CZ20012781A3 - 2-alkinyladenosinové deriváty - Google Patents

Description

2-Alkinyladenosinové deriváty

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká 2-alkinyladenosinových derivátů, farmaceutických prostředků a jejich použití pro prevenci poškození tkání, například v důsledku zánětlivého procesu.

Dosavadní stav techniky

Předkládaný vynález byl vytvořen za pomoci fondu US vlády (Grant NIH ROL HL37942) a vláda USA má k němu určitá práva.

Zánětlivá odpověď slouží pro odstranění škodlivých vlivů z organismu. Existuje široké rozmezí patogenních vlivů, které mohou vyvolat zánětlivou odpověď, včetně infekce, alergenů, autoimunitních stimulů, imunitních odpovědí na transplantovanou tkáň, škodlivých chemikálií a toxinů, ischemie/reperfuze, hypoxie a mechanického a teplotního poranění. Zánět je za normálních okolností velmi lokalizovaná akce, která slouží pro vypuzení, oslabení prostřednictvím naředění a izolaci poškozujícího vlivu a poraněné tkáně. Tělesná odpověď se stává činitelem vyvolávajícím onemocnění, jestliže je jejím důsledkem poškození hostitelských tkání v neadekvátním rozsahu při procesu odstraňování činitele vyvolávajícího onemocnění, nebo jako odpověď na poškození úrazem.

Jako příklad lze uvést zánět jako složku patogenního procesu u několika cévních onemocnění nebo poranění. Mezi příklady patří poškození v důsledku ischemie/reperfuze (N. G. Frangogiannis a další, Myocardial Ischemia: Mechanisms, Reperfusion, Protection, M. Karmazyn, ed., Birkhuser Verlag (1996), 236 - 284; H. S. Sharma a další, Med, of Inflamm., 6, 175 (1987)), ateroskleróza (R. Ross, Nátuře, 362, 801 (1993)), zánětlivá aneuryzmata aorty (N. Girardi a

9· · ·· ··

9 9 9 9 9 9 9 9 · 9

další, Ann. Thor. Surq., 64, 251 (1997); D. I. Walker a další, Brit. J. Surq., 59, 609 (1972); R. L. Pennell a další, J. Vasc. Surq., 2, 859 (1985)), a restenóza po balónkové angioplastice (viz R. Ross citováno výše). Mezi buňky, které se účastní zánětlivého procesu, patří leukocyty (tj. buňky imunitního systému - neutrofily, eosinofily, lymfocyty, monocyty, basofily, makrofágy, dendritické buňky a žírné buňky), cévní endothel, buňky hladkého svalstva cév, fibroblasty a myocyty.

Prostředkem, kterým imunitní systém potírá patogenní invazi včetně infekcí, je uvolňování zánětlivých cytokinů jako je tumorový nekrózní faktor alfa (TNFa) leukocyty. TNFa stimuluje expresi a aktivaci adherentních faktorů na leukocytech a endotheliálních buňkách, připravuje neutrofily na zvýšenou zánětlivou odpověď na sekundární stimuly a zvyšuje oxidační aktivitu adherentních neutrofilů, viz Sharma a další, citováno výše. Jako pomocné buňky napomáhající zpracování antigenu pro prezentaci lymfocytům navíc slouží makrofágy/dendritické buňky. Naopak lymfocyty jsou stimulovány k působení ve funkci prozánětlivých cytotoxických buněk.

Cytokiny obecně stimulují neutrofily pro zvýšení oxidativní (např. působením superoxidu a sekundárních produktů) i neoxidativní (např. působení myeloperoxidázy a jiných enzymů) zánětlivé aktivity. Nevhodné a nadměrné uvolňování cytokinů může působit kontraproduktivní nepřiměřené patogenní jevy prostřednictvím uvolňování oxidačních a neoxidačních produktů poškozujících tkáň (K. G. Tracey a další, J, Exp. Med., 167, 1211 (1988); a D. N. Manne a další, Rev. Infect. Dis., 9 (dodatek 5), S602 - S606 (1987)). Například TNFa může indukovat neutrofily k adhezi na cévní stěny a potom k migraci přes cévy do místa poranění a uvolňování svých oxidačních a neoxidačních zánětlivých produktů.

I když se monocyty v ohnisku zánětu shromažďují pomalu, za vhodných podmínek se monocyty vyvíjejí do formy dlouhodobě

-3-.

přetrvávajících pomocných buněk a makrofágů. Po stimulaci činitelem spouštějícím zánět také monocyty/makrofágy produkují a sekrenují celou řadu cytokinů (včetně TNFa), komplement, lipidy, reaktivní kyslíkaté molekuly, proteázy a růstové faktory, které remodelují tkáň a řídí funkce okolní tkáně.

Bylo například ukázáno, že zánětlivé cytokiny jsou patogeny u onemocnění jako: artritida (C. A. Dinarello, Semin. Immunol., 4, 133 (1992)); ischemie (A. Seekamp a další, Aqents-Actions-Supp., 41, 137 (1993)); septický šok (D. N. Mánnel a další, Rev. Infect. Dis., 9 (dodatek 5), S602 - S606 (1987)); astma (N. M. Cembrzynska a další, Am. Rev. Respir. Dis, 147, 291 (1993)); odmítnutí transplantovaného orgánů (D. K. Imagawa a další, Transplantation, 51, 57 (1991); roztroušená skleróza (Η. P. Hartung, Ann, Neurol., 33, 591 (1993)); AIDS (T. Matsuyama a další, AIDS, 5, 1405 (1991)); a popálení očí alkáliemi (F. Miyamoto a další, Opthalmic Res., 30, 168 (1997)). Navíc se předpokládá, že tvorba superoxidu v leukocytech je činitel podporující replikaci viru lidské imunodeficience (HIV) (S. LegrandPoels a další, AIDS Res. Hum. Retroviruses, 6, 1389 (1990)).

Je dobře známo, že adenosin a některé analogy adenosinu, které neselektivně aktivují subtypy adenosinového receptoru, snižují produkci zánětlivých oxidačních produktů neutrofily (Β. N. Cronstein a další, Ann, N. Y. Acad. Scí., 411, 291 (1985); P. A. Roberts a další, Biochem. J,, 227, 669 (1985); D. J. Schrier a další, J, Immunol., 137, 3284 (1986); Β. N. Cronstein a další, Clinícal Immunol. and Immunopath., 42, 76 (1987); M. A. lannone a další, Topics and Perspective in Adenosine Research, E. Gerlach a další, ed., Springer Verlag, Berlin, str. 286 (1987); S. T. McGarrity a další, J. Leukocyte Biol., 44, 411 - 421 (1988); J. De La Harpe a další, J, Immunol., 143, 596 (1989); S. T. McGarrity a další, J. Immunol., 142, 1986 (1989); a C. P. Nielson a další, Br. J. Pharmacol., 97, 882 (1989)). Například bylo ukázáno, že adenosin inhibuje uvolňování superoxidu z neutrofilů stimulované chemoatraktanty jako je syntetická látka napodobující •φ φφ ♦ φφ φφ φ • ·· φ φφφ · · · φ φ . · φ φφφφφφ

-4-·......· * · φ > φφφφφφ φφφφφφφφ φφφ φ· φφ bakteriální peptidy, f-met-leu-phe (fMLP), a složka komplementu C₅a (Β. N. Cronstein a další, J. Immunol., 135, 1366 (1985)). Adenosin může snižovat silné zvýšení výronu oxidativních látek PMN (neutrofilů) poprvé aktivovaných TNF-a a potom stimulovaných sekundární stimulující látkou jako je f-met-leu-phe (G. W. Sullivan a další, Clin. Res., 41, 172A (1993)). Navíc se uvádí, že adenosin může snížit rychlost replikace HIV v linii T-buněk (S. Šipka a další, Acta Biochim. Biopys. Hunq., 23, 75 (1988)). Neexistuje však žádný důkaz, že adenosin in vivo má protizánětlivé účinky (G. S. Firestein a další, Clin. Res., 41, 170A (1993); a Β. N. Cronstein a další, Clin. Res., 41, 244A (1993)).

Bylo navrhováno, že na neutrofilech existuje více než jeden subtyp adenosinových receptorů, který může mít na uvolňování superoxidu opačné účinky (Β. N. Cronstein a další, J. Clin. Invest., 85, 1150 (1990)). Existence receptoru A_2A na neutrofilech byla poprvé ukázána autory Van Calker a další, (D. Van Calker a další, Eur, J. Pharmacology, 206, 285 (1991)).

