HU212928B - Enzymatic synthesis of soluble phosphatides from phospholipids - Google Patents
Enzymatic synthesis of soluble phosphatides from phospholipids Download PDFInfo
- Publication number
- HU212928B HU212928B HU9203258A HU325892A HU212928B HU 212928 B HU212928 B HU 212928B HU 9203258 A HU9203258 A HU 9203258A HU 325892 A HU325892 A HU 325892A HU 212928 B HU212928 B HU 212928B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- salt
- divalent
- monovalent
- sodium
- calcium
- Prior art date
Links
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 title claims abstract description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 35
- -1 phosphatidyl ester Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims abstract description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 102000011420 Phospholipase D Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108090000553 Phospholipase D Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims abstract description 11
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 150000001450 anions Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 30
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 229960005160 dimyristoylphosphatidylglycerol Drugs 0.000 claims description 26
- BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N ditetradecanoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N 0.000 claims description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical group CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 17
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 15
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 14
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 claims description 13
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 13
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 12
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 12
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 12
- CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 1,2-di-O-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 0.000 claims description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229960003724 dimyristoylphosphatidylcholine Drugs 0.000 claims description 9
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- HNAGHMKIPMKKBB-UHFFFAOYSA-N 1-benzylpyrrolidine-3-carboxamide Chemical compound C1C(C(=O)N)CCN1CC1=CC=CC=C1 HNAGHMKIPMKKBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ZPVFWPFBNIEHGJ-UHFFFAOYSA-N 2-octanone Chemical compound CCCCCCC(C)=O ZPVFWPFBNIEHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- HCFAJYNVAYBARA-UHFFFAOYSA-N 4-heptanone Chemical compound CCCC(=O)CCC HCFAJYNVAYBARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- OBNCKNCVKJNDBV-UHFFFAOYSA-N butanoic acid ethyl ester Natural products CCCC(=O)OCC OBNCKNCVKJNDBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FKRCODPIKNYEAC-UHFFFAOYSA-N ethyl propionate Chemical compound CCOC(=O)CC FKRCODPIKNYEAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- CATSNJVOTSVZJV-UHFFFAOYSA-N heptan-2-one Chemical compound CCCCCC(C)=O CATSNJVOTSVZJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- NGAZZOYFWWSOGK-UHFFFAOYSA-N heptan-3-one Chemical compound CCCCC(=O)CC NGAZZOYFWWSOGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 5
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RHLVCLIPMVJYKS-UHFFFAOYSA-N 3-octanone Chemical compound CCCCCC(=O)CC RHLVCLIPMVJYKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000004810 partition chromatography Methods 0.000 claims description 4
- XNLICIUVMPYHGG-UHFFFAOYSA-N pentan-2-one Chemical compound CCCC(C)=O XNLICIUVMPYHGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FDPIMTJIUBPUKL-UHFFFAOYSA-N pentan-3-one Chemical compound CCC(=O)CC FDPIMTJIUBPUKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- MTMGWZZYAQSPBR-UHFFFAOYSA-M 2-hydroxyethyl(dimethyl)sulfanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[S+](C)CCO MTMGWZZYAQSPBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 claims description 2
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 claims description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- CTKINSOISVBQLD-UHFFFAOYSA-N Glycidol Chemical compound OCC1CO1 CTKINSOISVBQLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- RJUFJBKOKNCXHH-UHFFFAOYSA-N Methyl propionate Chemical compound CCC(=O)OC RJUFJBKOKNCXHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- CYTYCFOTNPOANT-UHFFFAOYSA-N Perchloroethylene Chemical group ClC(Cl)=C(Cl)Cl CYTYCFOTNPOANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 claims description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- MJOQJPYNENPSSS-XQHKEYJVSA-N [(3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxyoxan-3-yl] acetate Chemical compound CC(=O)O[C@@H]1CO[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O MJOQJPYNENPSSS-XQHKEYJVSA-N 0.000 claims description 2
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims description 2
- 229940017219 methyl propionate Drugs 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229950011008 tetrachloroethylene Drugs 0.000 claims description 2
- CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N trichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)(Cl)Cl CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940029284 trichlorofluoromethane Drugs 0.000 claims description 2
- JJDDPDHSLLONIF-UHFFFAOYSA-N C=C.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O Chemical compound C=C.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O JJDDPDHSLLONIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- HBGGXOJOCNVPFY-UHFFFAOYSA-N diisononyl phthalate Chemical compound CC(C)CCCCCCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCCCCCCC(C)C HBGGXOJOCNVPFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 9
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 8
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 6
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000010408 film Substances 0.000 description 4
- 125000001095 phosphatidyl group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 3
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 2
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPNJKFRXQLXVQD-UHFFFAOYSA-N ClCCl.[Ca] Chemical compound ClCCl.[Ca] NPNJKFRXQLXVQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000004210 ether based solvent Substances 0.000 description 1
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000013554 lipid monolayer Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229940088417 precipitated calcium carbonate Drugs 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- UPDATVKGFTVGQJ-UHFFFAOYSA-N sodium;azane Chemical compound N.[Na+] UPDATVKGFTVGQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
- C07F9/09—Esters of phosphoric acids
- C07F9/10—Phosphatides, e.g. lecithin
- C07F9/106—Adducts, complexes, salts of phosphatides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6481—Phosphoglycerides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P9/00—Preparation of organic compounds containing a metal or atom other than H, N, C, O, S or halogen
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Description
A találmány tárgya oldható foszfatidok javított szintézise, amelyben foszfolipidekből kiindulva foszfolipáz D enzim katalizátor alkalmazásával igen jó kitermeléssel és tisztasággal stabil oldható foszfatidokat állíthatunk elő.
A foszfatidok, mint például a foszfatidil-glicerin értékes anyagok, amelyek alkalmazhatók liposzómák és lipid-komplexek képzésére.
A foszfatidil-glicerineket és más foszfatidokat korábban úgy állították elő, hogy kalcium-acetátot, ecetsavat és valamely enzimet, például foszfolipáz D enzimet, valamint glicerint vagy más elsőrendű alkoholt tartalmazó vizes puffer oldatot elegyítettek valamely foszfatidil-lipiddel, mint például foszfatidil-kolinnal, amely utóbbit vízzel nem elegyedő szerves oldószerben oldották. Abból a célból, hogy az enzimet aktiválják megfelelő oldószert, mint például étert használtak vagy felületaktív anyagot adagoltak az elegyhez és így a vízben oldhatatlan elegyből és a vizes oldatból emulzió képződött.
