DE60133448T2

DE60133448T2 - Von Pflanzen abgeleitete Zusammensetzung mit akarizider Aktivität

Info

Publication number: DE60133448T2
Application number: DE60133448T
Authority: DE
Inventors: Young-Joon Songpa-gu Ahn; Young-Soo Dongjak-gu Kim; Soon-Il Suwon-shi Kim; Hyun-Kyung Kim
Original assignee: Naturobiotech Co Ltd Suwon; Naturobiotech Co Ltd
Current assignee: Naturobiotech Co Ltd Suwon; Naturobiotech Co Ltd
Priority date: 2000-12-23
Filing date: 2001-02-05
Publication date: 2009-05-07
Anticipated expiration: 2021-02-06
Also published as: JP3597479B2; JP2002193723A; KR100350391B1; WO2002051247A1; ATE390844T1; EP1216617A2; DE60133448D1; EP1216617A3; EP1216617B1; KR20010044177A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(a) Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine akarizide (milbentötende) Zusammensetzung, die aus Pflanzen isoliert wurde, und insbesondere eine akarizide Zusammensetzung, die Rohextrakte aus Pflanzen und chemische Verbindungen umfasst.
(b) Beschreibung des Stands der Technik
Milben sind ein erheblicher Grund von Allergien, und sie verursachen insbesondere bronchiales Asthma und Nasenentzündung (Maunsell, K., D. C. Wratith und A. M. Cunnington. 1968. Mites and house dust allergy in bronchial asthma. Lancet 1: 1267–1270). Milben, die zur Pyroglyphidae Familie gehören, wohnen im Staub (Voorhorst, R., M. I. A. Spieksma-Boezeman und F. Th. Spieksma. 1964. A mite Dermatophagoides spp. is the Producer of the house dust allergen. Allerg. Asthma 10(6): 329–334). Dermatophagoides pteronyssinus, D. farinae, D. microceras und Euroglyphus maynei verursachen atrophobe Symptome, wie z. B. bronchiales Asthma, Nasenentzündung und Ekzem (International Workshop Report. 1989. Dust mite allergens and asthma – a worldwide Problem. The Journal of Allergy and Clinical Immunology 83: 416–427; International Workshop Report. 1992. Dust mite allergens and asthma; Report of a second international Workshop. The Journal of Allergy and Clinical Immunology 89: 1046–1060).
Seit kurzem haben Veränderungen der Lebensumgebungen, wie z. B. der Anstieg der Anzahl von Appartement-Haushalten mit installierter Zentralheizung, Raumheizung und Teppichen zu einer optimalen Umgebung für Milben beigetragen, womit sie sich schnell sehr stark vermehren und die vier Jahreszeiten im Haus überleben können. In Korea wird von vier Arten von Milben berichtet und die gängigsten sind Dermatophagoides pteronyssinus und Dermatophagoides farinae.
Man hat Hausstaubmilben in Teppichen, Kleidern, Möbeln, Matratzen und Bettwäsche gefunden. Hausstaubmilben sind nicht nur in temperierten Bereichen, sondern sind in nahezu allen Plätzen eines Hauses verteilt (de Boer, R. 1991. An indirect effect of cleaning an house-dust mites (Dermatophagoides spp.) in carpets. The acari: reproduction, development, and life history strategies. New York. Chapman and Hall. p. 517–518).
Hausstaubmilben sind photophob und sie benötigen eine geeignete Temperatur, Luftfeuchtigkeit und abgeschälte Hautschuppen als eine Nahrungsquelle. Um Hausstaubmilben zu kontrollieren, existieren Verfahren zum Staubreinigen von Häusern, zum Sterilisieren von Möbeln, Kleidungsstücken und Teppichen, wobei Staub bis 70°C existiert, oder zur Regulierung der Temperatur und der Luftfeuchtigkeit. Diese Verfahren sind in ihrer Anwendung begrenzt und es ist schwierig, die Milben aus einem Haus zu entfernen.
Es ist berichtet worden, dass Lindan, Pirimiphos-Methyl, Benzylbenzoat, Dibutylphthalat und Diethyl-m-toluamid eine akarizide Wirkung haben (Hellet-Haupt A. und J. R. Buseine. 1974. Tests of acaricides against house dust mites (Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae). J. Med. Entomol. 2(5): 551–558). Lindan ist das wirksamste und langlebigste Akarizid, aber aufgrund der Toxizität ist dessen Verwendung für Wohnungen beschränkt. Die zweitbeste akarizide Verbindung unter den oben genannten Verbindungen, Pirimiphos-Methyl, hat eine geringe Toxizität gegenüber Säugetieren und es ist in der Praxis verwendet worden, um Milben zu kontrollieren, die in gelagertem Korn wohnen. Mitchell (Mitchell, E. B., S. Wilkins, J. McCallum Deighton and T. A. E. Platts-Mills. 1985. Reduction of house dust mite allergen levels in the home: use of the acaricide, pirimiphos methyl. Clin. Allergy 15: 234–240) berichtete, dass Pirimiphos-Methyl 60% der Milben, die in Teppichen wohnen, und 50% der Milben, die in Stühlen wohnen, kontrollieren konnte.
