KR100496456B1 - 식물에서 추출한 살비제 조성물 - Google Patents

식물에서 추출한 살비제 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물에서 추출한 살비제 조성물에 관한 것으로, 보다 바람직하게는 천궁(Cnidium officinale) 추출물 또는 그 추출물에서 유래한 부틸리덴프탈라이드(butylidenephthalide)를 포함하는 살비제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 천궁 추출물 및 그 유래 화합물인 부틸리덴프탈라이드는 진드기에 대해 강한 살충력을 나타내며, 특히 부틸리덴프탈라이드는 집먼지진드기에 대해 더욱 강한 살비활성을 나타낸다.

Description

식물에서 추출한 살비제 조성물{ACARICIDE COMPOSITION DERIVED FROM PLANT}
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 식물에서 추출한 살비제(acaricide) 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 진드기에 살충력을 가지는 천궁 추출물과 천궁에서 분리된 화합물을 포함하는 살비제 조성물에 관한 것이다.
[종래 기술]
진드기는 주요한 알러지원이면서(van Bronswijk J. E. M. H.; Sinha R. N. Pyroglyphid mites (Acari) and house dust allergy. J. Allergy 1971, 47, 31-52; Fain, A.; Guerin, B.; Hart, B. J. Mite and Allergic Disease; Allerbio: Varennes en Argonne, France, 1990; 190 pp.), 갑작스런 유아의 사망을 일으키는 원인 인자(Helson, G. A. H. House-dust mites and possible connection with sudden infant death syndrome. N. Z. Med. J. 1971, 74, 209)이며, 이는 전세계적인 분포를 보이고 가옥내에 주로 서식한다(Pollart, S. M.; Ward, G. W. Jr.; Platts-Mills, T. A. E. House dust sensitivity and environmental control. Immunol. Allergy Clin. North Amer. 1987, 7, 447-461; Arlian, L. G. Biology and ecology of house dust mites, Dermatophagoides spp. and Euroglyphus spp. Immunol. Allergy Clin. North Amer. 1989, 9, 339-356).
최근에 중앙난방식 관리 방식의 아파트세대 증가, 밀폐환경, 보조 난방장치의 사용증가, 카펫 이용량의 증가 등의 주거환경이 변화되면서 진드기 생육에 최적조건을 부여하게 되었으며, 그로 인하여 진드기는 빠른 증식과 4계절 실내조건하에서 생존할 수 있게 되었다(Pollart, S. M.; Ward, G. W. Jr.; Platts-Mills, T. A. E. House dust sensitivity and environmental control. Immunol. Allergy Clin. North Amer. 1987, 7, 447-461).
집먼지진드기들 중에서 가장 중요한 2종으로 간주되는 것으로 큰다리먼지진드기(American house dust mite, Dermatophagoides farinae (Hughes))와 세로무늬먼지진드기(European house dust mite, D. pteronyssinus (Trouessart))가 있다.
또한 긴털가루진드기인 티로파구스 푸트레스센티애(Tyrophagus putrescentiae)는 진드기과(Acaridae)에 속하는 종으로 일반적으로 달걀, 햄, 치즈나 땅콩과 같은 높은 지질과 단백질 함량을 갖는 많은 저장곡물이나 가공 식품을 오염시키는 전세계적인 종이다(Hughes, A.M., 1976. The mites of stored food and houses. Technical Bulletin of the Ministry of Agriculture, Fisheries and Food. 9, 1-400; Sinha, R.B. 1979. Role of Acarina in stored grain ecosystem. Recent Adv. Acarol. 1, 263-273; Gulati, R., Mathur, S., 1995. Effect of Eucalyptus and Mentha leaves and Curcuma rhizomes on Tyrophagus putrescentiae (Schrank) (Acarina: Acaridae) in wheat. Experimental and Applied Acarology. 19: 511-518). 대개 이들은 오염시킨 곡물이나 식품의 표면에서 서식하지만 때때로 안쪽까지 침입하여 심각한 경제적인 손실을 야기하며(Zdarkova, E. Stored product acarology. 1991. In Modern Acarology, Vol 1.; Dusbabek, F., Bukva, V., Eds.;Academia:Prague. pp. 211-218), 소금에 절인 햄을 취급하는 농부들이나 작업자들에게 알러지를 일으키기도 한다.
