JPH05509222A - リン脂質からの可溶性ホスファチドの酵素的合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リン脂質からの可溶性ホスファチドの酵素的合成対応米国特許出願 本出願は、１９９０年４月１７日に出願した、同時係属の米国特許出願番号筒５ １３，２８５号の一部継続出願である。

発明の背景 本発明は、触媒としてホスホリパーゼＤ酵素を使用し、高収率の高純度可溶性ホ スファチドが得られる、リン脂質からの可溶性ホスファチドの改善された合成法 に関するものである。

ホスファチジルグリセロール等のホスファチドは、リポソームや脂質複合体を作 るのに用いられる有用で有効な製品である。ホスファチジルグリセロール及びそ の他のホスファチドは、従来、酢酸カルシウム、酢酸及び酵素ホスホリパーゼＤ を含む水性緩衝液とグリセロール又は他の第一級アルコールとを、水に不混和性 の有機溶媒に溶解したホスファチジル脂質、例えばホスファチジルコリン、と混 合することにより作られていた。この酵素を活性化すためには、エーテルのよう な溶媒を用いるか、あるいは界面活性剤を加えて、水に不溶性のものと水溶液と の混合物を乳化させていた。

Ｒｅｄｅｍａｎｎ、　Ｐ　ＣＴ出願番号Ｗ○８９１０１５２４号、１９８９年２ 月２３日公開、により開示されているように、酵素を活性化するには、ジメチル エーテル、ジエチルエーテル及びその他のエーテルが用いられていたが、これら は、引火性、過酸化物形成性があるため、危険であることが知られており、ホス ファチドの自動酸化を促進する。更に、水に比較して、エーテルの比重が非常に 低いために、相の混合物を良好に混合するには、激しい振とうが必要であり、そ れは工業的規模にスケールアップするのが困難である。

フー 界面活性剤は、酵素を活性化するのにも有用であるが、目的とする生成物から除 去するのが難しい。従って、有用な純度のホスファチドを得るには、手の込んだ 、高価なカラムクロマトグラフィー分離が必要である。また、比較的多量の水が 存在するために、加水分解が起こり、ホスファチジル酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄ ｙｌ　ａｃｉｄ）を同時に生成する結果となり、これが、目的とするホスファチ ド生成物の収率を低下させ、また、目的とするホスファチドから分離されなけれ ばならないことにもなる。

更に、酵素は、緩衝液の使用が必要となる最適ｐＨ範囲を必要とする。酵素は、 カルシウム又はその他の２価のカチオンの塩としてホスファチドを生成し、溶液 から沈澱し、従って可溶化し難い２価のカチオン、例えばカルシウムイオンを、 反応混合物中に必要とする。カルシウム塩をそれらのより可溶性の１価の塩とす るために、酸性化又はイオン交換樹脂と中和を用いると、上に列挙した開運と共 に、リソホスファチジルグリセロールやホスファチジル酸などの分解生成物を伴 って、棲めて速い加水分解が生じる。　ホスファチジルグリセロール等のホスフ ァチドの収率を向上させようとして、ホスファチジル脂質を、有機溶媒中で、疎 水性基を有する担体に固定したホスホリパーゼと反応させる方法が開示されてい る。この溶媒は、ジエチルエーテル又はホスファチジルコリンなどのホスファチ ジル脂質を溶解することのできるアルカンであればよい。反応は、有機溶媒の沸 点よりも低い温度、例えば１５〜３５℃で行われる。しかし、目的とするホスフ ァチドの収率は、４５％のオーダーで低く、エーテル溶媒の使用は、それらが非 常に引火性で危険な溶媒であるため、不便である。

従って、安全、簡単な方法で、改善された収率で、しかも水溶性の１価の安定な 塩の形でホスファチドを製造する方法が、長い間求めら従来、このエステル交換 反応は、反応を有用な速度にまで活性化するために、通常、エーテルとの２相系 で行われていた。しかし、この反応は、かなりの量のホスファチジン酸も生ずる ため、定量的であることはめったになかった。更に、エーテル相と水相との間の 比重の差が大きいために、混合が不十分となり、大規模な反応では収率が制限さ れることになった。界面活性剤を用いてもよいが、生成物を精製するのがますま す難しくなる結果となった。