Došlo k intenzivnímu vývoji sloučenin, které mají stále vyšší účinky a/nebo selektivitu jako agonisté adenosinových receptorů A_2A (AR), založenému na testování vazby použitím radioaktivních ligandů a fyziologických odpovědí. Na počátku byly vyvinuty sloučeniny s malou nebo žádnou selektivitou pro receptory A_2A, jako je samotný adenosin nebo 5’-karboxamidy adenosinu, jako je 5’-N-ethylkarboxamidoadenosin (NECA) (Β. N. Cronstein a další, J. Immunol., 135, 1366 (1985)). Později bylo ukázáno, že přidání 2alkylaminových substituentů zvýšilo účinnost a selektivitu, např. u látek CV1808 a CGS21680 (M. F. Jarvis a další, J. Pharmacol. Exp. Ther., 251, 888 (1989)). 2-Alkoxysubstituované adenosinové deriváty jako je WRC-0090 mají ještě vyšší účinnost a selektivitu jako látky s agonistickým účinkem na receptor A₂a koronární arterie (M. Ueeda a další, J. Med. Chem,, 34, 1334 (1991)). Jako látky s agonistickým účinkem na receptor A_2a koronární arterie byly také vyhodnoceny 2-

•9 9» 9·· • ·· 9 · · 9·

5· 9 9 99

- · ♦· · 9·

9· 9 99 ········ · 9 · φ· alkylhydrazinoadenosinové deriváty, jako např. SHA 211 (nazývaný také WRC-0474) (K. Niiya a další, J. Med. Chem., 35, 4557 (1992)).

Existuje jedna zpráva o kombinaci relativně nespecifického analogu adenosinu, R-fenylisopropyladenosinu (R-PIA), a 2-chlor-adenosinu (Cl-Ado) s inhibitorem fosfodiesterázy (PDE), která vede ke snížení oxidační aktivity neutrofilů (M. A. lannone a další, Topics and Perspectives in Adenosine Research, E. Garlach a další, ed., Springer-Verlag, Berlin, str. 286 - 298 (1987)). Sloučeniny R-PIA a analogy Cl-Ado jsou však ve skutečnosti silnějšími aktivátory adenosinových receptorů Ai než adenosinových receptorů A₂a, takže budou pravděpodobně mít nežádoucí vedlejší účinky způsobené aktivací receptorů Ai na srdečním svalu a jiných tkáních, a budou způsobovat například „srdeční blokádu“.

R. A. Olsson a další (US patent No. 5,278,150) popisují látky s agonistickými účinky na adenosinový receptor A₂ selektivní vzorce:

kde Rib je ribosyl, Ri může být H a R₂ může být cykloalkyl. Uvádí se, že tyto sloučeniny jsou použitelné pro léčení hypertenze, aterosklerózy a jako vazodilatační látky.

Olsson a další (US patent No. 5,140,015) popisuje určité agonisty adenosinového receptorů A₂ vzorce:

• ·

kde C(X)BR₂ může být CH₂OH a R-ι může být alkyl- nebo alkoxyalkyl. Popisuje se, že tyto sloučeniny jsou použitelné jako látky s vazodilatačními účinky nebo jako látky působící proti zvýšenému krevnímu tlaku.

Linden a další (US patent No. 5,877,180) ukazují, že některá zánětlivá onemocnění jako je artritida a astma, mohou být účinně léčena podáváním sloučenin, které jsou selektivními agonisty adenosinových receptorů A_2A, s výhodou v kombinaci s inhibitorem fosfodiesterázy typu IV. Jedno provedení vynálezu autorů Linden a další poskytuje způsob léčení zánětlivých onemocnění podáváním účinného množství agonisty adenosinového receptorů A_2A následujícího vzorce:

kde význam R a X se uvádí v patentu.

Ve výhodném provedení se vynález autorů Linden a další týká podávání inhibitoru fosfodiesterázy typu IV (PDE) v kombinaci s agonístou adenosinového receptorů A₂a- Mezi inhibitory

- 7 fosfodiesterázy typu IV (PDE) patří racemické a opticky aktivní 4-(polyalkoxyfenyl)-2-pyrrolidony následujícího vzorce:

kde R’, R¹⁸, R¹⁹ a X jsou jak ukázáno v US patentu No. 4,193,926. Vhodným příkladem inhibitoru PDE typu IV je rolipram, který spadá do výše uvedeného vzorce.

G. Cristalli (US patent No. 5,593,975) popisuje 2-arylethinylové, 2-cykloalkylethinylové nebo 2-hydroxyalkylethinylové deriváty, ve kterých je ribosidový zbytek substituován skupinou karboxyamino, nebo substituovanou skupinou karboxyamino (R₃HNC(O)-). 2-Alkinylpurinové deriváty byly popsány v patentu Miyasaka a další (US patent No. 4,956,345), kde 2-alkinylová skupina je substituována skupinou (C3~Ci6)alkyl. Sloučeniny z patentu 5,593,975 byly ukázány jako látky s vazodilatačními účinky a látky s inhibičními účinky na agregaci destiček, které by tedy mohly být užitečné jako antiischemické, antiaterosklerotické a antihypertenzivní látky.

Existuje však trvalá potřeba selektivních agonistů adenosinového receptoru A₂ použitelných pro terapeutické aplikace, které mají snížené vedlejší účinky.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález zahrnuje sloučeniny a jejich použití pro léčení zánětlivé aktivity v savčí tkáni. Zánětlivá aktivita tkáně může být

- 8 důsledkem patologických činitelů nebo může být důsledkem fyzikálního, chemického, nebo teplotního traumatu nebo poškození po lékařských výkonech, jako je transplantace orgánu, tkáně nebo buněk, angioplastika (PCTA), zánět po ischemii/reperfuzi nebo vložení štěpu. Předkládané sloučeniny zahrnují novou třídu 2-alkinyladenosinových derivátů, které jsou substituovány v ethinové poloze substituovanými cykloalkylovými skupinami. S výhodou je ribosidový zbytek substituován v 5’-poloze („X“) N-alkyl- (nebo cykloalkyl)karboxyaminovou („aminokarbonylovou“) skupinou. Předkládaný vynález dále poskytuje způsob inhibice zánětiivé odpovědi u savce jako je člověk, a ochranu tkáně proti této odpovědi podáváním účinného množství jedné nebo více sloučenin podle vynálezu.

Sloučeniny podle vynálezu mají následující obecný vzorec (I):

N(R)?

---N

OH OH kde (a) každá skupina R je individuálně atom vodíku, Ci-C₆-alkyl, C₃-C₇-cykloalkyl, fenyl nebo fenyl(Ci-C₃)-alkyl;

(b) X je -CH₂OH, -CO₂R², -OC(O)R², CH₂OC(O)R² nebo C(O)NR³R⁴;

(c) každá ze skupin R², R³ a R⁴ je nezávisle H, C-|.₆-alkyl; Ci-₆-alkyl substituovaný 1 až 3 skupinami C-f-6-alkoxy, C₃-C7-cykloalkyl, C^e-alkylthio, halogen, hydroxy, amino, mono(Ci.₆-alkyl)amino, di(Ci_6-alkyl)amino, nebo C₆-io-aryl, kde aryl může být substituovaný 1 až 3 ·· · · · · · · · • ♦ · · · · · · · skupinami halogen, C₁_₆-alkyl, hydroxy, amino, mono(Ci.₆-alkyl)amino, nebo di(Ci_6-alkyl)amino; C₆-io-aryl; nebo C₆-io-aryl substituovaný 1 až 3 skupinami halogen, hydroxy, amino, monoíCi-e-alkyljamino, di(Ci.₆-alkyl)amino, nebo Ci.₆-alkyl;

(d) R¹ je (X-(Z)-)_n[(C₃-Cio)cykloalkyl]-(Z’)-, kde Z a Z’ jsou nezávisle (Ci-C₆)alkyl, popřípadě přerušený 1 až 3 atomy S nebo neperoxidového O, nebo jsou nepřítomné, a n je 1 až 3; nebo jejich farmaceuticky přijatelná sůl.

Vynález poskytuje sloučeninu vzorce I pro použití v lékařství, s výhodou pro použití při léčení nebo ochranu tkáně před zánětem, jako je zánětlivá odpověď, stejně jako použití sloučeniny vzorce (I) pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení zánětlivé odpovědi v důsledku patologického stavu nebo příznaku u savce jako je člověk, která je spojena se zánětem.

I když se uvádí, že některé látky s agonistickými účinky na adenosinový receptor A₂a mají vazodilatační účinky a jsou tedy použitelné pro přímé léčení hypertenze, trombu, aterosklerózy apod., ochranné účinky těchto sloučenin vzorce (I) na tkáně nebyly podle dosavadního stavu techniky navrhovány.

Vynález také zahrnuje použití kombinace těchto sloučenin s inhibitory fosfodiesterázy typu IV pro synergické snížení zánětlivé odpovědi imunitních buněk.

Vynález také poskytuje farmaceutický prostředek obsahující účinné množství sloučeniny vzorce (I) nebo její farmaceuticky přijatelné soli v kombinaci s farmaceuticky přijatelným ředivem nebo nosičem, a popřípadě v kombinaci s inhibitorem fosfodiesterázy typu IV (PDE). Farmaceutický prostředek je s výhodou v jednotkové dávkové formě.

Vynález dále poskytuje způsob léčení nebo prevence patologického stavu nebo příznaku u savce jako je člověk, u kterého

se předpokládá aktivita adenosinového receptoru A₂a, a u kterého je žádoucí agonistický účinek na tuto aktivitu, který zahrnuje podávání účinného množství sloučeniny vzorce I, nebo její farmaceuticky přijatelné soli savci v případě potřeby. Předpokládá se, že aktivace adenosinových receptorů A_2A inhibuje zánět působením na neutrofily, žírné buňky, monocyty/makrofágy, T-buňky a/nebo eosinofily. Inhibice těchto zánětlivých buněk vede k ochraně tkáně po napadení tkáně.

