DE69916460T2

DE69916460T2 - Carboxylierte phosphatidicsäuresterne

Info

Publication number: DE69916460T2
Application number: DE69916460T
Authority: DE
Inventors: Herve Tournier; Bernard Lamy
Original assignee: Bracco Research SA
Current assignee: Bracco Research SA
Priority date: 1998-08-19
Filing date: 1999-08-17
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2019-08-18
Also published as: WO2000011007A1; EP1105399A1; US6706280B2; ATE264334T1; JP2002523418A; US20020136760A1; DE69916460D1; EP1105399B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft Phosphatidsäureester aliphatischer und cycloaliphatischer, hydroxylierter Kohlenwasserstoffe, die mit Carboxylfunktionen substituiert sind. Diese Verbindungen sind in den Bereichen der gezielten Pharmakotherapie (drug targeting) mit Liposomen und der MR-Bilddarstellungskontrastmedien zu diagnostischen Zwecken besonders brauchbar.
STAND DER TECHNIK
Aliphatische Ester von Diacyl-Glycerophosphatidsäure (Diacylglycerophosphatester) sind wohl bekannt, da einige von ihnen, wie Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylinositol und Phosphatidylglycerin, natürliche Phospholipidbestandteile von Lecithinen sind.
Es ist über synthetische Ester von Diacyl-Glycerophosphatidsäure berichtet worden, beispielsweise über Phosphatidylester von acyl- und benzylsubstituiertem Glycerin (Chemical Abstract-Zugriffnummern CA 92-110494/13 und CA 94-046877/07, Abstracts of Journal of Organic Chemistry of the USSR 1979, 15 (10), 2016-18 und Bioorganicheskaya Khimija 1980, 6 (9), 1346–54) oder über einen anti-retroviralen Diacylphosphatidsäureester der folgenden Hydroxyverbindung
in der X eine Nukleobase ist (van Wijk et al., Biochim. Biophys. Acta 1165 (1992), 45 bis 52).
Der Artikel von Lee et al. "Phospholipid functional groups involved in protein kinase C activation, phorbol ester binding and binding to mixed micells" [An der Ptoteinkinase-C-Aktivierung beteiligte, funktionelle Phospholipidgruppen, Phorbolesterbindung und Bindung an gemischte Micellen], Journal of Biological Chemistry, 1989, 264 (25), Seiten 14797 bis 14805, offenbart bestimmte Phospholipide, die für die Aktivierung von Proteinkinase C, Phorbolesterbindung und Bindung an gemischte Micellen geeignet sind.
Die europäische Patentanmeldung EP 0 122 151 offenbart ein Verfahren zur Herstellung primärer oder sekundärer Alkoholderivate von Phospholipiden durch Umsetzung eines Phospholipids mit einem ausgewählten primären oder sekundären Alkohol in Gegenwart von Phospholipidase DM.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die jetzigen Erfinder haben gefunden, dass Phosphatidsäureester der Formel
die unerwartete, nützliche Eigenschaft haben, Phospholipide zu stabilisieren, wenn sie damit gemischt werden. Wenn Phospholipide beispielsweise zur Herstellung von Liposomen verwendet werden, verbessert die Anwesenheit der Phosphatidsäureester die Einschlusskapazität der Liposomvesikel, verhindert Vesikelkoaleszenz und inhibiert ein Lecken der eingeschlossenen Substanzen in den flüssigen Träger. In der obigen Formel sind R₁ und R₂ Phospholipidfettsäurereste und A ist eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette der Formel -(CH₂)_n-, wobei n eine ganze Zahl von 5 bis 14 ist, und/oder eine cycloaliphatische Kohlenwasserstoffkette, die gegebenenfalls mit Hydroxy- und/oder weiteren Carboxylfunktionen substituiert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist n eine ganze Zahl von 5 bis 10.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Fettsäurereste R₁ und R₂ sind vorzugsweise von gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren abgeleitet, die sich üblicherweise in Lecithinen finden, beispielsweise Laurin-, Myristin-, Palmitin-, Stearin-, Arachin-, Öl-, Linolsäuren und dergleichen.
