para visualizar
los fragmentos de interés digeridos y no digeridos. Las sondas
usadas son de la siguiente manera: ESR1, AAACCAAAACTC [SEC ID Nº.
39]; y APC, CCCACACCCAACCAAT [SEC ID Nº 40]. La cuantificación se
realizó con el Phosphoimager 445SI (Molecular Dynamics). Los
cálculos se realizaron en Microsoft Excel. El nivel de metilación
del ADN en los sitios CpG investigados se determinó calculando el
porcentaje de los fragmentos de PCR digeridos (Xiong y Laird,
supra).
MLH1 y CDKN2A se analizaron usando MsSNuPE
(ensayo de extensión del cebador de nucleótido sencillo sensible a
metilación), realizado como describen Gonzalgo y Jones (Nucleic
Acids Res. 25:2529-2531). La amplificación por
PCR del ADN transformado por el bisulfito se realizó usando
cebadores específicos paras las islas CpG de interés, y la detección
se realizó usando cebadores específicos adicionales (sondas de
extensión). Los cebadores directos e inversos usados para los genes
MLH1 y CDKN2A son: GGAGGTTATAAGAGTAGGGTTAA [SEC ID Nº. 41],
CCAACCAATAAAACAAAATACC [SEC ID Nº 42] (promotor MLH1);
GTAGGTGGGGAGGAGT
TTAGTT [SEC ID Nº. 43], TCTAATAACCAACCAACCCCTCC [SEC ID Nº. 44] (promotor CDKN2A); y TTGTAT
TATTTTGTTTTTTTTGGTAGG [SEC ID Nº. 45], CAACTTCTCAAATCATCAATCCACAC [SEC ID Nº 46] (exón 2 de CDKN2A), respectivamente. Las sondas MsSNuPE de extensión se localizan inmediatamente en la posición 5' del CpG a analizar, y las secuencias son: TTTAGTAGAGGTATATAAGTT [SEC ID Nº. 47], TAAGGGGAGAGGAG
GAGTTTGAGAAG [SEC ID Nº. 48] (sitios promotores 1 y 2 de MLH1, respectivamente); TTTGAGGGATAGGGT [SEC ID Nº 49], TTTTAGGGGTGTTATATT [SEC ID Nº 50], TTTTTTTGGAAAGATAT [SEC ID Nº 51] (sitios promotores 1, 2 y 3, respectivamente) y GTTGGTGGTGTTGTAT [SEC ID Nº 52], AGGTTATGATGATGGGTAG [SEC ID Nº 53], TATTAGAGGTAGTAATTATGTT [SEC ID Nº 54] (sitios 1, 2 y 3 del exón 2, respectivamente. Se establecieron un par de reacciones para cada muestra usando 32p-dCTP ó 32p-dTTP para la extensión del nucleótido simple. Los cebadores MsSNuPE extendidos (sondas) se separaron por gel de poliacrilamida desnaturalizante. La cuantificación se realizó usando el Phosphoimager.
TTAGTT [SEC ID Nº. 43], TCTAATAACCAACCAACCCCTCC [SEC ID Nº. 44] (promotor CDKN2A); y TTGTAT
TATTTTGTTTTTTTTGGTAGG [SEC ID Nº. 45], CAACTTCTCAAATCATCAATCCACAC [SEC ID Nº 46] (exón 2 de CDKN2A), respectivamente. Las sondas MsSNuPE de extensión se localizan inmediatamente en la posición 5' del CpG a analizar, y las secuencias son: TTTAGTAGAGGTATATAAGTT [SEC ID Nº. 47], TAAGGGGAGAGGAG
GAGTTTGAGAAG [SEC ID Nº. 48] (sitios promotores 1 y 2 de MLH1, respectivamente); TTTGAGGGATAGGGT [SEC ID Nº 49], TTTTAGGGGTGTTATATT [SEC ID Nº 50], TTTTTTTGGAAAGATAT [SEC ID Nº 51] (sitios promotores 1, 2 y 3, respectivamente) y GTTGGTGGTGTTGTAT [SEC ID Nº 52], AGGTTATGATGATGGGTAG [SEC ID Nº 53], TATTAGAGGTAGTAATTATGTT [SEC ID Nº 54] (sitios 1, 2 y 3 del exón 2, respectivamente. Se establecieron un par de reacciones para cada muestra usando 32p-dCTP ó 32p-dTTP para la extensión del nucleótido simple. Los cebadores MsSNuPE extendidos (sondas) se separaron por gel de poliacrilamida desnaturalizante. La cuantificación se realizó usando el Phosphoimager.
Análisis de metilación de la invención.
El ADN genómico transformado por el bisulfito se amplificó usando
cebadores de PCR específicos de locus que flanquean una sonda de
oligonucleótidos con un colorante fluorescente informador en 5'
(6FAM) y un colorante interruptor en 3' (TAMRA) (Livak y col.,
PCR methods Appl. 4:357-362, 1995) (las
sondas y cebadores usados para los análisis de metilación se
enumeran, en "Genes, MethyLight primers and probe sequences",
en este documento, infra). En este ejemplo, los cebadores
directo e inverso y las sondas fluorescentes correspondientes se
diseñaron para discriminar entre moléculas de ADN transformado por
bisulfito completamente metiladas y completamente no metiladas.
(véase la discusión del diseño del cebador en "Descripción
detallada de la invención, Procedimiento D", en este documento).
Los cebadores y una sonda se diseñaron también para un estiramiento
del gen MYOD1 (gen de diferenciación miogénica), completamente
desprovisto de dinucleótidos CpG como una reacción control para la
cantidad de ADN aportado. Las reacciones paralelas se realizaron
usando los procedimientos con las muestras metiladas y no metiladas
(D), ó oligos de control (A) de ADN de esperma y HCT116 tratado con
bisulfito. Los valores obtenidos para las reacciones metiladas y no
metiladas se normalizaron con los valores de las reacciones de
control de MYOD1 para dar proporciones que se muestran en la Tabla 1
(a continuación).
