PT97391B - Processo para a preparacao de fosfatidos soluveis a partir de fosfatidos por sintese enzimatica - Google Patents

Processo para a preparacao de fosfatidos soluveis a partir de fosfatidos por sintese enzimatica Download PDF

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Description

THE LIPOSOME COMPANY, INC., pretende obter privilégio de invenção em Portugal.
Este pedido é uma continuation-in-part do Pedido de Patente dos E.U.A. com o na. de série 513.285, ainda pendente, depositado em 17 de Abril de 1990.
O presente invento refere-se a um processo para a realização de uma síntese aperfeiçoada de fosfátidos solúveis provenientes de fosfolípidos, utilizando a enzima fosfolipase D como catalisador, através do qual se obtêm elevados rendimentos de fosfátidos solúveis de grande pureza.
Os fosfátidos, como por exemplo, o fosfatidilo glicerol são produtos úteis e valiosos para preparar complexos de lípidos e de liposomas.
Até à data têm-se preparado fosfatidilo gliceróis e outros fosfátidos através da mistura de uma solução aquosa tampão contendo acetato de cálcio, ácido acético e uma enzima a fosfolipase D e glicerol ou outro álcool primário com um
D-470 —2 — lípido fosfatidilo, tal como fosfatidilo colina dissolvida num solvente orgânico imiscivel em água. Para activar a enzima, tanto pode ter sido usado um solvente tal como o éter, como pode ter-se adicionado um agente tensio-activo para emulsionar as misturas de soluções aquosas e insolúveis em água.
éter dimetílico, o éter dietílico e outros éteres, tal como descritos por Redemann, no Pedido PCT N2. WO 89/01524, publicado em 23 de Fevereiro de 1989, têm sido utilizados para activar a enzima, mas é sabido que se trata de produtos perigosos, em virtude de serem inflamáveis e das suas propriedades de formação de peróxido que promovem a auto-oxidação dos fosfátidos. Além disso, em virtude da muito baixa densidade dos éteres quando comparados com a água, uma boa mistura da mistura de fases, requer uma oscilação vigorosa que pode ser difícil de aumentar proporcionalmente em quantidades comerciais.
Os agentes tensio-activos também são úteis para activar a enzima, mas são difíceis de remover do produto desejado. Deste modo são necessárias elaboradas e dispendiosas separações por cromatografia de coluna, para se obter um fosfátido de pureza útil. Além disso, a presença de água em quantidades relativamente grandes resulta em hidrólise e na concomitante produção de ácido fosfatidílico, o que reduz o rendimento do desejado produto fosfátido e que também tem de
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ser separado do fosfátido desejado.
Além disso, a enzima requer uma gama óptima de pH, sendo necessária a utilização de soluções tampão. A enzima requer também um catião bivalente, tal como o ião de cálcio na mistura de reacção que produz o fosfátido, como por exemplo, o cálcio ou outro sal catiónico bivalente, que precipita fora da solução e, portanto, é difícil de solubilizar. Se se utilizar acidificação ou neutralização e resina de permuta de ião para converter os sais de cálcio nos seus sais monovalentes mais solúveis, desenrola-se uma rápida hidrólise com a concomitante precipitação de produtos de decomposição, tais como lisofosfatidilo glicerol ou ácido fosfatidílico, com os problemas acima enumerados.
Numa tentativa para mellhorar os rendimentos dos fosfátidos, como por exemplo, o fosfatidilo glicerol, foi descoberto um processo através do qual um fosfatidilo lípido é feito reagir num solvente orgânico com a fosfolipase D num veículo que possui grupos hidrofóbicos. 0 solvente pode ser éter dietílico ou um alcano que pode dissolver fosfatidilos lípidos, como por exemplo, a fosfatidilo colina. A reacção é efectuada a uma temperatura inferior à do ponto de ebulição do solvente orgânico, como seja de 15 a 35aC. No entanto, os rendimentos dos fosfátidos desejados são baixos, na ordem dos 45%, e o uso de solventes éter não é conveniente por causa dos seus solventes perigosos e altamente inflamáveis. Por
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-4estas razões tem-se procurado um processo para produzir fosfátidos de um modo seguro e simples, com um rendimento melhorado e na forma de um sal estável, monovalente e solúvel em água.