Gemäß einem ersten Herstellungsverfahren für Verbindungen der Formel
kann man eine Phosphatidinsäure (II) mit einem Säurealkohol HO-A-COOH verestern, beispielsweise HO-(CH₂)_n-COOH (III), dessen Säurefunktion temporär geschützt wird, indem sie beispielsweise benzyliert wird, und man anschließend die Schutzgruppe entfernt. Dies wird in dem folgenden beispielhaften Schema zusammengefasst:
Die Benzylierung des Säurealkohols (III) kann bewirkt werden, indem Benzylbromid mit einem Alkalimetallsalz von (III) in DMF oder Hexamethylphosphoramid (HMPT) wie folgt umgesetzt wird:
Dieses Verfahren ist natürlich allgemein und gilt auch für andere Verbindungen der Formel I unter Verwendung anderer Säure-Alkohole HO-A-COOH, wobei das obige Ausführungsschema nur zur Veranschaulichung dient.
Gemäß einem weiteren Weg zur Herstellung von (Ia) kann man eine Bromsäure Br-(CH₂)_nCOOH (IV) mit dem Silbersalz der Phosphatidsäure (II) umsetzen:
Gemäß einem weiteren Weg kann man das freie -OH der Phosphatidsäure (II) schützen und nachfolgend das Produkt mit dem Bromid (V) umsetzen, um die Verbindung (VI) zu ergeben. Die Letztere liefert nach dem Entschützen mit üblichen Mitteln den Säure-Ester (IA). Dies wird schematisch wie folgt dargestellt:
Die direkte Umsetzung der Phosphatidsäure (II) mit dem Bromid (V) ist auch wie folgt möglich:
Natürlich sind die obigen Ausführungswege nicht einschränkend, die offenbarten Verfahren sind allgemein und unter Verwendung anderer Intermediate der Formeln Br-A-COOH und Br-A-COOBzl anwendbar.
Die neuen, offenbarten Verbindungen sind sehr nützlich zum Stabilisieren von Liposomvesikeln in Suspension in Wasser, Puffern und biologischen Flüssigkeiten gegen ein Reißen und Koaleszieren mit der Zeit. Sie erhöhen auch ihre Verkapselungskapazität (erhöhtes Gewichtsverhältnis von verkapselter Substanz zu Phospholipiden, die die Vesikel bilden) und stabilisieren die Vesikelmembran gegen ein Lecken der eingeschlossenen Substanzen in die Trägerflüssigkeit. Wenn Liposomvesikel beispielsweise dazu verwendet werden, um iodierte Röntgenopazifizierungsmedien mittels des Blutstroms in dem Organismus zu tragen, wird der Einbau eines Anteils von einer oder mehreren der neuen Verbindungen in die Phospholipide, die die Liposomen bilden, die Neigung des verkapselten Iods, in das Blut durch Permeieren der Vesikelmembran freigesetzt zu werden, stark verringern. Die Transporteffizienz der Opazifizierungsverbindungen zu möglicherweise fernen Organen im Körper wird so deutlich erhöht. Üblicherweise liegt der wirksame Anteil der neuen Verbindungen in den liposombildenden Lipiden im Bereich von 1 bis 25 Gew.-%, diese Werte können gewünschtenfalls jedoch überschritten werden. Die Liposom bildenden Lipide oder Mischung von Lipiden schließen im Wesentlichen alle Verbindungen ein, die üblicherweise auf dem Gebiet der Liposomen verwendet werden, d. h. Glycerophospholipide, nicht-phosphorylierte Glyceride, Glycolipide, Sterole und andere Additive, die Liposommembranen modifizierte Eigenschaften verleihen sollen. Sie umfassen vorzugsweise mindestens eine polarisierbare Komponente, nämlich ein eine kationische oder anionische Funktion tragendes Lipid oder ein ionisierbares Tensid, wie einen Fettalkoholdiphosphatester, z. B. Dicetylphosphat (DCP) oder ein höheres Alkylamin wie Stearylamin (SA). Geladene Phospholipide, d. h. Fettsäureglyceride, Phosphatide wie Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylglycerin (PG), Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidylserin (PS) aus natürlichen oder synthetischen Quellen (wie Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPA), Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG), usw.) sind zweckmäßige polarisierbare Lipidkomponenten. Die Glycerophospholipide können beispielsweise Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE) und das entsprechende Distearoyl- und Dimyristylphosphatidylcholin und -ethanolamin (DSPC, DSPE, DMPC und DMPE) einschließen. Die Liposom bildenden Phospholipide können auch natürliche Phospholipide einschließen, die einer mehr oder weniger umfassender Hydrierung unterzogen worden sind, beispielsweise Ei- und Sojaphosphatidylcholin.
