JP2007068539A - 高処理dnaメチル化解析のための方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】修飾型の核酸の増幅に基づいてゲノムDNA試料中のメチル化パターンを決定し、そして特異的にアニールしたハイブリダイゼーションプローブの増幅依存性の置換に基づいてメチル化核酸を検出するための、改良した高処理的かつ定量的な方法の提供。
【解決手段】ゲノムDNA試料を亜硫酸水素ナトリウムで処理してメチル化依存性の配列の差異を生成せしめ、続いて蛍光を基にした定量的PCR技術を用いて検出する方法。
【選択図】図1
【解決手段】ゲノムDNA試料を亜硫酸水素ナトリウムで処理してメチル化依存性の配列の差異を生成せしめ、続いて蛍光を基にした定量的PCR技術を用いて検出する方法。
【選択図】図1
Description
本発明はゲノムDNA試料のメチル化パターンを決定するための向上した高処理量的かつ定量的方法を提供する。具体的には、本発明の方法は、ゲノムDNA試料を亜硫酸水素ナトリウムで処理して、メチル化依存性の配列の差異を生成せしめること、これに続く蛍光を基にした定量的PCR技術を用いる検出を提供する。
高等真核生物において、DNAはCpGジヌクレオチドのグアノシンに対して5′側に位置するシトシンのみがメチル化される。この修飾は、それが遺伝子配列のプロモーター領域に位置するCpGに富む領域(CpG島)を含む場合に、支配的に遺伝子発現に対する重要な制御作用を有する。CpGの広範なメチル化は、選択の刷り込まれた遺伝子の転写不活性化及び雌の不活性X染色体上の遺伝子と関連づけられてきた。通常メチル化されていないCpG島の異常なメチル化は、不死化細胞及び形質転換した細胞における高頻度の事象として説明されており、そしてヒトのガンにおける腫瘍抑制遺伝子の転写不活性化としばしば関連づけられてきた。
DNAメチラーゼは、一般的なメチルドナー、例えばS−アデノシルメチオニン由来のメチル基を、DNA上の特異的な部位へと転移させる。細菌におけるDNAのメチル化の1つの生物学的機能は、同族の制限酵素による消化からのDNAの保護である。哺乳類細胞は、グアニンの5′側に隣接しているDNA上のシトシン残基(CpG)をメチル化するメチラーゼを有する。このメチル化は、遺伝子不活性化、細胞分化、腫瘍形成、X染色体の不活性化、及び遺伝子刷り込みにおける役割を果たしていると思われる。CpG島は正常な細胞においてメチル化されていないままであるが、X染色体の不活性化及び5′側の制御領域のメチル化が転写の抑制を導き得る親の特異的刷り込みの間は除く。DNAのメチル化はまた、そのコード機能を変えること無く、DNAの塩基配列を変化させる機構である。DNAのメチル化は、遺伝的、可逆的、そして後成的な変化である。更に、DNAのメチル化は遺伝子の発現を変える潜在性を有しており、これは深い発生的かつ遺伝的な結果を有する。
メチル化反応は、標的シトシンをそのままの二重らせんの外へとはじき出し、酵素であるDNA(シトシン−5)−メチルトランスフェラーゼ(Klimasauskas et al., Cell 76 : 357-369, 1994)の間隙においてS−アデノシルメチオニン由来のメチル基を転移させて5−メチルシトシン(5−mCyt)を形成せしめることを可能にすることに関与する。この酵素的変換は、脊椎動物において存在することが知られているDNAの唯一の後成的修飾であり、そして正常な胚発生に必須である(Bird, Cell 70 : 5-8, 1992 ; Laird and Jaenisch, Human Mol. Genet. 3 : 1487-1495, 1994 ; 及びLi et al., Cell 69 : 915-926, 1992)。CpGジヌクレオチドでの5−mCytの存在は、脊椎動物の進化の間、ゲノムにおけるこの配列の5倍の減少をもたらしており、これは恐らく5−mCytからTへの自発的な脱アミノ化によるものであると思われる(Schoreret et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 957-961, 1992)。その様な抑制を示さないゲノムのそれらの領域は、「CpG島」と称されている(Bird, Nature 321 : 209-213, 1986 ; 及びGardiner - Garden et al., J. Mol. Biol. 196 : 261-282, 1987)。これらのCpG島領域は、脊椎動物のゲノムの約1%を含んで成り、そしてまたCpGジヌクレオチドの合計数の約15%を占めている(Bird, Nature 321 : 209-213, 1986)。CpG島は典型的に0.2〜約1kbの長さであり、そして多くのハウスキーピング遺伝子及び組織特異的遺伝子の上流に位置しているが、遺伝子のコード領域にも達し得る。それ故に、体細胞性の組織におけるCpG島内のシトシン残基のメチル化は、転写を変えることによって遺伝子の機能に影響を及ぼすと信じられている(Cedar, Cell 53 : 3-4, 1988)。
ある遺伝子のCpG島内に含まれるシトシン残基のメチル化は、遺伝活性と逆に相関させられてきた。これは、例えば局所的な染色質の構造の破壊、転写因子とDNAとの結合の阻害を含む様々な機構による、又は転写因子の結合を間接的に妨害するメチル化配列と特異的に相互作用するタンパク質の動員による、遺伝子の発現の低下を導き得る。換言すると、メチル化がどの様にmRNAの転写及び遺伝子の発現に影響を及ぼすかということに関して複数の理論が存在しているが、正確な作用機構は全く理解されていない。いくつかの研究は、CpG島のメチル化と遺伝子発現との間の逆の相関を示したが、常染色体上の多くのCpG島は生殖系列において非メチル化のままであり、そしてこれらの島のメチル化は通常遺伝子の発現と無関係である。組織特異的遺伝子は受容性の標的器官において通常メチル化されないが、生殖系列及び非発現性の成体の組織においてメチル化される。構成的に発現するハウスキーピング遺伝子のCpG島は、生殖系列及び体細胞の組織において通常メチル化されない。
腫瘍抑制遺伝子と関連しているCpG島の異常なメチル化も、遺伝子発現の低下をもたらし得る。その様な領域のメチル化の増大は、選択的な増殖の利点(すなわち悪性)を有する細胞群の選択をもたらす正常な遺伝子発現の進行性の低下を導き得る。
DNAメチル化のパターン、特にシトシン残基のメチル化の変化がゲノムの不安定性をもたらし、そして変異原性であるとみなされている。このことは、恐らく真核生物におけるCpGメチル受容部位の抑制の80%を導き、それらのゲノムをメチル化する。シトシンのメチル化は更に、多型性及び生殖系列の変異の生成並びに腫瘍抑制遺伝子を不活性化する転移変異に寄与する(Jones, Cancer Res. 56 : 2463-2467, 1996)。メチル化はまた、哺乳類の胚の形成に必要とされる(Li et al., Cell 69 : 915-926, 1992)。CpGに富むプロモーター領域のメチル化が、転写活性を阻害し得ると思われる。Ushijima等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 2284-2289, 1997)は、マウスの肝臓癌形成の間にメチル化の変化を示すDNAを特徴づけ、そしてクローン化した。ガン細胞におけるメチル化部位の変化の一連の研究に由来するデータは、それが単にガンにおいて変化するDNAメチル化の全体的なレベルではないが、メチル基の分布における変化であることを示す。
これらの研究は、CpG島として知られている、CpGに富む配列でのメチル化が、腫瘍抑制遺伝子の不活性化のための代替経路を提供することを示唆している。腫瘍抑制遺伝子のプロモーターにおけるCpGオリゴヌクレオチドのメチル化は、それらの不活性化を導き得る。他の研究は、正常なメチル化過程における変化がゲノムの不安定性と関連しているというデータを提供する(Lengauer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 2545-2550, 1997)。その様な異常な後成的変化は多くのガンの型において見出すことができ、そして腫瘍形成の変換のための潜在的なマーカーとしての役割を果たすことがあり、これはその様な後成的な変化を素速く決定するための信頼できる手段が存在していることを示している。それ故に、好ましい後成的な変化としてメチル化を検出するための信頼でき、かつ素速い(高処理量)方法についての当業界での要望が存在している。
DNAのメチル化を決定するための方法
様々なゲノムのスキャニング法が存在しており、ガン細胞におけるメチル化部位の変化を同定するために使用されてきた。例えば、ある方法はRLGS(restriction landmark genomic scanning)(Kawai et al., Mol. Cell. Biol. 14 : 7421-7427, 1994)を含み、そして別の例はメチル化感受性AP(arbitrarily primed)−PCR(Gonzalgo et al., Cancer Res. 57 : 594-599, 1997)を含む。特異的なCpG部位におけるメチル化パターンの変化は、メチル化感受性制限酵素を用いたゲノムDNAの消化、続く注目の領域のサザン解析(消化−サザン法)によって観察されてきた。消化−サザン法の直接的な方法であるが、それは大量の高分子量DNA(少なくとも5μg又はそれ以上)を必要とし、そしてCpG部位の解析のための限定された範囲を有する(メチル化感受性制限酵素の認識部位の存在によって決定されるもの)という固有の欠点を有する。メチル化パターンの変化を解析するための別の方法は、PCR増幅の前のメチル化感受性制限酵素を用いたゲノムDNAの消化を含む、PCRに基づいた方法を含む(Singer - Sam et al., Nucl. Acids Res. 18 : 687, 1990)。しかしながら、この方法が有効であると示されていないのは、非効率的な酵素消化又はその次のPCR反応における過剰増幅による、偽のポジティブなシグナル(メチル化の存在)の程度の高さのためである。
様々なゲノムのスキャニング法が存在しており、ガン細胞におけるメチル化部位の変化を同定するために使用されてきた。例えば、ある方法はRLGS(restriction landmark genomic scanning)(Kawai et al., Mol. Cell. Biol. 14 : 7421-7427, 1994)を含み、そして別の例はメチル化感受性AP(arbitrarily primed)−PCR(Gonzalgo et al., Cancer Res. 57 : 594-599, 1997)を含む。特異的なCpG部位におけるメチル化パターンの変化は、メチル化感受性制限酵素を用いたゲノムDNAの消化、続く注目の領域のサザン解析(消化−サザン法)によって観察されてきた。消化−サザン法の直接的な方法であるが、それは大量の高分子量DNA(少なくとも5μg又はそれ以上)を必要とし、そしてCpG部位の解析のための限定された範囲を有する(メチル化感受性制限酵素の認識部位の存在によって決定されるもの)という固有の欠点を有する。メチル化パターンの変化を解析するための別の方法は、PCR増幅の前のメチル化感受性制限酵素を用いたゲノムDNAの消化を含む、PCRに基づいた方法を含む(Singer - Sam et al., Nucl. Acids Res. 18 : 687, 1990)。しかしながら、この方法が有効であると示されていないのは、非効率的な酵素消化又はその次のPCR反応における過剰増幅による、偽のポジティブなシグナル(メチル化の存在)の程度の高さのためである。
ゲノムの配列決定は、亜硫酸水素塩処理を用いることによって、DNAのメチル化パターン及び5−メチルシトシンの分布の解析のために単純化されてきた(Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 1827-1831, 1992)。DNAの亜硫酸水素塩処理は非メチル化シトシンからメチル化型を識別するが、本来の亜硫酸水素塩ゲノム配列決定は、全体的なメチル化パターンを決定するために、多数のプラスミドクローンの大規模な配列決定を必要とすることによって、この技術が日常的な診断的アッセイの任意の型において、メチル化パターンを決定するために商業的に有用であることを妨げている。
更に、メチル化解析のための出発点として、DNAの亜硫酸水素塩処理を利用する他の技術が報告されてきた。これらはメチル化特異的PCR(MSP)(Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 9821-9826, 1992);及び亜硫酸水素塩で変換したDNAから増幅したPCR生成物の制限酵素消化(Sadri and Hornsby, Nucl. Acids Res. 24 : 5058-5059, 1996 ; 及びXiong and Laird, Nucl. Acids Res. 25 : 2532-2534, 1997)を含む。
