HU212928B - Enzymatic synthesis of soluble phosphatides from phospholipids - Google Patents

Enzymatic synthesis of soluble phosphatides from phospholipids Download PDF

Info

Publication number
HU212928B
HU212928B HU9203258A HU325892A HU212928B HU 212928 B HU212928 B HU 212928B HU 9203258 A HU9203258 A HU 9203258A HU 325892 A HU325892 A HU 325892A HU 212928 B HU212928 B HU 212928B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
salt
divalent
monovalent
sodium
calcium
Prior art date
Application number
HU9203258A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9203258D0 (en
HUT63198A (en
Inventor
Frank Marziani
Frank G Pilkiewicz
John A F Tino
Paul A Tremblay
Original Assignee
Liposome Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Liposome Co Inc filed Critical Liposome Co Inc
Publication of HU9203258D0 publication Critical patent/HU9203258D0/hu
Publication of HUT63198A publication Critical patent/HUT63198A/hu
Publication of HU212928B publication Critical patent/HU212928B/hu

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127Liposomes
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127Liposomes
    • A61K9/1271Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07FACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02Phosphorus compounds
    • C07F9/06Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09Esters of phosphoric acids
    • C07F9/10Phosphatides, e.g. lecithin
    • C07F9/106Adducts, complexes, salts of phosphatides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436Fatty acid esters
    • C12P7/6445Glycerides
    • C12P7/6481Phosphoglycerides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P9/00Preparation of organic compounds containing a metal or atom other than H, N, C, O, S or halogen

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Fodder In General (AREA)

