DE69328528T2

DE69328528T2 - D-Ketohexose-3-Epimerase, und seine Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE69328528T2
Application number: DE69328528T
Authority: DE
Inventors: Ken Izumori; Keiji Tsusaki
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1992-10-08
Filing date: 1993-10-06
Publication date: 2000-10-12
Anticipated expiration: 2013-10-07
Also published as: EP0592202A3; US5411880A; KR940009331A; TW232029B; US5679562A; EP0592202B1; DE69328528D1; KR100278757B1; JP3333969B2; JPH06125776A; EP0592202A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft D-Ketohexose-3-epimerase, ihre Herstellung sowie ihre Verwendung.
Wie in der Enzyme Nomenclature, veröffentlicht von der Academic Press Inc., USA, 1992, beschrieben, wirken Epimerasen auf zahlreiche Saccharide. Da jedoch konventionelle Epimerasen, wie Ribulose-phosphat-3-epimerase (EC 5.1.3.1) und UDP-glucose-4-epimerase (EC 5.1.3.2), hauptsächlich auf Saccharide wirken, die mit Phosphaten oder UDP verbunden sind, sind sie nicht für eine Produktion von freien, neutralen Sacchariden im industriellen Maßstab geeignet. Es waren lediglich 2 Epimerasen bekannt, d. h. Aldose-1-epimerase (EC 5.1.3.3) und Cellobiose-epimerase (EC 5.1.3.11), die auf freie Saccharide wirken. Die erste katalysiert die Epimerisierung zwischen α- und β-Isomeren von Aldosen an ihren C-1-Positionen, während die zweite die Epimerisierung zwischen α- und β-Isomeren der Cellobiose katalysiert. Obwohl ein großer Bedarf an Epimerasen, die auf freie Ketosen wirken, bestand, wurde die Existenz solcher Stoffe bisher nicht bestätigt.
Es bestand ein großer Bedarf, eine Ketose-Epimerase, die auf freie Ketosen wirkt, zu erhalten sowie ihre Herstellung und ihre Verwendung festzulegen.
Wir haben zahlreiche Epimerasen, die leicht freie Ketopentosen und Ketohexosen zu ihren korrespondierenden, epimeren Ketopentosen und Ketohexosen epimerisieren, untersucht. Als Resultat haben wir schließlich D-Ketohexose-3- epimerase gefunden und ihre Herstellung festgelegt und haben ebenso eine Methode, D-Ketohexose, D-Ketopentose und L-Ketopentose unter Einsatz des Enzyms umzuwandeln, ein Verfahren für die Produktion umgewandelter Ketosen und ein Verfahren für die Produktion von Süßstoffen, die diese enthalten, festgelegt. Auf diese Weise haben wir die vorliegende Erfindung fertiggestellt. Ganz besonders ist die erfindungsgemäße D-Ketohexose-3-epimerase ein neues Enzym, welches eine Aktivität besitzt, D-Ketohexose an ihrer C-3-Position zu ihrer korrespondierenden, epimeren Ketohexose zu epimerisieren, und die folgenden physikochemischen Eigenschaften zeigt:

1. Wirkungs- und Substrat-Spezifität

Sie epimerisiert D-Ketohexose an ihrer C-3-Position zu ihrer korrespondierenden, epimeren D-Ketohexose.
Sie epimerisiert D- und L-Ketopentosen an ihren C-3-Positionen zu ihren korrespondierenden, epimeren D- und L-Ketopentosen;

2. Optimaler pH und pH-Stabilität

sie besitzt einen optimalen pH von 7-10 und ist stabil bei pH 5-10;

3. Optimale Temperatur und thermische Stabilität

sie besitzt eine optimale Temperatur von ca. 60ºC und ist stabil bis hinauf zu 50ºC; und