PCR技術は遺伝子変異の検出(Kuppuswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 1143-1147, 1991)及び対立遺伝子特異的な発現の定量(Szabo and Mann, Genes Dev. 9 : 3097-3108, 1995 ; 及び Singer - Sam et al., PCR Methods Appl. 1 : 160-163, 1992)のために開発されてきた。その様な技術は内部プライマーを使用し、これはPCRで生成した鋳型とアニーリングし、そしてアッセイすべき一塩基の5′側で直ちに終結する。しかしながら、対立遺伝子特異的な発現の技術は、DNAのメチル化パターンについてアッセイする状況において挑戦されていなかった。
特異的な遺伝子座、例えば複雑なゲノムDNAにおけるCpG島を解析するために使用する多くの分子生物学的技術は、配列特異的増幅のいくつかの型を含み、これはE.コリにおけるクローニングによる生物学的増幅、PCRによる直接的な増幅又は可視化され得るプローブを用いたハイブリダイゼーションによるシグナル増幅のいずれかである。DNAのメチル化は、E.コリ又はPCR反応のいずれにも存在しない、専用の維持DNAメチルトランスフェラーゼによって複製後に加えられるので、その様なメチル化の情報は分子クローニング又はPCR増幅の間に失われる。更に、分子ハイブリダイゼーションがメチル化DNAと非メチル化DNAとを識別しないのは、シトシン上のメチル基が塩基の対合に参加しないためである。複雑なゲノムDNAにおけるメチル化情報を増幅するための容易な方法の欠如は、恐らくDNAのメチル化の研究に対する最も重大な障害であった。それ故に、特に定量的方法における、メチル化検出技術について改良するための当業界での要求が存在している。
開発されてきた特異的な遺伝子座でのDNAのメチル化パターンの決定のための間接的な方法は、増幅の事象の前にメチル化依存性の挙動でゲノムDNAを変化させる技術に頼っている。このメチル化依存性のDNA変化を達成するために利用されてきた2つの主要な方法が存在している。最初のものは、CpG配列の前後の5−メチルシトシンにより、その活性に影響が及ぼされている制限酵素による消化である。開裂、又はその欠如は、サザンブロッティング又はPCRによってその後に明らかにされ得る。近年の広範な使用を支えた他の技術は、亜硫酸水素ナトリウムを用いたゲノムDNAの処理である。亜硫酸水素ナトリウム処理は、DNA中の全ての非メチル化シトシン残基を脱アミノ化によってウラシルへと変換するが、メチル化シトシン残基はそのままにしておく。その後のPCR増幅はウラシル残基をチミンと置換し、そして5−メチルシトシン残基をシトシンと置換する。生じた配列の差異は、標準的なDNA配列検出技術、主にPCRを用いて検出されてきた。
多くのDNAメチル化検出技術は亜硫酸水素塩処理を利用する。現在、全ての亜硫酸水素塩処理を基にした方法が、ゲノム内の特異的な遺伝子座を解析するためのPCR反応に先行している。2つの原理的に異なる方法が存在しており、この中で亜硫酸水素ナトリウムで生じた配列の差異が明らかにされ得る。最初のものは、メチル化又は非メチル化のいずれかの変換したDNAと独特にアニールするPCRプライマーを設計することである。この技術は「メチル化特異的PCR」又は「MSP」と称されている。他の亜硫酸水素塩を基にした技術(例えば亜硫酸水素塩ゲノム配列決定、COBRA及びMs−SNuPE)の全てに使用される方法は、本来のゲノム配列においてCpGジヌクレオチドを欠く部位でアニールするプライマーを用いて、亜硫酸水素塩で変換したDNAを増幅することである。この方法において、PCRプライマーは、2つのプライマー間の配列を、本来のゲノムDNAにおけるその配列のDNAメチル化状態に関係無しに増幅し得る。これは異なるPCR生成物のプールをもたらし、これは全て長さが同一であり、そして2つのプライマー間に位置するCpGの、潜在的なDNAメチル化の部位でのみそれらの配列に差異がある。亜硫酸水素塩で変換した配列を処理するこれらの方法間の差異は、MSPの場合、メチル化情報がPCR生成物の発生又は発生の欠如に由来し、一方、他の技術の場合、生成物の混合物が常に生成し、そして混合物が引き続き解析されて、異なるメチル化状態の相対的な発生に対する定量的な情報を生成せしめることにある。
MSPは定性的な技術である。それが定量的でないという2つの理由が存在している。最初に、メチル化情報が2つの別のPCR反応(メチル化のものと非メチル化のもの)の比較に由来するということである。それには2つの異なるPCR反応の動力学的な比較を行う際の固有の難しさが存在している。MSPを用いる他の問題は、しばしばプライマーが1以上のCpGジヌクレオチドを覆うことにある。その結果、複数の配列変異体が本来のゲノムDNAのDNAメチル化パターンに依存して生成し得る。例えば、上流プライマーが3つのCpGを覆う24マーのオリゴヌクレオチドであるならば、23 =8の異なる理論的な配列の順列が、24ヌクレオチドの配列内での亜硫酸水素塩の変換の後に、ゲノムDNAにおいて起こり得る。万が一、完全にメチル化及び完全に非メチル化の反応が行われるならば、8個の可能なメチル化状態のうちの2個のみを現実に研究することだろう。この状況は、中間のメチル化状態が、効率は低下するが増幅を導くならば、更に複雑となる。それ故に、MSP技術は非定量的である。それ故に、MSP技術を改良し、そしてそれを更に定量的に変え、そしてその方法がより大量に処理することを可能にさせる要求が当業界には存在している。本発明は、より素速くかつ定量的なメチル化アッセイのためのこの要求に取り組む。
本発明の要約
本発明は、DNAのゲノム試料中のメチル化されたCpG島を検出するための方法であって、
(a)患者由来のDNAのゲノム試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を生成せしめる修飾剤とを接触させ;
(b)1又は複数の特異的なオリゴヌクレオチドプローブの存在下又は非存在下で、2つのオリゴヌクレオチドプライマーによって変換した核酸を増幅し、ここで、1又は複数のオリゴヌクレオチドプライマー及び/又はプローブは、非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別することができる;そして
(c)前記プローブの増幅を介する消化に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法を提供する。好ましくは、増幅段階はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)であり、そして修飾剤は亜硫酸水素塩である。好ましくは、変換した核酸は、DNAの非修飾型ゲノム試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む。好ましくは、プローブは更に蛍光標識部分を含んで成り、そして増幅及び検出段階は蛍光に基づいた定量的PCRを含んで成る。
本発明は、DNAのゲノム試料中のメチル化されたCpG島を検出するための方法であって、
(a)患者由来のDNAのゲノム試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を生成せしめる修飾剤とを接触させ;
(b)1又は複数の特異的なオリゴヌクレオチドプローブの存在下又は非存在下で、2つのオリゴヌクレオチドプライマーによって変換した核酸を増幅し、ここで、1又は複数のオリゴヌクレオチドプライマー及び/又はプローブは、非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別することができる;そして
(c)前記プローブの増幅を介する消化に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法を提供する。好ましくは、増幅段階はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)であり、そして修飾剤は亜硫酸水素塩である。好ましくは、変換した核酸は、DNAの非修飾型ゲノム試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む。好ましくは、プローブは更に蛍光標識部分を含んで成り、そして増幅及び検出段階は蛍光に基づいた定量的PCRを含んで成る。
本発明は、メチル化CpG含有核酸を検出するための方法であって、
(a)核酸含有試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を形成せしめる修飾剤とを接触させ;
(b)CpG特異的オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、オリゴヌクレオチドプライマーによって試料中の変換した核酸を増幅し、ここで、前記プライマーではなく、CpG特異的プライマーが、非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する;そして
(c)CpG特異的プローブの増幅を介する置換に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法を提供する。好ましくは、増幅段階はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含んで成り、そして修飾剤は亜硫酸水素塩を含んで成る。好ましくは、変換した核酸は、非修飾型核酸含有試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む。好ましくは、検出方法は、CpG特異的プローブの増幅を介する置換に基づいた蛍光シグナルの測定によるものであり、そして増幅及び検出方法は、蛍光に基づいた定量的PCRを含んで成る。核酸試料中のメチル化量は、投入した核酸の量のためのコントロール反応との参照に基づいて定量的に決定される。
(a)核酸含有試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を形成せしめる修飾剤とを接触させ;
(b)CpG特異的オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、オリゴヌクレオチドプライマーによって試料中の変換した核酸を増幅し、ここで、前記プライマーではなく、CpG特異的プライマーが、非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する;そして
(c)CpG特異的プローブの増幅を介する置換に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法を提供する。好ましくは、増幅段階はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含んで成り、そして修飾剤は亜硫酸水素塩を含んで成る。好ましくは、変換した核酸は、非修飾型核酸含有試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む。好ましくは、検出方法は、CpG特異的プローブの増幅を介する置換に基づいた蛍光シグナルの測定によるものであり、そして増幅及び検出方法は、蛍光に基づいた定量的PCRを含んで成る。核酸試料中のメチル化量は、投入した核酸の量のためのコントロール反応との参照に基づいて定量的に決定される。
本発明は更に、メチル化CpG含有核酸を検出するための方法であって、
(a)核酸含有試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を形成せしめる修飾剤とを接触させ;
(b)オリゴヌクレオチドプライマーによって、そしてCpG特異的オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、試料中の変換した核酸を増幅し、ここで、前記プライマー及びCpG特異的プライマーの両方が、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する;そして
(c)CpG特異的プローブの増幅を介する置換に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法を提供する。好ましくは、増幅段階はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)であり、そして修飾剤は亜硫酸水素塩である。好ましくは、変換した核酸は、非修飾型核酸含有試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む。好ましくは、検出方法は、CpG特異的プローブの増幅を介する置換に基づいて蛍光シグナルを測定することを含んで成り、そして増幅及び検出方法は、蛍光に基づいた定量的PCRを含んで成る。
(a)核酸含有試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を形成せしめる修飾剤とを接触させ;
(b)オリゴヌクレオチドプライマーによって、そしてCpG特異的オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、試料中の変換した核酸を増幅し、ここで、前記プライマー及びCpG特異的プライマーの両方が、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する;そして
