DE69131404T2

DE69131404T2 - Enzymatische Synthese löslicher Phosphatide aus Phospholipiden

Info

Publication number: DE69131404T2
Application number: DE69131404T
Authority: DE
Inventors: Frank Marziani; Frank G. Pilkiewicz; John A.F. Tino; Paul A. Tremblay
Original assignee: Liposome Co Inc
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1990-04-17
Filing date: 1991-04-16
Publication date: 1999-11-25
Anticipated expiration: 2011-04-17
Also published as: ES2132780T3; DE69123145D1; ATE145244T1; DK0727491T3; CA2080907C; EP0528834B1; EP0727491A1; DE69131404D1; HU9203258D0; AU646458B2; EP0528834A4; HU212928B; CA2080907A1; DE69123145T2; JP3169132B2; WO1991016444A1; JPH05509222A; PT97391B; GR3022375T3; NZ237845A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft eine verbesserte Synthese löslicher Phosphatide aus Phospholipiden unter Verwendung des Enzyms Phospholipase D als Katalysator, wodurch hohe Ausbeuten hochreiner löslicher Phosphatide erhalten werden.
Phosphatide wie Phosphatidylglycerin sind wertvolle, nützliche Produkte, die für die Herstellung von Liposomen- und Lipidkomplexen verwendet werden.
Phosphatidylglycerine und andere Phosphatide werden bisher durch Mischen einer wäßrigen Pufferlösung, die Calciumacetat, Essigsäure und ein Enzym (Phospholipase D) und Glycerin oder einen anderen primären Alkohol enthält, mit einem Phosphatidyllipid, z. B. Phosghatidylcholin, das in einem nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel gelöst wurde, hergestellt. Zur Aktivierung des Enzyms wird entweder ein Lösungsmittel wie Ether verwendet, oder es wird zur Emulgierung des Gemischs aus wasserunlöslicher und wäßriger Lösung ein Tensid zugegeben.
Zur Aktivierung des Enzyms werden Dimethylether, Diethylether und andere Ether verwendet, wie von Redemann beschrieben (PCT-Anmeldung Nr. WO 89/01524, veröffentlicht am 23. 02. 1989), doch sind diese bekanntermaßen wegen ihrer leichten Brennbarkeit und ihrer Peroxidbildungseigenschaften gefährlich, die die Selbstoxidation der Phosphatide fördern. Aufgrund der sehr niedrigen Dichte von Ethern im Vergleich zu Wasser ist für eine gute Mischung des Gemischs von Phasen außerdem kräftiges Schütteln erforderlich, was sich manchmal schwer auf Produktionsmengen für kommerzielle Herstellung übertragen läßt.
Tenside sind ebenfalls nützlich zur Aktivierung des Enzyms, doch lassen sie sich schwer aus dem gewünschten Produkt entfernen. Um ein Phosphatidyl mit einem nützlichen Reinheitsgrad zu erhalten, müssen deshalb umständliche, kostenaufwendige säulenchromatographische Trennungen durchgeführt werden. Die Anwesenheit relativ großer Wassermengen bewirkt außerdem eine Hydrolyse und die Erzeugung von Phosphatidylsäure, die die Ausbeute des gewünschten Phosphatidprodukts reduziert und ebenfalls vom gewünschten Phosphatid getrennt werden muß.
Das Enzym erfordert außerdem einen optimalen pH-Bereich, was die Verwendung von Pufferlösungen nötig macht. Das Enzym erfordert auch ein bivalentes Kation wie z. B. ein Calciumion im Reaktionsgemisch, das das Phosphatid in Form eines Salzes des Calcium- oder anderen bivalenten Kations erzeugt, das sich aus der Lösung abscheidet und daher schwer löslich gemacht werden kann. Wenn die Calciumsalze mit Hilfe von Ansäuerung oder Ionenaustauschharz und Neutralisation in ihre löslicheren monovalenten Salze umgewandelt werden, erfolgt eine sehr schnelle Hydrolyse zusammen mit einer Ausfällung von Zersetzungsprodukten wie Lysophosphatidylglycerin oder Phosphatidylsäure, mit den oben genannten Problemen.
In einem Versuch, die Ausbeute von Phosphatiden wie Phosphatidylglycerin zu verbessern, wurde ein Verfahren beschrieben, in dem ein Phosphatidyllipid in einem organischen Lösungsmittel mit Phospholipase D zur Reaktion gebracht wird, die auf einem Träger mit hydrophoben Gruppen fixiert wurde. Als Lösungsmittel kommen Diethylether oder ein Alkan in Frage, das Phosphatidyllipide wie Phosphatidylcholin lösen kann. Die Reaktion erfolgt bei einer Temperatur unter dem Siedepunkt des organischen Lösungsmittels, z. B. 15 bis 35ºC. Die Ausbeute des gewünschten Phosphatids ist jedoch gering, in der Größenordnung von 45%, und die Verwendung der Etherlösungsmittel ist unpraktisch, da sie sehr leicht brennbar und gefährlich sind.