Anteriormente esta reacção de transesterificação foi efectuada num sistema de duas fases com éter para activar a reacção numa proporção útil. No entanto, a reacção raramente foi quantitativa, uma vez que também se geraram quantidades significativas de ácido fosfatídico. Além disso, devido à grande diferença em densidades entre o éter e a fase aquosa, reacções em larga escala deram rendimentos limitados devido a uma mistura insuficiente. Podem utilizar-se detergentes, mas tal resulta numa dificuldade aumentada na purificação do produto.
De acordo com o presente invento, um fosfolípido, como por exemplo, fosfatidilo colina, pode ser feito reagir com um álcool primário na presença de (i) uma enzima catalisadora, como seja a fosfolipase D, (ii) um solvente não éter que não destrói nem desnatura a enzima e menos inflamável que os éteres, e (iii) uma solução tamponizada do sal bivalente, de preferência, o sal de cálcio, para formar o éster fosfatidílico correspondente com um sal bivalente. 0 sal bivalente insolúvel é convertido num sal monovalente estável solúvel orgânico, suspendendo-se o sal bivalente num solvente orgânico e adicionando uma quantidade estequiométrica de um sal monovalente sólido que simultaneamente solubiliza o
-5D-470 fosfátido e precipita o sal de cálcio do anião do sal catiónico monovalente adicionado. Este processo produz o sal monovalente do fosfátido sem formação substancial de produtos de hidrólise, como seja o ácido fosfatidilico.
Descobriu-se também que para um sal de éster particular, o sal misto de sódio/amónio de dimiristoilfosfatidilo glicerol, quando a proporção de iões de amónio para iões de sódio é uma proporção particular por peso e a quantidade de catião bivalente presente é limitada, a solubilidade e a estabilidade do sal dimiristoilfosfatidilo glicerol são maximizadas. Para maximizar a estabilidade e a solubilidade de um sal misto de sódio/amónio dimiristoilfosfatidilo glicerol num solvente orgânico, verificou-se que a percentagem por peso de ião de amónio se deve situar entre cerca de 2,0 e cerca de 2,6 por cento por peso do sal misto e a percentagem por peso do ião de sódio deve situar-se entre cerca de 0,3 e cerca de 0,8 por cento por peso do sal misto. O nível de máximo de cálcio deve ser de cerca de 0,1, de preferência cerca de 0,05 por cento por peso do sal misto.
Além disso, verificou-se que pode utilizar-se a Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC), para facilitar mais a reacção da enzima fosfolipase D com a fosfatidilo colina e glicerol ou qualquer outro álcool.
A Figura 1 é um gráfico de solubilidade versus teor de ião de
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-6amónio em cloreto de metileno para um sal misto de dimiristoilfosfatidilo glicerol.
presente processo é um processo de duas fases para a formação de um sal monovalente de um éster de fosfatidilo que compreende:
a) fazer-se reagir um fosfolípido com um álcool primário na presença da enzima catalisadora apropriada, como seja a fosfolipase D e uma solução tampão catiónica bivalente num solvente imiscível em água, que possui baixa inflamabilidade para formar o fosfátido insolúvel correspondente do sal catiónico bivalente, e
b) converter-se o sal catiónico bivalente do fosfátido no seu sal monovalente solúvel correspondente, suspendendo-o numa quantidade estequiométrica de um sal monovalente sólido, cujo anião forma um precipitado insolúvel com o catião bivalente.
Devido à estabilidade e solubilidade melhoradas, os compostos do presente invento são particuiarmente úteis em composições complexas de lípidos e de liposomas.
Os liposomas são membranas de camada dupla de lipido completamente fechadas que contêm um volume aquoso aprisionado. Os liposomas podem ser vesículas unilamelares (que possuem uma única membrana de camada dupla) ou vesículas multilamelares (estruturas tipo cebola, caracterizadas pela
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-7existência de múltiplas membranas de camada dupla, cada uma separada da que se lhe segue por uma camada aquosa) . A camada dupla é composta por duas monocamadas de lípido que possuem uma zona de cauda” hidrofóbica e uma zona de cabeça hidrofílica. A estrutura da camada dupla de membrana é tal que as caudas (não polares) hidrofóbicas das monocamadas de lípido se orientam em direcção ao centro da camada dupla, enquanto que a cabeça hidrofílica se orienta em direcção à fase aquosa.
Os liposomas que contêm dimiristoilfosfatidilo colina (DMPC), dimiristoilfosfatidilo glicerol (DMPG) e colesterol de encapsulamento de anfotericina B são úteis no tratamento de infecções sistémicas de fungos. Juliano e outros, Annals N.Y. Acad., Sei., 1985, 446:390-402; Lopez Berenstein e outros, J. Infect. Dis, 1986, 151:704-710.