(c)CpG特異的プローブの増幅を介する置換に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法を提供する。好ましくは、増幅段階はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)であり、そして修飾剤は亜硫酸水素塩である。好ましくは、変換した核酸は、非修飾型核酸含有試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む。好ましくは、検出方法は、CpG特異的プローブの増幅を介する置換に基づいて蛍光シグナルを測定することを含んで成り、そして増幅及び検出方法は、蛍光に基づいた定量的PCRを含んで成る。
本発明は更に、メチル化CpG含有核酸の検出にとって有用なメチル化検出キットであって、これが
(i)非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を生成せしめる修飾剤を含む第一容器;
(ii)変換した核酸の増幅のためのプライマーを含む第二容器;
(iii)コントロールの非修飾型核酸の増幅のためのプライマーを含む第三容器;及び
(iv)検出が増幅を介する置換に基づいている、特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含む第四容器、
を含んで成る、1又は複数の容器を近接した制限で内部に収容するために区分されている輸送手段を含んで成り、プライマー及びプローブのそれぞれが非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別し得るか又はし得ないキットを提供する。好ましくは、修飾剤は亜硫酸水素塩を含んで成る。好ましくは、修飾剤はシトシン残基をウラシル残基へと変換する。好ましくは、特異的なオリゴヌクレオチドプローブはCpG特異的オリゴヌクレオチドプローブであり、そして変換した核酸の増幅のためのプライマーではなく、プローブが修飾型非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する。あるいは、特異的なオリゴヌクレオチドプローブはCpG特異的オリゴヌクレオチドプローブであり、そしてプローブ及び変換した核酸の増幅のためのプライマーの両方が、修飾型非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する。好ましくは、プローブは更に、直接的に又はリンカー部分を介してオリゴヌクレオチド塩基と連結した蛍光部分を含んで成り、そしてプローブは特異的な、二重標識したTaqManプローブである。
(i)非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を生成せしめる修飾剤を含む第一容器;
(ii)変換した核酸の増幅のためのプライマーを含む第二容器;
(iii)コントロールの非修飾型核酸の増幅のためのプライマーを含む第三容器;及び
(iv)検出が増幅を介する置換に基づいている、特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含む第四容器、
を含んで成る、1又は複数の容器を近接した制限で内部に収容するために区分されている輸送手段を含んで成り、プライマー及びプローブのそれぞれが非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別し得るか又はし得ないキットを提供する。好ましくは、修飾剤は亜硫酸水素塩を含んで成る。好ましくは、修飾剤はシトシン残基をウラシル残基へと変換する。好ましくは、特異的なオリゴヌクレオチドプローブはCpG特異的オリゴヌクレオチドプローブであり、そして変換した核酸の増幅のためのプライマーではなく、プローブが修飾型非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する。あるいは、特異的なオリゴヌクレオチドプローブはCpG特異的オリゴヌクレオチドプローブであり、そしてプローブ及び変換した核酸の増幅のためのプライマーの両方が、修飾型非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する。好ましくは、プローブは更に、直接的に又はリンカー部分を介してオリゴヌクレオチド塩基と連結した蛍光部分を含んで成り、そしてプローブは特異的な、二重標識したTaqManプローブである。
本発明の詳細な説明
本発明は、核酸の試料におけるメチル化パターンを検出するための、素速い、感受性の、再現性がある高処理方法を提供する。本発明は、核酸のメチル化依存性修飾を提供し、核酸の本来の試料に存在するメチル化残基と非メチル化残基とを識別するために、核酸の増幅、検出、又はその両方の方法を使用する。好ましい態様において、本発明はゲノムDNAの試料中のCpG島のメチル化状態を決定することを提供する。
本発明は、核酸の試料におけるメチル化パターンを検出するための、素速い、感受性の、再現性がある高処理方法を提供する。本発明は、核酸のメチル化依存性修飾を提供し、核酸の本来の試料に存在するメチル化残基と非メチル化残基とを識別するために、核酸の増幅、検出、又はその両方の方法を使用する。好ましい態様において、本発明はゲノムDNAの試料中のCpG島のメチル化状態を決定することを提供する。
メチル化パターンを決定するための以前の方法と対照的に、当該メチル化核酸の検出は比較的速く、そして特異的オリゴヌクレオチドの増幅を介する置換に基づいている。好ましい態様において、増幅及び検出は、事実、二重標識したTaqMan(商標)オリゴヌクレオチドプローブを用いる、蛍光に基づいたリアルタイム(real time)定量的PCR(「RT−PCR」)によって測定されるのと同時に起こる。置換可能なプローブは、本来の、非修飾型核酸試料に存在するメチル化CpG部位と非メチル化CpG部位とを識別するために特異的に設計され得る。
メチル化特異的PCRの技術(「MSP」;米国特許第5,786,146号)の様に、本発明は、メチル化パターンを決定するために使用される、以前のPCRに基づいた方法及び他の方法(例えばサザン解析)以上の有意な利益を提供する。本発明は、実質的にサザン解析以上に感度があり、そして非常に小さな核酸試料、及びパラフィンが包埋した試料中の少数(パーセンテージ)のメチル化対立遺伝子の検出を容易にする。更に、ゲノムDNAの場合、解析はメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによって認識されるDNA配列に限定されておらず、その結果より幅広いCpGに富む領域を通過するメチル化パターンの精巧なマッピングを可能にしている。本発明はまた、以前のPCRに基づくメチル化法に固有な、メチル化感受性制限酵素による不完全な消化に起因する、あらゆる偽のポジティブな結果を排除する。
本発明はまた、MSP技術以上の有意な利益を提案する。それはメチル化の量を測定するための定量方法として利用されることがあり、そして実質的に更に素速い。MSP技術以上の1つの重大な利益は、ゲル電気泳動が高処理の可能性を制限する時間のかかる手作業であるだけでなく、PCRの反応チューブの操作及び開口が試料の誤識の機会を増大させ、そしてそれが微量のPCR生成物による将来のPCR反応の汚染の機会を大きく増大させることである。ウラシルの取り込み及びウラシルDNAグリコシラーゼ(AmpErase)の使用によるPCR汚染を回避する標準的な方法は、亜硫酸水素塩処理したDNAにおけるウラシルの存在により、亜硫酸水素塩技術と両立できない。それ故に、亜硫酸水素塩処理したDNAを用いる高処理適用におけるPCR生成物汚染の回避は、非修飾型DNAの増幅よりも大きな技術的挑戦である。本発明はPCR後の操作又は処理を全く必要としない。これは亜硫酸水素塩処理したDNAの解析に関わる仕事の量を大きく減少させるだけでなく、将来の反応を汚染し得るPCR生成物の扱いを回避する手段も提供する。
2つの要因が、よく見ても半定量的な適用にMSPを制限する。最初に、MSPのメチル化情報は2つの別々のPCR反応(メチル化及び非メチル化のもの)の比較に由来する。そこには、以後の増幅反応、例えばリアルタイム定量的PCRの高度に定量的な方法無しに、2つの異なるPCR反応の動力学的な比較の実施における固有の困難性が存在する。他の問題は、MSPの増幅が特定のCpG特異的オリゴヌクレオチドによって、すなわち偏ったプライマーによって提供されるという事実に関連している。しばしば、その様なプライマーによって覆われるDNA配列は、増幅した配列が、本来のゲノムDNAにおけるDNAのメチル化パターンに依存して存在する複数の潜在的な配列変異体のわずかに1つを表すであろうという結果によって、1以上のCpGジヌクレオチドを含む。例えば、上流プライマーが3つのCpGを覆う24マーのオリゴヌクレオチドであるならば、23 =8の異なる理論的な配列の順列が、この24ヌクレオチドの配列内での亜硫酸水素塩変換に続いて、ゲノムDNAに起こり得る。万が一、完全にメチル化及び完全に非メチル化の反応が行われるならば、8つの可能なメチル化状態のうちのわずかに2つが解析される。
この状況は、中間のメチル化状態が完全にメチル化又は完全に非メチル化のプライマーによって非特異的に増幅されるならば、更に複雑となる。従って、MSPの特許は、2つの反応の動力学の比較というより、完全にメチル化される反応、それに対する完全に非メチル化される反応におけるPCR生成物の発生又は発生無しに基づいている非定量的技術を明示的に記載している。
対照的に、本発明の1つの態様は、本来の、非修飾型DNA配列におけるCpG配列を全く覆わないプライマーを用いて、全ての可能なメチル化状態の偏っていない増幅を提供する。全てのメチル化パターンが等しく増幅される限り、DNAのメチル化パターンについての定量的な情報は、配列の差異を検出することができる技術のいずれかによって(例えば蛍光に基づいたPCRによって)、生じたPCRプールから引き出され得る。
更に、本発明はMSPよりも実質的に速い。上文で指摘した様に、MSPはプライマーで覆われるCpG配列のメチル化状態を決定するために、メチル化反応対非メチル化反応におけるPCR生成物の発生又は発生無しに依存している。最低限、これはアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動解析を行うことを必要とする(米国特許第5,786,146号の図2A〜2E、及び3A〜3Eを参照のこと)。更に、所定のMSPの増幅領域内でのCpG部位のいずれかのメチル化状態の決定は、追加の解析、例えば(a)核酸の修飾及び増幅の前又は後のいずれかの制限エンドヌクレアーゼ解析(例えば、COBRA解析;Xiong and Laird, Nucleic. Acids Res. 25 : 2532-2534, 1997)、但し、注目の非修飾型配列がメチル化感受性部位を含むか、あるいは修飾(例えば亜硫酸水素塩)が制限部位の作制又は破壊をもたらす;(b)一塩基プライマー伸長反応(Ms−SNuPE; Gonzalo and Jones, Nucleic Acids Res 25 : 2529-2531, 1997);又は(c)増幅生成物のDNA配列決定、を必要とするだろう。その様な追加の解析は、間違いが起こりやすいだけでなく(不完全な制限酵素消化)、例えばゲノムDNAの試料のCpGメチル化状態を決定する方法に、実質的な時間及び費用も加える。
対照的に、本発明の好ましい態様において、増幅及び検出は、特異的な二重標識のオリゴヌクレオチドプローブを用いる、蛍光を基にしたリアルタイム定量的PCRによって測定するのと同時に起こる。原則として、増幅された領域内のプローブ特異的配列のいずれかでのメチル化状態は、その後の操作又は解析の必要無しに、増幅と同時に決定され得る。
MSPの発明者によって開示されている様に、特徴づけられた領域内のほとんどのCpG部位のために、MSPよりも更に直接的な解析を提供し得る唯一の技術がゲノムの配列決定である(米国特許第5,786,146号、5ページの15〜17行目)。本発明は、事実、ゲノムDNAの既知の(既に配列決定されている)領域内での修飾型CpG部位の部分的な直接的配列決定のための方法を提供する。この様に、それぞれが所定の増幅されたDNA領域内の特定のメチル化部位に相当する、一連のCpG特異的TaqMan(商標)プローブが構築される。この一連のプローブは、ゲノムDNAの本来の非修飾型試料に存在している完全なメチル化パターンを同時に決定するために、単一の修飾型DNA試料の一定分量を用いて、類似の増幅反応に引き続き利用される。これは、ゲノムDNAの試料の直接的な配列決定に必要な時間及び費用の一部で達成され、そして実質的に更に感度がある。更に、本発明の1つの態様は、その様なメチル化パターンの定量的な評価を提供する。