Die Glycolipide können Cerebroside, Galactocerebroside, Glucocerebroside, Sphingomyeline, Sulfatide und Sphingolipide einschließen, die mit Mono-, Di- und Trihexosiden derivatisiert sind. Die Sterole, die sparsam verwendet werden sollen, da zu viel die Membranpermeation beeinträchtigen können, beinhalten Cholesterol, Ergosterol, Coprostanol, Cholesterolester wie Hemisuccinat (HCS), Tocopherolester und dergleichen.
Es ist auch gefunden worden, dass gefriergetrocknete Phospholipidpulver, die erfindungsgemäße Phosphatidylverbindungen enthalten, bequem längere Zeiträume ohne Verlust der Eigenschaften gelagert werden können. Dies ist besonders nützlich, wenn diese Phospholipide zur Herstellung von therapeutischen oder Kontrastmitteln verwendet werden oder in Arzneimittelfreisetzungsvehikel eingebaut werden, die ferner Zielfindungsvektoren einschließen können.
Aus gefriergetrockneten Pulvern, die die erfindungsgemäßen Phosphatidylverbindungen enthalten, hergestellte Liposome haben dieselbe verbesserte Stabilität und Einschlusskapazität gezeigt, die bei den Liposomen beobachtet wurde, die in der üblichen Weise aus nicht gefriergetrockneten Formulierungen hergestellt wurden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung detaillierter.
BEISPIEL 1
Ester von DPPA (Dipalmitoylphosphatidsäure) mit 6-Hydroxycapronsäure
A) Benzyl-6-hydroxycaproat
In 200 ml Wasserlösung, die 0,22 mol NaOH enthielt, gab man langsam unter Rühren zwischen 4 und 8°C 21,4 ml (0,2 mol) γ-Caprolacton. Nach dem vierstündigen Stehen bei Raumtemperatur (RT), wurde die Mischung in einem Rotationsverdampfer eingedampft, und der resultierende trockene Feststoff wurde durch Zerreiben mit Aceton gewaschen. Ausbeute: 29,47 g (96%) Natrium-6-hydroxycaproat, das im Exsikkator über P₂O₅ gelagert wurde.
In 40 ml HMPT wurden bei 60°C 7,7 g (50 mmol) des genannten Natriumsalzes gelöst und 55 mmol Benzylbromid unter Rühren zugegeben. Die Mischung wurde weiterhin 2 Stunden bei 60°C bewegt, danach wurde sie über Nacht beiseite gestellt. Die Mischung wurde mit 100 ml Wasser verdünnt, und die Lösung wurde nacheinander mit 100 und 200 ml Ether extrahiert. Nachdem die kombinierten Extrakte mit 2 × 100 ml Wasser gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet worden waren, wurden sie eingedampft, um 11,26 g des gewünschten Produkts in flüssiger Form zu liefern. Dieses Produkt enthielt relativ wenige Verunreinigungen, wie durch Dünnschichtchromatographie (DC) an Kieselgel (Hexan/Ether 1 : 3) bestätigt wurde. Die weitere Reinigung wurde bewirkt, indem die Verunreinigungen mit 3 aufeinanderfolgenden Portionen von 60 ml Hexan bei 60°C extrahiert wurden, dann auf 4°C abgekühlt wurde und die oberen Hexanphasen verworfen wurden. Der flüssige Rückstand wurde getrocknet und weiter mit tels DC analysiert. Das ¹H-NMR-Spektrum stand in vollständiger Übereinstimmung mit der Struktur der gewünschten Verbindung.
