WO2007088744A1 - ゲノムdnaのメチル化状況に基づく細胞の同定方法 - Google Patents

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WO2007088744A1
WO2007088744A1 PCT/JP2007/050906 JP2007050906W WO2007088744A1 WO 2007088744 A1 WO2007088744 A1 WO 2007088744A1 JP 2007050906 W JP2007050906 W JP 2007050906W WO 2007088744 A1 WO2007088744 A1 WO 2007088744A1
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chrl
iji
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Application number
PCT/JP2007/050906
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Inventor
Kunio Shiota
Satoshi Tanaka
Masako Suzuki
Shintaro Yagi
Naka Hattori
Original Assignee
The University Of Tokyo
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method of identifying a cell based on the methylation status of a specific region on genomic DNA, and a kit for use in the identification method.
  • each cell expresses a different gene, and the tissues are maintained. This is because the gene expression pattern of the cell is maintained across cell generations. Of the same individual! / Although different cells have the same genome with some exceptions, different gene expression indicates that there is a gene expression control system that is maintained across cell generations. Yes. Such a system is described as epigenetic.
  • the main body of epigenetic gene expression control is a chromosomal regulatory mechanism, which is applied to mammals and by modification of genomic DNA and histones.
  • the RLGS method is effective as a method for obtaining a pattern consisting of the methylation status of the gene region of the entire genome.
  • the technique since the technique is complicated, the ability and technique of obtaining a certain result are difficult. Requires skill. In order to obtain more accurate results, high quality samples are required. In other words, DNA is necessary even if it is damaged by mechanical shearing force. In order to obtain DNA that can be used in the RLGS method, a relatively large tissue and a large number of cells are required. Therefore, with the RLGS method, it is difficult to analyze a limited amount of samples such as clinical specimens, and it is also difficult to analyze many types of tissues and cells.
  • Genomic DNA cleaved with a methylation-sensitive restriction enzyme is subjected to the Southern DNA hybridization method, and the status of methylation is tested by comparing the size of the fragments.
  • MS-PCR method Analyzing the situation of methyl candy by MS presence (MS-PCR method), subjecting similarly treated fragments to PCR using arbitrary primers, and comparing the patterns of the resulting fragments to detect different regions of the methyl candy situation (MS-AP-PCR method), the sensitivity of non-methyl cytosine to bisulfite is used.
  • the target fragment After converting non-methyl cytosine to uracil, the target fragment is amplified by PCR, and the sequence of the fragment is determined.
  • Bisulfite sequencing method to be determined analysis of the presence or absence of restriction enzyme sequences resulting from conversion by electrophoresis of amplified PCR fragments (COBRA Method), a method of concentrating fragments generated by digestion with a methylation-sensitive restriction enzyme that recognizes the same base sequence and an insensitive enzyme using the Representational Difference Analysis (RDA) method (MS-RDA method), the above genome
  • RDA Representational Difference Analysis
  • MS-microarray method a method that examines the methylation status by combining DNA treatment and microarray.
  • Southern hybridization method MS-PCR method, bisulfite -Sequencing and COBRA methods are methods that focus on and analyze specific regions of the genome that have already been identified! /.
  • MS-PCR method bisulfite -Sequencing and COBRA methods are methods that focus on and analyze specific regions of the genome that have already been identified! /.
  • information on regions suitable for identifying cell types is limited.
  • the MS-microarray method is a method that can examine the methylation status of a large number of regions in the entire genome. It does not disclose that the type can be identified.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-171973
  • An object of the present invention is to provide means for examining the degree of methylation of a plurality of genomic gene regions necessary for cell identification from a small amount of DNA sample. It is another object of the present invention to provide a means for creating a cell lineage by numerically processing the cell-specific profile of the degree of genomic DNA methylation in each cell. Another object of the present invention is to provide a means for identifying cells based on the genealogy.
  • the present inventor has efficiently examined the methylation status of a region containing a recognition site for a methylation-sensitive restriction enzyme on genomic DNA.
  • the present invention was completed based on this finding. That is, the present invention provides the following (1) to (16).
  • a method for identifying a cell comprising measuring a methylation state of a region including a recognition site for a methylation-sensitive restriction enzyme present on genomic DNA.
  • the methylation sensitive restriction enzyme is Notl, (1) or (2) Cell identification method.
  • the region including the recognition site for the methylation-sensitive restriction enzyme corresponds to the site on the genomic DNA of the mouse described in group E below in the organism to be identified.
  • the cell identification method according to any one of (1) to (3), characterized in that it is a region comprising a site, Group E: Chr8: 121718239, Chrl0: 40268206, Chr7: 40434319, Chr2: 168434887, Ch rl7: 13377255, Chr4: 11505437, Chr7: 23275835, Chrl0: 81558075, Chr2: 25510660, ChrUn: 64525443, Chr5: 149198213, Chrl3: 23258680, Chr8: 31681160, Chr5: 1188 32953, Chr8: 69313165, Chrl5: 103071 : 114999783, Chr4: 105344669, Chr 10: 85928951, Chr3: 114023516 (The number or symbol after “Chr” represents the chro
  • a region containing a recognition site for a methylation-sensitive restriction enzyme is selected as a site force on the genomic DNA of a mouse described in group A below in the organism to be identified.
  • the cell identification method according to any one of (1) to (3), characterized in that the region includes a region corresponding to the above region, Group A: ChrX: 153737739, Chrl 1: 23974565, Chr4 : 150 805756, Chr8: 125819650, Chrl7: 44401746, Chrl: 106112977, Chr6: 137933486, C hrl6: 8809376, Chrl5: 29789917, Chrl 1: 84598871, Chr6: 17264675, Chr3: 96185168, Chrl 1: 49465545, Chrl9: 46063101 , Chr5: 33885424, Chr8: 47668219, Chrl2: 8407 9717, Chr4: 103326546, Chr3: 120044619,
  • Methylation status of the region containing the recognition site for methylation-sensitive restriction enzyme should be measured by real-time PCR using a primer set represented by the combination of SEQ ID NOs listed in group a below.
  • the method for identifying a cell according to (6) characterized in that a group: SEQ ID NO: 1 and 2, SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 11 and 12, SEQ ID NOS: 13 and 14, SEQ ID NOS: 15 and 16, SEQ ID NOS: 17 and 18, SEQ ID NOS: 19 and 20, IJI IJ numbers 21 and 22, UJI U numbers 23 and 24, UJI U Number 25 and 26, Self U number 27 and 28, Self IJ number 29 and 30, Self IJ number 31 and 32, Self U number 33 and 34, Self U number 35 and 36, SEQ ID NOs: 37 and 38, SEQ ID NOS: 39 and 40, SEQ ID NOS: 41 and 42, SEQ ID NOS:
  • the cell to be identified is a human cell, and the region containing a recognition site for a methylation-sensitive restriction enzyme is a region containing a site on human genomic DNA described in Group F below.
  • Methylation status of a region containing a recognition site for a methylation-sensitive restriction enzyme is measured by real-time PCR using a primer set represented by a combination of SEQ ID NOs described in group f below.
  • a kit for identifying a cell which amplifies a region including a site corresponding to a site on the genomic DNA of a mouse described in group E in an organism to be identified.
  • a cell identification kit comprising a primer set capable of hr8: 121718239, Chrl0: 40268206, Chr7: 40434319, Chr2: 168434887, Chrl7: 133772 55, Chr4: 11505437, Chr7: 23275835, Chrl0: 81558075, Chr2: 25510660, ChrUn: 645 25443, Chr5: 149198213, Chrl3: 23258680 Chr8: 31681160, Chr5: 118832953, Chr8: 69313165, Chrl5: 103071181, Chr5: 114999783, Chr4: 105344669, Chrl0: 85928951, Chr3: 114023516 (The number or symbol after ⁇ Chr '' represents the chromosome number, after the colon
  • the cell identification kit according to (11), comprising a primer set represented by a combination of SEQ ID NOs described in the following e group: e group: SEQ ID NOS: 71 and 72; Arrangement U numbers 99 and 100, self IJ numbers 111 and 112, self IJ numbers 119 and 120, self IJ numbers 141 and 142, self U numbers 167 and 168, self IJ numbers 199 And 200, self IJ numbers 213 and 214, self IJ numbers 231 and 2 32, self IJ numbers 253 and 254, self IJ numbers 275 and 276, self IJ numbers 285 and 286, Self IJ numbers 29 1 and 292, Self IJ numbers 295 and 296, Self IJ numbers 305 and 306, Self IJ numbers 323 and 324, Self IJ numbers 343 and 344, Self IJ Numbers 393 and 394, IJ numbers 399 and 400, IJ numbers 423 and 424.
  • a kit for identifying a cell wherein in the organism for which the cell is to be identified, the site force on the mouse genomic DNA described in group A below: Cell identification kit characterized by containing a primer set that can amplify the region containing the corresponding site, Group A: ChrX: 153737739, Chrl 1: 23974565, Chr4: 150805756, Chr8: 125819650, Chrl7: 44401746, Chrl: 106112977, Chr6: 137933486, Chrl6: 88 09376, Chrl5: 29789917, Chrl 1: 84598871, Chr6: 17264675, Chr3: 96185168, Chrll: 49465545, Chrl9: 46063101, Chr5: 33885424, Chr8: 47668219, Chrl2: 84079717 C hr4: 103326546, Chr3: 120044619, Chrl2: 66000384, Chrl0: 80417554
  • the cell identification kit according to (13), comprising a primer set represented by a combination of SEQ ID NOs described in the following group a, wherein 50 or more primer sets are also selected, group a: SEQ ID NO: 1 and 2, SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 11 and 12, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 and 16, SEQ ID NO: 17 and 18, Self IJ numbers 19 and 20, Self IJ numbers 21 and 22, Self I U numbers 23 and 24, Self U numbers 25 and 26, Self IJ numbers 27 and 28, Self IJ numbers 29 and 30, Self U numbers 31 and 32, Self U numbers 33 and 34, Self IJ numbers 35 and 36, Self IJ numbers 37 and 38, Self U numbers 39 And 40, self U number 41 and 42, self U number 43 and 44, self IJ number 45 and 46, self IJ number 47 and 48, self U number 49 and 50, self ⁇ U numbers 51 and 52, SEQ ID numbers 53 and 54, SEQ
  • a kit for identifying a human cell comprising a primer set capable of amplifying a region containing a site on human genomic DNA described in group F below: Kit, Group F: Chrl6: 9361629, Chr7: 115733903 or 115733915, Chr10: 104406914, Chr4— random: 34125, Chr4: 152378551, Chr6: 160361011 or 160 361078, Chr21: 44203879, Chrl: 17064077, Chr21: 32572930 or 32572937 Chr 6: 30018279, Chrl5: 61269020 or 61269026, Chrl: 44552339, Chr6: 170515044, Chrl 1: 65895290, Chrll: 12240503, Chrl: 181241380, Chrl: 46663373, Chr20: 9311 09, Chrll: 71817692, Chrl0: 44189121 or 44189127, Chrl9: 1948330, Chrl: 18 553323, Chr4: 129009382
  • a cell identification kit comprising a primer set represented by a combination of SEQ ID NOs described in f group below, f group: SEQ ID NOs: 447 and 448, ⁇ IJ numbers 449 and 450, IJI IJ numbers 451 and 452, IJI IJ numbers 453 and 454, IJI IJ numbers 455 and 456, IJI IJ numbers 457 and 458, IJI IJ numbers 459 460, personal IJ numbers 461 and 462, personal self IJ numbers 463 and 464, personal self IJ numbers 465 and 466, personal self IJ numbers 467 and 468, personal self IJ numbers 469 and 470, personal self IJ number 4 71 and 472, self IJ number 473 and 474, self self IJ number 475 and 476, self self IJ number 477 and 478, self self IJ number 479 and 480, self self IJ number 481 And 482, self IJ numbers 483 and 484, self self IJ numbers 485 and 486,
  • CpG dense regions called CpG islands exist in gene groups and housekeeping genes essential for survival.
  • all cells have low methyl cocoons.
  • the situation of methyli in the non-coding region containing the repetitive sequence that occupies most of the genome and the housekeeping gene region is hardly different from cell to cell. Therefore, even if a genomic region is randomly extracted and analyzed for the DNA methylation and unmethylation status of that region, it appears that all cells exhibit the same pattern.
  • the cytosine in CpG in the repetitive sequence occupying most of the genome and many genes
  • the cytosine in the CpG island in the transcriptional regulatory region of the housekeeping gene composed of Therefore, even if the methylation state of cytosine in genomic DNA is randomly selected and analyzed, only a very limited region differs from cell to cell, and the genomic region used for cell type identification Is difficult to identify.
  • the reason is that it is difficult to obtain the genetic information of the spots presented in the RLGS method.
  • Examples of methods for clotting spots in the RLGS method include the positional cloning method, the Notl trapper method, and the positional cloning method based on viRLGS information.
  • gene isolation is difficult by either method.
  • One of the essences of the present invention is to provide genetic information of genomic DNA necessary for cell identification, which is difficult to obtain by the RLGS method and changes the methylation status.
  • methylation information of specific sites of genomic DNA There are two types of methylation information of specific sites of genomic DNA: methylated and unmethylated. Since mammalian cells are diploid, they can provide three types of information: methylation: methylation, methylation: unmethylation, and nonmethylation: nonmethylation. In terms of methylation status, they are 100%, 50%, and 0%. Furthermore, when analyzing the tissue, which is a cell population, the tissue is a population that is also composed of multiple different cells, and therefore has different methylation information for each type. When examining a situation, the situation can have a deviation value between 0% and 100%. In other words, in order to use the methylation status of genomic DNA as an indicator, it is necessary to quantitatively indicate the status of methylation.
  • the present invention provides a method for quantitatively measuring the methylation status of each genomic region necessary for cell identification.
  • methylation-sensitive real-time is used as a quantitative measurement method. Results by PCR were shown. There are many difficulties in PCR in areas where DNA methylation conditions change. DNA methylation is a force that occurs in cytosine of the CpG dinucleotide sequence. Most of the CpG sequences are localized in the genome, and a region that is particularly concentrated is called a CpG island.
  • C / G content is more than a certain amount (for example, 50% or more), and the frequency of CpG is higher than the frequency of usual observation (observed CpG frequency Z Expected CpG frequency value or more)
  • a region that has a sequence power of 3 ⁇ 400 bases or more In general, it is known that PCR efficiency decreases as the G / C content increases because the DNA structure changes as the C / G content increases.
  • CpG islands have similar characteristics as described above, so they have similar sequences and are likely to induce non-specific PCR reactions. Furthermore, it is difficult to design primers with specific sequences. Thus, there are many difficulties in the CPR of the CpG island. Many of the regions where the DNA methylation status changes are located in the CpG island and the surrounding area of the CpG island. Therefore, PCR analysis is a very difficult area.
  • PCR primers are designed for 953 methylation-sensitive restriction enzyme sequences scattered in the genome, the reaction is performed, and 223 regions are defined as regions where methylation status can be measured quantitatively. Selected.
  • PCR analysis using a methylation-sensitive enzyme is shown in the examples, but it is also possible to use PCR using a bisulfite reaction such as COBRA.
  • cell differentiation has a direction
  • the process of differentiation is a process of loss of differentiation pluripotency. Fate depends on the activation and inactivation of a particular group of genes. That is, in a specific cell group on the cell lineage, a group of genes is inactivated, that is, methylated, a group of genes is activated, that is, demethylated, and many of the conditions are inherited by the offspring. It is.
  • the significance of differences arising from measurement errors in the methylation status of individual genes can be obtained by treating them as a group (cluster). You will be able to confirm. In other words, in order to classify cells based on the methylation status, analysis data in a region sufficient to absorb measurement errors by statistical processing is necessary.
  • the present invention provides a specific method for analyzing cell-specific DNA methylation profiles, not only to identify cell types, but also to identify the developmental lineage of cells by appropriate numerical processing. Provide a method that can This provides a method for determining normality and abnormality even in the same tissue.
  • the gene region can be further By selecting, it is possible to obtain a combination of gene regions exhibiting the same effect as the methylation status of the 223 region.
  • the appropriate method is a method of selecting genes based on the information obtained by dividing genes into groups by cluster analysis or the like, by selecting the fluctuation range of methyl ⁇ status between the already divided tissue 'cells as an index. Selection can be made by following appropriate statistical analysis techniques.
  • the methyli status of deoxycytidine is the same in all cells in the noncoding region and the housekeeping gene region, including the repetitive sequences that occupy most of the genome. Therefore, for example, even when comparing the methylation degree of genomic DNA of cells showing two different traits, only a small part of the region differs by 1% or less. Without it, even this 1% difference cannot be found.
  • the most appropriate method is the RLGS method, but the procedure is complicated and there is a limitation that a large amount of sample must be used.
  • the gene information of the 223 region provided by the present invention it is possible to obtain a methyl cocoon profile necessary for cell identification by a simpler procedure.
  • the method provided by the present invention it becomes possible to identify cells with a smaller amount of DNA sample than the RLGS method. Furthermore, quantitative data can be obtained.
  • the DNA methylation profile analysis method provided by the present invention, it is possible not only to identify cells but also to predict the developmental lineage of cells. This makes it possible to correctly determine the normality of cells in the field of regenerative medicine. In the diagnosis of a disease, it is possible to examine the degree of cell abnormality and the severity of the disease.
  • FIG. 1 is a diagram (1) showing a region in which the state of methyl vagina in mouse cells was measured and a primer sequence used to amplify the region.
  • FIG. 2 A diagram (2) showing a region where the state of methyl vagina in mouse cells was measured and a primer sequence used to amplify the region.
  • FIG. 3 Methyl candy status measured in mouse cells and to amplify that region (3) which shows the arrangement
  • FIG. 4 is a diagram (4) showing a region where the state of methyl vagina in mouse cells was measured and a primer sequence used to amplify the region.
  • FIG. 5 A diagram (5) showing a region where the state of methyl vagina in mouse cells was measured and a primer sequence used to amplify the region.
  • FIG. 6 is a diagram (6) showing a region where the state of methyl vagina in mouse cells was measured and a primer sequence used to amplify the region.
  • FIG. 7 is a diagram (7) showing a region where the state of methyl vagina in mouse cells was measured and a primer sequence used to amplify the region.
  • FIG. 8 is a diagram (8) showing a region where the state of methyl vagina in mouse cells was measured and a primer sequence used to amplify the region.
  • FIG. 9 A diagram showing the results of clustering analysis of the methylation status of 223 regions on mouse genomic DNA.
  • FIG. 10 A diagram showing the results of clustering analysis of 50 regions selected from 223 regions on the genomic DNA of mice at random, and methylation status of those 50 regions.
  • FIG. 11 A graph showing the results of clustering analysis of 93 regions selected for 93 regions using the rate of change in the state of methyl ⁇ on the genomic DNA of mice as an index.
  • FIG. 12 A graph showing the results of clustering analysis of 72 regions selected for the 93 region force on the genomic DNA of mice in order to reduce the effects of gender differences and methylation status of the 72 regions.
  • FIG. 13 A graph showing the results of clustering analysis of 50 regions selected from 50 regions using the rate of change of the 223 region force on the genomic DNA of mice as an index.
  • FIG. 14 A diagram showing the results of clustering analysis of 20 regions selected from 20 regions using the rate of change in methylation status as an index from 223 regions on the genomic DNA of mice.
  • FIG. 15 is a diagram showing a region in which the state of methyl vagina in human cells was measured and the sequence of primers used to amplify the region.
  • FIG. 16 A diagram showing the results of clustering analysis of the situation of methyli in 45 regions on human genomic DNA.
  • the cell identification method of the present invention is characterized in that the methylation status of a region containing a recognition site for a methylation sensitive restriction enzyme present on genomic DNA is measured.
  • “methylation status” refers to the proportion of DNA that is selected for the region to be measured in the total genomic DNA contained in the cell to be identified. Measurement of methyl cocoon status may be done, for example, by force that can be performed by real-time PCR or other means.
  • methylation-sensitive restriction enzymes include Notl and Hpall, but others include Aatll, Acll, Agel, Ascl, Aval, BmgBI, BsiWI, BspDI, BstBI, Clal, Eagl, Fsel, Fspl, Examples include Haell, Hhal, Hpy99I, HpyCH4IV, Kasl, Mlul, Narl, Nael, Nrul, Pmll, Pvul, Rsrll, SacII, Sail, Sfol, SgrAi, Smal, and SnaBI.
  • the region to be measured is not particularly limited, but if a mouse cell is identified, a region including each of the 20 Notl recognition sites described in Group E below can be exemplified. In addition, the number was further increased in the region containing 50 Notl recognition sites described in the following group D, and the region including 72 Notl recognition sites described in the following group C. It may be a region containing 93 Notl recognition sites. Furthermore, the region to be measured may be a region including 50 or more sites, preferably each including 100 or more sites, in which 223 Notl recognition site forces described in group A below are also selected. .
  • a site corresponding to the Notl recognition site on the mouse genomic DNA described in groups A to E should be selected.
  • organisms other than mice include humans, ushi and pigs.
  • the region containing each of the 45 Hpall recognition sites described in Group F below may be used as the measurement target.
  • the length of the region to be measured is not particularly limited, but when measuring the methylation status by the real-time PCR method, it is usually 100 to 2000 bases, preferably 150 to 300 bases.
  • the primer sequences used for real-time PCR are not particularly limited, but are used to identify mouse cells and amplify the region containing 20 Notl recognition sites described in Group E below. Use the 20 primer sets listed in group e below. Can do.
  • a region containing 50 Notl recognition sites described in Group D below is amplified
  • 50 primer sets described in Group d below are amplified
  • regions containing 72 Notl recognition sites described in Group C below are amplified.
  • 72 primer sets described in group c below can be used, and in the case of amplifying a region containing 93 Notl recognition sites described in group B below, 93 primer sets described in group b below can be used.
  • identifying cells of organisms other than mice those obtained by modifying the sequences of the primer sets described in the following groups a to e in accordance with the genome DNA sequence of the organism can be used.
  • the 45 primer sets described in group f below can be used.
  • the numbers or symbols after “Chr” in groups A to F represent the chromosome number, and the numbers after the colon represent the position on the chromosome.
  • the restriction enzyme recognition sites described in Group A correspond to the combinations of SEQ ID NOs described at the same positions in Group a. The same applies to groups B and b, groups C and c, groups D and d, groups E and e, and groups F and f.
  • Group A consists of ChrX: 153737739, Chrl 1: 23974565, Chr4: 150805756, Chr8: 125819650, Chrl7: 44401746, Chrl: 106112977, Chr6: 137933486, Chrl6: 8809376, Chrl5: 2978 9917, Chrl 1: 84598871, Chr6: 17264675, Chr3: 96185168, Chrl1: 49465545, Chrl9: 46063101, Chr5: 33885424, Chr8: 47668219, Chrl2: 84079717, Chr4: 103326546, C hr3: 120044619, Chrl2: 66000384, Chrl0: 80417554, Chrll: 96513323, Chr4: 129012 370, Chr8: 122498663, Chr8: 78509264, Chr3: 85886742, Chrl7: 11408482, Chrl3: 4 6027430, Chr7
  • Group B is ChrX: 153737739, Chrl 1: 23974565, Chr8: 125819650, Chr6: 137933486, Chrl6: 8809376, Chrl5: 29789917, Chr6: 17264675, Chrl9: 46063101, Chr5: 338854 24, Chrll: 96513323, Chr3: 85886742, Chrl7: 11408482, Chrl3: 46027430, Chrl0: 7 8398276, Chr5: 114637408, Chr8: 121718239, Chr4: 139884259, Chr4: 146644182, Chrl6: 89884169, Chrl7: 33102816, Chrl0: 40268206, Chr7: 40434319, Chr9: 67043 Chr4: 116443668, Chrl7: 13377255, Chrl9: 4813393, Chrl: 34575316, Chr7: 10 6207521, Chrl: 151841674, Chr6:
  • Group C consists of Chr8: 125819650, Chr6: 137933486, Chrl6: 8809376, Chrl5: 29789917, Chr6: 17264675, Chrl9: 46063101, Chr5: 33885424, Chrll: 96513323, Chr3: 85886742, Chrl7: 11408482, Chrl3: 46027430, Chrl0: 78398276, Chr5: 114637408, Chr8: 121 718239, Chr4: 139884259, Chr4: 146644182, Chrl6: 89884169, Chrl7: 33102816, C hrl0: 40268206, Chr7: 40434319, Chr9: 67043441, Chr2: 168487 1337725 5, Chrl9: 4813393, Chrl: 34575316, Chr7: 106207521, Chrl: 151841674, Chr6: 4935 0227, Chr7: 10818048,
  • Group D is Chrl5: 29789917, Chrl9: 46063101, Chr5: 33885424, Chrl7: 11408482, Ch rl3: 46027430, Chr5: 114637408, Chr8: 121718239, Chr4: 139884259, Chrl7: 331028 16, Chrl0: 40268206, Chr7 : 40434319, Chr9: 67043441, Chr2: 168434887, Chrl7: 13 377255, Chrl9: 4813393, Chrl: 151841674, Chr7: 10818048, Chr4: 11505437, Chr7: 95775089, Chr6: 117613722, Chr7: 23275835, Chr2: 149957601, Chr2: 149957601 81558075, Chr2: 25510660, Chr4: 22462691, Chr2: 165860247, ChrUn: 64525443, Chr5: 149198 213, Chr5: 724594
  • Group E consists of Chr8: 121718239, Chrl0: 40268206, Chr7: 40434319, Chr2: 168434887, Ch rl7: 13377255, Chr4: 11505437, Chr7: 23275835, Chrl0: 81558075, Chr2: 25510660, ChrUn: 64525443, Chr5: 149198213, Chrl3: 23258680, Chr8: 31681160, Chr5: 1188 32953, Chr8: 69313165, Chrl5: 103071181, Chr5: 114999783, Chr4: 105344669, Chr 10: 85928951, Chr3: 114023516 .