En un protocolo TaqMan®, la actividad 5' a 3'
nucleasa de la ADN taq polimerasa corta la sonda y libera al
informador, cuya fluorescencia se detecta con el detector láser del
sistema de detección de secuencia ABI Prism 7700
(Perkin-Elmer, Foster City, CA). Después de cruzar
un umbral de detección de fluorescencia, la amplificación por PCR da
como resultado una señal proporcional a la cantidad de producto de
PCR generado. La cantidad inicial de molde puede obtenerse del
número de ciclo al cual la señal fluorescente cruza el umbral en la
fase exponencial de la reacción de PCR. Se incluyeron varias
muestras de referencia en cada placa de ensayo para verificar la
consistencia de placa a placa. Las placas se normalizaron una con
otra utilizando muestras de referencia. La amplificación por PCR se
realizó usando placas y tapas ópticas de 96 pocillos con una mezcla
final de reacción de 25 \mul constituida por 600 nM de cada
cebador, 200 nM de la sonda, 200 \muM cada uno de dATP, dGTP,
dCTP, 400 \muM de dUTP, 5,5 mM de MgCl_{2}, 1X de Tampón A
TaqMan® que contiene un colorante de referencia, y ADN transformado
por bisulfito y ADN no transformado por bisulfito en las siguientes
condiciones: 50ºC durante 2 min, 95ºC durante 10 min, seguido de 40
ciclos de 95ºC durante 15 s y 60ºC durante 1 min.
Genes, cebadores MethyLight y secuencias de
sondas. Se eligieron 4 genes humanos para el análisis: (1) APC
(coli poliposis adenomatosa) (Hiltunen y col., Int. J. Cancer
70:644-648, 1997), (2) ESR1 (receptor de estrógeno)
(Issa y col., Nature Genet. 7:536-40, 1994);
(3) CDKN2A (p16) (Ahuja, Cancer Res.
57:3370-3374, 1997); y (4) hMLH1 (reparador de
desemparejamientos) (Herman y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA
95:6870-6875, 1998; Veigt y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 95:8698-8702, 1998). Se
eligieron estos genes porque contienen islas CpG hipermetilizables
que son conocidas por sufrir metilación de novo en el tejido
colorrectal humano en todas las muestras normales y tumorales. El
gen humano APC, por ejemplo, se ha vinculado con el desarrollo del
cáncer colorrectal, y los sitios CpG en las secuencias reguladoras
del gen se conocen por ser distintivamente más metiladas en
carcinomas de colon, pero no en carcinomas premalignos; en relación
con la mucosa normal del colon (Hiltunen y col., supra). El
gen humano ESR contiene una isla CpG en su extremo 5', que se
convierte en cada vez más metilada con la edad en la mucosa
colorrectal y está fuertemente metilada en todos los tumores
colorrectales humanos analizados (Issa y col, supra). El gen
reparador de desemparejamientos MLH1 juega un papel fundamental en
el desarrollo de casos esporádicos de tumores colorrectales
deficientes en la reparación de desemparejamientos (Thibodeau y
col., Science 260:816-819, 1993). Se ha
informado de que MLH1 puede silenciarse transcripcionalmente por
hipermetilación del ADN de su región promotora, llevando a
inestabilidad del microsatélite (MSI) (Kane y col., Cancer
Res. 57:808-811, 1997; Ahuja y col.,
supra; Cunningham y col., Cancer Res.
58:3455-3460, 1998; Herman y col., supra;
Veigl y col.,
supra).
supra).
Se usaron 5 conjuntos de cebadores de PCR y
sondas, diseñadas específicamente para secuencias de ADN
transformado por bisulfito: (1) un conjunto representa el ADN
completamente metilado y completamente no metilado para el gen ESR1;
(2) un conjunto completamente metilado para el gen MLH1; (3) un
conjunto completamente metilado y completamente no metilado para el
gen APC; (4) un conjunto completamente metilado y completamente no
metilado para el gen CDKN2A (p16); y (5) una referencia interna para
el gen MYOD1 como control para el ADN aportado. Los cebadores
metilados y no metilados y las correspondientes sondas se diseñaron
para solapar 1 a 5 sitios potenciales de dinucleótidos CpG. La
referencia interna de cebadores y sondas de MYOD1 se diseñaron para
cubrir una región del gen MYOD1 completamente carente de cualquier