B) Benzyldipalmitoylphosphatidylhexanoat (DPPA-Na-C₆-OBzl)
Bei 60°C wurden durch Ultraschallbehandlung in 20 ml Chloroform 1,34 g (2 mmol) DPPA-Na dispergiert, dann wurde die Dispersion auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Eine weitere Lösung wurde hergestellt, indem 0,88 g (4 mmol) des in der vorhergehenden Stufe hergestellten Benzylhydroxycaproats in 20 ml trockenem Pyridin gelöst wurde, danach wurden 1,82 g (6 mmol) Triisopropylbenzolsulfonylchlorid (TPS-Cl) zugegeben. Die zweite Lösung wurde tropfenweise zu der ersten Lösung gegeben, und die Bewegung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde fortgesetzt, danach wurde eine halbe Stunde auf 50°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde mit 2 ml Wasser und 20 ml Aceton behandelt und eine weitere Dreiviertelstunde auf 50°C erhitzt.
Nach dem Eindampfen der flüchtigen Lösungsmittel wurde der Rückstand mit 50 ml Wasser verdünnt und die saure Lösung durch vorsichtige Zugabe von 1,26 g NaHCO₃ auf einen pH-Wert von 6,5 gebracht. Danach wurde der pH-Wert mit 1 N NaOH weiter auf 9 bis 9,5 erhöht, und das Wasser wurde zunehmend durch azeotrope Destillation mit Toluol (4 aufeinander folgende 50 ml Portionen) entfernt. Der Rückstand wurde in 100 ml Hexan dispergiert und filtriert. Der aufgefangene Feststoff, 2,47 g, war gemäß DC-Analyse P-frei und wurde verworfen. Nach dem Eindampfen ergab das Filtrat 2,61 g Feststoff, der in 40 ml Hexan gelöst wurde, und die Lösung wurde über 52 g Siliciumdioxid gegossen (Typ 60 für HPLC). Das Siliciumdioxid wurde im Vakuum getrocknet und mit zwei aufeinander folgenden Portionen von 120 ml Wasser (Büchner-Filtration) gewaschen. Das feuchte Siliciumdioxid wurde wiederum im Rotationsverdampfer getrocknet und in 120 ml CHCl₃/MeOH (8 : 2)-Mischung aufgenommen, danach wurde das Siliciumdioxid abfiltriert und das Filtrat eingedampft, um 2,2 g Feststoff zu ergeben. Dieser Feststoff wurde aus 150 ml siedendem Ethanol (Abkühlen auf RT, dann im Kühlschrank auf 4°C) kristallisiert. Der kristallisierte Feststoff wurde abtropfen gelassen, mit kaltem EtOH und Aceton gewaschen und getrocknet, Ausbeute 1,3 g (76%). Das Produkt war gemäß DC-Analyse rein (Siliciumdioxid 60F₂₅₄; CHCl₃/MeOH/H₂O 65 : 25 : 4).