Az enzim aktiválására leírták a dimetil-éter és a dietil-éter, valamint más éterek alkalmazását Redemann és munkatársai a WO 89/01 524 számú PCT-beli közrebocsátási iratban, azonban ezek a vegyületek veszélyesek, mivel gyúlékonyak, valamint peroxid képzésre hajlamosak, amely peroxid ezután a foszfolipidek autooxidációját elősegíti. Ezen túlmenően mivel az éterek sűrűsége a vízhez képest igen alacsony, a fázisok jó keverését csak úgy lehet megvalósítani, ha erős rázást alkalmaznak, amely kereskedelmi mennyiségű gyártás esetében nehezen megvalósítható.
Felületaktív anyagok is alkalmazhatók az enzim aktiválására, azonban ezeket ezután a kívánt terméktől nehéz elválasztani. Ilyen esetben drága oszlopkromatográfiás elválasztást kell alkalmazni, hogy a megfelelő tisztaságú foszfatidot nyerjük. Ezen túlmenően a viszonylag nagy mennyiségű víz jelenléte hidrolízist eredményez és foszfatidilsav keletkezik, amely csökkenti a kívánt foszfatid termék hozamát, illetve amelyet el kell választani a kívánt foszfatidtól.
Enzim alkalmazása esetén szükséges egy optimális pH határértéken belüli technológia alkalmazása, amely puffer oldatok felhasználását igényli. Az enzimes reakciónál az is lényeges, hogy a reakcióelegyben valamely kétvegyértékű kation, mint például kalciumion legyen jelen, amely a foszfatidot kalcium- vagy más kétvegyértékű kationos só formában eredményezi, amely só ezután az oldatból csapadékként kiválik, és nehezen vihető oldatba. Amennyiben megsavanyítást vagy ioncserélő gyantát és semlegesítést alkalmazunk a kalciumnak oldhatóbb egy vegyértékű sókká történő átalakításához, akkor a hidrolízis igen gyorsan végbemegy és ez együtt jár a bomlási termék csapadékként történő kiválásával, ahol a termék lehet lipofoszfatidil-glicerin vagy foszfatidilsav és ezek keletkezése a fent leírt problémákkal jár együtt.
Ismert, hogy a foszfatidok, mind például a foszfatidil-glicerin kitermelése megnövelhető, ha olyan eljárást alkalmazunk, amelyben a foszfatidil-lipid szerves oldószerben reagál foszfolipáz D enzimmel, amely enzim hidrofób csoportokat tartalmazó hordozóra van felvive. Az oldószer lehet dietil-éter vagy valamilyen alkán, amely oldja a foszfatidil-lipideket, mint például a foszfatidil-kolint. A reakció a szerves oldószer forráspontja alatti hőmérsékleten, mint például 15-35 'C közötti hőmérsékleten végezhető. Azonban ebben az esetben a kívánt foszfatid hozama alacsony, körülbelül 45%, továbbá az éter oldószerek alkalmazása ezek nagy gyúlékonysága és veszélyessége miatt hátrányos.
Foszfolipáz D enzim alkalmazásával végzett foszfatidil-glicerin szintézist ír le például az Applied Microbiology and Biotechnology 27, 146-151 (1987) és az Enzyme and Microbiol. Technology 9, 350-354 (1987) közlemény.
Vizsgálataink célja az volt, hogy kidolgozzunk egy eljárást a foszfatidok biztonságos és egyszerű előállítására javított hozammal célszerűen úgy, hogy a tennék vízoldható egyvegyértékű stabil só formájában legyen.
Korábban az átészterezési reakciót rendszerint kétfázisú rendszerben végezték, amely étert tartalmazott abból a célból, hogy a reakciót megfelelő sebességűvé aktiválja. Azonban ilyen típusú reakció során ritkán értek el kvantitatív kitermelést, mivel jelentős mennyiségű foszfatidinsav is keletkezett. Ezen túlmenően az éter és a vizes fázis közötti nagy sűrűségkülönbség miatt a nagy tömegben végzett reakció csak limitált hozamot eredményezett, mivel az elegy keverése nem volt megfelelő. Amennyiben felületaktív anyagokat is alkalmaztak, akkor a termék tisztítása okozott problémát.
Vizsgálataink során felismertük, hogy stabil oldható foszfatidil-sók állíthatók elő igen jó kitermeléssel, ha az eljárást az alábbiak szerint végezzük.
A találmány szerinti eljárás során foszfolipidet, mint például foszfatidil-kolint, reagáltatunk valamely elsőrendű alkohollal (1) foszfolipáz D enzim katalizátor, továbbá (2) egy nem éter-típusú oldószer, amely az enzimet nem bontja és nem denaturálja, valamint az étereknél kevésbé gyúlékony, és (3) egy pufferolt kétvegyértékű sóoldat, előnyösen kalciumsó oldat, amely a megfelelő foszfatidil-észtert mint kétvegyértékű sót képzi, jelenlétében. Az oldhatatlan kétvegyértékű sót valamely szerves oldószerben oldható, stabil egyvegyértékű kevert sóvá alakítjuk úgy, hogy a kétvegy értékű sót egy szerves oldószerben szuszpendáljuk és a megfelelő sztöchiometrikus mennyiségű szilárd egyvegyértékű sókat hozzáadjuk, amely párhuzamosan oldatba viszi a foszfatidot és csapadékként leválasztja a hozzáadott egyvegyértékű kationos sók anionjával képzett kalcium sót. Ezzel az eljárással a foszfatid egy vegyértékű kevert sóját állítjuk elő anélkül, hogy jelentős mennyiségű hidrolízis termék, mint például foszfatidilsav keletkezne.
Továbbá azt találtuk, hogy egy adott észter-só, a dimirisztoil-foszfatidil-glicerin ammónium/nátrium kevert só oldhatósága és stabilitása maximális értéket ér el, amennyiben az ammónium- és nátriumionok tömegaránya adott értékű és a kétvegyértékű jelenlevő anion mennyisége limitált. A dimirisztoil-foszfatidil-glicerin ammónium/nátrium-kevert sójának maximális stabili2
HU 212 928 Β tását és oldhatóságát szerves oldószerben úgy érhetjük el, hogy az ammóniumion tömeg%-át a kevert só tömegére vonatkoztatva körülbelül 2,0- körülbelül 2,6 tömeg% közötti értéken, illetve a nátriumion tömeg%-át a kevert só tömegére vonatkoztatva körülbelül 0,3 körülbelül 0,8 tömeg% közötti értéken tartjuk. A maximális kalcium-koncentráció a kevert sóra vonatkoztatva körülbelül 0,1, előnyösen körülbelül 0,05 tömeg%.
Ezen túlmenően az találtuk, hogy a foszfolipáz D enzim reakcióját a foszfatidil-kolinnal és glicerinnel vagy más alkohollal nagymértékben elősegíti a centrifugális megosztásos kromatográfia (CPC) alkalmazása.