Description

A találmány tárgya oldható foszfatidok javított szintézise, amelyben foszfolipidekből kiindulva foszfolipáz D enzim katalizátor alkalmazásával igen jó kitermeléssel és tisztasággal stabil oldható foszfatidokat állíthatunk elő.
A foszfatidok, mint például a foszfatidil-glicerin értékes anyagok, amelyek alkalmazhatók liposzómák és lipid-komplexek képzésére.
A foszfatidil-glicerineket és más foszfatidokat korábban úgy állították elő, hogy kalcium-acetátot, ecetsavat és valamely enzimet, például foszfolipáz D enzimet, valamint glicerint vagy más elsőrendű alkoholt tartalmazó vizes puffer oldatot elegyítettek valamely foszfatidil-lipiddel, mint például foszfatidil-kolinnal, amely utóbbit vízzel nem elegyedő szerves oldószerben oldották. Abból a célból, hogy az enzimet aktiválják megfelelő oldószert, mint például étert használtak vagy felületaktív anyagot adagoltak az elegyhez és így a vízben oldhatatlan elegyből és a vizes oldatból emulzió képződött.
Az enzim aktiválására leírták a dimetil-éter és a dietil-éter, valamint más éterek alkalmazását Redemann és munkatársai a WO 89/01 524 számú PCT-beli közrebocsátási iratban, azonban ezek a vegyületek veszélyesek, mivel gyúlékonyak, valamint peroxid képzésre hajlamosak, amely peroxid ezután a foszfolipidek autooxidációját elősegíti. Ezen túlmenően mivel az éterek sűrűsége a vízhez képest igen alacsony, a fázisok jó keverését csak úgy lehet megvalósítani, ha erős rázást alkalmaznak, amely kereskedelmi mennyiségű gyártás esetében nehezen megvalósítható.
Felületaktív anyagok is alkalmazhatók az enzim aktiválására, azonban ezeket ezután a kívánt terméktől nehéz elválasztani. Ilyen esetben drága oszlopkromatográfiás elválasztást kell alkalmazni, hogy a megfelelő tisztaságú foszfatidot nyerjük. Ezen túlmenően a viszonylag nagy mennyiségű víz jelenléte hidrolízist eredményez és foszfatidilsav keletkezik, amely csökkenti a kívánt foszfatid termék hozamát, illetve amelyet el kell választani a kívánt foszfatidtól.
Enzim alkalmazása esetén szükséges egy optimális pH határértéken belüli technológia alkalmazása, amely puffer oldatok felhasználását igényli. Az enzimes reakciónál az is lényeges, hogy a reakcióelegyben valamely kétvegyértékű kation, mint például kalciumion legyen jelen, amely a foszfatidot kalcium- vagy más kétvegyértékű kationos só formában eredményezi, amely só ezután az oldatból csapadékként kiválik, és nehezen vihető oldatba. Amennyiben megsavanyítást vagy ioncserélő gyantát és semlegesítést alkalmazunk a kalciumnak oldhatóbb egy vegyértékű sókká történő átalakításához, akkor a hidrolízis igen gyorsan végbemegy és ez együtt jár a bomlási termék csapadékként történő kiválásával, ahol a termék lehet lipofoszfatidil-glicerin vagy foszfatidilsav és ezek keletkezése a fent leírt problémákkal jár együtt.
Ismert, hogy a foszfatidok, mind például a foszfatidil-glicerin kitermelése megnövelhető, ha olyan eljárást alkalmazunk, amelyben a foszfatidil-lipid szerves oldószerben reagál foszfolipáz D enzimmel, amely enzim hidrofób csoportokat tartalmazó hordozóra van felvive. Az oldószer lehet dietil-éter vagy valamilyen alkán, amely oldja a foszfatidil-lipideket, mint például a foszfatidil-kolint. A reakció a szerves oldószer forráspontja alatti hőmérsékleten, mint például 15-35 'C közötti hőmérsékleten végezhető. Azonban ebben az esetben a kívánt foszfatid hozama alacsony, körülbelül 45%, továbbá az éter oldószerek alkalmazása ezek nagy gyúlékonysága és veszélyessége miatt hátrányos.
Foszfolipáz D enzim alkalmazásával végzett foszfatidil-glicerin szintézist ír le például az Applied Microbiology and Biotechnology 27, 146-151 (1987) és az Enzyme and Microbiol. Technology 9, 350-354 (1987) közlemény.
Vizsgálataink célja az volt, hogy kidolgozzunk egy eljárást a foszfatidok biztonságos és egyszerű előállítására javított hozammal célszerűen úgy, hogy a tennék vízoldható egyvegyértékű stabil só formájában legyen.
Korábban az átészterezési reakciót rendszerint kétfázisú rendszerben végezték, amely étert tartalmazott abból a célból, hogy a reakciót megfelelő sebességűvé aktiválja. Azonban ilyen típusú reakció során ritkán értek el kvantitatív kitermelést, mivel jelentős mennyiségű foszfatidinsav is keletkezett. Ezen túlmenően az éter és a vizes fázis közötti nagy sűrűségkülönbség miatt a nagy tömegben végzett reakció csak limitált hozamot eredményezett, mivel az elegy keverése nem volt megfelelő. Amennyiben felületaktív anyagokat is alkalmaztak, akkor a termék tisztítása okozott problémát.
Vizsgálataink során felismertük, hogy stabil oldható foszfatidil-sók állíthatók elő igen jó kitermeléssel, ha az eljárást az alábbiak szerint végezzük.
A találmány szerinti eljárás során foszfolipidet, mint például foszfatidil-kolint, reagáltatunk valamely elsőrendű alkohollal (1) foszfolipáz D enzim katalizátor, továbbá (2) egy nem éter-típusú oldószer, amely az enzimet nem bontja és nem denaturálja, valamint az étereknél kevésbé gyúlékony, és (3) egy pufferolt kétvegyértékű sóoldat, előnyösen kalciumsó oldat, amely a megfelelő foszfatidil-észtert mint kétvegyértékű sót képzi, jelenlétében. Az oldhatatlan kétvegyértékű sót valamely szerves oldószerben oldható, stabil egyvegyértékű kevert sóvá alakítjuk úgy, hogy a kétvegy értékű sót egy szerves oldószerben szuszpendáljuk és a megfelelő sztöchiometrikus mennyiségű szilárd egyvegyértékű sókat hozzáadjuk, amely párhuzamosan oldatba viszi a foszfatidot és csapadékként leválasztja a hozzáadott egyvegyértékű kationos sók anionjával képzett kalcium sót. Ezzel az eljárással a foszfatid egy vegyértékű kevert sóját állítjuk elő anélkül, hogy jelentős mennyiségű hidrolízis termék, mint például foszfatidilsav keletkezne.