C) Dipalmitoylphosphatidyl-O-hexansäure
In einer Mischung aus 15 ml EtOH und 135 ml AcOEt wurden durch Erwärmen 3,13 g (3,6 mmol) des unter B) beschriebenen Benzyldipalmitoylphosphatidyl-O-hexanoats gelöst, danach wurden 3 g Pd/C-Hydrierkatalysator und 10 ml Cyclohexen zugegeben. Die Mischung wurde unter Bewegung eine Stunde auf 60°C erhitzt, danach wurde sie abgekühlt und die Aktivkohle durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde durch Leiten durch einen 0,2 μm Mikroporenfilter weiter gereinigt und eingedampft, um 2,73 g Produkt zu ergeben, das aus 100 ml EtOH umkristallisiert wurde. Die Endausbeute an reiner Dipalmitoylphosphatidyl-O-hexansäure betrug 2,34 g (86%).
BEISPIEL 2
Ester von DPPA (Dipalmitoylphosphatidsäure) mit 8-Hydroxyoctansäure
A) Benzyl-8-bromoctanoat
In 100 ml CCl₄ wurden bei etwa 5°C (Eisbad) 11,6 g (52 mmol) 8-Bromoctansäure gelöst, zu der Lösung wurden 5,41 g (50 mmol) Benzylalkohol und 2,5 mmol 4-Pyrrolidinopyridinkatalysator gegeben. Danach wurde eine Lösung von 10,73 g (52 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 10 ml Tetrachlorkohlenstoff portionsweise unter Rühren zugegeben. Die Ausfällung des erwarteten Dicyclohexylharnstoffs (DCU) trat nach einigen Minuten ein, und die Temperatur wurde wieder auf Raumtemperatur kommen gelassen. Nach einer halben Stunde war die Umsetzung abgeschlos sen, wie mittels DC (Hexan/Ether 1 : 1) überprüft wurde. Dann wurden nach etwa einer Stunde 0, 5 ml AcOH zugegeben, um restliches DCC abzufangen, und das DCU wurde nach etwa einer Stunde abfiltriert (Ausbeute 11,2 g = 100%).
Die Lösung wurde mit aufeinanderfolgenden, flüssigen Portionen von Extraktionsmitteln wie folgt gewaschen:
2 × 100 ml Wasser (zur Entfernung der Essigsäure);
2 × 100 ml 1 N NaHCO₃/Na₂CO₃ Lösung (pH 9,5) zur Entfernung der nicht umgesetzten Bromsäure;
100 ml 1 N NaHCO₃-Lösung;
100 ml halbgesättigte NaCl-Lösung;
50 ml gesättigte NaCl-Lösung.
Die gereinigte Tetrachlorkohlenstofflösung wurde durch Phasentrennpapier filtriert, mit wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und zur Trockne eingedampft, was eine klare Flüssigkeit zurückließ, aus der etwas restliches DCC beim Stehenlassen auskristallisierte. Dieses Produkt war ausreichend rein für die Verwendung in den folgenden präparativen Sequenzen.
B) Benzylester von DPPA (Na-Salz)
In 50 ml DMF wurden 6,71 g (10 mmol) DPPA.Na unter kräftigem Rühren dispergiert, 1,4 g (10 mmol) Triethylamin (NEt₃) und 2,7 ml (22 mmol) Benzylbromid wurden zugesetzt. Die Mischung wurde 24 Stunden bei 70°C bewegt, danach wurde sie nach Abkühlen mit 300 ml Ether verdünnt und filtriert (der Feststoff wurde mittels DC als Mischung aus NaBr und nicht umgesetztem DPPA.Na identifiziert). Das Etherfiltrat wurde mit 2 × 100 ml HCl 0,1 N gewaschen, und die Waschflüssigkeit wurde mit 100 ml Ether rückextrahiert. Dieser Extrakt wurde mit der Hauptetherphase kombiniert. Nach Filtration (0,92 g nicht umgesetztes DPPA.Na) wurde die Etherlösung getrocknet und eingedampft, was 6,77 g Produkt ergab, das in 350 ml Aceton dispergiert wurde. Nach dem Zerreiben der unlöslichen Fraktion und Bewegen unter Sieden wurde die Dispersion heiß filtriert und auf Raumtemperatur, dann über Nacht auf 4°C abkühlen gelassen. Der Feststoff, welcher auskristallisierte, wurde ein weiteres Mal unter denselben Bedingungen umkristallisiert, was schließlich 4,72 g des gewünschten Produkts ergaben.
