DE60009665T2

DE60009665T2 - Zusammensetzungen zur behandlung von entzündungsreaktionen

Info

Publication number: DE60009665T2
Application number: DE60009665T
Authority: DE
Inventors: M. Joel LINDEN; W. Gail SULLIVAN; J. Ian SAREMBOCK; Timothy Macdonald; Mark Okusa; L. Irving KRON; Michael W. SCHELD
Original assignee: University of Virginia UVA; University of Virginia Patent Foundation
Current assignee: UVA Licensing and Ventures Group; University of Virginia UVA
Priority date: 1999-02-01
Filing date: 2000-01-31
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2020-02-01
Also published as: HU228937B1; AU2005201255B2; ES2215609T3; WO2000044763A2; EE200100397A; DE60009665D1; ATE263777T1; CA2361614E; PT1150991E; WO2000044763A3; BR0007864A; PL199953B1; UA72912C2; DK1150991T3; AU2005201255A1; JP2002536300A; IL144188A; SK284877B6; CA2361614C; HK1047288A1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen zur Vorbeugung einer Gewebeverletzung, dass heißt auf Grund einer entzündlichen Aktivität.
Hintergrund der Erfindung
Die entzündliche Reaktion dient dem Zweck schädliche Agenzien aus dem Körper zu eliminieren. Es gibt ein weites Spektrum an pathogenen Insulten, die eine entzündliche Reaktion initiieren können, einschließlich einer Infektion, Allergiestoffe, Autoimmunstimuli, Immunreaktionen auf transplantiertes Gewebe, schädlicher Chemikalien und Toxinen, einer Ischämie/Reperfusion, einer Hypoxie, einem mechanischen und thermischen Trauma. Die Entzündung ist normalerweise eine sehr lokale Wirkung, die zur Ausscheidung, Abschwächung durch Verdünnung und zur Isolation des schädigenden Agenzes und verletzten Gewebes dient. Die Körperreaktion wird ein Mittel der Erkrankung, wenn sie in dem Eliminierungsprozess des Targetagenzes zu einer unpassenden Verletzung des Wirtsgewebes führt oder wenn sie auf einen traumatischen Insult reagiert.
Als Beispiel ist eine Entzündung ein Bestandteil der Pathogenese bei vaskulären Erkrankungen und Verletzungen. Die Beispiele schließen ein: Ischämie/Reperfusionsverletzungen (N. G. Frangogiannis et al., in Myocardial Ischemia: Mechanisms, Reperfusion, Protection, M. Karmazyn, Herausgeber, Birkhuser Verlag (1996) auf 236–284; H. S. Sharma et al., Med. of Inflamm., 6, 175 (1987)), Atherosklerose (R. Ross, Nature, 362, 801 (1993)), entzündliche Aortenaneurysma (N. Girardi et al., Ann. Thor. Surg., 64, 251 (1997); D. I. Walker et al., Brit. J. Surg., 59, 609 (1972); R. L. Pennell et al., J. Vasc. Surg., 2, 859 (1985)) und Restenose im Anschluss an eine Ballonangioplastie (siehe, R. Ross oben). Die Zellen, die in die Entzündung involviert sind, schließen Leukozyten (das heißt die Immunsystemzellen-Neutrophile (neutrophile Granulozyten), Eosinophile (eosinophile Granulozyten), Lymphozyten, Monozyten, Basophile (basophile Granulozyten), Makrophagen, dendritische Zellen und Mastzellen), das vaskuläre Endothelium, die vaskulären glatten Muskelzellen, Fibroblasten und Myozyten ein.
Die Freisetzung von Entzündungscytokinen wie dem Tumor Nekrose Faktor-alpha (TNFα) durch Leukozyten ist eine Mittel, durch welches das Immunsystem Pathogeninvasionen, einschließlich von Infektionen, bekämpft. Der TNFα stimuliert die Expression und die Aktivierung von Anheftungsfaktoren auf den Leukozyten und Endothelialzellen, primt (voraktiviert) Neutrophile für eine gesteigerte entzündliche Reaktion auf sekundäre Stimuli und eine gesteigerte oxidative Aktivität von haftenden Neutrophilen. Siehe Sharma et al, oben. Zusätzlich wirken Markophagen/dendritische Zellen als akzessorische Zellen, die das Antigen für die Präsentation zu den Lymphozyten prozessieren. Die Lymphozyten wiederum werden stimuliert, um als entzündungsfördernde cytotoxische Zellen zu wirken.
Im Allgemeinen stimulieren Cytokine Neutrophile, um die oxidative (zum Beispiel Superoxid und sekundäre Produkte) und die nichtoxidative (zum Beispiel die Myeloperoxidase und andere Enzyme) entzündliche Aktivität zu steigern. Eine unpassende und eine zu hohe Freisetzung von Cytokinen kann wegen der Freisetzung von gewebeschädigenden oxidativen und nichtoxidativen Produkten kontraproduktive, überzogene pathogene Effekte verursachen (K. G. Tracey et al., J. Exp. Med., 167, 1211 (1988); und D. N. Männel et al., Rev. Infect. Dis., 9 (Suppl. 5), S. 602–S. 606 (1987)). Zum Beispiel kann der TNFα Neutrophile induzieren, dass sie sich an der Gefäßwand anheften und dann durch das Gefäß zu der Stelle der Verletzung wandern und ihre oxidativen und nichtoxidativen entzündlichen Produkte freisetzen.
Obwohl sich Monozyten langsam an den entzündlichen Fokussen sammeln, günstige Bedingungen vorausgesetzt, entwickeln sich Monozyten zu langzeitresidenten akzessorischen Zellen und Makrophagen. Auf die Stimulation mit einem Entzündungsauslöser hin können Monozyten/Makrophagen auch eine Reihe von Cytokinen (einschließlich dem TNFα), Komplementen, Lipiden, reaktiven Sauerstoffspezies, Proteasen und Wachstumsfaktoren, die das Gewebe umgestalten und die umgebenden Gewebefunktionen regulieren, herstellen und sekretieren.
Zum Beispiel wurde gezeigt, dass Entzündungscytokine pathogen sind bei: Arthritis (C. A. Dinarello, Semin. Immunol. 4, 133 (1992)); Ischämie (A. Seekamp et al, Agents-Actions-Supp., 41, 137 (1993)); septischem Shock (D. N. Männel et al, Rev. Infect. Dis., 9 (Suppl. 5), S. 602–S. 606 (1987)); Asthma (N. M. Cembrzynska et al., Am. Rev Respir. Dis., 147, 291 (1993)); Abstoßung von Organtransplantaten (D. K. Imagawa et al., Transplantation, 51, 57 (1991); multipler Sklerose (H. P. Hartung, Ann. Neurol., 33, 591 (1993)); AIDS (T. Matsuyama et al, AIDS, 5, 1405 (1991)); und bei Alkali-Verbrennungen an den Augen (F. Miyamoto et al., Opthalmic Res., 30, 168 (1997)). Zusätzlich wurde die Superoxidbildung in Leukozyten mit der Begünstigung der Replikation des humanen Immundefizienzvirus (HIV) in Verbindung gebracht (S. Legrand-Poels et at., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 6, 1389 (1990)).
Es ist gut bekannt, dass Adenosin und einige Adenosinanalogons, die nichtselektiv Adenosinrezeptorsubtypen aktivieren, die Herstellung von entzündlichen, oxidativen Produkten der Neutrophilen vermindern (B. N. Cronstein et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 451, 291 (1985); P. A. Roberts et al., Biochem. J., 227, 669 (1985); D. J. Schrier et al., J. Immunol., 137, 3284 (1986); B. N. Cronstein et al., Clinical Immunol. and Immunopath., 42, 76 (1987); M. A. Iannone et al., in Topics and Perspective in Adenosine Research, E. Gerlach et al., Herausgeber, Springer-Verlag, Berlin, S. 286 (1987); S. T. McGarrity et al., J. Leukocyte Biol., 44, 411421 (1988); J. De La Harpe et al., J. Immunol., 143, 596 (1989); S. T. McGarrity et al., J. Immunol., 142, 1986 (1989); und C. P. Nielson et al., Br. J. Pharmacol., 97, 882 (1989)). Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass Adenosin die Freisetzung von Superoxid durch die Neutrophilen hemmt, stimuliert durch chemische Lockstoffe wie durch die synthetische Imitation von bakteriellen Peptiden, f-met-leu-phe (fMLP) und die Komplementverbindung C₅a (B. N. Cronstein et al, J. Immunol., 135, 1366 (1985)). Adenosin kann den sehr erhöhten oxidativen Ausbruch der PMN (neutrophile Granulozyten/Neutrophile), welcher zuerst durch den TNF-α geprimt und dann durch einen zweiten Stimulus wie f-met-leu-phe stimuliert wird (G. W. Sullivan et al., Clin. Res., 41, 172A (1993)), vermindern. Zusätzlich ist berichtet worden, dass Adenosin die Rate der HIV-Replikation in einer T-Zellinie verringern kann (S. Sipka et al., Acta. Biochem. Biophys., Hung., 23, 75 (1988)). Jedoch gibt es keinen Beweis, dass Adenosin in vivo eine entzündungshemmende Wirkung hat (G. S. Firestein et al., Clin. Res., 41, 170A (1993); und B. N. Cronstein et al., Clin. Res., 41, 244A (1993)).
Es ist vorgeschlagen worden, das es mehr als einen Subtyp von Adenosinrezeptoren auf den Neutrophilen gibt, die eine gegenteilige Wirkungen auf die Superoxidfreisetzung haben können (B. N. Cronstein et al., J. Clin. Invest., 85, 1150 (1990)). Die Existenz des A_2A-Rezeptors auf den Neutrophilen wurde ursprünglich von Van Calker et al gezeigt (D. Van Calker et al., Eur. J. Pharmacology, 206, 285 (1991)).
Es gab eine fortschreitende Entwicklung von Verbindungen, die mehr und mehr potentere und/oder selektivere Agonisten des A_2A-Adenosinrezeptors (AR) sind, basierend auf Radioligandenassays und physiologischen Reaktionen. Anfangs wurden Verbindungen mit einer geringen oder keiner Selektivität für die A_2A-Rezeptoren entwickelt, wie Adenosin selbst oder 5'-Carboxyamide von Adenosin, wie 5'-N-Ethylcarboxamidoadenosin (NECA) (B. N. Cronstein et al., J. Immunol., 135, 1366 (1985)). Später wurde gezeigt, dass die Addition von 2-Alkylamino-Substituenten die Potenz und Selektivität erhöht, zum Beispiel CV1808 und CGS21680 (M. F. Jarvis et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 251, 888 (1989)). 2-Alkoxy-substituierte Adenosinderivate wie WRC-0090 sind sogar noch potenter und selektiver als Agonisten an dem A_2A-Rezeptor der Koronararterie (M. Udeeda et al., J. Med. Chem., 34, 1334 (1991)). Die 2-Alkylhydrazinadenosinderivate, zum Beispiel SHA211 (auch WRC-0474 genannt), wurden auch so eingeschätzt, Agonisten an dem A_2A-Rezeptor der Koronararterie zu sein (K. Niiya et al., J. Med. Chem., 35, 4557 (1992)).
Es gibt keinen Bericht über die Kombination relativ unspezifischer Adenosinanalogons, R-Phenylisopropyladenosin (R-PIA) und 2-Chloradenosin (Cl-Ado), mit einem Phosphodiesterase (PDE)-Hemmer, welcher zu einer Verringerung der oxidativen Aktivität der Neutrophilen führt (M. A. Iannone et al., Topics and Perspectives in Adenosine Research, E. Garlach et al., Herausgeber, Springer-Verlag, Berlin, S. 286–298 (1987)). Jedoch sind die R-PIA- und Cl-Ado-Analogons eigentlich potentere Aktivatoren der A₁-Adenosinrezeptoren als der A_2A-Adenosinrezeptoren und folglich ist es wahrscheinlich, dass sie auf Grund der Aktivierung der A₁-Rezeptoren des Herzmuskels und anderer Gewebe Nebenwirkungen verursachen, die zu Effekten wie einen „Herzstillstand" führen.
R. A. Olsson et al. (U.S. Pat. Nr. 5,278,150) offenbaren selektive Adenosin-A₂-Rezeptoragonisten mit der Formel:
wobei Rib Ribosyl ist, R₁ H sein kann und R₂ Cycloalkyl sein kann. Für die Verbindungen wird offenbart, dass sie zur Behandlung von Bluthochdruck, Atherosklerose und als Vasodilatoren nützlich sind.
Olsson et al. (U.S. Pat. Nr. 5,140,015) offenbaren bestimmte Adenosin-A₂-Rezeptoragonisten mit der Formel:
wobei C(X)BR₂ CH₂OH sein kann und R₁ Alkyl- oder Alkoxyalkyl sein kann. Für die Verbindungen wird offenbart, dass sie als Vasodilatoren oder blutdrucksenkende Mittel nützlich sind.
Linden et al (U.S. Pat. Nr. 5,877,180) basiert auf der Entdeckung, dass bestimmte entzündliche Erkrankungen wie Arthritis und Asthma wirksam durch die Verabreichung von Verbindungen behandelt werden könnten, welche selektive Agonisten der A_2A-Adenosinrezeptoren sind, vorzugsweise in Kombination mit einem Typ IV Phosphodiesterasehemmer. Eine Ausführungsform der Erfindung von Linden et al. stellt ein Verfahren zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen durch die Verabreichung einer wirksamen Menge eines A_2A-Adenosinrezeptors mit der folgenden Formel
wobei R und X in dem Patent beschrieben werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung von Linden et al. bezieht die Verabreichung eines Typ IV Phosphodiesterase (PDE)-Hemmers in Kombination mit einem A_2A-Adenosinrezeptoragonisten mit ein. Der Typ IV Phosphodiesterase (PDE)-Hemmer schließt die razemischen und optisch aktiven 4-(Polyalkoxyphenyl)-2-pyrrolidone der folgenden Formel ein:
wobei R, R¹⁸, R¹⁹ und X in dein U.S. Pat. Nr. 4,193,926 offenbart und beschrieben sind. Rolipram ist ein Beispiel für einen geeigneten Typ IV PDE-Hemmer, der in der Formel oben mit eingeschlossen ist.