Az 1. ábrán bemutatjuk a dimirisztoil-foszfatidilglicerin kevert só diklórmentánban való oldhatóságának és ammónium-ion tartalmának függvényét.
A találmány tárgya tehát kétlépéses eljárás egy foszfatidil-észter egy vegyértékű kevert sónak előállítására megfelelő foszfolipidből egy enzim-katalizátor és egy pufferoldat jelenlétében, oly módon, hogy
i) a megfelelő foszfolipidet reagáltatjuk valamely elsőrendű alkohollal egy vízzel nem elegyedő, nem éter-típusú oldószerben, foszfolipáz D enzim katalizátor és egy kétvegyértékű kationos pufferoldat jelenlétében, és ii) a kapott kétvegyértékű foszfatid sót valamely szerves oldószerben oldható, stabil, egyvegyértékű kevert sóvá alakítjuk úgy, hogy a szerves oldószerben szuszpendáljuk a megfelelő sztöchiometrikus mennyiségű egyvegyértékű sókkal együtt, amelyek anionja oldhatatlan csapadékot képez a kétvegyértékű kationnal.
A találmány tárgya továbbá eljárás dimirisztoilfoszfatidil-glicerin oldható ammónium/nátrium kevert sójának előállítására, dimirisztoil-foszfolipidből egy enzim katalizátor és egy pufferoldat jelenlétében, oly módon, hogy
i) a megfelelő dimirisztoil-foszfolipidet egy elsőrendű alkohollal reagáltatjuk valamely vízzel nem elegyedő, nem éter-típusú oldószerben, egy enzim katalizátor és egy kétvegyértékű kationos pufferoldat jelenlétében, majd ii) a kapott kétvegyértékű kationos sót egy szerves oldószerben oldható egyvegyértékű sóvá alakítjuk úgy, hogy a kétvegyértékű sót a szerves oldószerben sztöchiometrikus mennyiségű egyvegyértékű sóval együtt szuszpendáljuk, amely só anionja a kétvegyértékű kationnal csapadékot képez, és amely só kationja olyan tömegarányú ammóniumés nátrium-ion keveréke, hogy az egyvegyértékű dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert só körülbelül 2,0-2,6 tömeg% ammónium-iont és körülbelül 0,30,8 tömeg% nátrium-iont tartalmaz.
A találmány szerinti eljárással előállított anyagok javított oldhatóságuk és stabilitásuk révén különösen előnyösen alkalmazhatók liposzóma és lipid komplex készítményekben.
A liposzómák teljesen zárt lipid kétrétegű membránok, amelyek fázist foglalnak magukba. A liposzómák lehetnek egy lamellás, hólyagszerű készítmények (amelyek csak egyetlen kétrétegű membránt tartalmaznak) vagy lehetnek többlamellás hólyagok (amelyek hagymaszerű szerkezetűek és azzal jellemezhetők, hogy több membrán kettős réteget tartalmaznak, amely rétegeket egymástól vizes réteg választ el). A kettős réteg két lipid rétegből áll, amelyek hidrofób „farokrésszel” és hidrofil „fejrésszel” rendelkeznek. A membrán kettős réteg szerkezete olyan, hogy a hidrofób (nem poláris) „farok rész” a lipid monorétegekben a kettős réteg központja felé helyezkedik el, míg a hidrofil „fej rész” a vizes fázis irányában található.
Liposzómák, amelyek dimirisztoil-foszfatidil-kolint (DMPC), dimirisztoil-foszfatidil-glicerint (DMPG) és koleszterint és amfotericin B-t foglalnak magukba, alkalmazhatók a szervezetre kiterjedő gombás fertőzések kezelésére (Juliano és munkatársai, Annals Ν. Y. Acad, Sci., 1985, 446:390-402; Lopez-Berenstein és munkatársai, J. Infect. Dis., 1986, 151-704-710).
A WO 88/06 443 számú „Kis toxicitású hatóanyaglipid rendszerek” című PCT-beli közrebocsátási iratban Janoff és munkatársai leírtak eljárásokat magas hatóanyag/lipid tartalmú komplexek előállítására, amelyek hatóanyaghoz asszociált nem liposzóma formában lévő lipideket tartalmaznak, vagy HDLC anyagok és liposzómák előállítását, amely liposzómák megadott arányú DMPC és DMPG anyagot tartalmaznak. A foszfolipideket oldószerben oldották, amely lehet kloroform és diklórmetán.
A HDLC (magas hatóanyag:lipid komplex) anyagokat úgy állíthatjuk elő, hogy először egy hatóanyagot, különösen amennyiben a hatóanyag valamely polietilén gombaellenes antibiotikum, mint például amfotericin B, oldunk egy biokompatíbilis szerves oldószerben, mint például dimetil-szulfoxidban (DMSO) vagy metanolban, majd a kapott oldatot lipiddel vagy lipidekkel, mint például DMPC:DMPG 7:3 mólarányú eleggyel keverjük, amely utóbbit előzetesen egy oldószerben, mint például diklórmetánban oldottuk. Ezt követően az oldószereket vákuumban elpárologtatjuk és egy vékony lipid-hatóanyag filmet nyerünk. A filmet valamely vizes oldattal, mint például fiziológiás sóoldattal PBS vagy glicin puffer oldattal hidratáljuk, és így HDLC anyagot képzünk. Más eljárás szerint a vizes oldatot az oldószert tartalmazó hatóanyag és lipid fázishoz adagolhatjuk azelőtt, mielőtt az oldószert elpárologtatnánk. Ismét más eljárás szerint a kapott száraz lipid-hatóanyag filmet újra szuszpendálhatjuk valamely oldószerben, mint például diklórmetánban és az oldószert ismét elpárologtatjuk vákuumban a film hidratálása előtt. Egy dehidratálási eljárás is alkalmazható, amelynek során egy száraz lipid-hatóanyag filmet dehidratálunk, és így pikkelyszerű vagy pehelyszerű anyagot képzünk, amelyet ezt követően vizes oldattal hidratálunk. Más eljárás szerint a HDLC előállítható úgy, hogy MLV eljárással lipid részecskéket képezünk, amelyek a biológiailag aktív hatóanyagot tartalmazzák, majd ezeket a részecskéket melegítési ciklusba visszük körülbelül 25-60 °C hőmérsékleten.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazható foszfolipidek természetes és szintetikus lipidek lehetnek, amelyek egy vagy több foszfatidil-csoportot tartalmaz3
HU 212 928 Β nak. Ilyen anyagok például a foszfatidil-kolin, a foszfatidil-etanolamin, a foszfatidil-szerin, a foszfatidinsav, a dimirisztoil-foszfatidil-kolin és a foszfatidil-inozitol. A foszfatidil-kolin kereskedelemben kapható nagy tisztaságban, ennélfogva előnyösen alkalmazható anyag.