本発明は、核酸試料(例えば、ゲノムDNA試料)中のCpGのメチル化状態を定性的かつ定量的に決定するための、メチル化依存性核酸修飾剤(例えば、亜硫酸水素塩)を利用する、4つの方法の技術を発見し、そして診断キットを結びつけた。4つの方法は図3に概要を示しており、そしてA〜Dの文字で下方に標識されている。全体的に、メチル化CpG配列の識別は、増幅、プローブハイブリダイゼーションのレベルで、又はその両方のレベルで行われる様に設計される。例えば、適用C及びDは、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別し、そしてPCRの増幅レベルでのメチル化CpG配列の識別を提供する「偏った(biased)」プライマーを利用する。方法Bは、修飾型核酸の偏っていない増幅を提供するために、「偏っていない(unbiased)」プライマー(CpGのメチル化部位を覆わない)を使用するが、むしろ検出レベル(例えば、蛍光(又は発光)プローブのハイブリダイゼーションレベルでのみ)での定量的なメチル化CpG配列の識別を提供するために、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別するプローブを利用する。方法Aは、それ自身で、増幅又は検出レベルのいずれかでのメチル化CpG配列の識別を提供しないが、投入DNAのためのコントロール反応を提供することによって、他の3つの適用を支え、そして有効にする。
方法D 最初の態様において(図3、適用D)、本発明はメチル化CpG含有核酸を定性的に検出する方法であって、核酸含有試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を生成せしめる修飾剤とを接触させ、特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの存在下で、2つのオリゴヌクレオチドプライマーによって変換した核酸を増幅させ(この中で、プライマー及びプローブの両方が修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する)、そして増幅を介するプローブの置換を基にして「メチル化」核酸を検出することを含む方法を提供する。
用語「修飾」は、本明細書で使用する場合、修飾剤による別のヌクレオチドへの非メチル化シトシンの変換であって、本来の核酸試料中のメチル化シトシンから、非メチル化シトシンを識別する変換を意味する。好ましくは、修飾剤は非メチル化シトシンをウラシルに修飾する。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾するために使用する修飾剤は亜硫酸水素ナトリウムであるが、メチル化シトシンではなく、非メチル化シトシンを選択的に修飾する他の相当する修飾剤は、本発明の方法において置き換えられ得る。亜硫酸水素ナトリウムは、シトシンの5,6位の二重結合と容易に反応するが、メチル化シトシンとは反応せず、その結果、ウラシルを生成するアルカリ性の条件下で脱アミノ化を受けるスルホン化シトシンが生成する(例1)。Taqポリメラーゼがチミンとしてウラシルを、そしてシチジンとして5−メチルシチジン(m5C)を認識するので、亜硫酸ナトリウム処理及びPCR増幅の時系列の組み合わせは、非メチル化シトシン残基からチミン(C→U→T)、及びメチル化シトシン残基(「mC」)からシトシン(mC→mC→C)への最終的な変換をもたらす。この様に、ゲノムDNAの亜硫酸水素ナトリウム処理は、非メチル化シトシンをウラシルに変換することによってメチル化依存性の配列の差異を作制し、そしてPCRによって生じた生成物は、メチル化シトシンが非修飾型核酸において発生する位置でのみシトシンを含む。
オリゴヌクレオチド「プライマー」は、本明細書で使用する場合、修飾型又は非修飾型核酸の相補鎖と配列特異的なハイブリダイゼーション(アニーリング)が可能な、直線状の、一本鎖の、オリゴマーのデオキシリボ核酸又はリボ核酸分子を意味する。本明細書で使用する場合、特異的なプライマーは、好ましくはDNAである。本発明のプライマーは、増幅過程の間、特異的かつ効率的な重合化(プライマー伸長)の開始を提供する様な、適当な配列及び十分な長さのオリゴヌクレオチドを包含する。本発明の方法において使用する場合、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的に12〜30ヌクレオチド又はそれ以上を含むが、小数のヌクレオチドも含み得る。好ましくは、プライマーは18〜30ヌクレオチドを含む。正確な長さは、温度(増幅の間)、緩衝液、及びヌクレオチドの組成を含む複数の要因に依存するだろう。好ましくは、プライマーは一本鎖であるが、鎖が最初に分離されるならば二本鎖プライマーも使用され得る。プライマーは、任意の適当な方法、例えば常用のホスホトリエステル及びホスホジエステル法又は当業界で一般的に知られている自動化された態様を用いて調製され得る。
本明細書の発明の態様において使用する場合、特異的なプライマーは、好ましくは注目のゲノムの遺伝子座のそれぞれの鎖に対して実質的に相補的である様に設計される。典型的に、一方のプライマーは遺伝子座のマイナス(−)鎖(平行に位置する二本鎖DNA分子の「下方」の鎖)に対して相補的であり、そして他方はプラス(+)鎖(「上方」の鎖)に対して相補的である。適用Dの態様において使用する場合、プライマーは、好ましくはDNAのメチル化の潜在的な部位(CpGヌクレオチド)を覆い、そしてメチル化DNAから、修飾型の非メチル化DNAを識別する様に設計される。好ましくは、この配列の識別は、好ましくは対合したオリゴヌクレオチド対誤対合したオリゴヌクレオチドの異なるアニーリング温度に基づいている。適用Dの態様において、プライマーは典型的に1ないし複数のCpG配列を覆う様に設計される。好ましくは、それらは1〜5のCpG配列、そして最も好ましくは1〜4のCpG配列を覆う様に設計される。対照的に、本発明の定量的な態様において、プライマーはCpG配列を全く覆わない。
完全に「非メチル化した」(修飾型の非メチル化核酸鎖と相補的な)プライマーの組み合わせの場合、アンチセンスプライマーは、相当する(−)鎖配列において、グアノシン残基(「Gs」)の代わりにアデノシン残基(「As」)を含む。これらのアンチセンスプライマーにおいて置換されたAsは、非メチル化C残基(「Cs」)の亜硫酸水素塩修飾及びその後の増幅から生じる相当する(+)鎖領域におけるウラシル及びチミジン残基(「Us」及び「Ts」)に対して相補的であるだろう。センスプライマーは、この場合において、好ましくはアンチセンスプライマー伸長生成物に対して相補的である様に設計され、そして相当する(+)鎖配列において非メチル化Csの代わりにTsを含む。これらのセンスプライマーにおいて置換されたTsは、本来の(+)鎖における修飾型Cs(Us)に対して相補的な位置で、アンチセンスプライマーの伸長生成物に組み込まれたAsに対して相補的だろう。
完全にメチル化されたプライマー(メチル化CpG含有核酸鎖に対して相補的)の場合、アンチセンスプライマーは、本来の(+)鎖においてメチル化Csに対して相補的な相当する(−)鎖配列(すなわち、mCpG配列)のGsの代わりにAsを含まないだろう。同様に、この場合のセンスプライマーは、相当する(+)鎖のmCpG配列におけるメチル化Csの代わりにTsを含まないだろう。しかしながら、完全にメチル化したプライマーによって覆われる領域のCpG配列にはなく、そしてメチル化されていないCsは、非メチル化プライマーについて上文に記載した、完全にメチル化したプライマーの組み合わせにおいて表されるだろう。
好ましくは、適用Dの態様において利用される場合、増幅過程は、特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの存在下で、2つのオリゴヌクレオチドプライマーによる、亜硫酸水素塩で変換した核酸の増幅を提供する。プライマー及びプローブは共に、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する。更に、「メチル化」核酸の検出は、増幅を介するプローブの蛍光に基づいている。1つの態様において、蛍光はポリメラーゼ酵素の5′から3′へのエキソヌクレアーゼ活性によるプローブの分解によって生成する。別の態様において、蛍光は2つの隣接性のハイブリダイズしているプローブ間(Lightcycler(商標)の技術)又はハイブリダイズしているプローブとプライマーとの間の蛍光のエネルギー移動作用によって生じる。別の態様において、蛍光はプライマー自身によって生じる(Sunrise(商標)の技術)。好ましくは、増幅過程は、オリゴヌクレオチドプライマーを使用する、関与する反応段階の数に比例して、標的遺伝子座から指数関数的な量の増幅生成物を生成せしめる酵素的な連鎖反応である。
上述の様に、プライマーの組み合わせの一方のメンバーは(−)鎖と相補的であり、同時に他方のものが(+)鎖と相補的である。プライマーは、増幅し得る注目の領域、すなわち「アンプリコン」を一括すべく選択される。変性した標的核酸に対するプライマーのハイブリダイゼーション、それに続くDNAポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いるプライマー伸長は、アンプリコンに相当する新規な核酸鎖の合成をもたらす。好ましくは、DNAポリメラーゼは、当業界で一般的に使用される様にTaqポリメラーゼである。しかし、5′から3′へのヌクレアーゼ活性を有する相当のポリメラーゼが代わりになり得る。新規アンプリコン配列がプライマー及びポリメラーゼの鋳型でもあるので、変性、プライマーのアニーリング、及び伸長の周期の繰り返しは、アンプリコンの指数関数的な生成をもたらす。連鎖反応の生成物は、適用される特異的なプライマーの末端によって特徴づけられる終端を有する、アンプリコン配列に相当する別個の核酸の二本鎖である。好ましくは、使用される増幅方法は、PCRのものであり(Mullis et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51 : 263-273 ; Gibbs, Anal. Chem. 62 : 1202-1214, 1990)、又は更に好ましくは、当業界で一般に知られている、その自動化された態様のものである。
好ましくは、メチル化依存性の配列の差異は、蛍光を基にした定量的PCR(リアルタイム定量的PCR、Heid et al., Genome Res. 6 : 986-994, 1996 ; Gibson et al., Genome Res. 6 : 995-1001, 1996)を基にした方法によって検出される(例えば、「TaqMan(商標)」、「Lightcycler(商標)」、及び「Sunrise(商標)」の技術)。TaqMan(商標)及びLightcycler(商標)の技術の場合、配列の識別は2つの段階、(1)増幅段階、又は(2)蛍光検出段階、のいずれか又はその両方で起こり得る。「Sunrise(商標)」の技術の場合、増幅及び蛍光の段階は同一のものである。FRETハイブリダイゼーションの場合、FRETオリゴヌクレオチドのいずれか又はその両方である、Lightcycler(商標)上でのプローブの形式は、配列の差異を識別するために使用され得る。最も好ましくは、増幅過程は、本明細書の全ての発明の態様で適用される様に、蛍光を基にしたリアルタイム定量的PCRのものであり(Heid et al., Genome Res. 6 : 986-994, 1996)、これは二重標識した蛍光オリゴヌクレオチドプローブを適用している(ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, Californiaを用いる、TaqMan(商標)PCR)。
「TaqMan(商標)」PCR反応は、上流と下流(すなわち、センスとアンチセンス)のプライマー間に位置するGCに富む配列とハイブリダイズする様に設計される、TaqMan(商標)プローブと称される、延長不可能な疑問のオリゴヌクレオチドに沿う増幅プライマーの対を使用する。TaqMan(商標)プローブは、更にTaqMan(商標)オリゴヌクレオチドのヌクレオチドに結合する、リンカー部分(例えば、ホスホラミダイト)と共有結合した蛍光「レポーター部分」及び「クエンチャー部分」を含んで成る。適当なレポーター及びクエンチャー分子の例は、5′蛍光レポーター色素6FAM(「FAM」;2,7−ジメトキシ−4,5−ジクロロ−6−カルボキシ−フルオレセイン)、及びTET(6−カルボキシ−4,7,2′,7′−テトラクロロフルオロセイン);並びに3′クエンチャー色素TAMRA(6−カルボキシテトラメチルロダミン)(Livak et al., PCR Methods Appl. 4 : 357-362, 1995 ; Gibson et al., Genome Res. 6 : 995-1001 ; and 1996 ; Heid et al., Genome Res. 6 : 986-994, 1996)である。
適当なTaqMan(商標)プローブを設計するための1つの方法は、特異的な配列(AT塩基対と比較して、GCのより強い結合)、又はプライマーの長さのいずれかに起因する少なくとも10℃の融解温度の差異(プライマーの融解温度との比較)を提供するために、GCに富む配列中のCpG島の位置の変化を決定し得る、手段を容易にするソフトウェア、例えば「Primer Express」の利用を含む。