Mezi zánětlivými odpověďmi, které je možno léčit (včetně profylaktického působení) sloučeninou vzorce (I), popřípadě spolu s inhibitorem PDE typu IV, jsou záněty v důsledku:

(a) autoimunitní stimulace (autoimunitních onemocnění) jakoje lupus erythematosus, roztroušená skleróza, neplodnost v důsledku endometriózy, diabetes mellitus typu I, včetně destrukce pankreatických ostrůvků vedoucí k diabetů a zánětlivých důsledků diabetů, včetně vředů na nohou, Crohnovy nemoci, ulcerativní kolitidy, zánětlivého onemocnění střev, osteoporózy a revmatoidní artritidy;

(b) alergických onemocnění jako je astma, senná rýma, rýma, zánět spojivek a další stavy způsobené eosinofily;

(c) kožních onemocnění jako je lupénka, kontaktní dermatitida, ekzém, infekční vředy na kůži, otevřená poranění a celulitida;

(d) infekčních onemocnění včetně sepse, septického šoku, encefalitidy, infekční artritidy, endotoxického šoku, gramnegativního šoku, Jarisch-Herxheimerovy reakce, pásového oparu, toxického šoku, mozkové malárie, bakteriální meningitidy, syndromu akutní dechové nedostatečnosti (ARDS), lymské nemoci, infekce HIV (replikace HIV zvýšená působením TNFa, inhibice inhibitoru reverzní transkriptázy působením TNFa);

(e) vyčerpávajících onemocnění: sešlost v důsledku rakoviny a

HIV;

• · ·

99

9 99

99

999 9 (f) transplantace orgánů, tkáně nebo buněk (například kostní dřeně, rohovky, ledviny, plic, jater, srdce, kůže, pankreatických ostrůvků) včetně odmítání transplantátů a onemocnění způsobeného reakcí hostitele na štěp;

(g) nepříznivých vlivů léků při léčbě včetně nepříznivých účinků způsobených léčbou amfotericinem B, nepříznivých účinků imunosupresivní terapie, např. léčení interleukinem-2, nepříznivých účinků léčení OKT3, nepříznivých účinků léčení GM-CSF, nepříznivých účinků léčení cyklosporinem a nepříznivých účinků léčení aminoglykosidy, stomatitidy a mukositidy v důsledku imunosuprese;

(h) kardiovaskulárních stavů včetně onemocnění oběhu indukovaných nebo zhoršovaných zánětlivou odpovědí, jako je ischemie, ateroskleróza, onemocnění periferních cév, restenóza po angioplastice, zánětlivé aneuryzma aorty, vaskulitida, mrtvice, poranění míchy, městnavé srdeční onemocnění, hemoragický šok, poškození způsobené ischemií/reperfuzí, vazospasmus po subarachnoidní hemoragii, vazospasmus po cerebrovaskulární příhodě, pleuritida, perikarditida a kardiovaskulární komplikace diabetů;

(i) dialýzy včetně perikarditidy v důsledku peritoneální dialýzy;

(j) dny; a (k) chemického nebo teplotního poranění v důsledku popálenin a působení kyselin, alkálií apod.

Zvláště významné je použití sloučenin podle předkládaného vynálezu pro léčení zánětlivých odpovědí v důsledku transplantace orgánu, tkáně nebo buněk, tj. transplantace allogenní nebo xenogenní tkáně do savčího příjemce, autoimunitních onemocnění a zánětlivých stavů způsobených patologickými stavy oběhového systému a jejich léčením včetně angioplastiky, umístění stentu, umístění zkratu nebo vložení štěpu. Neočekávaně bylo zjištěno, že podání jedné nebo více ·· ·♦ · ·· ·· · • 9 9 9 99 9 9 9999

9 9 9 9 9 99 · ·· ······9

I £» “ 9 9 9 9 9 99

9999 9999 999 99 99999 sloučenin vzorce (I) bylo účinné po nástupu zánětlivé odpovědi, například po postižení pacienta patologickým dějem nebo poškozením, který vyvolá zánětlivou odpověď.

Vynález také zahrnuje způsob měření odpovědi nebo vazby sloučeniny vzorce (I) na určená místa adenosinového receptoru A₂a obsahující tyto receptory in vivo nebo in vitro, množstvím sloučeniny vzorce (I) účinným pro navázání na tyto receptory. Pro selektivní měření testovaných sloučenin pro konkrétní subtypy receptorů, množství bioaktivní sloučeniny v krvi a jiných fyziologických kapalinách mohou být použity tkáně nebo buňky obsahující receptorová místa navázaná na ligand, nebo mohou být tyto tkáně nebo buňky použity jako nástroj pro identifikaci potenciálních terapeutických prostředků pro léčení onemocnění nebo stavů souvisejících s aktivací receptorového místa přivedenímdo styku těchto látek s uvedenými komplexy ligand-receptor a měřením míry vytěsnění ligandu a/nebo vazby prostředku nebo buněčné odpovědi na tento prostředek (např. akumulace cAMP).

Podrobný popis vynálezu

Používá se následujících definic, pokud není uvedeno jinak.

Halo is fluor, chlor, brom nebo jod. Alkyl, alkoxy, aralkyl, alkylaryl atd. označují přímé i rozvětvené alkylové skupiny; přičemž však odkaz na jednotlivou skupinu jako je „propyl“ zahrnuje pouze skupinu s přímým řetězcem - na isomer s rozvětveným řetězcem jako je „isopropyl“ se konkrétně odkazuje. Aryl zahrnuje fenylový radikál nebo v poloze ortho fúzovaný bicyklický karbocyklický radikál obsahující přibližně 9 až 10 atomů v kruhu, přičemž alespoň jeden kruh je aromatický. Heteroaryl zahrnuje skupinu navázanou přes atom uhlíku monocyklického aromatického kruhu obsahujícího 5 nebo 6 atomů v kruhu zahrnujících uhlík a 1 až 4 heteroatomy, z nichž každý je zvolen ze skupiny neperoxidového kyslíku, síry a N(X), kde skupina • · ·· ·· · ·· ·· • · · · ·· · * 9 • * · · · · ·

X není přítomna nebo znamená H, O, (Ci-C₄)alkyl, fenyl nebo benzyl, stejně jako z něj odvozenou skupinu v poloze ortho fúzovaného bicyklického heterocyklu obsahující 8 až 10 atomů v kruhu, zvláště benzenový derivát nebo derivát odvozený fúzí propylenového, trimethylenového nebo tetramethylenového diradikálu.

Odborníkům v oboru bude zřejmé, že sloučeniny vzorce (I) obsahují více než jedno centrum chirality, a tyto sloučeniny mohou být izolovány v opticky aktivních a racemických formách. S výhodou je ribosidová skupina vzorce (I) odvozena z D-ribózy, tj. 3’,4’-hydroxylové skupiny jsou v poloze alfa vzhledem k cukernému kruhu a 2’ a 5’ skupiny jsou v poloze beta (3R, 4S, 2R, 5S). Jestliže jsou dvě skupiny na cyklohexylové skupině v poloze 4, jsou s výhodou v konfiguraci trans. Některé sloučeniny mohou vykazovat polymorfismus. Je třeba rozumět, že předkládaný vynález zahrnuje jakoukoli racemickou, opticky aktivní, polymorfní nebo stereoisomerní formu sloučenin podle vynálezu, nebo jejich směsi, která má zde popisované užitečné vlastnosti přičemž způsob přípravy opticky aktivních forem (například dělením racemických forem rekrystalizací nebo enzymaticky, syntézou z opticky aktivních výchozích látek, chirální syntézou nebo chromatografickou separací použitím chirální stacionární fáze) je v oboru znám a stanovení agonistické aktivity pro adenosin může být provedeno použitím testů popisovaných v přihlášce nebo použitím dalších podobných testů, které jsou známy v oboru.

Specifické a výhodné hodnoty uváděné níže pro skupiny, substituenty a rozsahy jsou pouze pro ilustraci; nevylučují další definované hodnoty nebo další hodnoty uvnitř definovaných rozmezí pro skupiny a substituenty.

Skupina (Ci-C6)alkyl může být konkrétně methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sek-butyl, pentyl, 3-pentyl nebo hexyl. Jak se zde používá, termín „cykloalkyl“ zahrnuje bicykloalkyl (norbornyl, 2,2,2bicyklooktyl, atd.) a tricykloalkyl (adamantyl, atd.), popřípadě aa ·· · ·4 ·· • · · · · · a a a obsahující 1 až 2 atomy N, O nebo S. Cykloalkyl také zahrnuje (cykloalkyl)alkyl. (C3-C6)cykloalkyl tedy může být cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl nebo cyklohexyl; (C3-C₆)cykloalkyl(Ci-C₆)alkyl může být cyklopropylmethyl, cyklobutylmethyl, cyklopentylmethyl, cyklohexylmethyl; 2-cyklopropylethyl, 2-cyklobutylethyl, 2-cyklo-pentylethyl nebo 2-cyklohexylethyl.