A leírásban megadott elsőrendű alkohol a glicerin, azonban más elsőrendű alkoholok, mint például szulfokolin, etilén-glikol, glicidol, ribóz, etanolamin, glicerin-formai és hasonlók is alkalmazhatók. Az egyszerű elsőrendű alkoholok, mint például a metanol, az etanol, a propanol és hasonlók célszerűen elkerülendők, mivel igen gyors reakcióba lépnek és a megfelelő alkil-észter vegyületet képzik.
Az alkalmazható kétvegyértékű kationos pufferek pH-értéke körülbelül 5,7 és kétvegyértékű kationt, mint például kalcium-iont tartalmaznak. A kation az enzimmel nem léphet reakcióba. Alkalmas puffer lehet például a kalcium-hidroxid, kalcium-klorid vagy kalcium-acetát ecetsavval vagy nátrium-acetáttal képzett oldata.
A nem gyúlékony vagy igen kis gyúlékonyságú vízzel nem elegyedő oldószer, amelyet a találmány szerinti eljárásban alkalmazhatunk olyan, hogy a dietiléternél vagy a dimetil-éternél kevésbé gyúlékony legyen, lobbanáspontja 0 °C érték feletti legyen, előnyösen 20 °C feletti legyen és az oldószer nem bonthatja vagy denaturálhatja az enzimet illetve csökkentheti ennek aktivitását; a dietil-éter ilyen hatásával összehasonlítva a károsítás mértéke legfeljebb a dietil-éter által kifejtett károsításnál körülbelül 25%-kal kisebb lehet. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható oldószerek például a halogénezett oldószerek, mint például a diklórmetán, a kloroform, a tetraklór etilén, a triklórfluor-metán és hasonlók. Alifás vagy aromás észterek, alkánok, ketonok vagy észterek, amelyeknek molekulatömege körülbelül 5000 alatti, ugyancsak alkalmazhatók. így például alkalmazható etil-acetát, etil-propionát, etil-butirát, metil-acetát, metil-propionát, 3-pentanon, 3-heptanon, 2-oktanon, 2-butanon, 2-pentanon,
2-heptanon, 3-oktanon és 4-heptanon, valamint hasonló oldószerek.
A fenti leírt reaktánsokat elegyítjük például keveréssel vagy rázatással, és így a kiindulási foszfatidilésztert, mint például foszfatidil-kolint, a kívánt termék kétvegyértékű kationos sójává, például foszfatidil-glicerin kalcium-sóvá alakítjuk.
Általában kis energiájú elegyítés, mint például keverés vagy örvénylés, elegendő ahhoz, hogy legalább körülbelül 80%-os hozammal nyerjük a kívánt kétvegyértékű kationos sót. Centrifugális megosztási kromatográfia (CPC), [Cazes, J. „Nagy teljesítőképességű CPC biológiai anyagok folyásirányú feldolgozására”, American Biological Laboratories, 1989. június 17-23], alkalmazható az enzim által kifejtett átészterezési reakció elősegítésére, amely a foszfolipid és az alkohol között zajlik. Egy stacionárius vizes fázist, amely alkalmas körülbelül 5,6 pH értékű puffért, mint például nátrium-acetátot tartalmaz, továbbá kalciumkloridot, egy alkalmas alkoholt és az enzimet bemérjük a centrifugába. A centrifugát működésbe hozzuk, majd a mozgó fázist, amely egy szerves nem alkohol jellegű oldószer, mint például etil-acetát vagy etil-butirát. és a foszfolipidet tartalmazza, a CPC rendszerbe adagoljuk. A telített foszfatidil-glicerin, mint például DMPG kalcium sója, az eluensből csapadékként kiválik. A nem reagált oldható foszfatidil-kolint ezután recirkuláltatjuk, hogy a termelést növeljük. A foszfatidil-glicerint ezután tovább tisztíthatjuk. A szakember előtt nyilvánvaló az ilyen célra alkalmazott eljárás.
A reakció hőmérséklete általában körülbelül 1550 °C, előnyösen körülbelül 20-37 °C és legelőnyösebben körülbelül 20-30 °C közötti.
A csapadékként kivált kétvegyértékű kationos sót könnyen elválaszthatjuk az enzimtől és más reakcióban keletkezett mellékterméktől szűrés segítségével, a csapadékot vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, mint például etil-acetáttal, ezt követően diklórmetánnal mossuk a további tisztítás érdekében.
A kétvegyértékű kationos sót ezután valamely szerves oldószerfázis, mint például metilalkohol és kloroform jelenlétében oldható, stabil egyvegyértékű kevert sóvá alakítjuk úgy, hogy szuszpenzióban reagáltatjuk körülbelül sztöchiometrikus mennyiségű megfelelő egyvegyértékű sókkal, amely sók anionja csapadékot képez a kétvegyértékű kationnal. Előnyösen alkalmazható egyvegyértékű kationok az ammóniumion, a nátriumion és a káliumion, amelyeket karbonát, citrát. fluorid, szulfát, foszfát, nitrát, laktat, szukcinát, formiát, oxalát, klorid, etilén-diamin-tetraacetát, etilénbisz(oxi-etilén-nitrilo)-tetraacetát és hasonló formában alkalmazhatunk, mivel ezek vízben jól oldódnak. A foszfatidil egyvegyértékű sók oldatban maradnak és a kétvegyértékű só csapadékként kiválik, ennélfogva szűréssel vagy más eljárással könnyen eltávolítható, így elérhető legalább 25% és általában 35%-os vagy ennél magasabb konverzió is. Mivel az ammóniumsókban található ammónia illékony, amely sók alkalmazása egyébként magas oldhatóságuk miatt előnyös lehet, célszerűen kevert ammónium/nátrium sót képezünk, mivel ez jó oldhatóságú és jó stabilitású is. Az ammóniunrnátrium ion közötti előnyös moláris ionarány körülbelül 1:1 - körülbelül 8:1 közötti. Különösen előnyös ammónium :nátrium ion arány a 4:1 mólarány.
A dimirisztoil-foszfatidil-glicerin ammónium-sója elég jól oldódik szerves oldószerekben, mint például diklórmetánban. A dimirisztoil-foszfatidil-glicerin ammónium sójának oldhatósága diklórmetánban nagy obb mint körülbelül 26 mg/ml. Azonban ez a só nem túl stabil. A nátriumsó stabilabb de sokkal kevésbé oldható, például a dimirisztoil-foszfatidin-glicerin nátrium sójának oldhatósága diklórmetánban kisebb mint körülbelül 0,2 mg/ml. A nátrium-só és az ammónium-só adott aránya stabilizálja a kevert sót anélkül, hogy az oldhatóságot a megfelelő mérték alá csökkentené, amennyiben az alkalmazott nátrium-só mennyiségét szabályozzuk. Körülbelül 0,3 tömeg% nátrium kationmennyiség stabilitást biztosít, azonban a maximális, körülbelül 0,8 tömeg% nátrium mennyiség alkalmazása felett a kevert só oldhatósága diklórmetánban csökken.