Enzyme and Microbial Biotechnology 1987, Bd. 9, Nr. 6, Seiten 350-354, L. Juneja et al., offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylglycerin, bei dem Glycerin mit Phospholipase D, Calciumchlorid, einem Acetatpuffer und Diethylether als organischem Lösungsmittel inkubiert wird, mit allen Nachteilen, die mit der Verwendung von Etherlösungsmitteln verbunden sind.
JP-A-62 205 788 offenbart, daß andere Lösungsmittel neben Ethylether verwendet werden können, schlägt jedoch nicht die Umwandlung eines divalenten Kationphosphatidsalzes in ein monovalentes Salz vor.
WO 89/01524 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylglycerin, welches Umwandlung seines Calciumsalzes in sein Ammoniumsalz umfaßt. Sie zieht nicht die kombinierte Verwendung von Natrium- und Ammoniumsalz in Betracht.
Aus diesem Grund wird seit langem nach einem ungefährlichen, einfachen Verfahren mit höherer Ausbeute zur Herstellung von. Phosphatiden gesucht, bei dem die Phosphatide in Form eines wasserlöslichen, monovalenten, stabilen Salzes erhalten werden.
Diese Umesterungsreaktion wurde in der Vergangenheit gewöhnlich in einem Zweiphasensystem mit Ether durchgeführt, um die Reaktion auf eine nützliche Geschwindigkeit zu aktivieren. Die Reaktion war jedoch selten quantitativ abschätzbar, da auch signifikante Mengen Phosphatidsäure erzeugt wurden. Aufgrund des großen Dichteunterschieds zwischen dem Ether und der wäßrigen Phase lieferten im großen Maßstab durchgeführte Reaktionen außerdem begrenzte Ausbeuten, weil das Mischen nicht ausreichend war. Der Einsatz von Detergenzien ist möglich, doch verursachten diese größere Schwierigkeiten bei der Reinigung des Produkts.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Phospholipid wie z. B. Phosphatidylcholin mit einem primären Alkohol zur Reaktion gebracht werden, und zwar in Anwesenheit von (i) einem Enzym-Katalysator wie z. B. Phospholipase D, (ii) einem anderen Lösungsmittel als Ether, das weder zerstörend noch denaturierend auf das Enzym wirkt und weniger leicht brennbar als Ether ist, und (iii) einer gepufferten, bivalenten Salzlösung, vorzugsweise Calciumsalz, um den entsprechenden Phosphatidylester in Form eines bivalenten Salzes zu bilden. Das unlösliche bivalente Salz wird in ein organisches, lösliches, stabiles monovalentes Salz umgesetzt, indem das bivalente Salz in einem organischen Lösungsmittel suspendiert und eine stöchiometrische Menge eines festen, monovalenten Salzes zugegeben wird, das das Phosphatid löslich macht und gleichzeitig das Calciumsalz des Anions des zugegebenen monovalenten Kationensalzes abscheidet. Mit diesem Verfahren wird das monovalente Salz des Phosphatids ohne wesentliche Bildung von Hydrolyseprodukten wie Phosphatidylsäure hergestellt.
Es wurde auch festgestellt, daß die Löslichkeit und Stabilität eines bestimmten Estersalzes, gemischten Ammonium-/Natriumsalzes von Dimyristoylphosphatidylglycerin, maximiert wird, wenn das Verhältnis von Ammonium- zu Natriumionen ein bestimmtes Gewichtsverhältnis beträgt und die Menge der vorhandenen bivalenten Kationen begrenzt ist. Es wurde festgestellt, daß der prozentuale Gewichtsanteil der Ammoniumionen zwischen etwa 2,0 und etwa 2,6 Gewichtsprozent des gemischten Salzes und der prozentuale Gewichtsanteil der Natriumionen zwischen etwa 0,3 und etwa 0,8 Gewichtsprozent des gemischten Salzes betragen sollte, damit die Stabilität und Löslichkeit eines gemischten Ammonium-/Natriurnsalzes von Dimyristoylphosphatidylglycerin in einem organischen Lösungsmittel maximiert wird. Der maximale Calciumgehalt sollte etwa 0,1 und vorzugsweise etwa 0,05 Gewichtsprozent des gemischten Salzes betragen.
Weiterhin wurde festgestellt, daß die enzymatische Reaktion von Phospholipase D mit Phosphatidylcholin und -glycerin oder einem anderen Alkohol durch Anwendung von Zentrifugal-Verteilungschromatographie [Centrifugal Partition Chromatography - CPC] stark gefördert werden kann.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Abb. 1 ist ein Diagramm der Löslichkeit in Methylenchlorid von gemischtem Dimyristoylphosphatidylglycerinsalz in Abhängigkeit vom Ammoniumionengehalt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das vorliegende Verfahren ist ein Zweistufenprozeß zur Bildung eines monovalenten Salzes eines Phosphatidylesters, der umfaßt:
a) Reaktion eines Phospholipids mit einem primären Alkohol in Anwesenheit von
(i) Phospholipase D;