  • Group F is Chrl6: 9361629, Chr7: 115733903 or 115733915, Chrl0: 104406914, Chr4— random: 34125, Chr4: 152378551, Chr6: 160361011 or 160361078, Chr21: 44203879, Chrl: 17064077, Chr21: 32572930 or 32572937 Chr6: 30018279, Chrl5: 61269020 or 61269026, Chrl: 44552339, Chr6: 170515044, Chrl 1: 6589529 0, Chrl 1: 12240503, Chrl: 181241380, Chrl: 46663373, Chr20: 931109, Chrll: 7181 7692, Chrl0: 44189121 or 44189127, Chrl9: 1948330, Chrl4: l 29009382, Chr2: 211166961, ChrX: 19121661, Chr20: 36789818, Chr9: 137016164, ChrX: 152757752 or 15
  • group a is SEQ ID NO: 1 and 2, SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 11 and 12, SEQ ID NO: 13 and 14, sequence Nos. 15 and 16, SEQ ID Nos. 17 and 18, SEQ ID Nos. 19 and 20, SEQ ID Nos. 21 and 22, SEQ ID Nos. 23 and 24, SEQ ID Nos. 25 and 26, SEQ ID Nos. 27 and 28, IJI IJ Nos. 29 and 30 , Self U number 31 and 32, self U number 33 and 34, self U number 35 and 36, self IJ number 37 and 38, self IJ number 39 and 40, self U Nos. 41 and 42, Umi U Nos.
  • Group b consists of SEQ ID NO: 1 and 2, SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 and 16, SEQ ID NO: 17 and 18, SEQ ID NO: 21 and 22, SEQ ID NO: 27 And 28, SEQ ID NOS: 29 and 30, IJI IJ numbers 43 and 44, IJI IJ numbers 51 and 52, IU U numbers 53 and 54, IU U numbers 55 and 56, IJ column numbers 63 And 64, SEQ ID Nos. 67 and 68, SEQ ID Nos. 71 and 72, SEQ ID Nos. 81 and 82, SEQ ID Nos. 91 and 92, IJ Nos. 93 and 94, Ubiquitous U Nos.
  • IJI IJ numbers 159 and 160 IJI IJ numbers 167 and 168, IJI IJ numbers 169 and 170, IJI U numbers 171 and 172, IJI IJ numbers 177 and 178, IJ numbers 183 and 184, IJ numbers 189 and 190, IJ numbers 191 and 192, IJ numbers IJ numbers 195 and 196, IJ numbers IJ numbers 197 and 198, IJ numbers IJ numbers 199 and 200, self IJ numbers 207 and 208, self IJ numbers 211 and 212, self IJ numbers 213 and 214, self IJ numbers 2 15 and 216, self IJ numbers 217 and 218, IJ numbers 219 and 220, IJ numbers 225 and 226, IJ numbers IJ numbers 231 and 232, IJ numbers IJ numbers 233 and 234, IJI IJ numbers 237 and 238, IJI IJ Numbers 239 and 240, Self ⁇ U numbers 243 and 244, Self ⁇ IJ numbers
  • c group consists of SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 and 16, SEQ ID NO: 17 and 18, SEQ ID NO: 21 and 22, SEQ ID NO: 27 and 28, SEQ ID NO: 29 and 30, SEQ ID NO: 43 44, sequence number 51 and 52, self IJ number 53 and 54, self U number 55 and 56, self U number 63 and 64, self U number 67 and 68, self IJ number 71 and 72, self IJ number 81 and 82, self U number 91 and 92, self U number 93 and 94, self U number 97 and 98, self IJ number 99 and 100, Self IJ numbers 111 and 112, Self IJ numbers 113 and 114, Self I U numbers 119 and 120, Self IJ numbers 141 and 142, Self IJ numbers 143 and 144, Self IJ numbers 147 And 148, self IJ numbers 149 and 150, self IJ numbers 151 and 152, self IJ numbers 157 and 158, self IJ numbers
  • Group d is SEQ ID NOs: 17 and 18, SEQ ID NOs: 27 and 28, SEQ ID NOs: 29 and 30, SEQ ID NOs: 53 and 54, IJI IJ numbers 55 and 56, IJI IJ numbers 67 and 68, ⁇ Self U number 71 and 72, Self U number 81 and 82, Self IJ number 97 and 98, Self IJ number 99 and 100, Self IJ number 111 and 112, Self IJ number 113 And 114, self IJ numbers 119 and 120, self IJ numbers 141 and 142, self IJ numbers 143 and 144, self IJ numbers 151 and 152, self U numbers 159 and 160, self ⁇ IJ numbers 167 and 168, IJI IJ numbers 195 and 196, IJI IJ numbers 197 and 198, IJI IJ numbers 199 and 200, IJI IJ numbers 211 and 212, IJI IJ numbers 213 And 214, self IJ numbers 23 1 and 232, self IJ numbers 23 1 and
  • Group e includes SEQ ID NOs: 71 and 72, SEQ ID NOs: 99 and 100, SEQ ID NOs: 111 and 112, SEQ ID NOS: 11 and 120, IJI IJ numbers 141 and 142, IJI IJ numbers 167 and 168, IJ numbers 199 and 200, IJ numbers 213 and 214, IJ numbers 231 and 232, IJ numbers IJ numbers 253 and 254, IJ numbers IJ numbers 275 and 276, I U Numbers 285 and 286, self IJ numbers 291 and 292, self IJ numbers 295 and 296, self IJ numbers 305 and 306 , ⁇ ⁇ ⁇ IJ numbers 323 and 324, ⁇ ⁇ ⁇ IJ numbers 343 and 344, ⁇ ⁇ ⁇ IJ numbers 393 and 394, ⁇ ⁇ ⁇ IJ numbers 399 and 400, and SEQ ID NOs: 423 and 424 A group consisting of
  • the f group consists of IJ numbers 447 and 448, IJ IJ numbers 449 and 450, IJ IJ numbers 451 and 452, IJI IJ numbers 453 and 454, IJ IJ numbers 455 And 456, self-service IJ numbers 457 and 458, self-service IJ numbers 459 and 460, self-service U numbers 461 and 462, self-service IJ numbers 463 and 464, self-service IJ numbers 465 and 466, self-service ⁇ IJ numbers 467 and 468, IJI IJ numbers 469 and 470, IJI IJ numbers 471 and 472, IJI IJ numbers 473 and 474, IJI IJ numbers 475 and 476, IJI IJ numbers 477 and 478, self-service IJ numbers 479 and 480, self-service IJ numbers 481 and 482, self-service IJ numbers 4 83 and 484, self-service IJ numbers 485 and 486, self-service IJ numbers 487 and 488, self-service ⁇ IJ
  • Example 1 Culture of mouse embryonic stem cells (ES cells) and embryonic germ stem cells (EG cells)
  • Embryonic stem cell line (MS12), embryonic germline stem cells (EG cells: Development. 1994 Nov; 120 (1 1): 3197-204.)
  • worm fetal serum 15% penicillin 100 U / ml, streptomycin 100 DMEM medium supplemented with ⁇ g / ml, 100 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ non-essential amino acids, lmM sodium pyruvate, 100 M mercaptoethanol, 2 mM glutamine, 37 ° C, 5% carbon dioxide present Cultivation was performed below.
  • primary fetal fibroblasts isolated by the method described later were used as a feeder, and supplemented with LIF (Leukemia inihibitory factor) at 10 OOU / ml.
  • LIF Leukemia inihibitory factor
  • the cultured cells were treated with trypsin / EDTA and transferred to a new culture dish. After standing for 25 minutes, the supernatant containing only ES cells was collected. Next, the cells are transferred to a gelatin-coated culture dish and cultured in the above-mentioned culture medium containing no LIF. The cells were differentiated.
  • Primary fetal fibroblasts used as feeder cells were isolated as follows. Mouse embryos 15 days were dissected and the head, internal organs and spine were removed and chopped in PBS. The precipitate was collected by centrifugation (lOOOrpm, 3 minutes), resuspended in trypsin / EDTA mixture, and treated at room temperature for 30 minutes. After filtration through a mesh, the precipitate was collected by a circular operation. The number of viable cells was assayed, and the culture was continued for 3 days in DMEM medium supplemented with urchin fetal serum to 10%. An appropriate amount of the fibroblasts thus obtained was collected and stored frozen in liquid nitrogen in an appropriate storage solution until used for stem cell culture.
  • Placental trophoblast stem cells contain 20% urchin fetal serum, 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, lmM sodium pyruvate, 100 ⁇ mercaptoethanol, and 2 mM glutamine. Cultivation was performed in RPMI1640 medium supplemented with iodine at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide. In order to maintain the undifferentiated state, primary fetal fibroblasts were used as feeders, and FGF-4 was added at 25 ng / ml and heparin at 1 ⁇ g / ml.
  • the cultured cells were treated with trypsin / EDTA and transferred to a new culture dish. After standing for 25 minutes, the supernatant containing only TS cells was collected. Next, the cells were transferred to a gelatin-coated culture dish and cultured in the above-mentioned culture medium not containing FGF-4 to differentiate TS cells.
  • mouse undifferentiated embryonic stem cells, undifferentiated placental trophoblast stem cells, differentiated placental trophoblast stem cells, undifferentiated embryonic germ stem cells, differentiated embryonic germ stem cells, testis cells, sperm, brain cells, spleen cells, White adipocytes, placental cells, pituitary cells, kidney cells, brown mesenchymal cells, brown adipocytes, and liver cells were used.
  • Embryonic stem cells and placental trophoblast stem cells were prepared by the method described above. Adipocytes from adipose tissue and brown mesenchymal cells were separated according to a conventional method. (Nechad et al, 1983, Experimental Cell Research 149, 105-118). Each mouse tissue was collected from sacrificed mice. [0068] 2) Preparation of genomic DNA
  • the genomic DNA of the target cell was prepared as follows according to a known method (Molecular cloning). Lyse each frozen cell sample (approximately 7 lxlO) in 5 ml of lysis buffer [150 mM EDTA, 10 mM Tris-HC1 pH 8.0, containing 1% SDS-proteinase K (10 mg / ml)] Incubated at 55 ° C for 20 minutes. Extract with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (50: 49: 1) twice, precipitate the genomic DNA by ethanol precipitation, and add 300 ⁇ 1 ⁇ (10 mM Tris-HC1, 1 mM EDTA pH 7. Dissolved in 6).
  • the DNA methylation status was analyzed using the mouse cell samples described above.
  • Real-time PCR was performed as follows. Genomic DNA was treated with Pstl (NipponGene), subjected to enzyme inactivation at 65 ° C for 30 minutes, and then equally divided into two tubes. One divided tube was treated with Notl (Takara), a methylation sensitive enzyme. Two tubes, the Notl untreated group and the treated group, were extracted twice with phenol Z-cloform form Z isoamyl alcohol (50: 49: 1), and genomic DNA was precipitated by ethanol precipitation. DNA was dissolved using TE (10 mM Tris-HC1, 1 mM EDTA pH7.6) so that each concentration was 10 ⁇ l / ⁇ l.
  • the CT value (number of cycles at which the PCR product concentration reaches a certain concentration) was calculated according to the ABI PRISM 7000 instruction manual.
  • the initial sample concentration was calculated using the following formula.
  • the DNA methylation status was calculated by the following formula.
  • DNAc DNAOc / DNAsc
  • DNAc Initial concentration of sample cleaved with methylation sensitive enzyme
  • DNAOc Initial concentration obtained from PCR reaction theory
  • DNAsc Does not contain a methylation-sensitive enzyme cleavage sequence! /, Initial concentration obtained from the PCR reaction theory when the product is amplified
  • DNAuc DNAOuc / DNAsuc
  • DNAuc cut with methylation sensitive enzyme, sample initial concentration
  • DNAOuc Initial concentration obtained from PCR reaction theory
  • DNAsuc Initial concentration obtained from PCR reaction theory when a product that does not contain a methylation-sensitive enzyme cleavage sequence is amplified
  • FIG. 1-8 show the nucleotide sequence of the primer set used to amplify this 223 region, and the position of the Notl recognition site contained in each region on the mouse genomic DNA.
  • the position and sequence on the chromosome were obtained from the UCSC genome browser (http: ⁇ genome.ucsc.edu/).
  • the sequence defined in the present invention was created based on the mouse (Mus musculus) draft genome d ata (Build 34 assembly) in March 2005 and provided by NCBI (The National Center for Biotechnology Information). ing.
  • ChrUN is a region where the chromosome has not yet been identified, and random indicates that the chromosome number has been identified, but the location has been correctly identified.
  • SWx Human hepatoma cells
  • HEK293 human fetal kidney cells
  • Caco-2 human colon cancer-derived cells
  • Orthogonal regions of the human genome were selected using the rate of change in the methylome status of the mouse genome as an index. Primers were designed to include the sequence of the methylation sensitive enzyme Hpall.
  • the genomic DNA of the target cell was prepared as follows according to a known method (Molecular cloning). Lyse each frozen cell sample (approximately 7 lxlO) in 5 ml of lysis buffer [150 mM EDTA, 10 mM Tris-HC1 pH 8.0, containing 1% SDS-proteinase K (10 mg / ml)] Incubated at 55 ° C for 20 minutes. Extract with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (50: 49: 1) twice, precipitate the genomic DNA by ethanol precipitation, and add 300 ⁇ 1 ⁇ (10 mM Tris-HC1, 1 mM EDTA pH 7. Dissolved in 6).
  • the DNA methylation status was analyzed using the cell sample described above.
  • Real-time PCR was performed as follows. Genomic DNA was treated with Pstl (NipponGene), subjected to enzyme inactivation at 65 ° C for 30 minutes, and then equally divided into two tubes. One divided tube was treated with Hpall (Takara), a methylation sensitive enzyme. Two tubes, Hpall untreated group and treated group, were extracted twice with phenol Z, Kuroguchi form Z isoamyl alcohol (50: 49: 1), and genomic DNA was precipitated by ethanol precipitation. The DNA was dissolved using TE (10 mM Tris—HC1, 1 mM EDTA pH7.6) so that each concentration was 10 ⁇ l / ⁇ l.
  • Methyl candy status was calculated in the same manner as in Example 3.
  • FIG. 15 shows the base sequence of the primer set used for this, and the position of the Hpall recognition site contained in each region on the human genomic DNA.