Seit kurzem sind Verbindungen, die als Akarizide verwendet werden, Benzylbenzoat, Paragerm, usw. (Penaud, A., J. Nourrit, P. Timon-David und J. Charpid. 1977. Results of a controlled trial of the acaricide paragerm an Dermatophagoides spp. In dwelling houses. Clin. Allergy 7: 49–53; Schober, G., G. Wetter, E. Bischoff, J. E. M. H. van Bronswijk and F. M. Kniest. 1987. Control of house dust mites (Pyroglyphidae) with home disinfectants. Exp. Appl. Acarol. 3: 179–189).
Die Kontrolle von Milben war zuallererst von chemischen Akariziden abhängig. Die Verwendung dieser Akarizide hat jedoch eine Milbenresistenz verursacht, und insbesondere sind Milben der Pyroglyphidae Spezies entdeckt worden, die eine Resistenz gegenüber sowohl DDT als auch Lindan gezeigt haben (Bronswijk, J. E. M. H. van, J. M. C. P. Schonen, M. A. F. Berli and F. S. Lukoschus. 1971. On the abundance of Dermatophagoides pteronyssinus (Trouessart. 1897) (Pyroglyphidae: Acarina) in house dust. Res. Popul. Ecol. 8: 67–79). Deshalb ist auf der ganzen Welt Forschung unternommen worden, um Alternativen für diese Mittel zu finden. Um natürliche Akarizide zu entwickeln, ist eine große Anstrengung auf pflanzliche Materialien gerichtet worden, die für Volksheilmittel als auch aromatische Verbindungen mit angenehmem Geruch verwendet wurden (Miyazaki, Y., M. Yatagai und M. Takaoka. 1989. Jpn. J. Biometeor. 26: 105–108; Watanabe, F., S. Tadaki, M. Takaoka, S. Ishino und I. Morimoto. 1989. Killing Activities of the volatiles emitted from essential oils for Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae and Tyrophagus putrescentiae. Syoyakugaku Zasshi 43: 163–168; Yatagai, M. und S. Morita. 1991. Extractives from Yakusugi bogwood and their termicidal activity and growth regulation effects an plant seeds. Mokuzai Gakkishi J. Japan Wood Res. Soc. 37: 345–351; Morita, S., M. Yatagai und T. Ohira. 1991. Antimite and antifungal activities of the hexane extracts from Yakusugi bogwood. Journal of the Japan Wood Research Soc. 37(4): 352–357).
WO-A-01/00033 offenbart eine Pestizidzusammensetzung zur Kontrolle von Hausstaubmilben, die in einer Mischung mit einem geeigneten Träger mindestens eine essentielle Pflanzenölverbindung oder Derivate davon umfasst, die aus Amylzimtaldehyd, Zimtaldehyd und Zimtalkohol und Ähnlichem ausgewählt werden.
EP-A-0 428 276 offenbart eine akarizide Zusammensetzung, die aus Alkylcinnamat, Allylcinnamat, Cinnamylacetat, Cinnamylpropionat, Cinnamylbutyrat und Ähnlichem ausgewählt wird.
CA, AN:132:233050 & JP-A-095604 offenbaren eine akarizide Zusammensetzung, die eine ölige Duftsubstanz oder einen Pflanzenextrakt auf sublimierbaren Trägern umfasst.
CA, AN:115:201141 & JP-A-03 066602 offenbart eine akarizide Aktivitätszusammensetzung, die ein Zimtaldehyd und/oder 3-Phenylpropanal umfasst.
WPI, AN 1999-210703 & JP-A-11-049623 offenbart einen akariziden, wasserabstoßenden Stoff, der Zimtblattöl als eine Hauptkomponente umfasst.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die aus drei Heilpflanzen und drei ätherischen Ölen mit akarizider Aktivität zusammengesetzt ist.
Für dieses Ziel stellt die vorliegende Erfindung ein Akarizid bereit, das eine oder mehrere Verbindungen umfasst, die aus der Gruppe, die aus Paeonia suffruticosa, Cnidium officinale und Cinnamomum cassia besteht, ausgewählt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Akarizid bereit, das eine oder mehrere Verbindungen umfasst, die aus der Gruppe, die aus Hexanextrakten oder Chloroformextrakten, die mit Methanol oder Chloroform isoliert wurden, von Methanolextrakten von Cinnamomum cassia besteht, ausgewählt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Akarizid bereit, das eine oder mehrere Verbindungen umfasst, die aus der Gruppe, die aus trans-Zimtaldehyd (Formel 1), Zimtalkohol (Formel 2) und Salicylaldehyd (Formel 3) besteht, ausgewählt werden.
[Formel 1]
[Formel 2]
[Formel 3]