(ii) einer Pufferlösung, die ein zweiwertiges Kation enthält und
(iii) einem mit Wasser nicht mischbaren nicht-etherischen Lösungsmittel zur Bildung des entsprechenden zweiwertigen Kation-Phosphatidsalzes; und
b) Umwandlung des zweiwertigen Kation-Phosphatidsalzes in ein lösliches einwertiges Salz durch
(i) Suspendieren des zweiwertigen Kation Phosphatidsalzes in einem organischen Lösungsmittel;
(ii) Zusatz zu der Suspension von einem einwertigen Salz, umfassend ein Kation, welches Natrium und Ammonium umfaßt und ein Anion, das zur Bildung einer Ausfällung mit dem zweiwertigen Kation geeignet ist.
Aufgrund ihrer höheren Löslichkeit und Stabilität sind die erfindungsgemäßen Substanzen von besonderem Nutzen für Liposomen- und Lipidkomplexverbindungen.
Liposomen sind vollständig geschlossene Lipid-Doppelschichtmembranen, die im Inneren eine wäßrige Lösung enthalten. Liposomen können monolamellare Vesikel (einzelne Doppelschichtmembran) oder multilamellare Vesikel (zwiebelähnliche Gebilde mit mehreren Doppelschichtmembranen, die jeweils durch eine wäßrige Schicht voneinander getrennt sind) sein. Die Doppelschicht besteht aus zwei Lipid- Einzelschichten mit einem hydrophoben "Schwanzbereich" und einem hydrophilen "Kopfbereich". In der Membrandoppelschicht sind die hydrophoben (apolaren) "Schwänze" der Lipid-Einzelschichten zur Mitte der Doppelschicht gerichtet, während die hydrophilen (polaren) "Köpfe" zur wäßrigen Phase ausgerichtet sind.
Liposomen, die Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC), Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG) und Amphotericin B einschließendes Cholesterol enthalten, sind für die Behandlung von systemischen Pilzinfektionen nützlich. Juliano et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 1985, 446: 390-402; Lopez-Berenstein et al., J. Infect. Dis., 1986, 151 : 704-710.
In der PCT-Druckschrift Nr. WO 88/06443 mit dem Titel "Low Toxicity Drug- Lipid Systems", Janoff et al., veröffentlicht am 7. 9. 1988, werden Verfahren zur Herstellung von Komplexen mit hohem Arzneimittel-Lipid-Verhältnis aus Arzneimittelassoziierten Lipiden in partikulärer, Nichtliposomen-Form ("high drug : lipid complexes", HDLC) beschrieben sowie von Liposomen, die ein bestimmtes Verhältnis von DMPC und DMPG enthalten. Die Phospholipide werden in Lösungsmitteln wie Chloroform und Methylenchlorid löslich gemacht.
Zur Herstellung von HDLC wird ein Arzneimittel, besonders wenn das Arzneimittel ein antifungales Polyethylen-Antibiotikum wie z. B. Amphotericin B ist, zunächst in einem biokompatiblen organischen Lösungsmittel wie z. B. Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Methanol löslich gemacht, und anschließend wird die erhaltene Lösung mit Lipiden wie z. B. DMPC : DMPG im Molverhältnis 7 : 3 gemischt, die in einem Lösungsmittel wie z. B. Methylenchlorid löslich gemacht wurden. Die Lösungsmittel werden unter reduziertem Druck verdampft, so daß eine dünne Lipid-Arzneimittel- Schicht erhalten wird. Diese Schicht wird in einer wäßrigen Lösung wie z. B. Kochsalzlösung, phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder Glycinpuffer hydratisiert, so daß HDLC entstehen. Die wäßrige Lösung kann auch dem Lösungsmittel enthaltenden Arzneimittel und der Lipidphase vor der Verdampfung des Lösungsmittels zugegeben werden. Eine weitere Alternative besteht darin, die erhaltene trockene Lipid-Arzneimittel- Schicht nochmals in einem Lösungsmittel wie z. B. Methylenchlorid zu suspendieren und vor der Hydratisierung der Schicht nochmals unter reduziertem Druck zu verdampfen. Es kann auch ein Dehydratationsverfahren benutzt werden, bei dem eine trockene Lipid- Arzneimittel-Schicht zu einer Flocke dehydratisiert wird, die mit wäßriger Lösung hydratisiert wird. In einem alternativen Verfahren zur Herstellung von HDLCs werden Lipidpartikel gebildet, die eine mit dem MLV-Verfahren hergestellte bioaktive Substanz enthalten und die Partikel dann einem Heizzyklus bei etwa 25 bis etwa 60ºC unterworfen.
Die ihr die vorliegende Erfindung brauchbaren Phospholipide sind eine Klasse natürlicher und synthetischer Lipide, die eine oder mehrere Phosphatidylgruppen enthalten. Zu dieser Klasse gehören Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure, Dimyristoylphosphatidylcholin und Phosphatidylinositol. Phosphatidylcholin in hochreiner Form ist kommerziell leicht erhältlich und wird deshalb bevorzugt.