(Ci-Cejalkoxy může být methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, sek-butoxy, pentoxy, 3-pentoxy nebo hexyloxy; (C2-C6)alkenyl může být vinyl, allyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, 1hexenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 4-hexenyl nebo 5-hexenyl; (C₂-C₆)alkinyl může být ethinyl, 1-propinyl, 2-propinyl, 1-butinyl, 2butinyl, 3-butinyl, 1-pentinyl, 2-pentinyl, 3-pentinyl, 4-pentinyl, 1hexinyl, 2-hexinyl, 3-hexinyl, 4-hexinyl nebo 5-hexinyl; (Ci-Cejalkanoyl může být acetyl, propanoyl nebo butanoyl; halo(Ci-Ce)alkyl může být jodmethyl, brommethyl, chlormethyl, fluormethyl, trifluormethyl, 2chlorethyl, 2-fluorethyl, 2,2,2-trifluorethyl nebo pentafluorethyl; hydroxy(Ci-C6)alkyl může být hydroxymethyl, 1-hydroxyethyl, 2hydroxyethyl, 1-hydroxypropyl, 2-hydroxypropyl, 3-hydroxypropyl, 1hydroxybutyl, 4-hydroxybutyl, 1-hydroxypentyl, 5-hydroxypentyl, 1hydroxyhexyl nebo 6-hydroxyhexyl; (C₁-C₆)alkoxykarbonyl(CO₂R₂) může být methoxykarbonyl, ethoxykarbonyl, propoxykarbonyl, isopropoxykarbonyl, butoxykarbonyl, pentoxykarbonyl nebo hexyl-oxykarbonyl; (Ci-Cejalkylthio může být methylthio, ethylthio, propylthio, isopropylthio, butylthio, isobutylthio, pentylthio nebo hexylthio; (C₂-C6)alkanoyloxy může být acetoxy, propanoyloxy, butanoyloxy, isobutanoyloxy, pentanoyloxy nebo hexanoyloxy; aryl může být fenyl, indenyl nebo naftyl; a heteroaryl může být furyl, imidazolyl, triazolyl, triazinyl, oxazoyl, isoxazoyl, thiazolyl, isothiazoyl, pyraxolyl, pyrrolyl, pyrazinyl, tetrazolyl, puridyl (nebo jeho N-oxid), thientyl, pyrimidinyl (nebo jeho N-oxid), indolyl, isochinolyl (nebo jeho N-oxid) nebo chinolyl (nebo jeho N-oxid).

• 9 99

9

Specifický význam skupiny R je amino, monomethylamino nebo cyklopropylamino.

Specifický význam skupiny R¹ je karboxy- nebo (C₁-C4)alkoxykarbonylcyklohexyl(C₁-C₄)alkyl.

Specifický význam skupiny R² je H nebo (Ci-C₄)alkyl, např. methyl nebo ethyl.

Specifický význam skupiny R³ je H, methyl nebo fenyl.

Specifický význam skupiny R⁴ je H, methyl nebo fenyl.

Specifický význam skupiny Z je -CH₂- nebo -CH₂-CH₂-.

Specifický význam skupiny X je CO₂R², (C₂-C5)alkanoylmethyl nebo amido.

Specifický význam n je 1.

Výhodné sloučeniny vzorce (I) jsou sloučeniny, ve kterých každá skupina R je Η, X je ethylaminokarbonyl a R¹ je 4-karboxy-cyklohexylmethyl (DWH-146a), R¹ je 4-methoxykarbonyl-cyklohexylmethyl (DWH-146e) nebo R¹ je 4-acetoxymethyl-cyklohexylmethyl (JMR-193). Tyto sloučeniny jsou ukázány dále (DWH-146 (kyselina) a methylester (e)) a JMR-193.

HO

OH

DWH-146 (kyselina, X=H; ester, X=Me)

Syntéza methyl-4[3-(6-amino-9(5-[(ethylamino)karbonyl]-3,4-dihydroxytetrahydro-Z-furanyl-9/-/-2-purinyl)-2-propinyl]-1-cyklohexan-karboxylátu (DWH-146e) byla prováděna křížovou reakcí jodadenosinového derivátu (N-ethyl-1 ’-deoxy-1 ’-(amino-2-jod-9/-/-purin-

9-yl)-p-D-ribofuranuoramid) s methyl-4-(2-propinyl)-1 -cyklohexan-karboxylátem použitím katalyzátoru Pd¹¹. Syntéza jodadenosinových derivátů byla provedena z guanosinu. Na guanosin se nejprve působí acetanhydridem, který acetyluje hydroxylové skupiny cukru, a potom se provede chlorace v poloze 6 tetramethylamoniumchloridem a oxidochloridem fosforečným. Jodace v poloze 2 byla prováděna modifikovanou Sandmeyerovou reakcí, přičemž následně byly odstraněny atom chloru v poloze 6 a acetátové skupiny cukru amoniakem. Hydroxylové skupiny v polohách 2’ a 3’ byly chráněny jako acetonidy a 5’ hydroxyl byl oxidován na kyselinu manganistanem draselným. Odstranění 2’ a 3’ acetonidu, Fisherova esterifikace 5’ kyseliny ethanolem a převedení získaného ethylesteru na ethylamid pomocí ethylaminu poskytly N-ethyl-1’-deoxy-1’-(amino-2-jod-9H-purin-9-yl)-p-D-ribofuranuoramid.

Acetylen (methyl 4-(2-propinyl)-1-cyklohexankarboxylát) byl syntetizován z frans-1,4-cyklohexandimethanolu. Nejprve byl trans-dio\ monotosylován a potom byl tosylát odstraněn acetylenovým aniontem. Hydroxyl získané hydroxylacetylenové sloučeniny byl oxidován na kyselinu Jonesovým činidlem a potom byla provedena methylace

·· 444 • ta· · ·»♦ • * · · 6· • 4 4 4 4 44 • · · 4 44 • 44 4« <4 444 (trimethylsilyl)diazomethanem za poskytnutí methyl-4-(2-propinyl)-1-cyklohexankarboxylátu.

Křížová vazebná reakce byla provedena za následujících podmínek uvedených dříve. K roztoku Λ/,/V-dimethylformamidu (0,5 ml), acetonitrilu (1 ml), triethylaminu (0,25 ml) a N-ethyl-1 ’-deoxy-1’-(amino-2-jod-9H-purin-9-yl)-p-D-ribofuranuroamidu (25 mg, 0,06 mmol) byl přidán dichlorid bis(trifenylfosfin) paladia (1 mg, 2 mol. %) a jodid měďný (0,06 mg, 0,5 mol. %). K získané směsi se přidá methyl-4-(2-propinyl)-1-cyklohexankarboxylát (54 mg, 0,3 mmol) a reakční směs byla míchána v atmosféře dusíku 16 hod. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a získaný zbytek byl čištěn bleskovou chromatografii ve 20% methanolu v chloroformu (Rf = 0,45) za získání 19 mg (bělavá pevná látka, teplota tání 125 °C (rozklad)) methyl-4[3-(6-amino-9-(5-[(ethylamino)karbonyl]-3,4-dihydroxytetra-hydro-Z-furanyl)-9/-/-2-purinyl)-2-propinyl]-1-cyklohexankarboxylátu (DWH-146e).

Látky DWH-146e a JMR193 jsou jako inhibitory v systémech modelu zánětu podstatně účinnější než referenční sloučenina, CGS21680 (2-[p-(karboxyethyl)-fenylethylamino]-5’-N-ethylkarbox-amidoadenosin). Například DWH-146e je přibližně 80 krát účinnější na receptorech A₂a a 40 krát selektivnější pro receptor A₂a proti receptorům A₃, než sloučenina CGS21680.

Příklady farmaceuticky přijatelných solí jsou adiční soli s organickými kyselinami vytvořené s kyselinami, které tvoří fyziologicky přijatelný aniont, například tosylát, methansulfonát, malát, acetát, citrát, malonát, tartarát, sukcinát, benzoát, askorbát, aketoglutarát a α-glycerofosát. Mohou být také vytvořeny vhodné anorganické soli, včetně hydrochloridových, sulfátových, nitrátových, bikarbonátových a karbonátových solí.

Farmaceuticky přijatelné soli mohou být získány standardními postupy dobře známými v oboru, například reakcí dostatečně bazické

·* ··9

9 9 ··· • · · ·· • · · · ·· • * Φ ·· • 4· ♦· ·«.· sloučeniny jako je amin, s vhodnou kyselinou za poskytnutí fyziologicky přijatelného aniontu. Mohou být také vytvořeny soli karboxylových kyselin s alkalickými kovy (například, sodík, draslík nebo lithium) nebo kovy alkalických zemin (například vápník).