  • the results of clustering analysis are shown in Figure 16.
  • the genealogy of the cells created based on the methylation status was similar to that of the cells, as in the case of the mouse.

Abstract

　ゲノムDNA上に存在するメチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域のメチル化状況をリアルタイムPCR法などによって測定することを特徴とする細胞の同定方法を提供する。この方法を用いることにより、少量のDNAサンプルから、正確に細胞を同定することが可能になる。

Description

明 細 書
ゲノム DNAのメチルイ匕状況に基づく細胞の同定方法
技術分野
[0001] 本発明は、ゲノム DNA上の特定領域のメチルイ匕状況を測定し、それに基づ 、て細 胞を同定する方法、及びその同定方法に使用するキットに関する。
背景技術
[0002] 組織及び組織を構成している細胞が異なる表現形を持つのは、それぞれの細胞が 異なった遺伝子を発現して ヽるからであり、組織が維持されるのは構成して ヽる細胞 の遺伝子発現様式が細胞世代を超えて維持されるためである。同一個体の！/、ずれ の細胞も、一部の例外を除き同じゲノムを持つにも関わらず、異なる遺伝子発現をす るのは、細胞世代を超えて維持される遺伝子発現制御システムが存在することを示し ている。そのようなシステムをェピジェネティックと形容する。ェピジェネティックな遺伝 子発現制御の本体は染色体の調節機構であり、哺乳類にぉ 、てはゲノム DNAのメチ ルイ匕とヒストンの修飾による。
[0003] 遺伝子発現状況と染色体のェピジェネティックな状態は関連している。遺伝子発現 が起こらない領域では、 DNAが高度にメチルイ匕され、染色体が不活性化されている。 逆に遺伝子発現が活発な領域において、染色体は緩んだ状態を保ち、該領域の DN Aは低メチルイ匕である。すなわち遺伝子発現状況と DNAのメチル化状況は負の相関 を示す。前述のように組織及び組織を構成して ヽる細胞が異なる表現形を持つのは 、それぞれの細胞が異なった遺伝子を発現しているからであり、故に細胞の種類は D NAメチルイ匕状況により規定することが出来ると考えられる。たとえば各々の遺伝子領 域のメチル化状況を、例えば表組みすることによって得られるパターンを用いることに より細胞の種類を同定することが出来ると予想された。
[0004] このことを示すために、細胞'組織間でのゲノム全体に渡る DNAのメチルイ匕状況の 違いを調べた。このような解析に最適な方法として、一度に多くの遺伝子領域のメチ ルイ匕状況を調べることが出来る RLGS法がある。 RLGS法は一度にゲノム遺伝子領域 の約 2000箇所のメチルイ匕状況を調べることが出来る。細胞 ·組織間でのゲノム DNAの メチルイ匕状況力 なるパターンを比較することにより、細胞の種類を同定できることを 見いだした (特許文献 1)。
[0005] RLGS法はゲノム全体の遺伝子領域のメチル化状況からなるパターンを得る方法と して有効であるが、その手技は煩雑であるため、一定の結果を得るためには能力と手 技の熟練を必要とする。さらに精度の高い結果を得るためには、高品質なサンプル が必要である。すなわち機械的な剪断力などによって傷つ ヽて 、な 、DNAが必要と なる。 RLGS法に供することが出来る DNAを得るためには、比較的大きな組織、また多 くの細胞が必要となる。ゆえに RLGS法では、臨床検体のような限られた量のサンプル の解析を行うことは困難であり、数多くの種類の組織、細胞を解析することも困難であ る。
[0006] また RLGS法によって変化が認められる領域を同定する方法が煩雑なため、ゲノム のどこの配列のメチルイ匕状況を解析することによって細胞の種類が同定できることに 関しては、限られた情報が開示されているのみである。
[0007] DNAのメチルイ匕状態を解析する方法としては、 RLGS法以外にも以下の方法が報告 されて ヽる。メチル化感受性制限酵素で切断したゲノム DNAをサザンノヽイブリダィゼ ーシヨン法に供し、断片の大小を比較することによりメチルイ匕状況を検定する方法、 同様処理を施した DNAを PCR反応に供し、生じた断片の有無によりメチルイ匕状況を 解析する方法 (MS-PCR法）、同様に処理した断片を arbitrary primerを用いた PCRに 供し、生じた断片のパターンを比較することによりメチルイ匕状況の異なる領域を検出 する方法 (MS-AP-PCR法）、バイサルファイトに対する非メチルイ匕シトシンの感受性を 利用し、非メチルイ匕シトシンをゥラシルに変換させた後、 PCRにより目的断片を増幅さ せ、その断片の配列を決定するバイサルファイトシーケンシング法、変換により生じた 制限酵素配列の有無を、増幅した PCR断片の電気泳動等で解析する方法 (COBRA 法)、同じ塩基配列を認識するメチル化感受性制限酵素と非感受性酵素で切断した により生じることなる断片を、 Representational Difference Analysis (RDA)法により濃 縮する方法 (MS-RDA法）、上記のゲノム DNA処理とマイクロアレイを組み合わせるこ とによりメチル化状況を調べる方法 (MS-microarray法)などがある。
[0008] これら諸方のうち、サザンハイブリダィゼーシヨン法、 MS-PCR法、バイサルファイトシ ーケンシング法、 COBRA法は配列が既に判明して!/、るゲノムの特定の領域につ!、て 注目し解析する方法である。し力しこれらの方法を用いて一度に複数の領域のメチ ル化状況を解析し、それらの情報に基づき細胞の種類を同定して 、る試みはな 、。 また細胞の種類を同定することに適した領域についての情報は限られている。
[0009] MS-microarray法は RLGS法と同様にゲノム全体の、多数の領域のメチル化状況を 調べることができる方法である力 どの遺伝子領域のメチルイ匕状況の違 、を調べるこ とにより細胞の種類が同定できることを開示してはいない。
[0010] 特許文献 1 :特開 2002— 171973号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 本発明は、少量の DNAサンプルから、細胞の同定に必要な、複数のゲノム遺伝子 領域のメチルイ匕度合を調べる手段を提供することを目的とする。さらに各々の細胞の ゲノム DNAメチルイ匕度合の細胞特異的プロフィールを、数値処理することにより、細 胞の分化系譜を作る手段を提供することを目的とする。またその分ィ匕系譜に基づく細 胞の同定手段をも提供することを目的とする。
[0012] 特に再生医療において、再生された細胞がモニター可能な表現マーカーの有無に よってのみ細胞の正常性を確認しているのに対し、細胞の分ィ匕系譜を知ることが出 来れば、その細胞が正しく分ィ匕した正常な細胞か否かを判別することが可能となる。 課題を解決するための手段
[0013] 本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ゲノム DNA上のメ チル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域のメチルイ匕状況を調べることにより、 効率的に細胞を同定できることを見出し、この知見に基づき本発明を完成した。 即ち、本発明は、以下の（1)〜（16)を提供するものである。
[0014] (1)ゲノム DNA上に存在するメチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域のメチ ル化状況を測定することを特徴とする細胞の同定方法。
(2)メチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域のメチルイ匕状況の測定をリアル タイム PCR法によって行なうことを特徴とする（1)に記載の細胞の同定方法。
(3)メチル化感受性制限酵素が、 Notlであることを特徴とする（1)又は（2)に記載の 細胞の同定方法。
[0015] (4)メチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域が、細胞を同定しょうとする生 物にお 、て、下記の E群に記載されたマウスのゲノム DNA上の部位に対応する部位 を含む領域であることを特徴とする（1)乃至（3)のいずれかに記載の細胞の同定方 法、 E群： Chr8:121718239、 Chrl0:40268206、 Chr7:40434319、 Chr2: 168434887、 Ch rl7:13377255, Chr4: 11505437、 Chr7:23275835, Chrl0:81558075、 Chr2:25510660 、 ChrUn:64525443、 Chr5:149198213、 Chrl3:23258680、 Chr8:31681160、 Chr5:1188 32953、 Chr8:69313165、 Chrl5:103071181、 Chr5: 114999783、 Chr4: 105344669、 Chr 10:85928951、 Chr3:114023516 (「Chr」の後の数字又は記号は染色体番号を表し、コ ロンの後の数字はその染色体上の位置を表わす。 ) 0
[0016] (5)メチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域のメチルイ匕状況の測定を、下 記 e群に記載された配列番号の組み合わせによって表されるプライマーセットを用い たリアルタイム PCR法によって行なうことを特徴とする (4)に記載の細胞の同定方法、 e群：酉己歹 IJ番号 71と 72、酉己歹 IJ番号 99と 100、酉己歹 U番号 111と 112、酉己歹 U番号 119と 1 20、酉己歹 IJ番号 141と 142、酉己歹 IJ番号 167と 168、酉己歹 IJ番号 199と 200、酉己歹 IJ番号 21 3と 214、酉己歹 IJ番号 231と 232、酉己歹 IJ番号 253と 254、酉己歹 IJ番号 275と 276、酉己歹 IJ番 号 285と 286、酉己歹 IJ番号 291と 292、酉己歹 IJ番号 295と 296、酉己歹 IJ番号 305と 306、酉己 歹 U番号 323と 324、酉己歹 IJ番号 343と 344、酉己歹 IJ番号 393と 394、酉己歹 IJ番号 399と 400 、配列番号 423と 424。
[0017] (6)メチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域が、細胞を同定しょうとする生 物において、下記の A群に記載されたマウスのゲノム DNA上の部位力 選択される 5 0以上の部位に対応する部位を含む領域であることを特徴とする（1)乃至（3)のいず れかに記載の細胞の同定方法、 A群： ChrX: 153737739、 Chrl 1:23974565、 Chr4:150 805756、 Chr8:125819650、 Chrl7:44401746, Chrl:106112977、 Chr6: 137933486、 C hrl6:8809376、 Chrl5:29789917、 Chrl 1:84598871、 Chr6:17264675, Chr3:96185168 、 Chrl 1:49465545、 Chrl9:46063101、 Chr5:33885424、 Chr8:47668219、 Chrl2:8407 9717、 Chr4: 103326546、 Chr3:120044619、 Chrl2:66000384、 Chrl0:80417554、 Chrl 1:96513323、 Chr4:129012370, Chr8: 122498663、 Chr8:78509264、 Chr3: 85886742、 Chrl7:11408482、 Chrl3:46027430、 Chr7:76723912, Chrl9:44619519、 Chr9:88075 903、 Chrl0:78398276、 Chr8: 105978735、 Chr5: 114637408、 Chrl4: 19865028、 Chr8: 121718239、 Chrl3:48746725, Chr7:74796742, Chrl:65031809、 Chr7:52936750、 C hr4: 139884259、 Chr4:45101184、 ChrX:36432657、 Chr2:92750731, Chr8:83330656 、 Chr4: 146644182、 Chrl6:89884169、 Chr8: 104658905、 Chrl7:33102816、 Chrl0:40 268206、 Chrl3:42866853、 Chr4:28998320、 Chrl :155453586、 Chrll:83201331、 Chr 14:32336574、 Chr7:40434319、 Chr9:67043441、 Chr4: 116443668、 Chr8:121664181 、 Chr2: 168434887、 Chr3:95483641、 Chr6: 127523140、 Chrl4:32448118、 Chrl5:795 6800、 Chrl9:9721804、 Chr6:83693750、 Chrl0:80225872, Chr9: 114526827、 Chr6:l 16114291、 Chr9:56270240, Chrl7:13377255, Chrl9:4813393、 Chr7:23565628、 Chr 1:34575316、 Chr7:106207521, Chrl:151841674、 Chrl0:95491636、 Chrl6: 16859974 、 Chr6:49350227, Chr7:10818048、 Chrl4:42557426, Chr7: 115979724, Chrl0:1206 17583、 Chr4: 11505437、 Chrl :93023446、 Chr7:47738905, Chrl 1:95826461、 Chrl4: 18186366、 Chr4:114903199、 Chrl4:20196166、 Chr5:66374286、 Chr2:172095255, Chrll:77890507, Chr4:117093825、 Chr2: 151299843、 Chr2:86196662、 Chr6:94136 966、 Chr7:95775089, Chr6:117613722, Chr7:23275835, Chrl:160810726、 Chrl3:2 4417279, Chr4:87708528, Chrll:115679875、 Chrl4:28957086、 Chr2: 149957601、 Chrl0:81558075、 Chrl:67331020、 ChrX: 153737740, Chr5:40517610、 Chr8:257759
80、 Chr4: 11249059、 Chr2:158071001、 Chrl2:87004048、 Chr4:83661222、 Chr2:255 10660、 Chr4:22462691, Chrl 1:95886409、 Chr2: 165860247, Chr7:57532361、 Chrl 3 :44304760、 ChrX:68627376, Chrl2:46747475, Chrl :39874007、 Chr4:25102296、 Ch r5:111413041、 ChrUn:64525443、 Chr6:23885534、 Chrl3:54216756、 Chr2: 1797599
81、 Chrl0:5792605、 Chrl7:44313006、 Chrl0:62042196、 Chr7:75800342, Chrl6:29 359640、 Chr9: 107465609、 Chrl6 (random): 11291833、 Chr5:149198213、 Chrl9:468 04447、 Chr5:72459426, Chr4: 105344670、 Chr2: 11088454、 Chrl3:23258680、 Chr3: 87155781、 Chrl3:69792720, Chr8:31681160、 Chrl0:42304235、 Chr5:118832953、 Chr8: 119877706, Chr8:108001483、 Chr3:8368783、 Chr6:109211761、 Chr8:693131 65、 Chrll:70251059、 Chr8: 120440336、 Chrl5:96527917、 Chr6:127316378、 Chrl5: 57702368、 ChrX: 106041129、 Chrl4:46019287、 Chrl9:40841588、 Chrl5:103071181 、 Chrl4:18512073、 Chr5:29507642、 ChrX:68334575、 Chrl2:76993764, ChrX:6833 4574、 Chr7: 124389371, Chr2:54362031、 Chrl 1:74894287, Chr8:71647146, Chr5:l 14999783、 Chr9:88688368、 Chr8: 106354332、 Chr4:6367964、 ChrUn:65258017、 Ch r8:125762282, Chr9:37087646、 Chr2:155513500、 Chrl4:67062171, Chr7:22966694 、 Chrl4:48957516、 Chrl9:17878685、 ChrX:64029083、 Chrl4:50403225、 Chr6:1498 31859、 Chrl3:12606447、 ChrX:32710687, Chrl:63738959、 Chrl4:12363880、 Chrl 2:21230518、 Chrll:20636114、 Chr9:83305251、 Chr7: 116848543、 Chr9:69414907、 Chr6: 17264674, Chr4: 105344669、 Chrl6:22771437, Chr2: 116489694、 Chrl0:8592 8951、 Chrll:92919702、 Chrl6:21039084、 Chrl3:109194553、 Chrl :130566806、 Chr 4:127833013、 Chrl0:91054117、 Chr6:125621440、 Chr7: 11038084、 Chrl8: 17003789 、 Chrl4:116935487、 Chrl6: 19488240、 Chr3: 114023516、 Chrl9:44099394、 Chr2:22 972004、 Chrl3:91808887、 Chr9:14111525、 Chrl :4453057, Chrl8:53692623、 ChrlO :95539647、 Chrl4— random:10699516、 Chr5:46746383、 Chr2:120491191、 Chr2:1492 87485 ( rchrjの後の数字又は記号は染色体番号を表し、コロンの後の数字はその染 色体上の位置を表わす。）。
(7)メチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域のメチルイ匕状況の測定を、下 記 a群に記載された配列番号の組み合わせによって表されるプライマーセットを用い たリアルタイム PCR法によって行なうことを特徴とする（6)に記載の細胞の同定方法、 a群：配列番号 1と 2、配列番号 3と 4、配列番号 5と 6、配列番号 7と 8、配列番号 9と 1 0、配列番号 11と 12、配列番号 13と 14、配列番号 15と 16、配列番号 17と 18、配列 番号 19と 20、酉己歹 IJ番号 21と 22、酉己歹 U番号 23と 24、酉己歹 U番号 25と 26、酉己歹 U番号 27 と 28、酉己歹 IJ番号 29と 30、酉己歹 IJ番号 31と 32、酉己歹 U番号 33と 34、酉己歹 U番号 35と 36、 配列番号 37と 38、配列番号 39と 40、配列番号 41と 42、配列番号 43と 44、配列番 号 45と 46、酉己歹 IJ番号 47と 48、酉己歹 U番号 49と 50、酉己歹 U番号 51と 52、酉己歹 U番号 53と 54、酉己歹 IJ番号 55と 56、酉己歹 IJ番号 57と 58、酉己歹 U番号 59と 60、酉己歹 U番号 61と 62、酉己 列番号 63と 64、配列番号 65と 66、配列番号 67と 68、配列番号 69と 70、配列番号 71と 72、酉己歹 IJ番号 73と 74、酉己歹 U番号 75と 76、酉己歹 U番号 77と 78、酉己歹 IJ番号 79と 80 、酉己歹 U番号 81と 82、酉己歹 IJ番号 83と 84、酉己歹 U番号 85と 86、酉己歹 U番号 87と 88、酉己歹 IJ 番号 89と 90、酉己歹 IJ番号 91と 92、酉己歹 U番号 93と 94、酉己歹 U番号 95と 96、酉己歹 U番号 97 と 98、配列番号 99と 100、配列番号 101と 102、配列番号 103と 104、配列番号 10 5と 106、酉己歹 IJ番号 107と 108、酉己歹 IJ番号 109と 110、酉己歹 IJ番号 111と 112、酉己歹 IJ番 号 113と 114、酉己歹 IJ番号 115と 116、酉己歹 IJ番号 117と 118、酉己歹 IJ番号 119と 120、酉己 歹 U番号 121と 122、酉己歹 IJ番号 123と 124、酉己歹 IJ番号 125と 126、酉己歹 IJ番号 127と 128 、酉己歹 IJ番号 129と 130、酉己歹 IJ番号 131と 132、酉己歹 IJ番号 133と 134、酉己歹 IJ番号 135と 136、酉己歹 IJ番号 137と 138、酉己歹 IJ番号 139と 140、酉己歹 IJ番号 141と 142、酉己歹 IJ番号 1 43と 144、配列番号 145と 146、配列番号 147と 148、配列番号 149と 150、配列番 号 151と 152、酉己歹 IJ番号 153と 154、酉己歹 IJ番号 155と 156、酉己歹 IJ番号 157と 158、酉己 歹 U番号 159と 160、酉己歹 IJ番号 161と 162、酉己歹 IJ番号 163と 164、酉己歹 IJ番号 165と 166 、酉己歹 IJ番号 167と 168、酉己歹 IJ番号 169と 170、酉己歹 IJ番号 171と 172、酉己歹 IJ番号 173と 174、酉己歹 IJ番号 175と 176、酉己歹 IJ番号 177と 178、酉己歹 IJ番号 179と 180、酉己歹 IJ番号 1 81と 182、配列番号 183と 184、配列番号 185と 186、配列番号 187と 188、配列番 号 189と 190、酉己歹 IJ番号 191と 192、酉己歹 IJ番号 193と 194、酉己歹 IJ番号 195と 196、酉己 歹 U番号 197と 198、酉己歹 IJ番号 199と 200、酉己歹 IJ番号 201と 202、酉己歹 IJ番号 203と 204 、酉己歹 IJ番号 205と 206、酉己歹 IJ番号 207と 208、酉己歹 IJ番号 209と 210、酉己歹 IJ番号 211と 212、酉己歹 IJ番号 213と 214、酉己歹 IJ番号 215と 216、酉己歹 IJ番号 217と 218、酉己歹 IJ番号 2 19と 220、酉己歹 IJ番号 221と 222、酉己歹 IJ番号 223と 224、酉己歹 IJ番号 225と 226、酉己歹 IJ番 号 227と 228、酉己歹 IJ番号 229と 230、酉己歹 IJ番号 231と 232、酉己歹 IJ番号 233と 234、酉己 歹 U番号 235と 236、酉己歹 IJ番号 237と 238、酉己歹 IJ番号 239と 240、酉己歹 IJ番号 241と 242 、配列番号 243と 244、配列番号 245と 246、配列番号 247と 248、配列番号 249と 250、酉己歹 IJ番号 251と 252、酉己歹 IJ番号 253と 254、酉己歹 IJ番号 255と 256、酉己歹 IJ番号 2 57と 258、酉己歹 IJ番号 259と 260、酉己歹 IJ番号 261と 262、酉己歹 IJ番号 263と 264、酉己歹 IJ番 号 265と 266、酉己歹 IJ番号 267と 268、酉己歹 IJ番号 269と 270、酉己歹 IJ番号 271と 272、酉己 歹 U番号 273と 274、酉己歹 IJ番号 275と 276、酉己歹 IJ番号 277と 278、酉己歹 IJ番号 279と 280 、酉己歹 IJ番号 281と 282、酉己歹 IJ番号 283と 284、酉己歹 IJ番号 285と 286、酉己歹 IJ番号 287と 288、酉己歹 IJ番号 289と 290、酉己歹 IJ番号 291と 292、酉己歹 IJ番号 293と 294、酉己歹 IJ番号 2 95と 296、酉己歹 IJ番号 297と 298、酉己歹 IJ番号 299と 300、酉己歹 IJ番号 301と 302、酉己歹 IJ番 号 303と 304、酉己歹 IJ番号 305と 306、酉己歹 IJ番号 307と 308、酉己歹 IJ番号 309と 310、酉己 歹 U番号 311と 312、酉己歹 IJ番号 313と 314、酉己歹 IJ番号 315と 316、酉己歹 IJ番号 317と 318 、酉己歹 IJ番号 319と 320、酉己歹 IJ番号 321と 322、酉己歹 IJ番号 323と 324、酉己歹 IJ番号 325と 326、酉己歹 IJ番号 327と 328、酉己歹 IJ番号 329と 330、酉己歹 IJ番号 331と 332、酉己歹 IJ番号 3 33と 334、酉己歹 IJ番号 335と 336、酉己歹 IJ番号 337と 338、酉己歹 IJ番号 339と 340、酉己歹 IJ番 号 341と 342、酉己歹 IJ番号 343と 344、酉己歹 IJ番号 345と 346、酉己歹 IJ番号 347と 348、酉己 歹 U番号 349と 350、酉己歹 IJ番号 351と 352、酉己歹 IJ番号 353と 354、酉己歹 IJ番号 355と 356 、酉己歹 IJ番号 357と 358、酉己歹 IJ番号 359と 360、酉己歹 IJ番号 361と 362、酉己歹 IJ番号 363と 364、酉己歹 IJ番号 365と 366、酉己歹 IJ番号 367と 368、酉己歹 IJ番号 369と 370、酉己歹 IJ番号 3 71と 372、酉己歹 IJ番号 373と 374、酉己歹 IJ番号 375と 376、酉己歹 IJ番号 377と 378、酉己歹 IJ番 号 379と 380、酉己歹 IJ番号 381と 382、酉己歹 IJ番号 383と 384、酉己歹 IJ番号 385と 386、酉己 歹 U番号 387と 388、酉己歹 IJ番号 389と 390、酉己歹 IJ番号 391と 392、酉己歹 IJ番号 393と 394 、酉己歹 IJ番号 395と 396、酉己歹 IJ番号 397と 398、酉己歹 IJ番号 399と 400、酉己歹 IJ番号 401と 402、酉己歹 IJ番号 403と 404、酉己歹 IJ番号 405と 406、酉己歹 IJ番号 407と 408、酉己歹 IJ番号 4 09と 410、酉己歹 IJ番号 411と 412、酉己歹 IJ番号 413と 414、酉己歹 IJ番号 415と 416、酉己歹 IJ番 号 417と 418、酉己歹 IJ番号 419と 420、酉己歹 IJ番号 421と 422、酉己歹 IJ番号 423と 424、酉己 歹 U番号 425と 426、酉己歹 IJ番号 427と 428、酉己歹 IJ番号 429と 430、酉己歹 IJ番号 431と 432 、酉己歹 IJ番号 433と 434、酉己歹 IJ番号 435と 436、酉己歹 IJ番号 437と 438、酉己歹 IJ番号 439と 440、酉己歹 IJ番号 441と 442、酉己歹 IJ番号 443と 444、酉己歹 IJ番号 445と 446。
[0019] (8)メチル化感受性制限酵素が、 Hpallであることを特徴とする（1)又は（2)に記載の 細胞の同定方法。