Der hier zur Veranschaulichung dienende primäre Alkohol ist Glycerin, doch können auch andere primäre Alkohole wie Sulfocholin, Ethylenglykol, Glycidol, Ribose, Ethanolamin, Glycerinformal u. ä. verwendet werden. Einfache primäre Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol u. ä. müssen sorgfältig ausgeschlossen werden, da sie sehr schnell reagieren und die entsprechenden Alkylester gebildet werden.
Die geeigneten bivalenten kationischen Puffer haben einen pH-Wert von etwa 5,7 und enthalten ein bivalentes Kation wie z. B. Calcium. Das Kation sollte in bezug auf das Enzym inaktiv sein. Der Puffer kann beispielsweise eine Lösung mit einer oder mehreren der folgenden Substanzen sein: Calciumhydroxid, Calciumchlorid oder Calciumacetat mit Essigsäure oder Natriumacetat.
Das für die vorliegende Erfindung brauchbare nicht oder schwer brennbare, nicht mit Wasser mischbare Lösungsmittel ist eines, das schwerer brennbar als Diethylether bzw. Dimethylether ist, einen Flammpunkt über 0ºC und vorzugsweise über 20ºC aufweist und das Enzym nicht so degradiert oder denaturiert, daß dessen Aktivität auf einen Wert reduziert wird, der mehr als etwa 25% unter dem von Diethylether liegt. Zu den geeigneten Lösungsmitteln für das vorliegende Verfahren gehören halogenierte Lösungsmittel wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorethylen, Trichlorfluormethan u. ä. Aliphatische oder aromatische Ester, Alkane, Ketone oder Ester mit einem Molekulargewicht unter etwa 5000 können ebenfalls verwendet werden, wie z. B. Ethylacetat, Ethylpropionat, Ethylbutyrat, Methylacetat, Methylpropionat, 3-Pentanon, 3- Heptanon, 2-Octanon, 2-Butanon, 2-Pentanon, 2-Heptanon, 3-Oetanon, 4-Heptanon, und ähnliche.
Die obengenannten Reaktionspartner werden durch Rühren oder Schütteln zusammengemischt, um den ursprünglichen Phosphatidylester, z. B. Phosphatidylcholin, in das bivalente kationische Salz des gewünschten Produktes, z. B. das Calciumsalz von Phosphatidylglycerin, umzuwandeln.
Im allgemeinen ist energiearmes Mischen wie Rühren oder Verwirbeln ausreichend, um mindestens etwa 80% der geplanten Ausbeute des bivalenten kationischen Salzes zu erhalten.
Die Umesterungsreaktion des Enzyms mit dem Phospholipid und dem Alkohol kann durch Anwendung von Zentrifugal-Verteilungschromatographie [Centrifugal Partition Chromatography, CPC] gefördert werden (Cazes, J., "High Performance CPC for Downstream Processing of Biomaterials", American Biological Laboratories, Juni 1989, 17-23). Eine stationäre wäßrige Phase, die aus einem geeigneten Puffer von etwa 5,6 wie z. B. Natriumacetat besteht, wird mit Calciumchlorid, einem geeigneten Alkohol und dem Enzym in die Zentrifuge gegeben. Die Zentrifuge wird in Bewegung gesetzt, und eine mobile Phase, die aus einem organischen, nichtalkoholischen Lösungsmittel wie z. B. Ethylacetat oder Ethylbutyrat besteht und das Phospholipid enthält, wird in das CPC- System gepumpt. Das Calciumsalz des gesättigten Phosphatidylglycerins, z. B. DMPG, scheidet sich vom Eluens ab. Das nicht umgesetzte, lösliche Phosphatidylcholin wird zur Erhöhung der Ausbeute dann dem Kreislauf wieder zugeführt. Das Phosphatidylglycerin (DMPG) kann dann weiter gereinigt werden. Die dafür nötigen Bedingungen sind Fachleuten bekannt.
Die Temperatur für die Reaktion beträgt gewöhnlich zwischen etwa 15 und 50ºC, vorzugsweise zwischen etwa 20 und 37ºC und am besten zwischen etwa 20 und 30ºC.
Das bivalente kationische Salz scheidet sich ab und läßt sich leicht durch Filtern und, zur weiteren Reinigung, Waschen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Ethylacetat gefolgt von Methylenchlorid, vom Enzym und anderen Nebenprodukten der Reaktion trennen.