HU 212 928 Β
A maradék kalciumion-mennyiség körülbelül 0,1 tömeg%, előnyösen körülbelül 0,05 tömeg% alatti legyen a kevert sóban. A kalciumsó oldhatatlan és a túlzott kalciumion-mennyiség jelenléte a kevert só oldhatóságát csökkenti a viszonylag nem poláros szerves oldószerekben.
Megjegyzendő azonban, hogy a dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert ammónium/nátrium sója tartalmazhat több mint körülbelül 0,1 tömeg% vagy körülbelül 0,05 tömeg% kalcium-iont és a nátrium-ion tartalom nagyobb lehet mint körülbelül 0,8 tömeg%, ennek ellenére a só oldhatósága jelentősen megnövekszik, amennyiben az ammónium-ion tartalom 2,0 tömeg% felett van, és igen magas a só oldhatósága amennyiben az ammónium-ion tartalom körülbelül 2,25-2,35 tömeg% (lásd az 1. ábrát és a II. táblázatot).
Általában amennyiben a kalcium-ion tartalom körülbelül 0,05 tömeg% feletti vagy amennyiben az ammónium-ion tartalom körülbelül 2,0 tömeg% alatti, az oldhatatlan dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert ammónium/nátrium-só mennyisége diklórmetánban növekszik (lásd a III. táblázatot).
Ennélfogva a találmány szerinti eljárásban a dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kalcium-sójának csapadékként történő leválasztása, mosása és leszűrése után ammónium-karbonátot és nátrium-karbonátot adagolunk hozzá olyan mennyiségben, hogy a kalcium aniont szilárd kalciumsóvá, például karbonáttá alakítsuk. Előnyösen az egyvegyértékű karbonátokat nem feleslegben adagoljuk, hanem csak sztöchiometrikus mennyiségben, amely ahhoz szükséges, hogy a kalcium anion kalcium-karbonát sóként kicsapódjon. A dimirisztoil-foszfatidil-glicerin ammónium/nátrium kevert sóját elválasztjuk az oldhatatlan kalcium sótól, majd kívánt esetben tovább tisztíthatjuk.
Amennyiben további tisztítás szükséges, erre a célra kromatográfiás eljárást alkalmazhatunk, amelyben ammóniával kezelt szilikagél oszlopot használunk, eluensként pedig metanol/kloroform oldószerelegyet alkalmazunk.
A találmány szerinti eljárást detergensek vagy más felületaktív anyagok jelenléte nélkül végezzük, amely anyagokat egyébként később el kellene távolítani. Az eljárás alkalmazásával nagy tisztaságú terméket nyerünk igen jó kitermeléssel a foszfatidilsav vagy más melléktermékek párhuzamos keletkezése nélkül, amely anyagok a kívánt foszfát-észter-sók hozamát csökkentenék, illetve további tisztítást tennének szükségessé.
A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk. A példák illusztratív jellegűek és nem jelentik a találmány tárgykörének korlátozását. Valamennyi reakciót körülbelül 23 °C hőmérsékleten hajtottuk végre.
1. példa ml 5,6 pH értékű nátrium-acetát puffer, 1 ml víz, 0,2 ml 1M kalcium-klorid és 0,2 ml glicerin elegyében 200 mg foszfatidil-kolint emulgeálunk.
A kapott emulzióhoz 1 mg foszfolipáz D enzim, 1 ml nátrium-acetátban és 1 ml vízben készült oldatát adagoljuk. Ezután az elegyhez 2 ml diklórmetánt adunk, majd 17 órán át keverjük.
A csapadékként kivált foszfatidil-glicerint leszűrjük, 10 ml diklórmetánnal mossuk, majd a kalcium-sót kinyerjük. A hozam 74%.
140 mg fent nyert kalcium-sót szuszpendálunk 6 ml etanol és 3 ml hexán elegyében. Ezután a szuszpenzióhoz sztöchiometrikus mennyiségű 1:4 mólarányú nátrium-karbonát/ammónium-karbonát elegyet adunk, majd a keveréket elegyítjük.
A kivált kalcium-karbonátot leszűrjük.
120 mg (78% termelés) foszfatidil-glicerin nátrium/ammónium sót nyerünk.
2. példa literes tartályban, amely 500 ml vizet és 500 ml
5,6 pH értékű 0,5 n nátrium-acetát puffért tartalmaz, bemérünk 100 g dimirisztoil-foszfatidil-kolint, majd az elegyhez 100 ml 1M kalcium-klorid oldatot és 100 mg foszfolipáz D-nek 50 ml puffer és 50 ml víz elegyében készült oldatát adagoljuk. A keverékhez 1 liter etil-butirátot adunk, majd a tartályt lezárjuk és 17 órán át rázatjuk.
A csapadékként kivált kalcium-dimirisztoil-foszfatidil-glicerint leszűijük. A terméket Büchner-tölcséren szűrjük, majd 5 liter etilacetáttal és végül 1 liter diklórmetánnal mossuk.
A szűrőlepényt 1052 ml metanol, 526 ml kloroform és 420 ml víz elegyében szuszpendáljuk.
A szuszpenzióhoz 526 ml 1:1 térfogatarányú 2n ammóniumkarbonát és 0,5 n nátrium-karbonát elegyet adunk. A keveréket gyorsan leszűrjük, majd a szűrlethez 526 ml kloroformot adagolunk. A kloroformot körülbelül 200 ml térfogatra bepároljuk, majd az elegyhez 5 liter hideg acetont adunk.
Az elegyet Büchner-tölcséren leszűrjük és a kapott DMPG anyagot hideg acetonnal mossuk.
g (95% termelés) nátrium/ammónium-dimirisztoil-foszfatidil-glicerint nyerünk.
A kapott terméket tovább tisztítjuk úgy, hogy 20% metanol tartalmú kloroformban oldjuk, majd 25 mm-es szilikagél oszlopra visszük és oldószereleggyel, amely 80% kloroform/20% metanol/1% ammónium-hidroxid, eluáljuk.
A dimirisztoil-foszfatidil-glicerin terméket tartalmazó frakciókat elválasztjuk és szárazra pároljuk.
99%-os tisztaságú dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert ammónium/nátrium sót nyerünk.