Továbbá azt találtuk, hogy egy adott észter-só, a dimirisztoil-foszfatidil-glicerin ammónium/nátrium kevert só oldhatósága és stabilitása maximális értéket ér el, amennyiben az ammónium- és nátriumionok tömegaránya adott értékű és a kétvegyértékű jelenlevő anion mennyisége limitált. A dimirisztoil-foszfatidil-glicerin ammónium/nátrium-kevert sójának maximális stabili2
HU 212 928 Β tását és oldhatóságát szerves oldószerben úgy érhetjük el, hogy az ammóniumion tömeg%-át a kevert só tömegére vonatkoztatva körülbelül 2,0- körülbelül 2,6 tömeg% közötti értéken, illetve a nátriumion tömeg%-át a kevert só tömegére vonatkoztatva körülbelül 0,3 körülbelül 0,8 tömeg% közötti értéken tartjuk. A maximális kalcium-koncentráció a kevert sóra vonatkoztatva körülbelül 0,1, előnyösen körülbelül 0,05 tömeg%.
Ezen túlmenően az találtuk, hogy a foszfolipáz D enzim reakcióját a foszfatidil-kolinnal és glicerinnel vagy más alkohollal nagymértékben elősegíti a centrifugális megosztásos kromatográfia (CPC) alkalmazása.
Az 1. ábrán bemutatjuk a dimirisztoil-foszfatidilglicerin kevert só diklórmentánban való oldhatóságának és ammónium-ion tartalmának függvényét.
A találmány tárgya tehát kétlépéses eljárás egy foszfatidil-észter egy vegyértékű kevert sónak előállítására megfelelő foszfolipidből egy enzim-katalizátor és egy pufferoldat jelenlétében, oly módon, hogy
i) a megfelelő foszfolipidet reagáltatjuk valamely elsőrendű alkohollal egy vízzel nem elegyedő, nem éter-típusú oldószerben, foszfolipáz D enzim katalizátor és egy kétvegyértékű kationos pufferoldat jelenlétében, és ii) a kapott kétvegyértékű foszfatid sót valamely szerves oldószerben oldható, stabil, egyvegyértékű kevert sóvá alakítjuk úgy, hogy a szerves oldószerben szuszpendáljuk a megfelelő sztöchiometrikus mennyiségű egyvegyértékű sókkal együtt, amelyek anionja oldhatatlan csapadékot képez a kétvegyértékű kationnal.
A találmány tárgya továbbá eljárás dimirisztoilfoszfatidil-glicerin oldható ammónium/nátrium kevert sójának előállítására, dimirisztoil-foszfolipidből egy enzim katalizátor és egy pufferoldat jelenlétében, oly módon, hogy
i) a megfelelő dimirisztoil-foszfolipidet egy elsőrendű alkohollal reagáltatjuk valamely vízzel nem elegyedő, nem éter-típusú oldószerben, egy enzim katalizátor és egy kétvegyértékű kationos pufferoldat jelenlétében, majd ii) a kapott kétvegyértékű kationos sót egy szerves oldószerben oldható egyvegyértékű sóvá alakítjuk úgy, hogy a kétvegyértékű sót a szerves oldószerben sztöchiometrikus mennyiségű egyvegyértékű sóval együtt szuszpendáljuk, amely só anionja a kétvegyértékű kationnal csapadékot képez, és amely só kationja olyan tömegarányú ammóniumés nátrium-ion keveréke, hogy az egyvegyértékű dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert só körülbelül 2,0-2,6 tömeg% ammónium-iont és körülbelül 0,30,8 tömeg% nátrium-iont tartalmaz.
A találmány szerinti eljárással előállított anyagok javított oldhatóságuk és stabilitásuk révén különösen előnyösen alkalmazhatók liposzóma és lipid komplex készítményekben.
A liposzómák teljesen zárt lipid kétrétegű membránok, amelyek fázist foglalnak magukba. A liposzómák lehetnek egy lamellás, hólyagszerű készítmények (amelyek csak egyetlen kétrétegű membránt tartalmaznak) vagy lehetnek többlamellás hólyagok (amelyek hagymaszerű szerkezetűek és azzal jellemezhetők, hogy több membrán kettős réteget tartalmaznak, amely rétegeket egymástól vizes réteg választ el). A kettős réteg két lipid rétegből áll, amelyek hidrofób „farokrésszel” és hidrofil „fejrésszel” rendelkeznek. A membrán kettős réteg szerkezete olyan, hogy a hidrofób (nem poláris) „farok rész” a lipid monorétegekben a kettős réteg központja felé helyezkedik el, míg a hidrofil „fej rész” a vizes fázis irányában található.
Liposzómák, amelyek dimirisztoil-foszfatidil-kolint (DMPC), dimirisztoil-foszfatidil-glicerint (DMPG) és koleszterint és amfotericin B-t foglalnak magukba, alkalmazhatók a szervezetre kiterjedő gombás fertőzések kezelésére (Juliano és munkatársai, Annals Ν. Y. Acad, Sci., 1985, 446:390-402; Lopez-Berenstein és munkatársai, J. Infect. Dis., 1986, 151-704-710).
A WO 88/06 443 számú „Kis toxicitású hatóanyaglipid rendszerek” című PCT-beli közrebocsátási iratban Janoff és munkatársai leírtak eljárásokat magas hatóanyag/lipid tartalmú komplexek előállítására, amelyek hatóanyaghoz asszociált nem liposzóma formában lévő lipideket tartalmaznak, vagy HDLC anyagok és liposzómák előállítását, amely liposzómák megadott arányú DMPC és DMPG anyagot tartalmaznak. A foszfolipideket oldószerben oldották, amely lehet kloroform és diklórmetán.
A HDLC (magas hatóanyag:lipid komplex) anyagokat úgy állíthatjuk elő, hogy először egy hatóanyagot, különösen amennyiben a hatóanyag valamely polietilén gombaellenes antibiotikum, mint például amfotericin B, oldunk egy biokompatíbilis szerves oldószerben, mint például dimetil-szulfoxidban (DMSO) vagy metanolban, majd a kapott oldatot lipiddel vagy lipidekkel, mint például DMPC:DMPG 7:3 mólarányú eleggyel keverjük, amely utóbbit előzetesen egy oldószerben, mint például diklórmetánban oldottuk. Ezt követően az oldószereket vákuumban elpárologtatjuk és egy vékony lipid-hatóanyag filmet nyerünk. A filmet valamely vizes oldattal, mint például fiziológiás sóoldattal PBS vagy glicin puffer oldattal hidratáljuk, és így HDLC anyagot képzünk. Más eljárás szerint a vizes oldatot az oldószert tartalmazó hatóanyag és lipid fázishoz adagolhatjuk azelőtt, mielőtt az oldószert elpárologtatnánk. Ismét más eljárás szerint a kapott száraz lipid-hatóanyag filmet újra szuszpendálhatjuk valamely oldószerben, mint például diklórmetánban és az oldószert ismét elpárologtatjuk vákuumban a film hidratálása előtt. Egy dehidratálási eljárás is alkalmazható, amelynek során egy száraz lipid-hatóanyag filmet dehidratálunk, és így pikkelyszerű vagy pehelyszerű anyagot képzünk, amelyet ezt követően vizes oldattal hidratálunk. Más eljárás szerint a HDLC előállítható úgy, hogy MLV eljárással lipid részecskéket képezünk, amelyek a biológiailag aktív hatóanyagot tartalmazzák, majd ezeket a részecskéket melegítési ciklusba visszük körülbelül 25-60 °C hőmérsékleten.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazható foszfolipidek természetes és szintetikus lipidek lehetnek, amelyek egy vagy több foszfatidil-csoportot tartalmaz3