発明の要旨 この発明によれば、（１）ホスホリパーゼＤなどの酵素触媒、（■）酵素を分解 及び変性せず、エーテルよりも引火性の低い非エーテル溶媒、及び（ｍ）緩衝２ 価塩溶液、好ましくはカルシウム塩の存在下で、ホスファチジルコリンのような リン脂質を第１級アルコールと反応させて、対応するホスファチジルエステルを ２価の塩として形成することができる。この２価の塩を有機溶媒中に懸濁させ、 ホスファチドを可溶化し、同時に、添加された１価のカチオン塩のアニオンのカ ルシウム塩を沈澱させる化学量論的な量の固体１価塩を添加することにより、不 溶性の２価の塩を、有機可溶性の安定な１価の塩に変えることができる。この方 法により、ホスフチジル酸などの加水分解生成物の実質的な生成なしに、ホスフ ァチドの１価の塩が製造される。

特定のエステル塩、シミリストイルホスファチジルグリセロールの混合アンモニ ウム／ナトリウム塩については、ナトリウムイオンに対するアンモニウムイオン の比が特定の重量比であり、存在する２価のカチオンの量が限定されている場合 は、シミリストイルホスファチジルグリセロール塩の溶解度と安定度が最大にな ることもわかっている。

有機溶媒でのシミリストイルホスファチジルグリセロールの混合アンモニウム／ ナトリウム塩の安定度と溶解度を最大にするためには、アンモニウムイオンの重 量パーセントが混合塩の約２．０と約２．６重量パーセントとの間にあり、ナト リウムイオンの重量パーセントが混合塩の約０．３と約０．８重量パーセントと の間にあるべきであることがわかっている。最大カルシウム濃度は、混合塩の約 ０．１、好ましくは約０．０５重量パーセントであるべきである。

更に、ホスファチジルコリン及びグリセロール又はある種の他のアルコールとホ スホリパーゼＤとの反応を大きく促進するために、遠心分離クロマトグラフィ− （ＣＰＣ）を用いてもよいことがわかっている。

図面の簡単な説明 図１は、シミリストイルホスファチジルグリセロールの混合塩についての塩化メ チレン中のアンモニウムイオン含有量に対する溶解度のグラフである。

発明の詳細な説明 本方法は、 ａ）ホスホリパーゼＤなどの適当な酵素触媒、及び引火性が低く、水に不混和性 の溶媒の２価カチオンの緩衝溶液の存在下で、リン脂質を第１級アルコールと反 応させて、２価カチオンの塩の対応する不溶性ホスファチドを生成し、 ｂ）アニオンが２価のカチオンと不溶性沈澱を生成する化学量論的な量の固体１ 価塩と共に、それを懸濁させることにより、ホスファチドの２価のカチオンの塩 をその対応する可溶性の１価の塩に変えること、 からなるホスファチジルエステルの１価の塩を生成する２段階法である。

二の発明の化合物は、溶解度及び安定度が改善されているため、リポソームと脂 質の複合組成物に特に有用である。

リポソームは、取り込まれた水性容積を含む完全に閉鎖された脂質単分子膜であ る。リポソームは、単ラメラ小胞（１個の二分子膜を有する）であっても、多重 ラメラ小胞（複数の膜状二分子膜が、水性層により、それぞれ隣接する膜から分 離されていることを特徴とする玉葱状構造物）であってもよい。二分子膜は、疎 水性パ尾″領域と親水性゛′頭頭領領域を有する２つの脂質単分子膜で構成され ている。膜状二分子膜の構造は、脂質単分子膜の疎水性（非極性）“尾”が二分 子膜の中心に向かって配向し、一方、親水性“頭”が水性層に向かって配向する ようになっている。

シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、シミリストイルホスファチ ジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、コレステロールカプセル化アンホテリシンＢを 含むリポソームは、全身性真菌感染の治療に有用である。Ｊｕｌ　１ａｎｏ等、 Ａｎｎａｌｓ　Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　１９８５．４４６：３９０− ４０２；　Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｎｓｔｅｉｎ等、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ 、、１９８６．１５１ニア０４−７］０゜ＰＣＴ公開番号Ｗ○８８１０６４４３ 号、名称“低毒性薬剤−脂質系”、Ｊａｎｏｆｆ等、１９８８年９月７日公開、 は、微粒子状非リポソーム形態の薬剤−混合脂質の高薬剤：脂質複合体、即ち、 ＨＤＬＣと、特定の比率のＤＭＰＣとＤＭＰＧを含むリポソームを製造する方法 を記載している。リン脂質は、クロロホルム、塩化メチレンなどの溶媒に可溶化 される。