O Pedido PCT N2. W088/06443, intitulado Sistemas de Droga-Lípido de Baixa Toxicidade, Janoff e outros, publicado em 7 de Setembro de 1988 descreve métodos para preparar elevados complexos de droga:lípido de lípidos associados a drogas numa particular forma não liposomal, ou HDLCs e liposomas contendo uma proporção específica de DMPC ou DMPG. Os fosfolípidos são solubilizados em solventes como, por exemplo, clorofórmio e cloreto de metileno.
Os HDLCs são preparados solubilizando-se primeiro uma droga,
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-8particularmente em que a droga é um antibiótico antifungo polietileno, tal como a anfotericina B, num solvente orgânico biocompatível como, por exemplo, dimetilsulfóxido (DMSO) ou metanol e misturando a solução resultante com lípido(s) como, por exemplo, DMPC:DMPG numa proporção de moles de 7:3 que foi solubilizada num solvente, tal como, cloreto de metiieno. Os solventes são evaporados sob pressão reduzida, tendo como resultado uma fina película de lípido-droga. A película é hidratada numa solução aquosa tampão, por exemplo, salina, PBS ou glicina, formando HDLC's. Em alternativa, a solução aquosa pode ser adicionada ao solvente que contem a droga e à fase lípida antes da evaporação do solvente. Como outra alternativa, a película seca droga-lípido resultante pode ser novamente suspensa num solvente como, por exemplo, cloreto de metiieno e novamente evaporada sob pressão reduzida antes de se hidratar a película. Pode também utilizar-se um processo de desidratação em que a película seca droga-lípido é desidaratada para formar um floco que é hidratado com solução aquosa. Num método alternativo para a formação de HDLC's são formadas partículas de lípido que contêm agente bioactivo preparado pelo processo MVL e, em seguida, as partículas são sujeitas a um ciclo de aquecimento de cerca de 258C a cerca de 60aC.
Os fosfolípidos úteis no presente invento são uma classe de lípidos naturais e sintéticos que contêm um ou mais grupos fosfatidilos. Incluem fosfatidilo colina, fosfatidilo
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-9etanolamina, fosfatidilo serina, ácido fosfatidíco, dimiristoilfosfatidilo colina e fosfatitilo inositol. A fosfatidilo colina está disponível no comércio com elevada pureza e, por iso, é preferida. 0 álcool primário aqui ilustrado é o glicerol, mas podem utilizar-se outros alcoóis primários como, por exemplo, sulfocolina, etileno glicol, glicidol, ribose, etanolamina, glicerolformal e semelhantes. Os alcoóis primários simples como, por exemplo, metanol, etanol, propanol e semelhantes devem ser cuidadosamente excluídos, visto que reagem de modo extremamente rápido para formar o éster alquilo correspondente.
Os tampões catiónicos bivalentes apropriados têm um pH de cerca de 5,7 e contêm um catião bivalente como, por exemplo, cálcio. 0 catião deve ser inactivo em relação à enzima. 0 tampão pode ser, por exemplo, uma solução de um ou mais dos compostos seguintes: hidróxido de cálcio, cloreto de cálcio ou acetato de cálcio, com ácido acético ou acetato de sódio, por exemplo.
solvente não inflamável ou pouco inflamável, imiscível em água, útil no presente invento é menos inflamável do que o éter dietílico ou o éter dimetílico, tem um ponto de brilho de mais de 0®C e, de preferência, mais de 202C e não degradará nem desnaturará a enzima de modo a reduzir a sua aetividade mais do que cerca de 25% abaixo do éter dietílico. Solventes apropriados para o processo do presente invento
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-10incluem solventes halogenados como, por exemplo, cloreto de metileno, clorofórmio, tetracloroetileno, triclorofluorometano e semelhantes. Podem também usar-se ésteres alifáticos ou aromáticos, alcanos, cetonas ou ésteres que possuem um peso molecular inferior a cerca de 5000 como, por exemplo, acetato de etilo, propionato de etilo, butirato de etilo, acetato de metilo, propionato de metilo, 3—pentanona, 3-heptanona, 2octanona, 2-butanona, 2-pentanona, 2-heptanona, 3-octanona e 4-heptanona e semelhantes.