Sloučeniny vzorce (I) mohou být formulovány jako farmaceutické prostředky a podávány savčímu hostiteli jako je člověk v řadě forem upravených podle zvoleného způsobu podávání, tj. orální nebo parenterální, intravenózní, intramuskulární, místní nebo subkutánní cestou.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu tedy mohou být podávány systémově, například orálně, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným vehikulem jako je inertní ředivo, nebo asimilovatelný jedlý nosič. Mohou být uzavřeny v tvrdých nebo měkkých želatinových kapslích, mohou být lisovány do tablet nebo mohou být přímo přidány do diety pacienta. Pro orální terapeutické podávání může být účinná sloučenina kombinována s jednou nebo více pomocnými látkami a použita ve formě tablet pro polykání, bukálních tablet, pastilek, kapslí, elixírů, suspenzí, sirupů, oplatek apod. Tyto prostředky a preparáty by měly obsahovat alespoň 0,1 % hmotnostního účinné sloučeniny. Obsah v prostředcích a preparátech se může samozřejmě měnit a může být vhodně mezi přibližně 2 až přibližně 60 % hmotnostními z dané jednotkové dávkové formy. Množství účinné sloučeniny v takových terapeuticky použitelných prostředcích je takové, že lze získat účinnou dávku.

Tablety, pastilky, pilulky, kapsle apod. mohou také obsahovat následující složky: pojivá jako je tragakantová guma, akácie, kukuřičný škrob nebo želatina; pomocné látky jako je hydrogenfosforečnan vápenatý; rozvolňovadla jako je kukuřičný škrob, bramborový škrob, alginová kyselina apod.; kluznou látku jako je stearan hořečnatý; a sladidlo jako je sacharóza, fruktóza, laktóza nebo aspartam, nebo příchuti jako mátu, libavku, nebo třešeň. Jestliže je jednotková

- 19 dávková forma kapsle, může obsahovat navíc k materiálům výše uvedených typů kapalný nosič, jako je rostlinný olej nebo polyethylenglykol. Jako povlaky nebo pro jinou modifikaci fyzikální formy pevné jednotkové dávkové formy mohou být přítomny různé další materiály. Například tablety, pilulky nebo kapsle mohou být potahovány želatinou, voskem, šelakem nebo cukrem apod. Sirup nebo elixír může obsahovat účinnou sloučeninu, sacharózu nebo fruktózu jako sladidlo, methyl- a propylparabeny jako ochranné látky a barvivo a příchuť jako je třešňová nebo pomerančová příchuť. Jakýkoli materiál použitý při výrobě kterékoli jednotkové dávkové formy by měl být samozřejmě farmaceuticky přijatelný a v použitých množstvích v podstatě netoxický. Navíc může být účinná sloučenina vložena do preparátů a zařízení s prodlouženým uvolňováním.

Účinná sloučenina může být také podávána intravenózně nebo intraperitoneálně infuzí nebo injekcí. Roztoky účinné sloučeniny nebo jejích solí mohou být připraveny ve vodě, popřípadě ve směsi s netoxickou povrchově aktivní látkou. Disperze mohou být také připraveny v glycerolu, kapalných polyethylenglykolech, triacetinu a směsích těchto látek a v olejích. Za běžných podmínek skladování a použití obsahují tyto prostředky ochrannou látku pro zabránění růstu mikroorganismů.

Farmaceutické dávkovači formy vhodné pro injekce nebo infuze mohou zahrnovat sterilní vodné roztoky nebo disperze nebo sterilní prášky obsahující účinnou složku, které jsou upraveny pro přípravu sterilních roztoků nebo disperzí pro injekce nebo infuze těsně před podáním, popřípadě mohou být zapouzdřeny v liposomech. Ve všech případech musí být konečná dávková forma sterilní, kapalná a za podmínek výroby a skladování stabilní. Kapalný nosič nebo vehikulum může být rozpouštědlo nebo kapalné disperzní prostředí obsahující například vodu, ethanol a polyol (například glycerol, propylenglykol, kapalné polyethylenglykoly apod.), rostlinné oleje, netoxické glycerylestery a jejich vhodné směsi. Vhodná tekutost může být • · ·· · ·· ·· • · · ··· · · « · • · · · · · ·

-20 -, udržena například vytvořením liposomů, vhodnou velikostí částic v případě disperzí nebo použitím povrchově aktivních látek. Zabránění působení mikroorganismů může být dosaženo různými antibakteriálními a antifungálními sloučeninami, například parabeny, chlorbutanolem, fenolem, kyselinou sorbovou, thimerosalem apod. V mnoha případech bude výhodné přidávat látky upravující osmotický tlak, například cukry, pufry nebo chlorid sodný. Prodloužená absorpce prostředků pro injekce může být dosažena použitím prostředků opožďujících absorpci ve směsích, jako je například monostearan hlinitý a želatina.

Vhodné roztoky pro injekce se připravují přidáním účinné sloučeniny v požadovaném množství do vhodného rozpouštědla s různými dalšími složkami popsanými výše podle potřeby a následnou filtrační sterilizací, v případě sterilních prášků pro přípravu sterilních roztoků pro injekce se jako výhodné způsoby přípravy používá vakuové sušení a lyofilizace, které poskytují prášky účinné složky plus jakékoli další požadované složky přítomné v roztocích, které byly předem sterilovány filtrací.

Pro místní podávání mohou být sloučeniny podle vynálezu aplikovány v čisté formě, tj. jestliže jsou kapalné. Obecně však bude vhodné podávání těchto látek na kůži ve formě prostředků nebo formulací, v kombinaci s dermatologicky přijatelným nosičem, který může být pevný nebo kapalný.

Mezi použitelné kapalné nosiče patří jemné pevné látky jako je talek, jíl, mikrokrystalická celulóza, oxid křemičitý, oxid hlinitý apod. Mezi použitelné kapalné nosiče patří voda, alkoholy nebo glykoly, nebo směsi voda-alkohol/glykol, ve kterých mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu rozpuštěny nebo dispergovány v účinných koncentracích, popřípadě za pomoci netoxických povrchově aktivních látek. Pro optimalizaci vlastností pro dané použití mohou být přidávány adjuvantní látky jako jsou vonné látky a další antimikrobiální • · ·· · ♦ · ·♦ • ♦ · · ♦ · · ···

- 21 prostředky. Výsledné kapalné prostředky mohou být aplikovány z absorpčních polštářků, použity pro impregnaci obvazů a jiných forem pro přikládání, nebo rozstřikovány na postiženou oblast použitím rozprašovačů pumpičkového nebo aerosolového typu.

Spolu s kapalnými nosiči mohou být také použita zahušťovadla jako jsou syntetické polymery, mastné kyseliny, soli mastných kyselin a estery mastných kyselin, mastné alkoholy, modifikované celulózy nebo modifikované minerální materiály za vytvoření roztíratelných past, gelů, mastí, mýdel apod., pro použití přímo na kůži uživatele. Příklady vhodných dermatologických prostředků, které mohou být použity pro dodávání sloučenin vzorce (I) na kůži, se popisují ve spisech Jacquet a další (US patent No. 4,608,392), Geria (US patent No. 4,992,478), Smith a další (US patent No. 4,559,157) a Wortzman (US patent No. 4,820,508).

Použitelné dávkování sloučenin vzorce (I) může být zjištěno porovnáním jejich aktivity in vitro a in vivo na zvířecích modelech. Metody pro extrapolaci účinného dávkování u myší a jiných zvířat na člověka jsou v oboru známy; viz například US patent No. 4,938,949. Použitelné dávkování inhibitorů PDE typu IV je v oboru známo, viz například US patent No. 5,877,180, sloupec 12.

Obecně bude koncentrace sloučeniny nebo sloučenin vzorce (I) v kapalném prostředku jako je pleťové mléko od přibližně 0,1 do 25 % hmotnostních, s výhodou přibližně 0,5 až 10 % hmotnostních. Koncentrace v polotuhém nebo tuhém prostředku jako je gel nebo prášek bude přibližně 0,1 až 5 % hmotnostních, s výhodou přibližně 0,5 až 2,5 % hmotnostních.

Množství sloučeniny nebo její účinné soli nebo jejího derivátu požadované pro použití při léčení se bude lišit nejen podle konkrétní zvolené soli, ale také podle cesty podání, povahy léčeného stavu a věku a stavu pacienta a konečné rozhodnutí bude provádět ošetřující lékař.

• · · ♦ · ·· ·· • · · · * · · ·*· • · · φφφ ·

- 22 Obecně bude však vhodná dávka v rozmezí od přibližně 0,5 do přibližně 100 pg/kg, např. od přibližně 10 do přibližně 75 pg/kg tělesné hmotnosti za den, jako je 3 až přibližně 50 pg na kilogram tělesné hmotnosti příjemce za den, s výhodou v rozmezí od 6 do 90 pg/kg/den, nejvýhodněji v rozmezí 15 až 60 pg/kg/den.

Sloučenina se vhodně podává v jednotkové dávkové formě; například obsahující 5 až 1000 pg, vhodně 10 až 750 pg, nejvhodněji 50 až 500 pg účinné látky na jednotkovou dávkovou formu.