TaqMan(商標)プローブは、使用される特定の発明の方法に依存して、既知のCpGメチル化部位を覆うこともあり、又は覆わないこともある。好ましくは、適用Dの態様において、TaqMan(商標)プローブは、1〜5のCpG配列を覆うことによって、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する様に設計される。完全に非メチル化及び完全にメチル化したプライマーの組み合わせについて上文に記載した様に、TaqMan(商標)プローブは、非修飾型核酸に対して、あるいは適当な塩基置換によって、本来の非修飾型核酸試料中の完全に非メチル化し、又は完全にメチル化した、そのいずれかの亜硫酸水素塩で修飾した配列に対して、そのいずれかに相補的であるべく設計され得る。
TaqMan(商標)PCR反応における各オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブは、それぞれ亜硫酸水素塩処理後の2つの異なる配列変異体( mCpG、又はUpG)を生じ得る、ゼロないし多数の異なるCpGジヌクレオチドのどこにでも及び得る。例えば、オリゴヌクレオチドが3つのCpGジヌクレオチドに及ぶならば、ゲノムDNAにおいて生じる可能性のある配列変異体の数は、23 =8の異なる配列である。上流及び下流プライマーがそれぞれ3つのCpGに及び、そしてプローブオリゴヌクレオチド(又はFRET形式の場合、両方が一緒のオリゴヌクレオチド)が別の3つのものに及ぶならば、配列の順列の合計数は、8×8×8=512となる。理論的に、これらの512の配列変異体のそれぞれの相対的な量を定量的に解析するために、別々のPCR反応が設計され得る。実際には、定量的なメチル化情報の相当量が、それよりかなり少ない数の配列変異体の解析に由来し得る。この様に、最も単純な形態において、本発明の方法は、仮設上の例(図3の適用Dを参照のこと)において最も極端な配列変異体を表す完全にメチル化した変異体及び完全に非メチル化した変異体のための反応を設計することによって行われ得る。これら2つの反応間の比率、又は代わりとしてメチル化反応とコントロール反応(図3、適用A)との間の比率は、この遺伝子座でのDNAのメチル化レベルの測定を提供するだろう。定性的なものの更に詳細な概要を図4に示す。
適用Dの態様におけるメチル化の検出は、本明細書の他の態様の様に、プローブの増幅を介する置換に基づいている。理論的には、プローブの置換方法は、プローブをそのままにしておくか、又はプローブの消化をもたらす様に設計され得る。好ましくは、本明細書で使用する場合、プローブの置換は、増幅の間のプローブの消化によって起こる。PCR周期の伸長期の間、蛍光ハイブリダイゼーションプローブは、DNAポリメラーゼの5′から3′へのヌクレアーゼ活性によって開裂される。プローブの開裂時、レポーター部分の発光は、もはや効率的にクエンチング部分に移されず、518nmでのレポーター部分の蛍光−発光スペクトルの増大をもたらす。クエンチング部分(例えば、TAMRA)の蛍光強度は、PCR増幅の間、非常に小さく変化する。複数の要因がTaqMan(商標)PCR反応の効率に影響を及ぼすことがあり、これはマグネシウム及び塩の濃度;反応条件(時間及び温度);プライマー配列;及びPCRの標的サイズ(すなわちアンプリコンのサイズ)及び組成を含む。所定のゲノムの遺伝子座にとっての最適な蛍光強度を生むための、これらの要因の最適化はPCRの業界の者にとって明らかであり、そして好ましい条件は更に本明細書の「例」において例示する。アンプリコンは50〜8,000塩基対、又はそれ以上のサイズに及ぶことがあるが、より小さいこともある。典型的に、アンプリコンは100〜1000塩基対であり、そして好ましくは100〜500塩基対である。好ましくは、反応は、96穴のオプティカルトレイ及びキャップを用いてPCR増幅を行い、そして配列検出器(ABI Prism)を用いて、PCR増幅の間、連続的にサーマルサイクラーの全ての96穴の蛍光スペクトルの測定を行うことによってリアルタイムに監視される。好ましくは、方法Dは投入核酸の量のためのコントロールを提供し、そしてトレイからトレイへのデータを標準化するために、方法A(図3)と組み合わせて行われる。
適用C 本発明の方法は、PCR生成物の検出レベルでの配列の識別を避けるために修飾され得る。この様に、追加の定性的な方法の態様において(図3、適用C)、CpGジヌクレオチドを覆うプライマーのみが設計され、そして配列の識別は増幅のレベルで単独に起こる。好ましくは、この態様において使用されるプローブはなおもTaqMan(商標)プローブであるが、本来の非修飾型核酸に存在するCpG配列のいずれも覆わない様に設計される。適用Cの態様は、MSP技術の高処理の、蛍光を基にしたリアルタイムのものを表し、この中で実質的な改良が、メチル化CpG配列の検出に必要とれさる時間の減少によって達成された。好ましくは、反応は、96穴のオプティカルトレイ及びキャップを用いてPCR増幅を行い、そして配列検出器(ABI Prism)を用いて、PCR増幅の間、連続的にサーマルサイクラーの全ての96穴の蛍光スペクトルの測定を行うことによってリアルタイムに監視される。好ましくは、方法Cは投入核酸の量のためのコントロールを提供し、そしてトレイからトレイへのデータを標準化するために、方法Aと組み合わせて行われる。
適用B 本発明の方法はまた、PCRの増幅レベルでの配列の識別を避けるために修飾され得る(図3、A及びB)。定量的な方法の態様において(図3、適用B)、CpGジヌクレオチドを覆うプローブのみが設計され、そして配列の識別は、プローブハイブリダイゼーションのレベルでのみ起こる。好ましくは、TaqMan(商標)プローブが使用される。この型において、亜硫酸水素塩による変換段階から生じる配列変異体は、固有な増幅の偏りが無い限り、等しい効率で増幅される(Warnecke et al., Nucleic Acids Res. 25 : 4422-4426, 1997)。特定のメチル化パターンと関連する異なる配列変異体のそれぞれについての、異なるプローブの設計(例えば、3つのCpGの場合、23 =8のプローブ)は、PCR生成物の混合プールにおけるそれぞれの配列の順列の相対的な普及の定量的な決定を可能にするだろう。好ましくは、反応は、96穴のオプティカルトレイ及びキャップを用いてPCR増幅を行い、そして配列検出器(ABI Prism)を用いて、PCR増幅の間、連続的にサーマルサイクラーの全ての96穴の蛍光スペクトルの測定を行うことによってリアルタイムに監視される。好ましくは、方法Bは投入核酸の量のためのコントロールを提供し、そしてトレイからトレイへのデータを標準化するために、方法Aと組み合わせて行われる。
適用A 方法A(図3)は、それ自身では増幅又は検出のいずれかのレベルでのメチル化CpG配列の識別を提供しないが、投入DNAの量のためのコントロール反応を提供することによって、そしてトレイからトレイへのデータを標準化するために、他の3つの適用を支持し、そして有効にする。この様に、プライマーもプローブもCpGジヌクレオチドを覆わないならば、反応は偏っていない増幅を表し、そして蛍光を基にした定量的なリアルタイムPCRを用いる増幅の測定は、投入DNAの量のためのコントロールを務める(図3、適用A)。好ましくは、方法Aはプライマー及びプローブにおいてCpGジヌクレオチドを欠くだけでなく、増幅過程での亜硫酸水素塩処理のあらゆる差示的な作用を完全に回避するために、アンプリコン中にCpGを全く含まない。好ましくは、方法Aのアンプリコンは、コピー数の変化、例えば遺伝子増幅又は欠失にほとんどかけられないDNAの領域である。
前記技術の定性的なもので得られる結果を以下の例に記載する。何十ものヒト腫瘍の試料が、優れた結果を有するこの技術を用いて解析されてきた。TaqMan(商標)の機械を用いる高処理は、1つのTaqMan(商標)の機械によって、3日間で1100の解析を可能にした。
例1
最初の実験は、ゲノムDNAにおけるCpG島のメチル化状態の評価のための本発明の戦略を有効にするために行った。この実験は、4つの異なる遺伝子における、特異的な、過剰なメチル化が可能なCpG島のメチル化状態に関して、ヒト精子DNA(高度に非メチル化されていることが知られている)とHCT 116DNA(多くのCpG部位で高度にメチル化されていることが知られている、ヒト結腸直腸細胞系に由来)との間の比較を示す。COBRA(combined bisulfite restriction analysis ; Xiong and Laird, Nucleic Acids Res. 25 : 2532-2534, 1997)は、メチル化状態の独立した測定として使用した。
最初の実験は、ゲノムDNAにおけるCpG島のメチル化状態の評価のための本発明の戦略を有効にするために行った。この実験は、4つの異なる遺伝子における、特異的な、過剰なメチル化が可能なCpG島のメチル化状態に関して、ヒト精子DNA(高度に非メチル化されていることが知られている)とHCT 116DNA(多くのCpG部位で高度にメチル化されていることが知られている、ヒト結腸直腸細胞系に由来)との間の比較を示す。COBRA(combined bisulfite restriction analysis ; Xiong and Laird, Nucleic Acids Res. 25 : 2532-2534, 1997)は、メチル化状態の独立した測定として使用した。
DNAの単離及び亜硫酸水素塩処理 要約すると、ゲノムDNAはプロティナーゼK消化及びフェノール−クロロホルム抽出の標準的な方法によってヒト精子又はHCT116細胞から単離した(Wolf et al., Am. J. Hum. Genet. 51 : 478-485, 1992)。次にDNAは、最初に0.2M NaOH中で変性させ、続いて亜硫酸水素ナトリウム及びヒドロキノンの添加(それぞれ3.1M、及び0.5Mの最終濃度まで)、55℃で16時間のインキュベーション、脱塩(DNA Clean-Up System ; Promega)、0.3M NaOHによる脱スルホン化、及び最後のエタノール沈澱により、亜硫酸水素ナトリウムを用いる処理がされた(Xiong and Laird(上記)、Sadri and Hornsby, Nucleic Acids Res. 24 : 5058-5059, 1996 ; Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 1827-1831, 1992も参照のこと)。亜硫酸水素塩処理後、DNAは上述したCOBRA解析(Xiong and Laird(上記))又は蛍光を基にしたリアルタイム定量PCR(Heid et al., Genome Res. 6 : 986-994, 1996 ; Gibson et al., Genome Res. 6 : 995-1001, 1996)を用いる本発明の方法のいずれかにかけられた。
COBRA及びMsSNuPE反応 ESR1及びAPC遺伝子は、COBRA(Combined Bisulfite Restriction Analysis)を用いて解析した。COBRA解析の場合、メチル化依存性の差異は、Frommer 等によって記述されている方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 1827-1831, 1992)に従う標準的な亜硫酸水素塩処理によってゲノムDNAに導入された(1μgのサケ精子DNAが、ゲノムDNAを亜硫酸水素ナトリウムで処理する前にキャリヤーとして加えられた)。亜硫酸水素塩で変換したDNAのPCR増幅は、注目のCpG島に特異的なプライマーを用いて行い、引き続いて制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動、及び特異的な標識されたハイブリダイゼーションプローブを用いる検出を行った。ESR1及びAPC遺伝子に使用する上流及び下流プライマーの組み合わせは:それぞれTCCTAAAACTACACTTACTCC〔配列番号35〕、GGTTATTTGGAAAAAGAGTATAG〔配列番号36〕(ESR1プロモーター);及びAGAGAGAAGTAGTTGTGTTAAT〔配列番号37〕、 ACTACACCAATACAACCACAT〔配列番号38〕(APCプロモーター)である。ESR1のPCR生成物は、制限エンドヌクレアーゼTaqI及びBstUIによって消化され、一方、APC由来の生成物はTaqI及びSfaNIによって消化され、APCの場合には3つのCpG、そしてESR1の場合には4つのCpGのメチル化が測定された。消化されたPCR生成物は、変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけられ、そしてエレクトロブロッティングによってナイロン膜(Zetabind ; American Bioanalytical)に転写された。膜は注目の消化型DNAフラグメント及び末梢化型DNAフラグメントの両方を可視化するために、5′末端が標識されたオリゴヌクレオチドによってハイブリダイズされた。使用されるプローブは次の通りである:ESR1,AAACCAAAACTC〔配列番号39〕;及びAPC,CCCACACCCAACCAAT〔配列番号40〕。定量は Phosphoimager 445SI(Molecular Dynamics)で行った。計算はMicrosoftのExcelで行った。研究されたCpG部位でのDNAのメチル化レベルは、消化したPCRフラグメントの割合を計算することによって決定した(Xiong and Laird(上記))。