HU 212 928 Β nak. Ilyen anyagok például a foszfatidil-kolin, a foszfatidil-etanolamin, a foszfatidil-szerin, a foszfatidinsav, a dimirisztoil-foszfatidil-kolin és a foszfatidil-inozitol. A foszfatidil-kolin kereskedelemben kapható nagy tisztaságban, ennélfogva előnyösen alkalmazható anyag.
A leírásban megadott elsőrendű alkohol a glicerin, azonban más elsőrendű alkoholok, mint például szulfokolin, etilén-glikol, glicidol, ribóz, etanolamin, glicerin-formai és hasonlók is alkalmazhatók. Az egyszerű elsőrendű alkoholok, mint például a metanol, az etanol, a propanol és hasonlók célszerűen elkerülendők, mivel igen gyors reakcióba lépnek és a megfelelő alkil-észter vegyületet képzik.
Az alkalmazható kétvegyértékű kationos pufferek pH-értéke körülbelül 5,7 és kétvegyértékű kationt, mint például kalcium-iont tartalmaznak. A kation az enzimmel nem léphet reakcióba. Alkalmas puffer lehet például a kalcium-hidroxid, kalcium-klorid vagy kalcium-acetát ecetsavval vagy nátrium-acetáttal képzett oldata.
A nem gyúlékony vagy igen kis gyúlékonyságú vízzel nem elegyedő oldószer, amelyet a találmány szerinti eljárásban alkalmazhatunk olyan, hogy a dietiléternél vagy a dimetil-éternél kevésbé gyúlékony legyen, lobbanáspontja 0 °C érték feletti legyen, előnyösen 20 °C feletti legyen és az oldószer nem bonthatja vagy denaturálhatja az enzimet illetve csökkentheti ennek aktivitását; a dietil-éter ilyen hatásával összehasonlítva a károsítás mértéke legfeljebb a dietil-éter által kifejtett károsításnál körülbelül 25%-kal kisebb lehet. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható oldószerek például a halogénezett oldószerek, mint például a diklórmetán, a kloroform, a tetraklór etilén, a triklórfluor-metán és hasonlók. Alifás vagy aromás észterek, alkánok, ketonok vagy észterek, amelyeknek molekulatömege körülbelül 5000 alatti, ugyancsak alkalmazhatók. így például alkalmazható etil-acetát, etil-propionát, etil-butirát, metil-acetát, metil-propionát, 3-pentanon, 3-heptanon, 2-oktanon, 2-butanon, 2-pentanon,
2-heptanon, 3-oktanon és 4-heptanon, valamint hasonló oldószerek.
A fenti leírt reaktánsokat elegyítjük például keveréssel vagy rázatással, és így a kiindulási foszfatidilésztert, mint például foszfatidil-kolint, a kívánt termék kétvegyértékű kationos sójává, például foszfatidil-glicerin kalcium-sóvá alakítjuk.
Általában kis energiájú elegyítés, mint például keverés vagy örvénylés, elegendő ahhoz, hogy legalább körülbelül 80%-os hozammal nyerjük a kívánt kétvegyértékű kationos sót. Centrifugális megosztási kromatográfia (CPC), [Cazes, J. „Nagy teljesítőképességű CPC biológiai anyagok folyásirányú feldolgozására”, American Biological Laboratories, 1989. június 17-23], alkalmazható az enzim által kifejtett átészterezési reakció elősegítésére, amely a foszfolipid és az alkohol között zajlik. Egy stacionárius vizes fázist, amely alkalmas körülbelül 5,6 pH értékű puffért, mint például nátrium-acetátot tartalmaz, továbbá kalciumkloridot, egy alkalmas alkoholt és az enzimet bemérjük a centrifugába. A centrifugát működésbe hozzuk, majd a mozgó fázist, amely egy szerves nem alkohol jellegű oldószer, mint például etil-acetát vagy etil-butirát. és a foszfolipidet tartalmazza, a CPC rendszerbe adagoljuk. A telített foszfatidil-glicerin, mint például DMPG kalcium sója, az eluensből csapadékként kiválik. A nem reagált oldható foszfatidil-kolint ezután recirkuláltatjuk, hogy a termelést növeljük. A foszfatidil-glicerint ezután tovább tisztíthatjuk. A szakember előtt nyilvánvaló az ilyen célra alkalmazott eljárás.
A reakció hőmérséklete általában körülbelül 1550 °C, előnyösen körülbelül 20-37 °C és legelőnyösebben körülbelül 20-30 °C közötti.
A csapadékként kivált kétvegyértékű kationos sót könnyen elválaszthatjuk az enzimtől és más reakcióban keletkezett mellékterméktől szűrés segítségével, a csapadékot vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, mint például etil-acetáttal, ezt követően diklórmetánnal mossuk a további tisztítás érdekében.
A kétvegyértékű kationos sót ezután valamely szerves oldószerfázis, mint például metilalkohol és kloroform jelenlétében oldható, stabil egyvegyértékű kevert sóvá alakítjuk úgy, hogy szuszpenzióban reagáltatjuk körülbelül sztöchiometrikus mennyiségű megfelelő egyvegyértékű sókkal, amely sók anionja csapadékot képez a kétvegyértékű kationnal. Előnyösen alkalmazható egyvegyértékű kationok az ammóniumion, a nátriumion és a káliumion, amelyeket karbonát, citrát. fluorid, szulfát, foszfát, nitrát, laktat, szukcinát, formiát, oxalát, klorid, etilén-diamin-tetraacetát, etilénbisz(oxi-etilén-nitrilo)-tetraacetát és hasonló formában alkalmazhatunk, mivel ezek vízben jól oldódnak. A foszfatidil egyvegyértékű sók oldatban maradnak és a kétvegyértékű só csapadékként kiválik, ennélfogva szűréssel vagy más eljárással könnyen eltávolítható, így elérhető legalább 25% és általában 35%-os vagy ennél magasabb konverzió is. Mivel az ammóniumsókban található ammónia illékony, amely sók alkalmazása egyébként magas oldhatóságuk miatt előnyös lehet, célszerűen kevert ammónium/nátrium sót képezünk, mivel ez jó oldhatóságú és jó stabilitású is. Az ammóniunrnátrium ion közötti előnyös moláris ionarány körülbelül 1:1 - körülbelül 8:1 közötti. Különösen előnyös ammónium :nátrium ion arány a 4:1 mólarány.