3. példa
200 g (0,29 mmól) dimirisztoil-foszfatidil-kolint mérünk 5 literes háromnyakú banán keverővei ellátott lombikba, majd 1 liter 5,6 pH értékű 0,5 n nátrium-acetát puffért, 1 liter vizet, 200 ml glicerint és 200 ml 1M kalcium-kloridot adagolunk hozzá. A pH értékét 5,5 értékre állítjuk be.
Az elegyhez 80 mg foszfolipáz D-nek, 5 ml nátrium-acetát puffer és 5 ml víz elegyében képzett oldatát adagoljuk, végül 1 liter diklórmetánt adagolunk. Az elegyet ezt követően 17 órán át keverjük.
HU 212 928 Β
A reakcióelegyet Büchner-tölcséren leszűrjük és a szűrőlepényt 5 liter vízzel és 5 liter diklórmetánnal mossuk.
166 g (0,24 mól) kalcium-dimirisztoil-foszfatidilglicerint nyerünk, termelés 82%. A termék vékonyréteg-kromatográfiás analízis szerint 95%-os tisztaságú.
4. példa
Egy mintacső sorozatot megtöltünk szuszpenzióval úgy, hogy az egyes csövekbe az alábbi alkotóelemek kerülnek: 200 ml dimirisztol-foszfatidil-kolin; 2 ml
5,6 pH értékű 0,25 M nátrium-acetát puffer; 200 ml 1 M kalcium-klorid: 200 ml glicerin és 5 mg foszfolipáz D 2 ml 0,25 M nátrium-acetát pufferben készült oldata, amely pH 5,6 értékkel rendelkezik.
Az egyes csövekhez 2,5 ml különféle oldószert adagolunk (lásd az I. táblázatot). A csöveket lezáijuk és 25 °C hőmérsékleten rázógépre helyezzük. A rázógép 250 ford/perc értékre beállított és 17 órán át végezzük a rázatást. Ezután a rázógépet leállítjuk és valamennyi cső tartalmát megvizsgáljuk, majd a tartalmukat 3x5 ml kloroformmal és ezt követően 5 ml acetonnal mossuk, majd vákuumban konstans tömegig szárítjuk. Minden egyes cső mintáját analizáljuk vékonyrétegkromatográfiás analízis segítségével szilikagélen. Az analízisben kloroform:metanol:ammónia 65:35:5 térfogatarányú eluenst alkalmazunk. Az eredményeket az alábbi I. táblázatban adjuk meg.
/. táblázat
| Oldószer | Az oldhatatlan termék hozama (mg**) |
| etil-acetát | 183 |
| etil-propionát | 205* |
| etil-butirát | 254* |
| 2-butanon | 78 |
| 2-pen tanon | 78 |
| 2-heptanon | 162 |
| 2-oktanon | 166 |
| butil-acetát | 126 |
| 3-pen tanon | 150 |
| 3-heptanon | 116 |
| 3-oktanon | 9 |
| 4-heptanon | 175 |
| széntetraklorid | 5 |
| kloroform | 46 |
| diklór-metán | 185 |
| éter | 190 |
* A magas értékek valószínűleg a nem homogén liposzóma szuszpenzió következtében lépnek fel.
** A vékonyréteg-kromatográfiás analízis azt mutatja, hogy a foszfatidil-kolin foszfatidil-glicerin-kalcium-sóvá alakult és a nem-ceagált foszfatidil-kolin a mosással eltávozott.
5-10. példák
Különféle dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert ammónium/nátrium sók diklór-metánban való oldhatósága.
Minden egyes kevert sóból 1,6 mg mennyiséget elegyítünk és az oldatot 35 °C hőmérsékletre melegítjük keverés közben 1 és 2 óra időtartamon át. Ezután az elegyet leszűrjük, 0,2 gm 25 mm átmérőjű fecskendőszűrőn (Gelman Acrodisc CR) és meghatározzuk az oldhatóság%-ot. Az eredményeket az alábbi, II. táblázatban adjuk meg.
II. táblázat
| Példa | %nh4 + | %NA+ | %Ca2+ | Oldhatóság % | |
| 1 óra | 2 óra | ||||
| 5 | 2,28 | 0,34 | 0,19 | 94 | 98 |
| 6 | 1,64 | 1,11 | 0,06 | 62 | 64 |
| 7 | 1,59 | 1,08 | 0,09 | 60 | 65 |
| 8 | 1,97 | 0,75 | 0,05 | 76 | 83 |
| 9 | 2,32 | 0,55 | 0,33 | - | 92 |
| 10 | 2,11 | 0,51 | 0,26 | - | 79 |
Az 1. ábrán bemutatjuk az ammóniumion-tartalom függvényében a diklórmetánban való oldhatóság változásának görbéjét. A diagram azt mutatja, hogy még abban az esetben is, amennyiben a kalcium-tartalom körülbelül 0,05 tömeg% feletti és a nátrium-tartalom körülbelül 0,8 tömeg% feletti, az oldhatóság jelentősen növekszik, amennyiben az ammóniumion tartalom körülbelül 2,0 tömeg% feletti és az oldhatóság igen nagy, amennyiben az ammóniumion tartalom körülbelül 2,25-2,35 tömeg%.
11. példa
0,2 M nátrium-acetát puffért, amelynek pH értéke 5,6, elegyítünk 0,3 M kalcium-kloriddal, 0,3 M glicerinnel és foszfolipáz D enzimmel és centrifugális megosztási kromatografáló (CPC) rendszerbe helyezzük. A centrifugát mozgásba hozzuk és 0-20% mennyiségű foszfatidil-kolint tartalmazó etilacetátot vagy etil-butirátot szivattyúzunk a CPC rendszerbe. Az eluensből a PG-kalcium-só csapadékként kiválik és tovább tisztítható. A nem reagált oldható foszfatidil-kolin recirkuláltatható.
1—4. összehasonlító példák
Különféle dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert ammónium/nátrium-sók diklórmetánban való oldhatósága.
1,6 mg kevert sót elegyítünk minden egyes sótípusból 4,5 mg dimirisztoil-foszfatidil-kolinnal és 35 °C hőmérsékleten keveijük 1 órán át az elegyet. Az anyagot ezután 0,2 μηι méretű 25 mm átmérőjű fecskendő szűrőn (Gelman Acrodisc CR) bocsátjuk keresztül és az oldhatatlan anyag%-át számítjuk. Az eredményeket az alábbi III. táblázatban adjuk meg.