Os reagentes acima mencionados são misturados em conjunto, agitando-se ou oscilando-se para se converter o éster de fosfatidilo inicial como, por exemplo, a fosfatidilo colina no sal catiónico bivalente do produto desejado, tal como sal de cálcio de fosfatidilo glicerol, por exemplo.
Em geral será suficiente uma baixa energia de mistura, como seja agitação ou turbilhão, para se obter, pelo menos, cerca de 80% do rendimento projectado do sal catiónico bivalente.
Pode utilizar-se a Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC), Gazes, J. High Performance PCP for Downstream Processing of Biomaterials, American Biological Laboratories, June 1989, 17-23, para facilitar a reacção de transesterificação da enzima com o fosfolípido e com o álcool. Uma fase aquosa estacionária consistindo num tampão apropriado de cerca de 5,6, tal como acetato de sódio, é
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11carregada com cloreto de cálcio, com um álcool apropriado e com a enzima no centrifugador. 0 centrifugador é posto em movimento e uma fase móvel, que consiste num solvente orgânico não alcoólico como, por exemplo, acetato de etilo ou butirato de etilo, contendo o fosfolípido é bombeada para o sistema CPC. 0 sal de cálcio do fosfatidilo glicerol saturado, tal como DMPG, precipita do eluente. A fosfatidilo colina solúvel não reagida é, em seguida, reciclada para aumentar o rendimento. 0 fosfatidilo glicerol (DMPG) pode ser ainda purificado. Um perito no ramo saberá quais as condições necessárias para o fazer.
A temperatura a que a reacção se desenvolve situa-se, em geral, entre cerca de 15BC e cerca de 50 aC, de preferência, entre cerca de 20 e 37 aC e, mais preferivelmente, entre cerca de 20 a 302C.
sal catiónico bivalente precipita e pode ser prontamente separado da enzima e de outros subprodutos da reacção por filtração e lavando-o com um solvente orgânico imiscível em água, tal como acetato de etilo seguido de cloreto de metileno para purificá-lo ainda mais.
Este sal catiónico bivalente é convertido na presença de uma fase solvente orgânica, tal como álcool metilico e clorofórmio, num sal monovalente solúvel fazendo-o reagir em suspensão com uma quantidade estequiométrica de um sal
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-12monovalente cujo anião forma um precipitado com o catião bivalente. Os catiões monovalentes preferidos são o amónio, o sódio e o potássio assim como os seus carbonatos, citratos, fluoretos, sulfatos, fosfatos, nitratos, lactatos, succinatos, formatos, oxalatos, tetracetatos de cloreto de etileno diamina, tetracetatos etileno bis (nitrilo oxietileno) e semelhantes, possuindo todos uma significativa solubilidade em água. Os sais fosfatidilo monovalentes permanecem em solução e o sal bivalente precipita e pode ser prontamente removido por filtração ou processo semelhante. Obtem-se prontamente, pelo menos, 25% de conversão e, em geral, 35% de conversão. Em virtude da volatilidade do amoníaco em sais de amónio que são desejáveis por causa da sua elevada solubilidade, é preferível preparar um sal misto de amónio/sódio para uma boa solubilidade e para uma boa estabilidade. Uma proporção preferida de ião molar de amónio para sódio é de cerca de 1:1 a cerca de 8:1. Uma proporção particularmente preferida de ião de amónio para sódio é uma proporção molar de 4:1.
sal de amónio dimiristoilfosfatidilo glicerol é bastante solúvel em solventes orgânicos como, por exemplo, cloreto de metileno. A solubilidade do sal de amónio de dimiristoilfosfatidilo glicerol em cloreto de metileno é superior a cerca de 26 mg/ml. No entanto, este sal tem tendência para ser instável. 0 sal de sódio é mais estável, mas muito menos solúvel; por exemplo, a solubilidade do sal
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-13de sódio de dimiristoilfosfatidilo glicerol em cloreto de metileno é inferior a cerca de 0,2 mg/ml. Determinadas proporções do sal de sódio com o sal de amónio estabilizarão o sal misto, mas sem afectar adversamente a solubilidade abaixo dos níveis satisfatórios quando a quantidade de sal de sódio é controlada. Aproximadamente 0,3% por peso do catião de sódio confere estabilidade? no entanto, acima de uma quantidade máxima de cerca de 0,8% por peso de sódio, diminui a solubilidade do sal misto em cloreto de metileno.
A quantidade de ião de cálcio residual deverá ser limitada a menos de 0,1, de preferência cerca de 0,05% por peso do sal misto. O sal de cálcio é insolúvel e a presença de excesso de ião de cálcio tem um efeito adverso na solubilidade do sal misto em solventes orgânicos relativamente não polares.