4. Ultraviolett-Absorptions-Spektrum

sie zeigt eine Absorption bei einer Wellenlänge von 275-280 nm.
Die vorliegende Erfindung wird nun darüber hinaus lediglich beispielhaft beschrieben unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und die beigefügten Abbildungen, von denen:
Fig. 1 den optimalen pH des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt.
Fig. 2 die pH-Stabilität des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt.
Fig. 3 die optimale Temperatur des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt.
Fig. 4 die thermische Stabilität des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt.
Fig. 5 das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt.
Fig. 6 das Schema einer Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt.
Fig. 7 ein Infrarot-Absorptions-Spektrum von D-Sorbose zeigt, die nach der vorliegenden Erfindung aus D-Tagatose hergestellt wurde.
Fig. 8 ein Infrarot-Absorptions-Spektrum einer Standard-D-Sorbose zeigt.
In Fig. 5 das Symbol "A" Rinderserum-Albumin (BSA); das Symbol "B" Ovalbumin; das Symbol "C" das erfindungsgemäße Enzym (D- Ketohexose-3-epimerase); das Symbol "D" Chymotrypsinogen A; und das Symbol "E" Cytochrom C zeigt.
In Fig. 6 das Symbol "I" den Startpunkt der Elektrophorese; das Symbol "II" das erfindungsgemäße Enzym (D-Ketohexose-3-epimerase); und das Symbol "III" Bromphenol-Blau zeigt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft D-Ketohexose-3-epimerase, ihre Herstellung sowie ihre Verwendung.
Wir haben zahlreiche Epimerasen, die leicht freie Ketopentosen und Ketohexosen zu ihren korrespondierenden, epimeren Ketopentosen und Ketohexosen epimerisieren, untersucht. Als Resultat haben wir schließlich D-Ketohexose-3- epimerase gefunden und ihre Herstellung festgelegt und haben ebenso eine Methode, D-Ketohexose, D-Ketopentose und L-Ketopentose unter Einsatz des Enzyms umzuwandeln, ein Verfahren für die Produktion umgewandelter Ketosen und ein Verfahren für die Produktion von Süßstoffen, die diese enthalten, festgelegt. Auf diese Weise haben wir die vorliegende Erfindung fertiggestellt. Ganz besonders ist die erfindungsgemäße D-Ketohexose-3-epimerase ein neues Enzym, weiches eine Aktivität besitzt, D-Ketohexose an ihrer C-3-Position zu ihrer korrespondierenden, epimeren D-Ketohexose zu epimerisieren, und die folgenden physikochemischen Eigenschaften zeigt:

1. Wirkungs- und Substrat-Spezifität

2. Optimaler pH und pH-Stabilität

sie besitzt einen optimalen pH von 7-10 und ist stabil bei pH 5-10;