dinucleótido CpG para permitir una amplificación imparcial por PCR
del ADN genómico, sin reparar en el estado de metilación. Como se
indica anteriormente, las reacciones de PCR TaqMan® paralelas se
realizaron con cebadores específicos para las secuencias de genes
transformadas por bisulfito metiladas y/o no metiladas y con los
cebadores de referencia de MYOD1. Las secuencias del cebador y de la
secuencia se enumeran a continuación. En todos los casos, el primer
cebador de la lista es el cebador de PCR directo, el segundo es la
sonda TaqMan®, y el tercero es el cebador de PCR inverso. ESR1
metilado. (GGCGTTCGTTTTGGGATTG [sec id nº. 1], 6FAM
5'-CGATAAAACCGAACGACCCGAC
GA-3' TAMRA [sec id nº 2], GCCGACACGCGAACTCTAA [sec id nº. 3]); ESR1 no metilado (ACACATATCC
CACCAACACACAA [SEC ID Nº. 4], 6FAM 5'-CAACCCTACCCCAAAAACCTACAAATCCAA-3'TAMRA [SEC ID Nº 5], AGGAGTTGGTGGAGGGTGTTT [SEC ID Nº.6]); MLH1 metilado (CTATCGCCGCCTCATCGA [SEC ID Nº. 7], 6FAM 5'-CGCGACGTCAAACGCCACTACG-3' TAMRA [SEC ID Nº. 8], CGTTATATATCGTTCG
TAGTATTCGTGTTT [SEC ID Nº 9]); APC metilado (TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT [SEC ID Nº 10], 6FAM 5'-CCCGTCGAAAACCCGCCGATTA-3' TAMRA [SEC ID Nº 11], GAACCAAAACGCTCCCAT [SEC ID Nº 12]), APC no metilado (GGGTTGTGAGGGTATATTTTTGAGG [SEC ID Nº 13], 6FAM 5'-CCCACCCAAC
CACACAACCTACCTAACC-3' TAMRA [SEC ID Nº 14], CCAACCCACACTCCACAATAAA [SEC ID Nº 15]); CDKN2A metilado (AACAACGTCCGCACCTCCT [SEC ID Nº 16], 6FAM 5'-ACCCGACCCCGAACCGCG-3' TAMRA [SEC ID Nº 17], TGGAATTTTCGGTTGATTGGTT [SEC ID Nº 18]); CDKN2A no metilado (CAACCAAT
CAACCAAAAATTCCAT [SEC ID Nº 19], 6FAM 5'-CCACCACCCACTATCTACTCTCCCCCTC-3' TAMRA [SEC ID Nº. 20], GGTGGATTGTGTGTGTTTGGTG [SEC ID Nº. 21]); y MYOD1, (CCAACTCCAAATCCCCTCTCTAT [SEC ID Nº. 22], 6FAM 5'-TCCCTTCCTATTCCTAAATCCAACCTAAATACCTCC-3' TAMRA [SEC ID Nº. 23], TGATTAATTTAGATTGGGTTTAGAGAAGGA [SEC ID Nº. 24]).
GA-3' TAMRA [sec id nº 2], GCCGACACGCGAACTCTAA [sec id nº. 3]); ESR1 no metilado (ACACATATCC
CACCAACACACAA [SEC ID Nº. 4], 6FAM 5'-CAACCCTACCCCAAAAACCTACAAATCCAA-3'TAMRA [SEC ID Nº 5], AGGAGTTGGTGGAGGGTGTTT [SEC ID Nº.6]); MLH1 metilado (CTATCGCCGCCTCATCGA [SEC ID Nº. 7], 6FAM 5'-CGCGACGTCAAACGCCACTACG-3' TAMRA [SEC ID Nº. 8], CGTTATATATCGTTCG
TAGTATTCGTGTTT [SEC ID Nº 9]); APC metilado (TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT [SEC ID Nº 10], 6FAM 5'-CCCGTCGAAAACCCGCCGATTA-3' TAMRA [SEC ID Nº 11], GAACCAAAACGCTCCCAT [SEC ID Nº 12]), APC no metilado (GGGTTGTGAGGGTATATTTTTGAGG [SEC ID Nº 13], 6FAM 5'-CCCACCCAAC
CACACAACCTACCTAACC-3' TAMRA [SEC ID Nº 14], CCAACCCACACTCCACAATAAA [SEC ID Nº 15]); CDKN2A metilado (AACAACGTCCGCACCTCCT [SEC ID Nº 16], 6FAM 5'-ACCCGACCCCGAACCGCG-3' TAMRA [SEC ID Nº 17], TGGAATTTTCGGTTGATTGGTT [SEC ID Nº 18]); CDKN2A no metilado (CAACCAAT
CAACCAAAAATTCCAT [SEC ID Nº 19], 6FAM 5'-CCACCACCCACTATCTACTCTCCCCCTC-3' TAMRA [SEC ID Nº. 20], GGTGGATTGTGTGTGTTTGGTG [SEC ID Nº. 21]); y MYOD1, (CCAACTCCAAATCCCCTCTCTAT [SEC ID Nº. 22], 6FAM 5'-TCCCTTCCTATTCCTAAATCCAACCTAAATACCTCC-3' TAMRA [SEC ID Nº. 23], TGATTAATTTAGATTGGGTTTAGAGAAGGA [SEC ID Nº. 24]).
Las Tablas 1 y 2 muestran los resultados del
análisis del ADN de esperma humano y HCT116 para el estado de
metilación de las islas CpG dentro de 4 genes; APC, ESR1, CDKN2A
(p16), y Hmlh1. Los resultados se expresan como proporciones entre
las reacciones metiladas y no metiladas y una reacción de control
(MYOD1). La tabla 1 muestra que el ADN de esperma produce una
proporción positiva sólo con los cebadores y sondas "no
metilados", consecuente con el conocido estado no metilado del
ADN de esperma, y consecuente con el porcentaje de valores de
metilación determinados por el análisis COBRA. Esto es, la
iniciación en el ADN tratado con bisulfito se produce desde regiones
que contienen citosinas no metiladas en las secuencias CpG en el
correspondiente ADN genómico, y por lo tanto se desaminan (se
transforman en uracilo) por el tratamiento con bisulfito.