V ideálním případě by měla být účinná složka podávána pro dosažení maximálních koncentrací účinné sloučeniny v plasmě od přibližně 0,1 do přibližně 10 nM, s výhodou přibližně 0,2 až 10 nM, nejvýhodněji přibližně 0,5 až přibližně 5 nM. To může být dosaženo například intravenózní injekcí 0,05 až 5% roztoku účinné složky, popřípadě ve fyziologickém roztoku, nebo podávané orálně v jednorázové dávce přibližně 1 až 100 pg účinné složky. Požadované hladiny v krvi mohou být udržovány kontinuální infuzí pro poskytnutí přibližně 0,01 až 5,0 pg/kg/hod nebo přerušovanými infuzemi obsahujícími přibližně 0,4 až 15 pg/kg účinné složky nebo složek.

Požadovaná dávka může být vhodně přítomna v jednotlivé dávce nebo v dělených dávkách podávaných ve vhodných intervalech, například jako dvě, tři, čtyři nebo více dělených dávek za den. Samotná dělená dávka může být dále rozdělena například na řadu diskrétních podání ve vhodných intervalech; jako jsou vícenásobné inhalace z insuflátoru nebo aplikace většího množství kapek do oka. Je například vhodné podávat předkládané prostředky intravenózně po prodloužené období po vlivu, který způsobil zánět.

Schopnost dané sloučeniny podle vynálezu působit jako agonista (nebo antagonista) adenosinového receptoru A2A může být zjištěna použitím farmakologických modelů, které jsou v oboru dobře známy, nebo použitím dále popsaných testů.

- 23 Vynález bude dále popsán na následujících podrobných příkladech, které se uvádějí pro ilustraci vynálezu a nemají být považovány za omezující.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Trans-(1-[4-hydroxymethvl)cyklohexvl]methyl)-4-methylbenzensulfonát (5,21

Hydrid sodný (1,68 g, 70 mmol) byl přidán k roztoku 10 g (70 mmol) [4-(hydroxymethyl)cyklohexyl]methan-1-olů (5.1) v 700 ml tetrahydrofuranu a směs byla míchána 1 hod, potom byl přidán ptoluensulfonylchlorid (13,3 g, 70 mmol) a reakční směs byla zahřívána pod zpětným chladičem 5 hod. Reakční směs byla ochlazena na 0 °C a reakce byla pomalu ukončena vodou, až do odstranění veškerého reaktivního hydridu. Jakmile byl hydrid rozložen, reakční směs byla zředěna etherem (700 ml) a extrahována dvakrát 10% vodným uhličitanem draselným (700 ml). Organické vrstvy byly sušeny s použitím síranu sodného a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku. Produkt byl čištěn chromatografii na koloně silikagelu s eluci směsí aceton-dichlormethan (5 : 95) za získání sloučeniny 5.2 (35 %).

¹H NMR (300 MHz, CDCI₃) δ 7,75 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,32 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 3,79 (d, J = 6,35 Hz, 2H), 3,39 (d, J = 6,35 Hz, 2H),

2,42 (s, 3H), 1,75 (m, 4H), 1,59 (m, 1H), 1,37 (m, 1H), 0,9 (m, 4H). ¹³C NMR (300 MHz, CDCI₃) δ 145,3, 133,4, 130,3, 130,3, 128,3,

128,3, 128,3, 75,8, 68,5, 40,6, 37,8, 28,9, 28,9, 28,9, 28,9, 22,1.

• φ · φ · ·· tt • · · φ · · · · ·*·

Příklad 2 (4-prop-2-invlcyklohexyl)methan-1-ol (5.3)

Komplex acetylid lithný - ethylendiamin (90 %) (6,4 g, 70 mmol) byl velmi pomalu přidáván k roztoku sloučeniny 5.2 (3 g, 10 mmol) ve 40 ml dimethylsulfoxidu. Reakční směs byla ponechána míchat 5 dnů a potom byla reakce pomalu ukončena při 0 °C vodou. Směs byla zředěna etherem (300 ml) a extrahována třikrát nasyceným vodným chloridem amonným (200 ml). Organické vrstvy byly sušeny síranem sodným Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku a produkt byl čištěn chromatografii na koloně silikagelu s elucí směsí ethylacetát-hexany (20 : 80) za získání látky 5.3 (85 %).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 3,41 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 2,07 (dd, J = 2,5, 6,5 Hz, 2H), 1,96 - 1,75 (m, 5H), 1,41 (m, 2H), 0,095 (m, 4). ¹³C NMR (300 MHz, CDCI3) δ 83,8, 69,6, 68,9, 40,7, 37,7, 32,3, 32,3, 29,6, 29,6, 26,5.

Příklad 3

Kyselina 4-prop-2-inylcvklohexankarboxvlová (5.4)

Roztok oxidu chromitého (1,1 g, 11 mmol) v 1,5 M kyselině sírové (40 ml, 27 mmol) byl udržován při teplotě 0 °C, zatímco sloučenina 5.3 (0,46 g, 3 mmol) v 80 ml acetonu byla pomalu přidávána v průběhu 2 hod. Reakční směs byla potom míchána ještě 2 hodiny při teplotě laboratoře. Reakční směs byla zředěna etherem (200 ml) a dvakrát extrahována vodou. Organické vrstvy byly sušeny síranem sodným. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku a produkt byl čištěn chromatografii na koloně silikagelu s elucí směsí aceton-dichlormethan (70 : 30) za získání sloučeniny 5.4 (75 %).

¹H NMR (300 MHz, CDCI₃) δ 2,24 (dt, J = 3,66, 12,1 Hz, 1H),

2,10 (dd, J = 2,7, 6,5 Hz, 2H), 2,04 - 1,89 (m, 5H), 1,76 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 1,43 (dq, J = 3,28, 13,1 Hz, 2H), 1,03 (dq, J = 3,28, 13,1 Hz, 2H).

• · ·

-25 • · · · · · • · · · • · · · · • · · · · ¹³C NMR (300 MHz, CDCI₃) δ 183,2, 83,3, 69,9, 43,4, 36,7, 31,8, 28,9,

26,3.

Příklad 4

Methyl 4-prop-2-invlcyklohexankarboxvlát (5.5)

Roztok (trimethylsilyl)diazomethanu (2,0 M) v hexanech (1 ml, mmol) byl přidán k roztoku sloučeniny 5.4 (0,34 g, 2 mmol) v 15 ml směsi methanol : dichlormethan (3 : 7). Rozpouštědla byla odstraněna za sníženého tlaku při dosažení 100% konverze výchozího materiálu na produkt.

¹H NMR (300 MHz, CDCI₃) δ 2,24 (dt, J = 3,66, 12,1 Hz, 1H),

2,10 (dd, J = 2,7, 6,5 Hz, 2H), 2,06 (dd, J = 1,54, 6,54 Hz, 1H), 2,00 1,89 (m, 3H), 1,76 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 1,43 (dq, J = 3,28, 13,1 Hz, 2H), 1,03 (dq, J = 3,28, 13,1 Hz, 2H). ¹³C NMR (300 MHz, CDCI3) δ

176,8, 83,3, 69,8, 51,9, 43,4, 36,7, 31,9, 29,2, 26,3.

Příklad 5 í(2R,3R,4R,5R)-3,4-diacetyloxv-5-(2-amino-6-oxohydropurin-9-yl)-oxolan-2-vllmethylacetát (6.2)

Suspenze 113 g (0,4 mol) suchého guanosinu (6.1), acetanhydridu (240 ml, 2,5 mol), suchého pyridinu (120 ml) a suchého DMF (320 ml) byla zahřívána 3,75 hod při teplotě 75 °C, aniž by byla teplota ponechána překročit 80 °C. Čirý roztok byl potom převeden do

I Erlenmyerovy baňky a doplněn 2-propanolem. Po ochlazení roztoku na laboratorní teplotu byla zahájena krystalizace, která byla ponechána pokračovat při 4 °C přes noc. Bílá pevná látka byla zfiltrována, promyta 2-propanolem a rekrystalizována z 2-propanolu, za získání látky 6.2 (96 %).

¹H NMR (300 MHz, CDCI₃) δ 8,20 (s, 1H, H-8), 6,17 (d, J = 5,41 Hz, 1H, H-1 ’) 5,75 (t, J = 5,39 Hz, 1H, H-2’), 5,56 (t, J = 5,0, H3’), 4,41 (m, 3H, H-4’, 5’), 2,14 (s, 3H, Ac), 2,11 (s, 3H, Ac), 2,10 (s, 3H, Ac). ¹³C NMR (300 MHz, CD3OD) δ 171,0, 170,3, 170,2, 157,7,

154,8, 152,4, 136,7, 117,7, 85,5, 80,4, 73,0, 71,3, 64,0, 31,3, 21,2, 21,0.