3. Optimale Temperatur und thermische Stabilität

4. Ultraviolett-Absorptions-Spektrum

sie zeigt eine Absorption bei einer Wellenlänge von 275-280 nm.
Die erfindungsgemäße D-Ketohexose-3-epimerase wird üblicherweise durch die Züchtung von Mikroorganismen, die in der Lage sind, D-Ketohexose-3- epimerasen zu produzieren, erhalten.
Beispiele für Mikroorganismen, die vorteilhaft für die Erfindung eingesetzt werden können, sind Bakterien des Stammes Pseudomonas, einschließlich Pseudomonas cichorü ST-24 (FERM BP-2736) und ihre Abkömmlinge, die in der japanischen Patentveröffentlichung No. 266,996/91 beschrieben werden.
D-Ketohexose-3-epimerase wird durch die Züchtung eines solchen Bakteriums in einer Nährlösungskultur, die Kohle-Quellen, Stickstoff-Quellen, Minerale, Vitamine und ähnliches für ca. 1-5 Tage enthält, vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, wie z. B. Belüften und Rühren, hergestellt und aus den erhaltenen Zellen und/oder der überstehenden Flüssigkeit gewonnen. Die resultierende Kultur ist als rohe D-Ketohexose-3-epimerase brauchbar. Bei Bedarf kann die Kultur durch konventionelle Verfahren, wie Filtration, Zentrifugieren, Aussalzen, Dialyse, Konzentration und Gefriertrocknen, vor ihrem Einsatz teilweise gereinigt werden. Für den Fall, dass eine höhere Reinheit gefordert wird, wird die Kultur durch Absorption und Resorption unter Einsatz eines Ionenaustauschers, Gelfiltration, Einstellen des isoelektrischen Punktes, Elektrophorese, Hochleistungs-Flüssigchromatographie (hier später als "HPLC" abgekürzt), Affinitäts-Chromatographie und/oder Absorption und Desorption unter Einsatz von monoklonalen Antikörpern auf den höchstmöglichen Reinheitsgrad gebracht.
Bei der Umwandlungsreaktion, bei der eines oder mehrere Mitglieder ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus D-Ketohexose, D-Ketopentose und L- Ketopentose, an ihren C-3-Positionen zu ihrer korrespondierenden, epimeren D- Ketohexose, D-Ketopentose und L-Ketopentose epimerisiert werden, kann die D- Ketohexose-3-epimerase auf die übliche Weise festgehalten werden und vorteilhaft bei Wiederholungs- oder weiterführenden Reaktionen eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäße Umwandlungsreaktion wird üblicherweise unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Die Substrat-Konzentration wird in den Bereich von 1-60 Gew.-%, vorteilhaft ca. 5-50 Gew.-%; die Reaktionstemperatur in den Bereich von 10-70ºC, vorteilhaft ca. 30-60ºC; der pH der Reaktion in den Bereich von 5-10, vorteilhaft in den Bereich von ca. 7 - 10; und der Anteil an Enzym auf mindestens eine Einheit pro Gramm Substrat, vorteilhaft 50 - 5,000 Einheiten pro Gramm Substrat gelegt. Die Reaktionszeit kann willkürlich gewählt werden, üblicherweise liegt sie bei einem Batch-Betrieb aus ökonomischen Gesichtspunkten im Bereich von 5-50 Stunden.
Reaktionsmischungen, die durch die vorliegende Umwandlungsreaktion erhältlich sind und neu gebildete Ketosen und als Ausgangsmaterial unveränderte Ketosen enthalten, können vorteilhaft unverändert als Süßstoff sowie als Wirkstoff zur Vermittlung von Feuchtigkeit, zur Verhinderung der Kristallisation und zum Verleihen von Glanz eingesetzt werden. Die Reaktionsmischungen werden gewöhnlich durch sukzessive Entfärbung mit Aktivkohle, Aussalzen mit einem Ionenaustauscher in H- und OH-Form und Konzentration auf die übliche Art zu sirupartigen Produkten verarbeitet.
Bei Bedarf können die so erhaltenen Konzentrate leicht und ohne Schwierigkeiten über eine chromatographische Säule, unter Einsatz eines stark sauren Kationenaustauschers in Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Form, getrennt und gereinigt werden, um die neu gebildeten Ketosen und die als Ausgangsmaterial unveränderten Ketosen zu erhalten, gefolgt von einer Konzentration der Ketosereichen Fraktionen zu sirupartigen Produkten. Wenn die Ketosen kristallisierbar sind, werden sie vorteilhaft zu kristallinen Produkten auskristallisiert. Die abgetrennten Ketosen können vorteilhaft als Ausgangsmaterial für die nächste Umwandlungsreaktion eingesetzt werden.
Die abgetrennten Ketosen können vorteilhaft als Süßstoff eingesetzt werden, besonders um oral einzunehmende Produkte, wie Lebensmittel, Getränke, Futtermittel, Tiernahrung, Zahnpasta, Katechu, sublinguale Wirkstoffe und inwendige Arzneimittel auf geeignete Weise zu süßen und ihre Geschmacksqualität zu verbessern. Die Ketosen können auch vorteilhaft als Kohle-Quelle für die Fermentation, als chemisches Reagenz sowie als Ausgangsstoff und Zwischenprodukt für Chemikalien und Arzneimittel eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Eine Nährlösungskultur, die aus 0.2 Gew.-% Ammoniumsulfat, 0.24 Gew.- % mono-basischem Kaliumphosphat, 0.56 Gew.-% di-basischem Kaliumphosphat, 0.01 Gew.-% Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0.5 Gew.-% Hefe-Extrakt, 1 Gew.-% D-Glucose und destilliertem Wasser besteht, wurde in einen Gärbehälter gegeben, bei 120ºC für 20 Minuten sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen mit 1 Vol.-% einer Keim-Kultur der Pseudomonas cichorü ST-24 (FERM BP-2736) geimpft, gefolgt von einer Züchtung bei 30ºC für 40 Stunden unter Belüften und Rühren. Die Zellen, die aus 80 Litern der resultierenden Kultur erhalten wurden, wurden durch Mahlen in Gegenwart von aktiver Tonerde zerkleinert und anschließend verarbeitet, um ein Enzym in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.5) zu extrahieren.
Die erhaltene rohe Enzymlösung wurde in Gegenwart von Manganchlorid durch wiederholte fraktionierte Sedimentation unter Einsatz von Polyäthylenglykol 6,000 (hier später als "PEG" abgekürzt) gereinigt. Der Niederschlag, der sich in der rohen Enzymlösung bei einer PEG-Konzentration von 5-18 Gew.-% in Gegenwart von 0.1 M Manganchlorid bildete, wurde in einer frisch bereiteten Lösung des gleichen Puffers gelöst. Die rohe Enzymlösung wurde weiterhin über die oben genannte fraktionierte Sedimentation gereinigt. Die resultierende Lösung wurde für 20 Minuten auf 50ºC erhitzt und die entstehenden degenerierten Proteine wurden durch Zentrifugieren entfernt. Das resultierende Produkt wurde gereinigt, indem man es an "DEAE-TOYOPEARL® 650M", einem Produkt der Tosho Corporation, Tokyo, Japan, absorbieren ließ und die absorbierte Substanz mit einer Kaliumchlorid-Lösung auswusch. Das so erhaltene gereinigte Produkt wurde durch Ultrafiltration unter Einsatz von "Toyo Roshi UK-10", einer Filtermembran, die von der Toyo Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Japan vertrieben wird, demineralisiert und über eine Gel-Filtration unter Einsatz von "Sephadex® G150", einem Produkt der Pharmacia, Uppsala, Schweden, konzentriert und gereinigt. Fraktionen mit einer Aktivität wurden durch Einstellung des isoelektrischen Punktes unter Einsatz von "Ampholine®, einem Produkt der Pharmacia, Uppsala, Schweden, konzentriert und gereinigt.
Die so erhaltene Enzym-Probe wurde wie folgt geprüft: Die Reaktionslösung, die bei dieser Prüfung eingesetzt wurde, bestand aus 100 Mikroliter 50 mM Tris-HCl- Puffer (pH 7.5), 50 Mikroliter 40 mM D-Tagatose, und 50 Mikroliter einer Enzymlösung. Die Enzym-Reaktion wurde für 60 Minuten bei 30ºC durchgeführt und die gebildete D-Sorbose wurde über HPLC quantifiziert. Eine Einheit der Enzym-Aktivität ist definiert als der Anteil an Enzym, der ein Mikromol der D- Tagatose pro Minute epimerisiert.
Der Reinigungsprozess entspricht dem in der Tabelle 1 wiedergegebenen Bild. Tabelle 1
Wie aus den Ergebnissen der Tabelle 1 ersichtlich ist, verbesserte der Reinigungsschritt die spezifische Aktivität des rohen Enzyms ca. um das 290- fache und ergab eine Ausbeute von ca. 2%. Die physikochemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen D-Ketohexose-3-epimerase wurden anhand der zuletzt erhaltenen Probe dieser Reinigungsschritte untersucht:

(1) Wirkungs- und Substrat-Spezifität

D-Ketohexose-3-epimerase wirkt auf jede der vier D-Ketohexosen (D- Tagatose, D-Sorbose, D-Fructose und D-Psicose) unter den acht D- und L- Ketohexosen und epimerisiert sie an ihren C-3-Positionen zu ihren korrespondierenden, epimeren D-Ketohexosen. Sie wirkt auf alle vier D- und L-Ketopentosen (D- und L- Xylulose, D- und L-Ribulose) und epimerisiert sie an ihren C-3-Positionen zu ihren korrespondierenden, epimeren D- und L-Ketopentosen.
Das Enzym katalysiert am stärksten die jeweiligen Umwandlungsreaktionen der D-Tagatose und D-Sorbose. Die Aktivität bei den Umwandlungsreaktionen von D-Fructose und D-Psicose betrug ca. 30-40 bezogen auf die jeweiligen Umwandlungsreaktionen von D-Tagatose und D-Sorbose. Während die Aktivität bei den Umwandlungsreaktionen zwischen D- und L-Ketosen bei ca. 10-30% von der von D-Tagatose und D-Sorbose lag. Alle Reaktionen waren reversible Gleichgewichtsreaktionen und benötigten keine Koenzyme und Metall-Ionen.

(2) Optimaler pH und pH-Stabilität

Der optimale pH wurde gemäß der vorher erwähnten Enzym-Untersuchung festgelegt. Die Ergebnisse entsprechen dem Bild, das in Fig. 1 wiedergegeben wird. In der Abbildung zeigt das Symbol "- -" 50 mM Citrat- Puffer; das Symbol "- -" 50 mM Malonat-Puffer; das Symbol "- -" 50 mM Tris-HCl-Puffer; und das Symbol "- -" 50 mM Glycin-NaOH-Puffer. Wie aus Fig. 1 offensichtlich wird, betrug der optimale pH 7-10.
Die pH-Stabilität des Enzyms wurde durch inkubation über 60 Minuten bei 30ºC und anschließendes Messen der verbliebenen Aktivität untersucht. Die Ergebnisse werden in der Fig. 2 gezeigt. Wie aus Fig. 2 offensichtlich wird, war das Enzym bei pH 5-10 stabil.