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Akarizid bereit, das eine oder mehrere Verbindungen umfasst, die aus der Gruppe, die aus trans-Zimtaldehyd-Derivaten, Zimtalkohol- Derivaten und Salicylaldehyd-Derivaten besteht, ausgewählt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Flussdiagramm der Trennschritte, die die Akarizid-wirksamen Verbindungen aus dem Hexanteil der Methanolextrakte von Cinnamomum cassia isolieren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben Pflanzen auf ihre akarizide Aktivität untersucht und haben herausgefunden, dass Paeonia suffruticosa, Cnidium officinale und Cinnamomum cassia akarizide Aktivität haben. Der hier verwendete Begriff „akarizide Aktivität" bedeutet, Milben zu töten. Die vorliegende Erfindung misst akarizide Aktivität gegenüber Dermatophagoides pteronyssinus und Dermatophagoides farinae, welche die bedeutendsten Milben in Korea als auch auf der ganzen Welt sind.
Methanolextrakte wurden von Paeonia suffruticosa, Cnidium officinale und Cinnamomum cassia erhalten. Die oben genannten drei Materialien haben akarizide Aktivität für zwei Spezies von Hausstaubmilben bestätigt.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Kontrolle von Milben bereit. Es ist bevorzugt, dass die Zusammensetzung aus der Gruppe, die aus Paeonia suffruticosa, Cnidium officinale und Cinnamomum cassia besteht, ausgewählt wird. Das Cinnamomum cassia kann durch Zimt ersetzt werden. Insbesondere beinhalten die Zusammensetzungen ein oder mehrere Extrakte, die aus der Gruppe, die aus Methanolextrakten von Paeonia suffruticosa, Methanolextrakten von Cnidium officinale und Methanolextrakten von Cinnamomum cassia besteht, ausgewählt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Akarizid zur Kontrolle von Milben bereit, das aus den oben genannten Heilpflanzen, ätherischen Ölen und Extrakten dieser Pflanzen hergestellt wird. Das Akarizid enthält ebenfalls die Pflanzen- oder Methanolextrakte und kann Materialien enthalten, die zu einem bekannten Insektizid hinzugegeben werden. Die Menge der Methanolextrakte in dem Akarizid für Milben reicht von ungefähr 0.01% bis 70%. Die Menge der Methanolextrakte wird aber bevorzugt für die Verwendung angepasst, z. B. der Art des Akarizids und des Verfahrens zur Berieselung des Akarizids. Das Akarizid der vorliegenden Erfindung kann als ein Spray, eine Lösungssalbe und ein Festsalbengel oder Rauch formuliert werden.
Das Methanolextrakt von Cinnamomum cassia wird ebenfalls weiter durch Verwendung von Hexan, Chloroform, Ethylacetat und Butanol isoliert. Es wurde bestätigt, dass die Hexan- und Chloroform-Fraktionen akarizide Aktivität haben. Somit können Hexan- und Chloroform-Fraktionen in einer Zusammensetzung zur Kontrolle von Milben und in einem Insektizid angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls trans-Zimtaldehyd, Zimtalkohol und Salicylaldehyd bereit, die aus Cinnamomum cassia isoliert wurden. Diese drei Fraktionen haben akarizide Aktivität. Das trans-Zimtaldehyd ist die Verbindung nach Formel 1, der Zimtalkohol ist die Verbindung nach Formel 2 und das Salicylaldehyd ist die Verbindung nach Formel 3.
[Formel 1]
[Formel 2]
[Formel 3]
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Akarizid bereit. Es ist möglich, jeweils trans-Zimtaldehyd, Zimtalkohol und Salicylaldehyd alleine oder alle zusammen zu verwenden. Die Mischung, die trans-Zimtaldehyd, Zimtalkohol und Salicylaldehyd enthält, hat eine synergistische Wirkung zur Kontrolle von Milben verglichen mit der alleinigen Verwendung jeder Verbindung, deshalb ist es bevorzugt, eine Mischung von trans-Zimtaldehyd, Zimtalkohol und Salicylaldehyd zu verwenden.
Das Akarizid der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls weiter andere Materialien enthalten, die als gewöhnliche Insektizide angewendet werden. Ein gut bekanntes, pyrethroides Akarizid ist ein synthetisches Derivat, das aus einer Verbindung der Blume Chrysanthemum cinerariefolicum hergestellt wird, und es hat eine geringere Photolysewirkung und eine höhere Toxizität als das Ursprungsmaterial. Es ist bevorzugt, dass ein Akarizid eine oder mehrere Verbindungen in einer Menge, die von 0.01% bis 70% reicht, enthält, die aus der Gruppe, die aus trans-Zimtaldehyd, Zimtalkohol und Salicylaldehyd besteht, ausgewählt werden. Es ist jedoch angemessen, die Menge an trans-Zimtaldehyd, Zimtalkohol und Salicylaldehyd gemäß des Anwendungsverfahrens des Akarizids und seiner Formulierung zu regulieren.
