JPS62205788A

JPS62205788A - ホスフアチジルグリセロ−ル又はその誘導体の製造法

Info

Publication number: JPS62205788A
Application number: JP4633086A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Shimizu; 清水　祥一; Tsuneo Yamane; 恒夫山根; Tokuhiro Hibi; 徳浩日比; Tomoaki Inagaki; 智亮稲垣
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-03-05
Filing date: 1986-03-05
Publication date: 1987-09-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、酵素利用によるホスファチジルグリセロール
又はその誘導体の製造に関するものである。更に詳細に
は、本発明は、特定の担体に選択的に包括固定化したホ
スホリパーゼＤを触媒として、また、同担体に包括され
たグリセロールを基質として、有機溶媒中でリン脂質（
ホスファチジルグリセロール又はその誘導体を除く、以
下同じ）のホスファチジル基転移を行ない、ホスファチ
ジルグリセロールを製造する方法に関するものである。

従来の技術ホスファチジルグリセロール（以下ＰＧと略称する。一
般式（Ｉ＞で表わされる６）は、肺表面活性物質の重要
な成分のひとつであり、呼吸窮迫症候群に対する人工肺
表面活性物質の補充療法にあたって、その主要な成分に
なりうろことで注目されている。また、食品分野におい
てもホスファチジルコリン（以下ＰＣと略称する。一般
式（Ｉ［＞で表わされる。）よりも優れた乳化剤として
期待がもたれている。

Ｃ）Ｉ２−○−Ｒ１ ■ ＣＨＯＲ２０・・・　（Ｉ＞ＣＨ２−○□Ｐ　　　ＯＣＲ２ＣＨ−ＣＲ２０Ｈ（Ｒ＋
　、Ｒ２はアシル基を示す。）ＣＨ２０Ｒ＋’ ■ 〇− （Ｒ＋　’　、Ｒ２’　はアシル基を示す。）従来ＰＧ
の製造法は、ホスホリパーゼＤ及びグリセロールを含ん
だ緩衝液と、疎水性の基質であるリン脂質が溶解した有
機溶媒とを十分に混合し、分散もしくは乳化した状態で
反応を行なう方法、あるいは、界面活性剤を用いて、ホ
スホリパーゼＤ及びグリセロールを含んだ緩衝液中に、
疎水性の基質であるリン脂質を分散もしくは乳化させて
反応を行なう方法などがとられてきた（　Ｍ　ｅｔｈｏ
ｄｓｉｎ　　Ｅ　ｎｚｙｍｏ＋ｏｇｙ、　　旦、　　２
０８−２１１（１９６９）　：３５Ｂ。

２２６−２３２　（１９７５）　；旦、　　６３２−６
３９　（１９８１）等参照）。

これらの方法においては、ＰＧの生成率がはなはだ低く
、また、水を大量に用いるため副生成物としてホスファ
チジンＭ（以後ＰＡと略称する）が相当母生じる。更に
は、界面活性剤を使用した場合には、使用した界面活性
剤と生成物の分離も容易ではな（、大量のＰＧの製造は
困難である。

また、ホスホリパーゼＤは遊離の状態で用いるため、そ
の再利用は非常に困難であり、そのために高価なホスホ
リパーゼＤを大量に使用しなければならないなどの欠点
がある。更には、遊離のホスホリパーゼＤでは、連続的
にＰＧを製造することは不可能である。

一方、これらの欠点を克服するために脱型反応装置を用
いたＰＧの製造法が提案されているが（Ｊｏｕｒｎａｌ
　　ｏｆ　　ｌ”ｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ。

６３、３７−４４　（１９８５）参照）、ＰＧへの変換
率が低く、ＰＡの生成を伴い、揮発性の有機溶媒を使う
ために再循環が困難などの理由で、上記の欠点を十分に
補うものではなく、実用化には至っていない。

発明が解決しようとする問題、本発明者らは、上記の従来技術の欠点を解決すべり、鋭
意研究を進めた結果、選択的かつ簡便、更には連続的に
行なうこと・も可能なＰＧの製造法に成功し、本発明を
完成するに至った。

問題１、を解決するための一本発明は、ホスホリパーゼＤを触媒として、リン脂質と
グリセロールとからホスファチジルグリセロール又はそ
の誘導体を製造するに際し、ホスホリパーゼＤとグリセ
ロールを共に、疎水性の基を有する担体に包括固定化し
て用い、かつ有機溶媒中で反応を行なうことを特徴とす
る、ホスファチジルグリセロール又はその誘導体の製造
法である。

本発明において、包括固定化に用いるホスホリパーゼＤ
は、微生物により生産されたものでも、あるいは動物の
組織や植物の葉、茎、根１種子などより得られたもので
も、いずれでも用いることができる。また、必ずしも精
製されたホスホリパーゼＤでなくても、用いることがで
きる。