(3) Optimale Temperatur und thermische Stabilität

Die optimale Temperatur des Enzyms wurde gemäß der vorher erwähnten Enzym-Untersuchung festgelegt. Aus den Resultaten in Fig. 3 ergab sich eine optimale Temperatur um ca. 60ºC. Die thermische Stabilität wurde anhand von Inkubation in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.5) über 10 Minuten bei verschiedenen Temperaturen und anschließende Bestimmung der Rest-Aktivität untersucht. Wie aus Fig. 4 offensichtlich wird, war das Enzym bis hinauf zu 50ºC stabil.

(4) Ultraviolett-Absorptions-Spektrum

Das Enzym zeigt eine Absorption bei einer Wellenlänge von 275-280 nm.

(5) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des Enzyms wurde durch Gel-Filtrations- Chromatographie unter Einsatz einer Säule (1.2 · 100 cm), die mit "Sephadex® G150" gepackt war, bestimmt, wobei 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.5) als Extraktionsmittel eingesetzt wurde und der Kolonne mit einer Fließgeschwindigkeit von 0.15 ml/min zugegeben wurde. Die Ergebnisse werden in Fig. 5 wiedergegeben. In der Abbildung zeigt das Symbol "A" Rinderserum-Albumin, 67,000 Dalton; das Symbol "B" Ovalbumin, 45,000 Dalton; das Symbol "C" das erfindungsgemäße Enzym; das Symbol "D" Chymotrypsinogen A, 12,500 Dalton; und das Symbol "E" Cytochrom C, 12,500 Dalton. Wie aus Fig. 5 offensichtlich wird, wurde das Molekulargewicht des Enzyms (C) mit 43,000 ± 3,000 bestimmt, auf Basis der Standardkurve, die durch die graphische Auswertung der Molekulargewichte der Proteine A, B, D und E, die bekannt waren, gefertigt wurde.

(6) Der isoelektrische Punkt

Nach der Analyse bei der Bestimmung des isoelektrischen Punktes unter Einsatz von "Ampholine®" zeigte das Enzym einen isoelektrischen Punkt des Enzyms bei pH 4.3 ± 0.2.

(7) Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

Fig. 6 zeigt das Schema einer Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese des Enzyms. In der Abbildung zeigt das Symbol "I" den Startpunkt; das Symbol "II" das erfindungsgemäße Enzym; und das Symbol "III" Bromphenol-Blau. Es wird offensichtlich aus Fig. 6, dass das Enzym ein einzelnes Band zeigte.

Beispiel 2

Umwandlungsreaktion von D-Tagatose und D-Sorbose Eine fünf Gew.-%ige, wässerige D-Tagatose-Lösung (pH 7.5) wurde mit 500 Einheiten/g D-Tagatose einer teilweise gereinigten Enzymlösung, die den Reinigungsschritten bis zu der zweiten Fraktionierung unter Einsatz von PEG in Beispiel 1 unterworfen worden war, versetzt und die Mischung wurde für 30 Stunden bei 40ºC einer Enzym-Reaktion unterzogen. Nach Beendigung der Reaktion wurde die resultierende Reaktionsmischung auf die übliche Art mit Aktivkohle entfärbt, mit "Diaion SK1 B (H-form)" und "Diaion WA30 (OH&supmin;form)", Produkten der Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japan, demineralisiert und im Vakuum aufkonzentriert, um einen ca. 60%igen, transparenten Sirup zu ergeben, der D-Tagatose und D-Sorbose enthält. Der Sirup wurde über Säulenchromatographie unter Einsatz von "Dowex 50 W-X4", einem stark sauren Kationenaustauscher der Dow Chemical Company, Midland, Michigan, USA, separiert und gereinigt, dann konzentriert, kristallisiert und separiert, um eine kristalline D-Sorbose mit einer Ausbeute von ca. 55% zu erhalten. Die physikochemischen Eigenschaften des Produktes waren wie folgt: Der Schmelzpunkt betrug 165ºC und die spezifische Drehung betrug [α]D/20 = + 44.0º (C = 10%, H&sub2;O). Das Infrarot-Absorptions-Spektrum (Fig. 7 zeigt das Spektrum des Produktes und Fig. 8 zeigt D-Sorbose als Standard) hatte eine gute Übereinstimmung mit dem der D-Sorbose. Basierend auf diesen Resultaten handelte es sich bei dem erhaltenen Saccharid, das aus D-Tagatose durch Enzym-Reaktion umgewandelt worden war, um D-Sorbose. Das Produkt kann vorteilhaft als Süßstoff, als Kohle-Quelle bei der Fermentation, als chemisches Reagenz sowie als Ausgangsstoff und Zwischenprodukt für Chemikalien und Arzneimittel eingesetzt werden. Die Enzym-Reaktion ist eine reversible Reaktion, so dass leicht D-Tagatose erhalten wird, wenn D-Sorbose als Ausgangsstoff eingesetzt wird.