In der vorliegenden Erfindung werden trans-Zimtaldehyd, Zimtalkohol und Salicylaldehyd ebenfalls als Substrate verwendet, um ein Derivat mit gesteigerter akarizider Aktivität und einem Ausrottungsspotential gegenüber einer großen Anzahl von Arthropoden durch Modifikation der Struktur von trans-Zimtaldehyd, Zimtalkohol und Salicylaldehyd zu entwickeln. Die Derivate sind neue Verbindungen, die durch Hinzufügen oder Entfernen von OH^– oder anderen chemischen Strukturen der bekannten Verbindungen, die spezielle Aktivität haben, erhalten werden, sie haben nicht die Probleme, die mit den bekannten Verbindungen verbunden sind, und sie halten eine hohe Aktivität bei.
Deshalb stellt die vorliegende Erfindung ein Akarizid bereit, das trans-Zimtaldehyd-Derivate, Zimtalkohol-Derivate oder Salicylaldehyd-Derivate umfasst.
Das Akarizid der vorliegenden Erfindung wird durch ein Räuchermittel oder ein Kontaktverfahren auf Milben angewendet. Die Extrakte und aktiven Verbindungen, die sich von Cinnamomum cassia ableiten, dessen Derivate und aktive Verbindungen von Senföl und Meerrettichöl, können auf gesundheitsschädliche Arthropoden angewendet werden, um diese zu töten.
Die vorliegende Erfindung wird mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele detaillierter beschrieben werden.
[Beispiel 1] Herstellung einer Probe und Pflanzen und Öle mit akarizider Aktivität
Die Methanol-Extrakte
300 g Paeonia suffruticosa, Cnidium officinale und Cinnamomum cassia wurden unter Verwendung eines Mixers fein gepulvert und das Resultat wurde mit 500 ml Methanol für 3 Tage in einem 500 ml Erlenmeyerkolben gemischt und zweimal mit Methanol bei Raumtemperatur extrahiert und gesammelt. Die vereinigten Filtrate wurden im Vakuum bei 35°C aufkonzentriert.
[Test 1]
Testmilben
Zwei Arten von Milben wurden für die akarizide Aktivität verwendet. Die amerikanische Hausstaubmilbe (Dermatophagoides farinae) und die Europäische Hausstaubmilbe (Dermatophagoides pteronyssinus) wurden bei 75 ± 5% RH (relative Luftfeuchtigkeit) bei 25 ± 1°C gepflegt und ihnen wurde eine Nahrungsmischung aus Fischmehl und Multivitaminen in einem Verhältnis von 1 zu 1 in einem 12.5 × 10.5 × 5 cm Behälter bereitgestellt.
Test der akariziden Aktivität
Die Startkonzentration ist wichtig für das erstmalige Screenen von bioaktiven Verbindungen von Pflanzenextrakten und -ölen. In der vorliegenden Erfindung wurden die Konzentrationen von Verbindungen auf spezifische Verhältnisse in einem 2 ml Mikroröhrchen mit 1 mg der Verbindungen für verschiedene Tests festgelegt, und die Milben wurden mit einem Mikroskop beobachtet. 1 mg der Methanolextrakte oder -öle wurde mit 40 μl Methanol suspendiert und wurde in ein farbloses Mikroröhrchen (2 ml) transferiert. Das Mikroröhrchen wurde vertikal mehrere Male geschüttelt, um die Inhaltsstoffe an der Wand und dem Verschluss des Mikroröhrchens zu dispergieren, und es wurde für 1 Stunde in einen Gefriertrockner gegeben, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Fünfundzwanzig Milben wurden auf das präparierte Mikroröhrchen gegeben und alle Behandlungsgruppen wurden in einen Inkubator transferiert, der bei 25 ± 1°C gehalten wurde. Aktive Milben wurden nur mit einem feinen Pinsel unter einem Mikroskop ausgewählt. Die Sterblichkeiten wurden mit einem Mikroskop 24 Stunden und 48 Stunden nach der Behandlung bestimmt. Die Milben wurden als tot angesehen, wenn sich die Extremitäten nicht bewegten, wenn sie mit einem feinen Pinsel angestupst wurden. Alle Tests wurden vier oder mehrere Male wiederholt. Der Sterblichkeitsprozentsatz wurde bestimmt und zur Bestimmungen von Abweichungen (ANOVA) in arcsin-Quadratwurzel-Werte transformiert. Die Behandlungsmittel wurden verglichen und durch Scheffe's-Test bei P = 0.05 getrennt (SAS Institute, 1996). Mittelwerte (± Standardabweichung) von nicht transformierten Daten wurden angezeigt. Die Kontrollen erhielten 40 μl Methanol.