ＨＤＬＣは、特に薬剤がアンホテリシンＢのようなポリエチレン抗真菌性抗生物 質である場合は、まず、薬剤をジメチルスルホキシド（ＤＭＳ○）、メタノール などの両親和性の（ｂｉｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）有機溶媒に可溶化し、得られた 溶液を、塩化メチレンなどの溶媒に可溶化された、ＤＭＰＣ・Ｄ　Ｍ　Ｐ　Ｇの モル比が７．３のような脂質と混合することにより調製される。溶媒を減圧下で 蒸発させると、薄い脂質−薬剤膜となる。この膜を、食塩水、ＰＢＳ、グリシン 緩衝液などの水溶液中で水和すると、ＨＤＬＣを生成する。これとは別に、水溶 液を、溶媒蒸発前の溶媒を含有する薬剤と脂質の相に添加してもよい。またこれ とは別に、得られた乾脂質−薬剤膜を、塩化メチレンなどの溶媒に再懸濁させ、 膜を水和する前に、再度減圧下で蒸発させてもよい。

乾脂質−薬剤膜を脱水して、水溶液で水和されたフレークを形成する脱水法を用 いてもよい。ＨＤＬＣを生成する別の方法では、ＭＬＶ法により作られた生理活 性剤を含む脂質粒子を形成し、次いでこの粒子を、約り５℃〜約６０℃で加熱サ イクルに供する。

本発明において有用なリン脂質は、１つ又はそれ以上のホスファチジル基を含む 一種の天然及び合成脂質である。それらとしては、ホスファチジルコリン、ホス ファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、シミ リストイルホスファチジルコリン及びホスファチジルイノシトールが挙げられる 。ホスファチジルコリンは、商品として高純度で入手できるので、好ましい。

ここで説明する第一級アルコールはグリセロールであるが、スルホコリン、エチ レングリコール、グリシドール、リボース、エタノールアミン、グリセロールホ ルマール（ｇＬｙｃｅｒｏｌｆｏｒｍａｌ　）等の他の第一級アルコールを用い ることができる。メタノール、エタノール等の単純な第一級アルコールは、極め て急速に反応して、対応するアルキルエステルを生成するので、注意して除外し なければならない。

適当な２価のカチオン緩衝液は、約５．７のｐＨを有し、カルシウムのような２ 価のカチオンを含んでいる。このカチオンは、酵素に関して不活性でなければな らない。例えば、緩衝液は、次の１つ又はそれ以上の溶液であることができる。

−例として、酢酸又は酢酸ナトリウムと水酸化カルシウム、塩化カルシウム又は 酢酸カルシウム。

この発明で有用な、非引火性又は低引火性で、水に不混和性の溶媒は、ジエチル エーテル又はジメチルエーテルよりも引火性が低く、引火点が０℃より高く、好 ましくは２０℃より高いもの、及びジエチルエーテルの場合の活性よりも、約２ ５％以上低くその活性を低減させるように酵素を分解又は変性することのないも のである。本方法に適した溶媒としては、塩化メチレン、クロロホルム、テトラ クロロエチレン、トリクロロフルオロメタン等のようなハロゲン化した溶媒が挙 げられる。酢酸エチル、プロピオン酸エチル、酪酸エチル、酢酸メチル、プロピ オン酸メチル、３−ペンタノン、３−ヘプタノン、２−オクタノン、２−ブタノ ン、２−ペンタノン、２−ヘプタノン、３−オクタノン、４−ヘプタノン等のよ うな、脂肪族又は芳香族のエステル、アルカン、ケトン、分子量が５０００より 低いエステルを用いることもできる。　上記反応成分を、撹拌又は振とうにより 混合し、例えばホスファチジルコリンのような最初のホスファチジルエステルを 、ホスファチジルグリセロールのカルシウム塩のような目的とする生成物の２価 のカチオン塩に変える。