C) Benzylester von DPPA (Ag-Salz)
Die folgenden Präparationen sollten so weit wie möglich im Dunkeln erfolgen. 1 mmol (761 mg) DPPA.Na.OBzl, d. h. das oben unter B) erhaltene Produkt, wurde unter Sieden in 110 ml Aceton gelöst, dann wurde nach dem Abkühlen eine wässrige Lösung von Silbernitrat (0,17 g AgNO₃ in einer Mischung aus 5 ml H₂O und 15 ml Aceton) tropfenweise zugegeben. Nach dem Erhitzen wurde die Mischung über Nacht im Dunkeln kristallisieren gelassen, es wurden 0,79 g (93%) Feststoff aufgefangen.
D) Benzylierter DPPA-Ester von Benzyl-8-hydroxyoctanoat (DPPA.OBzl.C₈.OBzl)
In 2,5 ml HMPT wurden 423 mg (0,5 mmol) des in der vorhergehenden Stufe hergestellten DPPA.Ag.OBzl gelöst, dann wurden bei 55°C unter Bewegen 189 mg (0,6 mmol) des wie oben unter A) erhaltenen Benzyl-8-bromoctanoats zugegeben. Die Temperatur wurde auf 70°C erhöht, und es bildete sich ein brauner Niederschlag. Nach dem Abkühlen wurden 20 ml Ether zugegeben, und die Mischung wurde filtriert; das Filtrat wurde nacheinander mit 2 × 10 ml H₂O, 10 ml HCl 0,1 N, 10 ml (NH₄)₂CO₃ N (in den beiden letzten Waschstufen musste die Phasentrennung bewirkt werden, indem 10 Minuten bei 10.000 g zentrifugiert wurde), 10 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Dann wurde der Ether wie üblich getrocknet, um einen Feststoff zu ergeben, der in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
E) Dipalmitoylphosphatidyl-O-octansäure
Das wie in der vorhergehenden Stufe beschrieben hergestellte DPPA.OBzl.C₈.OBzl wurde durch Hydrierung wie in Beispiel 1, Stufe C, offenbart entschützt. Das so erhaltene Produkt hatte dieselben Eigenschaften wie dasjenige aus Beispiel 1, Stufe C.
BEISPIEL 3
Dipalmitoylphosphatidyl-O-octansäure
A) Dipalmitoylphosphatidinsäure-Ag-Salz
In 1 ml Wasser wurden 0,85 g (5 mmol) AgNO₃ gelöst, dann wurde die Lösung mit 10 ml MeOH verdünnt und im Dunkeln unter kräftigem Rühren zu einer Lösung von 3,35 g (5 mmol) DPPA.Na in 350 ml warmem Methanol gegeben. Die Mischung wurde auf 4°C gekühlt, der gebildete Niederschlag wurde abtropfen gelassen, mit Aceton gewaschen und im Dunkeln getrocknet. Ausbeute 3,67 g (97%).
B) Dipalmitoylphosphatidyl-O-octansäurebenzylester
1,675 g DPPA.Na (2,5 mmol) wurden in 10 ml HMPT gelöst, und dazu wurde eine Lösung von 1,56 g (5 mmol) Benzyl-8-bromoctaonat in 5 ml HMPT gegeben. Die Mischung wurde rotiert und für 24 Stunden auf 70°C gebracht, dann über Nacht auf Raumtemperatur. Dann wurden 60 ml Hexan zugegeben, und die Lösung wurde nacheinander mit 20 ml Portionen von Wasser, 0,5 M NaHCO₃, M NaHCO₃ und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Nach dem Filtrieren an Phasentrennpapier wurde das Hexan über Magnesiumsulfat getrocknet, erneut filtriert und eingedampft, was 2,05 g Feststoff ergab, der aus Aceton kristallisiert wurde. Ausbeute 1,09 g (46%).