G. Cristalli (U.S. Pat. Nr. 5,593,975) offenbart 2-Arylethynyl-, 2-Cycloalkylethynyl-, oder 2-Hydroxyalkylethynylderivate, wobei der Riboserrest durch ein Carboxyamino substituiert ist oder ein substituiertes Carboxyamino (R₃HNC(O)-) ist. Es wurden 2-Alkynylpurinderivate in Miyasaka et al offenbart (U.S. Pat. Nr. 4,956,345), wobei die 2-Alkynylgruppe mit einem (C₃-C₁₆)Alkyl substituiert ist. Für die '975-Verbindungen wurde offenbart, dass sie Vasodilatoren sind und dass sie die Thrombozytenaggregation hemmen und folglich als antiischämische, antiatherosklerotische und als Mittel gegen Bluthochdruck nützlich sind.
Jedoch besteht eine anhaltender Bedarf für einen selektiven A₂-Adenosinrezeptoragonisten, der für therapeutische Anwendungen nützlich ist, die verminderte Nebenwirkungen haben.
Die vorliegende Erfindung umfasst Verbindungen, die für die Behandlung der entzündlichen Aktivität in Säugetiergewebe nützlich sind. Die entzündliche Gewebeaktivität kann auf Grund von pathologischen Mitteln oder auf Grund eines physikalischen, chemischen oder thermischen Traumas oder auf Grund eines Traumas wegen einem medizinischen Verfahren wie einer Organ-, Gewebe- oder Zelltransplantation, einer Angioplasie (PCTA), einer Entzündung in Folge einer Ischämie/Reperfusion oder einem Grafting sein. Die vorliegenden Verbindungen umfassen eine neuartige Klasse von 2-Alkynyladenosinderivaten, die an der Ethyn-Position mit Cycloalkylhälften substituiert sind. Vorzugsweise ist der Riboserrest an der 5'-Position („X") mit einer N-Alkyl (oder Cycloalkyl)-carboxyamino („Aminocarbonyl")-Hälfte substituiert. Folglich stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen bereit, die zur Hemmung einer entzündlichen Reaktion in einem Säugetier verwendet werden können, wie einem humanen Subjekt, und zum Schutz des Gewebesubjekts vor der Reaktion verwendet werden können, indem eine wirksame Menge von einer oder mehreren Verbindungen der Erfindung verabreicht wird.
Die Verbindungen der Erfindung haben die folgende allgemeine Formel (I):
wobei (a) jeder R individuell Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, C₃-C₇-Cycloalkyl, Phenyl oder Phenyl(C₁-C₃)alkyl ist;
(b) X -CH₂OH, -CO₂R², -OC(O)R² oder C(O)NR³R⁴ ist;
(c) R², R³ und R⁴ jeweils individuell H, C_1-6-Alkyl; ein C_1-6-Alkyl, substituiert mit 1–3 C_1-6-Alkoxy, C₃-C₇-Cycloalkyl, C_1-6-Alkylthio, Halogen, Hydroxy, Amino, Mono(C_1-6-alkyl)amino, Di(C_1-6-alkyl)amino oder C_6-10-Aryl, wobei das Aryl mit 1–3 Halogen, C_1-6-Alkyl, Hydroxy, Amino, Mono(C_1-6-alkyl)amino oder Di(C_1-6-alkyl)amino substituiert sein kann; C_6-10-Aryl; oder ein C_6-10-Aryl, substituiert mit 1–3 Halogen, Hydroxy, Amino, Mono(C_1-6-alkyl)amino, Di(C_1-6-alkyl)amino oder C_1-6-Alkyl ist;
(d) Z und Z' individuell (C_1-6)Alkyl sind, optional unterbrochen von 1–3 S oder einem nichtperoxid O oder abwesend sind und n 1–3 ist; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Die Erfindung stellt eine Verbindung mit der Formel (I) zur Verwendung in der medizinischen Therapie bereit, vorzugsweise zur Verwendung bei der Behandlung oder zum Schutz von Gewebe vor Entzündungen, wie einer entzündlichen Reaktion, sowie die Verwendung einer Verbindung mit der Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer entzündlichen Reaktion auf Grund einer pathologischen Kondition oder einem pathologischen Symptom in einem Säugetier, wie einem Menschen, das mit der Entzündung assoziiert ist.
Obwohl von bestimmten A_2A-Adenosinrezeptoragonisten berichtet worden ist, dass sie Vasodilatoren sind, und folglich für eine direkte Behandlung von Bluthochdruck, eines Thrombus, Atherosklerose und dergleichen nützlich sind, wird auf die gewebeschützende Wirkung der Verbindungen mit der Formel (I) im Stand der Technik nicht hingewiesen.
Die Erfindung schließt auch die Verwendung einer Kombination von diesen Verbindungen mit Typ IV Phosphodiesterasehemmern für eine synergistische Verminderungen der entzündlichen Reaktion der Immunzellen ein.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine wirksame Menge einer Verbindung mit der Formel (I) umfasst, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel oder Träger und optional in Kombination mit einem Typ IV Phosphodiesterase (PDE)-Hemmer. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung als eine unit dosage form vorgelegt.
Zusätzlich stellt die Erfindung ein therapeutisches Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung einer pathologischen Kondition oder einem pathologischen Symptom in einem Säugetier, wie einem Menschen, bereit, wobei die Aktivität der A_2A-Adenosinrezeptoren mit einbezogen wird und der Agonismus der besagten Aktivität gewünscht wird, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung mit der Formel (I), oder einem pharmazeutisch akzeptabel Säureadditionssalz davon, an ein Säugetier, welches eine solche Therapie benötigt. Es wird angenommen, dass die Aktivierung der A_2A-Adenosinrezeptoren die Entzündung hemmt, indem sie auf Neutrophile, Mastzellen, Monozyten/Makrophagen, T-Zellen und/oder Eosinophile wirken.
Unter den entzündlichen Reaktionen, die durch eine Verbindung mit der Formel (I) behandelt werden können (einschließlich prophylaktisch behandelt) und optional mit einem Typ IV PDE-Hemmer, bestehen die Entzündungen auf Grund:

(a) Autoimmunstimulation (Autoimmunerkrankungen), wie einem Lupus erythematosus, multipler Sklerose, einer Unfruchtbarkeit von einer Endometriose, einem Typ I Diabetes melitus, einschließlich der Destruktion der Pankreasinseln, was zu Diabetes und den entzündlichen Konsequenzen von Diabetes führt, einschließlich von Beingeschwüren, der Crohnschen Krankheit, Colitis ulcerosa, einer entzündlichen Darmerkrankung, Osteoporose und einer rheumatoiden Arthritis;
(b) allergischer Erkrankungen, wie Asthma, Heuschnupfen, Rhinitis, vernaler Konjunktivitis, oder anderen eosinophilvermittelte Konditionen;
(c) Hauterkrankungen, wie einer Psoriasis, einer Kontaktdermatitis, einem Ekzem, infektiösen Hautgeschwüren, offenen Wunden, einer Cellulitis;
(d) infektiöser Erkrankungen, einschließlich einer Sepsis, septischen Schock, einer Enzephalitis, einer infektiösen Arthritis, einem endotoxischem Schock, einem gram negativen Schock, einer Jarisch-Herxheimer-Reaktion, einer Gürtelrose, einem toxischem Schock, einer cerebralen Malaria, einer bakteriellen Meningitis, einem akuten Atemnotsyndrom (ARDS für Englisch: acute respiratory distress syndrome), der Lyme-Erkrankung, einer HIV-Infektion, (TNFα-erhöhte HIV-Replikation, TNFα-Inhibition der Aktivität des Reverse-Transkriptase-Inhibitors);
(e) zehrender Krankheiten: Kachexie sekundär zu Krebs und HIV;
(f) Organ-, Gewebe- oder Zelltransplantation (zum Beispiel Knochenmark, Kornea, Niere, Lunge, Leber, Herz, Haut, Pankreasinseln), einschließlich einer Transplantatabstoßung und Graft- versus Wirtserkrankung;
(g) nachteiliger Wirkungen von einer medikamentösen Therapie, einschließlich nachteiliger Wirkungen von einer Amphotericin B – Behandlung, nachteiliger Wirkungen von einer immunsuppressiven Therapie, zum Beispiel einer Interleukin-2-Behandlung, nachteiliger Wirkungen von einer OKT3-Behandlung, nachteiliger Wirkungen von einer GM-CSF-Behandlung, nachteiliger Wirkungen von einer Cyclosporinbehandlung und nachteiliger Wirkungen von einer Aminoglykosidbehandlung, einer Stomatitis und Mucositis auf Grund einer Immunsuppression;
(h) cardiovaskulärer Konditionen, einschließlich zirkulartorischer Erkrankungen, die durch eine entzündliche Reaktion induziert oder hervorgerufen werden, wie einer Ischämie, einer Atherosklerose, einer periphären vaskulären Erkrankung, einer Restenose in Folge einer Angioplastie, einem entzündlichen Aortenaneurysma, einer Vaskulitis, einem Schlaganfall, einer Rückenmarkverletzung, einem kongestiven Herzversagen, einem hämorrhagischen Schock, einer Ischämie/Reperfusionsverletzung, einem Vasospasmus in Folge einer subarachnoidalen Blutung, einem Vasospasmus in Folge eines cerebrovaskulären Unfalls, einer Pleuritis, einer Perikarditis und den cerebrovaskulären Komplikationen von Diabetes;
(i) Dialyse, einschließlich einer Perikarditis, auf Grund einer peritonealen Dialyse;
(j) Gicht; und
(k) chemischen oder thermischen Trauma auf Grund von Verbrennungen, Säure, Alkali und dergleichen.

Von besonderem Interesse und Effizienz ist die Verwendung der vorliegenden Verbindungen, um entzündliche Reaktionen auf Grund einer Organ-, Gewebe- oder Zelltransplantation, dass heißt der Transplantation von allogenem oder xenogenem Gewebe in einen Säuregtierrezipienten, auf Grund von Autoimmunerkrankungen und entzündlichen Konditionen auf Grund zirkulatorischer Pathologien und der Behandlung davon, einschließlich einer Angioplastie, der Legung eines Stents, der Legung eines Shunts oder eines Graftings, zu behandeln. Unerwarteter Weise wurde herausgefunden, dass die Verabreichung von einer oder mehreren Verbindungen mit der Formel (I) nach dem Beginn der entzündlichen Reaktion wirksam war, zum Beispiel nachdem das Subjekt von der Pathologie oder dem Trauma, welches die entzündliche Reaktion initiierte, betroffen war.
Es wird auch ein Verfahren zur Messung der Reaktion oder der Bindung einer Verbindung mit der Formel (I) an oder zu die genannten A_2A-Adenosinrezeptorsites, umfassend den besagten Rezeptor, in vivo oder in vitro mit einer Menge einer Verbindung mit der Formel I, die wirksam ist, an den besagten Rezeptor zu binden, offenbart. Gewebe oder Zellen, die ligandengebundene Rezeptorsites umfassen, können verwendet werden, um die Selektivität der Testverbindungen für spezifische Rezeptorsubtypen, die Menge der bioaktiven Verbindung im Blut oder anderen physiologischen Flüssigkeiten zu messen, oder sie können als ein Werkzeug verwendet werden, um potentielle therapeutische Mittel zur Behandlung von Erkrankungen und Konditionen, die mit einer Rezeptorsiteaktivierung assoziiert sind, zu identifizieren, indem die besagten Mittel mit den besagten Ligand-Rezeptor-Komplexen in Kontakt gebracht werden und das Ausmaß der Verdrängung des Liganden und/oder der Bindung des Mittels oder die zelluläre Reaktion auf das besagte Mittel (zum Beispiel die cAMP-Akkumulation) gemessen wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die folgenden Definitionen werden, wenn nicht anders beschreiben, verwendet. Halo ist Fluor, Chlor, Brom oder Jod. Alkyl, Alkoxy, Aralkyl, Alkylaryl, etc. bezeichnen sowohl gerade als auch verzweigte Alkylgruppen; der Verweis aber auf ein individuelles Radikal wie „Propyl" umfasst nur das gradkettige Radikal, auf ein verzweigtkettiges Isomer wie „Isopropyl" wird spezifisch hingewiesen. Aryl schließt ein Phenylradikal oder ein orthofusioniertes bicyclisches carbocyclisches Radikal ein, das etwa neun bis zehn Ringatome hat, in welchem wenigstens ein Ring aromatisch ist. Heteroaryl umfasst ein Radikal, das via einem Ringkohlenstoffatom eines monocyclischen aromatischen Rings gebunden ist, der fünf oder sechs Ringatome enthält, die aus Kohlenstoffatomen und eins bis vier Heteroatomen bestehen, jeweils ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus nichtperoxid Sauerstoff, Schwefel und N(X), wobei X abwesend oder H, O, (C₁-C₄)Alkyl, Phenyl oder Benzyl ist, sowie einem Radikal eines ortho-fusionierten bicyclischen Heterocyclus von etwa acht bis zehn Ringatomen, die davon ableiten sind, insbesondere ein Benzderivat oder ein Derivat, indem ein Propylen-, Trimethylen- oder Tertramethylendiradikals daran fusioniert wird.
Es wird von Fachleuten verstanden werden, dass die Verbindungen mit der Formel (I) mehr als ein chirales Zentrum haben und in optisch aktiven und razemischen Formen isoliert werden können. Vorzugsweise wird die Ribosehälfte der Formel (I) von D-Ribose abgeleitet, dass heißt die 3',4'-Hydroxylgruppen sind alpha zu dem Zuckerring und die 2'- und 5'-Gruppen beta (3R, 4S, 2R, 5S). Wenn zwei Gruppen an der Cyclohexylgruppe in der 4-Position sind, dann sind sie vorzugsweise trans. Einige Verbindungen können Polymorphismen aufweisen. Es ist selbstverständlich, dass die vorliegende Erfindung jede razemische, optisch aktive, polymorphe oder stereoisomere Form, oder Mischungen davon, von einer Verbindung gemäß der Erfindung umfasst, die die hierin beschriebenen nützlichen Eigenschaften besitzt, dass im Stand der Technik gut bekannt ist, wie optisch aktive Formen herzustellen sind (zum Beispiel durch die Auflösung von razemischen Formen durch Rekristallisationstechniken oder enzymatische Techniken, mittels der Synthese von optisch aktiven Ausgangsmaterialien, mittels einer chiralen Synthese oder mittels einer chromatographischen Auftrennung unter Verwendung einer chiralen stationären Phase) und wie eine adenosinagonistische Aktivität unter Verwendung des Test, der hierin beschrieben ist, oder unter Verwendung von anderen, ähnlichen Test, die im Stand der Technik gut bekannt sind, bestimmen wird.