이러한 집먼지진드기와 긴털가루진드기 개체군을 방제하기 위해 주로 γ-BHC, 피리미포스-메틸(pirimiphos-methyl), 벤질 벤조에이트(benzyl benzoate), 디에틸-m-톨루아미드(diethyl-m-toluamide: DEET), 디부틸 프탈레이트(dibutyl phthalate)와 같은 합성제제들이 개발되어 사용되었다(Pollart, S. M.; Ward, G. W. Jr.; Platts-Mills, T. A. E. House dust sensitivity and environmental control. Immunol. Allergy Clin. North Amer. 1987, 7, 447-461). 그러나, 비록 이들이 효과적인 살비제로서 작용할지라도, 이들의 반복적인 사용이 때로는 저항성 종의 출현을 불러 일으켰고(van Bronswijk J. E. M. H.; Sinha R. N. Pyroglyphid mites (Acari) and house dust allergy. J. Allergy 1971, 47, 31-52), 비목적 생물에 대해 역효과를 유발함으로써 환경과 인간의 건강에 대한 관심을 증가시키는 결과를 야기하였다(Pollart, S. M.; Ward, G. W. Jr.; Platts-Mills, T. A. E. House dust sensitivity and environmental control. Immunol. Allergy Clin. North Amer. 1987, 7, 447-461; Hayes, W. J. Jr.; Laws, E. R. Jr. Handbook of Pesticide Toxicology, Vol 1.; Academic: San Diego, 1991). 이러한 문제들로 인해 이들 진드기를 선택적으로 방제할 수 있는 새로운 유형의 방제원을 찾고자하는 노력이 수행되었다.
일반적으로 식물체들은 다양한 생물활성 물질들을 함유하고 있기 때문에 진드기 방제를 위한 어떤 대체원이 될 수 있다. 이들 대다수는 매우 선택적이며 무독성 산물로 환경내에서 생분해되어 기존의 합성 살비제와 동일한 방법으로 메트리스, 침대, 소파, 저장곡물이나 가공식품 등 진드기가 서식할 수 있는 곳에 적용할 수 있는 특성을 갖는다. 이러한 장점으로 인해 많은 연구가 경제적으로 중요한 절지동물들을 방제하는 유용한 자원으로서 식물체 추출물 또는 정유(essential oil)에 집중되었다(Arnason, J. T.; Philogene, B. J. R.; Morand, P. Insecticides of Plant Origin; ACS Symposium Series 387; American Chemical Society: Washington, DC, 1989; Isman, M. B. Plant essential oils for pest and disease management. Crop Protection 2000, 19, 603-608).
동아시아에서 주로 사용되는 천궁(C. officinale)은 감기, 몸살, 류마티스, 월경불순 및 외인성 질환에 대한 진통제와 같은 한약재로서 오랫동안 이용되어 왔다(Namba, T. The Encyclopedia of Wakan-Yaku (Traditional Sino-Japanese Medicines) with Color Pictures; Hoikusha: Osaka, Japan, 1993). 천궁에는 부틸리덴프탈라이드(butylidenephthalide), 부틸프탈라이드(buthylphthalide), 크라이소파놀(chrysophanoll), 크니딜라이드(cnidilide), 코니페릴 페룰레이트(coniferyl ferulate), 4-히드록시-3-부틸프탈라이드(4-hydroxy-3-butylphthalide), 리거스틸라이드(ligustilide), 펄올리린(perlolyrine), 프레그네놀론(pregnenolone), 세다노닉 엑시드(sedanonic acid), 센키우놀라이드(senkyunolide), 및 테트라메틸피라진(tetramethylpyrazine)과 같은 많은 화합물들이 함유되어 있는 것으로 보고되었다(Namba, T. The Encyclopedia of Wakan-Yaku (Traditional Sino-Japanese Medicines) with Color Pictures; Hoikusha: Osaka, Japan, 1993; Kobayashi, M.; Fujita, M.; Mitsuhashi, H. Components of Cnidium officinale Makino: occurrence of pregnenolone, coniferyl ferulate, and hydroxyphthalides. Chem. Pharm. Bull. 1984, 32, 3770-3773; Tang, E.; Eisenbrand, G. Chinese Drugs of Plant Origin; Springer: New York, 1992).
이중에서 상기 부틸리덴프탈라이드는 Ligusticum chuanxiong Hort., L. sinensis Oliv., L. jeholense Nakai et Kitagawa, Angelica acutiloba Kitagawa, 및 A. sinensis (Oliv.) Diels의 뿌리에 함유된 성분으로도 알려졌다(Tang, E.; Eisenbrand, G. Chinese Drugs of Plant Origin; Springer: New York, 1992). 이 화합물은 주로 지질에 산소를 첨가하여 환상을 만들어주는 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase)에 대한 저해활성을 보이고 부분적으로는 칼슘의 이동을 방해하여 혈소판 응고를 억제하는 것으로 알려졌고(Teng, C. M.; Chen, W. Y.; Ko, W. C.; Ouyang, C. H. Antiplatelet effect of butylidenephthalide. Biochim. Biophys. Acta 1987, 924, 375-382), 임신하지 않은 암컷 쥐를 이용한 실험에서는 프로스타글란딘(prostagladin) F2α, 옥시토신(oxytocin)과 아세틸콜린(acetylcholine)에 의해 유도되는 자궁수축을 억제하는 효과를 보이는 것으로 밝혀졌다(Teng, C.M.; Chen, W.Y.; Ko, W.C.; Ouyang, C.H. Antiplatelet effect of butylidenephthalide. Biochim. Biophys. Acta 1987, 924, 375-382; Ko, W.C.A newly isolated antispasmodic-butylidenephthalide. Jpn. J. Pharmacol. 1980, 30, 85-91).