[0020] (9)同定しょうとする細胞がヒト細胞であり、メチル化感受性制限酵素の認識部位を 含む領域が、下記の F群に記載されたヒトのゲノム DNA上の部位を含む領域であるこ とを特徴とする（1)、 （2)、又は（8)に記載の細胞の同定方法、 F群: Chrl6:9361629、 Chr7:115733903若しくは 115733915、 Chrl0:104406914、 Chr4— random:34125、 Chr4: 152378551、 Chr6:160361011若しくは 160361078、 Chr21:44203879, Chrl: 17064077 、 Chr21:32572930若しくは 32572937、 Chr6:30018279、 Chrl5:61269020若しくは 6126 9026、 Chrl :44552339、 Chr6:170515044、 Chrl 1:65895290、 Chrl 1:12240503、 Chrl: 181241380、 Chrl :46663373、 Chr20:931109、 Chrll:71817692、 Chrl0:44189121若し くは 44189127、 Chrl9:1948330、 Chrl:18553323、 Chr4: 129009382、 Chr2:211166961 、 ChrX:19121661、 Chr20:36789818、 Chr9:137016164、 ChrX:152757752若しくは 152 757759、 Chrl0:105334492、 Chr8:31617700、 Chr6: 109091470、 Chrl2:113572392, Chrl6:71649184、 Chrl2:52709725, Chrl9: 16548783、 Chrl4:22385098、 ChrX:1191 66342、 Chr9:72209436, Chr6:79844937, Chr7: 115733903若しくは 115733915、 Chrl :55306500、 Chrl7:47591789若しくは 47591806、 Chr5: 122463315、 Chrl3:101850567 、 Chr20:24397957 (「Chr」の後の数字又は記号は染色体番号を表し、コロンの後の 数字はその染色体上の位置を表わす。 ) o
[0021] (10)メチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域のメチルイ匕状況の測定を、下 記 f群に記載された配列番号の組み合わせによって表されるプライマーセットを用い たリアルタイム PCR法によって行なうことを特徴とする（9)に記載の細胞の同定方法、 f群：酉己歹 U番号 447と 448、酉己歹 IJ番号 449と 450、酉己歹 IJ番号 451と 452、酉己歹 IJ番号 45 3と 454、酉己歹 IJ番号 455と 456、酉己歹 IJ番号 457と 458、酉己歹 IJ番号 459と 460、酉己歹 IJ番 号 461と 462、酉己歹 IJ番号 463と 464、酉己歹 IJ番号 465と 466、酉己歹 IJ番号 467と 468、酉己 歹 U番号 469と 470、酉己歹 IJ番号 471と 472、酉己歹 IJ番号 473と 474、酉己歹 IJ番号 475と 476 、酉己歹 IJ番号 477と 478、酉己歹 IJ番号 479と 480、酉己歹 IJ番号 481と 482、酉己歹 IJ番号 483と 484、酉己歹 IJ番号 485と 486、酉己歹 IJ番号 487と 488、酉己歹 IJ番号 489と 490、酉己歹 IJ番号 4 91と 492、酉己歹 IJ番号 493と 494、酉己歹 IJ番号 495と 496、酉己歹 IJ番号 497と 498、酉己歹 IJ番 号 499と 500、酉己歹 IJ番号 501と 502、酉己歹 IJ番号 503と 504、酉己歹 IJ番号 505と 506、酉己 歹 U番号 507と 508、酉己歹 IJ番号 509と 510、酉己歹 IJ番号 511と 512、酉己歹 IJ番号 513と 514 、酉己歹 IJ番号 515と 516、酉己歹 IJ番号 517と 518、酉己歹 IJ番号 519と 520、酉己歹 IJ番号 521と 522、酉己歹 IJ番号 523と 524、酉己歹 IJ番号 525と 526、酉己歹 IJ番号 527と 528、酉己歹 IJ番号 5 29と 530、酉己歹 IJ番号 531と 532、酉己歹 IJ番号 533と 534、酉己歹 IJ番号 535と 536。
[0022] (11)細胞を同定するためのキットであって、細胞を同定しょうとする生物において、 下記の E群に記載されたマウスのゲノム DNA上の部位に対応する部位を含む領域を 増幅することのできるプライマーセットを含むことを特徴とする細胞同定キット、 E群: C hr8:121718239、 Chrl0:40268206、 Chr7:40434319、 Chr2: 168434887、 Chrl7:133772 55、 Chr4: 11505437、 Chr7:23275835, Chrl0:81558075、 Chr2:25510660、 ChrUn:645 25443、 Chr5:149198213、 Chrl3:23258680、 Chr8:31681160、 Chr5:118832953、 Chr8 :69313165、 Chrl5:103071181、 Chr5: 114999783、 Chr4: 105344669、 Chrl0:85928951 、 Chr3:114023516 (「Chr」の後の数字又は記号は染色体番号を表し、コロンの後の 数字はその染色体上の位置を表わす。 ) o
[0023] (12)下記 e群に記載された配列番号の組み合わせによって表されるプライマーセッ トを含むことを特徴とする（11)に記載の細胞同定キット、 e群:配列番号 71と 72、配 歹 U番号 99と 100、酉己歹 IJ番号 111と 112、酉己歹 IJ番号 119と 120、酉己歹 IJ番号 141と 142、 酉己歹 U番号 167と 168、酉己歹 IJ番号 199と 200、酉己歹 IJ番号 213と 214、酉己歹 IJ番号 231と 2 32、酉己歹 IJ番号 253と 254、酉己歹 IJ番号 275と 276、酉己歹 IJ番号 285と 286、酉己歹 IJ番号 29 1と 292、酉己歹 IJ番号 295と 296、酉己歹 IJ番号 305と 306、酉己歹 IJ番号 323と 324、酉己歹 IJ番 号 343と 344、酉己歹 IJ番号 393と 394、酉己歹 IJ番号 399と 400、酉己歹 IJ番号 423と 424。
[0024] (13)細胞を同定するためのキットであって、細胞を同定しょうとする生物において、 下記の A群に記載されたマウスのゲノム DNA上の部位力 選択される 50以上の部位 に対応する部位を含む領域を増幅することのできるプライマーセットを含むことを特 徴とする細胞同定キット、 A群： ChrX: 153737739、 Chrl 1:23974565、 Chr4: 150805756 、 Chr8:125819650、 Chrl7:44401746, Chrl:106112977、 Chr6: 137933486、 Chrl6:88 09376、 Chrl5:29789917、 Chrl 1:84598871、 Chr6: 17264675, Chr3:96185168、 Chrll :49465545、 Chrl9:46063101、 Chr5:33885424、 Chr8:47668219、 Chrl2:84079717, C hr4: 103326546、 Chr3:120044619、 Chrl2:66000384、 Chrl0:80417554、 Chrll:96513 323、 Chr4:129012370, Chr8: 122498663、 Chr8: 78509264、 Chr3:85886742、 Chrl 7:1 1408482、 Chrl3:46027430、 Chr7:76723912, Chrl9:44619519、 Chr9:88075903、 Chr 10:78398276、 Chr8:105978735、 Chr5: 114637408、 Chrl4:19865028、 Chr8:12171823 9、 Chrl3:48746725, Chr7:74796742, Chrl:65031809、 Chr7:52936750、 Chr4: 13988 4259、 Chr4:45101184、 ChrX:36432657、 Chr2:92750731, Chr8:83330656、 Chr4:146 644182、 Chrl6:89884169、 Chr8: 104658905、 Chrl7:33102816、 Chrl0:40268206、 C hrl3:42866853、 Chr4:28998320、 Chrl :155453586、 Chrll:83201331、 Chrl4:323365 74、 Chr7:40434319、 Chr9:67043441、 Chr4: 116443668、 Chr8:121664181、 Chr2:168 434887、 Chr3:95483641、 Chr6:127523140、 Chrl4:32448118、 Chrl5:7956800、 Chrl 9:9721804、 Chr6:83693750、 Chrl0:80225872, Chr9: 114526827、 Chr6:116114291、 Chr9:56270240, Chrl7:13377255, Chrl9:4813393、 Chr7:23565628、 Chrl:3457531 6、 Chr7:106207521, Chrl:151841674、 Chrl0:95491636、 Chrl6:16859974、 Chr6:49 350227、 Chr7:10818048、 Chrl4:42557426, Chr7: 115979724, Chrl0:120617583、 C hr4: 11505437、 Chrl :93023446、 Chr7:47738905, Chrl 1:95826461、 Chrl4: 18186366 、 Chr4:114903199、 Chrl4:20196166、 Chr5:66374286、 Chr2:172095255, Chrl 1:778 90507、 Chr4:117093825、 Chr2: 151299843、 Chr2: 86196662、 Chr6:94136966、 Chr7: 95775089、 Chr6:117613722, Chr7:23275835, Chrl:160810726、 Chrl3:24417279, Chr4:87708528, Chrll:115679875、 Chrl4:28957086、 Chr2: 149957601、 Chrl0:815 58075、 Chrl:67331020、 ChrX: 153737740, Chr5:40517610、 Chr8:25775980、 Chr4:l 1249059、 Chr2:158071001、 Chrl2:87004048、 Chr4:83661222、 Chr2:25510660、 Chr 4:22462691、 Chrl 1:95886409、 Chr2: 165860247, Chr7:57532361、 Chrl3:44304760 、 ChrX:68627376, Chrl2:46747475, Chrl :39874007、 Chr4:25102296、 Chr5:111413 041、 ChrUn:64525443、 Chr6:23885534、 Chrl3:54216756、 Chr2:179759981、 ChrlO: 5792605、 Chrl7:44313006、 Chrl0:62042196、 Chr7:75800342, Chrl6:29359640、 C hr9: 107465609、 Chrl6 (random): 11291833、 Chr5:149198213、 Chrl9:46804447, Chr 5:72459426, Chr4: 105344670、 Chr2: 11088454、 Chrl3:23258680、 Chr3:87155781、 Chrl3:69792720, Chr8:31681160、 Chrl0:42304235、 Chr5:118832953、 Chr8: 11987 7706、 Chr8:108001483、 Chr3:8368783、 Chr6:109211761、 Chr8:69313165、 Chrl 1:7 0251059、 Chr8: 120440336、 Chrl5:96527917、 Chr6: 127316378、 Chrl5:57702368、 ChrX:106041129、 Chrl4:46019287、 Chrl9:40841588、 Chrl5:103071181、 Chrl4:18 512073、 Chr5:29507642、 ChrX:68334575、 Chrl2:76993764, ChrX:68334574、 Chr7 :124389371、 Chr2:54362031、 Chrl 1:74894287, Chr8:71647146, Chr5: 114999783、 Chr9:88688368、 Chr8: 106354332、 Chr4:6367964、 ChrUn:65258017、 Chr8: 1257622 82、 Chr9:37087646、 Chr2:155513500、 Chrl4:67062171, Chr7:22966694、 Chrl4:48 957516、 Chrl9:17878685、 ChrX:64029083、 Chrl4:50403225、 Chr6:149831859、 Ch rl3:12606447、 ChrX:32710687, Chrl :63738959、 Chrl4:12363880、 Chrl2:2123051 8、 Chrll:20636114、 Chr9:83305251、 Chr7: 116848543、 Chr9:69414907、 Chr6:1726 4674、 Chr4: 105344669、 Chrl6:22771437, Chr2: 116489694、 Chrl0:85928951、 Chrl 1:92919702、 Chrl6:21039084、 Chrl3:109194553、 Chrl :130566806、 Chr4: 12783301 3、 Chrl0:91054117、 Chr6:125621440、 Chr7: 11038084、 Chrl8:17003789、 Chrl4:ll 6935487、 Chrl6: 19488240、 Chr3:114023516、 Chrl9:44099394、 Chr2:22972004, C hrl3:91808887、 Chr9:14111525、 Chrl :4453057, Chrl8:53692623、 Chrl0:95539647 、 Chrl4— random: 10699516、 Chr5:46746383、 Chr2:120491191、 Chr2:149287485 (「C hr」の後の数字又は記号は染色体番号を表し、コロンの後の数字はその染色体上の 位置を表わす。）。
( 14)下記 a群に記載された配列番号の組み合わせによって表されるプライマーセット 力も選ばれる 50種以上のプライマーセットを含むことを特徴とする（13)に記載の細 胞同定キット、 a群:配列番号 1と 2、配列番号 3と 4、配列番号 5と 6、配列番号 7と 8、 配列番号 9と 10、配列番号 11と 12、配列番号 13と 14、配列番号 15と 16、配列番号 17と 18、酉己歹 IJ番号 19と 20、酉己歹 IJ番号 21と 22、酉己歹 U番号 23と 24、酉己歹 U番号 25と 26 、酉己歹 IJ番号 27と 28、酉己歹 IJ番号 29と 30、酉己歹 U番号 31と 32、酉己歹 U番号 33と 34、酉己歹 IJ 番号 35と 36、酉己歹 IJ番号 37と 38、酉己歹 U番号 39と 40、酉己歹 U番号 41と 42、酉己歹 U番号 43 と 44、酉己歹 IJ番号 45と 46、酉己歹 IJ番号 47と 48、酉己歹 U番号 49と 50、酉己歹 U番号 51と 52、 配列番号 53と 54、配列番号 55と 56、配列番号 57と 58、配列番号 59と 60、配列番 号 61と 62、酉己歹 IJ番号 63と 64、酉己歹 IJ番号 65と 66、酉己歹 U番号 67と 68、酉己歹 IJ番号 69と 70、酉己歹 IJ番号 71と 72、酉己歹 IJ番号 73と 74、酉己歹 U番号 75と 76、酉己歹 U番号 77と 78、酉己 列番号 79と 80、配列番号 81と 82、配列番号 83と 84、配列番号 85と 86、配列番号 87と 88、酉己歹 IJ番号 89と 90、酉己歹 U番号 91と 92、酉己歹 U番号 93と 94、酉己歹 IJ番号 95と 96 、配列番号 97と 98、配列番号 99と 100、配列番号 101と 102、配列番号 103と 104 、配列番号 105と 106、配列番号 107と 108、配列番号 109と 110、配列番号 111と 112、酉己歹 IJ番号 113と 114、酉己歹 IJ番号 1 15と 116、酉己歹 IJ番号 117と 118、酉己歹 IJ番号 1 19と 120、酉己歹 IJ番号 121と 122、酉己歹 IJ番号 123と 124、酉己歹 IJ番号 125と 126、酉己歹 IJ番 号 127と 128、酉己歹 IJ番号 129と 130、酉己歹 IJ番号 131と 132、酉己歹 IJ番号 133と 134、酉己 歹 U番号 135と 136、酉己歹 IJ番号 137と 138、酉己歹 IJ番号 139と 140、酉己歹 IJ番号 141と 142 、配列番号 143と 144、配列番号 145と 146、配列番号 147と 148、配列番号 149と 150、酉己歹 IJ番号 151と 152、酉己歹 IJ番号 153と 154、酉己歹 IJ番号 155と 156、酉己歹 IJ番号 1 57と 158、酉己歹 IJ番号 159と 160、酉己歹 IJ番号 161と 162、酉己歹 IJ番号 163と 164、酉己歹 IJ番 号 165と 166、酉己歹 IJ番号 167と 168、酉己歹 IJ番号 169と 170、酉己歹 IJ番号 171と 172、酉己 歹 U番号 173と 174、酉己歹 IJ番号 175と 176、酉己歹 IJ番号 177と 178、酉己歹 IJ番号 179と 180 、配列番号 181と 182、配列番号 183と 184、配列番号 185と 186、配列番号 187と 188、酉己歹 IJ番号 189と 190、酉己歹 IJ番号 191と 192、酉己歹 IJ番号 193と 194、酉己歹 IJ番号 1 95と 196、酉己歹 IJ番号 197と 198、酉己歹 IJ番号 199と 200、酉己歹 IJ番号 201と 202、酉己歹 IJ番 号 203と 204、酉己歹 IJ番号 205と 206、酉己歹 IJ番号 207と 208、酉己歹 IJ番号 209と 210、酉己 歹 U番号 211と 212、酉己歹 IJ番号 213と 214、酉己歹 IJ番号 215と 216、酉己歹 IJ番号 217と 218 、酉己歹 IJ番号 219と 220、酉己歹 IJ番号 221と 222、酉己歹 IJ番号 223と 224、酉己歹 IJ番号 225と 226、酉己歹 IJ番号 227と 228、酉己歹 IJ番号 229と 230、酉己歹 IJ番号 231と 232、酉己歹 IJ番号 2 33と 234、酉己歹 IJ番号 235と 236、酉己歹 IJ番号 237と 238、酉己歹 IJ番号 239と 240、酉己歹 IJ番 号 241と 242、酉己歹 IJ番号 243と 244、酉己歹 IJ番号 245と 246、酉己歹 IJ番号 247と 248、酉己 歹 U番号 249と 250、酉己歹 IJ番号 251と 252、酉己歹 IJ番号 253と 254、酉己歹 IJ番号 255と 256 、酉己歹 IJ番号 257と 258、酉己歹 IJ番号 259と 260、酉己歹 IJ番号 261と 262、酉己歹 IJ番号 263と 264、酉己歹 IJ番号 265と 266、酉己歹 IJ番号 267と 268、酉己歹 IJ番号 269と 270、酉己歹 IJ番号 2 71と 272、酉己歹 IJ番号 273と 274、酉己歹 IJ番号 275と 276、酉己歹 IJ番号 277と 278、酉己歹 IJ番 号 279と 280、酉己歹 IJ番号 281と 282、酉己歹 IJ番号 283と 284、酉己歹 IJ番号 285と 286、酉己 歹 U番号 287と 288、酉己歹 IJ番号 289と 290、酉己歹 IJ番号 291と 292、酉己歹 IJ番号 293と 294 、酉己歹 IJ番号 295と 296、酉己歹 IJ番号 297と 298、酉己歹 IJ番号 299と 300、酉己歹 IJ番号 301と 302、酉己歹 IJ番号 303と 304、酉己歹 IJ番号 305と 306、酉己歹 IJ番号 307と 308、酉己歹 IJ番号 3 09と 310、酉己歹 IJ番号 311と 312、酉己歹 IJ番号 313と 314、酉己歹 IJ番号 315と 316、酉己歹 IJ番 号 317と 318、酉己歹 IJ番号 319と 320、酉己歹 IJ番号 321と 322、酉己歹 IJ番号 323と 324、酉己 歹 U番号 325と 326、酉己歹 IJ番号 327と 328、酉己歹 IJ番号 329と 330、酉己歹 IJ番号 331と 332 、酉己歹 IJ番号 333と 334、酉己歹 IJ番号 335と 336、酉己歹 IJ番号 337と 338、酉己歹 IJ番号 339と 340、配列番号 341と 342、配列番号 343と 344、配列番号 345と 346、配列番号 3 47と 348、酉己歹 IJ番号 349と 350、酉己歹 IJ番号 351と 352、酉己歹 IJ番号 353と 354、酉己歹 IJ番 号 355と 356、酉己歹 IJ番号 357と 358、酉己歹 IJ番号 359と 360、酉己歹 IJ番号 361と 362、酉己 歹 U番号 363と 364、酉己歹 IJ番号 365と 366、酉己歹 IJ番号 367と 368、酉己歹 IJ番号 369と 370 、酉己歹 IJ番号 371と 372、酉己歹 IJ番号 373と 374、酉己歹 IJ番号 375と 376、酉己歹 IJ番号 377と 378、酉己歹 IJ番号 379と 380、酉己歹 IJ番号 381と 382、酉己歹 IJ番号 383と 384、酉己歹 IJ番号 3 85と 386、酉己歹 IJ番号 387と 388、酉己歹 IJ番号 389と 390、酉己歹 IJ番号 391と 392、酉己歹 IJ番 号 393と 394、酉己歹 IJ番号 395と 396、酉己歹 IJ番号 397と 398、酉己歹 IJ番号 399と 400、酉己 歹 U番号 401と 402、酉己歹 IJ番号 403と 404、酉己歹 IJ番号 405と 406、酉己歹 IJ番号 407と 408 、酉己歹 IJ番号 409と 410、酉己歹 IJ番号 411と 412、酉己歹 IJ番号 413と 414、酉己歹 IJ番号 415と 416、酉己歹 IJ番号 417と 418、酉己歹 IJ番号 419と 420、酉己歹 IJ番号 421と 422、酉己歹 IJ番号 4 23と 424、酉己歹 IJ番号 425と 426、酉己歹 IJ番号 427と 428、酉己歹 IJ番号 429と 430、酉己歹 IJ番 号 431と 432、酉己歹 IJ番号 433と 434、酉己歹 IJ番号 435と 436、酉己歹 IJ番号 437と 438、酉己 歹 U番号 439と 440、酉己歹 IJ番号 441と 442、酉己歹 IJ番号 443と 444、酉己歹 IJ番号 445と 446
(15)ヒト細胞を同定するためのキットであって、下記の F群に記載されたヒトのゲノム DNA上の部位を含む領域を増幅することのできるプライマーセットを含むことを特徴と する細胞同定キット、 F群： Chrl6:9361629、 Chr7: 115733903若しくは 115733915、 Chr 10:104406914、 Chr4— random:34125、 Chr4:152378551、 Chr6:160361011若しくは 160 361078、 Chr21:44203879, Chrl:17064077, Chr21:32572930若しくは 32572937、 Chr 6:30018279、 Chrl5:61269020若しくは 61269026、 Chrl :44552339、 Chr6:170515044、 Chrl 1:65895290、 Chrll:12240503、 Chrl:181241380、 Chrl :46663373、 Chr20:9311 09、 Chrll:71817692、 Chrl0:44189121若しくは 44189127、 Chrl9:1948330、 Chrl :18 553323、 Chr4: 129009382、 Chr2:211166961、 ChrX:19121661、 Chr20:36789818、 Ch r9:137016164、 ChrX: 152757752若しくは 152757759、 Chrl0:105334492、 Chr8:31617 700、 Chr6:109091470、 Chrl2:113572392, Chrl6:71649184、 Chrl2:52709725, Chrl 9:16548783、 Chrl4:22385098、 ChrX: 119166342、 Chr9:72209436, Chr6: 79844937, Chr7:115733903若しくは 115733915、 Chrl :55306500、 Chrl7:47591789若しくは 4759 1806、 Chr5: 122463315、 Chrl3:101850567、 Chr20:24397957 (「Chr」の後の数字又 は記号は染色体番号を表し、コロンの後の数字はその染色体上の位置を表わす。 )
[0027] (16)下記 f群に記載された配列番号の組み合わせによって表されるプライマーセット を含むことを特徴とする（15)に記載の細胞同定キット、 f群:配列番号 447と 448、配 歹 IJ番号 449と 450、酉己歹 IJ番号 451と 452、酉己歹 IJ番号 453と 454、酉己歹 IJ番号 455と 456 、酉己歹 IJ番号 457と 458、酉己歹 IJ番号 459と 460、酉己歹 IJ番号 461と 462、酉己歹 IJ番号 463と 464、酉己歹 IJ番号 465と 466、酉己歹 IJ番号 467と 468、酉己歹 IJ番号 469と 470、酉己歹 IJ番号 4 71と 472、酉己歹 IJ番号 473と 474、酉己歹 IJ番号 475と 476、酉己歹 IJ番号 477と 478、酉己歹 IJ番 号 479と 480、酉己歹 IJ番号 481と 482、酉己歹 IJ番号 483と 484、酉己歹 IJ番号 485と 486、酉己 歹 U番号 487と 488、酉己歹 IJ番号 489と 490、酉己歹 IJ番号 491と 492、酉己歹 IJ番号 493と 494 、酉己歹 IJ番号 495と 496、酉己歹 IJ番号 497と 498、酉己歹 IJ番号 499と 500、酉己歹 IJ番号 501と 502、酉己歹 IJ番号 503と 504、酉己歹 IJ番号 505と 506、酉己歹 IJ番号 507と 508、酉己歹 IJ番号 5 09と 510、酉己歹 IJ番号 511と 512、酉己歹 IJ番号 513と 514、酉己歹 IJ番号 515と 516、酉己歹 IJ番 号 517と 518、酉己歹 IJ番号 519と 520、酉己歹 IJ番号 521と 522、酉己歹 IJ番号 523と 524、酉己 歹 U番号 525と 526、酉己歹 IJ番号 527と 528、酉己歹 IJ番号 529と 530、酉己歹 IJ番号 531と 532 、酉己歹 IJ番号 533と 534、酉己歹 IJ番号 535と 536。
[0028] 哺乳類ゲノム DNAに唯一存在する修飾様式は、 CpGジヌクレオチド配列にある C ( シトシン)の第 5位に起こるメチル基による修飾である。全 CpGのうちそのほとんどは発 生の一時期を除き、すべての細胞において生涯メチルイ匕されている。し力しこの生涯 高メチルイ匕状態で維持される領域は、ほとんどが非遺伝子領域であり、繰り返し配列 に存在する。
[0029] 一方多くの CpGアイランドと呼ばれる CpGの密な領域は、生存に必須な遺伝子群、 ハウスキーピング遺伝子に存在し、これらの遺伝子群においては、すべての細胞に おいて低メチルイ匕である。すなわちゲノムのほとんどを占める反復配列を含む非コー ド領域とハウスキーピング遺伝子領域のメチルイ匕の状況は細胞によってほとんど異な らない。故に無作為にゲノムの領域を取り出し、その領域の DNAメチル化、非メチル 化の状況を解析しても、すべての細胞において同じパターンを呈すと考えられる。す なわちゲノムの多くを占める繰返し配列中の CpGにあるシトシンと、数多くの遺伝子か ら構成されるハウスキーピング遺伝子の転写制御領域にある CpGアイランド中のシト シンは細胞の種類に応じたメチルイ匕状況を持たな 、。故にゲノム DNAのシトシンのメ チルイ匕状態をランダムに選択し、その状況を解析しても極く限られた領域のみが細胞 ごとによって異なっているのみであり、細胞の種類の同定に用いるゲノム領域を同定 することは困難である。
[0030] RLGS法によりゲノム DNAのメチルイ匕状況を解析でき、それら力もなるパターンを解 析することにより細胞の種類を同定できる力 それはメチル化感受性のある Notl制限 酵素配列の多くは、 CpGアイランド、もしくはその近傍に存在し、それらは遺伝子また は遺伝子発現制御領域の近傍にあり、さらに一度に数千ケ所の状況を解析できるた めである。しかし RLGS法においては、各々のスポットがゲノムのいずれの位置にある のかにつ 、ては、部分的な情報し力示して 、な 、。