Spezifische und bevorzugte Werte, die unten für Radikale, Substituenten und Bereiche aufgelistet sind, dienen nur der Illustration; sie schließen andere definierte Werte oder andere Werte innerhalb des definierten Bereichs für Radikale oder Substituenten nicht aus.
Speziell kann (C₁-C₆)Alkyl Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, Pentyl, 3-Pentyl oder Hexyl sein. Wie hierin verwendet umfasst der Begriff „Cycloalkyl" Bicycloalkyl (Norbornyl, 2.2.2-Bicyclooctyl, etc.) und Tricycloalkyl (Adamantyl, etc.), optional umfassend 1–2 N, O oder S. Cycloalkyl umfasst auch (Cycloalkyl)alkyl. Folglich kann (C₃-C₆)Cycloalkyl Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl sein; (C₃-C₆)Cycloalkyl(C₁-C₆)alkyl kann Cyclopropylmethyl, Cyclobutylmethyl, Cyclopentylmethyl, Cyclohexylmethyl, 2-Cyclopropylethyl, 2-Cyclobutylethyl, 2-Cyclopentylethyl oder 2-Cyclohexylethyl sein.
(C₁-C₆)Alkoxy kann Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy, Isobutoxy, sec-Butoxy, Pentoxy, 3-Pentoxy oder Hexyloxy sein; (C₂-C₆)Alkenyl kann Vinyl, Allyl, 1-Propenyl, 2-Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 1-Pentenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl oder 5-Hexenyl sein; (C₂-C₆)Alkynyl kann Ethynyl, 1-Propynyl, 2-Propynyl, 1-Butynyl, 2-Butynyl, 3-Butynyl, 1-Pentynyl, 2-Pentynyl, 3-Pentynyl, 4-Pentynyl, 1-Hexynyl, 2-Hexynyl, 3-Hexynyl, 4-Hexynyl oder 5-Hexynyl sein; (C₁-C₆)Alkanoyl kann Acetyl, Propanoyl oder Butanoyl sein; Halo(C₁-C₆)alkyl kann Jodmethyl, Brommethyl, Chlormethyl, Fluormethyl, Trifluormethyl, 2-Chlorethyl, 2-Fluorethyl, 2,2,2-Trifluorethyl oder Pentafluorethyl sein; Hydroxy(C₁-C₆)alkyl kann Hydroxymethyl, 1-Hydroxyethyl, 2-Hydroxyethyl, 1-Hydroxypropyl, 2-Hydroxypropyl, 3-Hydroxypropyl, 1-Hydroxybutyl, 4-Hydroxybutyl, 1-Hydroxypentyl, 5-Hydroxypentyl, 1-Hydroxyhexyl oder 6-Hydroxyhexyl sein; (C₁-C₆)Alkoxycarbonyl(CO₂R²) kann Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, Butoxycarbonyl, Pentoxycarbonyl oder Hexyloxycarbonyl sein; (C₁-C₆)Alkylthio kann Methylthio, Ethylthio, Propylthio, Isopropylthio, Butylthio, Isobutylthio, Pentylthio oder Hexylthio sein; (C₂-C₆)Alkanoyloxy kann Acetoxy, Propanoyloxy, Butanoyloxy, Isobutanoyloxy, Pentanoyloxy oder Hexanoyloxy sein; Aryl kann Phenyl, Indenyl oder Naphthyl sein; und Heteroaryl kann Furyl, Imidazolyl, Triazolyl, Triazinyl, Oxazoyl, Isoxazoyl, Thiazolyl, Isothiazoyl, Pyraxolyl, Pyrrolyl, Pyrazinyl, Tetrazolyl, Puridyl (oder sein N-Oxid), Thientyl, Pyrimidinyl (oder sein N-Oxid), Indolyl, Isoquinolyl (oder sein N-Oxid) oderr Quinolyl (oder sein N-Oxid) sein.
Ein spezifischer Wert für R ist Amino, Monomethylamino oder Cyclopropylamino.
Ein spezifischer Wert für R¹ ist Carboxy- oder (C₁-C₄)Alkoxycarbonylcyclohexyl(C₁-C₄)alkyl.
Ein spezifischer Wert für R² ist H oder (C₁-C₄)Alkyl, das heißt Methyl oder Ethyl.
Ein spezifischer Wert für R³ ist H, Methyl oder Phenyl.
Ein spezifischer Wert für R⁴ ist H, Methyl oder Phenyl.
Ein spezifischer Wert für Z ist -CH₂- oder -CH₂-CH₂-.
Ein spezifischer Wert für X ist CO₂R², (C₂-C₂)Alkanoylmethyl oder Amido.
Ein spezifischer Wert für n ist 1.
Bevorzugte Verbindungen mit der Formel (I) sind jene, wobei jeder R H ist, X Ethylaminocarbonyl und R¹ 4-Carboxycyclohexylmethyl(DWH-146a), R¹ 4-Methoxycarbonylcyclohexylmethyl (DWH-146e) oder R¹ 4-Acetoxymethylcyclohexylmethyl (JMR-193) ist. Die Verbindungen sind unten abgebildet(DWH-146 (Säure) und Methylester (e)) und JMR-193.
Die Synthese von 4[3-(6-Amino-9(5-[(ethylamino)carbonyl]-3,4-dihydroxytetrahydro-Z-furanyl-9H-2-purinyl)-2-propynyl]1-cyclohexancarboxylat (DWH-146e) wurde durch die Kreuzkopplung von einem Jodadenosinderivat(N-Ethyl-1'-deoxy-1'-(amino-2-jod-9H-purin-9-yl)-β-D-ribofuranuoramid) mit Methyl-4-(2-propynyl)-1-cyclohexancarboxylat durch die Verwendung eines Pd¹¹-Katalysators bewerkstelligt. Die Synthese des Jodadenosinderivats wurde ausgehend von Guanosin bewerkstelligt. Guanosin wird als erstes mit Essigsäureanhydrid behandelt, welches die Zuckerhydroxyle acetyliert, gefolgt von der Chlorierung der Position 6 mit Tetramethylammoniumchlorid und Phosphoroxychlorid. Die Jodierung der Position 2 wurde mittels einer modifizierten Sandmeyer-Reaktion bewerkstelligt, gefolgt von der Verdrängung des 6-Cl und der Zuckeracetate mit Ammonium. Die 2'- und 3'-Hydroxyle wurden als Acetonid geschützt und das 5'-Hydroxyl wurde mit Kaliumpermanganat zur Säure jodiert. Die Aufhebung des Schutzes des 2'- und 3'-Acetonids, die Fisher-Veresterung der 5'-Säure mit Ethanol und die Konversion des resultierenden Ethylesters zu dem Ethylamid mit Ethylamin ergab N-Ethyl-1'-deoxy-1'-(amino-2-jod-9H-purin-9-yl)-β-D-Ribofuranuoramid.
Das Acetylen(methyl-4-(2-propynyl)-1-cyclohexancarboxylat) wurde ausgehend von trans-1,4-Cyclohexandimethanol synthetisiert. Anfänglich wurde das trans-Diol monotosyliert, gefolgt von der Verdrängung des Tosylates mit einem Acetylenanion. Das Hydroxyl der resultierenden Hydroxylacetylenspezies wurde zur Säure mittels Jonesreagenz oxidiert, gefolgt von einer Methylierung mit (Trimethylsilyl)diazomethan, um Methyl-4-(2-propynyl)-1-cyclohexancarboxylat zu ergeben.
Die Kreuzkopplungsreaktion wurde unter den folgenden, zuvor berichteten Bedingungen, durchgeführt. Zu einer Lösung aus N,N-Dimethylformamid (0,5 ml), Azetonitril (1 ml), Triethylamin (0,25 ml) und N-Ethyl-1'-deoxy-1'-(amino-2 jod-9H-purin-9-yl)-β-D-ribofuranuroamid (25 mg, 0,06 mmol) wurden Bis(triphenylphosphin)palladiumdichlorid (1 mg, 2 mol%) und Kupfer(I)jodid (0,06 mg, 0,5 mol%) zugegeben. Zu der resultierenden Mischung wurden Methyl-4-(2-propynyl)-1-cyclohexancarboxylat (54 mg, 0,3 mmol) zugegeben und die Reaktion wurde unter N₂-Atmosphäre für 16 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der resultierende Rest in 20% Methanol in Chloroform (R_⨍ = 0,45) einer flashchromatographiert, um 19 mg (cremefarbener Feststoff, Schmelzpunkt 125°C (zersetzt)) Methyl-4[3-(6-amino-9(5-[(ethylamino)carbonyl]-3,4-dihydroxytetrahydro-Z-furanyl)-2-propynyl]-9H-2-purinyl)-1-cyclohexancarboxylat (DWH-146e) zu ergeben.
DWH-146e und JMR193 sind im Wesentlichen potentere Hemmer in Entzündungsmodelsystemen als die Vergleichsverbindung, CGS21680 (2-[p-(Carboxyethyl)-phenyl-ethylamino]5'-N-ethylcarboxamidoadenosine). Zum Beispiel ist DWH-146e etwa 80-mal potenter an A_2A-Rezeptoren und 40-mal selektiver für A_2A- gegenüber A₃-Rezeptoren als CGS21680.
Beispiele für pharmazeutisch akzeptable Salze sind organische Säureadditionssalze, die mit Säuren gebildet werden, die ein physiologisch akzeptables Anion bilden, zum Beispiel Tosylat, Methansulfonat, Malat, Acetat, Citrat, Malonat, Tartrat, Succinat, Benzoat, Ascorbat, α-Ketoglutarat und α-Glycerophosphat. Es können auch geeignete anorganische Salze gebildet werden, einschließlich der Hydrochlorid-, Sulfat-, Nitrat-, Bicarbonate- und Carbonatsalze.
Pharmazeutisch akzeptable Salze können unter Verwendung von Standartverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, erhalten werden, zum Beispiel durch die Reaktion einer ausreichend basischen Verbindung wie einem Amin mit einer geeigneten Säure, was ein physiologisch akzeptables Anion hervorbringt. Es können Alkalimetall- (zum Beispiel Natrium, Kalium oder Lithium) oder Erdalkalimetall- (zum Beispiel Kalzium) salze von Carbonsäuren hergestellt werden.
Die Verbindungen der Formel (I) können als pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden und an einen Säugetierwirt, wie einen menschlichen Patienten, in einer Vielzahl von Formen verabreicht werden, angepasst an den gewählten Verabreichungsweg, dass heißt oral oder parenteral, auf intravenösen, intramuskulären, topikalen oder subkutanen Wegen.
Folglich können die vorliegenden Verbindungen systemisch, zum Beispiel oral, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel wie einem inerten Verdünnungsmittel oder einem assimilierbaren essbaren Träger, verabreicht werden. Sie können in hart- oder weichschalige Gelatinekapseln eingeschlossen sein, in Tabletten gepresst sein oder sie können direkt mit der Nahrung einer Patientendiät eingenommen werden. Für die orale therapeutische Verabreichung kann die aktive Verbindung mit einem oder mehreren Exzipienten kombiniert werden und in Form von ingestierbaren Tabletten, bukkalen Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirups, Waffeln und dergleichen verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Präparationen sollten wenigstens 0,1% der aktiven Verbindung enthalten. Der Prozentsatz der Zusammensetzungen und Präparationen kann selbstverständlich variiert und in geeigneter Weise zwischen etwa 2 bis etwa 60% von dem Gewicht einer gegeben unit dosage form liegen. Die Menge der aktiven Verbindung in solchen therapeutisch nützlichen Zusammensetzungen ist so, dass ein wirksamer Dosierungslevel erhalten wird.
Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und dergleichen können auch das folgende enthalten: Bindemittel wie Tragantgummi, Gummi arabicum, Getreidestärke oder Gelatine; Exzipienten wie Dikalziumphosphat; ein Desintegrierungsmittel wie Getreidestärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und dergleichen; ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat; und es kann ein Süßungsmittel wie Saccharose, Fructose, Lactose oder Aspertam oder einen Aromastoff wie Pfefferminze, das Öl der Moosbeere oder Kirschgeschmack zugegeben werden. Wenn die unit dosage form eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu den Materialien des oben genannten Typs, einen flüssigen Träger, wie ein Pflanzenöl oder Polyethylenglycol enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Ummantelungen oder um die physikalische Form der festen unit dosage form auf andere Weise zu modifizieren vorhanden sein. Zum Beispiel können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Gelatine, Wachs, Shellac oder Zucker und dergleichen beschichtet sein. Ein Sirup oder Elixier kann die aktive Verbindung, Saccharose oder Fruktose als Süßungsmittel, Methyl- und Propylparabene als Konservierungsstoffe, einen Farbstoff und einen Aromastoff wie Kirsch- oder Orangenaroma enthalten. Natürlich sollte jedes Material, das zur Herstellung irgendeiner unit dosage form verwendet wird, pharmazeutisch akzeptabel und im Wesentlichen in den eingesetzten Mengen nicht toxisch sein. Zusätzlich kann die aktive Verbindung in sustained-release Präparationen und Einheiten umfasst sein.