Deverá notar-se, no entanto, que mesmo quando o sal misto amónio/sódio de dimiristoilfosfatidilo glicerol possui um teor de ião de cálcio de mais do que cerca de 0,1 por cento ou cerca de 0,05 por cento por peso e um teor de ião de sódio de mais do que cerca de 0,8 por cento por peso, a solubilidade do sal aumenta acentuadamente quando o teor do ião de amónio é superior a cerca de 2,0 por cento por peso e é muito elevada quando o teor de ião de amónio é de cerca de 2,25 a cerca de 2,35 por cento por peso (Figura 1 e Quadro II).
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Geralmente, se o teor de ião de cálcio é superior a cerca de 0,05 por cento por peso ou se os níveis de ião de amónio são inferiores a cerca de 2,0 por cento por peso, aumenta a percentagem de solúveis de sais mistos amónio/sódio de dimiristoilfosfatidilo glicerol em cloreto de metileno (ver Quadro III).
Assim, de acordo com o processo do presente invento, após a precipitação, lavagem e filtração do sal de cálcio de dimiristoilfosfatidilo glicerol, adiciona-se carbonato de amónio e carbonato de sódio em quantidade suficiente para converter o anião de cálcio num sal de cálcio sólido, isto é, o carbonato. De preferência não se adicionam carbonatos monovalentes para além da quantidade estequiométrica necessária para precipitar o anião de cálcio, como por exemplo, o sal carbonato de cálcio. O sal misto amónio/sódio de dimiristoilfosfatidilo glicerol é separado do sal de cálcio insolúvel e pode, se se desejar, ser ainda purificado.
Se se desejar ainda maior purificação, pode empregar-se a purificação cromatogrãfica usando uma coluna de sílica amoniacal com solventes mistos metanol/clorofórmio de uma maneira conhecida.
O processo do presente invento é efectuado na ausência de detergentes ou outros agentes tensio-activos que podem, em geral, ser removidos posteriormente e produz um produto de
D-;470 alta pureza com elevado rendimento sem a concomitante produção de ácido fosfatidílico ou outros subprodutos que reduzem o rendimento dos sais de éster fosfato desejados e que necessitam de purificação para serem removidos.
processo de acordo com o presente invento será ainda descrito com referência aos exemplos que se seguem, mas não se pretende que o invento fique limitado aos pormenores neles referidos. Todas as reacções foram efectuadas a cerca de
23fiC.
EXEMPLO 1
Emulsionaram-se 200 mg de fosfatidilo colina numa solução de 1 ml de tampão acetato de sódio possuindo um pH de 5,6, 1 ml de água, 0,2 ml de 1M de cloreto de cálcio e 0,2 ml de glicerol.
Adicionaram-se à emulsão acima 1 mg de fosfolipase D em 1 ml de acetato de sódio e adicionaram-se 2 ml de cloreto de metileno e a mistura foi agitada durante 17 horas.
precipitado glicerol de fosfatidilo foi filtrado, lavado com 10 ml de cloreto de metileno e recuperado como sal de cálcio com um rendimento de 74%.
Suspenderam-se 140 mg de sal de cálcio tal como obtido acima
D-;470 em 6 ml de etanol e adicionaram-se com agitação 3 ml de hexano e uma quantidade estequiométrica de uma mistura molar 1:4 de carbonato de sódio/carbonato de amónio.
precipitado de carbonato de sódio foi removido por filtração.
Obteve-se um rendimento de 120 mg ou 78% de fosfatidilo glicerol sódio/amónio.
EXEMPLO 2
Num recipiente de 5 litros introduziram-se 100 gramas de dimiristoilfosfatidilo colina, e adicionaram-se 500 ml de água e 500 ml de um tampão de acetato de sódio 0,5N com um pH de 5,6 e dissolveram-se 100 ml de cloreto de cálcio M e 100 mg de fosfolipase D em 50 ml do tampão e 50 ml de água. Adicionou-se um litro de butirato de etilo, o recipiente foi selado e feito oscilar durante 17 horas.
Recuperou-se o dimiristoilfosfatidilo glicerol de cálcio como um precipitado. 0 produto foi filtrado num funil Buchner, lavado com 5 litros de acetato de etilo e deu uma lavagem final de 1 litro com cloreto de metiieno.