一般に、２価のカチオンの塩の計画された収率の少なくとも約８０％を得るには 、撹拌又は渦巻のような低エネルギー混合で十分であろう。

酵素とリン脂質及びアルコールとのエステル交換反応を促進するために、遠心分 離グロマトグラフィ−（ＣＰＣ）　、　Ｊ、　Ｇａｚｅｓ、”バイオ物質の川下 処理（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）用高速ｃｐｃ”、Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１９８９年６ 月、１７−２３、を用いてもよい。酢酸ナトリウムのような、約５．６の適当な 緩衝液からなる固定水性相を、′塩化カルシウム、適当なアルコール及び酵素と 共に、遠心分離器に入れる。遠心分離器を運転し、酢酸エチルや酪酸エチルのよ うな有機非アルコール性溶媒からなり、リン脂質を含む移動相を、ＣＰＣ系へポ ンプで送る。ＤＭＰＧなどの飽和ホスファチジルグリセロールのカルシウム塩が 、溶出液から沈澱する。次いで、未反応可溶性ホスファチジルコリンを再循環さ せて、収率を高める。ホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）を更に精製して もよい。当業者は、このために用いる条件を理解するであろう。

反応が行われる温度は、一般に約１５°Ｃと５０℃との間、好ましくは約２０と ３７℃の間、最も好ましくは約２０と３０℃の間である。

２価のカチオンの塩は沈澱し、濾過及び水に不混和性の有機溶媒、例えば酢酸エ チルに続く塩化メチレン、での洗浄により、酵素及び反応の他の副生成物から容 易に分離されて、その塩を更に精製することができる。

２（ｉｌｌｉのカチオンの塩は、アニオンが２価のカチオンと沈澱を形成する、 およその化学的量論的な量の１価の塩と、懸濁状態で反応することにより、メチ ルアルコール、クロロホルムなどの有機溶媒相の存在下で、可溶性の１価の塩に 変換される。好ましい１＠ｆのカチオンは、すべてが著しい水溶性を有する炭酸 塩、クエン酸塩、フッ化物、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、 ギ酸塩、シュウ酸塩、塩化物、エチレンジアミン四酢酸塩、エチレンビス（オキ シエチレンニトリロ）四節酸塩等としてのアンモニウム、ナトリウム及びカリウ ムである。ホスファチジル１価塩は、溶液中に残り、２価塩が沈澱し、濾過等に より容易に除去することができる。少なくとも２５％の変換率、一般には３５％ 以上の変換率が、容易に得られる。アンモニウム塩は、溶解度が高いために望ま しいが、その中のアンモニアの揮発性のために、良好な溶解度と良好な安定度の うえで、混合アンモニウム／ナトリウム塩を調製するのが好ましい。ナトリウム に対するアンモニウムの好ましいモルイオン比は、約１・１〜約８＝１である。

ナトリウムに対するアンモニウムの特に好ましいイオン比は、４・１モル比であ る。

シミリストイルホスファチジルグリセロールのアンモニウム塩は、塩化メチレン などの有機溶媒に完全に可溶性である。シミリストイルホスファチジルグリセロ ールのアンモニウム塩の塩化メチレンへの溶解度は、約２６ｍｇ／ｍｌよりも大 きい。しかし、この塩は、不安定である傾向がある。ナトリウム塩は、より安定 であるが、可溶性がはるかに低い。例えば、シミリストイルホスファチジルグリ セロールのナトリウム塩の塩化メチレンへの溶解度は、約０．２ｍｇ／ｍｌより 混合塩が安定化されるが、ナトリウム塩の量をｍ節すると、満足な水準よりも低 くなるように、溶解度に悪影響を及ぼすことがない。約０゜３重量％のナトリウ ムカチオンは、安定性を付与するが、ナトリウムが約０．８重量％の最大量を越 えると、混合塩の塩化メチレンへの溶解度が低下する。

残留カルシウムイオンの量は、混合塩の約０．１重量％未満、好ましくは約０． ０５％未満に限定されるべきである。カルシウム塩は不溶性であレバ過剰のカル シウムイオンの存在は、相対的に非接性の有機溶媒への混合塩の溶解度に悪影響 を及ぼす。