A dimirisztoil-foszfatidil-glicerin ammónium-sója elég jól oldódik szerves oldószerekben, mint például diklórmetánban. A dimirisztoil-foszfatidil-glicerin ammónium sójának oldhatósága diklórmetánban nagy obb mint körülbelül 26 mg/ml. Azonban ez a só nem túl stabil. A nátriumsó stabilabb de sokkal kevésbé oldható, például a dimirisztoil-foszfatidin-glicerin nátrium sójának oldhatósága diklórmetánban kisebb mint körülbelül 0,2 mg/ml. A nátrium-só és az ammónium-só adott aránya stabilizálja a kevert sót anélkül, hogy az oldhatóságot a megfelelő mérték alá csökkentené, amennyiben az alkalmazott nátrium-só mennyiségét szabályozzuk. Körülbelül 0,3 tömeg% nátrium kationmennyiség stabilitást biztosít, azonban a maximális, körülbelül 0,8 tömeg% nátrium mennyiség alkalmazása felett a kevert só oldhatósága diklórmetánban csökken.
HU 212 928 Β
A maradék kalciumion-mennyiség körülbelül 0,1 tömeg%, előnyösen körülbelül 0,05 tömeg% alatti legyen a kevert sóban. A kalciumsó oldhatatlan és a túlzott kalciumion-mennyiség jelenléte a kevert só oldhatóságát csökkenti a viszonylag nem poláros szerves oldószerekben.
Megjegyzendő azonban, hogy a dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert ammónium/nátrium sója tartalmazhat több mint körülbelül 0,1 tömeg% vagy körülbelül 0,05 tömeg% kalcium-iont és a nátrium-ion tartalom nagyobb lehet mint körülbelül 0,8 tömeg%, ennek ellenére a só oldhatósága jelentősen megnövekszik, amennyiben az ammónium-ion tartalom 2,0 tömeg% felett van, és igen magas a só oldhatósága amennyiben az ammónium-ion tartalom körülbelül 2,25-2,35 tömeg% (lásd az 1. ábrát és a II. táblázatot).
Általában amennyiben a kalcium-ion tartalom körülbelül 0,05 tömeg% feletti vagy amennyiben az ammónium-ion tartalom körülbelül 2,0 tömeg% alatti, az oldhatatlan dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert ammónium/nátrium-só mennyisége diklórmetánban növekszik (lásd a III. táblázatot).
Ennélfogva a találmány szerinti eljárásban a dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kalcium-sójának csapadékként történő leválasztása, mosása és leszűrése után ammónium-karbonátot és nátrium-karbonátot adagolunk hozzá olyan mennyiségben, hogy a kalcium aniont szilárd kalciumsóvá, például karbonáttá alakítsuk. Előnyösen az egyvegyértékű karbonátokat nem feleslegben adagoljuk, hanem csak sztöchiometrikus mennyiségben, amely ahhoz szükséges, hogy a kalcium anion kalcium-karbonát sóként kicsapódjon. A dimirisztoil-foszfatidil-glicerin ammónium/nátrium kevert sóját elválasztjuk az oldhatatlan kalcium sótól, majd kívánt esetben tovább tisztíthatjuk.
Amennyiben további tisztítás szükséges, erre a célra kromatográfiás eljárást alkalmazhatunk, amelyben ammóniával kezelt szilikagél oszlopot használunk, eluensként pedig metanol/kloroform oldószerelegyet alkalmazunk.
A találmány szerinti eljárást detergensek vagy más felületaktív anyagok jelenléte nélkül végezzük, amely anyagokat egyébként később el kellene távolítani. Az eljárás alkalmazásával nagy tisztaságú terméket nyerünk igen jó kitermeléssel a foszfatidilsav vagy más melléktermékek párhuzamos keletkezése nélkül, amely anyagok a kívánt foszfát-észter-sók hozamát csökkentenék, illetve további tisztítást tennének szükségessé.
A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk. A példák illusztratív jellegűek és nem jelentik a találmány tárgykörének korlátozását. Valamennyi reakciót körülbelül 23 °C hőmérsékleten hajtottuk végre.
1. példa ml 5,6 pH értékű nátrium-acetát puffer, 1 ml víz, 0,2 ml 1M kalcium-klorid és 0,2 ml glicerin elegyében 200 mg foszfatidil-kolint emulgeálunk.
A kapott emulzióhoz 1 mg foszfolipáz D enzim, 1 ml nátrium-acetátban és 1 ml vízben készült oldatát adagoljuk. Ezután az elegyhez 2 ml diklórmetánt adunk, majd 17 órán át keverjük.
A csapadékként kivált foszfatidil-glicerint leszűrjük, 10 ml diklórmetánnal mossuk, majd a kalcium-sót kinyerjük. A hozam 74%.
140 mg fent nyert kalcium-sót szuszpendálunk 6 ml etanol és 3 ml hexán elegyében. Ezután a szuszpenzióhoz sztöchiometrikus mennyiségű 1:4 mólarányú nátrium-karbonát/ammónium-karbonát elegyet adunk, majd a keveréket elegyítjük.
A kivált kalcium-karbonátot leszűrjük.
120 mg (78% termelés) foszfatidil-glicerin nátrium/ammónium sót nyerünk.
2. példa literes tartályban, amely 500 ml vizet és 500 ml
5,6 pH értékű 0,5 n nátrium-acetát puffért tartalmaz, bemérünk 100 g dimirisztoil-foszfatidil-kolint, majd az elegyhez 100 ml 1M kalcium-klorid oldatot és 100 mg foszfolipáz D-nek 50 ml puffer és 50 ml víz elegyében készült oldatát adagoljuk. A keverékhez 1 liter etil-butirátot adunk, majd a tartályt lezárjuk és 17 órán át rázatjuk.
A csapadékként kivált kalcium-dimirisztoil-foszfatidil-glicerint leszűijük. A terméket Büchner-tölcséren szűrjük, majd 5 liter etilacetáttal és végül 1 liter diklórmetánnal mossuk.
A szűrőlepényt 1052 ml metanol, 526 ml kloroform és 420 ml víz elegyében szuszpendáljuk.
A szuszpenzióhoz 526 ml 1:1 térfogatarányú 2n ammóniumkarbonát és 0,5 n nátrium-karbonát elegyet adunk. A keveréket gyorsan leszűrjük, majd a szűrlethez 526 ml kloroformot adagolunk. A kloroformot körülbelül 200 ml térfogatra bepároljuk, majd az elegyhez 5 liter hideg acetont adunk.
Az elegyet Büchner-tölcséren leszűrjük és a kapott DMPG anyagot hideg acetonnal mossuk.