Die aktive Verbindung kann auch intravenös oder intraperitoneal mittels einer Infusion oder Injektion verabreicht werden. Lösungen der aktiven Verbindung oder ihrer Salze können in Wasser, optional mit einem nichttoxischen oberflächenaktiven Mittel gemischt, hergestellt werden. Es können auch Dispersionen in Glycerol, flüssigen Polyethylenglykolen, Tiacetin und Mischungen davon in Ölen hergestellt werden. Unter gewöhnlichen Bedingungen der Lagerung und Verwendung enthalten diese Präparationen einen Konservierungsstoff, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die pharmazeutischen Dosierungsformen, die für eine Injektion oder Infusion geeignet sind, können sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen oder sterile Pulver, die die aktive Ingredienz umfassen, einschließen, die für die extemporane Präparation von sterilen injezierbaren oder infusionierbaren Lösungen oder Dispersionen, optional in Liposomen eingeschlossen, angepasst sind. In allen Fällen muss die ultimative Dosierungsform steril, flüssig und unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein. Der flüssige Träger oder Vehikel kann ein Lösungsmittel oder ein flüssiges Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, ein Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglykol, flüssige Polyethylenglykole und dergleichen), pflanzliche Öle, nichttoxische Glycerylester und geeignete Mischungen davon umfasst. Die passende Fluidität kann zum Beispiel durch die Bildung von Liposomen, durch die Aufrechterhaltung der benötigten Partikelgröße im Fall von Dispersionen oder durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln aufrecht erhalten werden. Die Prävention der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und Antipilzmittel bewirkt werden, zum Beispiel durch Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerolsal und dergleichen. In vielen Fällen ist es vorzuziehen isotonische Mittel mit einzuschließen, zum Beispiel Zucker, Puffer oder Natriumchlorid. Eine hinausgezögerte Absorption der injezierbaren Zusammensetzungen kann bewirkt werden, indem in den Zusammensetzungen Mittel verwendet werden, die die Absorption verzögern, zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile injezierbare Lösungen werden durch die Inkorporation der aktiven Verbindung in der benötigten Menge in das geeignete Lösungsmittel mit verschiedenen anderen Ingredienzien, welche oben aufgezählt sind, wie benötigt hergestellt, gefolgt von einer Filtersterilisation. Im Fall von sterilen Pulvern für die Präparation von sterilen injezierbaren Lösungen sind die bevorzugten Verfahren zur Herstellung Vakuum- und Gefriertrocknungstechniken, die ein Pulver der aktiven Ingredienz plus irgendeine zusätzliche gewünschte Ingredienz ergeben, welche in den zuvor filtersterilisierten Lösungen vorhanden ist.
Für eine topikale Verabreichung können die vorliegenden Verbindungen in reiner Form angewendet werden, dass heißt wenn sie Flüssigkeiten sind.
Jedoch wird es im Allgemeinen wünschenswert sein sie auf die Haut als Zusammensetzungen oder Formulierungen in Kombination mit einem dermatologisch akzeptablen Träger, der ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein kann, zu verabreichen.
Brauchbare feste Träger schließen fein verteilte Feststoffe wie Talk, Lehm, mikrokristalline Cellulose, Silica, Tonerde und dergleichen ein. Brauchbare flüssige Träger schließen Wasser, Alkohole oder Glykole oder Wasser-Alkohol/Glykol-Mischungen ein, in welchen die vorliegenden Verbindungen zu einem wirksamen Grad gelöst oder dispergiert werden können, optional mit der Hilfe von nicht toxischen oberflächenaktiven Mitteln. Adjuvants wie Düfte und zusätzliche antimikrobielle Mittel können, um die Eigenschaften für eine gegebene Verwendung zu optimieren, zugegeben werden. Die resultierenden flüssigen Zusammensetzungen können von einem Absorptionspad aufgetragen werden, das verwendet wird, um Bandagen und andere Verbandsmaterialien zu imprägnieren, oder sie können auf den betroffenen Bereich unter Verwendung eines Pumptyp- oder Aerosolsprayers aufgesprüht werden.
Verdicker wie synthetische Polymere, Fettsäuren, Fettsäuresalze und -ester, Fettalkohole, modifizierte Cellulosen oder modifizierte Mineralmaterialien können auch mit einem flüssigen Träger eingesetzt werden, um streichbare Pasten, Gele, Salben, Seifen und dergleichen für eine direkte Anwendung auf der Haut des Verbrauchers zu bilden.
Beispiele für brauchbare dermatologische Zusammensetzungen, die verwendet werden können, um die Verbindungen mit der Formel (I) auf die Haut zu übertragen, sind in Jacquet et al. (U.S. Pat. Nr. 4,608,392), Geria (U.S. Pat. Nr. 4,992,478), Smith et al. (U.S. Pat. Nr. 4,559,157) und Wortzman (U.S. Pat. Nr. 4,820,508) offenbart.
Brauchbare Dosierungen der Verbindungen mit der Formel (I) können durch den Vergleich ihrer in vitro und in vivo Aktivität in Tiermodellen bestimmt werden. Verfahren für die Extrapolation der wirksamen Dosen in Mäusen und anderen Tieren auf den Menschen sind im Stand der Technik bekannt; siehe zum Beispiel U.S. Pat. Nr. 4,938,949. Brauchbare Dosierungen der Typ IV PDE-Hemmer sind im Stand der Technik bekannt. Siehe zum Beispiel U.S. Pat. Nr. 5,877,180, Col. 12.
Im Allgemeinen sind die Konzentrationen der Verbindungen) mit der Formel (I) in einer flüssigen Zusammensetzung wie einer Lotion etwa 0,1–25 Gew.%, vorzugsweise etwa 0,5–10 Gew.%. Die Konzentrationen in einer halbfesten oder festen Zusammensetzung wie einem Gel oder einem Pulver sind etwa 0,1–5 Gew.%, vorzugsweise etwa 0,5–2,5 Gew.%.
Die Menge der Verbindung oder eines aktiven Salzes oder Derivates davon, die für die Verwendung bei einer Behandlung benötigt wird, wird nicht nur mit dem jeweiligen ausgewählten Salz variieren, sondern auch mit dem Verabreichungsweg, der Beschaffenheit der Kondition, die behandelt wird, und dem Alter und der Kondition des Patienten und sie wird letztendlich in dem Ermessen des beistehenden Physikers oder Krankenhausarztes liegen.
Im Allgemeinen jedoch wird eine geeignete Dosis im Bereich von etwa 0,5 bis 100 μg/kg liegen, zum Beispiel von etwa 10 bis etwa 75 μg/kg des Körpergewichts pro Tag, wie 3 bis etwa 50 μg per Kilogramm Körpergewicht des Rezipienten pro Tag, vorzugsweise im Bereich von 6 bis 90 μg/kg/Tag und besonders vorzugsweise im Bereich von 15 bis 60 μg/kg/Tag.
Die Verbindung wird in geeigneter Weise in einer unit dosage form verabreicht, die zum Beispiel 5 bis 1000 μg, geeigneter Weise 10 bis 750 μg und in besonders geeigneter Weise 50 bis 500 μg der aktiven Ingredienz per unit dosage form enthält.
Idealweise sollte die aktive Ingredienz verabreicht werden, um Spitzenplasmakonzentrationen der aktiven Verbindung von etwa 0,1 bis etwa 10 nM, vorzugsweise etwa von 0,2 bis 10 nM und besonders vorzugsweise von etwa 0,5 bis 5 nM zu erreichen. Dieses kann zum Beispiel durch eine intravenöse Injektion einer 0,05 bis 5% Lösung der aktiven Ingredienz, optional in Saline, oder durch die orale Verabreichung als einen Bolus, der etwa 1–100 μg der aktiven Ingredienz enthält, erreicht werden. Wünschenswerte Blutlevel können durch eine kontinuierliche Infusion, um etwa 0,01–5,0 μg/kg/Std bereitzustellen, oder mittels unterbrochener Infusionen aufrecht erhalten werden, die etwa 0,4–15 μg/kg der aktiven Ingredienzien) enthalten.
Die gewünschte Dosis kann in geeigneter Weise in einer einzigen Dosis vorgelegt werden oder als aufgeteilte Dosen in geeigneten Intervallen verabreicht werden, zum Beispiel als zwei, drei, vier oder mehrere Subdosen pro Tag. Die Subdosis selbst kann ferner weiter aufgeteilt sein, zum Beispiel in eine Anzahl diskreter, locker verteilter Verabreichungen; wie mehrfache Inhalationen von einem Insufflator oder durch die Anwendung einer Vielzahl von Tropfen in das Auge. Zum Beispiel ist es wünschenswert die vorliegenden Zusammensetzungen intravenös über einen verlängerten Zeitraum, im Anschluss an den Insult, der die Entzündung verursachte, zu verabreichen.
Die Fähigkeit einer gegebenen Verbindung nach der Erfindung als ein A_2A-Adenosinrezeptoragonist (oder -antagonist) zu wirken kann unter Verwendung von pharmakologischen Modellen bestimmt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, oder unter Verwendung von den unten beschriebenen Tests.
Die Erfindung wird ferner mit Bezug auf die folgenden detaillierten Beispiele beschreiben werden. Das Folgende sind Marken: Celite, Ficoll, Zeneca und ICN.
Beispiel 1. Trans-(1-(4-Hydroxymethyl)cyclohexyl]methyl)-4-methylbenzensulfonat (5.2).
Es wurde Natriumhydrid (1,68 g, 70 mmol) zu einer Lösung aus 10 g (70 mmol) [4-(Hydroxymethyl)cyclohexyl]methan-1-ol (5.1) in 700 ml Tetrahydrofuran zugegeben und für 1 Stunde gerührt, dann wurde p-Toluolsulfonylchlorid (13,3 g, 70 mmol) zugegeben und die Reaktionsmischung für 5 Stunden refluxiert. Die Reaktion wurde dann auf 0°C abgekühlt und langsam mit Wasser abgekühlt bis kein reaktives Hydrid mehr vorhanden war. Sobald das Hydrid abgekühlt (quenched) war, wurde die Reaktionsmischung mit Ether (700 ml) verdünnt und 2-mal mit 10% wässrigen Kaliumcarbonat (700 ml) extrahiert. Die organischen Bestandteile wurden unter Verwendung von Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Das Produkt wurde mittels einer Chromatographie auf einer Silikagelsäule aufgereinigt, wobei mit Aceton-Dichlormethan (5 : 95) eluiert wurde, um 5.2 (35%) zu ergeben. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7,75 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,32 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 3,79 (d, J = 6,35 Hz, 2H), 3,39 (d, J = 6,35 Hz, 2H), 2,42 (s, 3H), 1,75 (m, 4H), 1,59 (m, 1H), 1,37 (m, 1H), 0,9 (m, 4H). ¹³C NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 145,3, 133,4, 130,3, 130,3, 128,3, 128,3, 75,8, 68,5, 40,6, 37,8, 28,9, 28,9, 28,9, 28,9, 22,1.
Beispiel 2. (4-Prop-2-ynylcyclohexyl)methan-1-ol (5.3).
Es wurde ein Lithiumacetylidethylendiamin-Komplex (90%) (6,4 g, 70 mmol) sehr langsam zu einer Lösung aus 5.2 (3 g, 10 mmol) in 40 ml Dimethylsulfoxid zugegeben. Der Reaktionsmischung wurde für 5 Tage gerührt und dann langsam bei 0°C mit Wasser abgekühlt. Diese Mischung wurde mit Ether (300 ml) verdünnt und 3-mal mit gesättigtem, wässrigem Ammoniumchlorid (200 ml) extrahiert. Die organischen Bestandteile wurden mit Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und das Produkt mittels einer Chromatographie auf einer Silikagelsäule aufgereinigt, wobei mit Ethylacetat-Hexanen (20 : 80) eluiert wurde, um 5.3 (85%) zu ergeben. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 3,41 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 2,07 (dd, J = 2,5, 6,5 Hz, 2H), 1,96–1,75 (m, 5H), 1,41 (m, 2H), 0,095 (m, 4). ¹³C NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 83,8, 69,6, 68,9, 40,7, 37,7, 32,3, 32,3, 29,6, 29,6, 26,5.
Beispiel 3. 4-Prop-2-ynylcyclohexancarbonsäure (5.4).
Es wurde eine Lösung aus Chromtrioxid (1,1 g, 11 mmol) in 1,5 M Schwefelsäure (40 ml, 27 mmol) auf 0°C gehalten, während 5.3 (0,46 g, 3 mmol) in 80 ml Aceton über 2 Stunden zugegeben wurde. Die Reaktion wurde dann für weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether (200 ml) verdünnt und 2-mal mit Wasser extrahiert. Die organischen Bestandteile wurden mit Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und das Produkt mittels einer Chromatographie auf einer Silikagelsäule aufgereinigt, wobei mit Aceton-Dichlormethan (70 : 30) eluiert wurde, um 5.4 (75%) zu ergeben. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 2,24 (dt, J = 3,66, 12,1 Hz, 1H), 2,10 (dd, J = 2,7, 6,5 Hz, 2H), 2,04–1,89 (m, 5H), 1,76 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 1,43 (dq, J = 3,28, 13,1 Hz, 2H), 1,03 (dq, J = 3,28, 13,1 Hz, 2H). ¹³C NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 183,2, 83,3, 69,9, 43,4, 36,7, 31,8, 28,9, 26,3.
Beispiel 4. Methyl-4-prop-2-ynylcyclohexancarboxylat (5.5).
Es wurde eine (Trimethylsilyl)diazomethan (2,0 M)-lösung in Hexanen (1 ml, 2 mmol) zu einer Lösung aus 5.4 (0,34 g, 2 mmol) in 15 ml Methanol : Dichlormethan (3 : 7) zugegeben. Die Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck entfernt, was zu einer 100% Konversion des Ausgangsmaterials zu dem Produkt führte. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 2,24 (dt, J = 3,66, 12,1 Hz, 1H), 2,10 (dd, J = 2,7, 6,5 Hz, 2H), 2,06 (dd, J = 1,54, 6,54 Hz, 1H), 2,00–1,89 (m, 3H), 1,76 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 1,43 (dq, J = 3,28, 13,1 Hz, 2H), 1,03 (dq, J = 3,28, 13,1 Hz, 2H). ¹³C NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 176,8, 83,3, 69,8, 51,9, 43,4, 36,7, 31,9, 29,2, 26,3.
Beispiel 5. [(2R,3R,4R,5R)-3,4-Diacetyloxy-5-(2-amino-6-oxohyropurin-9-yl)oxolan-2-y]methylacetat (6.2).