しかし、シミリストイルホスファチジルグリセロールの混合アンモニウム／ナト リウム塩のカルシウムイオン含有量が約０．１重量％あるいは約０．０５重量％ よりも多く、ナトリウムイオン含有量が約０゜８重量％よりも大きい場合でも、 アンモニウムイオン含有量が２．０重量％を越えるときは、この塩の溶解度が著 しく上昇し、アンモニウムイオン含有量が約２．２５〜約２．３５重量％である ときは、非常に高いことに注目すべきである（図１及び表■）。

一般に、カルシウムイオン含有量が約０．０５重量％を越えるか、あるいはアン モニウムイオン濃度が約２．０重量％未満であれば、塩化メチレンにおけるシミ リストイルホスファチジルグリセロールの混合アンモニウム／ナトリウム塩の不 溶物のパーセントが増加する（表■参照）。

かくして、本発明の方法によっても、シミリストイルホスファチジルグリセロー ルのカルシウム塩を沈澱させ、洗浄、濾過した後、カルシウムアニオンを固体カ ルシウム塩、即ち炭酸塩に変換する量の炭酸アンモニウムと炭酸ナトリウムの両 方を加える。カルシウムアニオンを炭酸カルシウム塩として沈澱させるのに必要 な化学量論的な量よりも過剰に、１価の炭酸塩を加えないことが好ましい。シミ リストイルホスファチジルグリセロールのアンモニウム／ナトリウム混合塩を不 溶性カルシウム塩から分離し、もし所望であれば、更に精製することができる。

もし、更に精製することが所望されるのであれば、混合メタノール／クロロホル ム溶媒で、公知の方法で、アンモニア性シリカカラムを使用するクロマトグラフ 精製を用いることができる。

この発明の方法は、一般に後で除去しなければならない洗浄剤及び他の界面活性 剤の不存在下で行われ、目的とするリン酸エステル塩の収率を低下させ、除去す るための精製を必要とするホスファチジル酸や他の副生成物が付随して生成する ことなく、高純度の生成物を高収率で製造する。

この発明の方法を、次の実施例を参照して更に説明するが、この発明は、ここに 記載された詳細に限定されるものではない。全ての反応は、約２３℃で行われた 。

実施例１ ｐＨが５．６の酢酸ナトリウム緩衝液１ｍｌ、水１ｍｌ、１Ｍ塩化カルシウム０ ．２ｍｌ及びグリセロール０．２ｍｌの溶液中で、２゜Ｏｍｇのホスファチジル コリンを乳化した。

酢酸ナトリウム１ｍｌ中のホスホリパーゼＤ１ｍｇと１　ｍ　ｌの水とを上記乳 化液に加え、２ｍｌの塩化メチレンを加えて、混合物を１７時間撹拌した。

ホスファチジルグリセロール沈澱を濾過し、１０ｍ１の塩化メチレンで洗浄して 、カルシウム塩として、７４％の収率で回収した。

上で得たカルシウム塩１４０ｍｇを、６ｍｌのエタノールと３　ｍ　ｌのヘキサ ン中に懸濁し、化学量論的な量の炭酸ナトリウム／炭酸アンモニウムの１＝４モ ル混合物を添加して、撹拌した。

炭酸カルシウムの沈澱を濾別した。

１２０ｍｇ、即ち７８％の収率のナトリウム／アンモニウムホスファチジルグリ セロールが得られた。

実施例２ １００ｇのシミリストイルホスファチジルコリンを５リツトルの容器に入れ、水 ５００　ｍ　ｌとｐ、　Ｈが５．６の０．５Ｎ酢酸ナトリウム緩衝液５００　ｍ 　ｌを添加し、Ｍ塩化カルシウム１００　ｍ　ｌと、緩衝液５０ｍ１と水５０ｍ １に溶解した１００ｍｇのホスホリパーゼＤを添加した。１リツトルの酪酸エチ ルを加えて、容器を密封し、１７時時間上うした。