MLH1及びCDKN2AはMsSNuPE(Methylation - sensitive Single Nucleotide Primer Extension Assay)を用いて解析され、これはGonzalgo及びJonesによって記述されている様に行った(Nucleic Acids Res. 25 : 2529-2531)。亜硫酸水素塩で変換したDNAのPCR増幅は、注目のCpG島に特異的なプライマーを用いて行い、そして検出は追加の特異的プライマー(伸長プローブ)を用いて行った。MLH1及びCDKN2A遺伝子に使用される上流及び下流プライマーの組み合わせは:それぞれ GGAGGTTATAAGAGTAGGGTTAA〔配列番号41〕、CCAACCAATAAAAACAAAAATACC〔配列番号42〕(MLH1プロモーター);GTAGGTGGGGAGGAGTTTAGTT〔配列番号43〕、TCTAATAACCAACCAACCCCTCC〔配列番号44〕(CDKN2Aプロモーター);及びTTGTATTATTTTGTTTTTTTTGGTAGG〔配列番号45〕、CAACTTCTCAAATCATCAATCCTCAC〔配列番号46〕(CDKN2Aエキソン2)である。MsSNuPEの伸長プローブは、解析すべきCpGの5′側の近くに位置し、そして配列は: TTTAGTAGAGGTATATAAGTT〔配列番号47〕、TAAGGGGAGAGGAGGAGTTTGAGAAG〔配列番号48〕(それぞれMLH1プロモーター部位1及び2);TTTGAGGGATAGGGT〔配列番号49〕、TTTTAGGGGTGTTATATT〔配列番号50〕、TTTTTTTGTTTGGAAAGATAT〔配列番号51〕(それぞれプロモーター部位1,2、及び3);及びGTTGGTGGTGTTGTAT〔配列番号52〕、AGGTTATGATGATGGGTAG〔配列番号53〕、 TATTAGAGGTAGTAATTATGTT〔配列番号54〕(それぞれエキソン2部位1,2、及び3)である。一組の反応は、一塩基伸長のための32p−dCTP又は32p−dTTPのいずれかを用いて各試料について設定した。伸長したMsSNuPEプライマー(プローブ)は、変性ポリアクリルアミドゲルによって分離した。定量はPhosphoimagerを用いて行った。
本発明のメチル化解析 亜硫酸水素塩で変換したゲノムDNAは、5′蛍光レポーター色素(6FAM)及び3′クエンチャー色素(TAMRA)を有するオリゴヌクレオチドプローブに隣接する遺伝子座特異的PCRプライマーを用いて増幅した(Livak et al., PCR Methods Appl. 4 : 357-362, 1995)(メチル化解析に使用されるプライマー及びプローブは、本明細書の後文の「遺伝子、MethyLightプライマー及びプローブの配列」に列記する)。この例において、上流及び下流プライマー並びに相当する蛍光原性プローブは、亜硫酸水素塩変換したDNAの完全にメチル化した分子又は完全に非メチル化した分子のいずれかの間で識別するために設計された(本明細書の「本発明の詳細な説明、方法D」の中のプライマーの設計の考察を参照のこと)。プライマー及びプローブは、投入DNAの量のためのコントロール反応として完全にCpGジヌクレオチドを欠く、MYOD1遺伝子(筋原性分化遺伝子)の伸展のためにも設計された。平行の反応は、亜硫酸水素塩処理した精子及びHCT116 DNA試料上で、メチル化及び非メチル化(D)、又はコントロールオリゴ(A)による本発明の方法を用いて行った。メチル化及び非メチル化反応のために得られる値は、表1(下文)に示す比率を与えるために、MYOD1コントロール反応の値に対して標準化された。
TaqMan(商標)のプロトコールにおいて、Taq DNAポリメラーゼの5′から3′側へのヌクレアーゼ活性はプローブを開裂し、そしてレポーターを放出し、この蛍光は ABI Prism 7700 Sequence Detection System(Perkin - Elmer, Foster City, CA)のレーザー検出器によって検出された。蛍光の検出の閾値を超えた後、PCR増幅は、生成されるPCR生成物の量に比例して蛍光シグナルを生成した。開始時の鋳型の量は、蛍光シグナルがPCR反応の対数期の閾値を超える周期数から導かれ得る。複数の参照試料が、プレートからプレートへの一貫性を検証するために、それぞれのアッセイプレートに含められた。プレートは、これらの参照試料を用いて互いに標準化された。PCR増幅は、600nMの各プライマー、200nMのプローブ、200μMの各dATP、dCTP、dGTP、400μMのdUTP、5.5mMのMgCl2 、参照色素を含む1×TaqMan(商標)緩衝液A、及び亜硫酸水素塩で変換したDNA又は変換していないDNAから成る最終反応混合物により、50℃で2分、95℃で10分、続いて40周期、95℃で15秒及び60℃で1分の条件に従い、96穴オプティカルトレイ及びキャップを用いて行った。
遺伝子、MethyLightプライマー及びプローブの配列 4つのヒト遺伝子を解析のために選択した:(1)APC(腺腫性多発結腸ポリープ)(Hiltunen et al., Int. J. Cancer 70 : 644-648, 1997);(2)ESR1(エストロゲン受容体)(Issa et al., Nature Genet. 7 : 536-40, 1994);(3)CDKN2A(p16)(Ahuja, Cancer Res. 57 : 3370-3374, 1997);及び(4)hMLHI(ミスマッチ修復)(Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95 : 6870-6875, 1998 ; Veigl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95 : 8698-8702, 1998)。これらの遺伝子が選択されたのは、それらが全ての正常及び腫瘍試料中のヒト結腸直腸組織において新規のメチル化を受けることが知られている過剰なメチル化が可能なCpGを含むためである。ヒトAPC遺伝子は、例えば結腸直腸ガンの発生と結びつけられており、そして当該遺伝子の制御配列中のCpG部位は、正常な結腸の粘膜と比較して、結腸ガンにおいてより明確にメチル化されているが、前悪性ガンにおいてはメチル化されていないことが知られている(Hiltunen et al.(上記))。ヒトESR遺伝子はその5′末端にてCpG島を含み、これは年齢と共に結腸直腸の粘膜において段々とメチル化され、そして解析された全てのヒト結腸直腸腫瘍において重度にメチル化されている(Issa et al.(上記))。CDKN2A(p16)遺伝子のプロモーターが関連するCpG島の過剰なメチル化は、複数の塩基のミスマッチ修復遺伝子の1つの欠陥により、マイクロサテライト不安定性(MI)を示す結腸直腸ガンのうちの60%において見られた(Ahuja et al.(上記))。ミスマッチ修復遺伝子MLH1は、ミスマッチ修復欠損結腸直腸腫瘍の散発性のものの発生において中心的な役割を果たしている(Thibodeau et al., Science 260 : 816-819, 1993)。MLH1は、マイクロサテライト不安定性(MSI)を導く、そのプロモーター領域のDNAの過剰なメチル化によって転写的にサイレンスとなり得る(Kane et al., Cancer Res. 57 : 808-811, 1997 ; Ahuja et al.(上記);Cunningham et al., Cancer Res. 58 : 3455-3460, 1998 ; Herman et al.(上記);Veigl et al.(上記))。
亜硫酸水素塩で変換したDNA配列について特異的に設計した、PCRプライマーとプローブの5つの組み合わせは:(1)ESR1遺伝子のための完全にメチル化したDNAと完全に非メチル化したDNAを表す組み合わせ;(2)MLH1遺伝子のための完全に非メチル化した組み合わせ;(3)APC遺伝子のための完全にメチル化したものと完全に非メチル化したものとの組み合わせ;及び(4)CDKN2A(p16)遺伝子のための完全にメチル化したものと完全に非メチル化したものとの組み合わせ;及び投入DNAのためのコントロールに対するMYOD1遺伝子のための内部標識の組み合わせを使用した。メチル化及び非メチル化プライマー並びに相当するプローブは、1〜5個の潜在的なCpGジヌクレオチド部位を覆うために設計された。MYOD1内部標準プライマー及びプローブは、メチル化状態に関係無く、ゲノムDNAの偏っていないPCR増幅を可能にするために、CpGジヌクレオチドのいずれかを完全に欠くMYOD1遺伝子の領域を覆う様に設計された。上文で言及した様に、平行のTaqMan(商標)PCR反応は、亜硫酸塩で変換したメチル化及び/又は非メチル化遺伝子配列に特異的なプライマー並びにMYOD1標準プライマーを用いて行った。プライマー及びプローブの配列を以下に列記する。全ての場合において、最初に列記したプライマーは上流PCRプライマーであり、第2番目のものはTaqMan(商標)プローブであり、そして第3番目のものは下流PCRプライマーである。ESR1メチル化(GGCGTTCGTTTTGGGATTG〔配列番号1〕、6FAM 5'-CGATAAAACCGAACGACCCGACGA-3' TAMRA〔配列番号2〕、GCCGACACGCGAACTCTAA〔配列番号3〕);ESR1非メチル化(ACACATATCCCACCAACACACAA〔配列番号4〕、6FAM 5'-CAACCCTACCCCAAAAACCTACAAATCCAA-3' TAMRA〔配列番号5〕、AGGAGTTGGTGGAGGGTGTTT〔配列番号6〕);MLH1メチル化(CTATCGCCGCCTCATCGT〔配列番号7〕、6FAM 5'-CGCGACGTCAAACGCCACTACG-3' TAMRA〔配列番号8〕、CGTTATATATCGTTCGTAGTATTCGTGTTT〔配列番号9〕);APCメチル化(TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT〔配列番号10〕、6FAM 5'-CCCGTCGAAAACCCGCCGATTA-3' TAMRA〔配列番号11〕、GAACCAAAACGCTCCCCAT〔配列番号12〕);APC非メチル化(GGGTTGTGAGGGTATATTTTTGAGG〔配列番号13〕、6FAM 5'-CCCACCCAACCACACAACCTACCTAACC-3' TAMRA〔配列番号14〕、CCAACCCACACTCCACAATAAA〔配列番号15〕);CDKN2Aメチル化(AACAACGTCCGCACCTCCT〔配列番号16〕、6FAM 5'-ACCCGACCCCGAACCGCG-3' TAMRA〔配列番号17〕、TGGAATTTTCGGTTGATTGGTT〔配列番号18〕);CDKN2A非メチル化(CAACCAATCAACCAAAAATTCCAT〔配列番号19〕、6FAM 5'-CCACCACCCACTATCTACTCTCCCCCTC-3' TAMRA〔配列番号20〕、GGTGGATTGTGTGTGTTTGGTG〔配列番号21〕);及びMYOD1、(CCAACTCCAAATCCCCTCTCTAT〔配列番号22〕、6FAM 5'-TCCCTTCCTATTCCTAAATCCAACCTAAATACCTCC-3' TAMRA〔配列番号23〕、TGATTAATTTAGATTGGGTTTAGAGAAGGA〔配列番号24〕)。
表1及び表2は、4つの遺伝子;APC,ESR1,CDKN2A(p16)、及びhMLH1中のCpG島のメチル化状態についてのヒト精子及びHCT116 DNAの解析結果を示す。結果は、メチル化及び非メチル化反応とコントロール反応(MYOD1)との比率として表す。表1は、精子DNAが「非メチル化」プライマー及びプローブでのみポジティブな比率をもたらしたことを示し、これは精子DNAの既知の非メチル化状態と一致しており、そしてCOBRA解析によって決定されるパーセントのメチル化の値と一致している。すなわち、亜硫酸水素塩処理したDNA上でのプライミングは、相当するゲノムDNAにおけるCpG配列の非メチル化シトシンを含む領域から起こり、そしてそれ故に、亜硫酸水素塩処理によって脱アミノ化(ウラシルへの変換)された。
※ 値はパーセンテージを表してないが、コントロール遺伝子との標準化の後に、同一反応についての異なるDNA試料間で定量的に比較され得る任意の単位の値である。
※※ Ms−SNuPEに基づく。
※※ Ms−SNuPEに基づく。