[0031] その理由は RLGS法に提示されているスポットの遺伝子情報を得ることが困難なた めである。 RLGS法のスポットをクローユングする方法としては、例えばポジショナルク ローニング法、 Notlトラッパ一法、 viRLGS情報を元にしたポジショナルクローニング法 などがある。し力しいずれの方法に従っても遺伝子の単離は困難である。
本発明の本質の一つは、細胞の同定に必要な、 RLGS法では得ることが困難であつ たメチルイ匕状況が変化するゲノム DNAの遺伝子情報を提供することにある。
[0032] ゲノム DNAの特定のサイトのメチル化情報は、メチル化、非メチル化の 2種類である 。ほ乳類の細胞は 2倍体であるので、メチル化:メチル化、メチル化:非メチル化、非メ チル化:非メチルイ匕の 3種類の情報を与えることが出来る。メチル化状況で表すと、 10 0%、 50%、 0%となる。さらに細胞集団である組織を解析すると、組織は複数の異なる細 胞カもなる集団であるため、種類ごとに異なるメチルイ匕情報を持っているため、組織 を用いてゲノムの特定のサイトのメチルイ匕状況を調べる場合には、その状況は 0%から 100%の間の 、ずれの値をも持ちうる。つまりゲノム DNAのメチルイ匕状況を指標とする ためには、メチルイ匕の状態を定量的に示す必要がある。
[0033] 故に、本発明は、細胞の同定に必要な各々のゲノム領域のメチルイ匕状況を、定量 的に測定する方法を提供する。
[0034] 本発明の実施例においては、定量的な測定方法としてメチル化感受性リアルタイム PCR法による結果を示した。 DNAメチルイ匕状況が変化する領域の PCRには多くの困 難が存在する。 DNAのメチル化は CpGジヌクレオチド配列のシトシンに起こる力 Cp G配列の多くはゲノムに局在しており、特に集中して存在する領域を CpGアイランドと 呼ぶ。 CpGアイランドの定義は諸説ある力 C/G含有率が一定量以上 (たとえば 50% 以上)であり、 CpGの頻度が通常観察される頻度より高い (観察 CpG頻度 Z期待 CpG 頻度の値力 以上)配列力 ¾00塩基以上続く領域を 、う。一般に C/Gの含有量が増 加することにより DNAの構造が変化するため、 G/C含量の増加に伴い PCR効率が低 下することが知られて 、る。また CpGアイランドは先に記したように共通の特徴を持つ ため互いに似た配列を持つこととなり、非特異的な PCR反応を誘発しやすい。さらに 特異的な配列を持つプライマーの設計が困難である。このように CpGアイランドの PC Rには多くの困難さがある力 DNAのメチル化状況の変化する領域の多くは CpGアイ ランド、及び CpGアイランドの周辺域に存在する。ゆえに PCRによる解析が非常に困 難な領域である。
[0035] 本発明ではゲノムに散在する 953ケ所のメチル化感受性制限酵素配列に対して PC Rプライマーを設計し、反応を行わせ、メチルイ匕状況を定量的に測定可能な領域とし て 223領域を選択した。
また本発明ではメチル化感受性酵素を利用した PCRによる解析を実施例で示して V、るが、例えば COBRAなどバイサルファイト反応を利用した PCRを利用することも可 能である。
また本発明で開示した領域の配列情報を元に、メチル化感受性マイクロアレイを設 計することも可能であり、それを利用した定量的な解析を行うことも出来る。
[0036] 生体を構成する細胞の種類は 200種類といわれている。発生段階をカ卩えるとさらに 多くの細胞種が生存期間中に生じる。例えば 1力所のゲノムのメチルイ匕状態だけを指 標に解析を行うと、そのメチル化状態は 3種類のみであるから、最大 3種類の細胞分 類が出来るのみである。 2力所では 32= 9種類、 3力所では 27種類、 4力所では 81種 類、 5力所では 243種類の細胞を決めることが原理的には可能である。しかし一般的 には 2倍体のいずれの染色体も同じメチルイ匕状態を示す場合が多いため、 2の階乗 で考える方が妥当と思われる。すなわち最低でも 8力所のメチルイ匕状態の組み合わ せにより、 256種類の細胞を規定できると考えられる。しかしメチル化状況を推定する 方法の精度には限界があり、少数箇所のみではそれを元にした分類方法の高い信 頼性を得ることは統計的に困難である。
[0037] 少数箇所で分類するためには測定の精度を上げる必要がある。測定値の信頼性を あげる唯一の方法は、測定回数を増やすことである力 そのためにはサンプルの量 を回数分増やす必要があり、本発明の本来の目的に外れる。
[0038] 解析箇所が増えた場合、個々の精度の幅のあるデータを組み合わせると、誤差の 階乗となり全く信頼性のおけない結果となるようにも思われる。し力しながらマイクロア レイによる遺伝子発現の統計処理を開発する過程で検討されてきたクラスター解析 を用いることにより、個々の測定値の精度問題の重みが解消される。それは細胞の分 化過程を考えると理解しやす ヽ。
[0039] さらに細胞特異的なメチルイ匕状況は 、くつかの遺伝子が群を形成しながら変化し ているものと考えられる。すなわち細胞の分化には方向性があり、分化の過程は分化 多能性の喪失の過程である。運命づけは特定の群の遺伝子の活性化と不活性化〖こ よる。すなわち細胞系譜上のある特定の細胞群では、一群の遺伝子が不活化、すな わちメチルイ匕され、一群の遺伝子が活性化、すなわち脱メチル化され、さらにその状 況の多くが子孫に受け継がれている。すなわちメチル化状況の変化を共にする一群 の遺伝子が存在しているため、それらを群 (クラスター）として扱うことにより、個々の遺 伝子のメチル化状況の測定誤差から生じる違 、の有意性を確認できることになる。す なわちメチル化状況に基づき細胞を分類するためには、測定誤差を統計処理により 吸収できるに十分な領域の解析データが必要である。
[0040] すなわち本発明では、 223領域のメチル化状況の解析可能な領域について開示す る。
さらに本発明では、細胞特異的な DNAメチルイ匕プロフィールの具体的な解析方法を 提供し、細胞の種類を同定できるのみならず、適切な数値処理を行うことにより、細胞 の発生系譜をも同定することが出来る方法を提供する。このことにより同一組織であ つても正常、異常の判定を行える方法を提供する。
[0041] メチル化状況が解析可能な 223領域のうち、適切な方法によってさらに遺伝子領域 を選択することにより、 223領域のメチル化状況と同等の効果を示す遺伝子領域の組 み合わせを得ることが出来る。ここで適切な方法とは、既に分力 ている組織 '細胞 間でメチルイ匕状況の変動幅を指標に選択する、クラスター解析などにより遺伝子を群 に分け、それらの情報に基づき選択する方法であり、適切な統計解析手法に従うこと により選択を行うことが可能である。
発明の効果
[0042] 哺乳類のゲノム DNAの唯一の修飾機構であるデォキシシチジンのメチルイ匕状況は 、ゲノムのほとんどを占める反復配列を含む非コード領域とハウスキーピング遺伝子 領域において、すべての細胞で同一である。そのため例えば 2種類の異なる形質を 示す細胞の、ゲノム DNAのメチルイ匕度合を比較しても、細胞ごとに異なる領域はごく 一部、 1%以下であり、適切なメチルイ匕度合を比較する方法を用いることなくしては、こ の 1%の違いすら見いだすことは出来ない。最も適切な方法として、 RLGS法があるが、 手技が煩雑であり、多量のサンプル量を用いなければならない制限がある。本発明 の提供する 223領域の遺伝子情報を用いることにより、より簡便化された手技により細 胞の同定に必要なメチルイ匕プロフィールを得ることが可能となる。また本発明が提供 する方法に従えば、 RLGS法よりも少な 、DNAサンプル量で細胞の同定を行うことが 可能となる。さらに定量的なデータを得ることが可能となる。
[0043] 本発明が提供する DNAメチルイ匕プロフィール解析方法に従えば、細胞の同定を行 うことが出来るのみならず、細胞の発生系譜を予測することが可能となる。そのことに より、再生医療分野において、細胞の正常性を正しく判別することが可能となる。また 疾患の診断において、細胞の異常さの度合い、疾患の重篤度の度合いを調べること が可能となる。
図面の簡単な説明
[0044] [図 1]マウス細胞におけるメチルイ匕状況を測定した領域及びその領域を増幅するため に使用したプライマーの配列を示す図（1)。
[図 2]マウス細胞におけるメチルイ匕状況を測定した領域及びその領域を増幅するため に使用したプライマーの配列を示す図（2)。
[図 3]マウス細胞におけるメチルイ匕状況を測定した領域及びその領域を増幅するため に使用したプライマーの配列を示す図（3)。
[図 4]マウス細胞におけるメチルイ匕状況を測定した領域及びその領域を増幅するため に使用したプライマーの配列を示す図（4)。
[図 5]マウス細胞におけるメチルイ匕状況を測定した領域及びその領域を増幅するため に使用したプライマーの配列を示す図（5)。
[図 6]マウス細胞におけるメチルイ匕状況を測定した領域及びその領域を増幅するため に使用したプライマーの配列を示す図（6)。
[図 7]マウス細胞におけるメチルイ匕状況を測定した領域及びその領域を増幅するため に使用したプライマーの配列を示す図（7)。
[図 8]マウス細胞におけるメチルイ匕状況を測定した領域及びその領域を増幅するため に使用したプライマーの配列を示す図（8)。
[図 9]マウスのゲノム DNA上の 223領域のメチルイ匕状況をクラスタリング解析した結果 を示す図。
[図 10]マウスのゲノム DNA上の 223領域から無作為に 50領域を選択し、その 50領域 のメチルイ匕状況をクラスタリング解析した結果を示す図。
[図 11]マウスのゲノム DNA上の 223領域力 メチルイ匕状況の変化率を指標として 93 領域を選択し、その 93領域のメチルイ匕状況をクラスタリング解析した結果を示す図。
[図 12]マウスのゲノム DNA上の 93領域力も性差の影響を軽減するために 72領域を 選択し、その 72領域のメチルイ匕状況をクラスタリング解析した結果を示す図。
[図 13]マウスのゲノム DNA上の 223領域力 メチルイ匕状況の変化率を指標として 50 領域を選択し、その 50領域のメチルイ匕状況をクラスタリング解析した結果を示す図。
[図 14]マウスのゲノム DNA上の 223領域からメチル化状況の変化率を指標として 20 領域を選択し、その 20領域のメチルイ匕状況をクラスタリング解析した結果を示す図。
[図 15]ヒト細胞におけるメチルイ匕状況を測定した領域及びその領域を増幅するため に使用したプライマーの配列を示す図。
[図 16]ヒトのゲノム DNA上の 45領域のメチルイ匕状況をクラスタリング解析した結果を 示す図。
発明を実施するための最良の形態 [0045] 以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細胞の同定方法は、ゲノム DNA上に存在するメチル化感受性制限酵素 の認識部位を含む領域のメチルイ匕状況を測定することを特徴とするものである。ここ で、「メチル化状況」とは、同定しょうとする細胞中に含まれる全ゲノム DNAにおける測 定対象領域カ チルイ匕されている DNAの割合をいう。メチルイ匕状況の測定は、例え ば、リアルタイム PCRによって行なうことができる力 他の手段によって行ってもよい。 メチル化感受性制限酵素としては、例えば、 Notlや Hpallを挙げることができるが、 他にも、 Aatll, Acll, Agel, Ascl, Aval, BmgBI, BsiWI, BspDI, BstBI, Clal, Eagl, Fsel, Fspl, Haell, Hhal, Hpy99I, HpyCH4IV, Kasl, Mlul, Narl, Nael, Nrul, Pmll, Pvul, Rs rll, SacII, Sail, Sfol, SgrAi, Smal, SnaBIなども例示できる。
[0046] 測定対象とする領域は特に限定されないが、マウスの細胞を同定する場合であれ ば、下記 E群に記載した 20の Notl認識部位を各々含む領域を例示することができる 。また、更に数を増やして下記 D群に記載した 50の Notl認識部位を各々含む領域で もよぐ下記 C群に記載した 72の Notl認識部位を各々含む領域でもよぐ下記 B群に 記載した 93の Notl認識部位を各々含む領域でもよい。更に、測定対象とする領域は 、下記 A群に記載した 223の Notl認識部位力も選択される 50以上の部位を各々含 む領域、好ましくは、 100以上の部位を各々含む領域であってもよい。
[0047] マウス以外の生物の細胞を同定する場合は、 A〜E群に記載されているマウスのゲ ノム DNA上の Notl認識部位に対応する部位を選択すればょ 、。マウス以外の生物と しては、例えば、ヒト、ゥシ、ブタなどを挙げることができる。ヒトの細胞を同定する場合 は、下記 F群に記載した 45の Hpall認識部位を各々含む領域を測定対象としてもよ い。
測定対象とする領域の長さは特に限定されないが、メチル化状況をリアルタイム PC R法によって測定する場合は、通常、 100〜2000塩基であり、好適には、 150〜300塩 基である。
[0048] リアルタイム PCRの際に使用するプライマーの配列は特に限定されないが、マウス の細胞を同定する場合であって、下記 E群に記載した 20の Notl認識部位を含む領 域を増幅させる場合には、下記 e群に記載した 20のプライマーセットを使用すること ができる。また、下記 D群に記載した 50の Notl認識部位を含む領域を増幅する場合 は下記 d群に記載した 50のプライマーセット、下記 C群に記載した 72の Notl認識部 位を含む領域を増幅する場合は下記 c群に記載した 72のプライマーセット、下記 B群 に記載した 93の Notl認識部位を含む領域を増幅する場合は下記 b群に記載した 93 のプライマーセットを使用することができる。マウス以外の生物の細胞を同定する場合 は、その生物のゲノム DNAの配列に合わせて、下記 a〜e群に記載したプライマーセ ットの配列を改変したものを使用することができる。ヒトの細胞を同定する場合であつ て、下記 F群に記載した 45の Hpall認識部位を増幅させる場合には、下記 f群に記載 した 45のプライマーセットを使用することができる。
[0049] 以下、 A〜F群、 a〜f群について記載する。なお、 A〜F群中の「Chr」の後の数字 又は記号は染色体番号を表し、コロンの後の数字はその染色体上の位置を表わす。 また、 A群に記載した制限酵素認識部位は、 a群の同じ位置に記載されている配列 番号の組み合わせと対応している。 B群と b群、 C群と c群、 D群と d群、 E群と e群も、 F 群と f群も同様である。
[0050] A群は、 ChrX: 153737739、 Chrl 1:23974565、 Chr4: 150805756、 Chr8: 125819650、 Chrl7:44401746, Chrl:106112977、 Chr6: 137933486、 Chrl6:8809376、 Chrl5:2978 9917、 Chrl 1:84598871、 Chr6:17264675, Chr3:96185168、 Chrl 1:49465545、 Chrl9: 46063101、 Chr5:33885424、 Chr8:47668219、 Chrl2:84079717, Chr4: 103326546、 C hr3:120044619、 Chrl2:66000384、 Chrl0:80417554、 Chrll:96513323、 Chr4: 129012 370、 Chr8: 122498663、 Chr8:78509264、 Chr3: 85886742、 Chrl7:11408482、 Chrl3:4 6027430、 Chr7:76723912, Chrl9:44619519、 Chr9:88075903、 Chrl0:78398276、 Chr 8:105978735、 Chr5: 114637408、 Chrl4:19865028、 Chr8:121718239、 Chrl3:4874672 5、 Chr7:74796742, Chrl:65031809、 Chr7:52936750、 Chr4: 139884259、 Chr4:45101 184、 ChrX:36432657、 Chr2:92750731, Chr8:83330656、 Chr4: 146644182、 Chrl6:89 884169、 Chr8: 104658905、 Chrl7:33102816、 Chrl0:40268206、 Chrl3:42866853、 C hr4:28998320、 Chrl:155453586、 Chrll:83201331、 Chrl4:32336574、 Chr7:4043431 9、 Chr9:67043441、 Chr4: 116443668、 Chr8:121664181、 Chr2: 168434887、 Chr3:954 83641、 Chr6:127523140、 Chrl4:32448118、 Chrl5:7956800、 Chrl9:9721804、 Chr6: 83693750、 Chrl0:80225872, Chr9: 114526827、 Chr6:116114291、 Chr9:56270240, Chrl7:13377255, Chrl9:4813393、 Chr7:23565628、 Chrl:34575316、 Chr7: 1062075 21、 Chrl:151841674、 Chrl0:95491636、 Chrl6: 16859974、 Chr6:49350227, Chr7:10 818048、 Chrl4:42557426, Chr7: 115979724, Chrl0:120617583、 Chr4: 11505437、 C hr 1:93023446, Chr7:47738905, Chrl 1:95826461、 Chrl4:18186366、 Chr4:11490319 9、 Chrl4:20196166、 Chr5:66374286、 Chr2: 172095255, Chrl 1:77890507, Chr4:117 093825、 Chr2: 151299843、 Chr2:86196662、 Chr6:94136966、 Chr7:95775089, Chr6: 117613722, Chr7:23275835, Chrl:160810726、 Chrl3:24417279, Chr4:87708528, Chrll:115679875、 Chrl4:28957086、 Chr2: 149957601、 Chrl0:81558075、 Chrl :673 31020、 ChrX: 153737740, Chr5:40517610、 Chr8:25775980、 Chr4: 11249059、 Chr2:l 58071001、 Chrl2:87004048、 Chr4:83661222、 Chr2:25510660、 Chr4:22462691, Chr 11:95886409、 Chr2: 165860247, Chr7:57532361、 Chrl3:44304760、 ChrX:68627376 、 Chrl2:46747475, Chrl :39874007、 Chr4:25102296、 Chr5:111413041、 ChrUn:6452 5443、 Chr6:23885534、 Chrl3:54216756、 Chr2:179759981、 Chrl0:5792605、 Chrl 7: 44313006、 Chrl0:62042196、 Chr7:75800342, Chrl6:29359640、 Chr9: 107465609、 Chrl6 (random): 11291833、 Chr5:149198213、 Chrl9:46804447, Chr5:72459426, Ch r4: 105344670, Chr2: 11088454、 Chrl3:23258680、 Chr3:87155781、 Chrl3:69792720 ゝ Chr8:31681160、 Chrl0:42304235、 Chr5: 118832953、 Chr8: 119877706, Chr8:1080 01483、 Chr3:8368783、 Chr6:109211761、 Chr8:69313165、 Chrll:70251059、 Chr8:l 20440336、 Chrl5:96527917、 Chr6:127316378、 Chrl5:57702368、 ChrX: 106041129、 Chrl4:46019287、 Chrl9:40841588、 Chrl5:103071181、 Chrl4:18512073、 Chr5:295 07642、 ChrX:68334575、 Chrl2:76993764, ChrX:68334574、 Chr7: 124389371, Chr2 :54362031、 Chrl 1:74894287, Chr8:71647146, Chr5: 114999783、 Chr9:88688368、 C hr8: 106354332、 Chr4:6367964、 ChrUn:65258017、 Chr8:125762282, Chr9:3708764 6、 Chr2:155513500、 Chrl4:67062171, Chr7:22966694、 Chrl4:48957516、 Chrl9:17 878685、 ChrX:64029083、 Chrl4:50403225、 Chr6: 149831859、 Chrl3:12606447、 Ch rX:32710687、 Chrl:63738959、 Chrl4:12363880、 Chrl2:21230518、 Chrll:2063611 4、 Chr9:83305251、 Chr7: 116848543、 Chr9:69414907、 Chr6: 17264674, Chr4: 10534 4669、 Chrl6:22771437, Chr2: 116489694、 Chrl0:85928951、 Chrll:92919702、 Chrl 6:21039084、 Chrl3:109194553、 Chrl :130566806、 Chr4:127833013、 Chrl0:9105411 7、 Chr6:125621440、 Chr7: 11038084、 Chrl8: 17003789、 Chrl4:116935487、 Chrl6:l 9488240、 Chr3:114023516、 Chrl9:44099394、 Chr2:22972004, Chrl3:91808887、 C hr9: 14111525、 Chrl :4453057、 Chrl8:53692623、 Chrl0:95539647、 Chr 14— random :1 0699516、 Chr5:46746383、 Chr2:120491191、 Chr2: 149287485の 223の Notl認識部 位力 なる群である。
B群は、 ChrX:153737739, Chrl 1:23974565、 Chr8:125819650、 Chr6: 137933486、 Chrl6:8809376、 Chrl5:29789917、 Chr6: 17264675, Chrl9:46063101、 Chr5:338854 24、 Chrll:96513323、 Chr3:85886742、 Chrl7: 11408482、 Chrl3:46027430、 Chrl0:7 8398276、 Chr5: 114637408、 Chr8:121718239、 Chr4: 139884259、 Chr4: 146644182、 Chrl6:89884169、 Chrl7:33102816、 Chrl0:40268206、 Chr7:40434319、 Chr9:67043 441、 Chr4: 116443668、 Chrl7:13377255, Chrl9:4813393、 Chrl:34575316、 Chr7:10 6207521、 Chrl:151841674、 Chr6:49350227, Chr7: 10818048、 Chr4: 11505437、 Chrl :93023446、 Chr7:47738905, Chr4:114903199、 Chr2:172095255, Chr2: 151299843、 Chr2:86196662、 Chr7:95775089, Chr6:117613722, Chr7:23275835, Chrll:115679 875、 Chr2: 149957601、 Chrl0:81558075、 Chrl:67331020、 ChrX: 153737740, Chr5:4 0517610、 Chr2:ql58071001、 Chr2:25510660、 Chr4:22462691, Chr2: 165860247, C hr7:57532361、 ChrX:68627376, ChrUn:64525443、 Chrl0:62042196、 Chrl6:293596 40、 Chr5:149198213、 Chrl9:46804447, Chr5:72459426, Chr4: 105344670、 Chrl3:2 3258680、 Chr8:31681160、 Chrl0:42304235、 Chr5: 118832953、 Chr8: 119877706, C hr8:108001483、 Chr3:8368783、 Chr6:109211761、 Chr8:69313165、 Chrl5:57702368 、 ChrX: 106041129、 Chrl9:40841588、 Chrl5:103071181、 Chrl4:18512073、 ChrX:6 8334575、 ChrX:68334574、 Chr8:71647146, Chr5: 114999783、 Chr9:88688368、 Chr 2:155513500、 Chrl4:48957516、 ChrX:64029083、 ChrX:32710687, Chrl4:12363880 、 Chr9:83305251、 Chr6: 17264674, Chr4: 105344669、 Chrl0:85928951、 Chrll:9291 9702、 Chr7: 11038084、 Chrl4:116935487、 Chr3: 114023516、 Chrl8:53692623の 93 の Notl認識部位力 なる群である。 [0052] C群は、 Chr8:125819650、 Chr6: 137933486、 Chrl6:8809376、 Chrl5:29789917、 Ch r6:17264675, Chrl9:46063101、 Chr5:33885424、 Chrll:96513323、 Chr3:85886742 、 Chrl7:11408482、 Chrl3:46027430、 Chrl0:78398276、 Chr5: 114637408、 Chr8:121 718239、 Chr4: 139884259、 Chr4: 146644182、 Chrl6:89884169、 Chrl7:33102816、 C hrl0:40268206、 Chr7:40434319、 Chr9:67043441、 Chr2: 168434887、 Chrl7:1337725 5、 Chrl9:4813393、 Chrl:34575316、 Chr7:106207521, Chrl:151841674、 Chr6:4935 0227、 Chr7:10818048、 Chr4: 11505437、 Chrl :93023446、 Chr7:47738905, Chr2:172 095255、 Chr2:86196662、 Chr7:95775089, Chr6: 117613722、 Chr7:23275835, Chr2: 149957601、 Chrl0:81558075、 Chrl:67331020、 Chr2:25510660、 Chr4:22462691, C hr2: 165860247, Chr7:57532361、 ChrUn:64525443、 Chrl0:62042196、 Chrl6:29359 640、 Chr5:149198213、 Chr5:72459426, Chr4: 105344670、 Chrl3:23258680、 Chr8:3 1681160、 Chrl0:42304235、 Chr5:118832953、 Chr8: 119877706, Chr8:108001483、 Chr3:8368783、 Chr6:109211761、 Chr8:69313165、 Chrl9:40841588、 Chrl5:103071 181、 Chrl4:18512073、 Chr8:71647146, Chr5: 114999783、 Chr4:6367964、 Chr2:155 513500、 Chrl4:48957516、 Chr9:83305251、 Chr4: 105344669、 Chrl0:85928951、 Chr 14:116935487、 Chr3:114023516の 72の Notl認識部位からなる群である。