C) Dipalmitoylphosphatidyl-O-octansäure
In einer Mischung aus 4 ml EtOH und 30 ml AcOEt wurden bei 60°C 1,09 g (1,2 mmol) Benzyldipalmitoylphosphatidyloctanoat gelöst; 1 g Pd/C und 2,5 ml Cyclohexen wurden zugegeben und die Mischung eine Stunde bei 60°C rotiert. Nach dem Abkühlen wurde die Mischung filtriert, der aufgefangene Katalysator mit Chloroform/Ethanol (8 : 2) gewaschen und die kombinierten Filtrate zur Trockene eingedampft. Ein Feststoff wurde aufgefangen und aus heißem Ethanol umkristallisiert. Ausbeute 0,45 g. Das Produkt war gemäß DC-Analyse rein.
Falls in den vorhergehenden Beispielen die linearen aliphatischen Reagenzien HOC_6-8COOBzl und BrC_6-8COOBzl durch entsprechende C_4-5 und C_9-14-Verbindungen ersetzt wurden, wurden die entsprechenden Phosphatidylsäureester erhalten.
Cycloaliphatische Analoge wurden auch durch ähnliche Techniken erhalten, beispielsweise unter Verwendung von Reagenzien wie
BEISPIEL 4
Drei Phospholipidmischungen bezeichnet als (A), (B) und (C) wurden durch Mischen der nachfolgend beschriebenen Bestandteile hergestellt.

(A) SPC-3 (ein hydriertes Sojalecithin von Lipoid GmbH, Deutschland) 299 mg (61, 7 mol.%); Cholesterol (von Fluka, Schweiz) 80,1 mg (33,3 mol.%); DPPA.Na (von Sygena, Schweiz) 20,9 mg (5,0 mol.%); Gesamtgewicht der Lipide = 400 mg
(B) SPC-3 299 mg (61,7 mol.%); Cholesterol 80,1 mg (33,3 mol.%); Dipalmitoylphosphatidyl-O-hexansäure 24,5 mg (5 mol.%); insgesamt 403,6 mg.
(C) SPC-3 275 mg (56,7 mol.%); Cholesterol 80,1 mg (33,3 mol.%); DPPA.Na 20,9 mg (5,0 mol.%); Dipalmitoylphosphatidyl-O-hexansäure 24,5 mg (5 mol.%); Gesamtlipide 400,5 mg.

Jede der obigen Mischungen wurde mit 5 ml MeOH und 10 ml Chloroform verdünnt, danach wurde die organische Lösung durch Rotieren über Nacht unter vermindertem Druck bei 35°C gründlich getrocknet.
Andererseits wurde eine Iodlösung aus 52,24 g Iomeprol hergestellt, gelöst in 56,18 ml Wasser durch Erhitzen, gefolgt von Ultrafiltration mit einer 0,2 μm Milliporenmembran.
Iodbeladene MLV-Liposomen (A) bis (C) wurden hergestellt, indem 20 ml der obigen Iodlösung mit jeweils 400 mg der obigen getrockneten Lipidmischungen gemischt und eine Dreiviertelstunde bei 65°C gerührt wurde. Die MLV-(multilamellaren Vesikel)-Liposomen wurden dann erschöpfend bei 65°C durch Polycarbonatmembranen (4 × 2 μm, dann 5 × 0,6 μm) extrudiert, um in unilamellare Vesikel (SUV) mit erhöhter Einschlusskapazität überführt zu werden. Danach wurden die SUV-Liposomlösungen mit filtriertem (0,2 μm) Tris-Puffer verdünnt, um Lösungen herzustellen, die 1 g/l Tris enthielten. 1 ml jeder Liposompräparation wurde durch Dialyse gegen 2 × 1 l Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) weiter gereinigt, dann wurden die Lipidkonzentration und das I/L (Gewicht Iod pro Gewicht der beteiligten Lipide) mit den üblichen Mitteln gemessen, z. B. wie in EP-A-0 314 764 offenbart. In allen drei Fällen lag die Vesikelgrösse im Bereich von 370 bis 400 nm, die Lipidkonzentration betrug etwa 20 mg/ml und die I/L-Werte betrugen 2,7 (A), 3,2 (B) und 3,0 (C). Die Einschlusskapazität der mit den erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellten Liposomen war somit erhöht.