Eine Suspension aus 113 g (0,4 mol) trockenem Guanosin (6.1), Essigsäureanhydrid (240 ml, 2,5 mol), trockenem Pyridin (120 ml) und trockenem DMF (320 ml) wurden für 3,75 Stunden auf 75°C erhitzt, ohne dass die Temperatur 80°C überschritt. Die klare Lösung wurde dann in einen 3 1 Erlenmeyer-Kolben transferiert und mit 2-Propanol gefüllt. Nach dem Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur wurde die Rekristallisation initiiert und über Nacht bei 4°C fortgesetzt. Das weiße Feststoffiltrat wurde gefiltert, mit 2-Propanol gewaschen und aus 2-Propanol rekristallisiert, um 6.2 (96%) zu ergeben. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8,20 (s, 1H, H-8), 6,17 (d, J = 5,41 Hz, 1H, H-1'), 5, 75 (t, J = 5,39 Hz, 1H, H-2'), 5,56 (t, J = 5,0, H-3'), 4,41 (m, 3H, H-4',5'), 2,14 (s, 3H, Ac), 2,11 (s, 3H, Ac), 2,10 (s, 3H, Ac). ¹³C NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 171,0, 170,3, 1702, 157,7, 154,8, 152,4, 136,7, 117,7, 85,5, 80,4, 73,0, 71,3, 64,0, 31,3, 21,2, 21,0.
Beispiel 6. [(2R,3R,4R,5R)-3,4-Diacetyloxy-5-(2-amino-6-chlorpurin-9-yl)oxolan-2-yl]methylacetat (6.3).
In einen 1000 ml Glaskolben wurden 80 g (0,195 mol) [(2R,3R,4R,SR)-3-4-Diacetyloxy-5-(2-amino-6-oxohyropurin-9-yl)oxolan-2-yl]methylacetat (6.2), Tetramethylammoniumchlorid (44 g, 0,4 mol), wasserfreies Acetonitril (400 ml) und N,N-Dimethlanilin (25 ml) gegeben. Der Glaskolben wurde in ein Eis-Salz-Bad gegeben und auf 2°C abgekühlt. Zu dieser Lösung wurde tropfenweise POCl₃ (107 ml, 1,15 mol) in einer Geschwindigkeit zugegeben, so dass die Temperatur auf unter 5°C gehalten wurde (45 Minuten). Der Glaskolben wurde dann aus dem Eisbad entfernt, mit einem Kondensator ausgestattet, in ein Ölbad gegeben und 10 Minuten refluxiert, während sich die Lösung zu einer rotbraunen Farbe veränderte. Das Lösungsmittel wurde dann unter reduziertem Druck entfernt, um einen öligen Rest zu ergeben, welcher in ein Becherglas transferiert wurde, das 1000 g Eis und 400 ml CHCl₃ enthielt, und für 1,5 Stunden gerührt, um alles verbleibende POCl₃ zu zersetzen. Die organische Phase wurde dann entfernt und die wässrige Phase mit 3 × 50 ml CHCl₃ extrahiert und mit der organischen Phase vereinigt. Die vereinigten organischen Bestandteile wurden dann mit 50 ml Wasser zurückextrahiert, gefolgt von dem Verrühren mit 200 ml gesättigtem NaHCO₃. Die organischen Bestandteile wurden ferner mit NaHCO₃ extrahiert bis der wässrige Extrakt neutral war (2×). Die organischen Bestandteile wurden endgültig mit Salzlauge extrahiert und dann über MgSO₄ für 16 Stunden getrocknet. Zu der Lösung wurden 800 ml 2-Propanol zugegeben und danach wurde die Lösung unter reduziertem Druck konzentriert. Zu dem öligen Feststoff wurden 200 ml 2-Propanol zugegeben und die Lösung wurde über Nacht eingefroren. Das kristalline Produkt wurde gefiltert, gewaschen und über Nacht erlaubt zu trocknen, um 6.3 (77%) zu ergeben. ¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 8,31 (s, 1H, H-8), 7,00 (s, 2H, NH₂), 6,06 (d, J = 5,8 Hz, 1H, H-1'), 5,83 (t, J = 6,16 Hz, 1H, H-2'), 5,67 (m, 1H, H-3'), 4,29 (m, 3H, H-4', 5'), 2,07 (s, 3H, Ac), 1,99 (s, 3H, Ac), 1,98 (s, 3H, Ac). ¹³C NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 171,0, 170,4, 170,2, 160,8, 154,6, 150,8, 142,2, 124,5, 85,8, 80,6, 72,8, 71,2, 63,9, 21,4, 21,3, 21,1.
Beispiel 7. [(2R,3R,4R,5R)-3,4-Diacetyloxy-5-(6-chlor-2-iodpurin-9-yl)oxolan-2-yl]methylacetat (6.4).
Es wurde Isoamylnitrit (5 ml, 37 mmol) zu einer Mischung aus 5,12 g (12 mmol) [(2R,3R,4R,SR)-3-,4-Diacetyloxy-5-(2-amino-6-chlorpurin-9-yl) oxolan-2-yl]methylacetat (6.3), I₂ (3,04 g, 12 mmol), CH₂I₂ (10 ml, 124 mmol) und CuI (2,4 g, 12,6 mmol) in THF (60 ml) zugegeben. Die Mischung wurde unter Rückfluss für 45 Minuten erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Zu dieser Lösung wurden 100 ml saturiertes Na₂S₂O₂ zugegeben, was die rötliche Farbe auf Grund des Jods entfernte. Das Wässrige wurde 3× mit Chloroform extrahiert, es wurde vereinigt, über MgSO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Produkt wurde dann über einer Silikagelsäule aufgereinigt, wobei CHCl₃-MeOH (98 : 2) verwendet wurde, um [(2R,3R,4R,SR)-3,4-Diacetyloxy-5-(6-chlor-2-iodpurin-9-yl)oxolan-2-yl]methylacetat (6.4) (80% aus EtOH kristallisiert) anzusammeln.
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8,20 (s, 1H, H-8), 6,17 (d, J = 5,41 Hz, 1H, H-1'), 5,75 (t, J = 5,39 Hz, 1H, H-2'), 5,56 (t, J = 5,40 Hz, 1H, H-3'), 4,38 (m, 3H, H-4', 5'), 2,14 (s, 1H, Ac), 2,11 (s, 1H, Ac), 2,10 (s, 1H, Ac).
Beispiel 8. (4S,2R,3R,5R)-2-(6-Amino-2-iodpurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolan-3,4-diol (6.5).
Zu einem Glaskolben, der 6,0 g (11,1 mmol) [(2R,3R,4R,SR)-3,4-Diacetyloxy-5-(6-chlor-2-iodpurin-9-yl)oxolan-2-yl]methylacetat (6.4) enthielt, wurden 100 ml flüssiger NH₃ mit –78°C zugegeben und die Lösung für 6 Stunden gerührt. Nach dieser Zeit wurde der Lösung erlaubt über Nacht auf Raumtemperatur zu kommen, mit einer gleichzeitigen Evaporation des NH₃, um ein braunes Öl zu ergeben. Das Produkt wurde aus heißem Isopropanol kristallisiert, um 6.5 (80%) zu ergeben, Schmelzpunkt 143-145°C, R. f. = 0,6 in 20% MeOH/CHCl₃. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,24 (s, 1H), 7,68 (s, 2H), 5,75 (d, J = 6,16, 1H), 5,42 (d, J = 5,40 Hz, 1H), 5,16 (d, J = 4,62 Hz, 1H), 4,99 (t, J = 5,39 Hz, 1H), 4,67 (d, J = 4,81 Hz, 1H), 4,06 (d, J = 3,37 Hz, 1H), 3,89 (m, 1H), 3,54 (m, 2H).
Beispiel 9. [(1R,2R,4R,5R)-4-(6-Amino-2-iodpurin-9-yl)-7-7-dimethyl-3,6,8-trioxabicyclo[3,3,0]oct-2-yl]methan-1-ol (6.6).
Zu einer Lösung aus 2,0 g (5,08 mmol) (4S,2R,3R,SR)-2-(6-Amino-2-iodpurin-9-yl)-5(hydroxymethyl)oxolan-3,4-diol (6.6) in 100 ml Aceton wurden 9,6 g p-Toluolsulfonsäure und 5 ml Dimethoxypropan zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt, zu welchem Zeitpunkt 15 g NaHCO₃ (zugegeben wurden), und dann für weitere 3 Stunden gerührt. Der Rest wurde gefiltert und 2 × mit EtOAc gewaschen. Das Filtrat wurde dann unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rest wurde auf einer Silikagelsäule mit MeOH-CHCl₃ (1 : 99) chromatographiert, um 6.6 (72%) als einen Feststoff zu ergeben, Schmelzpunkt 185–187°C. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,22 (s, 1H, H-8), 7,69 (s, 2H), NH₂), 6,00 (d, J = 2,70 Hz, 1H, H-1'), 5,21 (m, 1H, H-2'), 5,07 (bs, 1H, OH), 4,88 (m, 1H, H-3'), 4,13 (m, 1H, H-4'), 3,47 (m, 2H, H-5'), 1,49 und 1,28 (s, 3H, C(CH₃)₂).
Beispiel 10. (2S,1R,4R,5R)-4-(6-Amino-2-iodpurin-9-yl)-7,7-dimethyl-3,6,8-trioxabicyclo[3.3.0]octan-2-carbonsäure (6.7).
Zu einer gerührten Lösung aus 1,6 g (3,7 mmol) [(1R,2R,4R,SR)-4-(6-Amino-2-iodpurin-9-yl)-7-7-dimethyl-3,6,8-trioxabicyclo[3.3.0]oct-2-yl]methan-1-ol (6.6) in 200 ml H₂O wurden 0,60 g KOH und tropfenweisen eine Lösung aus 1,70 g (10,8 mmol) KMnO₄ in 50 ml H₂O zugegeben. Die Mischung wurde für 225 Stunden im Dunklen bei Raumtemperatur beiseite gestellt. Die Reaktionsmischung wurde dann auf 5–10°C abgekühlt und mit einer Lösung aus 4 ml 30% H₂O₂ in 16 ml Wasser entfärbt, während die Temperatur auf unter 10°C unter Verwendung eines Eis-Salz-Bads gehalten wurde. Die Mischung wurde durch Celite gefiltert und das Filtrat unter reduziertem Druck auf etwa 10 ml konzentriert und dann auf pH 4 mit 2N HCl angesäuert. Das resultierende Präzipitat wurde abgefiltert und mit Ether gewaschen, um 6.7 (70%) als einen weißen Feststoff nach dem Trocknen zu ergeben Schmelzpunkt 187–190°C. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,11 (s, 1H, H-8), 7,62 (s, 2H, NH₂), 7,46 (s, 1H, COOH), 6,22 (s, 1H, H-1'), 5,42 (d, J = 5,71 Hz, 1H, H-2'), 5,34 (d, J = 6,16 Hz, 1H, H-3'), 4,63 (s, 1H, H-4'), 1,46 und 1,30 (s, 3H, C(CH₃)₂).
Beispiel 11. (2S,3S,4R,5R)-5-(6-Amino-2-iodpurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-carbonsäure (6.8).
Es wurde eine Lösung aus 1,72 g (3,85 mmol) (2S,1R,4R,SR)-4-(6-Amino-2-iodpurin-9-yl)-7,7-dimethyl-3,6,8-trioxabicyclo[3.3.0]octan-2-carbonsäure (6.7) in 80 ml 50% HCOOH bei 80°C für 1,5 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter reduziertem Druck evaporiert, in H₂O gelöst und die Lösung wieder evaporiert. Dieser Prozess wurde so oft wiederholt, bis in dem Rest der Geruch nach Ameisensäure verschwunden war. Die Rekristallisation aus Wasser ergab 1,33 g (85%) 6.8 als einen weißen Feststoff, Schmelzpunkt 221–223°C, Zersetzung. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,31 (s, 1H, H-8), 7,68 (s, 2H, NH₂), 5,90 (d, J = 6,55 Hz, 1H, H-1'), 4,42 (m, 1H, H-2'), 4,35 (d, J = 2,31 Hz, 1H, H-4'), 4,22 (m, 1H, H-3').
Beispiel 12. [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-Amino-2-iodpurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-N-ethylcarboxamid (6.9).
Zu einer gekühlten (5°C) und gerührten Lösung aus 1,29 g (3,17 mmol) (2S, 3S,4R,SR)-5-(6-Amino-2-iodpurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-carbonsäure (6.8) in 150 ml absolutem Ethanol wurden tropfenweise 1,15 ml eisgekühltes SOCl₂ zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und dann mit gesättigtem wässrigen NaHCO₃ auf pH 8 gebracht. Die Mischung wurde gefiltert und dann das Filtrat unter reduziertem Druck konzentriert, um einen weißen Feststoff zu ergeben, welcher getrocknet und dann in 20 ml trockenem Ethylamin bei –20°C für 3 Stunden und dann bei Raumtemperatur über Nacht wieder gelöst wurde. Die Reaktionsmischung wurde mit absolutem Ethanol verdünnt und das präzipitierte Produkt abgefiltert und mit trockenem Ether gewaschen, um 530 mg (72%) 6.9 als einen reinen Feststoff zu ergeben, Schmelzpunkt 232–234°C. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,34 (s, 1H, H-8), 8,12 (t, 1H, NH), 7,73 (s, 2H, NH₂) 5,85, (d, J = 6,93 Hz, 1H, H-1'), 4,54 (m, 1H, H-2'), 4,25 (d, J = 1,92 Hz, 1H, H-4'), 4,13 (m, 1H, H-3'), 3,28 (m, 2H, CH₂CH₃), 1,00 (t, J = 7,2 Hz, 3H, CH₂CH₃).
Beispiel 13. Methyl-4-(3-{9-[(4S,5S,2R,3R)-5-(N-ethylcarbamoyl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-6-aminopurin-2-yl)}prop-2-ynyl)cyclohexancarboxylat (DWH-146e).