[0053] D群は、 Chrl5:29789917、 Chrl9:46063101、 Chr5:33885424、 Chrl7: 11408482、 Ch rl3:46027430、 Chr5: 114637408、 Chr8:121718239、 Chr4: 139884259、 Chrl7:331028 16、 Chrl0:40268206、 Chr7:40434319、 Chr9:67043441、 Chr2: 168434887、 Chrl7:13 377255、 Chrl9:4813393、 Chrl:151841674、 Chr7: 10818048、 Chr4: 11505437、 Chr7: 95775089、 Chr6:117613722, Chr7:23275835, Chr2: 149957601、 Chrl0:81558075、 Chr2:25510660、 Chr4:22462691, Chr2: 165860247, ChrUn:64525443、 Chr5: 149198 213、 Chr5:72459426, Chr4: 105344670、 Chrl3:23258680、 Chr8:31681160、 Chrl0:4 2304235、 Chr5:118832953、 Chr8: 119877706, Chr3:8368783、 Chr6:109211761、 Chr 8:69313165、 Chrl9:40841588、 Chrl5:103071181、 Chrl4:18512073、 Chr8:71647146 、 Chr5: 114999783、 Chr4:6367964、 Chr2:155513500、 Chr9:83305251、 Chr4: 105344 669、 Chrl0:85928951、 Chrl4:116935487、 Chr3: 114023516の 50の Notl認識部位か らなる群である。 [0054] E群は、 Chr8:121718239、 Chrl0:40268206、 Chr7:40434319、 Chr2: 168434887、 Ch rl7:13377255, Chr4: 11505437、 Chr7:23275835, Chrl0:81558075、 Chr2:25510660 、 ChrUn:64525443、 Chr5:149198213、 Chrl3:23258680、 Chr8:31681160、 Chr5:1188 32953、 Chr8:69313165、 Chrl5:103071181、 Chr5: 114999783、 Chr4: 105344669、 Chr 10:85928951、 Chr3:114023516の 20の Notl認識部位からなる群である。
[0055] F群は、 Chrl6:9361629、 Chr7:115733903若しくは 115733915、 Chrl0:104406914、 Chr4— random:34125、 Chr4:152378551、 Chr6:160361011若しくは 160361078、 Chr21: 44203879、 Chrl :17064077, Chr21:32572930若しくは 32572937、 Chr6:30018279、 Ch rl5:61269020若しくは 61269026、 Chrl :44552339、 Chr6:170515044、 Chrl 1:6589529 0、 Chrl 1:12240503、 Chrl:181241380、 Chrl :46663373、 Chr20:931109、 Chrll:7181 7692、 Chrl0:44189121若しくは 44189127、 Chrl9:1948330、 Chrl:18553323、 Chr4:l 29009382、 Chr2:211166961、 ChrX:19121661、 Chr20:36789818、 Chr9:137016164、 ChrX:152757752若しくは 152757759、 Chrl0:105334492、 Chr8:31617700、 Chr6:109 091470、 Chrl2:113572392, Chrl6:71649184、 Chrl2:52709725, Chrl9:16548783、 Chrl4:22385098、 ChrX: 119166342、 Chr9:72209436, Chr6: 79844937, Chr7:115733 903若しくは 115733915、 Chrl:55306500、 Chrl7:47591789若しくは 47591806、 Chr5:l 22463315、 Chrl3:101850567、 Chr20:24397957の 45の Hpall認識部位からなる群で ある。
[0056] a群は、配列番号 1と 2、配列番号 3と 4、配列番号 5と 6、配列番号 7と 8、配列番号 9 と 10、配列番号 11と 12、配列番号 13と 14、配列番号 15と 16、配列番号 17と 18、 配列番号 19と 20、配列番号 21と 22、配列番号 23と 24、配列番号 25と 26、配列番 号 27と 28、酉己歹 IJ番号 29と 30、酉己歹 U番号 31と 32、酉己歹 U番号 33と 34、酉己歹 U番号 35と 36、酉己歹 IJ番号 37と 38、酉己歹 IJ番号 39と 40、酉己歹 U番号 41と 42、酉己歹 U番号 43と 44、酉己 列番号 45と 46、配列番号 47と 48、配列番号 49と 50、配列番号 51と 52、配列番号 53と 54、酉己歹 IJ番号 55と 56、酉己歹 U番号 57と 58、酉己歹 U番号 59と 60、酉己歹 IJ番号 61と 62 、酉己歹 IJ番号 63と 64、酉己歹 IJ番号 65と 66、酉己歹 U番号 67と 68、酉己歹 U番号 69と 70、酉己歹 IJ 番号 71と 72、酉己歹 IJ番号 73と 74、酉己歹 U番号 75と 76、酉己歹 U番号 77と 78、酉己歹 U番号 79 と 80、酉己歹 IJ番号 81と 82、酉己歹 IJ番号 83と 84、酉己歹 U番号 85と 86、酉己歹 U番号 87と 88、 配列番号 89と 90、配列番号 91と 92、配列番号 93と 94、配列番号 95と 96、配列番 号 97と 98、配列番号 99と 100、配列番号 101と 102、配列番号 103と 104、配列番 号 105と 106、酉己歹 IJ番号 107と 108、酉己歹 IJ番号 109と 110、酉己歹 IJ番号 111と 112、酉己 歹 U番号 113と 114、酉己歹 IJ番号 115と 116、酉己歹 IJ番号 117と 118、酉己歹 IJ番号 119と 120 、酉己歹 IJ番号 121と 122、酉己歹 IJ番号 123と 124、酉己歹 IJ番号 125と 126、酉己歹 IJ番号 127と 128、酉己歹 IJ番号 129と 130、酉己歹 IJ番号 131と 132、酉己歹 IJ番号 133と 134、酉己歹 IJ番号 1 35と 136、酉己歹 IJ番号 137と 138、酉己歹 IJ番号 139と 140、酉己歹 IJ番号 141と 142、酉己歹 IJ番 号 143と 144、酉己歹 IJ番号 145と 146、酉己歹 IJ番号 147と 148、酉己歹 IJ番号 149と 150、酉己 歹 U番号 151と 152、酉己歹 IJ番号 153と 154、酉己歹 IJ番号 155と 156、酉己歹 IJ番号 157と 158 、配列番号 159と 160、配列番号 161と 162、配列番号 163と 164、配列番号 165と 166、酉己歹 IJ番号 167と 168、酉己歹 IJ番号 169と 170、酉己歹 IJ番号 171と 172、酉己歹 IJ番号 1 73と 174、酉己歹 IJ番号 175と 176、酉己歹 IJ番号 177と 178、酉己歹 IJ番号 179と 180、酉己歹 IJ番 号 181と 182、酉己歹 IJ番号 183と 184、酉己歹 IJ番号 185と 186、酉己歹 IJ番号 187と 188、酉己 歹 U番号 189と 190、酉己歹 IJ番号 191と 192、酉己歹 IJ番号 193と 194、酉己歹 IJ番号 195と 196 、酉己歹 IJ番号 197と 198、酉己歹 IJ番号 199と 200、酉己歹 IJ番号 201と 202、酉己歹 IJ番号 203と 204、酉己歹 IJ番号 205と 206、酉己歹 IJ番号 207と 208、酉己歹 IJ番号 209と 210、酉己歹 IJ番号 2 11と 212、酉己歹 IJ番号 213と 214、酉己歹 IJ番号 215と 216、酉己歹 IJ番号 217と 218、酉己歹 IJ番 号 219と 220、酉己歹 IJ番号 221と 222、酉己歹 IJ番号 223と 224、酉己歹 IJ番号 225と 226、酉己 歹 U番号 227と 228、酉己歹 IJ番号 229と 230、酉己歹 IJ番号 231と 232、酉己歹 IJ番号 233と 234 、酉己歹 IJ番号 235と 236、酉己歹 IJ番号 237と 238、酉己歹 IJ番号 239と 240、酉己歹 IJ番号 241と 242、配列番号 243と 244、配列番号 245と 246、配列番号 247と 248、配列番号 2 49と 250、酉己歹 IJ番号 251と 252、酉己歹 IJ番号 253と 254、酉己歹 IJ番号 255と 256、酉己歹 IJ番 号 257と 258、酉己歹 IJ番号 259と 260、酉己歹 IJ番号 261と 262、酉己歹 IJ番号 263と 264、酉己 歹 U番号 265と 266、酉己歹 IJ番号 267と 268、酉己歹 IJ番号 269と 270、酉己歹 IJ番号 271と 272 、酉己歹 IJ番号 273と 274、酉己歹 IJ番号 275と 276、酉己歹 IJ番号 277と 278、酉己歹 IJ番号 279と 280、酉己歹 IJ番号 281と 282、酉己歹 IJ番号 283と 284、酉己歹 IJ番号 285と 286、酉己歹 IJ番号 2 87と 288、酉己歹 IJ番号 289と 290、酉己歹 IJ番号 291と 292、酉己歹 IJ番号 293と 294、酉己歹 IJ番 号 295と 296、酉己歹 IJ番号 297と 298、酉己歹 IJ番号 299と 300、酉己歹 IJ番号 301と 302、酉己 歹 U番号 303と 304、酉己歹 IJ番号 305と 306、酉己歹 IJ番号 307と 308、酉己歹 IJ番号 309と 310 、酉己歹 IJ番号 311と 312、酉己歹 IJ番号 313と 314、酉己歹 IJ番号 315と 316、酉己歹 IJ番号 317と 318、酉己歹 IJ番号 319と 320、酉己歹 IJ番号 321と 322、酉己歹 IJ番号 323と 324、酉己歹 IJ番号 3 25と 326、酉己歹 IJ番号 327と 328、酉己歹 IJ番号 329と 330、酉己歹 IJ番号 331と 332、酉己歹 IJ番 号 333と 334、酉己歹 IJ番号 335と 336、酉己歹 IJ番号 337と 338、酉己歹 IJ番号 339と 340、酉己 列番号 341と 342、配列番号 343と 344、配列番号 345と 346、配列番号 347と 348 、酉己歹 IJ番号 349と 350、酉己歹 IJ番号 351と 352、酉己歹 IJ番号 353と 354、酉己歹 IJ番号 355と 356、酉己歹 IJ番号 357と 358、酉己歹 IJ番号 359と 360、酉己歹 IJ番号 361と 362、酉己歹 IJ番号 3 63と 364、酉己歹 IJ番号 365と 366、酉己歹 IJ番号 367と 368、酉己歹 IJ番号 369と 370、酉己歹 IJ番 号 371と 372、酉己歹 IJ番号 373と 374、酉己歹 IJ番号 375と 376、酉己歹 IJ番号 377と 378、酉己 歹 U番号 379と 380、酉己歹 IJ番号 381と 382、酉己歹 IJ番号 383と 384、酉己歹 IJ番号 385と 386 、酉己歹 IJ番号 387と 388、酉己歹 IJ番号 389と 390、酉己歹 IJ番号 391と 392、酉己歹 IJ番号 393と 394、酉己歹 IJ番号 395と 396、酉己歹 IJ番号 397と 398、酉己歹 IJ番号 399と 400、酉己歹 IJ番号 4 01と 402、酉己歹 IJ番号 403と 404、酉己歹 IJ番号 405と 406、酉己歹 IJ番号 407と 408、酉己歹 IJ番 号 409と 410、酉己歹 IJ番号 411と 412、酉己歹 IJ番号 413と 414、酉己歹 IJ番号 415と 416、酉己 歹 U番号 417と 418、酉己歹 IJ番号 419と 420、酉己歹 IJ番号 421と 422、酉己歹 IJ番号 423と 424 、酉己歹 IJ番号 425と 426、酉己歹 IJ番号 427と 428、酉己歹 IJ番号 429と 430、酉己歹 IJ番号 431と 432、酉己歹 IJ番号 433と 434、酉己歹 IJ番号 435と 436、酉己歹 IJ番号 437と 438、酉己歹 IJ番号 4 39と 440、酉己歹 IJ番号 441と 442、酉己歹 IJ番号 443と 444、酉己歹 IJ番号 445と 446の 223通 りの配列番号の組み合わせ力 なる群である。なお、上述した配列番号に記載され た塩基配列は、図 1〜図 8に基づき作成されたものである。
b群は、配列番号 1と 2、配列番号 3と 4、配列番号 7と 8、配列番号 13と 14、配列番 号 15と 16、配列番号 17と 18、配列番号 21と 22、配列番号 27と 28、配列番号 29と 30、酉己歹 IJ番号 43と 44、酉己歹 IJ番号 51と 52、酉己歹 U番号 53と 54、酉己歹 U番号 55と 56、酉己 列番号 63と 64、配列番号 67と 68、配列番号 71と 72、配列番号 81と 82、配列番号 91と 92、酉己歹 IJ番号 93と 94、酉己歹 U番号 97と 98、酉己歹 IJ番号 99と 100、酉己歹 U番号 111と 112、酉己歹 IJ番号 113と 114、酉己歹 IJ番号 115と 116、酉己歹 IJ番号 141と 142、酉己歹 IJ番号 1 43と 144、酉己歹 IJ番号 147と 148、酉己歹 IJ番号 149と 150、酉己歹 IJ番号 151と 152、酉己歹 IJ番 号 157と 158、酉己歹 IJ番号 159と 160、酉己歹 IJ番号 167と 168、酉己歹 IJ番号 169と 170、酉己 歹 U番号 171と 172、酉己歹 IJ番号 177と 178、酉己歹 IJ番号 183と 184、酉己歹 IJ番号 189と 190 、酉己歹 IJ番号 191と 192、酉己歹 IJ番号 195と 196、酉己歹 IJ番号 197と 198、酉己歹 IJ番号 199と 200、酉己歹 IJ番号 207と 208、酉己歹 IJ番号 211と 212、酉己歹 IJ番号 213と 214、酉己歹 IJ番号 2 15と 216、酉己歹 IJ番号 217と 218、酉己歹 IJ番号 219と 220、酉己歹 IJ番号 225と 226、酉己歹 IJ番 号 231と 232、酉己歹 IJ番号 233と 234、酉己歹 IJ番号 237と 238、酉己歹 IJ番号 239と 240、酉己 歹 U番号 243と 244、酉己歹 IJ番号 253と 254、酉己歹 IJ番号 265と 266、酉己歹 IJ番号 269と 270 、酉己歹 IJ番号 275と 276、酉己歹 IJ番号 277と 278、酉己歹 IJ番号 279と 280、酉己歹 IJ番号 281と 282、酉己歹 IJ番号 285と 286、酉己歹 IJ番号 291と 292、酉己歹 IJ番号 293と 294、酉己歹 IJ番号 2 95と 296、酉己歹 IJ番号 297と 298、酉己歹 IJ番号 299と 300、酉己歹 IJ番号 301と 302、酉己歹 IJ番 号 303と 304、酉己歹 IJ番号 305と 306、酉己歹 IJ番号 315と 316、酉己歹 IJ番号 317と 318、酉己 歹 U番号 321と 322、酉己歹 IJ番号 323と 324、酉己歹 IJ番号 325と 326、酉己歹 IJ番号 329と 330 、配列番号 333と 334、配列番号 341と 342、配列番号 343と 344、配列番号 345と 346、酉己歹 IJ番号 357と 358、酉己歹 IJ番号 363と 364、酉己歹 IJ番号 367と 368、酉己歹 IJ番号 3 75と 376、酉己歹 IJ番号 379と 380、酉己歹 IJ番号 385と 386、酉己歹 IJ番号 391と 392、酉己歹 IJ番 号 393と 394、酉己歹 IJ番号 399と 400、酉己歹 IJ番号 401と 402、酉己歹 IJ番号 415と 416、酉己 歹 U番号 419と 420、酉己歹 IJ番号 423と 424、酉己歹 IJ番号 435と 436の 93通りの酉己歹 IJ番号 の組み合わせ力 なる群である。
c群は、配列番号 7と 8、配列番号 13と 14、配列番号 15と 16、配列番号 17と 18、 配列番号 21と 22、配列番号 27と 28、配列番号 29と 30、配列番号 43と 44、配列番 号 51と 52、酉己歹 IJ番号 53と 54、酉己歹 U番号 55と 56、酉己歹 U番号 63と 64、酉己歹 U番号 67と 68、酉己歹 IJ番号 71と 72、酉己歹 IJ番号 81と 82、酉己歹 U番号 91と 92、酉己歹 U番号 93と 94、酉己 歹 U番号 97と 98、酉己歹 IJ番号 99と 100、酉己歹 IJ番号 111と 112、酉己歹 IJ番号 113と 114、酉己 歹 U番号 119と 120、酉己歹 IJ番号 141と 142、酉己歹 IJ番号 143と 144、酉己歹 IJ番号 147と 148 、酉己歹 IJ番号 149と 150、酉己歹 IJ番号 151と 152、酉己歹 IJ番号 157と 158、酉己歹 IJ番号 159と 160、酉己歹 IJ番号 167と 168、酉己歹 IJ番号 169と 170、酉己歹 IJ番号 171と 172、酉己歹 IJ番号 1 83と 184、酉己歹 IJ番号 191と 192、酉己歹 IJ番号 195と 196、酉己歹 IJ番号 197と 198、酉己歹 IJ番 号 199と 200、酉己歹 IJ番号 211と 212、酉己歹 IJ番号 213と 214、酉己歹 IJ番号 215と 216、酉己 歹 U番号 231と 232、酉己歹 IJ番号 233と 234、酉己歹 IJ番号 237と 238、酉己歹 IJ番号 239と 240 、酉己歹 IJ番号 253と 254、酉己歹 IJ番号 265と 266、酉己歹 IJ番号 269と 270、酉己歹 IJ番号 275と 276、酉己歹 IJ番号 279と 280、酉己歹 IJ番号 281と 282、酉己歹 IJ番号 285と 286、酉己歹 IJ番号 2 91と 292、酉己歹 IJ番号 293と 294、酉己歹 IJ番号 295と 296、酉己歹 IJ番号 297と 298、酉己歹 IJ番 号 299と 300、酉己歹 IJ番号 301と 302、酉己歹 IJ番号 303と 304、酉己歹 IJ番号 305と 306、酉己 歹 U番号 321と 322、酉己歹 IJ番号 323と 324、酉己歹 IJ番号 325と 326、酉己歹 IJ番号 341と 342 、酉己歹 IJ番号 343と 344、酉己歹 IJ番号 349と 350、酉己歹 IJ番号 357と 358、酉己歹 IJ番号 363と 364、酉己歹 IJ番号 385と 386、酉己歹 IJ番号 393と 394、酉己歹 IJ番号 399と 400、酉己歹 IJ番号 4 19と 420、配列番号 423と 424の 72通りの配列番号の組み合わせからなる群である
[0059] d群は、配列番号 17と 18、配列番号 27と 28、配列番号 29と 30、配列番号 53と 54 、酉己歹 IJ番号 55と 56、酉己歹 IJ番号 67と 68、酉己歹 U番号 71と 72、酉己歹 U番号 81と 82、酉己歹 IJ 番号 97と 98、酉己歹 IJ番号 99と 100、酉己歹 IJ番号 111と 112、酉己歹 IJ番号 113と 114、酉己歹 IJ 番号 119と 120、酉己歹 IJ番号 141と 142、酉己歹 IJ番号 143と 144、酉己歹 IJ番号 151と 152、 酉己歹 U番号 159と 160、酉己歹 IJ番号 167と 168、酉己歹 IJ番号 195と 196、酉己歹 IJ番号 197と 1 98、酉己歹 IJ番号 199と 200、酉己歹 IJ番号 211と 212、酉己歹 IJ番号 213と 214、酉己歹 IJ番号 23 1と 232、酉己歹 IJ番号 233と 234、酉己歹 IJ番号 237と 238、酉己歹 IJ番号 253と 254、酉己歹 IJ番 号 275と 276、酉己歹 IJ番号 279と 280、酉己歹 IJ番号 281と 282、酉己歹 IJ番号 285と 286、酉己 歹 U番号 291と 292、酉己歹 IJ番号 293と 294、酉己歹 IJ番号 295と 296、酉己歹 IJ番号 297と 298 、酉己歹 IJ番号 301と 302、酉己歹 IJ番号 303と 304、酉己歹 IJ番号 305と 306、酉己歹 IJ番号 321と 322、酉己歹 IJ番号 323と 324、酉己歹 IJ番号 325と 326、酉己歹 IJ番号 341と 342、酉己歹 IJ番号 3 43と 344、酉己歹 IJ番号 349と 350、酉己歹 IJ番号 357と 358、酉己歹 IJ番号 385と 386、酉己歹 IJ番 号 393と 394、酉己歹 IJ番号 399と 400、酉己歹 IJ番号 419と 420、酉己歹 IJ番号 423と 424の 50 通りの配列番号の組み合わせ力 なる群である。
[0060] e群は、配列番号 71と 72、配列番号 99と 100、配列番号 111と 112、配列番号 11 9と 120、酉己歹 IJ番号 141と 142、酉己歹 IJ番号 167と 168、酉己歹 IJ番号 199と 200、酉己歹 IJ番 号 213と 214、酉己歹 IJ番号 231と 232、酉己歹 IJ番号 253と 254、酉己歹 IJ番号 275と 276、酉己 歹 U番号 285と 286、酉己歹 IJ番号 291と 292、酉己歹 IJ番号 295と 296、酉己歹 IJ番号 305と 306 、酉己歹 IJ番号 323と 324、酉己歹 IJ番号 343と 344、酉己歹 IJ番号 393と 394、酉己歹 IJ番号 399と 400、配列番号 423と 424の 20通りの配列番号の組み合わせからなる群である。
[0061] f群は、酉己歹 IJ番号 447と 448、酉己歹 IJ番号 449と 450、酉己歹 IJ番号 451と 452、酉己歹 IJ番 号 453と 454、酉己歹 IJ番号 455と 456、酉己歹 IJ番号 457と 458、酉己歹 IJ番号 459と 460、酉己 歹 U番号 461と 462、酉己歹 IJ番号 463と 464、酉己歹 IJ番号 465と 466、酉己歹 IJ番号 467と 468 、酉己歹 IJ番号 469と 470、酉己歹 IJ番号 471と 472、酉己歹 IJ番号 473と 474、酉己歹 IJ番号 475と 476、酉己歹 IJ番号 477と 478、酉己歹 IJ番号 479と 480、酉己歹 IJ番号 481と 482、酉己歹 IJ番号 4 83と 484、酉己歹 IJ番号 485と 486、酉己歹 IJ番号 487と 488、酉己歹 IJ番号 489と 490、酉己歹 IJ番 号 491と 492、酉己歹 IJ番号 493と 494、酉己歹 IJ番号 495と 496、酉己歹 IJ番号 497と 498、酉己 歹 U番号 499と 500、酉己歹 IJ番号 501と 502、酉己歹 IJ番号 503と 504、酉己歹 IJ番号 505と 506 、酉己歹 IJ番号 507と 508、酉己歹 IJ番号 509と 510、酉己歹 IJ番号 511と 512、酉己歹 IJ番号 513と 514、酉己歹 IJ番号 515と 516、酉己歹 IJ番号 517と 518、酉己歹 IJ番号 519と 520、酉己歹 IJ番号 5 21と 522、酉己歹 IJ番号 523と 524、酉己歹 IJ番号 525と 526、酉己歹 IJ番号 527と 528、酉己歹 IJ番 号 529と 530、酉己歹 IJ番号 531と 532、酉己歹 IJ番号 533と 534、酉己歹 IJ番号 535と 536の 45 通りの配列番号の組み合わせ力 なる群である。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
実施例
[0062] [実施例 1 ] マウスの胚性幹細胞 (ES細胞）、胚性生殖幹細胞 (EG細胞)の培養
胚性幹細胞株（MS12)、胚性生殖幹細胞（EG細胞： Development. 1994 Nov; 120(1 1):3197-204.)はゥシ胎仔血清を 15%、ペニシリンを 100U/ml、ストレプトマイシンを 100 μ g/ml、非必須アミノ酸を 100 μ Μ、ピルビン酸ナトリウムを lmM、メルカプトエタノー ルを 100 M、グルタミンを 2mMとなるよう添カ卩した DMEM培地で、 37°C、 5%二酸化炭 素存在下で培養を行った。未分化状態を維持するために、後述する方法で分離した 初代胎児線維芽細胞をフィーダ一として用い、 LIF (Leukemia inihibitory factor)を 10 OOU/mlとなるよう添カ卩した。
[0063] フィーダ一細胞を取り除くため、培養細胞をトリプシン/ EDTAで処理し、新規な培養 皿に移した。 25分の静置処理後、 ES細胞のみを含む上清を回収した。次にゼラチン でコートした培養皿に移し、 LIFを含まない上記培養液中で培養することにより、 ES細 胞を分化させた。
[0064] フィーダ一細胞として用いた初代胎児線維芽細胞は以下のようにして分離した。マ ウス胎児 15日胚を解剖し、頭部、内臓、背骨を取り除き、 PBS中で細力べ細断した。遠 心操作（lOOOrpm, 3分）により沈殿を回収し、トリプシン、 EDTA混合液中に再浮遊さ せ、室温で 30分処理した。メッシュでろ過後、円操作にて沈殿を回収した。生細胞数 を検定し、 10%となるようゥシ胎仔血清をカ卩えた DMEM培地にて 3日間培養を続けた。 このようにして得た線維芽細胞を適当量分取し、幹細胞の培養に用いるときまで適当 な保存液中、液体窒素にて凍結保存した。
[0065] [実施例 2] マウスの胎盤栄養膜幹細胞 (TS細胞)の培養
胎盤栄養膜幹細胞 (TS細胞）はゥシ胎仔血清を 20%、ペニシリンを 100U/ml、ストレ プトマイシンを 100 μ g/ml、ピルビン酸ナトリウムを lmM、メルカプトエタノールを 100 μ Μ、グルタミンを 2mMとなるよう添カ卩した RPMI1640培地で、 37°C、 5%二酸化炭素存在 下で培養を行った。未分化状態を維持するために、初代胎児線維芽細胞をフィーダ 一として用い、 FGF- 4を 25ng/ml、へパリンを 1 μ g/mlとなるよう添カ卩した。
[0066] フィーダ一細胞を取り除くため、培養細胞をトリプシン/ EDTAで処理し、新規な培養 皿に移した。 25分の静置処理後、 TS細胞のみを含む上清を回収した。次にゼラチン でコートした培養皿に移し、 FGF-4を含まない上記培養液中で培養することにより、 T S細胞を分化させた。
[0067] [実施例 3] リアルタイム PCRを用いたマウスゲノムの DNAメチル化解析
1)細胞サンプル
細胞サンプルとして、マウスの未分化胚性幹細胞、未分化胎盤栄養膜幹細胞、分 化胎盤栄養膜幹細胞、未分化胚性生殖幹細胞、分化胚性生殖幹細胞、精巣細胞、 精子、脳細胞、脾臓細胞、白色脂肪細胞、胎盤細胞、下垂体細胞、腎臓細胞、褐色 間充織細胞、褐色脂肪細胞、肝臓細胞を用いた。
胚性幹細胞及び胎盤栄養膜幹細胞は、前述した方法により調製した。脂肪組織か らの脂肪細胞および褐色間充織細胞は定法に従い分離した。 (Nechad et al, 1983、 Experimental Cell Research 149, 105-118)。マウス各組織は屠殺したマウスから採取 した。 [0068] 2)ゲノム DNAの調製
目的とする細胞のゲノム DNAは、公知の方法 (Molecular cloning)に従い以下の通り 調製した。凍結したそれぞれの細胞サンプル (lxlO7個程度)を 5mlの溶解バッファー [ 150 mM EDTA, 10 mM Tris- HC1 pH 8.0, 1% SDSゝプロティナーゼ K(10 mg/ml)を含 有]に溶解し、 55°Cで 20分間インキュベートした。フエノール/クロ口ホルム/イソアミ ルアルコール (50:49:1)による抽出を 2回行い、エタノール沈殿法によりゲノム DNAを 沈澱させ、 300 μ 1の ΤΕ (10 mM Tris- HC1, 1 mM EDTA pH7.6)に溶解した。
[0069] 3)リアルタイム PCR法