Tabelle 1 zeigt die akarizide Aktivität der Methanol-Extrakte und -öle. [Tabelle 1]

Pflanze	Sterblichkeit (Durchschnittswert ± Standardabweichung, %)
	D. farinae		D. pteronyssinus
	24 Std.	48 Std.	24 Std.	48 Std.
Paeonia suffruticosa	98,3 ± 1,7	100	100	-
Cinnamomum cassia	100	-	100	-
Cnidium officinale	88,3 ± 6,0	95,5 ± 5,0	91,7 ± 4,4	98,3 ± 1,7
Zimtöl (C. cassia)	100	-	100	-

Durchschnittswert, gefolgt von dem gleichen Buchstaben in der Spalte sind nicht signifikant unterschiedlich (P = 0,05, Scheffe's-Test). Die Sterblichkeiten wurden vor ANOVA in arcsin-Quadratwurzel-Werte transformiert. Durchschnittswerte (± Standardabweichung) von nicht transformierten Daten wurden angezeigt.
Die akarizide Aktivität, die in Tabelle 1 gezeigt ist, wurde aus der Behandlung mit 1 mg der Methanolextrakte oder -öle in einem 2 ml Mikroröhrchen erhalten, und die Zeit ist die Zeit, die nach der Behandlung mit den Methanolextrakten und -ölen verstrichen ist. Die Tests der Tabelle 1 wurden fünfmal wiederholt.
Alle Methanolextrakte und -öle, mit Ausnahme von Cnidium officinale, hatten 48 Stunden nach der Behandlung eine starke akarizide Aktivität von 100% gegenüber zwei Spezies von Hausstaubmilben. Insbesondere hatte Cinnamomum cassia und Zimtöl hatten 24 Stunde nach der Behandlung 100% akarizide Aktivität gegenüber Milben.
[Beispiel 2]
Die Akarizid-Verbindungen der Methanolextrakte von Cinnamomum cassia, die nach Beispiel 1 hergestellt wurden, wurden isoliert und gereinigt. 20 g der Methanolextrakte wurden in 800 ml destilliertem Wasser und 800 ml n-Hexan suspendiert. Die Mischung wurde in einen Scheidetrichter (2 ml) transferiert, verschlossen und nach gutem Schütteln wurde sie in einen Wasserteil und einen Hexanteil getrennt. Nach 30 min wurde ein erster Hexanteil unter Verwendung eines anderen Scheidetrichters getrennt. Der Wasserteil wurde mit 800 ml Hexan gemischt und in einen zweiten Hexanteil auf die gleiche Art und Weise getrennt. Der restliche Wasserteil wurde mit 800 ml Chloroform gemischt, verschlossen und nach gutem Schütteln wurde er in einen Wasserteil und einen Chloroformteil getrennt. Nach 30 min wurde ein erster Chloroformteil abgetrennt. Der Wasserteil wurde mit 800 ml Chloroform gemischt und auf die gleiche Art und Weise wie beim Trennen des Hexanteils in einen zweiten Chloroformteil getrennt. Der restliche Wasserteil wurde mit 800 ml Ethylacetat gemischt und zweimal in einen Ethylacetatteil auf die gleiche Art und Weise wie beim Trennen des Hexanteils getrennt. Der restliche Wasserteil wurde mit 800 ml Butanol gemischt und auf die gleiche Art und Weise in einen Butanolteil getrennt. Ein Hexanteil, ein Chloroformteil, ein Ethylacetatteil, ein Butanolteil und ein Wasserteil wurden durch das oben genannte Trennverfahren erhalten. Der Wasserteil wurde in einem Gefriertrockner aufkonzentriert und der Hexanteil, der Chloroformteil, der Ethylacetatteil und der Butanolteil wurden in einem EYELA Autojack NAJ-160 (Japan) aufkonzentriert.

Die Sterblichkeit wurde bestimmt indem viermal Test 1 über den konzentrierten Anteil durchgeführt wurde, und ist in Tabelle 2 gezeigt. [Tabelle 2]

Teil	Anzahl der behandelten Milben	Sterblichkeit (Durchschnittswert ± Standardabweichung, %)
		D. pteronyssinus		D. farinae
		24 Std.	48 Std.	24 Std.	48 Std.
Hexanteil	100	100a	100a	100a	100a
Chloroformteil	100	100a	100a	100a	100a
Ethylacetatteil	100	2,7 ± 2,7b	2,7 ± 2,7b	4,0 ± 2,3b	5,3 ± 1,3b
Butanolteil	100	5,3 ± 1,3b	6,7 ± 1,3b	6,7 ± 1,3b	6,7 ± 1,3b
Wasserteil	100	2,7 ± 1,3b	4,0 ± 0b	2,7 ± 2,7b	4,0 ± 2,3b
Kontrolle	100	0b	0b	0b	0b