Zu einer entgasten Lösung aus 25 mg (0,063 mmol) [(2S,3S,4R,SR)-5-(6-Amino-2-jodpurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-N-ethylcarboxamid (6.9), 16,9 mg (0,094 mmol) (5.5) und 0,75 mg CuI in jeweils 5 ml Triethylamin (TEA) und Acetonitril wurden 15 mg Pd(PPh₃)₄ zugegeben. Die Lösung wurde für 24 Stunden bei 70°C gerührt, danach durch Celite gefiltert und auf Silikagel mit MeOH-CHCl₃ (5 : 95) chromatographiert, um DWH-146e (24%) zu ergeben.
Beispiel 14. (4-Prop-2-ynylcyclohexyl)methylacetat (5.6).
Es wurden Essigsäureanhydrid (0,92 ml, 8,25 mmol) und Pyridin (0,2 ml, 2,5 mmol) zu einer Lösung aus 5.3 (250 mg, 1,65 mmol) in 25 ml Ether zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Es wurde Wasser zu der Reaktion zugegeben und die organischen Bestandteile ferner mit 10% NaHCO₃ extrahiert. Die organischen Schichten wurden mit MgSO₄ getrocknet und evaporiert. Der Rest wurde auf Silikagel mit EtOAc-Hexanen (5 : 95) chromatographiert, um 5.6 (47%) zu erhalten.
Beispiel 15. [4-(3-{9-[(4S,5S,2R,3R)-5-(N-ethylcarbamoyl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-6-aminopurin-2-yl)}prop-2-ynyl)cyclohexyl]methylacetat (JMR193).
Zu einer entgasten Lösung aus 125 mg (0,29 mmol) [(2S,3S,4R,SR)-5-(6-Amino-2 jodpurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-N-ethylcarboxamid (6.9), 150 mg (0,77 mmol) (5.6) und 1,0 mg CuI in 1,3 ml TEA und 4 ml DMF wurden 25 mg Pd(PPh₃)₄ zugegeben. Die Lösung wurde für 72 Stunden bei 60°C gerührt, danach durch Celite gefiltert und auf Silikagel mit MeOH-CHCl₃ (5 : 95) chromatographiert, um JMR193 (10%) zu ergeben.
Beispiel 16. [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-Amino-2-{3-[4-(hydroxymethyl)cyclohexyl]prop-2-ynyl}purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-N-ethylcarboxamid.
A. (4-Prop-2-ynylcyclohexyl)methan-1-ol.
Es wurde ein Lithiumacetylidethylendiamin-Komplex (90%) (6,4 g, 70 mmol) sehr langsam zu einer Lösung aus trans-[4-(Hydroxymethyl)cyclohexyl]-methyl-4-methylbenzensulfonat (3 g, 10 mmol) in 40 ml Dimethylsufoxid zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 5 Tage gerührt und dann langsam bei 0°C mit Wasser abgekühlt. Die Mischung wurde mit Ether (300 ml) verdünnt und 3-mal mit gesättigtem, wässrigem Ammoniumchlorid (200 ml) gewaschen. Die organischen Bestandteile wurden mit Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Das Produkt wurde mittels Chromatographie auf einer Silikagelsäule aufgereinigt, wobei mit Ethylacatat-Hexanen (20 : 80) eluiert wurde, um das Produkt (85%) zu liefern. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 3,41 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 2,07 (dd, J = 2,5, 6,5 Hz, 2H), 1,96–1,75 (m, 5H), 1,41 (m, 2H), 0,095 (m, 4). ¹³C NMR (300 MHz, CDCl₃) d 83,8, 69,6, 68,9, 40,7, 37,7, 32,3, 32,3, 29,6, 29,6, 26,5.
B. [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-Amino-2-{3-[4-(hydroxymethyl)cyclohexyl]prop-1-yl}purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-N-ethylcarboxamid (JMR2037).
Es wurden 10 mg Ph(PPh₃)₄ zu einer entgasten Lösung aus 28 mg (0,065 mmol) [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-Amino-2-jodpurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-N-ethylcarboxamid, 30 mg (0,20 mmol) (4-Prop-2-ynylcyclohexyl)methan-1-ol und 1,0 mg CuI in 1 ml Triethylamin (TEA), 1 ml DMF und 1 ml Acetonitril zugegeben. Die Lösung wurde für 60 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, danach durch Celite gefiltert und auf Silikagel mit MeOH-CHCl₃ (7 : 93) chromatographiert, um 5 mg (17%) JMR2037 zu ergeben. Die in der Überschrift genannte Verbindung wurde unter Verwendung eines Bindungsassays, welcher hierin offenbart ist, getestet und es wurde herausgefunden, dass sie an rekombinante humane A_2A-Rezeptoren bindet, Ki von 694 ± 69 nM.
Beispiel 17. Radioligandbindungsstudien.
Die Bindung an die A_2A-Rezeptoren wurde mit dem Radioliganden ¹²⁵I-ZM241385 evaluiert. 2B stellt die Kompetition von selektiven Agonisten für die Bindung an rekombinante humane A_2A-Adenosinrezeptoren dar. DWH-146e ist hoch selektiv für den rekombinanten humanen A_2A(hA2A) Subtyp. Die Selektivität für den A₃-Rezeptor (nicht gezeigt) ist weniger beeindruckend, aber dennoch etwa 50-fach. DWH-146e ist etwa 5- bis 50-mal potenter als WRC0470 beziehungsweise CGS21680 (1). Ein unerwarteter und interessanter Befund ist, dass der Ester, DWH-146e, auch etwa 50-mal potenter ist als die Säure, DWH-146a (1).
Beispiel 17A. Wirkung von DWH-146e und JMR193 auf die oxidative Aktivität von Neutrophilen
A. Materialien
f-met-leu-phe (fMLP), Luminol, Superoxiddismutase, Cytochrom-c, Fibrinogen, Adenosindeaminase und Trypanblau wurden von Sigma Chemical erhalten. Ficoll-Hypaque wurde von ICN (Aurora, OH), Cardinal Scientific (Santa Fe, NM) und Accurate Chemicals and Scientific (Westerbury, NY) bezogen. Endotoxin (Lipopolysaccharid; E. coli K235) kam von List Biologicals (Campbell, CA). Die Hanks Balanced Salzlösung (HBSS) und der Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test-Kit kam von BioWittaker (Walkersville, MD). Das humane Serumalbumin (HSA) war von Cutter Biological (Elkhart, IN). Der rekombinante humane Tumor-Nekrose-Faktor-alpha wurde von Dianippon Pharmaceutical Co. Ltd. (Osaka, Japan) beschafft. ZM241385 (4-(2-[7-Amino-2-(2-furyl)-[1,2,4]-triazol[2,3-a][1,3,5]triazin-5-yl-amino]ethyl)phenol) war ein Geschenk von Simon Poucher, Zeneca Pharmaceuticals, Cheshire, UK. Es wurden Stocklösungen (1 mM und 10 mM in DMSO) hergestellt und bei –20°C aufbewahrt.
B. Präpartion von humanen Neutrophilen
Aufgereinigte Neutrophile (~98% Neutrophile und > 95% lebensfähige mittels Trypanblauexklusion), die < 1 Thrombozyt pro 5 Neutrophiler und < 50 pg/ml Endotoxin (Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test) enthielten, wurden aus normalem heparinisiertem (10 U/ml) venösem Blut durch ein one-step Ficoll-Hypaque Separationsverfahren erhalten (A. Ferrante et al., J. Immunol. Meth., 36, 109 (1980)).
C. Freisetzung von entzündlichen reaktiven Sauerstoffspezies von geprimter und stimulierter humaner neutrophiler Chemilumineszenz.
Die Luminol-gesteigerte Chemilumineszenz, eine Maß für die oxidative Aktivität von Neutrophilen, hängt von sowohl der Superoxidproduktion als auch der Mobilisierung des Enzyms der lysosomalen Granula, der Myeloperoxidase, ab. Das Licht wird von unstabilen hochenergetischen Sauerstoffspezies emittiert, die von aktivierten Neutrophilen gebildet werden. Es wurden aufgereinigte Neutrophile (5 – 10 × 10⁵/ml) in einer Hanks Balanced Salzlösung, die 0,1% humanes Serumalbumin (1 ml) mit oder ohne DWH-146a, DWH-146e, CGS21680 oder JMR193 mit oder ohne Rolipram und mit oder ohne Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (1 U/ml) enthielt, für 30 Minuten bei 37°C in einem Schüttelwasserbad inkubiert. Dann wurde die Luminol (1 × 10^–4 M)-gesteigerte f-met-leu-phe (1 mcM)-stimulierte Chemilumineszenz mit einem Chronolog^® Photometer (Crono-log Corp., Havertown, PA) bei 37°C für 2–4 Minuten gelesen. Die Chemilumineszenz wird als das relative emittierte Peaklicht (= Hochpunkt der Kurve) angezeigt, verglichen mit den Proben mit dem Tumor-Nekrose-Faktor-alpha und ohne DWH, JMR oder Rolipram.
D. Ergebnisse
Wie in 2 gezeigt, verminderte sowohl JMR193 als auch DWH-146e die Tumor-Nekrose-Faktor-alpha-geprimte f-met-leu-phe-stimulierte oxidative Aktivität der humanen Neutrophilen, wie mittels der Luminol-gesteigerten Chemilumineszenz gemessen, wirksamer als der Adenosin-A_2A-Rezeptoragonist CGS21680. Die horizontale Achse gibt die Konzentration von CGS21680, DWH-146a, DWH-146e oder JMR193 an (log nM). Die vertikale Achse gibt die resultierende Spitzenaktivität der humanen Neutrophilen als relative Menge der stimulierten Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies an, wie mittels der Luminol-gesteigerten Chemilumineszenz gemessen, verglichen mit Kontrollproben, die nicht mit dem Tumor-Nekrose-Faktor-alpha geprimt waren. Mittel-SEM (n = 4–5 separate Experimente).
Die Daten unter der horizontalen Achse in 2 geben den EC₅₀ für die Reduktion der Aktivität der humanen Neutrophilen an (basierend auf den Daten in 2). Mittel-SEM (n = 4–5 separate Experimente). *p < 0,05 verminderter IC₅₀ verglichen mit CGS21680.
JMR193 and DWH-146e verminderten den stimulierten oxidativen Ausbruch der Neutrophilen mit EC₅₀'s kleiner als 1 nM (0,8 beziehungsweise 0,3 nM). Im Gegensatz waren die freien Säuren der A_2A-Adenosinrezeptoragonisten DWH-146a und CGS21680 nicht so wirksam bei der Hemmung des oxidativen Ausbruchs (53 beziehungsweise 9 nM; 2). Der DWH-146e-Hemmung des stimulierten oxidativen Ausbruchs der Neutrophilen wurde mit dem selektiven A_2A-AR-Antagonisten ZM241385 entgegengewirkt.
Wie in 3 gezeigt vermindert JMR193 (1 nM) mit Rolipram (100 nM) synergistisch die stimulierte Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies. Die humanen Neutrophilen wurden mit dem Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (1 U/ml) geprimt und mit f-met-leu-phe (1 μM) stimuliert. Die vertikale Achse gibt die Hemmung der oxidativen Aktivität in Prozent an, wie mittels der Luminol-gesteigerten Chemilumineszenz gemessen. Mittel-SEM (n = 4 separate Experimente. *p < 0,05 Synergie zwischen JMR193 und Rolipram, verglichen mit der additativen Aktivität.
Wie in 4 gezeigt, wirkte der hoch selektive A_2A-Adenosinrezeptorantagonist ZM241385 (100 nM) (ZM) der oxidativen Aktivität der humanen Neutrophilen entgegen, die durch JMR193 (10 nM) inhibiert wurde, wie mittels der Luminol-gesteigerten Chemilumineszenz gemessen. Mittel-SEM von 4 separaten Experimenten. *p = 0,0004 ZM241385 wirkte der JMR193-gehemmten oxidativen Aktivität entgegen.
E. Humanes neutrophiles [cAMP]_i und Anheftung der Neutrophilen an eine biologische Oberfläche
Es wurde eine 24-Well Gewebekulturplatte mit humanem Fibrinogen (5 mg/ml in 1,5% Natriumbicarbonat; 0,5 ml/Well; Sigma Chemical) über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ beschichtet. Die Neutrophilen (3 – 4 × 10⁶/0,5 ml/Probe) wurden in einem Well der beschichteten Platte für 45 Minuten in 0,5 ml HBSS inkubiert, das 0,1% HSA und ADA (1 U/ml) in der An- und Abwesenheit von rekombinantem TNFα (10 U/ml), DWH-146e (3–300 nM), Rolipram (300 nM) und/oder ZM241385 (100 nM) enthielt. Im Anschluss an die Inkubation wurden 0,5 ml HCl (0,2 N) zu den Wells zugegeben und für weitere 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um das cAMP zu extrahieren. Die Proben wurden dann in einer Microfuge für 2 Minuten zentrifugiert, um alle Zellfragmente zu entfernen. Es wurden 0,5 ml Proben für die cAMP-Analyse eingefroren (B. Brooler et al., Science, 194, 270 (1976)). Die Wells wurden zweimal mit normaler Saline gewaschen und der verbleibende Monolayer mit 0,2 ml 0,2 N NaOH, das SDS enthielt, für 2 Stunden bei Raumtemperatur verdaut. Die Proteinproben wurden dann für eine spätere Proteinanalyse eingefroren (–70°C), um die relative PMN-Anheftung zu bestimmen (K. P. Stowell et al., Anal. Biochem., 85, 572 (1978)).
Ergebnisse
DWH-146e (30–300 nM) alleine und synergistisch mit Rolipram (300 nM) erhöhte den cAMP-Gehalt der humanen Neutrophilen und synergistisch mit Rolipram erniedrigte es die Anheftung der Neutrophilen an eine Fibrinogenbeschichte Oberfläche (5). Den Wirkungen von DWH-146e (300 nM) + Rolipram (300 nM) auf die cAMP-Produktion und Anheftung der Neutrophilen wurde mit dem selektiven A_2A-Adenosinrezeptoragonisten ZM241385 (ZM; 100 nM) entgegengewirkt. Mittel-SEM von 5 separaten Experimenten. *p < 0,05 angestiegenes neutrophiles [cAMP], verglichen ohne DWH-146e; **p < 0,05 verminderte Anheftung der Neutrophilen verglichen ohne DWH-146e.