HU 212 928 Β
III. táblázat
| Példa | Tömeg% | Oldható anyag% | Oldha- tatlan anyag% | ||
| Na+ | nh4 + | Ca2+ | |||
| Cl | 0,38 | 2,26 | 0,2 | 95 | 5 |
| C2 | 0,51 | 2,11 | 0,26 | 89 | 11 |
| C3 | 1,11 | 1,64 | 0,06 | 91 | 9 |
| C4 | 0,75 | 1,97 | 0,05 | 95 | 5 |
5. összehasonlító példa
1,6 mg/ml töménységű dimirisztoil-foszfatidil-glicerin ammónium/nátrium kevert sót, amelynek nátrium-tartalma 1,20 tömeg%, ammónium-tartalma 1,53 tömeg% és kalcium-tartalma 0,12 tömeg% elegyítünk 4,5 mg/ml töménységű diklórmetános dimirisztoil-foszfatidil-kolinnal, majd az elegyet keverés közben 35 °C hőmérsékletre melegítjük. Az elegy 1 óra után is zavaros, ami azt jelenti, hogy a kevert só nem teljesen oldódott.
Claims (17)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás foszfatidil-észter valamely oldható, egyvegyértékű kevert sóinak előállítására foszfolipidből egy enzim-katalizátor és egy pufferoldat jelenlétében, azzal jellemezve, hogyi) a megfelelő foszfolipidet reagáltatjuk valamely elsőrendű alkohollal egy vízzel nemelegyedő, nem éter-típusú oldószerben, foszfolipáz D enzim katalizátor és egy kétvegyértékű kationos pufferoldat jelenlétében, és ii) a kapott kétvegyértékű foszfatid sót valamely szerves oldószerben oldható, stabil, egyvegyértékű kevert sóvá alakítjuk úgy, hogy a szerves oldószerben szuszpendáljuk a · megfelelő sztöchiometrikus mennyiségű egyvegyértékű sókkal együtt, amelyek anionja oldhatatlan csapadékot képez a kétvegyértékű kationnal.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy foszfolipidként foszfatidil-kolint alkalmazunk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy foszfolipidként dimirisztoil-foszfatidil-kolint alkalmazunk.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkoholként glicerint, szulfokolint, etilén-glikolt, glicidolt, ribózt, etanolamint vagy glicerin-formait alkalmazunk.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkoholként glicerint alkalmazunk.
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan pufferoldatot alkalmazunk, amely kalciumsót tartalmaz.
- 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vízzel nem elegyedő oldószerként egy halogénezett alkánt vagy álként, így diklórmetánt, kloroformot, tetraklór-etilént vagy triklór-fluor-metánt alkalmazunk.
- 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vízzel nem elegyedő oldószerként valamely alifás vagy aromás észtert, alkánt vagy ketont alkalmazunk.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vízzel nem elegyedő oldószerként etil-acetátot, etil-propionátot, etil-butirátot, metil-acetátot, metilpropionátot, 2-butanont, 2-pentanont, 2-heptanont, 2oktanont, 3-pentanont, 3-heptanont, 3-oktanont vagy4-heptanont alkalmazunk.
- 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan egyvegyértékű sót alkalmazunk, melyben az egyvegyértékű kation ammónium-ion, nátriumion vagy kálium-ion.
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sót alkalmazunk, amelynek anionja citrát, szulfát, foszfát, nitrát, laktát, szukcinát, formiát, oxalát, etilén-tetraacetát, etilén-bisz(oxi-etilén-nitrilo)tetraacetát vagy klorid.
- 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i) lépést centrifugális megosztási kromatográfia alkalmazásával végezzük.
- 13. Eljárás dimirisztoil-foszfatidil-glicerin oldható ammónium/nátrium-kevert sójának előállítására, dimirisztoil-foszfolipidből egy enzim katalizátor és egy pufferoldat jelenlétében, azzal jellemezve, hogyi) a megfelelő dimirisztoil-foszfolipidet egy elsőrendű alkohollal reagáltatjuk valamely vízzel nem elegyedő, nem éter-típusú oldószerben, foszfplipáz D enzim katalizátor és egy kétvegyértékű kationos pufferoldat jelenlétében, és ii) a kapott kétvegyértékű kationos sót egy szerves oldószerben oldható egyvegyértékű sóvá alakítjuk úgy, hogy a kétvegyértékű sót a szerves oldószerben egy sztöchiometrikus mennyiségű egyvegyértékű sóval együtt szuszpendáljuk, amely só anionja a kétvegyértékű kationnal csapadékot képez, és amely só kationja olyan tömegarányú ammóniumés nátrium-ion keverék, hogy az egyvegyértékű dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert só mintegy 2,0-2,6 tömeg% ammónium-iont és mintegy 0,30,8 tömeg% nátrium-iont tartalmaz.
- 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kétvegyértékű kationként kalcium-iont alkalmazunk.
- 15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan egyvegyértékű dimirisztoil-foszfatidilglicerin kevert sót állítunk elő, amely legfeljebb 0,1 tömeg% kalciumot tartalmaz.
- 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egyvegyértékű dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert só legfeljebb 0,05 tömeg% kalciumot tartalmaz.