本発明において、ホスホリパーゼＤとグリセロールの包
括固定化に用いられる担体は、疎水性の基を有する担体
である。

これらは、例えば、アルキル基や芳香族基などの疎水性
の基を導入したデキストランゲル、アガロースゲル、セ
ルロースゲル、アクリロアミドゲル、水性ごニルモノマ
ーにより構成されるゲルである。疎水性の基としては、
炭素数３〜１０個のアルキル基が最も好ましい。

ホスホリパーゼＤとグリセロールの包括固定化は、ホス
ホリパーゼＤ粉末をその精製度によって１〜１０％、及
びグリセロールを５〜８０％、好ましくは３０〜６０％
を含む緩衝液と、前記担体とを十分混合し、その後ＮＩ
ｉ液を除いてから、担体を有機溶媒で洗浄することによ
って行なわれる。この操作により、ホスホリパーゼＤは
、たとえ精製されたものでなくても選択的に固定される
。緩衝液中のグリセロール濃度が５％以下の場合には、
ホスファチジル基転移反応において、ＰＡが主として生
成してくるため好ましくなく、８０％以上の場合にはＰ
Ｇの生成速度が遅く、実用的でない。洗浄に用いる有機
溶媒としては、ホスファチジル基転移反応に用、いる有
機溶媒と同じもの、もしくはジエチルエーテルなどが用
いられる。

本発明においては、疎水性の基を有する担体に包括固定
化したホスホリパーゼＤを触媒とし、また同担体に包括
されたグリセロールを基質として、有機溶媒中でその有
機溶媒に含まれるリン脂質のホスファチジル基転移を行
なうことによって、ＰＧが製造される。

本発明において用いる有機溶媒としては、例えば、ジエ
チルエーテル、ｎ−プロピルエーテル。

ジイソプロピルエーテルなどのエーテル類、あるいは、
ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ペンタン、ｎ−オク
タンなどのアルカン類が挙げられるが、リン脂質を可溶
化するものが好ましい。

本発明に用いられるリン脂質としては、その脂肪酸残基
の飽和、不飽和を問わず、例えば、ホスファチジルコリ
ン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル
セリン、ホスファチジルイノシトールなどいずれでも、
及びそれらの混合物でも用いることができるが、大量に
手に入れることのできるＰＣが好ましい。さらに、リゾ
グリセロリン脂質、エーテルグリセロリン脂質、スフィ
ンゴリン脂質などを用いれば、本発明により、それらに
対応したＰＧの誘導体が得られる。有機溶媒に対するリ
ン脂質の濃度は、０．１〜１０％、好ましくは０．５〜
２％とするのが望ましい。

本発明におけるホスファチジル基転移反応の温度は、通
常１０〜５０℃で、用いる有機溶媒の沸点以下、好まし
くは１５〜３５℃で行なうのが良い。本発明のホスファ
チジル基転移反応の反応形式は、回分式または連続方式
で行なう。回分式では、例えば、撹拌法などで行ない、
１回の反応時間は通常３０分〜２時間位である。回分式
では、反応終了後、固定化ホスホリパーゼＤを、例えば
、静置、′ａ過、または遠心分離などの方法で除去する
ことにより、簡便に反応液からＰＧを得ることができる
。回収した固定化ホスホリパーゼＤは、反復使用するこ
とができる。連続式には、ホスホリパーゼＤとグリセロ
ールとを固定化した担体をカラムなどに詰め、リン脂質
を含む有機溶媒をこれに通して、連続的にホスファチジ
ル基転移反応を行なう方法や、ホスホリパーゼＤとグリ
セロールを固定化した担体を、２つの口をもつ反応槽の
中で撹拌しながら、一方の口からリン脂質を含む有機溶
媒を連続的に送り込み、他方の口から反応生成物を連続
的に得る方法などがある。連続式では、循環系で反応を
行なってもかまわない。

発明の効果以上述べたように、本発明では、ホスホリパーゼＤを選
択的に担体に包括固、定化することにより、有機溶媒中
でも長期にわたってホスホリパーゼＤの活性を安定に保
つことができ、ＰＧの製造を選択的かつ簡便、更には連
続的にも行なうことが可能になり、高価なホスホリパー
ゼＤの節約になると共に、ＰＧの大ｍ製造を提供するも
のと言える。

衷ＩＬ次に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発
明は実施例により限定されるものではない。

実施例１キャベツ葉Ｉ　Ｋｇより常法に従って（Ｓ、Ｆ。

Ｙａｎｏ、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　ＥｎＺＶｌ
ｌｌｏｌｏ（ＩＩＩ／、　　１４．　２０８−２１１　
（１９６９）参照）１部分的に精製されたホスホリパー
ゼＤ粉末を１．２ｇ得た。このホスホリパーゼＤ粉末５
００■及びグリセロール５ｇを、０．０８ＭのＣａＣＱ
２含有の０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，６）５ａｄ！に
加え、混合後、４℃で１５０００ｘｇで２０分間遠心分
離を行ない、不溶物を除去し、その上清を酵素溶液とし
た。