그러나, 천궁의 우수한 약리활성에도 불구하고, 지금까지는 진드기를 포함한 절지동물들을 관리하기 위한 연구는 거의 이루어지지 않았다.
상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 진드기에 대해 높은 살비활성을 가지는 천궁(Cnidium officinale) 추출물을 포함하는 살비제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 다른 목적은 진드기에 대해 강한 살비활성을 나타내는 천궁 추출물에서 유래한 부틸리덴프탈라이드를 포함하는 살비제 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천궁 추출물을 포함하는 살비제 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 부틸리덴프탈라이드(butylidenephthalide) 화합물을 포함하는 살비제 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 진드기를 선택적으로 방제할 수 있는 새로운 유형의 방제원을 찾고자 식물체를 그 대체제 개발을 위한 대상으로 선정하였고, 식물체 중에서 천궁(Cnidium officinale)의 근경 추출물이 살비력을 가짐을 확인하고, 이로부터 유래한 화합물이 진드기에 대한 살비활성물질임을 밝히고 그 작용기작을 규명하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 식물 추출물인 천궁 추출물 및 그 유래 화합물인 부틸리덴프탈라이드는 종래 합성 살비제에 비해 진드기에 대해 아주 강한 살충력을 가지며, 특히 전세계적으로 우점을 차지하는 집먼지진드기 종들인 세로무늬먼지진드기(Dermatophagoides pteronyssinus)와 큰다리먼지진드기(Dermatophagoides farinae) 2종과 긴털가루진드기(Tyrophagus putrescentiae) 1종에 대한 살비효과가 매우 우수하다. 또한 살비활성물질인 부틸리덴프탈라이드는 집먼지진드기에 대해 더욱 강한 살비활성을 나타낸다.
따라서 본 발명은 상기 천궁의 추출물 또는 그 정유를 제조하여 살비제 조성물에 유효성분으로 사용할 수 있다. 상기 천궁 추출물은 천궁의 근경(rhizome) 추출물인 것이 바람직하다. 또한, 상기 천궁 추출물은 메탄올 조추출물 또는 헥산 추출물인 것이 더욱 바람직하다.
즉, 본 발명은 천궁의 살비성 물질을 추출하기 위해 메탄올 추출방법을 이용하여 천궁의 메탄올 조추출물을 얻을 수 있으며, 상기 천궁의 정유는 통상적인 정유제조방법으로 얻는 것이 바람직하다.
상기 천궁 메탄올 조추출물은 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올로 더욱 분획추출하였으며, 헥산층이 살비활성을 가짐을 확인하였다. 따라서, 상기 천궁 메탄올 추출물에서 수득한 헥산층은 살비제로 이용할 수 있으며 살충제로도 활용할 수 있다.
상기 살비제 조성물은 천궁의 메탄올 조추출물이나 그 정유를 단독으로 포함하거나 또는 통상의 살충제에 첨가 혼합하는 물질과 함께 혼합 사용할 수 있다.
상기 천궁 추출물의 함량은 전체 살비제 조성물에 대하여 10 내지 20 중량%로 포함하는 것이 바람직하나, 천궁의 메탄올 추출물의 함량은 살비제의 제형이나 그 살포방법 및 적용장소에 따라 달리 적용하는 것이 더욱 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 천궁에 포함된 살비활성물질을 분리하여, 살비능이 우수한 하기 화학식 1의 부틸리덴프탈라이드(butylidenephthalide)를 제공한다.
[화학식 1]
상기 부틸리덴프탈라이드는 현재 집먼지진드기 및 긴털가루진드기 방제제로 이용되는 벤질벤조에이트(benzyl benzoate)(LD50 = 6.7-8.5 ㎍/㎠)와 DEET(LD50 = 18.0-37.6 ㎍/㎠)의 활성에 필적할만한 살비활성(LD50 = 6.5-6.8 ㎍/㎠)을 나타내고, 그 활성은 기체상으로 작용하는 훈증제로서 작용하며, 넉다운 효과(Knock-down effect)없이 무감각증을 통해 치사에 이르게 하는 특성을 보인다. 따라서 본 발명의 부틸리덴프탈라이드의 살비기작은 훈증작용임을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 화학식 1의 부틸리덴프탈라이드는 살비활성을 가지며 다양한 절지동물에 효과를 가지는 신규화합물을 위한 유도체로 이용할 수 있다. 특히 상기 유도체는 부틸리덴프탈라이드의 구조상에 존재하는 높은 친전자성의 산소를 환원시킴으로써 그 활성을 증대시키거나 측쇄로 존재하는 알킬그룹의 메틸기를 치환하거나 산화시킴으로써 그 활성을 증대시킬 수 있다. 일반적으로 유도체 화합물은 더 넓고 강한 생물활성을 나타내는 물질 개발의 전구체로 작용한다.