\vskip1.000000\baselineskip
| Técnica | COBRA o Ms-SNuPE | Reacción metilada* | Reacción no metilada |
| GEN | |||
| APC | 0% | 0 | 49 |
| ESR1 | 0% | 0 | 62 |
| CDKN2A | \; \; 0%** | 0 | 52 |
| hMLH1 | ND | 0 | ND |
| * \begin{minipage}[t]{158mm}Los valores no representan porcentajes, pero los valores en una cantidad arbitraria pueden compararse cuantitativamente para la misma reacción entre diferentes muestras de ADN, después de la normalización con un gen de control.\end{minipage} | |||
| ** Basado en MsSNuPE. |
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla 2 muestra los resultados de un análisis
de ADN Hct116 para el estado de metilación de islas CpG dentro de
cuatro genes; APC, ESR1, CDKN2A (p16) y hMLH1. Los resultados se
expresan como proporciones entre reacciones específicas de
metilación y una reacción de control (MYOD1). Para el gen ESR, se
obtuvo una proporción positiva sólo con los cebadores y sonda
"metilada"; consecuente con el conocido estado de metilación
del ADN HCT116; y el análisis COBRA. Para el gen CDKN2A, el ADN
HCT116 produjo proporciones positivas con ambos cebadores y sonda
"metilados" y "no metilados"; consecuente con el conocido
estado de metilación del ADN HCT116, y con el análisis COBRA que
indica sólo una metilación parcial de esta región del gen. En
contraste, el gen APC dio resultados positivos sólo son la reacción
no metilada. Sin embargo, esto es enteramente consecuente con el
análisis COBRA, e indica que esta región del gen APC no está
metilada en el ADN HCT116. Esto puede indicar que el estado de
metilación de esta región reguladora particular del gen APC en el
ADN de la línea celular HCT116 es más parecido a aquellas de la
mucosa normal del colon ó adenomas premalignos en lugar de aquellas
de carcinomas de colon (conocidas por estar distintivamente más
metiladas).
| Técnica | COBRA y/o Ms-SNuPE | Reacción metilada* | Reacción no metilada |
| GEN | |||
| APC | 2% | 0 | 81 |
| ESR1 | 99% | 36 | 0 |
| CDKN2A | \; \; 38%** | 222 | 26 |
| hMLH1 | ND | 0 | ND |
| * \begin{minipage}[t]{158mm}Los valores no representan porcentajes, pero los valores en una unidad arbitraria pueden compararse cuantitativamente para la misma reacción entre diferentes muestras de ADN, después de la normalización con un gen de control.\end{minipage} | |||
| ** Basado en MsSNuPE. |
Este ejemplo es una comparación entre el
procedimiento de la invención (A y D en la Figura 3) con una
procedimiento COBRA independiente (véase "Procedimientos",
anteriormente) para determinar el estado de metilación de una isla
CpG asociada con el gen del receptor de estrógeno (ESR1) en la línea
celular colorrectal humana HCT116 y en ADN de esperma humano. Se ha
informado que esta isla CpG está altamente metilada en HCT116 y no
metilada en el ADN de esperma humano (Xiong y Laird, supra;
Issa y col., supra). El análisis COBRA se describió
anteriormente. Dos sitios TaqI dentro de esta isla CpG confirman
esto, mostrando una carencia de metilación en el ADN de esperma y
casi metilación completa en el ADN HCT116 (Figura 5A).
Adicionalmente, se compararon los resultados usando ADN tratado y no
tratado con bisulfito.
Para un análisis, se diseñaron cebadores y
sondas de ESR1 completamente "metilados" y completamente "no
metilados" y de control de MYOD1 como se describe anteriormente
en el "Ejemplo 1". Se realizaron 3 reacciones diferentes usando
los oligos "metilados", "no metilados" ó de control en
ambos ADN de esperma y HCT116. Como en el ejemplo 1, anteriormente,
los valores obtenidos para la reacción metilada y no metilada se
normalizaron a los valores par la reacción control de MYOD1 para dar
las proporciones que se muestran en la Figura 5B. El ADN de esperma
produjo una proporción positiva sólo con los cebadores y sonda no
metilados, consecuente con su estado no metilado. En contraste, el
ADN HCT116, con alelos metilados ESR1 predominantemente, generó una
proporción positiva sólo en la reacción metilada (Figura 5B). Ambos
ADN de esperma y HCT116 produjeron resultados positivos en las
reacciones con MYOD1, indicando que había suficiente aporte de ADN
para cada muestra. Como se esperaba, el ADN no transformado con
bisulfito no se amplifico con los oligonucleótidos metilados ni con
los no metilados (Figura 5B). Estos resultados son consecuentes con
los resultados de COBRA (Figura 5A), sugiriendo que el ensayo de la
invención puede discriminar entre alelos metilados y no metilados
del gen ESR1. Además, las reacciones son específicas de ADN
transformado con bisulfito, lo que impide la generación de falsos
positivos debido a una transformación con bisulfito incompleta.
Este ejemplo determina la especificidad de los
cebadores y sondas de la invención. La Figura 6 muestra un ensayo de
todas las posibles combinaciones de cebadores y sondas para más
tarde examinar la especificidad de los oligonucleótidos metilados y
no metilados en ADN de estado de metilación conocido. Se analizaron
ocho combinaciones diferentes de cebadores directos e inversos y
sondas "metilados" y "no metilados" de ESR1 (como se
describe anteriormente en el "Ejemplo 1") en diferentes
combinaciones en ensayos con ADN de esperma y HCT116, por duplicado.
Los ensayos se realizaron como se describe anteriormente en el
Ejemplo 1. El panel A (Figura 6) muestra la nomenclatura usada para
las combinaciones de los oligos de ESR1. "U" se refiere a la
secuencia del oligo que templa con ADN no metilado transformado con
bisulfito, mientras que "M" se refiere a la versión metilada.
La posición 1 indica el cebador directo de PCR, la posición 2 la
sonda, y la posición 3 el cebador inverso. Las combinaciones usadas
para las ocho reacciones se muestran a continuación cada una con un
par de barras, representando experimentos duplicados. Los resultados
se expresan como proporciones entre los valores de ESR1 y los
valores control de MYOD1. El panel B representa un análisis de ADN
de esperma humano. El Panel C representa un análisis del ADN
obtenido de la línea celular del cáncer colorrectal humano
HCT116.