Příklad 6 í(2R,3R,4R,5R)-3,4-diacetvloxv-5-(2-amino-6-chlorpurin-9-yl)oxolan--2yllmethylacetát (6.3)

Do 1000 ml baňky bylo přidáno 80 g (0,195 mol) [(2R,3R,4R,5R)-3-4-diacetyloxy-5-(2-amino-6-oxohyropurin-9-yl)oxolan-2-yl]methylacetátu (6.2), tetramethylamoniumchlorid (44 g, 0,4 mol), bezvodý acetonitril (400 ml) a N,N-dimethylanilin (25 ml). Baňka byla umístěna do lázně soli s ledem a ochlazena na 2 °C. K tomuto roztoku byl po kapkách přidán POCI₃ (107 ml 1,15 mol) takovou rychlostí, při které se teplota udržela po 5 °C (45 min). Baňka byla potom odstraněna z ledové lázně, byl k ní připojen kondenzátor, baňka byla umístěna do olejové lázně a ponechána vařit pod zpětným chladičem 10 min, přičemž barva roztoku se změnila z červené na hnědou. Rozpouštědlo bylo potom odstraněno za sníženého tlaku za získání olejového zbytku, který byl převeden do kádinky obsahující 1000 g ledu a 400 ml CHCI3 a ponechán míchat 1,5 hod pro rozložení jakýchkoli zbytků POCI3. Organická fáze byla potom odstraněna a vodná fáze byla extrahována 3 x 50 ml CHCI3 a spojena s organickou fází. Spojené organické podíly byly potom zpětně extrahovány 50 ml vody a potom míchány s 200 ml nasyceného NaHCO3. Organická fáze byla dále extrahována NaHCO₃, až do dosažení neutrality vodného extraktu (2 x). Organická fáze byla nakonec extrahována roztokem soli a potom sušena nad MgSO₄ 16 hod. K tomuto roztoku bylo přidáno 800 ml 2-propanolu a potom byl roztok zakoncentrován za sníženého ··♦· ·· · · · ♦·· • · ·<····

- 27 -·* · * »··*»· · ········ «·· ·· ·« tlaku. K olejovité pevné látce bylo přidáno 200 ml 2-propanolu a roztok byl chlazen přes noc. Krystalický produkt byl zfiltrován, promyt a ponechán usušit přes noc, za získání látky 6.3 (77 %).

¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 8,31 (s, 1H, H-8), 7,00 (s, 2H, NH₂) 6,06 (d, J= 5,8Hz, 1H, H-T), 5,83 (t, J = 6,16 Hz, 1H, H-2’), 5,67 (m, 1H, H-3’), 4,29 (m, 3H, H-4’, 5’), 2,07 (s, 3H, Ac), 1,99 (s, 3H, Ac),

1,98 (s, 3H, Ac). ¹³C NMR (300 MHz, CD3OD) δ 171,0, 170,4, 170,2,

160,8, 154,6, 150,8, 142,2, 124,5, 85,8, 80,6, 72,8, 71,2, 63,9, 21,4,

21,3, 21,1.

Příklad 7 [(2R,3R,4R,5R)-3₁4-diacetvloxv-5-(6-chlor-2-iodpurin-9-vl)oxolan-2-yll-methylacetát (6.4)

Isoamylnitrit (5 ml, 37 mmol) byl přidán ke směsi 5,12 g (12 mmol) [(2R,3R,4R,5R)-3,4-diacetyloxy-5-(2-amino-6-chlorpurin-9-yl)oxolan-2-yl]methylacetátu (6.3), l₂ (3,04 g, 12 mmol), CH₂I₂ (10 ml, 124 mmol), a Cul (2,4 g, 12,6 mmol) v THF (60 ml). Směs byla zahřívána pod zpětným chladičem 45 min a potom ponechána ochladit na teplotu laboratoře. K tomuto roztoku bylo přidáno 100 ml nasyceného Na₂S₂C>3, který odstranil červenavé zbarvení způsobené jodem. Vodný roztok byl extrahován 3 x chloroformem, extrakty byly spojeny, sušeny nad MgSCU a zakoncentrovány za sníženého tlaku. Produkt byl potom čištěn na koloně silikagelu s použitím CHCI₃-MeOH (98 : 2) pro oddělení [(2R,3R,4R,5R)-3,4-diacetyloxy-5-(6-chlor-2iodopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methylacetátu (6.4) (80 % krystalizoval z EtOH).

¹H NMR (300 MHz, CDCI₃) δ 8,20 (s, 1H H-8), 6,17 (d, J = 5,41 Hz, 1H, H-T), 5,75 (t, J = 5,39 Hz, 1H, H-2’), 5,56 (t, J= 5,40 Hz, 1H, H-3’), 4,38 (m, 3H, H-4’, 5’), 2,14 (s, 1H, Ac), 2,11 (s, 1H, Ac), 2,10 (s, 1H, Ac).

Příklad 8 (4S,2R,3R,5R)-2-(6-amino-2-iodpurin-9-vl)-5-(hvdroxvmethyl)oxolan-3,4-diol (6.5)

Do baňky obsahující 6,0 g (11,1 mmol) [(2R,3R,4R,5R)-3,4-diacetyloxy-5-(6-chlor-2-jodpurín-9-yl)oxolan-2-yl]methylacetátu (6.4) bylo přidáno 100 ml kapalného NH3 při -78 °C a roztok byl ponechán míchat 6 hod. Po této době byla teplota ponechána přejít na laboratorní teplotu přes noc, se současným odpařováním NH₃ za získání hnědého oleje. Produkt byl krystalizován z horkého isopropanolu za získání látky 6.5 (80 %), teplota tání 143 - 145 °C, r. f. = 0,6 v 20% MeOH/CHCI₃.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,24 (s, 1H), 7,68 (s, 2H), 5,75 (d, J = 6,16, 1H), 5,42 (d, J = 5,40 Hz, 1H), 5,16 (d, J = 4,62 Hz, 1H),

4,99 (t, J = 5,39 Hz, 1H), 4,67 (d, J = 4,81 Hz, 1H), 4,06 (d, J = 3,37 Hz, 1H), 3,89 (m, 1H), 3,54 (m, 2H).

Příklad 9 [(1 R,2R,4R,5R)-4-(6-amino-2-iodpurin-9-vl)-7-7dimethyl-3,6,8-trioxabi-cykloí3.3.0lokt-2-vl]methan-1-ol (6.6)

K roztoku 2,0 g (5,08 mmol) (4S,2R,3R,5R)-2-(6-amino-2-jodpurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolan-3,4-diolu (6.6) ve 100 ml acetonu bylo přidáno 9,6 g kyseliny p-toluensulfonové a 5 ml dimethoxypropanu. Reakční směs byla míchána při pokojové teplotě 1 hod, potom bylo přidáno 15 g NaHCO₃ a směs byla míchána další 3 hod. Zbytek byl zfiltrován a promyt 2 x EtOAc. Filtrát byl potom zakoncentrován za sníženého tlaku. Zbytek byl chromatografován na koloně silikagelu s MeOH-CHCI₃ (1 : 99) za poskytnutí sloučeniny 6.6 (72 %) jako pevné látky, teplota tání 185 - 187 °C.

·· φφ φ ·· ·· · • · ♦ φ φφφ · · φφφ ¹Η NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,22 (s, 1 Η, Η-8), 7,69 (s, 2Η), ΝΗ₂), 6,00 (d, J = 2,70 Hz, 1 Η, Η-Τ), 5,21 (m, 1 Η, Η2’), 5,07 (bs, 1 Η, ΟΗ), 4,88 (πί, 1 Η, Η-3’), 4,13 (m, 1 Η, Η-4’), 3,47 (m, 2Η, Η5’), 1,49 a

1,28 (s, 3Η, C(CH₃)₂).

Příklad 10

Kyselina (2S,1 R,4R,5R)-4-(6-amino-2-iodpurin-9-yl)-7,7-dimethyl-3,6,8-trioxabicyklo[3.3.01oktan-2-karboxylová (6.7)

K míchanému roztoku 1,6 g (3,7 mmol) [(1R,2R,4R,5R)-4-(6-amino-2-jodpurin-9-yl)-7-7-dimethyl-3,6,8-trioxabicyklo[3.3.0]okt-2-yl]-methan-1-olu (6.6) ve 200 ml H₂O bylo přidáno 0,60 g KOH a po kapkách roztok 1,70 g (10,8 ml) KMnO₄ v 50 ml H₂O. Směs byla ponechána stát v temnu při laboratorní teplotě 225 hod. Reakční směs byla potom ochlazena na 5 až 10 °C a odbarvena roztokem 4 ml 30% H₂O₂ v 16 ml vody, zatímco teplota byla udržována pod 10 °C s použitím lázně soli s ledem. Směs byla zfiltrována přes celit a filtrát byl zakoncentrován za sníženého tlaku na přibližně 10 ml a potom okyselen na pH 4 2N HCI. Získaná sraženina byla odfiltrována a promyta etherem za získání sloučeniny 6.7 (70 %), po usušení, jako bílé pevné látky, teplota tání 187 - 190 °C.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,11 (s, 1H, H-8), 7,62 (s, 2H, NH₂), 7,46 (s, 1H, COOH), 6,22 (s, 1H, H-1 ’), 5,42 (d, J = 5,71 Hz, 1H, H-2’), 5,34 (d, J = 6,16 Hz, 1H, H-3’), 4,63 (s, 1H, H4’), 1,46 a

1,30 (s, 3H, C(CH₃)₂).