表2は、4つの遺伝子;APC,ESR1,CDKN2A(p16)、及びhMLH1中のCpG島のメチル化状態についてのHCT116 DNAの解析結果を示す。結果は、メチル化特異的反応とコントロール反応(MYOD1)との間の比率として表されている。ESR遺伝子の場合、ポジティブな比率は「メチル化」プライマー及びプローブでのみ得られ;これはHCT116 DNAの既知のメチル化状態、及びCOBRA解析と一致している。CDKN2A遺伝子の場合、HCT116 DNAは、「メチル化」及び「非メチル化」プライマー及びプローブの両方でポジティブな比率を生み;これはHCT116 DNAの既知のメチル化状態、並びに当該遺伝子のこの領域のわずかに部分的なメチル化を示すCOBRA解析と一致している。対照的に、APC遺伝子は非メチル化反応でのみポジティブな結果を与えた。しかしながら、これはCOBRA解析と一致しており、そしてこのAPC遺伝子の領域がHCT116 DNAにおいて非メチル化であることを示している。このことは、HCT116細胞系由来のDNAの、この特定のAPC遺伝子制御領域のメチル化状態が、結腸ガンのもの(明確によりメチル化されていることが知られている)よりむしろ、正常な結腸の粘膜又は前悪性ガンのものにより類似していることを示唆し得る。
※ 値はパーセンテージを表してないが、コントロール遺伝子での標準化の後に、同一の反応についての異なるDNA 試料間で定量的に比較され得る任意の単位の値である。
※※ Ms−SNuPEに基づく。
※※ Ms−SNuPEに基づく。
例2
この例はヒト結腸直腸細胞系HCT116及びヒト精子DNAのエストロゲン受容体(ESR1)遺伝子と関連するCpG島のメチル化状態を決定するための、本発明の方法(図3のA及びD)と独立したCOBRA法(上文の「方法」を参照のこと)との比較である。このCpG島は、HCT116において高度にメチル化され、そしてヒト精子DNAにおいて非メチル化されていることが報告されてきた(Xiong and Caird(上記);Issa et al.(上記))。COBRA解析は上文に記載されている。このCpG島中の2つのTaqI部位は、これが精子DNAのメチル化の欠如及びHCT116 DNAのほぼ完全なメチル化を示していることを確認した(図5A)。更に、亜硫酸水素塩で処理したDNAと処理していないDNAを用いた結果が比較された。
この例はヒト結腸直腸細胞系HCT116及びヒト精子DNAのエストロゲン受容体(ESR1)遺伝子と関連するCpG島のメチル化状態を決定するための、本発明の方法(図3のA及びD)と独立したCOBRA法(上文の「方法」を参照のこと)との比較である。このCpG島は、HCT116において高度にメチル化され、そしてヒト精子DNAにおいて非メチル化されていることが報告されてきた(Xiong and Caird(上記);Issa et al.(上記))。COBRA解析は上文に記載されている。このCpG島中の2つのTaqI部位は、これが精子DNAのメチル化の欠如及びHCT116 DNAのほぼ完全なメチル化を示していることを確認した(図5A)。更に、亜硫酸水素塩で処理したDNAと処理していないDNAを用いた結果が比較された。
解析のために、完全に「メチル化した」ESR1及び完全に「非メチル化した」ESR1、並びにコントロールMYOD1のプライマー及びプローブは、上文の「例1」に記載されている様に設計された。精子及びHCT116 DNAの両方に対する「メチル化」、「非メチル化」又はコントロールオリゴのいずれかを用いる3つの異なる実験が行われた。上文の例1に記載の様に、メチル化及び非メチル化反応で得られた値は、図5Bに示した比率を与えるために、MYOD1コントロール反応の値に対して標準化された。精子DNAは非メチル化プライマー及びプローブでのみポジティブな比率をもたらし、これはその非メチル化状態と一致している。対照的に、主にメチル化されているESR1対立遺伝子を有するHCT116 DNAは、メチル化反応においてのみポジティブな比率を生じた(図5B)。精子及びHCT116 DNAは共にMYOD1反応においてポジティブな値を生み、これはそこに各試料にとって十分な投入DNAが存在していたことを示唆している。予想される様に、メチル化オリゴヌクレオチド又は非メチル化オリゴヌクレオチドのいずれかを用いて亜硫酸水素塩で変換しなかったDNA(図5B)は増幅されなかった。これらの結果はCOBRAでの発見と一致しており(図5A)、これは本発明のアッセイがESR1遺伝子のメチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子とを識別し得ることを示唆している。更に、反応は亜硫酸水素塩で変換したDNAに特異的であり、これは不完全な亜硫酸水素塩変換に起因する偽のポジティブな結果の生成を除外している。
例3
この例は、本発明のプライマー及びプローブの特異性を決定した。図6は、既知のメチル化状態のDNAに対するメチル化及び非メチル化オリゴヌクレオチドの特異性を更に試験するための、プライマーとプローブの全ての可能性のある組み合わせの試験を示す。ESR1「メチル化」及び「非メチル化」上流及び下流プライマー及びプローブの8個の異なる組み合わせ(上文の「例1」に記載)は、2つ1組で精子及びHCT116 DNAに対して、本発明のアッセイにおける異なる組み合わせで試験された。当該アッセイは上文の例1に記載の様に行われた。パネルA(図6)は、ESR1オリゴの組み合わせに使用される命名法を示す。「U」は、亜硫酸水素塩変換した非メチル化DNAとアニールするオリゴ配列を意味し、一方、「M」はメチル化型を意味する。位置1は上流PCRプライマー、位置2はプローブ、そして位置3は下流プライマーを示す。8つの反応に使用される組み合わせは、2つ1組の実験を表す、棒の対のそれぞれの下方に示される。結果はESR1の値とMYOD1コントロール値との比率として表される。パネルBはヒト精子DNAの解析を表す。パネルCはヒト結腸直腸細胞系HCT116から得られるDNAの解析を表す。
この例は、本発明のプライマー及びプローブの特異性を決定した。図6は、既知のメチル化状態のDNAに対するメチル化及び非メチル化オリゴヌクレオチドの特異性を更に試験するための、プライマーとプローブの全ての可能性のある組み合わせの試験を示す。ESR1「メチル化」及び「非メチル化」上流及び下流プライマー及びプローブの8個の異なる組み合わせ(上文の「例1」に記載)は、2つ1組で精子及びHCT116 DNAに対して、本発明のアッセイにおける異なる組み合わせで試験された。当該アッセイは上文の例1に記載の様に行われた。パネルA(図6)は、ESR1オリゴの組み合わせに使用される命名法を示す。「U」は、亜硫酸水素塩変換した非メチル化DNAとアニールするオリゴ配列を意味し、一方、「M」はメチル化型を意味する。位置1は上流PCRプライマー、位置2はプローブ、そして位置3は下流プライマーを示す。8つの反応に使用される組み合わせは、2つ1組の実験を表す、棒の対のそれぞれの下方に示される。結果はESR1の値とMYOD1コントロール値との比率として表される。パネルBはヒト精子DNAの解析を表す。パネルCはヒト結腸直腸細胞系HCT116から得られるDNAの解析を表す。
完全に非メチル化した組み合わせ(反応1)又は完全に非メチル化した組み合わせ(反応8)だけが、精子及びHCT116、それぞれについてのポジティブな反応をもたらした。他の組み合わせはネガティブであり、これは当該PCR条件が誤対合のオリゴヌクレオチドの弱いアニーリングを可能にしないことを示唆している。このことは、選択的に本発明の方法が、高い特異性の程度により、完全にメチル化した対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子とを識別し得ることを示唆している。
例4
この例は、本発明の方法が再現可能であることを示している。図7は、メチル化及び非メチル化対立遺伝子の異種の集団を研究するために、同一の患者に由来する原発性結腸直腸ガン及び対応する正常な粘膜由来のDNA試料(図8の試料10N及び10T)中のESR1遺伝子座のメチル化状態の解析を例示する。結腸直腸組織の試料は、下文の例5に記載する様に回収した。更に、本発明の方法の再現性は、各アッセイについての8個の独立した反応を行うことによって試験された。ESR1反応及びMYOD1コントロール反応の結果は、個々の反応の標準誤差が評価され得る様に、比率ではなく、これらの反応について得られた生の絶対値を表す。この値はプレート標準化されたが、投入DNAについて補正はされなかった。棒は8個の独立した反応で得られた平均値を示す。誤差棒は平均値の標準誤差を表す。
この例は、本発明の方法が再現可能であることを示している。図7は、メチル化及び非メチル化対立遺伝子の異種の集団を研究するために、同一の患者に由来する原発性結腸直腸ガン及び対応する正常な粘膜由来のDNA試料(図8の試料10N及び10T)中のESR1遺伝子座のメチル化状態の解析を例示する。結腸直腸組織の試料は、下文の例5に記載する様に回収した。更に、本発明の方法の再現性は、各アッセイについての8個の独立した反応を行うことによって試験された。ESR1反応及びMYOD1コントロール反応の結果は、個々の反応の標準誤差が評価され得る様に、比率ではなく、これらの反応について得られた生の絶対値を表す。この値はプレート標準化されたが、投入DNAについて補正はされなかった。棒は8個の独立した反応で得られた平均値を示す。誤差棒は平均値の標準誤差を表す。
図7は、メチル化反応の平均値が正常な組織と比較して、腫瘍においてより高いことを示し、一方、非メチル化反応は反対の結果を示した。8個の独立した測定について得られた標準誤差は比較的小幅であり、そしてTaqMan(商標)技術を利用している他の研究で報告されたものに相当していた(Fink et al., Nature Med. 4 : 1329-1333, 1998)。本発明の方法の可変性のうちのいくつかは確率的PCR(PCRバイアス)の結果であり、これは低い鋳型の濃度で起こり得る(Warnecke et al., Nucleic Acids Res. 25 : 4422-4426, 1997)。要約すれば、これらの結果は、本発明の方法が複雑な、異種DNA試料について、再現性がある結果をもたらし得ることを示唆している。
例5
この例は25個の一対組み合わせのヒト結腸直腸試料における、MLHI発現、マイクロサテライト不安定性及びMLH1プロモーターのメチル化の比較を示す。本発明の方法の主な利益は、特定の遺伝子座のメチル化状態のために、ヒト腫瘍を素速くスクリーニングする能力である。更に、遺伝子発現のための代理のマーカーとしてのDNAメチル化の解析は、腫瘍についての臨床的に有用な情報を得るための新規な方法である。我々は、MLH1プロモーターのメチル化状態を問い合わせることによって、本発明の方法の有用性を試験した。ミスマッチ修復遺伝子MLH1は、ミスマッチ修復欠損結腸直腸腫瘍の散発性の病気の進行において中心的な役割を果たしている(Thibodeau et al., Science 260 : 816-819, 1993)。MLH1は、マイクロサテライト不安定性(MSI)を導く、そのプロモーター領域のDNAの過剰なメチル化によって転写的にサイレンスと成り得ることが報告されてきた(Kane et al., Cancer Res. 57 : 808-811, 1997 ; Ahuja et al., Cancer Res. 57 : 3370-3374, 1997 ; Cunningham et al., Cancer Res. 58 : 3455-3460, 1998 ; Herman, J. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 : 6870-6875, 1998 ; Veigl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 : 8698-8702, 1998)。
この例は25個の一対組み合わせのヒト結腸直腸試料における、MLHI発現、マイクロサテライト不安定性及びMLH1プロモーターのメチル化の比較を示す。本発明の方法の主な利益は、特定の遺伝子座のメチル化状態のために、ヒト腫瘍を素速くスクリーニングする能力である。更に、遺伝子発現のための代理のマーカーとしてのDNAメチル化の解析は、腫瘍についての臨床的に有用な情報を得るための新規な方法である。我々は、MLH1プロモーターのメチル化状態を問い合わせることによって、本発明の方法の有用性を試験した。ミスマッチ修復遺伝子MLH1は、ミスマッチ修復欠損結腸直腸腫瘍の散発性の病気の進行において中心的な役割を果たしている(Thibodeau et al., Science 260 : 816-819, 1993)。MLH1は、マイクロサテライト不安定性(MSI)を導く、そのプロモーター領域のDNAの過剰なメチル化によって転写的にサイレンスと成り得ることが報告されてきた(Kane et al., Cancer Res. 57 : 808-811, 1997 ; Ahuja et al., Cancer Res. 57 : 3370-3374, 1997 ; Cunningham et al., Cancer Res. 58 : 3455-3460, 1998 ; Herman, J. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 : 6870-6875, 1998 ; Veigl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 : 8698-8702, 1998)。