Sólo las combinaciones completamente no metilada
(reacción 1) ó completamente metilada (reacción 8) dieron como
resultado una reacción positiva para el esperma y HCT116,
respectivamente. Las otras combinaciones fueron negativas, indicando
que las condiciones de PCR no permiten el templado débil de los
oligonucleótidos desemparejados. Esta selectividad indica que el
procedimiento de la invención puede discriminar entre alelos
completamente metilados ó completamente no metilados con un alto
grado de especificidad.
Este ejemplo muestra que el procedimiento de la
invención es reproducible. La Figura 7 ilustra un análisis del
estado de metilación del locus de ESR1 en muestras de ADN obtenidas
de un adenocarcinoma colorrectal y mucosa normal emparejada
obtenidas de algunos pacientes (muestras 10N y 10T en la Figura 8)
para estudiar una población heterogénea de alelos metilados y no
metilados. Las muestras de tejido colorrectal se recogieron como se
describe en el Ejemplo 5, a continuación. Además, la
reproducibilidad del procedimiento de la invención se analizó
realizando ocho reacciones independientes para cada ensayo. Los
resultados para las reacciones de ESR1 y la reacción control de
MYOD1 representan valores absolutos sin procesar para estas
reacciones, en lugar de proporciones, así que los errores estándar
de las reacciones individuales se pueden evaluar. Los valores se han
normalizado con placas, pero no se han corregido para el ADN
aportado. Las barras indican los valores medios obtenidos para las
ocho reacciones separadas. Las barras de error representan el error
estándar de la muestra.
La Figura 7 muestra que el valor medio para la
reacción metilada es más alto en el tumor comparado con el tejido
normal mientras que la reacción no metilada muestra el resultado
opuesto. Los errores estándar observados para las ocho medidas
independientes son relativamente modesto y comparables a aquellos
aportados por otros estudios que utilizan la tecnología TaqMan®
(Fink y col., Nature Med. 4:1329-1333, 1998).
Algo de la variabilidad del procedimiento de la invención puede ser
resultado de una amplificación de PCR estocástica (PCR parcial), que
puede ocurrir a bajas concentraciones de molde. (Warnecke y col.,
Nucleic Acids Res. 25:4422-4426, 1997). En
resumen, estos resultados indican que el procedimiento de la
invención puede producir resultados reproducibles para muestras de
ADN complejo y heterogéneo.
Este ejemplo muestra una comparación de la
expresión de MLH1, la inestabilidad del microsatélite y la
metilación del promotor MLH1 en 25 muestras colorrectales humanas
emparejadas. El mayor beneficio del procedimiento de la invención es
la capacidad de una rápida exploración del estado de metilación de
tumores humanos de un locus particular. Además, el análisis de la
metilación del ADN como un marcador sustitutivo para la expresión
génica es una nueva manera de obtener información clínicamente útil
sobre tumores. Se analizó la utilidad del procedimiento de la
invención interrogando sobre el estado de metilación del promotor de
MLH1. El gen reparador de desapareamientos MLH1 juega un papel
fundamental en el desarrollo esporádico de tumores colorrectales
deficientes en la reparación del desapareamiento (Thibodeau y col.,
Science 260:816-819, 1993). Se ha informado
que MLH1 puede silenciarse transcripcionalmente por hipermetilación
del ADN de su región promotor, llevando a inestabilidad del
microsatélite (MSI) (Kane y col., Cancer Res
57:808-811, 1997; Ahuja y col., Cancer Res
57:3370-3374, 1997; Cunningham y col., Cancer
Res. 58:3455-3460, 1998; Herman, J.g. y col.,
Proc. Natl. Sci. USA 95:6870-6875, 1998;
Veigl y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95-8698-8702, 1998).
Usando el procedimiento de la invención de alto
rendimiento, se analizó el estado de metilación de la isla CpG de
MLH1 con 50 muestras constituidas por 25 parejas apareadas de
adenocarcinoma colorrectal humano y mucosa normal. Se investigaron
los niveles de expresión de MLH1 normalizado a ACTB
(\beta-actina) con análisis de
RT-PCR cuantitativa (TaqMan®). Además, se analizó el
estado de inestabilidad del microsatélite (MSI) de cada muestra por
PCR de los loci BAT25 y BAT26 (Parsons y col., Cancer Res.
55:5548-5550, 1995). Las veinticinco muestras
apareadas de tumores y de tejidos de mucosa normal se obtuvieron de
25 pacientes con adenocarcinoma colorrectal primario. Los pacientes
comprendían 16 hombres y 9 mujeres, con un intervalo de edad de 39 a
88 años, con una media de edad de 68,8. La distancia de la mucosa de
especímenes con tumor a los normales fue de 10 a 20 cm. Se retiró
quirúrgicamente 2 gramos aproximadamente de tejido y se congeló
inmediatamente en nitrógeno líquido, almacenándose a -80ºC hasta el
aislamiento del ADN y ARN.