カルシウムシミリストイルホスファチジルグリセロールを沈澱として回収した。

生成物をブフナー漏斗で濾過し、５リツトルの酢酸エチルで洗浄して、最後に１ リツトルの塩化メチレンで洗浄した。

濾過ケークを、メタノール１０５２ｍ１、クロロホルム５２６ｍ１、水４２０ｍ １に懸濁した。

容積比１．１の２Ｎ炭酸アンモニウムと０．５Ｎ炭酸ナトリウムを５２６ｍ１添 加した。混合物を素早く濾過し、濾液に５２６ｍ１のクロロホルムを加えた。ク ロロホルムを蒸発させて２００ｍ１とし、５リツトルの冷アセトンを添加した。

混合物をブフナー漏斗で濾過し、回収ＤＭＰＣ；を冷アセトンで洗浄した。

９５ｇ（収率９５％）のナトリウム／アンモニウムシミリストイルホスファチジ ルグリセロールが得られた。

上記生成物を、メタノールの２０％クロロホルム溶液に溶解することにより更に 精製し、１インチのシリカカラムに装填して、１％の水酸化アンモニウムを含む ８０％クロロホルム／２０％メタノールの混合溶媒で溶出した。

シミリストイルホスファチジルグリセロール生成物を含む両分を分離し、蒸発乾 固した。９９％純度のシミリストイルホスファチジルグリセロール混合アンモニ ウム／ナトリウム塩を得た。

実施例３ ｐＨが５．６の０．５Ｎ酢酸ナトリウム緩衝液１リツトル、水１リットル、グリ セロール２００ｍ１及びＭ塩化カルシウム２００ｍ１を加えた、バナナパドル（ ｂａｎａｎａ　ｐａｄｄｌｅ）を装備した５リツトルの三つロフラスコに、２０ ０ｇ　（０，２９モル）のシミリストイルホスファチジルコリンを入れた。

酢酸ナトリウム緩衝液５　ｍ　ｌに溶解した８０ｍｇのホスホリパーゼＤと５ｍ ｌの水を、このフラスコに添加した。最後に、１リツトルの塩化メチレンを混合 物に加えて、１７時間撹拌した。

反応混合物をブフナー漏斗で濾過し、濾過ケークを５リツトルの水と５リツトル の塩化メチレンで洗浄した。

１６６ｇ　（０，２４モル）のカルシウムシミリストイルホスファチジルグリセ ロール、即ち８２％の収率が得られた。薄層クロマトグラフィーで測定すると、 この生成物は、純度が９５％であった。

実施例４ シミリストイルホスファチジルコリン２００ｍｇ、ｐＨが５．６の０．２５Ｍ酢 酸ナトリウム緩衝液２ｍｌ、モル塩化カルシウム（ｍｏ　ｌ　ａｒ　ｃａｌｃｉ ｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ）　２００　ｍ　ｌ、グリセロール２００ｍ１及びｐＨ が５．６の０．２５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液２ｍｌ中の５ｍｇのホスホリパーゼ Ｄからなる懸濁液を、一連の試験管にそれぞれ入れた。

２．５ｍｌの各種溶媒（表Ｉ参照）を、それぞれ各試験管に添加した。試験管に 蓋をして、２５℃で振どう機に載せた。振とう機を２５Ｏｒｐｍに設定し、１７ 時間運転した。振どう機を止め、各試験管を調べ、内容物を５　ｍ　ｌのクロロ ホルムで３回洗浄し、次いで５ｍｌのアセトンで洗浄して、恒量となるまで真空 で乾燥した。クロロホルム：メタノール：アンモニアの容積比が６５＋３５：５ であるシリカゲルの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、それぞれのサン プルを分析した。結果を下記表Ｉに示す。

去エ プロピオン酸エチル　２０５本 木　高い値は、恐らく不均一なリポソーム懸濁によるものであろう。

＊＊　ＴＬＣから、ホスファチジルコリンが、未反応ホスファチジルコリンが洗 い流された状態のホスファチジルグリセロールのカルシウム塩に変換されたこと がわかった。

り）イ５．６の０．２Ｍ酢酸ナト？ノウム緩衝液を、０．３Ｍ塩化カルシウム、 ０．３Ｍグリセロール及びホスホリパーゼＤと共に、遠心分実施例５〜１０ シミリストイルホスファチジルグリセロールの種々の混合アンモニウム／ナトリ ウム塩の塩化メチレンへの溶解度を測定した。１．６ｍｇの各混合塩を混合し、 撹拌しながら、３５℃で１時間及び２時間加熱した。混合物を０．２ミクロンの ２５ｍｍ注射器フィルター（ゲルマンアクロディスク（Ｇｅｌｍａｎ　Ａｃｒｏ ｄｉｓｃ）　ＣＲ）で濾過し、パーセント溶解度をめた。結果を下記表■にまと めた。