따라서, 본 발명은 천궁에서 분리한 살비성을 나타내는 상기 화학식 1의 부틸리덴프탈라이드 화합물을 포함하는 살비제 조성물을 제공한다.
이러한 본 발명의 살비제 조성물은 상기 화합물을 단독으로 포함하거나 또는 통상의 살충제에 첨가되는 물질과 혼합 사용할 수 있다.
혼합 사용되는 경우 부틸리덴프탈라이드의 함량은 5 내지 10 중량%로 포함하는 것이 바람직하다. 하지만 상기 살비제에 포함되는 부틸리덴프탈라이드의 함량은 살비제의 제형이나 적용방법 및 처리장소나 환경에 따라 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 살비제 조성물의 제형은 스프레이상, 액체도포상, 고체도포상, 크림상, 부직포 및 젤상의 제형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 살비제 조성물은 진드기가 서식하는 곳에 휘발성독으로 사용하여 진드기를 살비시키는 것이 바람직하며, 상기 식물유래 추출물 및 그 유래 물질 또는 모핵화합물은 진드기 이외의 절지동물에 대한 방제 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 살비제 조성물의 적용용량은 통상적인 살충제를 적용시키는 용량으로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하여 설명한다. 그러나 하기에 기술된 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
시료 조제: 메탄올 조추출물
서울 경동시장에서 천궁(Cnidium officinale)을 구입하여, 천궁 50 g을 300 mL 메탄올로 2일에 걸쳐 상온에서 2번 추출하여 여과한(Whatman No. 2) 후, 여과액을 회전진공농축기(EYELA autojack NAJ-160, Japan)로 농축하였다. 농축한 조추출물의 수율은 10% 이었다. 메탄올 조추출물의 수율은 분쇄한 천궁 무게 대비 수득된 메탄올 추출물의 무게로 계산되었다. 상기 메탄올 조추출물 20 g을 물 800 mL에 용해하여 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 순차분획하여 각각의 분획물 헥산층 4.2 g, 클로로포름층 0.1 g, 에틸아세테이트층 0.25 g, 부탄올층 2.7 g 및 물층 12.8 g을 수득하여, 살비활성을 측정하는 시료로 이용하였다.
[비교예 1]
합성살비제인 N,N-디메틸-톨루아미드(N,N-Diethyl-m-toluamide: DEET)와 벤질 벤조에이트(benzyl benzoate)는 시그마(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 대조구 화합물로 사용하였다.
[실험예 1]
살비활성 검정에 사용된 진드기
살비활성은 큰다리 먼지진드기(American house dust mite, Dermatophagoides farinae), 세로무늬 먼지진드기(European house dust mite, Dermatophagoide pteronyssinus), 및 긴털가루진드기(Storage mite, Tyrophagus putrescentiae)의 3종에 대하여 실시하였다. 이들은 상대습도 75±5 %, 온도 26 ±1 ℃를 유지한 사육실에 사육하였으며, 12.5 ×10.5 ×5 ㎤ 용기에 치어사료와 복합비타민제(에비오제?)를 1:1로 혼합한 사료 및 17.5 ×17.5 ×17.5 ㎤ 부피의 용기 바닥에 식염수를 적당량 부어 사육실에 넣어주었다. 상기 진드기들은 어떤 살비제에도 노출없는 감수성 계통들이다.
살비활성 검정(섬유확산법, fabric diffusion method)
천궁 추출물 및 화합물 적정량을 메탄올 100 ㎕에 녹이고, 직경 5 cm의 검은색 혼방천에 처리하여 1분간 용매를 휘발시키고 직경 5 cm, 높이 0.9 cm (부피 21.4 ㎤)의 페트리디쉬에 넣어 각각의 진드기 20개체씩을 처리된 천 위에 올리고 난 후, 뚜껑을 닫았다. 대조구는 단지 메탄올만을 처리한 것을 사용하였다. 검정한 모든 실험구와 대조구는 사육조건과 동일한 사육실에 넣어 24, 48, 72시간 후에 광학현미경(20배)하에서 살비유무를 조사하였는데, 미세한 붓을 이용해 부속지 및 몸통을 자극하여 전혀 움직임이 없는 개체는 사망한 것으로 간주하였다. 모든 검정은 5회 반복하여 실시하였으며, 살비율에 대한 평균간의 비교는 쉐페(Scheffe's test, SAS Institute, 1996)를 이용하였다. 또한 LD50값은 프라빗분석법(probit analysis)에 의해 산출하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다(SAS Institute, 1990). 하기 표 1의 살비율은 본 발명의 천궁 추출물들의 3종 진드기에 대한 살비율을 50.9 ㎍/㎠ 처리수준에서 측정하여 제시한 것이다. 표 1의 동일한 문자(a, b)는 평균이 통계상(P = 0.05, Sheffe 검정) 별다른 차이가 없음을 나타내며, 살비율은 아크사인 제곱근으로 변형시켜 나타내었다.