高処理の本発明の方法を用いて、例1の適用Dに記載されている様に、25個の一対組み合わせのヒト結腸直腸腺ガン及び正常な粘膜から成る50個の試料が、MLH1のCpG島のメチル化状態について解析された。ACTB(β−アクチン)に対して標準化されたMLH1の発現レベルの定量的RT−PCR(TaqMan(商標))解析が研究された。更に、各試料のマイクロサテライト不安定性(MSI)の状態が、BAT25及びBAT26の遺伝子座のPCRによって解析された(Parsons et al., Cancer Res. 55 : 5548-5550, 1995)。25個の対になった腫瘍と正常な粘膜組織の試料は、原発性結腸直腸腺ガンを有する25人の患者から得た。この患者は、平均年齢68.8才の、39〜88才の年齢に及ぶ16人の男性及び9人の女性から構成された。正常な検体に対する腫瘍からの粘膜の距離は10〜20cmであった。約2gの外科的に摘出した組織は直ちに液体窒素中で冷凍され、そしてRNA及びDNAの単離まで−80℃で保存された。
定量的RT−PCR及びマイクロサテライト不安定性解析 mRNAレベルの定量は、リアルタイム蛍光検出を用いて行った。TaqMan(商標)反応は、1UのAmpErase(ウラシルN−グリコシラーゼ)の添加を除いて、上文の前記アッセイについて記載されている様に行った。RNAの単離後、cDNAは概説されている様に各試料から調製した(Bender et al., Cancer Res. 58 : 95-101, 1998)。要約すると、RNAは、グアニジンイソチオシアネート(4M)、N−ラウリルサルコシン(0.5%)、クエン酸ナトリウム(25mM)、及び2−メルカプトエタノール(0.1M)を含む緩衝液中での組織の溶解、標準的なフェノール−クロロホルム抽出、及び50%イソプロパノール/50%溶解緩衝液中での沈澱によって単離した。cDNAの調製のために、RNA試料は、ランダムヘキサマー、デオキシヌクレオチド三リン酸、及びSuperscriptII(商標)逆転写酵素(Life Technologies, Inc. Palo Alto, CA)を用いて逆転写した。生じたcDNAは、続いてMLH1及びACTBに特異的なプライマーで増幅された。ゲノムDNAによるRNA試料の汚染は、事前のcDNA変換無しに全てのRNA試料の解析によって排除された。相対的な遺伝子発現は、MLH1遺伝子及び内部標準遺伝子ACTBの限界のサイクル(特異的なプローブによる検出に必要とされるPCRサイクルの数)に基づいて決定された。ACTB及びMLH1遺伝子の上流プライマー、プローブ及び下流プライマーの配列は:ACTB(TGAGCGCGGCTACAGCTT〔配列番号25〕、6FAM 5'-ACCACCACGGCCGAGCGG-3' TAMRA〔配列番号26〕、CCTTAATGTCACACACGATT〔配列番号27〕);及びMLH1(GTTCTCCGGGAGATGTTGCATA〔配列番号28〕、6FAM
5'-CCTCAGTGGGCCTTGGCACAGC-3' TAMRA〔配列番号29〕、TGGTGGTGTTGAGAAGGTATAACTTG〔配列番号30〕)である。
5'-CCTCAGTGGGCCTTGGCACAGC-3' TAMRA〔配列番号29〕、TGGTGGTGTTGAGAAGGTATAACTTG〔配列番号30〕)である。
多数のポリアデニン(「pA」)配列の変化は、ゲノムを通して広範に分布しており、これはマイクロサテライト不安定性を用いて腫瘍を特徴づけるのに有用な特性である(Ionov et al., Nature 363 : 558-561, 1993)。マイクロサテライト不安定性(MSI)は、概説されている様に、BAT25(c−kit発ガン遺伝子のイントロン由来の25塩基対のpAトラクト)及びBAT26(ミスマッチ修復遺伝子hMSH2のイントロン由来の26塩基対のpAトラクト)の遺伝子座のPCR及び配列解析によって決定した(Parsons et al., Cancer Res. 55 : 5548-5550, 1995)。要約すると、BAT25及びBAT26の遺伝子座のセグメントは、各遺伝子座についての1つの32P標識プライマー及び1つの未標識プライマーを用いて、30サイクル増幅された。反応は尿素−ホルムアミドゲル上で解明し、そしてフィルムに暴露した。BAT25及びBAT26の増幅に使用した上流及び下流プライマーは:BAT25(TCGCCTCCAAGAATGTAAGT〔配列番号31〕、TCTGCATTTTAACTATGGCTC〔配列番号32〕);及びBAT26(TGACTACTTTTGACTTCAGCC〔配列番号33〕、AACCATTCAACATTTTTAACCC〔配列番号34〕)である。
図8は、本発明の方法によって決定される場合のMLH1遺伝子発現、MSI状態及びMLH1のプロモーターのメチル化の間の相関を示す。上側のチャートは、対応する正常(斜線の棒)及び腫瘍(黒棒)の結腸直腸試料の定量的リアルタイムRT−PCR(TaqMan(商標))によって測定されたMLH1の発現レベルを示す。発現レベルはMLH1とACTBとの間の測定値の比率として表される。マイクロサテライト不安定性状態(MSI)は、2つのチャートの間に位置している丸によって示される。BAT25及びBAT26の遺伝子座の解析によって決定される場合に、黒丸はMSIポジティブであることを示し、一方、白丸は試料がMSIネガティブであることを示す。下側のチャートは、本発明の方法によって決定される場合のMLH1遺伝子座のメチル化状態を示す。メチル化レベルは、MLH1メチル化反応とMYOD1反応との間の比率として表される。
4つの結腸直腸腫瘍は、相当する正常な組織と比較して、有意にメチル化レベルが増大した。これらのうちの1つ(腫瘍17)が、本発明の方法によって計測される場合に、MLH1メチル化の特に高い程度を示した。腫瘍17は共にMSIポジティブ(黒丸)であった唯一の試料であり、そしてMLH1が転写的にサイレンスであることを示した。残りのメチル化腫瘍は小幅なレベルでMLH1を発現し、そしてMSIネガティブ(白丸)であった。これらの結果は、MLH1が腫瘍17において複対立遺伝子的にメチル化され、後成的なサイレンス及びその結果としてのマイクロサテライト不安定性が生じることを示し、一方、他の腫瘍はMLH1プロモーターの過剰なメチル化の程度がより低いことを示し、そして未変化の対立遺伝子からの発現を可能にする、唯一のメチル化対立遺伝子を1つだけ有し得る。従って、本発明の方法は重大な生物学的情報、例えばガンの過程に関する遺伝子の転写的なサイレンスと関係している、ヒト腫瘍におけるプロモーターのCpG島の過剰なメチル化の情報を素速くもたらすことができる。
Claims (26)
- DNAのゲノム試料中のシトシンのメチル化及びメチル化されたCpG島を検出するための方法であって、
(a)DNAのゲノム試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を生成せしめる修飾剤とを接触させ;
(b)1又は複数の特異的なオリゴヌクレオチドプローブの存在下又は非存在下で、2つのオリゴヌクレオチドプライマーによって変換した核酸を増幅し、ここで、1又は複数のオリゴヌクレオチドプライマー及び/又は特異的なプローブは、非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別することができる;そして
(c)前記プローブの増幅を介する消化に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法。 - 増幅段階がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である、請求項1に記載の方法。
- 修飾剤が亜硫酸水素塩である、請求項1に記載の方法。
- 変換した核酸が、非修飾型核酸を含む試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む、請求項1に記載の方法。
- プローブが更に1又は複数の蛍光ラベル部分を含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 増幅及び検出段階が蛍光に基づいた定量的PCRを含んで成る、請求項5に記載の方法。
- メチル化CpG含有核酸を検出するための方法であって、
(a)核酸含有試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を形成せしめる修飾剤とを接触させ;
(b)CpG特異的オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、オリゴヌクレオチドプライマーによって試料中の変換した核酸を増幅し、ここで、前記プライマーではなく、CpG特異的プライマーが、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する;そして
(c)CpG特異的プローブの増幅を介する置換に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法。 - 増幅段階がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含んで成る、請求項7に記載の方法。
- 修飾剤が亜硫酸水素塩を含んで成る、請求項7に記載の方法。
- 変換した核酸が、非修飾型核酸含有試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む、請求項7に記載の方法。
- 検出方法が、CpG特異的プローブの増幅を介する置換に基づいた蛍光シグナルの測定によるものである、請求項7に記載の方法。
- 増幅及び検出方法が、蛍光に基づいた定量的PCRを含んで成る、請求項7に記載の方法。
- 核酸試料中のメチル化量が、投入した核酸の量のためのコントロール反応との参照に基づいて定量的に決定される、請求項7に記載の方法。
- メチル化CpG含有核酸を検出するための方法であって、
(a)核酸含有試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を形成せしめる修飾剤とを接触させ;
(b)オリゴヌクレオチドプライマーによって、そしてCpG特異的オリゴヌクレオチドプローブの存在下で試料中の変換した核酸を増幅し、ここで、前記プライマー及びCpG特異的プライマーの両方が、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する;そして
(c)CpG特異的プローブの増幅を介する置換に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法。 - 増幅段階がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含んで成る、請求項14に記載の方法。
- 修飾剤が亜硫酸水素塩を含んで成る、請求項14に記載の方法。
- 変換した核酸が、非修飾型核酸含有試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む、請求項14に記載の方法。
- 検出方法が、CpG特異的プローブの増幅を介する置換に基づいて蛍光シグナルを測定することを含んで成る、請求項14に記載の方法。
- 増幅及び検出方法が、蛍光に基づいた定量的PCRである、請求項14に記載の方法。
- メチル化CpG含有核酸の検出にとって有用なメチル化検出キットであって、これが
(i)非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を生成せしめる修飾剤を含む第一容器;
(ii)変換した核酸の増幅のためのプライマーを含む第二容器;
(iii)コントロールの非修飾型核酸の増幅のためのプライマーを含む第三容器;及び
(iv)検出が増幅を介する置換に基づいている、特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含む第四容器、
を含んで成る、1又は複数の容器を近接した制限で内部に収容するために区分されている輸送手段を含んで成り、プライマー及びプローブのそれぞれが非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別し得るか又はし得ないキット。 - 修飾剤が亜硫酸水素塩である、請求項20に記載のキット。
- 修飾剤がシトシン残基をウラシル残基へと変換する、請求項20に記載のキット。
- 特異的なオリゴヌクレオチドプローブがCpG特異的オリゴヌクレオチドプローブであり、そして変換した核酸の増幅のためのプライマーではなく、プローブが修飾型非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する、請求項20に記載のキット。
- 特異的なオリゴヌクレオチドプローブがCpG特異的オリゴヌクレオチドプローブであり、そしてプローブ及び変換した核酸の増幅のためのプライマーの両方が、修飾型非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する、請求項20に記載のキット。
- プローブが更に、直接的に又はリンカー部分を介してオリゴヌクレオチド塩基と連結した蛍光部分を含んで成る、請求項20に記載のキット。
- プローブが特異的な、二重標識したTaqMan(商標)プローブである、請求項20に記載のキット。
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