Das bivalente kationische Salz wird in Anwesenheit einer organischen Lösungsmittelphase, z. B. Methylalkohol und Chloroform, durch Reaktion in einer Suspension mit einer ungefähr stöchiometrischen Menge eines monovalenten Salzes, dessen Anion mit dem bivalenten Kation einen Niederschlag bildet, in ein lösliches, monovalentes Salz umgewandelt. Die bevorzugten monovalenten Kationen sind Ammonium, Natrium und Kalium in Form ihrer Carbonate, Citrate, Fluoride, Sulfate, Phosphate, Nitrate, Lactate, Succinate, Formiate; Oxalate-, Chloride, Ethylendiamin-Tetraacetate, Ethylen-bis- (oxyethylennitrilo-)Tetraacetat u. ä., die alle signifikante Wasserlöslichkeit aufweisen. Die monovalenten Phosphatidylsalze bleiben in Lösung, während sich das bivalente Salz abscheidet und leicht durch Filtern u. ä. entfernt werden kann. Eine Umwandlung von mindestens 25%, gewöhnlich 35% oder höher, ist leicht zu erzielen. Aufgrund der Flüchtigkeit von Ammonium in Ammoniumsalzen, die wegen ihrer hohen Löslichkeit erwünscht sind, wird vorzugsweise ein gemischtes Ammonium-/Natriumsalz hergestellt, um gute Löslichkeit und gute Stabilität zu erzielen. Das bevorzugte Ionen-Molverhältnis von Ammonium zu Natrium beträgt etwa 1 : 1 bis etwa 8 : 1. Besonders bevorzugt ist ein Ionen-Molverhältnis von Ammonium zu Natrium von 4 : 1.
Das Ammoniumsalz von Dimyristoylphosphatidylglycerin ist in organischen Lösungsmitteln wie z. B. Methylenchlorid gut löslich. Die Löslichkeit des Ammoniumsalzes von Dimyristoylphosphatidylglycerin in Methylenchlorid ist höher als etwa 26 mg/ml. Dieses Salz ist jedoch meist instabil. Das Natriumsalz ist stabiler, aber weit weniger löslich; die Löslichkeit des Natriumsalzes von Dimyristoylphosphatidylglycerin in Methylenchlorid beispielsweise beträgt weniger als etwa 0,2 mg/ml. Ein bestimmtes Verhältnis von Natriumsalz zu Ammoniumsalz stabilisiert das gemischte Salz, ohne die Löslichkeit so weit zu beeinträchtigen, daß sie unter einen annehmbaren Wert sinkt, wenn die Menge des Natriumsalzes kontrolliert wird. Etwa 0,3 Gewichtsprozent des Natriumkations verleihen Stabilität; Mengen über dem Höchstwert von etwa 0,8 Gewichtsprozent Natrium reduzieren jedoch die Löslichkeit des gemischten Salzes in Methylenchlorid.
Die Menge des Restcalciumions sollte auf weniger als etwa 0,1 und vorzugsweise etwa 0,05 Gewichtsprozent des gemischten Salzes begrenzt werden. Das Calciumsalz ist nicht löslich, und die Anwesenheit überschüssigen Calciumions beeinträchtigt die Löslichkeit des gemischten Salzes in relativ unpolaren organischen Lösungsmitteln.
Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die Löslichkeit des Salzes selbst bei einem Calciumionengehalt des gemischten Ammonium-/Natriumsalzes von Dimyristoylphosphatidylglycerin von mehr als etwa 0,1 Prozent oder etwa 0,05 Gewichtsprozent und einem Natriumionengehalt von mehr als etwa 0,8 Gewichtsprozent stark ansteigt, wenn der Ammoniumionengehalt mehr als etwa 2,0 Gewichtsprozent beträgt, und die Löslichkeit ist sehr hoch, wenn der Ammoniumionengehalt etwa 2,25 bis etwa 2,35 Gewichtsprozent beträgt (Abb. 1 und Tabelle II).
Allgemein gilt, daß der prozentuale Anteil unlöslicher Substanz des gemischten Ammonium /Natriumsalzes von Dimyristoylphosphatidylglycerin in Methylenchlorid höher ist, wenn der Calciumionengehalt mehr als etwa 0,05 Gewichtsprozent oder der Ammoniumionengehalt weniger als etwa 2,0 Gewichtsprozent beträgt (siehe Tabelle III).
So wird, ebenfalls in Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, nach dem Ausfällen des Calciumsalzes von Dimyristoylphosphatidylglycerin, dem Waschen und dem Filtern sowohl Ammoniumcarbonat als auch Natriumcarbonat in einer Menge zugegeben, die die Umwandlung des Calciumanions in ein festes Calciumsalz, das Carbonat, bewirkt. Vorzugsweise wird nicht mehr monovalentes Carbonat zugegeben als die zur Ausfällung des Calciumanions als Calciumcarbonatsalz benötigte stöchiometrische Menge. Das gemischte Ammonium-/Natriumsalz von Dimyristoylphosphatidylglycerin wird von dem unlöslichen Calciumsalz getrennt und kann auf Wunsch zusätzlich gereinigt werden.
Wird eine zusätzliche Reinigung gewünscht, kann das Produkt chromatographisch unter Verwendung einer ammoniakhaltigen Kieselgelsäule mit gemischten Methanol-/ Chloroform-Lösungsmitteln nach bekanntem Verfahren gereinigt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in Abwesenheit von Detergenzien oder anderen Tensiden durchgeführt, die gewöhnlich später entfernt werden müssen; es wird ein hochreines Produkt mit hoher Ausbeute erzielt, ohne daß dabei Phosphatidylsäure oder andere Nebenprodukte erzeugt werden, die die Ausbeute der gewünschten Phosphatestersalze reduzieren und durch Reinigung entfernt werden müssen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der nachstehenden Beispiele näher beschrieben, doch soll die Erfindung nicht als auf die hierin beschriebenen Einzelheiten beschränkt gelten. Alle Reaktionen wurde bei etwa 23ºC durchgeführt.