g (95% termelés) nátrium/ammónium-dimirisztoil-foszfatidil-glicerint nyerünk.
A kapott terméket tovább tisztítjuk úgy, hogy 20% metanol tartalmú kloroformban oldjuk, majd 25 mm-es szilikagél oszlopra visszük és oldószereleggyel, amely 80% kloroform/20% metanol/1% ammónium-hidroxid, eluáljuk.
A dimirisztoil-foszfatidil-glicerin terméket tartalmazó frakciókat elválasztjuk és szárazra pároljuk.
99%-os tisztaságú dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert ammónium/nátrium sót nyerünk.
3. példa
200 g (0,29 mmól) dimirisztoil-foszfatidil-kolint mérünk 5 literes háromnyakú banán keverővei ellátott lombikba, majd 1 liter 5,6 pH értékű 0,5 n nátrium-acetát puffért, 1 liter vizet, 200 ml glicerint és 200 ml 1M kalcium-kloridot adagolunk hozzá. A pH értékét 5,5 értékre állítjuk be.
Az elegyhez 80 mg foszfolipáz D-nek, 5 ml nátrium-acetát puffer és 5 ml víz elegyében képzett oldatát adagoljuk, végül 1 liter diklórmetánt adagolunk. Az elegyet ezt követően 17 órán át keverjük.
HU 212 928 Β
A reakcióelegyet Büchner-tölcséren leszűrjük és a szűrőlepényt 5 liter vízzel és 5 liter diklórmetánnal mossuk.
166 g (0,24 mól) kalcium-dimirisztoil-foszfatidilglicerint nyerünk, termelés 82%. A termék vékonyréteg-kromatográfiás analízis szerint 95%-os tisztaságú.
4. példa
Egy mintacső sorozatot megtöltünk szuszpenzióval úgy, hogy az egyes csövekbe az alábbi alkotóelemek kerülnek: 200 ml dimirisztol-foszfatidil-kolin; 2 ml
5,6 pH értékű 0,25 M nátrium-acetát puffer; 200 ml 1 M kalcium-klorid: 200 ml glicerin és 5 mg foszfolipáz D 2 ml 0,25 M nátrium-acetát pufferben készült oldata, amely pH 5,6 értékkel rendelkezik.
Az egyes csövekhez 2,5 ml különféle oldószert adagolunk (lásd az I. táblázatot). A csöveket lezáijuk és 25 °C hőmérsékleten rázógépre helyezzük. A rázógép 250 ford/perc értékre beállított és 17 órán át végezzük a rázatást. Ezután a rázógépet leállítjuk és valamennyi cső tartalmát megvizsgáljuk, majd a tartalmukat 3x5 ml kloroformmal és ezt követően 5 ml acetonnal mossuk, majd vákuumban konstans tömegig szárítjuk. Minden egyes cső mintáját analizáljuk vékonyrétegkromatográfiás analízis segítségével szilikagélen. Az analízisben kloroform:metanol:ammónia 65:35:5 térfogatarányú eluenst alkalmazunk. Az eredményeket az alábbi I. táblázatban adjuk meg.
/. táblázat
Oldószer Az oldhatatlan termék hozama (mg**)
etil-acetát 183
etil-propionát 205*
etil-butirát 254*
2-butanon 78
2-pen tanon 78
2-heptanon 162
2-oktanon 166
butil-acetát 126
3-pen tanon 150
3-heptanon 116
3-oktanon 9
4-heptanon 175
széntetraklorid 5
kloroform 46
diklór-metán 185
éter 190
* A magas értékek valószínűleg a nem homogén liposzóma szuszpenzió következtében lépnek fel.
** A vékonyréteg-kromatográfiás analízis azt mutatja, hogy a foszfatidil-kolin foszfatidil-glicerin-kalcium-sóvá alakult és a nem-ceagált foszfatidil-kolin a mosással eltávozott.
5-10. példák
Különféle dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert ammónium/nátrium sók diklór-metánban való oldhatósága.
Minden egyes kevert sóból 1,6 mg mennyiséget elegyítünk és az oldatot 35 °C hőmérsékletre melegítjük keverés közben 1 és 2 óra időtartamon át. Ezután az elegyet leszűrjük, 0,2 gm 25 mm átmérőjű fecskendőszűrőn (Gelman Acrodisc CR) és meghatározzuk az oldhatóság%-ot. Az eredményeket az alábbi, II. táblázatban adjuk meg.
II. táblázat
Példa %nh4 + %NA+ %Ca2+ Oldhatóság %
1 óra 2 óra
5 2,28 0,34 0,19 94 98
6 1,64 1,11 0,06 62 64
7 1,59 1,08 0,09 60 65
8 1,97 0,75 0,05 76 83
9 2,32 0,55 0,33 - 92
10 2,11 0,51 0,26 - 79
Az 1. ábrán bemutatjuk az ammóniumion-tartalom függvényében a diklórmetánban való oldhatóság változásának görbéjét. A diagram azt mutatja, hogy még abban az esetben is, amennyiben a kalcium-tartalom körülbelül 0,05 tömeg% feletti és a nátrium-tartalom körülbelül 0,8 tömeg% feletti, az oldhatóság jelentősen növekszik, amennyiben az ammóniumion tartalom körülbelül 2,0 tömeg% feletti és az oldhatóság igen nagy, amennyiben az ammóniumion tartalom körülbelül 2,25-2,35 tömeg%.
11. példa
0,2 M nátrium-acetát puffért, amelynek pH értéke 5,6, elegyítünk 0,3 M kalcium-kloriddal, 0,3 M glicerinnel és foszfolipáz D enzimmel és centrifugális megosztási kromatografáló (CPC) rendszerbe helyezzük. A centrifugát mozgásba hozzuk és 0-20% mennyiségű foszfatidil-kolint tartalmazó etilacetátot vagy etil-butirátot szivattyúzunk a CPC rendszerbe. Az eluensből a PG-kalcium-só csapadékként kiválik és tovább tisztítható. A nem reagált oldható foszfatidil-kolin recirkuláltatható.
1—4. összehasonlító példák
Különféle dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert ammónium/nátrium-sók diklórmetánban való oldhatósága.
1,6 mg kevert sót elegyítünk minden egyes sótípusból 4,5 mg dimirisztoil-foszfatidil-kolinnal és 35 °C hőmérsékleten keveijük 1 órán át az elegyet. Az anyagot ezután 0,2 μηι méretű 25 mm átmérőjű fecskendő szűrőn (Gelman Acrodisc CR) bocsátjuk keresztül és az oldhatatlan anyag%-át számítjuk. Az eredményeket az alábbi III. táblázatban adjuk meg.
HU 212 928 Β
III. táblázat
Példa Tömeg% Oldható anyag% Oldha- tatlan anyag%
Na+ nh4 + Ca2+
Cl 0,38 2,26 0,2 95 5
C2 0,51 2,11 0,26 89 11
C3 1,11 1,64 0,06 91 9
C4 0,75 1,97 0,05 95 5
5. összehasonlító példa
1,6 mg/ml töménységű dimirisztoil-foszfatidil-glicerin ammónium/nátrium kevert sót, amelynek nátrium-tartalma 1,20 tömeg%, ammónium-tartalma 1,53 tömeg% és kalcium-tartalma 0,12 tömeg% elegyítünk 4,5 mg/ml töménységű diklórmetános dimirisztoil-foszfatidil-kolinnal, majd az elegyet keverés közben 35 °C hőmérsékletre melegítjük. Az elegy 1 óra után is zavaros, ami azt jelenti, hogy a kevert só nem teljesen oldódott.