Beispiel 3

Umwandluncisreaktion von D-Fructose und D-Psicose

Eine zehn Gew.-%ige, wässerige D-Fructose-Lösung (pH 7.5) wurde mit 1,500 Einheiten/g D-Fructose einer teilweise gereinigten Enzym-Lösung, die den Reinigungsschritten bis zu der Reinigung unter Einsatz von DEAE-TOYOPEARL® in Beispiel 1 unterworfen worden war, versetzt und die Mischung wurde für 30 Stunden bei 45ºC einer Enzym-Reaktion unterzogen. Nach Beendigung der Reaktion wurde die resultierende Mischung, ähnlich wie in Beispiel 2, entfärbt, demineralisiert und im Vakuum konzentriert, um einen transparenten Sirup zu ergeben, der D-Psicose enthält. Der Sirup wurde über Säulenchromatographie unter Einsatz eines stark sauren Kationenaustauschers, ähnlich wie in Beispiel 2, abgetrennt und gereinigt, um eine sirupartige D-Psicose mit einer Ausbeute von ca. 25%, gerechnet auf trockner, fester Basis (d.s.b.), zu erhalten.
Die physikochemischen Eigenschaften zeigten eine gute Übereinstimmung mit denen der Standard-D-Psicose. Das Produkt wird vorteilhaft als Süßstoff, Kohle- Quelle bei der Fermentation, chemisches Reagenz sowie als Ausgangsmaterial und Zwischenstoff für Chemikalien und Arzneimittel eingesetzt. Die Enzym- Reaktion ist eine reversible Reaktion, so dass D-Fructose leicht erhalten wird, wenn D-Psicose als Ausgangsmaterial eingesetzt wird.

Beispiel 4

Umwandlungsreaktion von D-Fructose und D-Psicose

Eine zehn Gew.-%ige, wässerige D-Fructose-Lösung (pH 7.0) wurde mit 1,000 Einheiten/g D-Fructose einer teilweise gereinigten Enzymlösung, die den Reinigungsschritten bis zu zweiten Fraktionierung unter Einsatz von PEG in Beispiel 1 unterworfen worden war, versetzt und die Mischung wurde für 30 Stunden bei 50ºC einer Enzym-Reaktion unterzogen. Nach Beendigung der Reaktion wurde die resultierende Mischung, ähnlich wie in Beispiel 2, entfärbt, demineralisiert und im Vakuum konzentriert, um einen transparenten Sirup zu ergeben, der D-Fructose und D-Psicose in einer Ausbeute von ca. 90%, d.s.b., enthält. Das Produkt wird passend eingesetzt als hochwertiger Süßstoff mit einer großen Süßkraft und vorteilhaft als Wirkstoff zu Vermittlung von Feuchtigkeit, zur Verhinderung der Kristallisation und zur Verleihung von Glanz sowie als Süßstoff für Lebensmittel und Getränke eingesetzt.