A massa de filtrado foi suspensa em 1052 ml de metanol, 526 ml de clorofórmio e 420 ml de água.
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Adicionaram-se 526 ml de carbonato de amónio com 1:1 por volume e carbonato de sódio 0,5 N. A mistura foi filtrada rapidamente e adicionaram-se 526 ml de clorofórmio ao filtrado. 0 clorofórmio foi evaporado para cerca de 200 ml e adicionaram-se 5 litros de acetona fria.
A mistura foi filtrada através de um funil Buchner e o DMPG recuperado foi lavado com acetona fria.
Obtiveram-se 95 gramas (95% de rendimento) de dimiristoilfosfatidilo glicerol de amónio/sódio.
produto acima foi purificado dissolvendo-se ainda em 20% de metanol em clorofórmio, introduzido numa coluna de sílica de 2,54 cm (1 polegada) e eluído com um solvente misto de 80% de clorofórmio/20% de metanol contendo 1% de hidróxido de amónio.
A fracção contendo o produto dimiristoilfosfatidilo glicerol foi separada e evaporada até ficar seca.
Obteve-se o sal misto de amónio/sódio de dimiristoilfosfatidilo glicerol com 99% de pureza.
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-18EXEMPLO 3
Introduziram-se 200 gramas (0,29 mole) de dimiristoilfosfatidilo colina num frasco de 5 litros de três bocas equipado com uma espátula de banana aos quais se adicionaram 1 litro de tampão de acetato de sódio 0,5 N com um pH de 5,6, 1 litro de água, 200 ml de glicerol e 200 ml de cloreto de cálcio M. 0 pH foi ajustado para 5,5.
Adicionaram-se ao frasco 80 miligramas de fosfolipase D em 5 ml de tampão acetato de sódio e 5 ml de água. Finalmente adicionou-se 1 1 de cloreto de metileno à mistura agitada durante 17 horas.
A mistura de reacção foi filtrada num funil Buchner e a massa de filtrado lavada com 5 litros de água e 5 litros de cloreto de metileno.
Obtiveram-se 166 gramas (0,24 mole) de glicerol de dimiristoilfosfatidilo de cálcio ou um rendimento de 82%.
Verificou-se que o produto era 95% puro através de
cromatografia de camada fina.
EXEMPLO 4
Uma série de tubos de amostras foi carregada com uma
suspensão que consiste em 200 miligramas de
D-Λ 7 Ο
dimiristoilfosfatidilo colina; 2 ml de tampão de acetato de sódio 0,25 M com um pH de 5,6; 200 ml de cloreto de cálcio molar; 200 ml de glicerol e 5 miligramas de fosfolipase D em 2 ml de tampão de acetato de sódio 0,25 M com um pH de 5,6.
Adicionaram-se 2,5 ml de cada um de vários solventes (ver Quadro I) a cada um dos tubos. Os tubos foram tapados e colocados num oscilador a 25aC. 0 oscilador foi colocado a 250 rpm e funcionou durante 17 horas. 0 oscilador foi feito parar e cada tubo foi examinado e o conteúdo lavado 3 vezes com 5 ml de clorofórmio e, em seguida, com 5 ml de acetona e seco em vácuo com um peso constante. Foi analisada uma amostra de cada através de cromatografia de camada fina (TLC) em gel de sílica com clorofórmio:metanol;amoníaco na proporção de volume de 65:35:5. Os resultados são apresentados no Quadro I a seguir:
D-470
OUADRO I
Solvente Rendimento de produto • && insolúvel ma—
Acetato de etilo 183
Propionato de etilo 4· 205
Butirato de etilo 4· 254
2-butanona 78
2-pentanona 78
2-heptanona 162
2-octanona 166
Acetato de butilo 126
3-pentanona 150
3-heptanona 116
3-octanona 9
4-heptanona 175
Tetracloreto de carbono 5
Clorofórmio 46
Cloreto de metileno 185
Éter 190
£
Valores elevados, provavelmente devido a suspensão de liposoma não homogénea
Conversão ilustrada de TLC de fosfatidilo colina para sal de cálcio de fosfatidilo glicerol, sendo a fosfatidilo colina não reagida retirada por lavagem.
D-470
-21EXEMPLOS 5-10
Determinou-se a solubilidade de vários sais mistos de amónio/sódio de dimiristoilfosfatidilo glicerol em cloreto de metileno. Misturaram-se 1,6 mg de cada sal misto e aqueceu-se a 35 aC com agitação durante uma e duas horas. A mistura foi filtrada através de um filtro de seringa de 25 mm o, 2 mícron (Gelman Acrodisc GR) e determinou-se a percentagem de solubilidade. Os resultados estão resumidos no Quadro II.