추출물 살비율, (평균 ± 표준편차, %)
세로무늬먼지진드기 D. pteronyssinus 큰다리먼지진드기 D. farinae 긴털가루진드기 T. putrescentiae
메탄올층 100 ±0.0 a 100 ±0.0 a 100 ±0.0 a
헥산층 100 ±0.0 a 100 ±0.0 a 100 ±0.0 a
클로로포름층 13 ±3.3 b 3 ±3.3 b 0 ±0.0 b
에틸아세테이트층 0 ±0.0 b 0 ±0.0 b 0 ±0.0 b
부탄올층 0 ±0.0 b 0 ±0.0 b 0 ±0.0 b
물층 0 ±0.0 b 0 ±0.0 b 0 ±0.0 b
상기 표 1에서 보면, 천궁의 메탄올 추출물과 헥산 추출물은 처리수준에서 3종 모두에 대해 100%의 강한 살비능을 보였다.
[실시예 2]
(살비활성물질의 분리 및 정제)
상기 실시예 1에서 제조한 천궁의 헥산 추출물에 함유된 살비활성 성분을 분리 정제하였다. 도 1에 천궁 추출물로부터 활성성분을 분리하는 과정을 도시하였다.
1차 실리카겔 크로마토그래피
천궁 메탄올 추출물 및 헥산층의 높은 살비활성에 근간하여 살비활성 성분을 분리ㆍ정제하였다. 분획을 통해 얻은 헥산층(10 g)을 실리카켈 칼럼크로마토그래피(Merck 70-230 mesh, 600 g, 직경 5.5, 길이 70 cm)를 이용하여 단계적 구배(stepwise gradient)로 1차 색층분석하였다. 사용한 단계적 구배는 헥산: 에틸아세테이트 비율을 99:1, 90:10, 70:30, 50:50, 30:70, 0:100 순으로 진행하였고, 각 비율에 따른 분획을 H1, H2, H3로 용리하였다.
2차 실리카겔 크로마토그래피
상기의 3개 분획분 중에서 H2층이 3종의 진드기에 대해 높은 살비력을 나타내었다. 상기 H2층을 헥산: 에틸아세테이트 비율을 20:1로 고정하여 7개의 색층 분획분을 얻었다. 각각의 층들을 H21, H22, H23, H24, H25, H26, H27으로 구분하였고, 이들의 살비력을 확인한 결과 H23층에서 살비력을 유지함을 확인하였다.
3차 실리카겔 크로마토그래피
상기의 H23 분획을 헥산: 에틸아세테이트 20:1 비율의 용매계를 이용한 고속액체크로마토그래피(Spectra System P2000, Thermo Separation Products, San Jose, CA, USA)를 실시하여 H231, H232, H233의 3개 분획분을 수득하였고, 살비활성을 나타내는 H232를 수득하였다. 고속액체크로마토그래피의 칼럼은 Porasil (직경 5 mm, 길이 250 mm, Waters, Milford, MA, USA)이었고, 사용한 자외선 검출기의 흡광도는 313 nm였으며 검출속도는 분당 3 ml이였다.
활성물질 분석
상기에서 정제한 최종 활성분획이자 정제물인 H232의 구조결정은 분광분석에 기초하였다. EI 질량분석기(JEOL GSX 400 spectrometer, 일본, 동경)를 이용하여 분자량을 결정하였고, 1H-NMR과 13C-NMR(표준물로는 TMS를 이용) 각각 400과 100 MHz를 이용하여 동정하였다. 상기에서 분리한 활성물질이 최종적으로 부틸리덴프탈라이드임을 확인하였다.
상기 실시예 2의 활성물질에 대한 살비활성을 활성에 근간한 분리법(activity-guided method)을 이용하여 측정하였다.