Análisis de RT-PCR
cuantitativa y de inestabilidad del microsatélite. La
cuantificación de los niveles de ARNm se realizó usando detección de
fluorescencia en tiempo real. Las reacciones TaqMan® se realizaron
como se describe anteriormente para el ensayo pero con la adición de
1U de AmpErasa uracil N-glicoxilasa. Después del
aislamiento del ARN se preparó el ADNc de cada muestra como se
describió previamente (Bender y col., Cancer Res
58:95-101, 1998). En resumen, el ARN se aisló
lisando el tejido en un tampón que contiene isocianato de guanidina
(4 M), N-lauril sarcosina (0,5%), citrato de sodio
(25 mM), y 2-mercaptoetanol (0,1 M), seguido de
extracción convencional con fenol-cloroformo, y
precipitación en isopropanol al 50%/tampón de lisis al 50%. Para
preparar el ADNc, las muestras de ARN fueron transcritas
inversamente usando hexámeros aleatorios, desoxinucleótidos
trifosfato y transcriptasa inversa Superscript® (Life technologies,
Inc., Palo Alto, CA). El ADNc resultante se amplificó después con
cebadores específicos para MLH1 y ACTB. Se excluyó la contaminación
de las muestras de ARN por ADN genómico por el análisis de todas las
muestras de ARN sin conversión previa del ADNc. La expresión
relativa del gen se determinó basándose en los ciclos umbral (número
de ciclos de PCR requeridos para la detección de una sonda
específica) del gen MLH1 y del gen de referencia interna ACTB. Las
secuencias del cebador directo, sonda y cebador inverso de los genes
ACTB y MLH1 son: ACTB (TGAGCGAGGCTACAGCTT [SEC ID Nº. 25],
6FAM5'-ACCACCACGGCC
GAGCGG-3'TAMRA [SEC ID Nº. 26], CCTTAATGTCACACACGATT [SEC ID Nº. 27]); y MLH1 (GTTCTCCGG
GAGATGTTGCATA [SEC ID Nº. 28], 6FAM5'-CCTCAGTGGGCCTTGGCACAGC-3'TAMRA [SEC ID Nº. 29], TGGTGGTGTTGAGAAGGTATAACTTG [SEC ID Nº. 30]).
GAGCGG-3'TAMRA [SEC ID Nº. 26], CCTTAATGTCACACACGATT [SEC ID Nº. 27]); y MLH1 (GTTCTCCGG
GAGATGTTGCATA [SEC ID Nº. 28], 6FAM5'-CCTCAGTGGGCCTTGGCACAGC-3'TAMRA [SEC ID Nº. 29], TGGTGGTGTTGAGAAGGTATAACTTG [SEC ID Nº. 30]).
La alteración de numerosas secuencias de
poliadenina ("pA"), distribuidas ampliamente a lo largo del
genoma, es una característica útil para definir tumores con
inestabilidad del microsatélite (Ionov y col., Nature
363:558-561, 1993). La inestabilidad del
microsatélite (MSI) se determinó por PCR y análisis de los loci
BAT25 (25 pares de bases pA de extensión desde un intrón del oncogén
c-kit) y BAT26 (26 pares de bases pA de extensión
desde un intrón del gen reparador de desapareamientos hMSH2) como se
describió previamente (Parsons y col., Cancer Res
55:5548-5550, 1995). En resumen, los segmentos de
los loci BAT25 y BAT26 se amplificaron con 30 ciclos usando un
cebador etiquetado con ^{32}P y un cebador no etiquetado para cada
locus. Las reacciones se resolvieron en geles de
urea-formamida y se expusieron en una película. Los
cebadores directos e inversos que fueron usados para la
amplificación de BAT25 y BAT26 fueron: BAT25 (TCGCCCTCCAAGAATGTAAGT
[SEC. ID Nº. 31], TCTGCATTTTAACTATGGCTC [SEC ID Nº. 32]); y BAT26
(TGACTACTTTTGACTTCAGCC [SEC ID Nº. 33], AACCATTCAACATTTTTAACCC [SEC.
ID Nº. 34]).
La Figura 8 muestra la correlación entre la
expresión del gen MLH1, el estado de MSI y la metilación del
promotor de MLH1, como se determina por el procedimiento de la
invención. El organigrama superior muestra los niveles de expresión
de MLH1 medidos por RT-PCR cuantitativa en tiempo
real (TaqMan®) en muestras apareadas normales (barras sombreadas) y
muestras de tumores colorrectales (barras negras). Los niveles de
expresión se disponen como una proporción entre las medidas de MLH1
y ACTB. El estado de inestabilidad del microsatélite (MSI) se indica
por los círculos situados entre los dos organigramas. Un círculo
negro denota positividad MSI, mientras que un círculo blanco indica
que la muestra en MSI negativa, como se determina por análisis de
los loci BAT26 y BAT25. El organigrama inferior muestra el estado de
metilación del locus de MLH1 como se determina por el procedimiento
de la invención. Los niveles de metilación se representan como la
proporción entre la reacción metilada de MLH1 y la reacción de
MYOD1.
Cuatro tumores colorrectales tuvieron niveles de
metilación significativos elevados comparados con el tejido normal
correspondiente. Uno de estos tumores (tumor 17) exhibió un grado
particularmente alto de metilación de MLH1, como se valora por el
procedimiento de la invención. El tumor 17 fue la única muestra que
fue MSI positiva (círculo negro) y mostró un silenciamiento
transcripcional de MLH1. Los restantes tumores metilados expresaron
MLH1 a niveles modestos y fueron MSI negativos (círculo blanco).