担体として用いるオクチル化架橋アガロースゲル（Ｏｃ
ｔｙｌ　−Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ　　ＣＬ　−４Ｂ　、
ファルマシア社製）は、予めイオン交換水で洗浄後、６
０℃１時間乾燥しておいた。そのゲルの４００１１１９
を、上記酵素溶液８威に加え、０℃で３時間撹拌し、こ
の懸濁液を濾過して緩衝液を除いた侵、ジエチルエーテ
ルで洗浄し、これをホスホリパーゼＤとグリセロールを
固定化した担体として用いた。この時のホスホリパーゼ
Ｄの固定化率は、次のようにして求めた。すなわち、前
記のＭｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＥ　ｎＺｌ／ｍｏｌｏｌｌ
ｌ’／、　　旦、　　２０９　（１９６９）に準じて、
使用した上記酵素溶液及び濾液に含まれるホスホリパー
ゼＤによるＰＣの加水分解活性を求め、次式に従って固
定化率を算出した。

（ａ　−ｂ　）　／ａ　ｘ　１００（％）ａ：固定化に
用いた酵素溶液中のホスホリパーゼＤの全活性ｂ：固定化されなかった濾液中のホスホリパーゼＤの全
活性）その結果、濾液中にホスホリパーゼＤ活性はなく、固定
化率は１００％であった。

次に、ＰＣを１％含むジエチルエーテル２戒に、上記方
法で調製した担体を、固定化されたホスホリパーゼＤの
量で５００ｑ加え、３０℃で撹拌しながら反応を行なっ
た。この時のＰＧの生成の初期速度は次のようにして求
めた。経時的に反応液を０、ｌＩｎ１づつ分取し、これ
にＯ，ｈｔｅのイオン交換水を加え、さらにクロロホル
ム−メタノール（容量比２：１）を５ｍｌ添加し、ホル
チらの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ユ岨。

４９７−５０９　（１９５７）参照）に準じてリン脂質
を抽出し、４１！りＯマドグラフィー／水素炎検出器（
ＴＬＣ／ＦＩＤ）によってＰＧの生成量を調べた。

これより求めたＰＧ生成の初期速度は、第１表に示した
通りである。また、同様にして反応開始７０分侵におけ
る全ＰＧ生成団を調べたところ、１．１グ・旦−１であ
った。また、ＰＡは全く検出されなかった。

なお、比較のために、担体として多孔性ガラス（比較例
１）、セライト（比較例２）、イオン交換樹脂（比較例
３）を用いた場合の結果も、第１表に示した。

第１表実施例２実施例１に示されたのと同様の方法で、キャベツ菓由来
のホスホリパーゼＤを、ブチル基を有する水性ビニルポ
リマーより構成されるゲル（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅ
ａｒｌ　　６５０Ｃ，東洋曹達社製）で包括固定化した
。実施例１で示したのと同じ条件で反応を行なった時の
、ＰＧ生成の初期速度を第１表に示した。

実施例３実施例１で調製した固定化ホスホリパーゼＤを、１％の
ＰＣを含むジインプロピルエーテル２ｍに加え、３０℃
で７０分間反応を行なった。この時のＰＧの生成量は、
１．１ｇ・１１−１であり、ＰＡの１成は認められなか
った。

実施例４実施例１と同様の方法で調製した固定化ホスホリパーゼ
Ｄ　ｉ、３ｇを、２つの口をもつ８伍４．１ｄの反応槽
に入れ、これに１％のＰＣを含むジエチルエーテルを満
たし、３０℃の恒温槽中に設置した。

−４（７）口Ｊ：’ｌ、流速１．１ｄ−ｈｒ’で１％の
ＰＣを含むジエチルエーテルをペリスタ・ポンプで送り
込み、反応槽の中で十分に撹拌しながら、もう一方の口
から反応生成物を回収した。反応は３日間続けたが、Ｐ
ＣのＰＧへの交換率は、この間平均４５％を維持した。

Claims

【特許請求の範囲】

１、ホスホリパーゼＤを触媒として、リン脂質（ホスフ
アチジルグリセロールとその誘導体を除く）とグリセロ
ールとからホスフアチジルグリセロール又はその誘導体
を製造するに際し、ホスホリパーゼＤとグリセロールを
共に、疎水性の基を有する担体に包括固定化して用い、
かつ有機溶媒中で反応を行なうことを特徴とする、ホス
フアチジルグリセロール又はその誘導体の製造法。