Claims (17)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás foszfatidil-észter valamely oldható, egyvegyértékű kevert sóinak előállítására foszfolipidből egy enzim-katalizátor és egy pufferoldat jelenlétében, azzal jellemezve, hogy
    i) a megfelelő foszfolipidet reagáltatjuk valamely elsőrendű alkohollal egy vízzel nemelegyedő, nem éter-típusú oldószerben, foszfolipáz D enzim katalizátor és egy kétvegyértékű kationos pufferoldat jelenlétében, és ii) a kapott kétvegyértékű foszfatid sót valamely szerves oldószerben oldható, stabil, egyvegyértékű kevert sóvá alakítjuk úgy, hogy a szerves oldószerben szuszpendáljuk a · megfelelő sztöchiometrikus mennyiségű egyvegyértékű sókkal együtt, amelyek anionja oldhatatlan csapadékot képez a kétvegyértékű kationnal.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy foszfolipidként foszfatidil-kolint alkalmazunk.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy foszfolipidként dimirisztoil-foszfatidil-kolint alkalmazunk.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkoholként glicerint, szulfokolint, etilén-glikolt, glicidolt, ribózt, etanolamint vagy glicerin-formait alkalmazunk.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkoholként glicerint alkalmazunk.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan pufferoldatot alkalmazunk, amely kalciumsót tartalmaz.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vízzel nem elegyedő oldószerként egy halogénezett alkánt vagy álként, így diklórmetánt, kloroformot, tetraklór-etilént vagy triklór-fluor-metánt alkalmazunk.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vízzel nem elegyedő oldószerként valamely alifás vagy aromás észtert, alkánt vagy ketont alkalmazunk.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vízzel nem elegyedő oldószerként etil-acetátot, etil-propionátot, etil-butirátot, metil-acetátot, metilpropionátot, 2-butanont, 2-pentanont, 2-heptanont, 2oktanont, 3-pentanont, 3-heptanont, 3-oktanont vagy
    4-heptanont alkalmazunk.
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan egyvegyértékű sót alkalmazunk, melyben az egyvegyértékű kation ammónium-ion, nátriumion vagy kálium-ion.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sót alkalmazunk, amelynek anionja citrát, szulfát, foszfát, nitrát, laktát, szukcinát, formiát, oxalát, etilén-tetraacetát, etilén-bisz(oxi-etilén-nitrilo)tetraacetát vagy klorid.
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i) lépést centrifugális megosztási kromatográfia alkalmazásával végezzük.
  13. 13. Eljárás dimirisztoil-foszfatidil-glicerin oldható ammónium/nátrium-kevert sójának előállítására, dimirisztoil-foszfolipidből egy enzim katalizátor és egy pufferoldat jelenlétében, azzal jellemezve, hogy
    i) a megfelelő dimirisztoil-foszfolipidet egy elsőrendű alkohollal reagáltatjuk valamely vízzel nem elegyedő, nem éter-típusú oldószerben, foszfplipáz D enzim katalizátor és egy kétvegyértékű kationos pufferoldat jelenlétében, és ii) a kapott kétvegyértékű kationos sót egy szerves oldószerben oldható egyvegyértékű sóvá alakítjuk úgy, hogy a kétvegyértékű sót a szerves oldószerben egy sztöchiometrikus mennyiségű egyvegyértékű sóval együtt szuszpendáljuk, amely só anionja a kétvegyértékű kationnal csapadékot képez, és amely só kationja olyan tömegarányú ammóniumés nátrium-ion keverék, hogy az egyvegyértékű dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert só mintegy 2,0-2,6 tömeg% ammónium-iont és mintegy 0,30,8 tömeg% nátrium-iont tartalmaz.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kétvegyértékű kationként kalcium-iont alkalmazunk.
  15. 15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan egyvegyértékű dimirisztoil-foszfatidilglicerin kevert sót állítunk elő, amely legfeljebb 0,1 tömeg% kalciumot tartalmaz.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egyvegyértékű dimirisztoil-foszfatidil-glicerin kevert só legfeljebb 0,05 tömeg% kalciumot tartalmaz.
  17. 17. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i) reakciólépést centrifugális megosztásos kromatográfia alkalmazásával hajtjuk végre.
HU9203258A 1990-04-17 1991-04-16 Enzymatic synthesis of soluble phosphatides from phospholipids HU212928B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51328590A 1990-04-17 1990-04-17