Durchschnittswerte gefolgt von dem gleichen Buchstaben in der Spalte sind nicht signifikant unterschiedlich (P = 0,05, Scheffe's-Test). Die Sterblichkeiten wurden vor ANOVA in arcsin-Quadratwurzel-Werte transformiert. Durchschnittswerte (± Standardabweichung) von untransformierten Daten wurden angezeigt.
Gemäß Tabelle 2 haben der Hexanteil und der Chloroformteil 100% akarizide Aktivität gegenüber zwei Arten von Milben.
[Beispiel 3] Isolierung einer akariziden Verbindung
Zwischen dem Hexanteil und dem Chloroformteil, die nach Beispiel 2 hergestellt wurden, wurden die akariziden Verbindungen aus dem Hexanteil isoliert. 1 zeigt das Verfahren, das die aktiven Verbindungen des Hexanteils, der sich von Cinnamomum cassia Borke ableitet, isoliert.
1. Chromatographie
Der Hexanteil (10 g) wurde auf einer Silicagelsäule (Merck 70–230 Mesh, 600 g, 5,5 i. d. × 70 cm) chromatographiert und nacheinander mit einem schrittweisen Gradienten von Hexan-Ethylacetat eluiert. Die Verhältnisse von Hexan zu Ethylacetat, die in dem schrittweisen Gradienten verwendet wurden, waren 100:1, 99:1, 95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 und 0:100, und die Fraktionen eines jeden Verhältnisses wurden als H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7 bzw. H8 gesammelt. Die acht Fraktionen wurden bezüglich ihrer Milbenkontrollwirkungen durch den Akarizid-Test von Test 1 getestet und als ein Ergebnis wurden die drei Fraktionen H2 (40,1% Ausbeute), H3 (4,2% Ausbeute) und H6 (8,8% Ausbeute), die akarizide Aktivität hatten, isoliert. Jede Fraktion wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) analysiert und Fraktionen mit einem vergleichbaren TLC-Muster wurden gesammelt.
2. Chromatographie
Die aktiven Fraktionen, die aus der 1. Silicagel-Chromatographie isoliert wurden, wurden erneut chromatographiert.
Die H2, H3 und H6 Fraktionen wurden auf einem Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatograph (Spectra System P2000, Thermo Separation Products, USA) isoliert.
Die H2 wurde mit Hexan-Ethylacetat (9:1) mit einer Flussrate von 4,0 ml/min eluiert. Die Säule war eine μ Porasil Silica (19 × 300 mm, Waters) und detektierte bei 260 nm. Die drei Fraktionen H21, H22 und H23 wurden erhalten und man hat herausgefunden, dass die H23 Fraktion die aktive Fraktion war, eine Verbindung I. Die H3 Fraktion wurde mit Hexan-Ethylacetat (8:2) auf HPLC eluiert. H31, H32, H33 und H34 wurden erhalten und man hat herausgefunden, dass die H32 Fraktion aktiv war.
Die H6 Fraktion wurde mit Hexan-Ethylacetat (7:3) auf HPLC eluiert. H61, H62 und H63 wurden erhalten und man hat herausgefunden, dass die H62 Fraktion eine Verbindung II war.
3. Chromatographie
Die aktive H32 Fraktion, die durch die zweite Chromatographie hergestellt wurde, wurde weiter isoliert.
Die H32 Fraktion wurde mit Hexan:Ethylacetat (10:1) durch eine Silicagel-Chromatographie eluiert und die aktive Fraktion H322 und die inerten Fraktionen H321, H322, H323 und H324 wurden isoliert.
4. Chromatographie
Die aktive H322 Fraktion, die durch die dritte Chromatographie hergestellt wurde, wurde weiter isoliert.
Die H322 Fraktion wurde mit Hexan:Ethylacetat (25:1) durch Silicagel-Chromatographie eluiert und die aktive Fraktion H3223 und die inerten Fraktionen H3221, H3222 wurden isoliert.
5. Chromatographie
Die aktive H3223 Fraktion, die durch die vierte Chromatographie hergestellt wurde, wurde weiter isoliert.
Die H3223 Fraktion wurde mit Chloroform:Methanol (5:1) durch Silicagel-Chromatographie eluiert und die aktive Fraktion H32232 wurde isoliert.
6. Chromatographie
Die aktive H32232 Fraktion, die durch die 5. Chromatographie hergestellt wurde, wurde weiter isoliert.
Die H32232 Fraktion wurde mit Chloroform:Methanol (30:1) durch Silicagel-Chromatographie eluiert und die aktive Fraktion H322322 wurde isoliert.
Die H322322 Fraktion wurde mit Hexan:Ethylacetat (100:1) auf Porasil Silica (19 × 300 mm, Waters) mit einer Fließgeschwindigkeit von 4,0 ml/min eluiert, wobei die Absorption bei 260 nm war. Die drei Fraktionen H3223221, H3223222, H3223223 wurden erhalten und man hat herausgefunden, dass die H3223223 Fraktion Verbindung III war.
Analyse der aktiven Verbindungen
Die strukturelle Bestimmung der aktiven Fraktionen (Verbindung I, Verbindung II, Verbindung III), die aus Beispiel 3(a), (b) und (c) isoliert wurden, wurde durch Spektralanalysen durchgeführt. ¹H- und ¹³C-NMR Spektren wurden in Deuterochloroform mit einem Bruker AM-500 Spektrometer bei 400 bzw. 100 MHz aufgenommen. EI-MS Spektren wurden auf einem JEOL JMS-DX 30 Spektrometer erhalten.
[Test 2] Die aktiven Verbindungen von Beispiel 3 wurden unter der Verwendung der direkten Kontaktanwendung gemessen.
Akarizid-Test

(a) Die akarizide Aktivität von trans-Zimtaldehyd, Zimtalkohol und Salicylaldehyd, die in Cinnamomum cassia enthalten sind, wurde durch die direkte Kontaktanwendung bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 und Tabelle 4 gezeigt.