QUADRO II
Percentagem de
Solubilidade
Exemnlo %nh4 %Na+ %Ca2+ 1 hora 2 horas
5 2,28 0,34 0,19 94 98
6 1,64 1,11 0,06 62 64
7 1,59 1,08 0,09 60 65
S 1,97 0,75 0,05 76 83
9 2,32 0,55 0,33 - 92
10 2,11 0,51 0,26 - 79
A Figura 1 é um gráfico de solubilidade versus teor de ião de
amónio em cloreto de metileno. 0 gráfico mostra que mesmo
quando há um excesso de cálcio de cerca de 0,05% por peso e
um excesso ι de teor de sódio de cerca de 0,8% por peso, a
solubilidade aumenta acentuadamente quando o teor de ião de amónio é superior em cerca de 2,0 por cento e é muito elevado quando o teor de ião de amónio é de cerca de 2,25 a cerca de
D-470
-222,35 por cento.
EXEMPLO 11
Um tampão de acetato de sódio 0,2 M com um ph de 5,6 é carregado com cloreto de cálcio 0,3 M, glicerol 0,3 M e fosfolipase D num sistema de Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC). 0 centrifugador é posto em movimento e bombeia-se para o sistema CPC acetato de etilo ou butirato de etilo contendo 0-20% de fosfatidilo colina. 0 sal de cálcio de DMPG precipita do eluente e pode ser ainda purificado. A fosfatidilo colina solúvel não reagida pode ser recirculada.
EXEMPLOS COMPARATIVOS
Determinou-se a solubilidade em cloreto de metileno de vários sais mistos de amónio/sódio de dimiristoilfosfatidilo glicerol. Combinaram-se 1,6 mg de cada sal misto com 4,5 mg de dimiristoilfosfatidilo colina e aqueceu—se a 35aC durante uma hora. O material foi, em seguida, feito passar através de um filtro de seringa de 25 mm 0,2 mícron (Gelman Acrodisc GR) e calculou-se a percentagem de produtos insolúveis. Os resultados estão resumidos no Quadro III.
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-23QUADRO III
Percentagem de
Exemplo Percentagem por peso
Solúveis
Na+ nh4+ Ça2+ % Insoluvéis
Cl 0,38 2,26 0,2 95 5
C2 0,51 2,11 0,26 89 11
C3 1,11 1,64 0,06 91 9
C4 0,75 1,97 0,05 95 5
EXEMPLO COMPARATIVO 5
Uma porção de 1,6 mg/ml de mistura de amónio/sódio de dimiristoilfosfatidilo glicerol com um teor de sódio de 1,20%, um teor de amónio de 1,53% e um teor de cálcio de 0,12% por peso do sal, foi misturada com 4,5 mg/ml de dimiristoilfosfatidilo colina em cloreto de metileno e >
aqueceu-se a 352C enquanto se agitava. A mistura estava ainda turva após uma hora, indicando uma solubilização incompleta do sal misturado.
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Claims (26)

  1. REIVINDICAÇÕES
    Ia - Processo para a formação de um sal monovalente solúvel de um éster fosfatidílico, caracterizado por compreender:
    a) fazer-se reagir um fosfolípido com um álcool primário na presença de (i) uma enzima catalisadora, (ii) uma solução tampão catiónica bivalente, e (iii) um solvente não éter imiscível em água, de modo a formar o fosfátido correspondente do sal catióníco bivalente; e
    b) converter-se o sal catióníco bivalente num sal monovalente solúvel orgânico suspendendo-o com uma quantidade estequiométrica de um sal monovalente cujo anião forma um precipitado insolúvel com o catião bivalente.
  2. 2a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o fosfolípido ser fosfatidilo colina.
  3. 3a - Processo de acordo com a reivindicação l, caracterizado por o fosfolípido ser dimiristoilfosfatidilo colina.
  4. 4a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o álcool ser escolhido do grupo que consiste em glicerol, sulfocolina, etileno glicol, glicidol, ribose, etanolamina e glicerolformal.
    D-470
    -255a - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o álcool ser glicerol.
  5. 6a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a solução tampão conter um sal de cálcio.