F. Oxidative Aktivität von haftenden humanen Neutrophilen
Verfahren: Unter Verwendung der Verfahren, die im Abschnitt E modifiziert wurden, wurden Neutrophile (2 × 10⁶/ml) aus der Ficoll-Hypaque-Separation 15 Minuten bei 37°C in 0,45 ml Hanks Balanced Salzlösung inkubiert, die 0,1% humanes Serumalbumin und Adenosindeaminase (1 U/ml), Rolipram (300 nM) und DWH-146e (3–300 nM) enthielt. Im Anschluss an die Inkubation wurden Cytochrom-c (120 μM) und Katalase (0,062 mg/ml) in der An- und Abwesenheit von rekombinantem humanem Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (1 U/ml) zugegeben und 200 μl Aliquots der Zellsuspension unverzüglich in Duplikatwells einer 96-Well Flachbodengewebekulturplatte transferiert, die über Nacht mit humanem Fibrinogen beschichtet worden war.
Die optische Dichte der Proben wurde bei 550 nm gegen abgestimmte Superoxidismutase (200 U/ml) -proben gelesen.
G. Ergebnisse
Wie in 6 gezeigt wurde die Hemmung des Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF)-stimulierten Superoxidfreisetzung der haftenden humanen Neutrophilen auf einer Fibrinogen-beschichteten Oberfläche durch Rolipram (300 nM) und DWH-146e erreicht. DWH-146e verminderte den oxidativen Ausbruch von haftenden Neutrophilen und verminderte synergistisch den oxidativen Ausbruch in der Anwesenheit von Rolipram, welches selbst nicht die oxidative Aktivität der Neutrophilen beeinflusste. Die horizontale Achse gibt die DHW-146e-Konzentration in nM an und die vertikale Achse die Menge an Superoxid, das von den Neutrophilen ausgeschüttet wurde und wie durch die Reduktion des Cytochrom-c gemessen. Es gab eine bezeichnende Synergie mit DWH-146e und dem Typ IV PDE-Hemmer, Rolipram, die Tumor-Nekrose-Faktor-alpha-stimulierte oxidative Aktivität der haftenden humanen Neutrophilen zu vermindern. Mittel-SEM der Wiederholung von 4–5 separaten Experimenten. *p < 0,05 verminderte Superoxidfreisetzung verglichen ohne DWH-146e; **p < 0,05 verminderte Superoxidfreisetzung verglichen mit Rolipram und ohne DWH-146e.
Beispiel 18. Behandlung einer Ischämie/Reperfusion (I/R)-Verletzung in der Niere mit DWH-146e.
Um zu bestimmen, ob oder ob nicht eine DWH-146e-induzierte A_2A-Adenosinrezeptoraktivierung das Plasmakreatinin 24 und 48 Stunden im Anschluss an eine I/R-Verletzung in Ratten reduziert, wurden Rattennieren für 45 Minuten einer Ischämie und 24 oder 48 Stunden einer Reperfusion unterworfen. Es wurde DWH-146e (0,004 μg/kg/min) oder das Vehikel kontinuierlich mittels einer Minipumpe verabreicht, wobei 5 Stunden vor der I/R begonnen wurde. Wie in 7 gezeigt verminderte DWH-146e das Plasmakreatinin in 7/7 Ratten (P < 0,05) beziehungsweise in 6/6 Ratten, behandelt mit DWH-146e (P < 0,001) nach 24 beziehungsweise 48 Stunden signifikant.
Um zu bestimmen, ob oder ob nicht die Wirkung von DWH-146e auf die Reduktion des Plasmakreatinins in Ratten, die einer I/R unterworfen wurden, A_2A-Rezeptor-vermittelt ist, wurden Rattennieren für 45 Minuten einer Ischämie, gefolgt von 48 Stunden Reperfusion, unterworfen. Es wurde DWH-146e (0,004 μg/kg/min) kontinuierlich mittels einer Minipumpe verabreicht, wobei 5 Stunden vor der Ischämie begonnen wurde. Wie in 8 gezeigt wurde die Verbesserung der Nierenfunktion durch den A_2A-Antagonisten ZM-241385 (0,003 μg/kg/min-äquimolarer Verabreichungsrate verglichen mit DWH-146e) umgekehrt (*P < 0,001 für das Vehikel vs. DWH; **P < 0,05 DWH vs. DWH/ZM. N = 5 für das Vehikel, DW; N = 6 für DWH/ZM. ANOVA, gefolgt von einer Bonferroni-Korrektion)
DWH-146e verhindert in Konzentrationen, die keine hämodynamischen Wirkungen haben, ein Nierenödem, eine Nekrose und den Zusammenschluss roter Blutkörperchen in der inneren Medulla.
Der Schutz gegen einen Nierenschaden, der durch DWH-146e (0,01 μg/kg/min s.c. für 48 Stunden) ermöglicht wurde, wurde mit einer dramatischen Hemmung der Anheftung der Neutrophilen an das vaskuläre Endothelium korreliert. Es wird angenommen, dass die Interaktionshemmung durch DWH-146e zwischen den Neutrophilen und dem vaskulären Endothelium wenigstens zum Teil für den Schutz vor einem Nierenschaden verantwortlich ist.
Um zu bestimmen, ob oder ob nicht die A_2A-AR-Aktivierung die Neutrophilen in der äußeren Medulla von Ratten reduziert, die einer I/R unterworfen wurden, wobei Neurolucida^® verwendet wurde, wurden die Nieren bei 100× Vergrößerung betrachtet und die gesamte Niere wurde gezeichnet. Die PMNs wurden gezählt, indem Nierensektionen bei 250 × Vergrößerung angesehen wurden. Die Nierensektionen wurden mit optischen Rahmen überlegt, die unter dem Mikroskop eingeblendet wurden, und alle PMNs wurden innerhalb jedes Rahmens gezählt. Dieses System verhindert, dass PMNs mehr als einmal gezählt werden. Wie in 9 gezeigt war die Dichte der Neutrophilen 15,65/mm² für das Vehikel und 3,02/mm² für die DWH-146e-Behandlung.
Beispiel 19. Wirkung von DWH-146e auf eine Lungenreperfusionsverletzung.
A. Verfahren: Es wurde ein isoliertes, gesamtblutdurchschwemmtes, ventiliertes Kaninchenlungenmodel verwendet. Die Spenderkaninchen machten die Lungenentnahme nach einer Pulmonalarterien (PGE_i)-infusion und einer Euro-Collins Konservierungslösungspühlung durch und die Lungen wurden für 18 Stunden bei 4°C konserviert. Die Lungen der Gruppe I(n = 9) dienten als Kontrollgegenstände. Die Lungen der Gruppe II(n = 9) wurden mit Gesamtblut, das zuerst durch einen Leukozytendepletionsfilter passiert worden war, reperfusiert. In der Gruppe III (n = 9) wurde DWH-146e zu dem Blutreperfusat (25 μg/kg) unverzüglich vor der Reperfusion zugegeben und über die Reperfusionsperiode durchwegs verabreicht (1 μg/kg/min). Alle Lungen wurden für 30 Minuten reperfusiert und es wurden der pulmonalarterielle Druck (PAP für Englisch: pulmonary artery pressure), die pulmonale vaskuläre Resistenz (PVR), die Atemwegskompleanz (CPL) und die arterielle Oxygenierung festgehalten. Die Mycloperoxidaseaktivität (MPO) wurde festgehalten, um die Sequestrierung der Neutrophilen zu quantifizieren, und es wurden die Nass/Trockengewichtsverhältnisse gemessen, um das pulmonale Ödem zu demonstrieren.
B. Ergebnisse. Die arterielle Oxygenierung in der Gruppe II und III war nach 30 Minuten Reperfusion signifikant höher als die der Gruppe I (514,27 ± 35,80 und 461,12 ± 43,77 vs. 91,41 ± 20,58 mm Hg, p < 0,001). Wie in 10 gezeigt wiesen die Gruppe III-Lungen eine progressive Beteiligung in dem pO₂ über die Reperfusion hindurch auf. Die Leukozytendepletion in den Gruppe II-Lungen verbesserte die arterielle Oxygenierung in der frühen Reperfusion. *p < 0,004 (Gruppe II versus Gruppe I und III); **p < 0,001 (Gruppe II und III versus Gruppe I).
Wie in 11 gezeigt war die Mittel-PVR in der Gruppe II signifikant reduziert, wenn sie mit den Kontrollungen verglichen wurde (*p < 0,001). Die PVR der Gruppe III-Lungen war sogar signifikant niedriger als die jener Lungen, die eine Reperfusion mit Blut durchliefen, das einer Leukozytendepletion unterworfen worden war (**p < 0,001 versus Gruppe I und II). Die pulmonale vaskuläre Resistenz war in der Gruppe III signifikant reduziert (22783 ± 357 dynes·s·cm^–5) verglichen mit sowohl der Gruppe II als auch der Gruppe I (31057 ± 1743 und 36911 ± 2173 dynes·s·cm^–5, p < 0,001). Die Atemwegskompleanz war in den Gruppen II und III verbessert, wenn sie mit der Gruppe I vergleichen wurde (1,68 ± 0,08 und 1,68 ± 0,05 vs. 1,36 ± 0,13, p = 0,03). Die mikrovaskuläre Permeabilität war in der Gruppe III auf 106,82 ± 17,09 reduziert verglichen mit 165,70 ± 21,83 ng Evans-Blau-Farbstoff/gm Gewebe in der Gruppe I (p = 0,05). Wie in 12 gezeigt war die Aktivität der Myeloperoxidase in der Gruppe III signifikant niedriger als in der Gruppe I (*p = 0,03). MPO = Myeloperoxidase. Die Myeloperoxidaseaktivität in der Gruppe III war 39,88 ± 4,87 verglichen mit 88,70 ± 18,69 ΔOD/gm/min in der Gruppe I (p = 0,03) und die Myeloperoxidaseaktivität in Gruppe II war 56,06 ± 7,46.
C. Schlussfolgerungen. DWH-146e reduzierte die Lungensequestrierung der Neutrophilen und verbesserte dramatisch die Funktion des pulmonalen Transplantats. Neutrophile sind wichtige Bestandteile der Entzündungskaskade von Reperfusionsverletzungen und ihr Ursprung kann sowohl das zirkulierende Blut als auch das Lungentransplantat selbst sein. Eine selektive Adenosin-A_2A-Aktivierung unterbricht die Neutrophilenvermittelte entzündliche Reaktion und reduziert die Lungenreperfusionsverletzung im Anschluss an eine Transplantation.
Unter dem Lichtmikroskop zeigten die Kontrollungen der Gruppe I eine schwere Leukozyteninfiltration und Ödembildung in den Alveolarräumen nach 18 Stunden ischämischer Lagerung und 30 Minuten Reperfusion. In den Lungen der Gruppe II, die eine Reperfusion mit Blut durchmachten, das einer Leukozytendepletion unterworfen worden war, und den Lungen der Gruppe III (die während der Reperfusion DWH-146e erhielten) war diese Infiltration viel geringer.
Beispiel 20. Wirkung von DWH-146e auf die neointimale Bildung nach einer arteriellen Verletzung.
Die Leukozytenaktivierung mit der Freisetzung von Entzündungscytokinen tritt nach einer perkutanen Koronarintervention ein und kann eine Rolle bei der Restinose spielen. In der Maus tritt eine robuste Neointimbildung in der Anwesenheit einer intakten Endothelschicht nach der Ligation der gemeinsamen Karotisarterie ein. Unter Verwendung dieses Models wurden C57/BL6-Mäuse zufällig zum Zeitpunkt der Karotisligation einer 7-tägigen Infusion mittels einer osmotischen Pumpe mit DWH-146e, (n = 7) oder dem Vehikel (n = 8) unterworfen.
Am 14. Tag nach der Karotisligation demonstrierte eine Histomorphometrie eine signifikante Reduktion im neointimalem Bereich (0,005 ± 0,004 mm² vs. 0,021 ± 0,014 mm², p = 0,02) und neotinimal zu dem medialen Bereichsverhältnis (0,13 ± 0,07 vs. 0,64 ± 0,44, p = 0,01) in den behandelten Tieren verglichen mit den Kontrollen. Der mediale Bereich war in den zwei Gruppen ähnlich (0,034 ± 0,007 mm² vs. 0,036 ± 0,009 mm², p = 0,81). Dieser Vorteil das neointimale Wachstum zu hemmen hielt 28 Tage an. 13 fasst die Wirkung von DWH-146e, das neointimale Wachstum in dem Maus LCCA-Model zu hemmen, zusammen. Diese Experimente demonstrieren, dass in einem Maus-Karotisarterien-Ligations-Model eine verlängerte A_2A-Stimulation (7 Tage) durch DWH-146e zu einer signifikanten Reduktion der neotinimalen Bildung für wenigstens 21 Tage führt, möglicherweise durch die Wirkung auf die Leukozytenaktivierung und -funktion.
Beispiel 21. Hemmung der Exotoxin-stimulierten Freisetzung von TNFα durch die humanen Monozyten.
A. Materialien. Ficoll-Hypaque wurde von ICN (Aurora, OH), Cardinal Scientific (Santa Fe. NM) und Accurate Chemicals and Scientific (Westbury, NY) erstanden. Endotoxin (Lipopolysaccharid; E. coli 0111B4) kam von List Biologicals (Campbell, CA). Die Hanks Balanced Salzlösung (HBSS) und der Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test-Kit kam von BioWittaker (Walkersville, MD). Das humane Serumalbumin (HSA) war von Cutter Biological (Elkhart, IN). ZM241385 (4-(2-[7-Amino-2-(2-furyl)-[1,2,4]-triazol[2,3-a][1,3,5]triazin-5-yl-amino]ethyl)phenol) war ein Geschenk von Simon Poucher, Zeneca Pharmaceuticals, Cheshire, UK. Es wurden Stocklösungen (1 mM und 10 mM in DMSO) hergestellt und bei –20°C aufbewahrt.