Beispiel 5

Umwandlungsreaktion von D-Xylulose und D-Ribulose

Eine ein Gew.-%ige, wässerige D-Xylulose-Lösung (pH 7.5) wurde mit 3,000 Einheiten/g D-Xylulose einer teilweise gereinigten Enzymlösung, die den Reinigungsschritten bis zur Reinigung unter Einsatz von DEAE-TOYOPEARL® in Beispiel 1 unterworfen worden war, versetzt und die Mischung wurde für 50 Stunden bei 35ºC einer Enzym-Reaktion unterzogen. Nach Beendigung der Reaktion wurde die resultierende Mischung, ähnlich wie in Beispiel 2, entfärbt, demineralisiert und im Vakuum konzentriert, um einen transparenten Sirup, der D- Ribulose enthält, zu ergeben. Ähnlich wie in Beispiel 2, wurde der Sirup über Säulenchromatographie unter Einsatz eines stark sauren Kationenaustauschers abgetrennt und gereinigt, um sirupartige D-Ribulose mit einer Ausbeute von ca. 20 %, d.s.b., zu erhalten. Die physikochemischen Eigenschaften zeigten eine gute Übereinstimmung mit denen der Standard-D-Ribulose. Das Produkt wird vorteilhaft als Süßstoff, Kohle-Quelle bei der Fermentation, als chemisches Reagenz sowie als Ausgangsmaterial und Zwischenstoff für Chemikalien und Arzneimittel eingesetzt. Die Enzym-Reaktion ist eine reversible Reaktion, so dass D-Xylulose leicht erhalten wird, wenn D-Ribulose als Ausgangsmaterial eingesetzt wird.

Beispiel 6

Umwandluncisreaktion von L-Xylulose und L-Ribulose

Eine ein Gew.-%ige, wässerige L-Xylulose-Lösung (pH 7.5) wurde mit 3,000 Einheiten/g L-Xylulose einer teilweise gereinigten Enzymlösung, die den Reinigungsschritten bis zur Reinigung unter Einsatz von DEAE-TOYOPEARL® in Beispiel 1 unterworfen worden war, versetzt und die Mischung wurde für 50 Stunden bei 35ºC einer Enzym-Reaktion unterzogen. Nach Beendigung der Reaktion wurde die resultierende Reakionsmischung, ähnlich wie in Beispiel 2, entfärbt, demineralisiert und im Vakuum konzentriert, um einen transparenten Sirup, der L-Ribulose enthält, zu ergeben. Ähnlich wie in Beispiel 2, wurde der Sirup über Säulenchromatographie unter Einsatz eines stark sauren Kationenaustauschers abgetrennt und gereinigt, um sirupartige L-Ribulose mit einer Ausbeute von ca. 20%, d.s.b., zu erhalten. Die physikochemischen Eigenschaften zeigten eine gute Übereinstimmung mit denen der Standard-L- Ribulose. Das Produkt wird vorteilhaft als Süßstoff, Kohle-Quelle bei der Fermentation, als chemisches Reagenz sowie als Ausgangsmaterial und Zwischenstoff für Chemikalien und Arzneimittel eingesetzt. Die Enzym-Reaktion ist eine reversible Reaktion, so dass L-Xylulose leicht erhalten wird, wenn L- Ribulose als Ausgangsmaterial eingesetzt wird.
Wenn man die erfindingsgemäße D-Ketohexose-3-epimerase auf freie D- Ketohexose, D-Ketopentose und L-Ketopentose einwirken lässt, werden diese Ketosen an ihren C-3-Positionen epimerisiert, um leicht ihre korrespondierende, epimere D-Ketohexose, D-Ketopentose und L-Ketopentose zu bilden. Das Reaktionssystem öffnet den Weg für eine Produktion von Ketosen im industriellen Maßstab, was bisher als sehr schwierig erachtet wurde. Somit kommt dem Auffinden der D-Ketohexose-3-epimerase und der Festlegung der Herstellung und Anwendung eine große Bedeutung für den Bereich der Saccharide herstellenden Industrie sowie der Lebensmittelindustrie, pharmazeutischen und kosmetischen Industrie zu.
Wenn beschrieben wurde, welche aus heutiger Sicht als die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung anzusehen sind, werden selbstverständlich die zahlreichen Modifikationen, die darin enthalten sind, auch gesehen und es ist beabsichtigt, mit den beigefügten Ansprüchen alle diese Modifikationen, sofern sie unter den wahren Sinn und Umfang der Erfindung fallen, abzudecken.

Claims

1. Eine D-Ketohexose-3-epimerase, welche die folgenden physikalisch chemischen Eigenschaften aufweist:

a) Wirkungs- und Substrat-Spezifität

Sie epimerisiert D-Ketohexose an ihrer C-3-Position in ihre korrespondierende epimere D-Ketohexose.