BEISPIEL 1

In einer Lösung aus 1 ml Natriumacetatpuffer (pH 5,6), 1 ml Wasser, 0,2 ml 1M- Calciumchlorid und 0,2 ml Glycerin wurden 200 mg Phospatidylcholin emulgiert. Der obengenannten Emulsion wurden 1 mg Phospholipase D in 1 ml Natriumacetat und 1 ml Wasser und anschließend 2 ml Methylenchlorid zugegeben und das Gemisch für 17 Stunden gerührt.
Das Phosphatidylglycerinpräzipitat wurde gefiltert, mit 10 ml Methylenchlorid gewaschen und mit einer Ausbeute von 74% als Calciumsalz gewonnen.
140 mg des wie oben gewonnenen Calciumsalzes wurden in 6 ml Ethanol und 3 ml Hexan suspendiert und eine stöchiometrische Menge eines Gemischs aus Natriumcarbonat und Animoniumearbonat im Molverhältnis von 1 : 4 zugegeben und gerührt.
Das abgeschiedene Calciumcarbonat wurde durch Filtration entfernt.
Die Ausbeute betrug 120 mg bzw. 78% Natrium-/Ammonium- Phosphatidylglycerin.

BEISPIEL 2

In einen 5-Liter-Behälter wurden 100 Gramm Dimyristoylphosphatidylcholin gefüllt, 500 ml Wasser und 500 ml 0,5 N-Natriumacetatpuffer (pH 5,6) wurden zugegeben, und 100 ml einmolares Calciumchlorid und 100 mg Phospholipase D wurden in 50 ml des Puffers und 50 ml Wasser gelöst. Nach Zugabe von 1 Liter Ethylbutyrat wurde der Behälter verschlossen und 17 Stunden geschüttelt.
Calcium-Dimyristoylphosphatidylglycerin wurde als Präzipitat erhalten. Das Produkt wurde mit einem Büchner-Trichter gefiltert, mit 5 Liter Ethylacetat gewaschen und abschließend einer Wäsche mit 1 Liter Methylenchlorid unterzogen.
Der Filterkuchen wurde in 1052 ml Methanol, 526 ml Chloroform und 420 ml Wasser suspendiert.
526 ml 2N-Ammoniumcarbonat und 0,5N-Natriumcarbonat im Volumenverhältnis 1 : 1 wurden zugegeben. Das Gemisch wurde rasch gefiltert und dem Filtrat 526 ml Chloroform zugegeben. Das Chloroform wurde auf etwa 200 ml verdampft und 5 Liter kaltes Aceton zugegeben.
Das Gemisch wurde durch einen Büchner-Trichter gefiltert und das erhaltene DMPG mit kaltem Aceton gewaschen.
Die Ausbeute betrug 95 Gramm (95%) Natrium-/Ammonium- Dimyristoylphosphatidylglycerin.
Dieses Produkt wurde zusätzlich gereinigt, indem es in 20% Methanol in Chloroform gelöst, auf eine 1-Zoll-Kieselgelsäule aufgebracht und mit einer 1% Ammoniumhydroxid enthaltenden Lösungsmittelmischung aus 80% Chloroform und 20% Methanol eluiert wurde.
Die das Produkt Dimyristoylphosphatidylglycerin enthaltende Fraktion wurde abgetrennt und bis zur Trockne eingedampft. Es wurde ein gemischtes Ammonium-/Natriumsalz von Dimyristoylphosphatidylglycerin mit einem Reinheitsgrad von 99% erhalten.