表■ パーセント溶解度 ス厘孤　孤Ｎ旦、叉Ｎ工土　笠旦エユ　工薩回　又亙回５　２．２８　０．３４ 　０．１９　９４　９８６　１．６４　１，１１　０．０６　６２　６４７　１ ．５９　１．０８　０．０９　６０　６５８　１．９７　０．７５　０．０５　 ７６　８３９　２．３２　０．５５　０．３３　９２１０　２．１１　０．５１ 　０．２６　７９図１は、塩化メチレン中のアンモニウムイオン含有量に対する 溶解度のグラフである。このグラフから、カルシウムが約０．０５重量％を越え 、ナトリウム含有量が約０．８重量％を越えても、アンモニウムイオン含有量が 約２．０パーセントを越えるときは、溶解度が著しく上昇し、アンモニウムイオ ン含有量が約２．２５〜約２．３５パーセントであるときは、溶解度が非常に高 いことがわかる。

実施例１１ ｍｌの混合アンモニウム／ナトリウムシミリストイルホスファチジルグリセロー ルを、４−　５ｒｒｚｙ／ｍ　ｌの・ソミリストイル本７７アーＦ−ＳブＪし離 グロマトグラフィ−（ＣＰＣ）系に装填する。遠心分離器を運転し、０〜２０％ のホスファチジルコリンを含む酢酸エチル又は酪酸エチルを、ＣＰＣ系へポンプ で送る。ＤＭＰＧのカルシウム塩が溶出液がらコリンの塩化メチレン溶液と混合 し、撹拌しながら、３５℃で加熱した。この混合物は、１時間後もまだ濁ってお り、混合塩の可溶化が不完全であることを示していた。

溶解度％ 要約書 ２価のカチオンの緩衝液中の酵素触媒及びその酵素を不活性化しない水に不混和 性の非エーテル溶媒の存在下に、リン脂質を第１級アルコールと反応させて、ホ スファチジルエステルの２価のカチオンの塩を生成すること、及びアニオンがそ の２価のカチオンと不溶性の塩を生成する、化学量論的な量の１価のカチオンの 塩の存在下で、その生成物を懸濁させることからなるホスファチジルエステルの 可溶性１価の塩をｔＲ製する方法。遠心分離クロマトグラフィーの使用が、この 酵素反応を促進する。上記１価の塩は、アンモニウム／ナトリウム混合塩である ことが好ましい。