[실험예 2]
실비활성 검정
상기 실시예 2에서 수득한 각 용리물질들의 3종 진드기에 대한 살비활성을 처리 수준을 50.9 ㎍/㎠으로 하여 24시간 후에 조사한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
용리층 수율 (g) 살비율 (평균 ± 표준편차, %)
세로무늬먼지진드기 D. pteronyssinus 큰다리먼지진드기 D. farinae 긴털가루진드기 T. putrescentiae
H1 4.13 0 ±0.0 0 ±0.0 0 ±0.0
H2 3.19 100 ±0.0 100 ±0.0 100 ±0.0
H3 2.68 0 ±0.0 0 ±0.0 0 ±0.0
H21 0.48 0 ±0.0 0 ±0.0 10 ±0.0
H22 0.36 30 ±2.9 35 ±2.9 51 ±1.7
H23 0.45 100 ±0.0 100 ±0.0 100 ±0.0
H24 0.52 52 ±1.7 40 ±2.9 73 ±1.7
H25 0.079 0 ±0.0 10 ±2.9 20 ±2.9
H26 0.27 0 ±0.0 0 ±0.0 0 ±0.0
H27 1.00 0 ±0.0 0 ±0.0 0 ±0.0
H231 1.09 0 ±0.0 0 ±0.0 0 ±0.0
H232 1.13 100 ±0.0 100 ±0.0 100 ±0.0
H233 2.29 0 ±0.0 0 ±0.0 0 ±0.0
상기 표 2에 보는 바와 같이, H2, H23, H232 용리층이 3종의 진드기에 대해 100% 살비활성을 나타내었다.
활성물질의 비교 활성
천궁의 살비활성물질인 부틸리덴프탈라이드와 유기합성 살비제인 벤질벤조에이트 및 DEET의 섬유확산법을 이용한 세로무늬먼지진드기에 대한 처리 24시간 후의 검정 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
화합물 기울기(±표준편차) LD50, ㎍/㎠ 95%신뢰역 LD90, ㎍/㎠ 95%신뢰역
부틸리덴프탈라이드 6.9(±0.7) 6.5 6.1-6.8 9.9 9.1-11.2
벤질벤조에이트 2.9(±0.3) 6.7 5.9-7.6 18.3 14.6-25.7
DEET 2.4(±0.4) 18.0 15.1-22.8 63.2 42.4-133.0
상기 표 3에 제시된 바와 같이, LD50값에 근간하여 부틸리덴프탈라이드와 유기합성 살비제들의 활성을 비교해 보면, 부틸리덴프탈라이드(6.5 ㎍/㎠)가 벤질벤조에이트(6.7 ㎍/㎠)와 DEET(18.0 ㎍/㎠)에 비해 더 강한 살비활성을 나타냄을 알 수 있다. 대조구에서는 어떤 살비활성도 관찰되지 않았다.
또한, 천궁의 살비활성물질인 부틸리덴프탈라이드와 유기합성 살비제인 벤질벤조에이드 및 DEET의 섬유확산법을 이용한 큰다리먼지진드기에 대한 처리 24시간 후의 검정 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
화합물 기울기(±표준편차) LD50, ㎍/㎠ 95%신뢰역 LD90, ㎍/㎠ 95%신뢰역
부틸리덴프탈라이드 6.8(±0.7) 6.8 6.4-7.2 10.4 9.5-11.9
벤질벤조에이트 6.5(±0.7) 8.5 8.0-9.0 13.4 12.3-15.2
DEET 5.0(±0.8) 37.6 34.6-40.9 67.6 58.0-88.5
상기 표 4에 제시된 바와 같이, LD50값에 근간하여 부틸리덴프탈라이드와 유기합성 살비제들의 활성을 비교해 보면, 부틸리덴프탈라이드(6.8 ㎍/㎠)가 벤질벤조에이트(8.5 ㎍/㎠)와 DEET(37.6 ㎍/㎠)에 비해 더 강한 살비활성을 나타냄을 알 수 있다. 대조구에서는 어떤 살비활성도 관찰되지 않았다.
또한, 천궁의 살비활성물질인 부틸리덴프탈라이드와 유기합성 살비제인 벤질벤조에이드 및 DEET의 섬유확산법을 이용한 긴털가루진드기에 대한 처리 24시간 후의 검정 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
화합물 기울기(±표준편차) LD50, ㎍/㎠ 95%신뢰역 LD90, ㎍/㎠ 95%신뢰역
부틸리덴프탈라이드 4.3(±0.4) 5.8 5.3-6.4 11.4 10.0-13.7
벤질벤조에이트 2.7(±0.3) 9.8 8.3-11.1 28.6 23.2-39.4
DEET 4.1(±0.4) 16.3 14.8-18.1 33.7 28.6-42.3
상기 표 5에 제시된 바와 같이, LD50값에 근간하여 부틸리덴프탈라이드와 유기합성 살비제들의 활성을 비교해 보면, 부틸리덴프탈라이드(5.8 ㎍/㎠)가 벤질벤조에이트(9.8 ㎍/㎠)와 DEET(16.3 ㎍/㎠)에 비해 더 강한 살비활성을 나타냄을 알 수 있다. 대조구에서는 어떤 살비활성도 관찰되지 않았다.
또한, 하기 표 6은 부틸리덴프탈라이드와 유기합성 살비제인 벤질벤조에이트 및 DEET의 살비활성을 각기 다른 농도에서 세로무늬먼지진드기에 대한 24시간, 48시간, 72시간 후의 노출에서 얻어진 결과를 나타낸 것이다.