[Tabelle 3]

Konz. (mg/Röhrchen)	Sterblichkeit (Durchschnittswerte ± Standardabweichung, %)
	trans-Zimtaldehyd		Zimtalkohol		Salicylaldehyd
	24 Std.	48 Std.	24 Std.	48 Std.	24 Std.	48 Std.
1	100a	100a	99,0 ± 1,0a	100a	100a	100a
0,5	84,0 ± 5,2a	94,0 ± 2,6a	90,0 ± 2,6a	97,0 ± 1,9a	89,0 ± 5,2a	92,0 ± 1,6a
0,4	33,0 ± 2,5b	42,0 ± 4,2b	56,0 ± 2,8b	62,0 ± 2,6b	44,0 ± 2,8b	46,0 ± 2,6b
0,3	25,0 ± 2,5bc	32,0 ± 2,8b	35,0 ± 2,5c	40,0 ± 3,7b	22,0 ± 2,6c	27,0 ± 2,5c
0,25	9,0 ± 1,9cd	10,0 ± 2,6bc	15,0 ± 1,9d	14,0 ± 2,6c	7,0 ± 3,0d	8,0 ± 2,8d
0,2	7,0 ± 1,0cd	9,0 ± 1,0c	6,0 ± 1,2d	10,0 ± 1,2c	6,0 ± 1,1d	9,0 ± 1,0d
0,125	6,0 ± 3,5d	9,0 ± 2,5c	1,0 ± 1,0e	3,0 ± 1,9d	0e	0e
Kontrolle	0e	0d	0e	0d	0e	0e

Durchschnittswerte gefolgt von dem gleichen Buchstaben in der Spalte sind nicht signifikant unterschiedlich (P = 0,05, Scheffe's-Test). Die Sterblichkeiten wurden vor ANOVA in arcsin-Quadratwurzel-Werte transformiert. Durchschnittswerte (± Standardabweichung) von nicht transformierten Daten wurden angezeigt.

Tabelle 3 zeigt die akarizide Aktivität gegenüber D. pteronyssinus in dem Akarizid-Test bei 1,0 mg und die akarizide Aktivität aller aktiven Verbindungen war 100%, 48 Stunden nach der Behandlung. Nach 24 Stunden hatte bei 0,5 mg trans-Zimtaldehyd 84% akarizide Aktivität, Zimtalkohol hatte 90% akarizide Aktivität und Salicylaldehyd hatte 89,0% akarizide Aktivität. Aber bei 0,4 mg oder weniger gab es keine signifikante akarizide Aktivität. [Tabelle 4]

Konz. (mg/Röhrchen)	Sterblichkeit (Durchschnittswerte ± Standardabweichung, %)
	trans-Zimtaldehyd		Zimtalkohol		Salicylaldehyd
	24 Std.	48 Std.	24 Std.	48 Std.	24 Std.	48 Std.
1	99,0a^c	100a	99,0 ± 1,0a	100a	100a	100a
0,5	94,0 ± 2,6a	96,0 ± 2,3a	90,0 ± 2,6a	97,0 ± 1,9a	99,0 ± 1,0a	100a
0,4	41,0 ± 2,5b	45,0 ± 2,5b	58,0 ± 2,6b	65,0 ± 1,9ab	44,0 ± 2,8b	48,0 ± 2,8b
0,3	32,0 ± 1,6bc	39,0 ± 2,5bc	39,0 ± 2,6b	45,0 ± 1,9b	27,0 ± 1,9c	37,0 ± 1,9bc
0,25	21,0 ± 2,5cd	30,0 ± 8,7bc	10,0 ± 3,8c	10,0 ± 4,1c	26,0 ± 2,0c	34,0 ± 2,6bc
0,2	19,0 ± 2,5cd	29,0 ± 1,9bc	7,0 ± 1,0c	7,0 ± 1,0c	22,0 ± 1,2c	28,0 ± 1,6c
0,125	18,0 ± 2,6d	23,0 ± 3,4c	1,0 ± 1,0d	2,0 ± 1,2c	20,0 ± 1,6c	27,0 ± 3,8c
Kontrolle	0e	0d	0d	0d	0d	0d

Durchschnittswerte gefolgt von demselben Buchstaben in der Spalte sind nicht signifikant unterschiedlich (P = 0,05, Scheffe's-Test). Die Sterblichkeiten wurden vor ANOVA in arcsin-Quadratwurzel-Werte transformiert. Durchschnittswerte (± Standardabweichung) von nicht transformierten Daten wurden angezeigt.
Tabelle 4 zeigt die akarizide Aktivität gegenüber D. farinae. In dem akariziden Test bei 1 mg war die akarizide Aktivität aller aktiven Verbindungen 100%, 48 Stunden nach der Behandlung. Bei 0,5 mg hatte nach 24 Stunden trans-Zimtaldehyd 94,0% akarizide Aktivität, Zimtalkohol hatte 90,0% akarizide Aktivität und Salicylaldehyd hatte 99,0% akarizide Aktivität. Aber bei 0,3 mg und weniger gab es keine signifikante akarizide Aktivität.
[Beispiel 4]
Um den synergistischen Effekt für die drei Arten von akariziden Verbindungen, die durch Beispiel 3 hergestellt wurden, zu bestätigen, wurde eine Konzentration, die keine akarizide Aktivität hatte, bestimmt. Bis zu 0,25 mg gab es keine akarizide Aktivität für die beiden Arten von Hausstaubmilben, wobei somit der synergistische Effekt bei 0,25 mg gemessen wurde.
Eine Mischung wurde durch Mischen in einem Verhältnis von 1 zu 1 von 0,25 mg jeder aktiven Verbindung wie folgt hergestellt.