補正書の写（翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年１０月１６日

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）（ｉ）酵素触媒、 （ｉｉ）２価カチオンの緩衝溶液、及び（ｉｉｉ）水に不混和性の非エーテル溶 媒の存在下で、２価カチオンの塩の対応するホスファチドを生成するように、リ ン脂質を第１級アルコールと反応させること、及びｂ）アニオンが２価のカチオ ンと不溶性沈澱を生成する化学量論的な量の１価の塩と共に懸濁させることによ り、その２価カチオンの塩を有機可溶性の１価の塩に変えること、からなるホス ファチジルエステルの可溶性の１価の塩を生成する方法。
2. ２．リン脂質がホスファチジルコリンである請求の範囲１による方法。
3. ３．リン脂質がシミリストイルホスフアチジルコリンである請求の範囲１による 方法。
4. ４．アルコールが、グリセロール、スルホコリン、エチレングリコール、グリシ ドール、リボース、エタノールアミン及びグリセロールホルマールからなる群よ り選ばれる請求の範囲１による方法。
5. ５．アルコールがグリセロールである請求の範囲４による方法。
6. ６．緩衝溶液がカルシウム塩を含む請求の範囲１による方法。
7. ７．水に不混和性の溶媒が、塩化メチレン、クロロホルム、テトラクロロエチレ ン及びトリクロロフルオロメタンからなる群より選ばれたハロゲン化したアルカ ン又はアルケンである請求の範囲１による方法。
8. ８．水に不混和性の溶媒が、脂肪族又は芳香族のエステル、アルカン、ケトンで ある請求の範囲１による方法。
9. ９．水に不混和性の溶媒が、酢酸エチル、プロピオン酸エチル、酪酸エチル、酢 酸メチル、プロピオン酸メチル、２−プタノン、２−ペンタノン、２−ヘプタノ ン、２−オクタノン、３−ペンタノン、３−ヘプタノン、３−オクタノン及び４ −ヘプタノンからなる群の１員である請求の範囲８による方法。
10. １０．１価の塩の１価のカチオンが、アンモニウム、ナトリウム及びカリウムか らなる群の１もしくはそれ以上より選ばれる請求の範囲１による方法。
11. １１．塩のアニオンが、炭酸塩、クエン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、乳酸 塩、コハク酸塩、ギ酸塩、シュウ酸塩、エチレン四酢酸塩、エチレンビス（オキ シエチレンニトリロ）四酢酸塩又は塩化物である請求の範囲１０による方法。
12. １２．工程ａ）が、遠心分離クロマトグラフィーを用いて行われる請求の範囲１ による方法。
13. １３．請求の範囲１により生成されたホスファチジルエステルの可溶性１価の塩 を含むリボソーム。
14. １４．請求の範囲１により生成されたホスフアチジルエステルの可溶性１価の塩 を含む脂質複合体。
15. １５．ａ）（ｉ）酵素触媒、 （ｉｉ）２価カチオンの緩衝溶液、及び（ｉｉｉ）水に不混和性の非エーテル溶 媒の存在下で、２価カチオンの塩の対応するホスファチドを生成するように、ジ ミリストイルリン脂質を第１級アルコールと反応させること、及び ｂ）アニオンが２価のカチオンと不溶性沈澱を生成し、カチオンが約２．０〜２ ．６重量％のアンモニウムと約０．３〜０．８重量％のナトリウムを含む混合１ 価シミリストイルホスフアチジルグリセロールを生成するような重量比のアンモ ニウムとナトリウムの混合物である化学量論的な量の１価の塩と共に懸濁させる ことにより、その２価カチオンの塩を有機可溶性の１価の塩に変えること、から なるホスファチジルエステルの可溶性の１価の塩を生成する方法。
16. １６．２価のカチオンがカルシウムである請求の範囲１５による方法。
17. １７．混合１価シミリストイルホスフアチジルグリセロールが、約０．１重量％ 以下のカルシウムの混合塩を含む請求の範囲１５による方法。
18. １８．混合１価シミリストイルホスフアチジルグリセロールが、約０．０５重量 ％以下のカルシウムの混合塩を含む請求の範囲１７による方法。
19. １９．工程ａが、遠心分離クロマトゲラフイーを用いて行われる請求の範囲１５ による方法。
20. ２０．請求の範囲１５により生成されたシミリストイルホスフアチジルグリセロ ールの可溶性１価の塩を含むリポソーム。
21. ２１．請求の範囲１５により生成されたシミリストイルホスフアチジルグリセロ ールの可溶性１価の塩を含有する脂質複合体。
22. ２２．約２．０から約２．６重量％までのアンモニウム、約０．３から約０．８ 重量％までのナトリウムを含有するシミリストイルホスフアチジルグリセロール の混合塩の水溶液。
23. ２３．シミリストイルホスフアチジルの混合１価塩が、０．１重量％以下のカル シウムの混合塩を含有する請求の範囲２２による溶液。
24. ２４．シミリストイルホスフアチジルの混合１価塩が、０．０５重量％以下のカ ルシウムの混合塩を含有する請求の範囲２３による溶液。
25. ２５．シミリストイルホスフアチジルコリンを更に含有する請求の範囲２２によ る溶液。
26. ２６．請求の範囲２２による溶液を含有するリポソーム。
27. ２７．請求の範囲２２による溶液を含有する脂質複合体。
28. ２８．約２．０％から約２．３２重量％までのアンモニウムを含むシミリストイ ルホスフアチジルグリセロールの混合塩の溶液。