STABILITÄT IN HUMANPLASMA
1 ml der obigen Liposomsuspensionen wurde mit 7 ml PBS verdünnt und 25 Minuten (46.000 g) zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstands wurde der Bodenrückstand zweimal gegen 1 Liter PBS dialysiert, danach wurde er mit wenig PBS verdünnt, um 1 ml zu bilden, d. h. um die anfängliche Lipidkonzentration wiederherzustellen (etwa 20 mg/ml). Dann wurde die dialysierte Probe mit 9 ml Humanplasma gemischt und zur Inkubation auf 37°C erhitzt. Das in die Trägerflüssigkeit abgegebene Iod wurde nach verschiedenen Inkubationszeiten (siehe folgende Tabelle) mittels HPLC bestimmt. Die Ergebnisse, ausgedrückt in Form von Prozent des ursprünglichen Iods, das im Zeitverlauf freigesetzt wurde, werden in der folgenden Tabelle für Proben der (A)-, (B)- und (C)-Liposompräparationen in Plasma (Pl) und in PBS als Kontrolle angegeben.
Die vorherigen Ergebnisse zeigen, dass die Stabilität der Vesikel erhöht und die Durchlässigkeit der Liposommembran gegen Lecken verringert wird, wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen Teil der zur Herstellung der Liposome verwendeten Phospholipide sind.

Claims

Phosphatidylverbindungen gemäß der allgemeinen Formel
in der R₁ und R₂ Phospholipidfettsäurereste sind und A eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette der Formel -(CH₂)_n-, in der n eine ganze Zahl von 5 bis 14 ist, und/oder eine cycloaliphatische Kohlenwasserstoffkette ist, gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy- und/oder weitere Carboxylfunktionen.
Verbindungen nach Anspruch 1, in denen n eine ganze Zahl von 5 bis 10 ist.
Verbindungen nach Anspruch 2, in denen n eine ganze Zahl von 6 bis 8 ist.
Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, bei dem man eine Phosphatidsäure der Formel R₁COO-CH₂-CH(OOCR₂)-CH₂-O-PO₃H (II) mit einem Säurealkohol HO-A-COOH, dessen Säurefunktion vorübergehend geschützt ist, verestert und man anschließend die Schutzgruppe entfernt.
Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, bei dem man eine Bromsäure Br-A-COOH mit dem Silbersalz einer Phosphatidsäure gemäß Formel (II) umsetzt.
Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, bei dem man ein freies -OH von einer Phosphatidsäure gemäß Formel (II) schützt, man das Produkt mit einem Brom Br-A-COOBzl umsetzt und man das erhaltene Produkt entschützt.
Liposomvesikel enthaltend Phosphatidylverbindungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3.
Gefriergetrocknetes Phospholipidpulver enthaltend Phosphatidylverbindungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3.
Wäßrige Suspensionen von Liposomen gemäß Anspruch 7.
Therapeutisches Mittel oder Kontrastmittel enthaltend wäßrige Suspensionen von Liposomen gemäß Anspruch 9.
Verwendung des gefriergetrockneten Pulvers gemäß Anspruch 8 zur Herstellung von Liposomen mit verbesserter Stabilität und Einschlußkapazität.
Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 in Mischung mit anderen Phospholipiden zur Herstellung von Liposomen mit verbesserter Stabilität und Einschlußkapazität.