Sie epimerisiert D- und L-Ketopentosen an ihren C-3-Positionen in ihre korrespondierenden epimeren D- und L-Ketopentosen;

b) Optimaler pH-Wert und pH-Stabilität

Sie besitzt einen optimalen pH-Wert von 7-10 und eine stabile Aktivität bei einem pH-Wert von 5-10;

c) Optimale Temperatur und thermische Stabilität Sie besitzt eine optimale Temperatur von ca. 60ºC und weist eine stabile Aktivität bis zu einer Temperatur von 50ºC auf;

d) Titer-Bestimmung

Lässt man sie auf D-Ketohexose einwirken, so epimerisiert sie D- Ketohexose an ihrer C-3-Position zu ihrer korrespondierenden epimeren D-Ketohexose;

e) Ultraviolett-Absorptions-Spektrum

Sie zeigt eine Absorption bei einer Wellenlänge 275-280 nm;

f) Molekulargewicht

41,000 ± 3,000 Daltons über Gel-Filtrations-Säulenchromatographie

g) Isoelektrischer Punkt

4. 3 ± 0.2 bei einer Einstellung des isoelektrischen Punktes unter Einsatz von "Ampholine"; und

h) Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

Sie zeigt ein einzelnes Band.

2. Eine D-Ketohexose-3-epimerase, welche aus Pseudomonas cichorii ST-24, FERM BP-2736 erhalten werden kann.

3. Ein Verfahren zur Präparation einer D-Ketohexose-3-epimerase, das

a) die Kultivierung eines Bakteriums, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas cichorü ST-24, FERM BP-2736 und seinen Abkömmlingen, die in der Lage sind, die D-Ketohexose-3- epimerase gemäß Anspruch 1 zu produzieren, in einer nährstoffhaltigen Bakterienkultur für 1-5 Tage, um die D-Ketohexose zu produzieren; und

b) die Gewinnung der D-Ketohexose-3-epimerase aus der Kultur umfasst.

4. Ein Verfahren zur Umwandlung der Struktur von Ketose, das

a) die Einwirkung von D-Ketohexose-3-epimerase gemäß Anspruch 1 bei einem pH-Wert von 5-10 und einer Temperatur von 10-70ºC auf eine Lösung, die ein oder mehrere Mitglieder, ausgewählt aus der Gruppe D-Ketohexose, D-Ketopentose und L-Ketopentose, enthält; und

b) eine Epimerisierung der Ketose(n) an ihrer C-3-Position umfasst.

5. Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem die Konzentration der Ketose(n) in Schritt a) im Bereich von 1-60 Gew.-% liegt.

6. Ein Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, bei dem man zwischen 50 und 5000 Einheiten der D-Ketohexose-3-epimerase auf die Lösung in Schritt a) pro Gramm Substrat, das die Lösung enthält, einwirken lässt.

7. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4-6, bei dem man die D- Ketohexose-3-epimerase auf die Lösung in Schritt a) für einen Zeitraum im Bereich von 5-50 Stunden einwirken lässt.

8. Ein Verfahren zur Herstellung von Ketose, welches

a) die Einwirkung von D-Ketohexose-3-epimerase gemäß Anspruch 1 auf eine Lösung, die ein oder mehrere Mitglieder, ausgewählt aus der Gruppe D-Ketohexose, D-Ketopentose und L-Ketopentose;

b) die Epimmerisierung der Ketose(n) an ihrer C-3-Position zur korrespondierenden, epimeren Ketose(n); und

c) die Rückgewinnung der resultierenden epimerisierten Ketose(n) umfasst.

9. Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem Schritt c) durch eine Methode, ausgewählt aus der Gruppe Absorption und Desorption unter Einsatz eines Ionen-Austauschers, Gel-Filtration, Einstellen des isoelektrischen Punktes, Elektrophorese, Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Affinitätschromatographie, Säulenchromatographie unter Einsatz eines stark sauren Kationen-Austausch-Harzes und Absorption und Desorption unter Einsatz monoklonaler Antikörper, bewirkt wird.

10. Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem der Schritt b) zusätzlich einen Schritt zur Konzentration und Kristallisation der epimerisierten Ketose(n) umfasst.

11. Ein Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, bei dem das stark saure Kationen- Austauscher-Harz in Form eines Alkali- oder Erdalkali-Metallsalzes vorliegt.

12. Ein Verfahren zur Herstellung eines Ketose enthaltenden Süßstoffes, das einen Schritt zur Herstellung der Ketose gemäß einem der Ansprüche 8-11 umfasst.