Estos resultados muestran que MLH1 estaba metilado en los dos alelos
en el tumor 17, dando como resultado un silencio epigenético y la
consecuente inestabilidad del microsatélite, mientras que los otros
tumores mostraron menor grado de hipermetilación del promotor de
MLH1 y podrían tener un solo alelo metilado, permitiendo la
expresión del alelo inalterado. Por consiguiente, el procedimiento
de la invención fue capaz de generar rápidamente información
biológica significativa, tal como hipermetilación de islas CpG en
tumores humanos, que están asociados con el silenciamiento
transcripcional de genes relevantes en el proceso del cáncer.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- INVENTORES: Peter W. Laird, Cindy A. Eads y Kathleen D. Danenberg
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO PARA ANÁLISIS DE METILACIÓN DEL ADN DE ALTO RENDIMIENTO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 54
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Davis Wright Tremaine LLP
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1501 Fourth Avenue
\hskip4.2cm2600 Century Square
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 98101-1688
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5 pulgadas con 1,44 MB de almacenamiento
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Windows 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Word 97
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD PRESENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: N/A
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: N/A
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: N/A
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Jeffrey B. Oster
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32585
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 47675-9WO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (206) 628-771
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (206) 628-7699
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGTTCGTT TTGGGATTG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- ((a)
- NOMBRE/LLAVE: sustitución 5' con un colorante fluorescente informador 6FAM (2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína-forforoamidita-citosina); sustitución 3' con un resto interruptor colorante TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGATAAAACC GAACGACCCG ACGA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGACACGC GAACTCTAA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACACATATCC CACCAACACA CAA
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- ((a)
- NOMBRE/LLAVE: sustitución 5' con un colorante fluorescente informador 6FAM (2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína-forforoamidita-citosina); sustitución 3' con un resto interruptor colorante TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAACCCTACC CCAAAAACCT ACAAATCCAA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGAGTTGGT GGAGGGTGTT T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTATCGCCGC CTCATCGT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- ((a)
- NOMBRE/LLAVE: sustitución 5' con un colorante fluorescente informador 6FAM (2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína-forforoamidita-citosina); sustitución 3' con un resto interruptor colorante TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGACGTCA AACGCCACTA CG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTTATATAT CGTTCGTAGT ATTCGTGTTT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATGTCG GTTACGTGCG TTTATAT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- ((a)
- NOMBRE/LLAVE: sustitución 5' con un colorante fluorescente informador 6FAM (2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína-forforoamidita-citosina); sustitución 3' con un resto interruptor colorante TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGTCGAAA ACCCGCCGAT TA
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAACCAAAAC GCTCCCCAT
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTTGTGAG GGTATATTTT TGAGG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- ((a)
- NOMBRE/LLAVE: sustitución 5' con un colorante fluorescente informador 6FAM (2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína-forforoamidita-citosina); sustitución 3' con un resto interruptor colorante TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCACCCAAC CACACAACCT ACCTAACC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAACCCACA CTCCACAATA AA
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACAACGTCC GCACCTCCT
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- ((a)
- NOMBRE/LLAVE: sustitución 5' con un colorante fluorescente informador 6FAM (2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína-forforoamidita-citosina); sustitución 3' con un resto interruptor colorante TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCCGACCCC GAACCGCG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGAATTTTC GGTTGATTGG TT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAACCAATCA ACCAAAAATT CCAT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- ((a)
- NOMBRE/LLAVE: sustitución 5' con un colorante fluorescente informador 6FAM (2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína-forforoamidita-citosina); sustitución 3' con un resto interruptor colorante TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCACCACCCA CTATCTACTC TCCCCCTC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTGGATTGT GTGTGTTTGG TG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAACTCCAA ATCCCCTCTC TAT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- ((a)
- NOMBRE/LLAVE: sustitución 5' con un colorante fluorescente informador 6FAM (2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína-forforoamidita-citosina); sustitución 3' con un resto interruptor colorante TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCCTTCCTA TTCCTAAATC CAACCTAAAT ACCTCC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGATTAATTT AGATTGGGTT TGAGAAGGA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAGCGCGGC TACAGCTT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- ((a)
- NOMBRE/LLAVE: sustitución 5' con un colorante fluorescente informador 6FAM (2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína-forforoamidita-citosina); sustitución 3' con un resto interruptor colorante TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCACCACGG CCGAGCGG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTTAATGTC ACACACGATT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTCTCCGGG AGATGTTGCA TA
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- ((a)
- NOMBRE/LLAVE: sustitución 5' con un colorante fluorescente informador 6FAM (2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína-forforoamidita-citosina); sustitución 3' con un resto interruptor colorante TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCAGTGGG CCTTGGCACA GC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGTGGTGTT GAGAAGGTAT AACTTG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Parsons, y col.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: Inestabilidad del microsatélite y mutaciones del factor de crecimiento transformante B tipo II del receptor del gen en cáncer colorrectal.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Cancer Res.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 55
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 5548-5550
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 01-DIC-1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGCCTCCAA GAATGTAAGT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Parsons, y col.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: Inestabilidad del microsatélite y mutaciones del factor de crecimiento transformante B tipo II del receptor del gen en cáncer colorrectal.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Cancer Res.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 55
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 5548-5550
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 01-DIC-1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTGCATTTT AACTATGGT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Parsons, y col.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: Inestabilidad del microsatélite y mutaciones del factor de crecimiento transformante B tipo II del receptor del gen en cáncer colorrectal.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Cancer Res.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 55
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 5548-5550
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 01-DIC-1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGACTACTTT TGACTTCAGC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Parsons, y col.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TÍTULO: Inestabilidad del microsatélite y mutaciones del factor de crecimiento transformante B tipo II del receptor del gen en cáncer colorrectal.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Cancer Res.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 55
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 5548-5550
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 01-DIC-1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACCATTCAA CATTTTTAAC CC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCTAAAACT ACACTTACTA C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTTATTTGG AAAAAGAGTA TAG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAGAGAAGT AGTTGTGTTA AT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTACACCAA TACAACCACA T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAACCAAAAC TC
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCACACCCA ACCAAT
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGGTTATA AGAGTAGGGT TAA
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAACCAATA AAAACAAAAA TACC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAGGTGGGG AGGAGTTTAG TT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTAATAACC AACCAACCCC TCC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGTATTATT TTGTTTTTTT TGGTAGG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAACTTCTCA AATCATCAAT CCTCAC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTAGTAGAG GTATATAAGT T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAAGGGGAGA GGAGGAGTTT GAGAAG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTGAGGGAT AGGGT
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTAGGGGT GTTATATT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTTTTGTT TGGAAAGATA T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTGGTGGTG TTGTAT
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGTTATGAT GATGGGTAG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATTAGAGGT AGTAATTATG TT
\hfill22
Claims (21)
1. Un procedimiento para detectar la metilación
de la citosina y/ó islas CpG metiladas dentro de una muestra de ADN
genómico que comprende:
(a) poner en contacto una muestra de ADN
genómico con un agente modificante que modifica citosinas no
metiladas para producir un ácido nucleico transformado; y
(b) realizar una etapa de amplificación y
detección que comprende
- -
- amplificar el ácido nucleico transformado por medio de cebadores de oligonucleótidos en presencia de una ó una pluralidad de sondas de oligonucleótidos, en la que dicha sonda o pluralidad de cebadores de oligonucleótidos o las sonda(s) específicas son capaces de distinguir entre ácido nucleico metilado y no metilado, con la condición de que al menos una sonda de oligonucleótido es una sonda específica de CpG, capaz de distinguir entre ácido nucleico metilado y no metilado; y
- -
- detectar el ácido nucleico metilado basándose en un desplazamiento de la sonda mediado por amplificación y PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la sonda específica de CpG comprende un conjunto de restos de
etiquetas fluorescentes.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en
el que la sonda es una sonda FRET, o una sonda doblemente etiquetada
que comprende un resto informador de fluorescencia y un resto
interruptor de fluorescencia.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que se realiza una reacción de PCR parcial ó imparcial.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que se detecta la metilación de la citosina de una isla CpG
dentro de una muestra de ADN genómico.