BEISPIEL 3

In einen 5-Liter-Dreihalskolben mit bananenförmigem Paddel wurden 200 Gramm (0,29 mol) Dimyristoylphosphatidylcholin gegeben, und 1 Liter 0,5N-Natriumacetatpuffer (pH 5,6), 1 Liter Wasser, 200 ml Glycerin und 200 ml einmolares Calciumchlorid wurden zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 5,5 eingestellt.
In 5 ml Natriumacetatpuffer wurden 80 mg Phospholipase D gelöst und 5 ml Wasser dem Kolben zugegeben. Schließlich würde 1 Liter Methylenchlorid dem Gemisch zugegeben und 17 Stunden gerührt.
Das Reaktionsgemisch würde durch einen Büchner-Trichter gefiltert und der Filterkuchen mit 5 Liter Wasser und 5 Liter Methylenchlorid gewaschen.
Die Ausbeute betrug 166 Gramm (0,24 mol) Calcium- Dimyristoylphosphatidylglycerin bzw. 82%. Mittels Dünnschichtchromatographie wurde die Reinheit des Produkts mit 95% ermittelt.

BEISPIEL 4

In eine Reihe von Reagenzröhrchen wurde eine Suspension aus: 200 mg Dimyristoylphosphatidylcholin, 2 ml 0,25M Natriumacetatpuffer (pH 5,6), 200 ml einmolares Calciumchlorid, 200 ml Glycerin und 5 mg Phospholipase D in 2 ml 0,25M- Natriumacetatpuffer mit einen pH-Wert von 5,6 gefüllt.
In jedes Röhrchen wurden jeweils 2,5 ml verschiedener Lösungsmittel (siehe Tabelle I) gegeben. Die Röhrchen wurden verschlossen und bei 25ºC in einen Schüttelapparat gesetzt, der auf 250 U/min und 17 Stunden eingestellt wurde. Der Schüttler wurde abgeschaltet und jedes Röhrchen untersucht und der Inhalt dreimal mit jeweils 5 ml Chloroform und dann mit 5 ml Aceton gewaschen; anschließend wurde der Inhalt in vacuo auf ein konstantes Gewicht getrocknet. Eine Probe jedes Röhrchens wurde mit Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Kieselgel mit Chloroform : Methanol : Ammoniak im Volumenverhältnis 65 : 35 : 5 analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I dargestellt:

TABELLE 1

Lösungsmittel Ausbeute an unlöslichem Produkt (mg)**
Ethylacetat 183
Ethylpropionat 205*
Ethylbutyrat 254*
2-Butanon 78
2-Pentanon 78
2-Heptanon 162
2-Octanon 166
Butylacetat 126
3-Pentanon 150
3-Heptanon 116
3-Octanon 9
4-Heptanon 175
Tetrachlorkohlenstoff 5
Chloroform 46
Methylenchlorid 185
Ether 190
*Hohe Werte vermutlich aufgrund nichthomogener Liposomensuspension
**Die TLC zeigte, daß das Phospatidylcholin in Calciumsalz von Phosphatidylglycerin umgewandelt und das nicht umgesetzte Phospatidylcholin weggewaschen wurde.

BEISPIELE 5-10

Die Löslichkeit verschiedener gemischter Ammonium-/Natriumsalze von Dimyristoylphosphatidylglycerin in Methylenchlorid wurde bestimmt. Dazu wurden 1,6 mg jedes gemischten Salzes gemischt und unter Rühren auf 35ºC erhitzt, für eine und zwei Stunden. Das Gemisch wurde durch ein Spritzenfilter (Gelman Aerodisc CR, 0,2 Mikrometer, 25 mm) gefiltert und die prozentuale Löslichkeit bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle II zusammengefaßt. TABELLE II
Abb. 1 ist ein Diagramm der Löslichkeit in Abhängigkeit vom Ammoniumionengehalt in Methylenchlorid. Das Diagramm zeigt, daß die Löslichkeit selbst bei einem Calciumgehalt von mehr als etwa 0,05 Gewichtsprozent und einem Natriumgehalt von mehr als etwa 0,8 Gewichtsprozent stark ansteigt, wenn der Ammoniumionengehalt mehr als etwa 2,0 Prozent beträgt, und die Löslichkeit ist sehr hoch, wenn der Ammoniumionengehalt etwa 2,25 bis etwa 2,35 Gewichtsprozent beträgt.

BEISPIEL 11

0,2 M Natriumacetatpuffer (pH 5,6) wird mit 0,3 M Calciumchlorid, 0,3 M Glycerin und Phospholipase D in ein Zentrifugal-Verteilungschromatographie-System (CPC) gegeben. Die Zentrifuge wird in Gang gesetzt, und Ethylacetat oder Ethylbutyrat mit 0-20% Phospatidylcholin wird in das CPC-System gepumpt. Das Calciumsalz von DMPG scheidet sich vom Eluenten ab und kann zusätzlich gereinigt werden. Das nicht umgesetzte lösliche Phospatidylcholin kann wieder in den Kreislauf eingebracht werden.