화합물 농도, ㎍/㎠ 살비율(평균 ±표준편차, %)
24시간 48시간 72시간
부틸리덴프탈라이드 9.6 88±2.6 90±0.0 90±0.0
6.4 50±2.7 52±2.0 52±2.0
DEET 25.5 43±1.3 64±2.3 64±2.3
12.7 35±6.7 36±6.1 36±6.1
벤질벤조에이트 12.7 82±3.3 90±2.9 90±2.9
6.4 42±4.4 42±5.0 42±5.0
상기 표 6에서 보면, 본 발명의 부틸리덴프탈라이드가 벤질벤조에이트와 DEET 보다 2-3배 낮은 농도에서도 더 높거나 동등한 살비력을 보였다.
하기 표 7은 부틸리덴프탈라이드와 유기합성 살비제인 벤질벤조에이트 및 DEET의 살비활성을 각기 다른 농도에서 큰다리먼지진드기에 대한 24시간, 48시간, 72시간 후의 노출에서 얻어진 결과를 나타낸 것이다.
화합물 농도, ㎍/㎠ 살비율(평균±표준편차, %)
24시간 48시간 72시간
부틸리덴프탈라이드 9.6 84±1.9 90±2.4 90±2.4
6.4 46±4.0 50±1.3 50±1.3
DEET 50.9 79±3.5 83±2.3 83±2.3
38.2 41±1.3 41±1.3 41±1.3
벤질벤조에이트 12.7 90±2.9 98±1.7 98±1.7
9.6 57±2.6 60±0.0 60±0.0
상기 표 7에서 보면, 부틸리덴프탈라이드가 벤질벤조에이트와 DEET와 비교하여 더 우수한 살비력을 나타내었다.
하기 표 8은 부틸리덴프탈라이드와 유기합성 살비제인 벤질벤조에이트 및 DEET의 살비활성을 각기 다른 농도에서 긴털가루진드기에 대한 24시간과 48시간 후의 노출에서 얻어진 결과를 나타낸 것이다.
화합물 농도, ㎍/㎠ 살비율(평균±표준편차, %)
24시간 48시간
부틸리덴프탈라이드 12.7 92±4.4 93±3.3
6.4 60±5.0 60±5.0
DEET 25.5 81±5.8 93±4.4
12.7 28±1.7 28±1.7
벤질벤조에이트 25.5 85±2.9 90±2.9
12.7 68±1.5 77±4.5
상기 8에 제시된 바와 같이, 부틸리덴프탈라이드가 벤질벤조에이트와 DEET와 비교시 더 우수한 살비력을 나타내었다.
중독증상(Poisoning symptoms) 시험
3종의 진드기에 대한 실험 화합물들의 중독증상은 상기의 검정법과 동일하게 실시하였다. 2종의 집먼지진드기 속 성충에 대해 천궁의 근경유래 물질, 종래 DEET 및 벤질벤조에이트를 각각 12.7, 50.9 및 50.9 ㎍/㎠ 수준에서 검정하였다. 긴털가루진드기에 대해서는 천궁 유래 물질, DEET 및 벤질벤조에이트를 각각 25.5, 50.9 및 50.9 ㎍/㎠ 수준에서 검정하였다. 각 처리 농도수준에서 실험 진드기들은 처리 5시간 이내에 100% 살비활성을 나타내었다. 중독증상에 대한 조사는 20배율의 광학현미경하에서 15분에서 30분 간격으로 실시하였고, 누적된 살비 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
화합물 농도, ㎍/㎠ 살비율(평균±표준편차, %)
5시간
세로무늬먼지진드기 큰다리먼지진드기 긴털가루진드기
부틸리덴프탈라이드 12.7 100±0.0 100±0.0 100±0.0
25.5 100±0.0 100±0.0 100±0.0
DEET 50.9 100±0.0 100±0.0 100±0.0
100±0.0 100±0.0 100±0.0
벤질벤조에이트 50.9 100±0.0 100±0.0 100±0.0
100±0.0 100±0.0 100±0.0
상기 표 9에서 보면, 모든 화합물들이 100% 살비율을 나타내었으며, 이들 화합물들 모두 3종 진드기에 대해 녹다운효과(knock-down effect) 보다는 무기력증(lethargy)을 통해 직접적인 살비율을 보였다.
[실험예 3]
상기 실시예 2에서 확인된 천궁의 부틸리덴프탈라이드의 살비활성 물질의 작용기작을 알아보기 위해, 검정에 사용한 페트리디쉬의 뚜껑을 랩을 이용해 완전히 밀폐한 실험구와 뚜껑에 구멍을 내어 공기의 유입이 가능토록 디자인한 실험구를 설정하여 본 화합물의 살비력이 접촉독에 의한 것인지 아니면 훈증독에 의한 것인지의 유무를 조사하였다.