6. Un procedimiento para la detección de ácido
nucleico que contiene CpG metilada que comprende:
(a) poner en contacto una muestra que contiene
ácido nucleico con un agente modificante que modifica la citosina no
metilada para producir un ácido nucleico transformado;
(b) realizar una etapa de amplificación y
detección que comprende
- -
- amplificar el ácido nucleico transformado en la muestra por medio de cebadores de oligonucleótidos en presencia de una sonda de oligonucleótidos específicos de CpG, en la que la sonda específica CpG, pero no los cebadores, distinguen entre ácido nucleico modificado metilado y no metilado; y
- -
- detectar el ácido nucleico metilado en base a un desplazamiento de la sonda mediado por amplificación y PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que la sonda además comprende una pluralidad de restos de
etiquetas fluorescentes.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en
el que la sonda específica de CpG es una sonda FRET, ó una sonda
etiquetada doblemente que comprende un resto informador de
fluorescencia y un resto interruptor de fluorescencia.
9. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que las cantidades de metilación en la muestra de ácido nucleico
se determinan cuantitativamente basándose en una reacción de control
de referencia para la cantidad de ácido nucleico aportado.
10. Un procedimiento para la detección de ácido
nucleico que contiene CpG metilada que comprende:
(a) poner en contacto una muestra que contiene
ácido nucleico con un agente modificante que modifica la citosina no
metilada para producir un ácido nucleico transformado;
(b) realizar una etapa de amplificación y
detección que comprende
- -
- amplificar el ácido nucleico transformado en la muestra por medio de cebadores de oligonucleótidos en presencia de sondas de oligonucleótidos específicos de CpG, donde la sonda específica CpG, pero no los cebadores, distinguen entre ácido nucleico modificado metilado y no metilado; y
- -
- detectar el ácido nucleico metilado en base a un desplazamiento de la sonda mediado por amplificación y PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que la sonda específica de CpG comprende un conjunto de restos de
etiquetas fluorescentes.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que la sonda específica de CpG es una sonda FRET, ó una sonda
etiquetada doblemente que comprende un resto informador de
fluorescencia y un resto interruptor de fluorescencia.
13. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho procedimiento es un
procedimiento de alto rendimiento.
14. Un kit de detección de la metilación útil
para la detección de un ácido nucleico que contiene CpG metilada que
comprende un medio de transporte que está compartimentalizado para
recibir en estrecho confinamiento en su interior uno ó más
recipientes que comprenden:
(i) un agente modificante que modifica la
citosina no metilada para producir un ácido nucleico
transformado;
(ii) cebadores para la amplificación del ácido
nucleico transformado
(iii) cebadores para la amplificación de ácido
nucleico no modificado de control; y
(iv) una sonda específica de CpG cuya detección
se basa en desplazamiento de la sonda mediado por amplificación y
PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia, en la que
la sonda específica de CpG distingue entre ácido nucleico modificado
metilado y no metilado, y donde cada uno de los cebadores puede
distinguir ó no entre ácido nucleico metilado ó no metilado.
15. El kit de la reivindicación 14, en el que el
agente modificante convierte los restos de citosina en restos de
uracilo.
16. El kit de la reivindicación 14, en el que la
sonda específica de CpG, pero no los cebadores para la amplificación
del ácido nucleico transformado, distinguen entre ácido nucleico
metilado y no metilado.
17. El kit de la reivindicación 14, en el que la
sonda específica de CpG y los cebadores para la amplificación del
ácido nucleico transformado, distinguen entre ácido nucleico
metilado y no metilado.
18. El kit de la reivindicación 14, en el que la
sonda específica de CpG comprende una pluralidad de restos de
etiquetas fluorescentes.
19. El kit de la reivindicación 18, en el que la
sonda específica de CpG es una sonda FRET, ó una sonda etiquetada
doblemente que comprende un resto informador de fluorescencia y un
resto interruptor de fluorescencia.
20. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 6 ó 10, en el que la etapa de amplificación
comprende una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
21. El procedimiento ó kit de una cualquiera de
las reivindicaciones 1, 6, 10 ó 14, donde el agente modificante
comprende bisulfito.
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