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9203258D0 HU9203258D0 (en) 1993-01-28
HUT63198A HUT63198A (en) 1993-07-28
HU212928B true HU212928B (en) 1996-12-30

Family

ID=24042616

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9203258A HU212928B (en) 1990-04-17 1991-04-16 Enzymatic synthesis of soluble phosphatides from phospholipids

Country Status (15)

Country Link
EP (2) EP0528834B1 (hu)
JP (1) JP3169132B2 (hu)
AT (2) ATE181747T1 (hu)
AU (1) AU646458B2 (hu)
CA (1) CA2080907C (hu)
DE (2) DE69123145T2 (hu)
DK (2) DK0727491T3 (hu)
ES (2) ES2132780T3 (hu)
GR (2) GR3022375T3 (hu)
HU (1) HU212928B (hu)
IE (1) IE911264A1 (hu)
NZ (1) NZ237845A (hu)
PT (1) PT97391B (hu)
WO (1) WO1991016444A1 (hu)
ZA (1) ZA912877B (hu)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060165606A1 (en) 1997-09-29 2006-07-27 Nektar Therapeutics Pulmonary delivery particles comprising water insoluble or crystalline active agents
US7871598B1 (en) 2000-05-10 2011-01-18 Novartis Ag Stable metal ion-lipid powdered pharmaceutical compositions for drug delivery and methods of use
DE10142014B4 (de) * 2001-08-28 2004-11-11 Degussa Bioactives Deutschland Gmbh & Co. Kg Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin
US7368102B2 (en) 2001-12-19 2008-05-06 Nektar Therapeutics Pulmonary delivery of aminoglycosides
US6878532B1 (en) 2003-04-28 2005-04-12 Sioux Biochemical, Inc. Method of producing phosphatidylserine

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1900959A1 (de) * 1969-01-09 1970-08-27 Unilever Nv Verfahren zur Herstellung von Pflanzenphosphatiden mit universeller Emulgierkraft
US4235792A (en) * 1977-04-14 1980-11-25 The Governing Council Of The University Of Toronto Immunological materials
SU831129A1 (ru) * 1979-07-24 1981-05-23 Дальневосточный Государственный Уни-Верситет Способ получени фосфатидилглицерина
US4485045A (en) * 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4587055A (en) * 1982-05-26 1986-05-06 Research Corporation Polymerized vesicles and compounds for their preparation
US4783402A (en) * 1983-04-11 1988-11-08 Meito Sangyo Kabushiki Kaisha Production of primary or secondary alcohol derivatives of phospholipids by the enzymatic technique
JPS62205788A (ja) * 1986-03-05 1987-09-10 Shoichi Shimizu ホスフアチジルグリセロ−ル又はその誘導体の製造法
WO1989001524A1 (en) * 1987-08-14 1989-02-23 Liposome Technology, Inc. Method of preparing phosphatidylglycerol
US4997761A (en) * 1987-10-06 1991-03-05 Houston Biotechnology Incorporated Phosphatidyl treatment of viral disease
DE69011739T2 (de) * 1989-05-26 1995-01-19 Kao Corp Verfahren zur Herstellung von Phosphatidsäure.

Also Published As

Publication number Publication date
DE69123145T2 (de) 1997-06-12
EP0727491B1 (en) 1999-06-30
IE911264A1 (en) 1991-10-23
DK0528834T3 (da) 1997-04-07
CA2080907A1 (en) 1991-10-18
AU646458B2 (en) 1994-02-24
PT97391B (pt) 1999-04-30
ES2094811T3 (es) 1997-02-01
DE69131404T2 (de) 1999-11-25
WO1991016444A1 (en) 1991-10-31
EP0528834A1 (en) 1993-03-03
EP0528834B1 (en) 1996-11-13
AU7699591A (en) 1991-11-11
DE69123145D1 (en) 1996-12-19
EP0727491A1 (en) 1996-08-21
ATE181747T1 (de) 1999-07-15
JP3169132B2 (ja) 2001-05-21
ES2132780T3 (es) 1999-08-16
CA2080907C (en) 2001-08-14
HU9203258D0 (en) 1993-01-28
GR3031059T3 (en) 1999-12-31
EP0528834A4 (en) 1993-06-02
JPH05509222A (ja) 1993-12-22
HUT63198A (en) 1993-07-28
GR3022375T3 (en) 1997-04-30
PT97391A (pt) 1991-12-31
DE69131404D1 (de) 1999-08-05
NZ237845A (en) 1993-06-25
ATE145244T1 (de) 1996-11-15
ZA912877B (en) 1992-12-30
DK0727491T3 (da) 1999-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6596305B1 (en) Method of controlling the size of liposomes
US4673567A (en) Process for preparing liposome composition
EP0498471A2 (en) Liposomes comprising a guanidino aminoglycoside
EP0293465B1 (en) Phospholipid composition
JP2798302B2 (ja) リポソームおよび脂質複合体組成物の調製
EP1241172B1 (en) Polyalkylene oxide-modified phospholipid and production method thereof
JPH02167218A (ja) リポソーム調製用脂質粉末の製造法及びリポソームの製造法
US5188951A (en) Enzymatic synthesis of soluble phosphatides from phospholipids
HU212928B (en) Enzymatic synthesis of soluble phosphatides from phospholipids
KR960014869B1 (ko) 서브미크론 크기의 리포좀 형태의 양쪽친화성 지질의 분산성 콜로이드계를 제조하는 방법
JP4540287B2 (ja) ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質の製造方法
WO1996009037A1 (en) Method of producing a lyophilized liposome product
CA2048471C (en) Water-containing liposome system
DE68915490T2 (de) Platinkomplexe mit einzelnen Isomeren von Neoalkylsäuren.
AU616040B2 (en) Agents for inhibiting adsorption of proteins on the liposome surface
AU641532B2 (en) Liposome preparation and antibiotic
CA2199018A1 (en) Method of producing a lyophilized liposome product
DD297164A5 (de) Langkettige di(acyloxy)dialkylsilane, di(acyloxy)diarylsilane, di(acyloxy)dialkoxysilane und tetra(acyloxy)silane, verfahren zu ihrer herstellung, ihre verwendung zur herstellung von vesikeln, aus ihnen hergestellte vesikel (siosomen) und deren verwendung als traeger von wirkstoffen