부틸리덴프탈라이드의 농도를 큰다리먼지진드기와 세로무늬먼지진드기에 대해서는 12.7 ㎍/㎠로 하였고, 긴털가루진드기에 대해서는 25.5 ㎍/㎠로 하여 24시간 동안 노출시킨 후 살비활성을 조사하여 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 하기 표 10의 동일한 문자(a, b, c)는 평균이 통계상(P = 0.05, Sheffe 검정) 별다른 차이가 없음을 나타내며, 살비율은 아크사인 제곱근으로 변형시켜 나타내었다.
진드기 방법 살비율(평균 ± 표준편차)
세로무늬먼지진드기 공기유입이 가능한 실험구 10 ±0.0 c
완전히 밀폐한 실험구 100 ±0.0 a
큰다리먼지진드기 공기유입이 가능한 실험구 8 ±1.7 c
완전히 밀폐한 실험구 100 ±0.0 a
긴털가루진드기 공기유입이 가능한 실험구 17 ±1.7 b
완전히 밀폐한 실험구 100 ±0.0 a
상기 표 10에서 보면, 3종의 진드기에 대한 부틸리덴프탈라이드의 살비활성은 접촉독에 의한 활성보다는 훈증독에 의해 나타나는 결과임을 알 수 있었다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 천궁(Cnidium officinale) 추출물 또는 그 추출물에서 유래한 부틸리덴프탈라이는 큰다리먼지진드기, 세로무늬먼지진드기 및 긴털가루진드기 등에 대해 강한 살비력을 가지며, 종래 유기합성 살비제인 벤질벤조에이트와 DEET에 비해서도 더욱 강한 살비력을 갖는다. 또한 본 발명의 화합물에 의한 살비력은 녹다운효과에 의한 살비력 보다는 무기력증과 직접적으로 관련된 중독증상에 의한 것이다. 또한 부틸리덴프탈라이드의 살비기작은 접촉독 보다는 훈증독에 기인된 활성일 가능성이 더 높다. 따라서 천궁 추출물 및 상기 화합물을 포함하는 조성물을 가정내 먼지나 카펫에 서식하는 집먼지진드기와 저장곡물이나 가공식품에 서식하는 진드기들을 방제하는 방제제로 활용하면 효과적이다.
도 1은 천궁 메탄올 조추출물의 헥산분획을 크로마토그래피를 실시하여 살비활성 성분을 분리하는 과정을 도시한 것이다.

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 훈증독에 의한 살비효과를 가지는 하기 화학식 1로 표시되는 부틸리덴프탈라이드(butylidenephthalide)를 포함하는 살비제 조성물.
    [화학식 1]
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 살비제 조성물은 세로무늬먼지진드기(Dermatophagoides pteronyssinus), 큰다리먼지진드기(Dermatophagoides farinae) 또는 긴털가루진드기(Tyrophagus putrescentiae)에 대하여 살비효과를 가지는 것을 특징으로 하는 살비제 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100785427B1 (ko) * 2006-05-15 2007-12-13 조점화 천연 생약 원료성분으로 제공되는 곤충기피 훈향제
CN109042657A (zh) * 2018-07-04 2018-12-21 上海市农业科学院 一种控制植食性害螨的复方杀螨剂及其制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR840009198A (ko) * 1983-05-06 1984-12-26 박병하 사과나무 부란병 치료제의 제조방법
KR19990025098A (ko) * 1997-09-06 1999-04-06 오기선 콩나물 재배용 콩불림액과 이를 이용한 콩나물 재배방법
KR20010044177A (ko) * 2000-12-23 2001-06-05 안용준 식물에서 추출한 살비성 조성물
KR20020087568A (ko) * 2001-05-14 2002-11-23 주식회사 내츄로바이오텍 살충활성을 가지는 식물 및 살충성 화합물
KR20030038196A (ko) * 2001-11-09 2003-05-16 우철주 한약 슬러지를 이용한 한약 미생물제제의 제조방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR840009198A (ko) * 1983-05-06 1984-12-26 박병하 사과나무 부란병 치료제의 제조방법
KR19990025098A (ko) * 1997-09-06 1999-04-06 오기선 콩나물 재배용 콩불림액과 이를 이용한 콩나물 재배방법
KR20010044177A (ko) * 2000-12-23 2001-06-05 안용준 식물에서 추출한 살비성 조성물
KR20020087568A (ko) * 2001-05-14 2002-11-23 주식회사 내츄로바이오텍 살충활성을 가지는 식물 및 살충성 화합물
KR20030038196A (ko) * 2001-11-09 2003-05-16 우철주 한약 슬러지를 이용한 한약 미생물제제의 제조방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160011285A (ko) 2014-07-21 2016-02-01 재단법인 전남생물산업진흥원 편백 오일을 포함하는 집먼지진드기 살비용 조성물

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