  6. 7a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o solvente imiscível em água ser um alcano ou um alqueno halogenado escolhido do grupo que consiste em cloreto de metileno, clorofórmio, tetracloroetileno e triclorofluorometano.
  7. 8a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o solvente imiscível em água ser um éster alifático ou aromático, um alcano ou uma cetona.
  8. 9a - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado | por o solvente imiscível em água ser um membro do grupo que consiste em acetato de etilo, propionato de etilo, butirato de etilo, acetato de metilo, propionato de metilo, 2-butanona, 2-pentanona, 2-heptanona, 2-octanona, 3-pentanona, 3-heptanona, 3-octanona e 4-heptanona.
  9. 10a - Processo de acordo com a reivindicação l, caracterizado por o catião monovalente do sal monovalente ser escolhido de um ou mais do grupo que consiste em amónio, sódio e potássio.
    D-470
    -2611a - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o anião do sal ser um carbonato, citrato, sulfato, fosfato, nitrato, lactato, succinato, formato, oxalato, tetracetato ou cloreto de etileno, tetracetato de etileno bis(nitrilo oxietileno).
  10. 12a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fase a) ser efectuada utilizando Cromatografia de Partição Centrífuga.
  11. 13a - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o liposoma compreender um sal monovalente solúvel de um éster fosfatidilo formado de acordo com a reivindicação 1.
  12. 14a - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por possuir um complexo de lípido que compreende um sal monovalente solúvel de um éster fosfatidilo formado de acordo com a reivindicação 1.
  13. 15 a - Processo para a formação de um sal misto solúvel de amónio/sódio de dimiristoilfosfatidilo glicerol, caracterizado por:
    a) se fazer reagir um dimiristoilfosfolípido com um álcool primário na presença de (i) uma enzima catalizadora, (ii) uma solução tampão catiónica bivalente, e
    D-470
    -271 (iii) um solvente não éter imiscível em água de modo a formar fosfátido correspondente do sal catiónico bivalente? e
    b) se converter o sal catiónico bivalente num sal monovalente solúvel orgânico suspendendo-o com uma quantidade estequiométrica de um sal monovalente cujo anião forma um precipitado com o catião bivalente e cujo catião é uma mistura de amónio e de sódio numa proporção de peso de modo a formar um dimiristoilfosfatidilo glicerol monovalente misto contendo desde cerca de 2,0 a cerca de 2,6% por peso de amónio e desde cerca de 0,3 a 0,8% por peso de sódio.
  14. 16 a - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o catião bivalente ser cálcio.
  15. 17a - Processo de acordo com a reivindicação 15, | caracterizado por o dimiristoilfosfatidilo glicerol misto monovalente conter não mais de cerca 0,1% por peso do sal misto de cálcio.
  16. 18a - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o dimiristoilfosfatidilo glicerol misto monovalente conter não mais de cerca 0,05% por peso do sal misto de cálcio.
  17. 19 a
    Processo de acordo com a reivindicação 15,
    D-470
    -28caracterizado por a fase a) ser efectuada utilizando Cromatografia de Partição Centrífuga.
  18. 20a - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o liposoma compreender um sal monovalente solúvel de dimiristoilfosfatidilo glicerol formado de acordo com a reivindicação 15.
  19. 21a - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o complexo de lípido compreender um sal monovalente solúvel de dimiristoilfosfatidilo glicerol formado de acordo com a reivindicação 15.
  20. 22a - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por a solução aquosa de sal misto de dimiristoilfosfatidilo glicerol compreender desde cerca de 2,0 a cerca de 2,6% por peso de amónio e desde cerca de 0,3 a cerca de 0,8% por peso de sódio.
  21. 23a - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o sal monovalente misto de dimiristoilfosfatidilo da solução obtida de acordo com a reivindicação 22 conter não mais do que 0,1% por peso do sal misto de cálcio.
  22. 24a - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o sal monovalente misto de
    D-470
    -29dimiristoilfosfatidilo conter não mais do que 0,05% por peso do sal misto de cálcio.
  23. 25a - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por a solução compreender adicionalmente dimiristoilfosfatidilo colina.
  24. 26a - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o liposoma compreender uma solução obtida de acordo com a reivindicação 22.
  25. 27a - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o complexo de lípido compreender uma solução obtida de acordo com a reivindicação 22.
  26. 28 a - Processo para a preparação de uma solução de um sal misto de dimiristoilfosfatidilo glicerol, caracterizado por a referida solução conter desde cerca de 2,0 por cento a cerca de 2,32 por cento por peso de amónio.
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