上述したマウスの細胞サンプルを用いて DNAメチル化状況を解析した。 リアルタイム PCRは下記のように行った。ゲノム DNAを Pstl (NipponGene)で処理し、 65°C、 30分の酵素失活処理を行った後、二つのチューブに均等に分割した。分割し た一つのチューブは、メチル化感受性酵素である Notl (Takara)で処理した。 Notl無 処理群と処理群の二つのチューブについてフエノール Zクロ口ホルム Zイソアミルァ ルコール (50:49:1)による抽出を 2回行い、エタノール沈殿法によりゲノム DNAを沈澱 させた。 DNAは TE (10 mM Tris- HC1, 1 mM EDTA pH7.6)を用い、それぞれの濃度 が 10 μも/ μ 1となるように溶解した。 20 μ 1の反応液中 [SYBR Green PCR Master Mix (Applied biosystems)10 μ 1、 4.5 mMプライマー 4 1、切断したゲノム DNA 1 1、 DM SO(Wako) 4 1、 5 M betain (Sigma) 1 μ 1]で、リアルタイム PCR装置 (ABI PRISM 700 0)により、 PCR増幅（95 °C for 10 minゝ 95 °C for 15 sec/ 60 °C for 1 min, 40 cycleゝ S YBRアツセィ)を行い、メーカーの推奨する方法に従い増幅 DNA断片による蛍光をモ ユタリングした。
[0070] 4)メチル化状況の算出法
各プライマーセットについて、 CT値 (PCRプロダクト濃度が一定の濃度に到達する サイクル数)を ABI PRISM 7000取り扱い説明書に従って計算した。サンプル初期濃 度は下記の計算式により計算した。
[0071] PCR反応理論式
DNA0 = 1/(1+E)C
DNA0;標的テンプレートの初期濃度 E; PCR効率 (今回は理論値である 1を採用した）
C; CT値
DNAメチル化状況は下記の計算式により計算した。
DNAc=DNAOc/DNAsc
DNAc:メチル化感受性酵素で切断したサンプルの初期濃度
DNAOc: PCR反応理論式より得られた初期濃度
DNAsc:メチル化感受性酵素切断配列を含まな!/、産物を増幅したときの PCR反応理 論式より得られた初期濃度
DNAuc=DNAOuc/DNAsuc
DNAuc：メチル化感受性酵素で切断して 、な 、サンプルの初期濃度
DNAOuc: PCR反応理論式より得られた初期濃度
DNAsuc:メチル化感受性酵素切断配列を含まない産物を増幅したときの PCR反応理 論式より得られた初期濃度
メチル化状況（％) = 100 X (DNAc/DNAuc)
[0072] 上記の方法により、マウスゲノムの 953箇所の Notlの制限酵素認識部位をもつ領域 を解析した。その結果ゲノム DNAが特異的に増幅される領域、 223領域を同定した。 この 223領域を増幅するために用いたプライマーセットの塩基配列、及び各領域中に 含まれる Notl認識部位のマウスゲノム DNA上の位置を図 1〜8に示す。なお、染色体 上の位置及び配列は UCSC genome browser (http：〃 genome.ucsc.edu/)から得た。 本発明で規定している配列は 2005年 3月の mouse (Mus musculus)の draft genome d ata (Build 34 assembly)を基に作成されたものであり NCBI (The National Center for Biotechnology Information)によって提供されている。 ChrUNはまだ染色体が同定さ れていない領域であり、 randomは染色体番号は同定されているものの、その場所が 正確に同定されて 、な 、ことを示す。
[0073] 各細胞サンプルにおける 223領域のメチル化状況を調べ、それをクラスタリング解析 した。結果を図 9に示す (メチル化状況を色の濃淡で表した。メチルイ匕状況の値が高 くなるほど色が濃くなるようにしている。 ) o図 9に示すように、メチル化状況に基づい て作成した細胞の系譜図は、細胞の分ィ匕系譜図と近似したものとなった。従って、細 胞の上記 223領域のメチル化状況を調べることにより、その細胞がどのような細胞であ る力、あるいはどのような細胞に分ィ匕していくかを知ることができると考えられる。なお 、クラスタリング解析は MeV(v3.1)を用いて行なった（Saeed等、 Biotechniques. 2003 F eb;34(2):374-378.) 0
[0074] [実施例 4] マウスの細胞同定に重要な領域の選択
223領域から無作為に 50、 100領域を選択し、選択した領域のメチル化状況を解析 し、細胞の系譜図を作成した。 100領域を選別して得られる系譜図は 223領域力も得 られるものにほぼ一致した。一方、 50領域を用いて解析した結果においても、異なる 組織力も得られる細胞の各領域のメチルイ匕状況は異なるものであつたが、解析の結 果得られる系譜図は、 223領域を用いたものとは異なっていた（図 10)。従って、二つ の細胞が異なるものであるかどうか調べるためには、無作為に選び出した領域のメチ ルイ匕状況を少なくとも 50箇所調べればよいが、細胞の系譜によって細胞を同定する ためには 50領域では不十分である。
[0075] より少ない領域によって細胞の同定を可能にするため、組織、細胞間でメチルイ匕状 況の異なる領域に着目し、それを指標に領域を選択し、その情報を元に解析を行つ た。統計的解析により組織間でのメチルイ匕の状態の変化率を算出し、値の大きい上 位 93領域 (前述した B群に記載した Notl認識部位を含む領域）、 72領域 (前述した C 群に記載した Notl認識部位を含む領域）、 50領域 (前述した D群に記載した Notl認識 部位を含む領域)、 20領域 (前述した E群に記載した Notl認識部位を含む領域)を選 択し、それらの情報を元に細胞系譜図を作成した（図 11〜図 14)。これらの図に示す ように、 93領域、 72領域、 50領域、 20領域のいずれに基づいて作成した細胞の系譜 図も、 223領域に基づいて作成した細胞の系譜図とほぼ同様のものとなった。
[0076] [実施例 5] リアルタイム PCRを用いたヒトゲノムの DNAメチル化解析
1)細胞サンプル
細胞サンプルとして、ヒトの肝ガン細胞（SWx、 Hep39)、ヒト胎児腎臓細胞（HEK293 )、ヒト結腸癌由来細胞 (Caco-2)細胞を用いた。 SWxは、 J. Gen. Virol. 1995, (76), pi 215-21に記載されている細胞を用い、 Hep39は、 Virology 1997, (229), p68-76に記 載されている細胞を用いた。 [0077] 2)プライマー
マウスゲノムのメチルイ匕状況の変化率を指標として、ヒトゲノムのオルソガスな領域を 選択した。メチル化感受性酵素 Hpallの配列を含むようにプライマーを設計した。
[0078] 3)ゲノム DNAの調製
目的とする細胞のゲノム DNAは、公知の方法 (Molecular cloning)に従い以下の通り 調製した。凍結したそれぞれの細胞サンプル (lxlO7個程度)を 5mlの溶解バッファー [ 150 mM EDTA, 10 mM Tris- HC1 pH 8.0, 1% SDSゝプロティナーゼ K(10 mg/ml)を含 有]に溶解し、 55°Cで 20分間インキュベートした。フエノール/クロ口ホルム/イソアミ ルアルコール (50:49:1)による抽出を 2回行い、エタノール沈殿法によりゲノム DNAを 沈澱させ、 300 μ 1の ΤΕ (10 mM Tris- HC1, 1 mM EDTA pH7.6)に溶解した。
[0079] 4)リアルタイム PCR法
上述した細胞サンプルを用 ヽて DNAメチル化状況を解析した。
リアルタイム PCRは下記のように行った。ゲノム DNAを Pstl (NipponGene)で処理し、 65°C、 30分の酵素失活処理を行った後、二つのチューブに均等に分割した。分割し た一つのチューブは、メチル化感受性酵素である Hpall (Takara)で処理した。 Hpall 無処理群と処理群の二つのチューブについてフエノール Zクロ口ホルム Zイソアミル アルコール (50:49:1)による抽出を 2回行い、エタノール沈殿法によりゲノム DNAを沈 澱させた。 DNAは TE (10 mM Tris— HC1, 1 mM EDTA pH7.6)を用い、それぞれの濃 度が 10 μも/ μ 1となるように溶解した。 20 μ 1の反応液中 [SYBR Green PCR Master M ix (Applied biosystems)10 μ 1、 4.5 mMプライマー 4 1、切断したゲノム DNA 1 1、 D MSO(Wako) 4 1、 5 M betain (Sigma) 1 μ 1]で、リアルタイム PCR装置 (ABI PRISM 7 000)により、 PCR増幅（95 °C for 10 min、 95 °C for 15 sec/ 60 °C for 1 min, 40 cycle 、 SYBRアツセィ）を行い、メーカーの推奨する方法に従い増幅 DNA断片による蛍光を モニタリングした。
[0080] 5)メチル化状況の算出法
実施例 3と同様にメチルイ匕状況を算出した。
Hpall認識部位を含むヒトゲノム DNA上の 45領域を選択し、各細胞サンプルにおけ るこの 45領域のメチルイ匕状況を調べ、それをクラスタリング解析した。 45領域を増幅 するために用いたプライマーセットの塩基配列、及び各領域中に含まれる Hpall認識 部位のヒトゲノム DNA上の位置を図 15に示す。また、クラスタリング解析の結果を図 1 6に示す。図 16に示すように、マウスの場合と同様に、メチルイ匕状況に基づいて作成 した細胞の系譜図は、細胞の分ィ匕系譜図と近似したものとなった。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願 (特願 2006-027447号） の明細書および Zまたは図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引 用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入 れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] ゲノム DNA上に存在するメチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域のメチル 化状況を測定することを特徴とする細胞の同定方法。
[2] メチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域のメチルイ匕状況の測定をリアルタ ィム PCR法によって行なうことを特徴とする請求項 1に記載の細胞の同定方法。
[3] メチル化感受性制限酵素が、 Notlであることを特徴とする請求項 1又は 2に記載の 細胞の同定方法。
[4] メチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域が、細胞を同定しょうとする生物 にお 、て、下記の E群に記載されたマウスのゲノム DNA上の部位に対応する部位を 含む領域であることを特徴とする請求項 1乃至 3のいずれか一項に記載の細胞の同 定方法、 E群： Chr8:121718239、 Chrl0:40268206、 Chr7:40434319、 Chr2: 168434887 、 Chrl7:13377255, Chr4: 11505437、 Chr7:23275835, Chrl0:81558075、 Chr2:25510 660、 ChrUn:64525443、 Chr5:149198213、 Chrl3:23258680、 Chr8:31681160、 Chr5:l 18832953、 Chr8:69313165、 Chrl5:103071181、 Chr5: 114999783、 Chr4: 105344669、 Chrl0:85928951、 Chr3:114023516 (「Chr」の後の数字又は記号は染色体番号を表し 、コロンの後の数字はその染色体上の位置を表わす。；)。
[5] メチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域のメチルイ匕状況の測定を、下記 e 群に記載された配列番号の組み合わせによって表されるプライマーセットを用いたリ アルタイム PCR法によって行なうことを特徴とする請求項 4に記載の細胞の同定方法 、 e群：酉己歹 IJ番号 71と 72、酉己歹 IJ番号 99と 100、酉己歹 U番号 111と 112、酉己歹 IJ番号 119と 120、酉己歹 IJ番号 141と 142、酉己歹 IJ番号 167と 168、酉己歹 IJ番号 199と 200、酉己歹 IJ番号 2 13と 214、酉己歹 IJ番号 231と 232、酉己歹 IJ番号 253と 254、酉己歹 IJ番号 275と 276、酉己歹 IJ番 号 285と 286、酉己歹 IJ番号 291と 292、酉己歹 IJ番号 295と 296、酉己歹 IJ番号 305と 306、酉己 歹 U番号 323と 324、酉己歹 IJ番号 343と 344、酉己歹 IJ番号 393と 394、酉己歹 IJ番号 399と 400 、配列番号 423と 424。
[6] メチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域が、細胞を同定しょうとする生物 にお 、て、下記の A群に記載されたマウスのゲノム DNA上の部位から選択される 50 以上の部位に対応する部位を含む領域であることを特徴とする請求項 1乃至 3のい ずれか一項に記載の細胞の同定方法、 A群： ChrX: 153737739、 Chrl 1:23974565、 C hr4: 150805756、 Chr8:125819650、 Chrl7:44401746, Chrl:106112977、 Chr6: 137933 486、 Chrl6:8809376、 Chrl5:29789917、 Chrl 1:84598871、 Chr6:17264675, Chr3:96 185168、 Chrl 1:49465545、 Chrl9:46063101、 Chr5:33885424、 Chr8:47668219、 Chrl 2:84079717, Chr4: 103326546、 Chr3: 120044619、 Chrl2:66000384、 Chrl0:80417554 ゝ Chrll:96513323、 Chr4:129012370, Chr8: 122498663、 Chr8:78509264、 Chr3:8588 6742、 Chrl7:11408482、 Chrl3:46027430、 Chr7:76723912, Chrl9:44619519、 Chr9: 88075903、 Chrl0:78398276、 Chr8:105978735、 Chr5: 114637408、 Chrl4:19865028、 Chr8:121718239、 Chrl3:48746725, Chr7:74796742, Chrl:65031809、 Chr7:529367 50、 Chr4: 139884259、 Chr4:45101184、 ChrX:36432657、 Chr2:92750731, Chr8:8333 0656、 Chr4: 146644182、 Chrl6:89884169、 Chr8: 104658905、 Chrl7:33102816、 Chrl 0:40268206、 Chrl3:42866853、 Chr4:28998320、 Chrl:155453586、 Chrll:83201331 、 Chrl4:32336574、 Chr7:40434319、 Chr9:67043441、 Chr4: 116443668、 Chr8:12166 4181、 Chr2: 168434887、 Chr3:95483641、 Chr6: 127523140、 Chrl4:32448118、 Chrl 5 :7956800、 Chrl9:9721804、 Chr6:83693750、 Chrl0:80225872, Chr9: 114526827、 Ch r6:116114291、 Chr9:56270240, Chrl7:13377255, Chrl9:4813393、 Chr7:23565628 、 Chrl:34575316、 Chr7:106207521, Chrl:151841674、 Chrl0:95491636、 Chrl6:168 59974、 Chr6:49350227, Chr7: 10818048、 Chrl4:42557426, Chr7: 115979724, ChrlO :120617583、 Chr4: 11505437、 Chrl :93023446、 Chr7:47738905, Chrl 1:95826461、 C hrl4:18186366、 Chr4:114903199、 Chrl4:20196166、 Chr5:66374286、 Chr2:1720952 55、 Chrl 1:77890507, Chr4:117093825、 Chr2: 151299843、 Chr2:86196662、 Chr6:94 136966、 Chr7:95775089, Chr6:117613722, Chr7:23275835, Chrl:160810726、 Chrl 3:24417279, Chr4:87708528, Chrll:115679875、 Chrl4:28957086、 Chr2: 149957601 、 Chrl0:81558075、 Chrl:67331020、 ChrX: 153737740, Chr5:40517610、 Chr8:25775 980、 Chr4: 11249059、 Chr2:158071001、 Chrl2:87004048、 Chr4:83661222、 Chr2:25 510660、 Chr4:22462691, Chrl 1:95886409、 Chr2: 165860247, Chr7:57532361、 Chrl 3:44304760、 ChrX:68627376, Chrl2:46747475, Chrl :39874007、 Chr4:25102296、 C hr5:111413041、 ChrUn:64525443、 Chr6:23885534、 Chrl3:54216756、 Chr2: 179759 981、 Chrl0:5792605、 Chrl7:44313006、 Chrl0:62042196、 Chr7:75800342, Chrl6:2 9359640、 Chr9: 107465609、 Chrl6 (random): 11291833、 Chr5:149198213、 Chrl9:46 804447、 Chr5:72459426, Chr4: 105344670、 Chr2: 11088454、 Chrl3:23258680、 Chr3 :87155781、 Chrl3:69792720, Chr8:31681160、 Chrl0:42304235、 Chr5: 118832953、 Chr8: 119877706, Chr8:108001483、 Chr3:8368783、 Chr6:109211761、 Chr8:693131 65、 Chrll:70251059、 Chr8: 120440336、 Chrl5:96527917、 Chr6:127316378、 Chrl5: 57702368、 ChrX: 106041129、 Chrl4:46019287、 Chrl9:40841588、 Chrl5:103071181 、 Chrl4:18512073、 Chr5:29507642、 ChrX:68334575、 Chrl2:76993764, ChrX:6833 4574、 Chr7: 124389371, Chr2:54362031、 Chrl 1:74894287, Chr8:71647146, Chr5:l 14999783、 Chr9:88688368、 Chr8: 106354332、 Chr4:6367964、 ChrUn:65258017、 Ch r8:125762282, Chr9:37087646、 Chr2:155513500、 Chrl4:67062171, Chr7:22966694 ゝ Chrl4:48957516、 Chrl9:17878685、 ChrX:64029083、 Chrl4:50403225、 Chr6:1498 31859、 Chrl3:12606447、 ChrX:32710687, Chrl:63738959、 Chrl4:12363880、 Chrl 2:21230518、 Chrll:20636114、 Chr9:83305251、 Chr7: 116848543、 Chr9:69414907、 Chr6: 17264674, Chr4: 105344669、 Chrl6:22771437, Chr2: 116489694、 Chrl0:8592 8951、 Chrll:92919702、 Chrl6:21039084、 Chrl3:109194553、 Chrl :130566806、 Chr 4:127833013、 Chrl0:91054117、 Chr6:125621440、 Chr7: 11038084、 Chrl8: 17003789 、 Chrl4:116935487、 Chrl6: 19488240、 Chr3: 114023516、 Chrl9:44099394、 Chr2:22 972004、 Chrl3:91808887、 Chr9:14111525、 Chrl :4453057, Chrl8:53692623、 ChrlO :95539647、 Chrl4— random:10699516、 Chr5:46746383、 Chr2:120491191、 Chr2:1492 87485 ( rchrjの後の数字又は記号は染色体番号を表し、コロンの後の数字はその染 色体上の位置を表わす。）。
メチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域のメチルイ匕状況の測定を、下記 a 群に記載された配列番号の組み合わせによって表されるプライマーセットを用いたリ アルタイム PCR法によって行なうことを特徴とする請求項 6に記載の細胞の同定方法 、 a群：配列番号 1と 2、配列番号 3と 4、配列番号 5と 6、配列番号 7と 8、配列番号 9と 10、配列番号 11と 12、配列番号 13と 14、配列番号 15と 16、配列番号 17と 18、配 列番号 19と 20、配列番号 21と 22、配列番号 23と 24、配列番号 25と 26、配列番号 27と 28、酉己歹 IJ番号 29と 30、酉己歹 U番号 31と 32、酉己歹 U番号 33と 34、酉己歹 U番号 35と 36 、酉己歹 IJ番号 37と 38、酉己歹 IJ番号 39と 40、酉己歹 U番号 41と 42、酉己歹 U番号 43と 44、酉己歹 IJ 番号 45と 46、酉己歹 IJ番号 47と 48、酉己歹 U番号 49と 50、酉己歹 U番号 51と 52、酉己歹 U番号 53 と 54、酉己歹 IJ番号 55と 56、酉己歹 IJ番号 57と 58、酉己歹 U番号 59と 60、酉己歹 U番号 61と 62、 配列番号 63と 64、配列番号 65と 66、配列番号 67と 68、配列番号 69と 70、配列番 号 71と 72、酉己歹 IJ番号 73と 74、酉己歹 U番号 75と 76、酉己歹 U番号 77と 78、酉己歹 U番号 79と 80、酉己歹 IJ番号 81と 82、酉己歹 IJ番号 83と 84、酉己歹 U番号 85と 86、酉己歹 U番号 87と 88、酉己 列番号 89と 90、配列番号 91と 92、配列番号 93と 94、配列番号 95と 96、配列番号 97と 98、配列番号 99と 100、配列番号 101と 102、配列番号 103と 104、配列番号 105と 106、酉己歹 IJ番号 107と 108、酉己歹 IJ番号 109と 110、酉己歹 IJ番号 111と 112、酉己歹 IJ 番号 113と 114、酉己歹 IJ番号 115と 116、酉己歹 IJ番号 117と 118、酉己歹 IJ番号 119と 120、 酉己歹 U番号 121と 122、酉己歹 IJ番号 123と 124、酉己歹 IJ番号 125と 126、酉己歹 IJ番号 127と 1 28、酉己歹 IJ番号 129と 130、酉己歹 IJ番号 131と 132、酉己歹 IJ番号 133と 134、酉己歹 IJ番号 13 5と 136、酉己歹 IJ番号 137と 138、酉己歹 IJ番号 139と 140、酉己歹 IJ番号 141と 142、酉己歹 IJ番 号 143と 144、酉己歹 IJ番号 145と 146、酉己歹 IJ番号 147と 148、酉己歹 IJ番号 149と 150、酉己 歹 U番号 151と 152、酉己歹 IJ番号 153と 154、酉己歹 IJ番号 155と 156、酉己歹 IJ番号 157と 158 、配列番号 159と 160、配列番号 161と 162、配列番号 163と 164、配列番号 165と 166、酉己歹 IJ番号 167と 168、酉己歹 IJ番号 169と 170、酉己歹 IJ番号 171と 172、酉己歹 IJ番号 1 73と 174、酉己歹 IJ番号 175と 176、酉己歹 IJ番号 177と 178、酉己歹 IJ番号 179と 180、酉己歹 IJ番 号 181と 182、酉己歹 IJ番号 183と 184、酉己歹 IJ番号 185と 186、酉己歹 IJ番号 187と 188、酉己 歹 U番号 189と 190、酉己歹 IJ番号 191と 192、酉己歹 IJ番号 193と 194、酉己歹 IJ番号 195と 196 、酉己歹 IJ番号 197と 198、酉己歹 IJ番号 199と 200、酉己歹 IJ番号 201と 202、酉己歹 IJ番号 203と 204、酉己歹 IJ番号 205と 206、酉己歹 IJ番号 207と 208、酉己歹 IJ番号 209と 210、酉己歹 IJ番号 2 11と 212、酉己歹 IJ番号 213と 214、酉己歹 IJ番号 215と 216、酉己歹 IJ番号 217と 218、酉己歹 IJ番 号 219と 220、酉己歹 IJ番号 221と 222、酉己歹 IJ番号 223と 224、酉己歹 IJ番号 225と 226、酉己 歹 U番号 227と 228、酉己歹 IJ番号 229と 230、酉己歹 IJ番号 231と 232、酉己歹 IJ番号 233と 234 、酉己歹 IJ番号 235と 236、酉己歹 IJ番号 237と 238、酉己歹 IJ番号 239と 240、酉己歹 IJ番号 241と 242、配列番号 243と 244、配列番号 245と 246、配列番号 247と 248、配列番号 2 49と 250、酉己歹 IJ番号 251と 252、酉己歹 IJ番号 253と 254、酉己歹 IJ番号 255と 256、酉己歹 IJ番 号 257と 258、酉己歹 IJ番号 259と 260、酉己歹 IJ番号 261と 262、酉己歹 IJ番号 263と 264、酉己 歹 U番号 265と 266、酉己歹 IJ番号 267と 268、酉己歹 IJ番号 269と 270、酉己歹 IJ番号 271と 272 、酉己歹 IJ番号 273と 274、酉己歹 IJ番号 275と 276、酉己歹 IJ番号 277と 278、酉己歹 IJ番号 279と 280、酉己歹 IJ番号 281と 282、酉己歹 IJ番号 283と 284、酉己歹 IJ番号 285と 286、酉己歹 IJ番号 2 87と 288、酉己歹 IJ番号 289と 290、酉己歹 IJ番号 291と 292、酉己歹 IJ番号 293と 294、酉己歹 IJ番 号 295と 296、酉己歹 IJ番号 297と 298、酉己歹 IJ番号 299と 300、酉己歹 IJ番号 301と 302、酉己 歹 U番号 303と 304、酉己歹 IJ番号 305と 306、酉己歹 IJ番号 307と 308、酉己歹 IJ番号 309と 310 、酉己歹 IJ番号 311と 312、酉己歹 IJ番号 313と 314、酉己歹 IJ番号 315と 316、酉己歹 IJ番号 317と 318、酉己歹 IJ番号 319と 320、酉己歹 IJ番号 321と 322、酉己歹 IJ番号 323と 324、酉己歹 IJ番号 3 25と 326、酉己歹 IJ番号 327と 328、酉己歹 IJ番号 329と 330、酉己歹 IJ番号 331と 332、酉己歹 IJ番 号 333と 334、酉己歹 IJ番号 335と 336、酉己歹 IJ番号 337と 338、酉己歹 IJ番号 339と 340、酉己 列番号 341と 342、配列番号 343と 344、配列番号 345と 346、配列番号 347と 348 、酉己歹 IJ番号 349と 350、酉己歹 IJ番号 351と 352、酉己歹 IJ番号 353と 354、酉己歹 IJ番号 355と 356、酉己歹 IJ番号 357と 358、酉己歹 IJ番号 359と 360、酉己歹 IJ番号 361と 362、酉己歹 IJ番号 3 63と 364、酉己歹 IJ番号 365と 366、酉己歹 IJ番号 367と 368、酉己歹 IJ番号 369と 370、酉己歹 IJ番 号 371と 372、酉己歹 IJ番号 373と 374、酉己歹 IJ番号 375と 376、酉己歹 IJ番号 377と 378、酉己 歹 U番号 379と 380、酉己歹 IJ番号 381と 382、酉己歹 IJ番号 383と 384、酉己歹 IJ番号 385と 386 、酉己歹 IJ番号 387と 388、酉己歹 IJ番号 389と 390、酉己歹 IJ番号 391と 392、酉己歹 IJ番号 393と 394、酉己歹 IJ番号 395と 396、酉己歹 IJ番号 397と 398、酉己歹 IJ番号 399と 400、酉己歹 IJ番号 4 01と 402、酉己歹 IJ番号 403と 404、酉己歹 IJ番号 405と 406、酉己歹 IJ番号 407と 408、酉己歹 IJ番 号 409と 410、酉己歹 IJ番号 411と 412、酉己歹 IJ番号 413と 414、酉己歹 IJ番号 415と 416、酉己 歹 U番号 417と 418、酉己歹 IJ番号 419と 420、酉己歹 IJ番号 421と 422、酉己歹 IJ番号 423と 424 、酉己歹 IJ番号 425と 426、酉己歹 IJ番号 427と 428、酉己歹 IJ番号 429と 430、酉己歹 IJ番号 431と 432、酉己歹 IJ番号 433と 434、酉己歹 IJ番号 435と 436、酉己歹 IJ番号 437と 438、酉己歹 IJ番号 4 39と 440、酉己歹 IJ番号 441と 442、酉己歹 IJ番号 443と 444、酉己歹 IJ番号 445と 446。