B. Produktion von TNFα durch aufgereinigte humane haftende Monozyten Methoden: Ein monozytenreicher Monolayer (>65% Monozyten) wurde hergestellt, indem 1 ml einer mononuklearen Leukozytenfraktion (5 × 10⁵/ml) aus einer Ficoll-Hypaque-Separation (A. Ferrante et al., J. Immunol. Meth., 36, 109 (1980)) in den Wells einer 24-Well Gewebekulturplatte inkubiert wurde (1 Std.; 37°C; 5% CO₂). Die nichthaftenden Leukozyten wurde mittels Waschen entfernt und es wurde Kulturmedium (1 ml Hanks Balanced Salzlösung, die 0,1% humanes Serumalbumin, Adenosindeaminase [5 U/ml] und 1% hitzinaktiviertes autologes Serum enthielt) zu den Wells zugegeben, die die haftenden mononuklearen Zellen enthielten. Es wurde das Folgende wie aufgeführt zugegeben: (1) Endotoxin (100 ng/ml) und der A_2A-AR-selektive Antagonist ZM241385 (100 nM) und (2) der A_2A-Andenosinrezeptor-selektive Agonist JMR193 (1–1000 nM), DWH-146e (1 –1000 nM) und CGS21680 (10–1000 nM). Die Proben wurden dann für 4 Stunden inkubiert (37°C; 5% CO₂) und die Überstände abgeerntet. Jegliche suspendierten Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt und die zellfreien Proben eingefroren (–70°C). Der TNFα wurde mit einem ELISA-Kit (Coulter/Immunotech, Miami, FL) in den zellfreien Überständen (n = 6) getestet.
C. Ergebnisse. Wie in 10 und 14 gezeigt verminderten die A_2A-Adenosinrezeptoragonisten die Endotoxin-stimulierte Produktion von TNFα der haftenden Monozyten. Der A_2A-AR-selektive Antagonist ZM241385 (100 nM) wirkte den Effekten von JMR193 auf die TNFα-Produktion entgegen (15).
Folglich vermindern DWH-146e und JMR193 die LPS Endotoxin-stimulierte TNFα-Produktion durch humane Monozyten mittels einem Mechanismus, der von der agonistischen Bindung an A_2A-Adenosinrezeptoren abhängt.
Beispiel 22. Aktivität von DWH-146e in einem murinen Peritonitis-Model
Vorläufige Experimente mit einer experimentellen Peritonitis involvierten die Injektion von Zymosan (Zym) als einen potenten Stimulus für die Entzündung (Y. Zhang et al., Eur. J. Pharmacol., 313, 237 (1996)). Wie in 16 gezeigt war im Anschluss an die Zymosaninjektion die mittlere Leukozytenkonzentration, wie sie in einem Neubauer-Hämocytometer bestimmt wurde, 7325 ± 1893/mm³. Eine intraperitoneale Injektion von DWH-146e mit einer Dosis von 2,5 μg/kg, eine Stunde vor dem Zymosan, hemmte die Entwicklung einer Peritonitis 6 Stunden später mit einer Mittel ± SEM Leukozytenkonzentration von 2012 ± 374/mm³ (p < 0,05). Folglich demonstrieren diese Studien, dass der A_2A-AR zur Vermittlung der PMN-Traversierung in das Peritoneum, in Folge einer Zymogenherausforderung, beiträgt.
Beispiel 23. Cardioprotektion, vermittelt durch die entzündungshemmende Wirkung von JMR193
Die Verbindungen der Erfindung wurden durch die Induzierung einer myocardialen Lähmung (Englisch: myocardial stunning), eine Form der Herzverletzung, die als Folge von repetitiven, transienten Perioden eines unterbrochenen koronaren Blutflusses durch die wiederholte Okklusion der Blutversorgung einer Koronararterie eintritt.
A. Wirkung von vier Cyclen einer Okklusion-Reperfusion
Die linke anteriore deszendierende (LAD) Koronararterie einer Hundegruppe wurde isoliert und mit einem Schlingenverschluss umfasst. Die LAD-arterielle Blutversorgung der Hunde wurde 4-mal für 5 Minuten verschlossen. Im Anschluss an jede Okklusion wurde der Blutstrom für 10 Minuten wieder hergestellt. Eine Gruppe von 6 Hunden wurde nach jeder Okklusionsperiode mit einer Lösung, die die Azetatverbindung (JMR193), hergestellt in Beispiel 15 (JMR193), (0,01 μg/kg/min) enthielt, infusioniert. Eine zweite Gruppe von 6 Hunden wurde mit einer Lösung infusioniert, die das Vehikel (Träger) enthielt. Nach dem letzten Okklusion-Reperfusioncyclus wurde die Herzfunktion der Tiere für 3 Stunden überwacht.
Die Ergebnisse sind in den 17 und 18 illustriert. Die 17 zeigt die systolische linke ventrikuläre (LV) Verdickungsreaktion in den 6 Kontrollhunden. Die Herzverdickung war zu etwa 50% 3 Stunden nach der letzten Okklusion reduziert. Die 18 zeigt die LV Verdickungsreaktion in den 6 Hunden, die eine intravenöse Infusion der Testverbindung JMRl93 (0,01 μg/kg/min) erhalten hatten, die während der Grundlinienperiode begann und durch das Experiment hindurch fortgesetzt wurde. Die Herzfunktion kehrte mit der JMRl93-Infusion bereits 90 Min nach der Reperfusion zu annähernd normal zurück.
B. Wirkung von zehn Cyclen Okklusion-Reperfusion.
Es wurden zwei zusätzliche Hundegruppen zehn (nicht vier) Okklusion-Reperfusionscyclen unterworfen, wobei jede Okklusion 5 Minuten dauerte, unterbrochen von 5 Minuten Reperfusion. In diesem Beispiel wurden zwei der Tiere nach jeder Okklusionsperiode mit einer Lösung infusioniert, die die Acetatverbindung (JMRl93), hergestellt in Beispiel 15, (0,01 μg/kg/min) enthielt. Weitere drei Tiere wurden mit einer Lösung, die das Vehikel (Träger) enthielt, infusioniert. Nach dem letzten Okklusion-Reperfusionscyclus wurde die Herzfunktion der Tiere für 3 Stunden überwacht.
Die Ergebnisse sind in den 19 und 20 dargestellt. Die 19 zeigt die systolische linke ventrikuläre Verdickungsreaktion in den 3 Kontrollhunden. Es war ein schwererer Herzinsult als in Beispiel 23A und als ein Ergebnis hat die LV Verdickung frühzeitig nach der Reperfusion vollständig gefehlt und verblieb für 3 Stunden akinetisch. 20 zeigt die LV Verdickung in den 2 Hunden, die eine intravenöse Infusion der Testverbindung JMRl93 (0,01 μg/kg/min) erhalten hatten, die während der Grundlinienperiode begann und durch das Experiment hindurch fortgesetzt wurde. Verglichen mit der Kontrollgruppe wiesen die Hunde, die die JMR193-Infusion erhalten hatten, eine signifikante und bezeichnende Verbesserung der Herzfunktion, unverzüglich nach der Reperfusion, auf, die für 3 Stunden anhielt.
C. Wirkung der Acetatverbindung JMRl93 auf die Aufnahme von Neutrophilen während der Okklusion-Reperfusion.
Einigen Tieren wurden radioaktiv markierte Neutrophile verabreicht. (Die Neutrophilen wurden aus Hundeblut isoliert, mit einer Verbindung, die ^99mTc enthielt, inkubiert und in die Hunde zurückinjeziert). Die ^99mTc-markierten Neutrophilen wurden intravenös als ein Marker verabreicht, um den Grad der Entzündung im Anschluss an vier Ischämische-Reperfusionscyclen in der Reperfusionszone zu bestimmen. Die Entzündung durch die Okklusion-Reperfusionscyclen verursachte die Anheftung der radioaktiven Neutrophilen und wurde mit einer Gamma-Kamera quantifiziert. Die Anheftung der Neutrophilen wurde mit JMRl93 gehemmt. Die Ergebnisse sind in 21 illustriert, wobei die Lokalisation der ^99mTc-markierten Neutrophilen in den Hunden, die mit dem Vehikel alleine behandelt wurden (ausgefüllte Balken) größer ist als in den JMRl93-behandelten Hunden (schraffierte Balken). Folglich illustriert die Reduktion der radioaktiv markierten Neutrophilen in der zentralen ischämischen Zone, verursacht durch die JMRl93-Infusion, die Reduktion der (*) Herzentzündung.
Die in Beispiel 23A und 23B beschriebenen Untersuchungen zeigen an, dass die Herzentzündung eine signifikante schädliche Rolle bei der Verursachung einer Herzmuskellähmung spielt. Zusätzlich verhindert die Verabreichung eines A_2A-Rezeptoragonisten, wie zum Beispiel JMR-193, entweder eine milde Lähmung (17 und 18) oder sie schwächt signifikant die myocardiale Fehlfunktion ab, die mit einer schweren Lähmung einhergeht (19 und 20).

Claims

Verbindung der Formel (I):
wobei (a) jeder R individuell Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, C₃-C₇-Cycloalkyl, Phenyl oder Phenyl(C₁-C₃)alkyl ist; (b) X -CH₂OH, -CO₂R², -OC(O)R² oder C(O)NR³R⁴ ist; (c) R², R³ und R⁴ jeweils individuell H, C_1-6-Alkyl; ein C_1-6-Alkyl, substituiert mit 1–3 C_1-6-Alkoxy, C₃-C₇-Cycloalkyl, C_1-6-Alkylthio, Halogen, Hydroxy, Amino, Mono(C_1-6-alkyl)amino, Di(C_1-6-alkyl)amino oder C_6-10-Aryl, wobei das Aryl mit 1–3 Halogen, C_1-6-Alkyl, Hydroxy, Amino, Mono(C_1-6-alkyl)amino oder Di(C_1-6-alkyl)amino substituiert sein kann; C_6-10-Aryl; oder ein C_6-10-Aryl, substituiert mit 1–3 Halogen, Hydroxy, Amino, Mono(C_1-6-alkyl)amino, Di(C_1-6-alkyl)amino oder C_1-6-Alkyl ist; (d) Z und Z' individuell (C₁-C₆)Alkyl sind, optional unterbrochen von 1–3 S oder einem O, der kein Peroxid ist, oder abwesend sind und n 1–3 ist; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei 5'-X -CH₂OH oder -C(O)NR³R⁴ ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei 5'-X -C(O)NR³R⁴ ist.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei R³ H und R⁴ ein (C₁-C₄)Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei jeder R H oder ein (C₁-C₄)Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei Z' -CH₂- oder -CH₂-CH₂- ist.
Verbindung nach Anspruch 6, wobei Z -CH₂- oder -CH₂-CH₂- ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei das C₃-C₁₀-Cycloalkyl ein Cyclohexyl oder Cyclopenthyl ist.
Verbindung nach Anspruch 8, wobei X ein (C₁-C₄)Alkoxycarbonyl, C(O)NR³R⁴ oder ein Acetoxymethyl ist.
Verbindung nach Anspruch 8, wobei X-Z HO₂C-Z- ist.
Verbindung nach Anspruch 8, wobei X-Z und Z' trans an dem C₃-C₁₀-Cycloalkyl stehen.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R H, 5'-X Ethylaminocarbonyl und (X-Z-)_n[(C₃-C₁₀)-Cycloalkyl]-Z'-C≡C- 2-(4-Methoxycarbonylcyclohexylmethyl)ethynyl oder 2-(4-Carboxycyclohexylmethyl)ethynyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R H, 5'-X Ethylaminocarbonyl und (X-Z-)_n[(C₃-C₁₀)-Cycloalkyl]-Z'-C≡C- 2-(4-Acetoxymethylcyclohexylmethyl)ethynyl ist.
[4-(3-{9-(2R,3R,4S,5S)-5-(N-Ethylcarbamoyl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-6-aminopurin-2-yl}prop-2-ynyl)cyclohexyl]methylacetate oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
[(2R,3R,4S,5S)-5-(6-Amino-2-{3-[4-(hydroxymethyl)cyclohexyl] prop-1-ynyl}purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-N-ethylcarboxamide oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Methyl-4-(3-{9-[(2R,3R,4S,5S)-5-(N-ethylcarbamoyl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-6-aminopurin-2-yl)}prop-1-ynyl)cyclohexancarboxylat oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
4-(3-{9-[(2R,3R,4S,5S)-5-(N-Ethylcarbamoyl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-6-aminopurin-2-yl)}prop-1-ynyl)cyclohexancarbonsäure oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 für die Verwendung in der medizinischen Therapie.
Verbindung nach Anspruch 18, wobei die medizinische Therapie die Hemmung einer entzündlichen Reaktion ist.
Verbindung nach Anspruch 18, wobei die medizinische Therapie ferner die Verwendung eines Typ IV Phosphodiesterasehemmers umfasst.
Verbindung nach Anspruch 20, wobei der Hemmer Rolipram ist.
Verbindung nach Anspruch 19, wobei die entzündliche Reaktion auf Grund einer Ischämie, einer Atherosklerose, einer Autoimmunerkrankung, einer Ischämie/Reperfusionsverletzung, eines Schlaganfalls, einer traumatischen Hirnverletzung, einer Rückenmarksverletzung, einer Organtransplantation, einer Gewebstransplantation, einer Zelltransplantation, einer Hauterkrankung, einer Infektion, einer Angioplastie, der Legung eines Stents, der Legung eines Shunts oder des Graftings eines Shunts, einer allergischen Erkrankung; einer zehrenden Krankheit, einer immunsuppressiven Therapie oder einer pathologischen Kondition oder einem pathologischen Symptom in einem Säugetier verursacht ist, wobei die Aktivität der A_2A-Adenosinrezeptoren mit einbezogen ist und der Agonismus einer solchen Aktivität gewünscht ist.
Verbindung nach Anspruch 19, wobei die entzündliche Reaktion im Herz, in der Niere oder der Lunge ist.
Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1–17, um ein Medikament herzustellen, das für die Behandlung einer entzündlichen Reaktion nützlich ist.
Verwendung von Anspruch 24, wobei das Medikament einen Typ IV Phosphodiesterasehemmer umfasst.
Verwendung von Anspruch 25, wobei der Phosphodiesterasehemmer Rolipram ist.
Verwendung von Anspruch 25, wobei das Medikament einen flüssigen Träger umfasst.
Verwendung von Anspruch 25, wobei das Medikament für eine parenterale Verabreichung geeignet ist.