(1) trans-Zimtaldehyd + Zimtalkohol
(2) trans-Zimtaldehyd + Salicylaldehyd
(3) Salicylaldehyd + Zimtalkohol
(4) trans-Zimtaldehyd + Zimtalkohol + Salicylaldehyd

Der synergistische Effekt der Mischungen wurde für ihre akarizide Aktivität gegenüber D. farinae und D. pteronyssinus getestet. Tabelle 7 zeigt die synergistischen Effekte. [Tabelle 7]

Mischung	Konz. (mg/ Röhrchen)	Sterblichkeit (Durchschnittswerte ± Standardabweichung, %)
		D. farinae		D. pteronyssinus
		24 Std.	48 Std.	24 Std.	48 Std.
trans-Zimtaldehyd + Zimtalkohol	0,25 + 0,25	91,0 ± 3,4a	98,0 ± 0a	83,0 ± 1,0b	100a
trans-Zimtaldehyd + Salicylaldehyd	0,25 + 0,25	95,0 ± 1,9a	99,0 ± 0a	93,0 ± 2,5a	100a
Salicylaldehyd + Zimtalkohol	0,25 + 0,25	99,0 ± 1,0a	100a	95,0 ± 1,9a	100a
trans-Zimtaldehyd + Zimtalkohol + Salicylaldehyd	0,25 + 0,25 + 0,25	100a	-	99,2 ± 0,8a	100a
Benzylbenzoat	0,25	100a	Nein	88,8 ± 3,9b	Nein
Dibutylphthalat	0,25	92,0 ± 3,8a	Nein	95,2 ± 1,5a	Nein
DEET	0,25	96,8 ± 3,2a	Nein	16,8 ± 3,4c	Nein
Kontrolle	0b	0b	0d	0b	0b

Durchschnittswerte gefolgt von dem gleichen Buchstaben in der Spalte sind nicht signifikant unterschiedlich (P = 0,05, Scheffe's-Test). Die Sterblichkeiten wurden vor ANOVA in arcsin-Quadratwurzel-Werte transformiert. Durchschnittswerte (± Standardabweichung) von nicht transformierten Daten wurden angezeigt.
Nach 24 Stunden hatte jede der Mischungen eine starke akarizide Aktivität. Die Mischung (trans-Zimtaldehyd + Zimtalkohol + Salicylaldehyd) hatte den stärksten synergistischen Effekt gegenüber zwei Arten von Milben, 24 Stunden nach der Behandlung, aber nach 48 Stunden gab es keinen signifikanten Unterschied, wenn mit anderen Mischungen verglichen. Es wurde bestätigt, dass alle drei Arten von akariziden Verbindungen synergistische Effekte hatten.
Die aktiven Verbindungen wurden mit synthetischen organischen Verbindungen (Benzylbenzoat, Dibutylphthalat und DEET) verglichen, welche eine starke akarizide Aktivität haben. 0,25 mg jeder synthetischen organischen Verbindung wurde mit D. farinae und D. pteronyssinus behandelt und 24 Stunden nach der Behandlung hatte Benzylbenzoat 100% und 88,8% Sterblichkeit, hatte Dibutylphthalat 92,0% und 95,2% Sterblichkeit und hatte DEET 96,8% und 16,8% Sterblichkeit gegenüber D. farinae bzw. D. pteronyssinus. Deshalb lässt sich die akarizide Aktivität der Verbindungen, die sich von Cinnamomum cassia ableiten, gut mit der der synthetischen Verbindungen vergleichen.
Wie oben beschrieben haben Paeonia suffruticosa, Cnidium officinale und Cinnamomum cassia akarizide Aktivität.
Ebenso haben trans-Zimtaldehyd, Zimtalkohol und Salicylaldehyd akarizide Aktivität und wenn sie gemischt werden, haben sie einen synergistischen Effekt.

Claims

Verwendung eines Pflanzenextraktes als ein Akarizid, wobei der Pflanzenextrakt ein Methanolextrakt von Paeonia suffruticosa, Cnidium officinale oder Cinnamomum cassia ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Methanolextrakt durch Verwenden von Hexan getrennt wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Methanolextrakt durch Verwenden von Chloroform getrennt wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Pflanzenextrakt mit einem Lösungsmittel verdünnt wird, wobei das Lösungsmittel Hexan und Ethylacetat umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei das Pflanzenextrakt nacheinander durch das Lösungsmittel, das ein unterschiedliches Volumenverhältnis von Hexan und Ethylacetat umfasst, verdünnt wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei das Lösungsmittel 60–99 Vol.-% Hexan und 1–40 Vol.-% Ethylacetat umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei der Pflanzenextrakt weiter durch ein anderes Lösungsmittel verdünnt wird, wobei das Lösungsmittel Chloroform und Methanol umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Pflanzenextrakt eine Mischung von trans-Zimtaldehyd, Zimtalkohol und Salicylaldehyd umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1 bis 8, wobei das Akarizid als ein Spray, eine Lösungssalbe, ein Festsalbengel oder Rauch formuliert wird.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Akarizid für die Anwendung bei Hausstaubmilben ist.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Akarizid für die Anwendung bei Dermatophagoides piteronyssinus und Dermatophagoides farinae ist.