メチル化感受性制限酵素が、 Hpallであることを特徴とする請求項 1又は 2に記載の 細胞の同定方法。 同定しょうとする細胞がヒト細胞であり、メチル化感受性制限酵素の認識部位を含 む領域が、下記の F群に記載されたヒトのゲノム DNA上の部位を含む領域であること を特徴とする請求項 1、 2、又は 8に記載の細胞の同定方法、 F群： Chrl6:9361629、 C hr7:115733903若しくは 115733915、 Chrl0:104406914、 Chr4— random:34125、 Chr4:l 52378551、 Chr6:160361011若しくは 160361078、 Chr21:44203879, Chrl: 17064077, Chr21 :32572930若しくは 32572937、 Chr6:30018279、 Chrl5:61269020若しくは 61269 026、 Chrl :44552339、 Chr6:170515044、 Chrl 1:65895290、 Chrl 1:12240503、 Chrl:l 81241380、 Chrl :46663373、 Chr20:931109、 Chrll:71817692、 Chrl0:44189121若し くは 44189127、 Chrl9:1948330、 Chrl:18553323、 Chr4: 129009382、 Chr2:211166961 、 ChrX:19121661、 Chr20:36789818、 Chr9:137016164、 ChrX:152757752若しくは 152 757759、 Chrl0:105334492、 Chr8:31617700、 Chr6: 109091470、 Chrl2:113572392, Chrl6:71649184、 Chrl2:52709725, Chrl9: 16548783、 Chrl4:22385098、 ChrX:1191 66342、 Chr9:72209436, Chr6:79844937, Chr7: 115733903若しくは 115733915、 Chrl :55306500、 Chrl7:47591789若しくは 47591806、 Chr5: 122463315、 Chrl3:101850567 、 Chr20:24397957 (「Chr」の後の数字又は記号は染色体番号を表し、コロンの後の 数字はその染色体上の位置を表わす。 ) o
メチル化感受性制限酵素の認識部位を含む領域のメチルイ匕状況の測定を、下記 f 群に記載された配列番号の組み合わせによって表されるプライマーセットを用いたリ アルタイム PCR法によって行なうことを特徴とする請求項 9に記載の細胞の同定方法 、 f群：酉己歹 IJ番号 447と 448、酉己歹 IJ番号 449と 450、酉己歹 IJ番号 451と 452、酉己歹 IJ番号 4 53と 454、酉己歹 IJ番号 455と 456、酉己歹 IJ番号 457と 458、酉己歹 IJ番号 459と 460、酉己歹 IJ番 号 461と 462、酉己歹 IJ番号 463と 464、酉己歹 IJ番号 465と 466、酉己歹 IJ番号 467と 468、酉己 歹 U番号 469と 470、酉己歹 IJ番号 471と 472、酉己歹 IJ番号 473と 474、酉己歹 IJ番号 475と 476 、酉己歹 IJ番号 477と 478、酉己歹 IJ番号 479と 480、酉己歹 IJ番号 481と 482、酉己歹 IJ番号 483と 484、酉己歹 IJ番号 485と 486、酉己歹 IJ番号 487と 488、酉己歹 IJ番号 489と 490、酉己歹 IJ番号 4 91と 492、酉己歹 IJ番号 493と 494、酉己歹 IJ番号 495と 496、酉己歹 IJ番号 497と 498、酉己歹 IJ番 号 499と 500、酉己歹 IJ番号 501と 502、酉己歹 IJ番号 503と 504、酉己歹 IJ番号 505と 506、酉己 歹 U番号 507と 508、酉己歹 IJ番号 509と 510、酉己歹 IJ番号 511と 512、酉己歹 IJ番号 513と 514 、酉己歹 IJ番号 515と 516、酉己歹 IJ番号 517と 518、酉己歹 IJ番号 519と 520、酉己歹 IJ番号 521と 522、酉己歹 IJ番号 523と 524、酉己歹 IJ番号 525と 526、酉己歹 IJ番号 527と 528、酉己歹 IJ番号 5 29と 530、酉己歹 IJ番号 531と 532、酉己歹 IJ番号 533と 534、酉己歹 IJ番号 535と 536。
細胞を同定するためのキットであって、細胞を同定しょうとする生物において、下記 の E群に記載されたマウスのゲノム DNA上の部位に対応する部位を含む領域を増幅 することのできるプライマーセットを含むことを特徴とする細胞同定キット、 E群: Chr8: 121718239、 Chrl0:40268206、 Chr7:40434319、 Chr2: 168434887、 Chrl7:13377255, Chr4: 11505437、 Chr7:23275835, Chrl0:81558075、 Chr2:25510660、 ChrUn: 645254 43、 Chr5:149198213、 Chrl3:23258680、 Chr8:31681160、 Chr5:118832953、 Chr8:69 313165、 Chrl5:103071181、 Chr5: 114999783、 Chr4: 105344669、 Chrl0:85928951、 Chr3:114023516 (「Chr」の後の数字又は記号は染色体番号を表し、コロンの後の数 字はその染色体上の位置を表わす。 ) o
下記 e群に記載された配列番号の組み合わせによって表されるプライマーセットを 含むことを特徴とする請求項 11に記載の細胞同定キット、 e群:配列番号 71と 72、配 歹 U番号 99と 100、酉己歹 IJ番号 111と 112、酉己歹 IJ番号 119と 120、酉己歹 IJ番号 141と 142、 酉己歹 U番号 167と 168、酉己歹 IJ番号 199と 200、酉己歹 IJ番号 213と 214、酉己歹 IJ番号 231と 2 32、酉己歹 IJ番号 253と 254、酉己歹 IJ番号 275と 276、酉己歹 IJ番号 285と 286、酉己歹 IJ番号 29 1と 292、酉己歹 IJ番号 295と 296、酉己歹 IJ番号 305と 306、酉己歹 IJ番号 323と 324、酉己歹 IJ番 号 343と 344、酉己歹 IJ番号 393と 394、酉己歹 IJ番号 399と 400、酉己歹 IJ番号 423と 424。 細胞を同定するためのキットであって、細胞を同定しょうとする生物において、下記 の A群に記載されたマウスのゲノム DNA上の部位力 選択される 50以上の部位に対 応する部位を含む領域を増幅することのできるプライマーセットを含むことを特徴とす る細胞同定キット、 A群： ChrX: 153737739、 Chrl 1:23974565、 Chr4: 150805756、 Chr8 :125819650、 Chrl7:44401746, Chrl:106112977、 Chr6: 137933486、 Chrl6:8809376 、 Chrl5:29789917、 Chrl 1:84598871、 Chr6: 17264675, Chr3:96185168、 Chrl 1:4946 5545、 Chrl9:46063101、 Chr5:33885424、 Chr8:47668219、 Chrl2:84079717, Chr4:l 03326546、 Chr3: 120044619、 Chrl2:66000384、 Chrl0:80417554、 Chrll:96513323、 Chr4:129012370, Chr8: 122498663、 Chr8: 78509264、 Chr3:85886742、 Chrl7:11408 482、 Chrl3:46027430、 Chr7:76723912, Chrl9:44619519、 Chr9:88075903、 Chrl0:7 8398276、 Chr8:105978735、 Chr5: 114637408、 Chrl4: 19865028、 Chr8:121718239、 Chrl3:48746725, Chr7:74796742, Chrl:65031809、 Chr7:52936750、 Chr4: 1398842 59、 Chr4:45101184、 ChrX:36432657、 Chr2:92750731, Chr8:83330656、 Chr4: 14664 4182、 Chrl6:89884169、 Chr8: 104658905、 Chrl7:33102816、 Chrl0:40268206、 Chrl 3:42866853、 Chr4:28998320、 Chrl :155453586、 Chrll:83201331、 Chrl4:32336574 、 Chr7:40434319、 Chr9:67043441、 Chr4: 116443668、 Chr8:121664181、 Chr2: 16843 4887、 Chr3:95483641、 Chr6:127523140、 Chrl4:32448118、 Chrl5:7956800、 Chrl9: 9721804、 Chr6:83693750、 Chrl0:80225872, Chr9: 114526827、 Chr6:116114291、 C hr9:56270240, Chrl7:13377255, Chrl9:4813393、 Chr7:23565628、 Chrl:34575316 、 Chr7:106207521, Chrl:151841674、 Chrl0:95491636、 Chrl6:16859974、 Chr6:493 50227、 Chr7:10818048、 Chrl4:42557426, Chr7: 115979724, Chrl0:120617583、 Chr 4:11505437、 Chrl :93023446、 Chr7:47738905, Chrl 1:95826461、 Chrl4: 18186366、 Chr4:114903199、 Chrl4:20196166、 Chr5:66374286、 Chr2:172095255, Chrl 1:7789 0507、 Chr4:117093825、 Chr2: 151299843、 Chr2: 86196662、 Chr6:94136966、 Chr7:9 5775089、 Chr6:117613722, Chr7:23275835, Chrl:160810726、 Chrl3:24417279, C hr4:87708528, Chrll:115679875、 Chrl4:28957086、 Chr2: 149957601、 Chrl0:81558 075、 Chrl:67331020、 ChrX: 153737740, Chr5:40517610、 Chr8:25775980、 Chr4:112 49059、 Chr2:158071001、 Chrl2:87004048、 Chr4:83661222、 Chr2:25510660、 Chr4: 22462691、 Chrl 1:95886409、 Chr2: 165860247, Chr7:57532361、 Chrl3:44304760、 ChrX:68627376, Chrl2:46747475, Chrl :39874007、 Chr4:25102296、 Chr5:1114130 41、 ChrUn:64525443、 Chr6:23885534、 Chrl3:54216756、 Chr2:179759981、 Chrl0:5 792605、 Chrl7:44313006、 Chrl0:62042196、 Chr7:75800342, Chrl6:29359640、 Chr 9:107465609、 Chrl 6 (random): 11291833、 Chr5:149198213、 Chrl9:46804447, Chr5: 72459426, Chr4: 105344670、 Chr2: 11088454、 Chrl3:23258680、 Chr3:87155781、 C hrl3:69792720, Chr8:31681160、 Chrl0:42304235、 Chr5:118832953、 Chr8: 1198777 06、 Chr8:108001483、 Chr3:8368783、 Chr6:109211761、 Chr8:69313165、 Chrl 1:702 51059、 Chr8: 120440336、 Chrl5:96527917、 Chr6: 127316378、 Chrl5:57702368、 Chr X:106041129、 Chrl4:46019287、 Chrl9:40841588、 Chrl5:103071181、 Chrl4:18512 073、 Chr5:29507642、 ChrX:68334575、 Chrl2:76993764, ChrX:68334574、 Chr7:12 4389371、 Chr2:54362031、 Chrl 1:74894287, Chr8:71647146, Chr5: 114999783、 Chr 9:88688368、 Chr8: 106354332、 Chr4:6367964、 ChrUn:65258017、 Chr8:125762282, Chr9:37087646、 Chr2:155513500、 Chrl4:67062171, Chr7:22966694、 Chrl4:48957 516、 Chrl9:17878685、 ChrX:64029083、 Chrl4:50403225、 Chr6:149831859、 Chrl3: 12606447、 ChrX:32710687, Chrl:63738959、 Chrl4: 12363880、 Chrl2:21230518、 C hrll:20636114、 Chr9:83305251、 Chr7: 116848543、 Chr9:69414907、 Chr6: 17264674 、 Chr4: 105344669、 Chrl6:22771437, Chr2: 116489694、 Chrl0:85928951、 Chrll:92 919702、 Chrl6:21039084、 Chrl3:109194553、 Chrl: 130566806、 Chr4:127833013、 Chrl0:91054117、 Chr6:125621440、 Chr7: 11038084、 Chrl8:17003789、 Chrl4:1169 35487、 Chrl6: 19488240、 Chr3:114023516、 Chrl9:44099394、 Chr2:22972004, Chrl 3:91808887、 Chr9:14111525、 Chrl :4453057, Chrl8:53692623、 Chrl0:95539647、 C hrl4— random:10699516、 Chr5:46746383、 Chr2:120491191、 Chr2: 149287485 (「Chr」 の後の数字又は記号は染色体番号を表し、コロンの後の数字はその染色体上の位 置を表わす。）。
下記 a群に記載された配列番号の組み合わせによって表されるプライマーセットか ら選ばれる 50種以上のプライマーセットを含むことを特徴とする請求項 13に記載の 細胞同定キット、 a群:配列番号 1と 2、配列番号 3と 4、配列番号 5と 6、配列番号 7と 8 、配列番号 9と 10、配列番号 11と 12、配列番号 13と 14、配列番号 15と 16、配列番 号 17と 18、配列番号 19と 20、配列番号 21と 22、配列番号 23と 24、配列番号 25と 26、酉己歹 IJ番号 27と 28、酉己歹 IJ番号 29と 30、酉己歹 U番号 31と 32、酉己歹 U番号 33と 34、酉己 列番号 35と 36、配列番号 37と 38、配列番号 39と 40、配列番号 41と 42、配列番号 43と 44、酉己歹 IJ番号 45と 46、酉己歹 U番号 47と 48、酉己歹 U番号 49と 50、酉己歹 U番号 51と 52 、酉己歹 IJ番号 53と 54、酉己歹 IJ番号 55と 56、酉己歹 U番号 57と 58、酉己歹 U番号 59と 60、酉己歹 IJ 番号 61と 62、酉己歹 IJ番号 63と 64、酉己歹 IJ番号 65と 66、酉己歹 U番号 67と 68、酉己歹 U番号 69 と 70、酉己歹 IJ番号 71と 72、酉己歹 IJ番号 73と 74、酉己歹 U番号 75と 76、酉己歹 U番号 77と 78、 配列番号 79と 80、配列番号 81と 82、配列番号 83と 84、配列番号 85と 86、配列番 号 87と 88、酉己歹 IJ番号 89と 90、酉己歹 U番号 91と 92、酉己歹 U番号 93と 94、酉己歹 IJ番号 95と 96、酉己歹 IJ番号 97と 98、酉己歹 IJ番号 99と 100、酉己歹 IJ番号 101と 102、酉己歹 IJ番号 103と 1 04、配列番号 105と 106、配列番号 107と 108、配列番号 109と 110、配列番号 11 1と 112、酉己歹 IJ番号 113と 114、酉己歹 IJ番号 115と 116、酉己歹 IJ番号 117と 118、酉己歹 IJ番 号 119と 120、酉己歹 IJ番号 121と 122、酉己歹 IJ番号 123と 124、酉己歹 IJ番号 125と 126、酉己 歹 U番号 127と 128、酉己歹 IJ番号 129と 130、酉己歹 IJ番号 131と 132、酉己歹 IJ番号 133と 134 、酉己歹 IJ番号 135と 136、酉己歹 IJ番号 137と 138、酉己歹 IJ番号 139と 140、酉己歹 IJ番号 141と 142、配列番号 143と 144、配列番号 145と 146、配列番号 147と 148、配列番号 1 49と 150、酉己歹 IJ番号 151と 152、酉己歹 IJ番号 153と 154、酉己歹 IJ番号 155と 156、酉己歹 IJ番 号 157と 158、酉己歹 IJ番号 159と 160、酉己歹 IJ番号 161と 162、酉己歹 IJ番号 163と 164、酉己 歹 U番号 165と 166、酉己歹 IJ番号 167と 168、酉己歹 IJ番号 169と 170、酉己歹 IJ番号 171と 172 、酉己歹 IJ番号 173と 174、酉己歹 IJ番号 175と 176、酉己歹 IJ番号 177と 178、酉己歹 IJ番号 179と 180、配列番号 181と 182、配列番号 183と 184、配列番号 185と 186、配列番号 1 87と 188、酉己歹 IJ番号 189と 190、酉己歹 IJ番号 191と 192、酉己歹 IJ番号 193と 194、酉己歹 IJ番 号 195と 196、酉己歹 IJ番号 197と 198、酉己歹 IJ番号 199と 200、酉己歹 IJ番号 201と 202、酉己 歹 U番号 203と 204、酉己歹 IJ番号 205と 206、酉己歹 IJ番号 207と 208、酉己歹 IJ番号 209と 210 、酉己歹 IJ番号 211と 212、酉己歹 IJ番号 213と 214、酉己歹 IJ番号 215と 216、酉己歹 IJ番号 217と 218、酉己歹 IJ番号 219と 220、酉己歹 IJ番号 221と 222、酉己歹 IJ番号 223と 224、酉己歹 IJ番号 2 25と 226、酉己歹 IJ番号 227と 228、酉己歹 IJ番号 229と 230、酉己歹 IJ番号 231と 232、酉己歹 IJ番 号 233と 234、酉己歹 IJ番号 235と 236、酉己歹 IJ番号 237と 238、酉己歹 IJ番号 239と 240、酉己 列番号 241と 242、配列番号 243と 244、配列番号 245と 246、配列番号 247と 248 、酉己歹 IJ番号 249と 250、酉己歹 IJ番号 251と 252、酉己歹 IJ番号 253と 254、酉己歹 IJ番号 255と 256、酉己歹 IJ番号 257と 258、酉己歹 IJ番号 259と 260、酉己歹 IJ番号 261と 262、酉己歹 IJ番号 2 63と 264、酉己歹 IJ番号 265と 266、酉己歹 IJ番号 267と 268、酉己歹 IJ番号 269と 270、酉己歹 IJ番 号 271と 272、酉己歹 IJ番号 273と 274、酉己歹 IJ番号 275と 276、酉己歹 IJ番号 277と 278、酉己 歹 U番号 279と 280、酉己歹 IJ番号 281と 282、酉己歹 IJ番号 283と 284、酉己歹 IJ番号 285と 286 、酉己歹 IJ番号 287と 288、酉己歹 IJ番号 289と 290、酉己歹 IJ番号 291と 292、酉己歹 IJ番号 293と 294、酉己歹 IJ番号 295と 296、酉己歹 IJ番号 297と 298、酉己歹 IJ番号 299と 300、酉己歹 IJ番号 3 01と 302、酉己歹 IJ番号 303と 304、酉己歹 IJ番号 305と 306、酉己歹 IJ番号 307と 308、酉己歹 IJ番 号 309と 310、酉己歹 IJ番号 311と 312、酉己歹 IJ番号 313と 314、酉己歹 IJ番号 315と 316、酉己 歹 U番号 317と 318、酉己歹 IJ番号 319と 320、酉己歹 IJ番号 321と 322、酉己歹 IJ番号 323と 324 、酉己歹 IJ番号 325と 326、酉己歹 IJ番号 327と 328、酉己歹 IJ番号 329と 330、酉己歹 IJ番号 331と 332、酉己歹 IJ番号 333と 334、酉己歹 IJ番号 335と 336、酉己歹 IJ番号 337と 338、酉己歹 IJ番号 3 39と 340、配列番号 341と 342、配列番号 343と 344、配列番号 345と 346、配列番 号 347と 348、酉己歹 IJ番号 349と 350、酉己歹 IJ番号 351と 352、酉己歹 IJ番号 353と 354、酉己 歹 U番号 355と 356、酉己歹 IJ番号 357と 358、酉己歹 IJ番号 359と 360、酉己歹 IJ番号 361と 362 、酉己歹 IJ番号 363と 364、酉己歹 IJ番号 365と 366、酉己歹 IJ番号 367と 368、酉己歹 IJ番号 369と 370、酉己歹 IJ番号 371と 372、酉己歹 IJ番号 373と 374、酉己歹 IJ番号 375と 376、酉己歹 IJ番号 3 77と 378、酉己歹 IJ番号 379と 380、酉己歹 IJ番号 381と 382、酉己歹 IJ番号 383と 384、酉己歹 IJ番 号 385と 386、酉己歹 IJ番号 387と 388、酉己歹 IJ番号 389と 390、酉己歹 IJ番号 391と 392、酉己 歹 U番号 393と 394、酉己歹 IJ番号 395と 396、酉己歹 IJ番号 397と 398、酉己歹 IJ番号 399と 400 、酉己歹 IJ番号 401と 402、酉己歹 IJ番号 403と 404、酉己歹 IJ番号 405と 406、酉己歹 IJ番号 407と 408、酉己歹 IJ番号 409と 410、酉己歹 IJ番号 411と 412、酉己歹 IJ番号 413と 414、酉己歹 IJ番号 4 15と 416、酉己歹 IJ番号 417と 418、酉己歹 IJ番号 419と 420、酉己歹 IJ番号 421と 422、酉己歹 IJ番 号 423と 424、酉己歹 IJ番号 425と 426、酉己歹 IJ番号 427と 428、酉己歹 IJ番号 429と 430、酉己 歹 U番号 431と 432、酉己歹 IJ番号 433と 434、酉己歹 IJ番号 435と 436、酉己歹 IJ番号 437と 438 、酉己歹 IJ番号 439と 440、酉己歹 IJ番号 441と 442、酉己歹 IJ番号 443と 444、酉己歹 IJ番号 445と 446。
ヒト細胞を同定するためのキットであって、下記の F群に記載されたヒトのゲノム DNA 上の部位を含む領域を増幅することのできるプライマーセットを含むことを特徴とする 細胞同定キット、 F群： Chrl6:9361629、 Chr7:115733903若しくは 115733915、 ChrlO:l 04406914、 Chr4— random:34125、 Chr4:152378551、 Chr6:160361011若しくは 1603610 78、 Chr21:44203879, Chrl:17064077, Chr21:32572930若しくは 32572937、 Chr6:30 018279、 Chrl5:61269020若しくは 61269026、 Chrl :44552339、 Chr6:170515044、 Chr 11:65895290、 Chrl 1:12240503、 Chrl:181241380、 Chrl :46663373、 Chr20:931109、 Chrll:71817692、 Chrl0:44189121若しくは 44189127、 Chrl9:1948330、 Chrl:185533 23、 Chr4: 129009382、 Chr2:211166961、 ChrX:19121661、 Chr20:36789818、 Chr9:13 7016164、 ChrX:152757752若しくは 152757759、 Chrl0:105334492、 Chr8:31617700、 Chr6:109091470、 Chrl2:113572392, Chrl6:71649184、 Chrl2:52709725, Chrl9:16 548783、 Chrl4:22385098、 ChrX:119166342、 Chr9: 72209436, Chr6: 79844937, Chr 7: 115733903若しくは 115733915、 Chrl :55306500、 Chrl7:47591789若しくは 4759180 6、 Chr5: 122463315、 Chrl3:101850567、 Chr20:24397957 (「Chr」の後の数字又は記 号は染色体番号を表し、コロンの後の数字はその染色体上の位置を表わす。 ) o 下記 f群に記載された配列番号の組み合わせによって表されるプライマーセットを 含むことを特徴とする請求項 15に記載の細胞同定キット、 f群:配列番号 447と 448、 酉己歹 U番号 449と 450、酉己歹 IJ番号 451と 452、酉己歹 IJ番号 453と 454、酉己歹 IJ番号 455と 4 56、酉己歹 IJ番号 457と 458、酉己歹 IJ番号 459と 460、酉己歹 IJ番号 461と 462、酉己歹 IJ番号 46 3と 464、酉己歹 IJ番号 465と 466、酉己歹 IJ番号 467と 468、酉己歹 IJ番号 469と 470、酉己歹 IJ番 号 471と 472、酉己歹 IJ番号 473と 474、酉己歹 IJ番号 475と 476、酉己歹 IJ番号 477と 478、酉己 歹 U番号 479と 480、酉己歹 IJ番号 481と 482、酉己歹 IJ番号 483と 484、酉己歹 IJ番号 485と 486 、酉己歹 IJ番号 487と 488、酉己歹 IJ番号 489と 490、酉己歹 IJ番号 491と 492、酉己歹 IJ番号 493と 494、酉己歹 IJ番号 495と 496、酉己歹 IJ番号 497と 498、酉己歹 IJ番号 499と 500、酉己歹 IJ番号 5 01と 502、酉己歹 IJ番号 503と 504、酉己歹 IJ番号 505と 506、酉己歹 IJ番号 507と 508、酉己歹 IJ番 号 509と 510、酉己歹 IJ番号 511と 512、酉己歹 IJ番号 513と 514、酉己歹 IJ番号 515と 516、酉己 歹 U番号 517と 518、酉己歹 IJ番号 519と 520、酉己歹 IJ番号 521と 522、酉己歹 IJ番号 523と 524 、酉己歹 IJ番号 525と 526、酉己歹 IJ番号 527と 528、酉己歹 IJ番号 529と 530、酉己歹 IJ番号 531と 532、酉己歹 IJ番号 533と 534、酉己歹 IJ番号 535と 536。
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