- 17. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i) reakciólépést centrifugális megosztásos kromatográfia alkalmazásával hajtjuk végre.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US51328590A | 1990-04-17 | 1990-04-17 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9203258D0 HU9203258D0 (en) | 1993-01-28 |
| HUT63198A HUT63198A (en) | 1993-07-28 |
| HU212928B true HU212928B (en) | 1996-12-30 |
Family
ID=24042616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9203258A HU212928B (en) | 1990-04-17 | 1991-04-16 | Enzymatic synthesis of soluble phosphatides from phospholipids |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0528834B1 (hu) |
| JP (1) | JP3169132B2 (hu) |
| AT (2) | ATE181747T1 (hu) |
| AU (1) | AU646458B2 (hu) |
| CA (1) | CA2080907C (hu) |
| DE (2) | DE69123145T2 (hu) |
| DK (2) | DK0727491T3 (hu) |
| ES (2) | ES2132780T3 (hu) |
| GR (2) | GR3022375T3 (hu) |
| HU (1) | HU212928B (hu) |
| IE (1) | IE911264A1 (hu) |
| NZ (1) | NZ237845A (hu) |
| PT (1) | PT97391B (hu) |
| WO (1) | WO1991016444A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA912877B (hu) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060165606A1 (en) | 1997-09-29 | 2006-07-27 | Nektar Therapeutics | Pulmonary delivery particles comprising water insoluble or crystalline active agents |
| US7871598B1 (en) | 2000-05-10 | 2011-01-18 | Novartis Ag | Stable metal ion-lipid powdered pharmaceutical compositions for drug delivery and methods of use |
| DE10142014B4 (de) * | 2001-08-28 | 2004-11-11 | Degussa Bioactives Deutschland Gmbh & Co. Kg | Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin |
| US7368102B2 (en) | 2001-12-19 | 2008-05-06 | Nektar Therapeutics | Pulmonary delivery of aminoglycosides |
| US6878532B1 (en) | 2003-04-28 | 2005-04-12 | Sioux Biochemical, Inc. | Method of producing phosphatidylserine |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1900959A1 (de) * | 1969-01-09 | 1970-08-27 | Unilever Nv | Verfahren zur Herstellung von Pflanzenphosphatiden mit universeller Emulgierkraft |
| US4235792A (en) * | 1977-04-14 | 1980-11-25 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Immunological materials |
| SU831129A1 (ru) * | 1979-07-24 | 1981-05-23 | Дальневосточный Государственный Уни-Верситет | Способ получени фосфатидилглицерина |
| US4485045A (en) * | 1981-07-06 | 1984-11-27 | Research Corporation | Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes |
| US4587055A (en) * | 1982-05-26 | 1986-05-06 | Research Corporation | Polymerized vesicles and compounds for their preparation |
| US4783402A (en) * | 1983-04-11 | 1988-11-08 | Meito Sangyo Kabushiki Kaisha | Production of primary or secondary alcohol derivatives of phospholipids by the enzymatic technique |
| JPS62205788A (ja) * | 1986-03-05 | 1987-09-10 | Shoichi Shimizu | ホスフアチジルグリセロ−ル又はその誘導体の製造法 |
| WO1989001524A1 (en) * | 1987-08-14 | 1989-02-23 | Liposome Technology, Inc. | Method of preparing phosphatidylglycerol |
| US4997761A (en) * | 1987-10-06 | 1991-03-05 | Houston Biotechnology Incorporated | Phosphatidyl treatment of viral disease |
| DE69011739T2 (de) * | 1989-05-26 | 1995-01-19 | Kao Corp | Verfahren zur Herstellung von Phosphatidsäure. |
-
1991
- 1991-04-16 DE DE69123145T patent/DE69123145T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-16 DK DK96100985T patent/DK0727491T3/da active
- 1991-04-16 AU AU76995/91A patent/AU646458B2/en not_active Expired
- 1991-04-16 CA CA002080907A patent/CA2080907C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-16 ES ES96100985T patent/ES2132780T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-16 ES ES91908298T patent/ES2094811T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-16 HU HU9203258A patent/HU212928B/hu unknown
- 1991-04-16 JP JP50805391A patent/JP3169132B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-16 EP EP91908298A patent/EP0528834B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-16 WO PCT/US1991/002608 patent/WO1991016444A1/en active IP Right Grant
- 1991-04-16 EP EP96100985A patent/EP0727491B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-16 NZ NZ237845A patent/NZ237845A/xx unknown
- 1991-04-16 AT AT96100985T patent/ATE181747T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-16 IE IE126491A patent/IE911264A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-04-16 DE DE69131404T patent/DE69131404T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-16 AT AT91908298T patent/ATE145244T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-16 DK DK91908298.2T patent/DK0528834T3/da active
- 1991-04-17 PT PT97391A patent/PT97391B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-04-17 ZA ZA912877A patent/ZA912877B/xx unknown
-
1997
- 1997-01-23 GR GR970400109T patent/GR3022375T3/el unknown
-
1999
- 1999-08-23 GR GR990402138T patent/GR3031059T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69123145T2 (de) | 1997-06-12 |
| EP0727491B1 (en) | 1999-06-30 |
| IE911264A1 (en) | 1991-10-23 |
| DK0528834T3 (da) | 1997-04-07 |
| CA2080907A1 (en) | 1991-10-18 |
| AU646458B2 (en) | 1994-02-24 |
| PT97391B (pt) | 1999-04-30 |
| ES2094811T3 (es) | 1997-02-01 |
| DE69131404T2 (de) | 1999-11-25 |
| WO1991016444A1 (en) | 1991-10-31 |
| EP0528834A1 (en) | 1993-03-03 |
| EP0528834B1 (en) | 1996-11-13 |
| AU7699591A (en) | 1991-11-11 |
| DE69123145D1 (en) | 1996-12-19 |
| EP0727491A1 (en) | 1996-08-21 |
| ATE181747T1 (de) | 1999-07-15 |
| JP3169132B2 (ja) | 2001-05-21 |
| ES2132780T3 (es) | 1999-08-16 |
| CA2080907C (en) | 2001-08-14 |
| HU9203258D0 (en) | 1993-01-28 |
| GR3031059T3 (en) | 1999-12-31 |
| EP0528834A4 (en) | 1993-06-02 |
| JPH05509222A (ja) | 1993-12-22 |
| HUT63198A (en) | 1993-07-28 |
| GR3022375T3 (en) | 1997-04-30 |
| PT97391A (pt) | 1991-12-31 |
| DE69131404D1 (de) | 1999-08-05 |
| NZ237845A (en) | 1993-06-25 |
| ATE145244T1 (de) | 1996-11-15 |
| ZA912877B (en) | 1992-12-30 |
| DK0727491T3 (da) | 1999-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6596305B1 (en) | Method of controlling the size of liposomes | |
| US4673567A (en) | Process for preparing liposome composition | |
| EP0498471A2 (en) | Liposomes comprising a guanidino aminoglycoside | |
| EP0293465B1 (en) | Phospholipid composition | |
| JP2798302B2 (ja) | リポソームおよび脂質複合体組成物の調製 | |
| EP1241172B1 (en) | Polyalkylene oxide-modified phospholipid and production method thereof | |
| JPH02167218A (ja) | リポソーム調製用脂質粉末の製造法及びリポソームの製造法 | |
| US5188951A (en) | Enzymatic synthesis of soluble phosphatides from phospholipids | |
| HU212928B (en) | Enzymatic synthesis of soluble phosphatides from phospholipids | |
| KR960014869B1 (ko) | 서브미크론 크기의 리포좀 형태의 양쪽친화성 지질의 분산성 콜로이드계를 제조하는 방법 | |
| JP4540287B2 (ja) | ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法 | |
| WO1996009037A1 (en) | Method of producing a lyophilized liposome product | |
| CA2048471C (en) | Water-containing liposome system | |
| DE68915490T2 (de) | Platinkomplexe mit einzelnen Isomeren von Neoalkylsäuren. | |
| AU616040B2 (en) | Agents for inhibiting adsorption of proteins on the liposome surface | |
| AU641532B2 (en) | Liposome preparation and antibiotic | |
| CA2199018A1 (en) | Method of producing a lyophilized liposome product | |
| DD297164A5 (de) | Langkettige di(acyloxy)dialkylsilane, di(acyloxy)diarylsilane, di(acyloxy)dialkoxysilane und tetra(acyloxy)silane, verfahren zu ihrer herstellung, ihre verwendung zur herstellung von vesikeln, aus ihnen hergestellte vesikel (siosomen) und deren verwendung als traeger von wirkstoffen |