VERGLEICHENDE BEISPIELE 1-4

Es wurde die Löslichkeit verschiedener gemischter Ammonium-/Natriumsalze von Dimyristoylphosphatidylglycerin in Methylenchlorid bestimmt. Dazu wurden jeweils 1,6 mg jedes gemischten Salzes zu 4,5 mg Dimyristoylphosphatidylcholin gegeben und gemischt und für eine Stunde auf 35ºC erhitzt. Anschließend wurde das Material durch ein Spritzenfilter (Gelman Acrodisc CR, 0,2 Mikrometer, 25 mm) gefiltert und der prozentuale Anteil unlöslicher Substanz bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle III zusammengefaßt. TABELLE III

VERGLEICHENDES BEISPIEL 5

Eine Partie gemischtes Ammonium-/Natrium-Dimyristoylphosphatidylglycerin (1,6 mg/ml) mit einem Natriumgehalt von 1,20%, Ammoniumgehalt von 1,53% und Calciumgehalt von 0,12% (nach Gewicht des Salzes) wurde mit 4,5 mg/ml Dimyristoylphosphatidylcholin in Methylenchlorid gemischt und unter Rühren auf 35ºC erhitzt. Das Gemisch war nach einer Stunde immer, noch trübe, was auf unvollständige Solubilisation des gemischten Salzes hinwies.

Claims

1. Verfahren zur Bildung eines löslichen, einwertigen Salzes eines Phosphatidylesters, welches umfaßt:

a) Reaktion eines Phospholipids mit einem primären Alkohol in Anwesenheit von

(i) Phospholipase D;

(ii) einer Pufferlösung, die ein zweiwertiges Kation enthält und

(iii) eines mit Wasser nicht mischbaren nicht-etherischen Lösungsmittels zur Bildung des entsprechenden zweiwertigen Kation-Phosphatidsalzes; und

b) Umwandlung des zweiwertigen Kation-Phosphatidsalzes in ein lösliches einwertiges Salz durch

(i) Suspensieren des zweiwertigen Kation-Phosphatidsalzes in einem organischen Lösungsmittel;

(ii) Zusatz zu der Suspension von einem einwertigen Salz umfassend ein Kation, welches Natrium und Ammonium umfaßt und ein Anion, das zur Bildung einer Ausfällung mit dem zweiwertigen Kation geeignet ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Phospholipid Phosphatidylcholin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Phospholipid Dimyristolphosphafidylcholin ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Alkohol ausgewählt wird aus der Gruppe von Glycerin, Sulfocholin, Ethylenglykol, Glycidol, Ribose, Ethanolamin und Glycerinformal.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin der Alkohol Glycerin ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Pufferlösung ein Calciumsalz enthält.

7. Verfahren nach einem der Anspräche 1 bis 6, worin das mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel ein halogeniertes Alkan oder Alken, ausgewählt aus der Gruppe von Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorethylen und Trichlorfluormethan ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel ein aliphatischer oder aromatischer Ester, Alkan oder Keton ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe von Ethylacetat, Ethylpropionat, Ethylbutyrat, Methylacetat, Methylpropionat, 2-Butanon, 2-Pentanon, 2- Heptanon, 2-Octanon, 3-Pentanon, 3-Heptanon, 3-Octanon und 4-Heptanon.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Molverhältnis von Ammonium zu Natrium in dem einwertigen Kationsalz etwa 1 : 1 bis etwa 8 : 1 ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin das Molverhältnis von Ammonium zu Natrium etwa 4 : 1 ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin die Konzentration an Natriumion in der Suspension etwa 0,3 bis weniger als etwa 0,8 Gew.-% ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin die Konzentration an Ammoniumion in der Suspension größer als etwa 2,0 Gew.-% ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Konzentration an Ammoniumion in der Suspension etwa 2,25 bis etwa 2,35 Gew.-% ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin die Konzentration an Calciumion in der Suspension weniger als etwa 0,1 Gew.-% ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Konzentration an Calciumion in der Suspension weniger als etwa 0,05 Gew.-% ist.

17. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Konzentration an Natriumion in der Suspension etwa 0,3 bis weniger als etwa 0,8 Gew.-%, die Konzentration an Ammoniumion in der Suspension größer als etwa 2,0 Gew.-% und die Konzentration an Calciumion in der Suspension weniger als etwa 0,1 Gew.-% ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin das Anion des Salzes ein Carbonat, Citrat, Sulfat, Phosphat, Nitrat, Lactat, Succinat, Formiat, Oxalat, Ethylentetraacetat, Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraacetat oder Chlorid ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, worin Stufe a) unter Verwendung der Zentrifugal-Partition-Chromatographie durchgeführt wird.