• ·

Příklad 11

Kyselina (2S₁3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-iodpurin-9-vl)-3,4-dihydroxvoxo-lan-2-karboxylová (6.8)

Roztok 1,72 g (3,85 mmol) kyseliny (2S,1 R,4R,5R)-4-(6-amino-2-jodpurin-9-yl)-7,7-dimethyl-3,6,8-trioxabicyklo[3.3.0]oktan-2-karboxylové (6.7) v 80 ml 50% HCOOH byl míchán při 80 °C 1,5 hod. Reakční směs byla odpařena za sníženého tlaku, rozpuštěna v H₂O a roztok byl znovu odpařen. Tento postup byl opakován, dokud nebyl zbytek zcela prostý zápachu kyseliny mravenčí. Rekrystalizace z vody poskytla 1,33 g (85 %) sloučeniny 6.8 jako bílé pevné látky, teplota tání 221 - 223 °C, rozklad.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,31 (s, 1H, H-8), 7,68 (s, 2H, NH₂), 5,90 (d, J = 6,55 Hz, 1 Η, H-T), 4,42 (m, 1H, H-2’), 4,35 (d, J =

2,31 Hz, 1H, H-4’), 4,22 (m, 1H, H-3’).

Příklad 12

F(2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-iodpurin-9-vl)-3,4-dihydroxvoxolan-2-vll-N-ethylkarboxamid (6.9)

K chlazenému (5 °C) a míchanému roztoku 1,29 g (3,17 mmol) kyseliny (2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-jodpurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxo-lan-2-karboxylové (6,8) ve 150 ml absolutního ethanolu bylo po kapkách přidáno 1,15 ml ledem chlazeného SOCI₂. Směs byla míchána při laboratorní teplotě přes noc a potom bylo pH upraveno na 8 nasyceným vodným NaHCC>3. Směs byla zfiltrována a filtrát byl potom zakoncentrován za sníženého tlaku, za poskytnutí bílé pevné látky, která byla sušena a potom znovu rozpuštěna ve 20 ml suchého ethylaminu, ponechána při -20 °C 3 hod a potom při teplotě laboratoře přes noc. Reakční směs byla zředěna absolutním ethanolem, a vysrážený produkt byl odfiltrován a promyt suchým etherem za získání •9 ·· · ·· ·· • · · · · · · ··« • · · · · 9 ·

- 31 530 mg (72 %) sloučeniny 6.9 jako čisté pevné látky, teplota tání 232 234 °C.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,34 (s, 1H, H-8), 8,12 (t, 1H, NH), 7,73 (s, 2H, NH₂), 5,85, (d, J = 6,93 Hz, 1H, H-1’), 4,54 (m, 1H, H-2’), 4,25 (d, J= 1,92 Hz, 1H, H-4’), 4,13 (m, 1H, H-3’), 3,28 (m, 2H, CH₂CH₃), 1,00 (t, J= 7,2 Hz, 3H, CH₂CH₃).

Příklad 13

Methvl-4-(3-{9-[(4S,5S,2R,3R)-5-(N-ethylkarbamoyl)-3,4-dihydroxy-oxolan-2-vll-6-aminopurin-2-yl)}prop-2-inyl)cvklohexankarboxylát (DWH-146e)

K odplyněnému roztoku 25 mg (0,063 mmol) [(2S,3S,4R,5R)-5(6-amino-2-jodpurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-N-ethylkarbox-amidu (6.9), 16,9 mg (0,094 mmol) látky (5.5) a 0,75 mg Cul v 5 ml triethylaminu (TEA) a 5 ml acetonitrilu bylo přidáno 15 mg Pd(PPh₂)₄. Roztok byl míchán 24 hod při 70 °C, potom byl roztok zfiltrován přes celit a čištěn chromatografii na silikagelu s eluentem MeOH-CHCI₃ (5 : 95), za získání látky DWH-146e (24 %).

Příklad 14 (4-prop-2-inylcyklohexyl)methylacetát (5.6)

Acetanhydrid (0,92 ml, 8,25 mmol) a pyridin (0,2 ml, 2,5 mmol) byly přidány k roztoku látky 5.3 (250 mg, 1,65 mmol) v 25 ml etheru. Reakční směs byla ponechána míchat při teplotě okolí 24 hod. Byla přidána voda a organická fáze byla dále extrahována 10% NaHCO₃. Organická vrstva byla sušena MgSO₄ a odpařena. Zbytek byl čištěn chromatografii na silikagelu se směsí EtOAc-hexany (5 : 95), za získání látky 5.6 (47 %).

• 0

Příklad 15 [4-(3-{9-(4S,5S,2R,3R)-5-(N-ethvlkarbamoyl)-3,4-dihvdroxvoxolan-2-vl1-6-aminopurín-2-yl}prop-2-invl)cvklohexvl]methylacetát (JMR193)

K odplyněnému roztoku 125 mg (0,29 mmol) [(2S,3S,4R,5R)-5(6-amino-2-jodpurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-N-ethylkarbox-amidu (6.9), 150 mg (0,77 mmol) látky (5.6) a 1,0 mg Cul v 1,3 ml TEA a 4 ml DMF bylo přidáno 25 mg Pd(PPh3)4. Roztok byl míchán 72 hod při 60 °C a po této době byl zfiltrován přes celit a čištěn chromatografii na silikagelu se směsí MeOH-CHCI₃ (5 : 95), za získání JMR193 (10 %).

Příklad 16 [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-{3-f4-(hvdroxvmethyl)cvklohexyllprop-2-inyl}purin-9-yl)-3,4-dihvdroxyoxolan-2-vl1-N-ethylkarboxamid

A. (4-prop-2-invlcyklohexyl)methan-1-ol

Komplex acetylid lithný - ethylendiamin (90 %) (6,4 g, 70 mmol) byl přidán velmi pomalu k roztoku řrans-[4-(hydroxymethyl)cyklohexyl]-methyl-4-methylbenzensulfátu (3 g, 10 mmol) ve 40 ml dimethylsulfoxidu. Reakční směs byla ponechána míchat 5 dnů a potom byla reakce pomalu ukončena při 0 °C vodou. Tato směs byla zředěna etherem (300 ml) a promyta třikrát nasyceným vodným chloridem amonným (200 ml). Organické vrstvy byly sušeny síranem sodným. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku. Produkt byl čištěn chromatografii na koloně silikagelu s elucí směsí ethylacetát-hexany (20 : 80) za poskytnutí produktu (85 %).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 3,41 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 2,07 (dd, J = 2,5, 6,5 Hz, 2H), 1,96 - 1,75 (m, 5H), 1,41 (m, 2H), 0,095 (m, 4). ¹³C NMR (300 MHz, CDCI3) δ 83,8, 69,6, 68,9, 40,7, 37,7, 32,3, 32,3, 29,6, 29,6, 26,5.

• · · · • · · · • ·

B. í(2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-{3-|'4-(hvdroxvmethvl)cvklo-hexyl]prop-1-invl}purin-9-yl)-3,4-dihvdroxvoxolan-2-yl1-N-ethylkarboxamid (JMR2037)

Pd(PPh₃)4, 10 mg, bylo přidáno k odplyněnému roztoku 28 mg (0,065 mmol) [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-jodpurin-9-yl)-3,4dihydroxyoxolan-2-yl]-N-ethylkarboxamidu, 30 mg (0,20 mmol) (4-prop2-inylcyklohexyl)methan-1-olu a 1,0 mg Cul v 1 ml triethylaminu (TEA), 1 ml DMF a 1 ml acetonitrilu. Roztok byl míchán 60 hod při teplotě laboratoře, potom byl zfiltrován přes celit a čištěn chromatografii na silikagelu se směsí MeOH-CHCl3 (7 : 93), za získání 5 mg (17 %) JMR2037. Sloučenina uvedená v názvu byla testována pomocí testů vazby popsaných dále a bylo zjištěno, že se váže na rekombinantní lidské receptory A₂a s hodnotou Ki 694 ± 69 nM.

Příklad 17

Studie vazby radioliqandu

Vazba na receptory A_2A byla vyhodnocována použitím radioligandu ¹²⁵I-ZM241385. Obr. 2B ukazuje soutěžení selektivních agonistů o vazbu na rekombinantní lidské adenosinové receptory A_2A. DWH-146e je vysoce selektivní pro rekombinantní subtyp lidského receptoru A_2A (hA2A). Selektivita pro receptor A₃ (není ukázáno) je méně výrazná, ale stále přibližně padesátinásobná. DWH-146e má přibližně pětinásobnou účinnost než látka WRC0470 a padesátinásobnou účinnost než látka CGS21680 (obr. 1). Neočekávané a zajímavé zjištění je, že ester, látka DWH-146e, je také přibližně padesátkrát účinnější než kyselina, látka DWH-146a (obr. 1).

♦ ♦ <·« · «· ·» • · · ··«· ··· • · · · · ♦ ·

- 34 • · ··«*· ··· «·«· ··· ·· «· »*·

Příklad 17Α

Vliv DWH-146e a JMR193 na oxidační aktivitu neutrofilů

A. Materiály

Látky f-met-leu-phe (fMLP), luminol, superoxiddismutáza, cytochrom C, fibrinogen, adenosindeamináza a trypanová modř byly získány od firmy Sigma Chemical. Ficoll-hypaque byl získán od firmy ION (Aurora, OH), a Cardinal Scientific (Santa Fe, NM) a Accurate Chemicals and Scientific (Westerbury, NY). Endotoxin (lipopolysacharid; E. coli K235) byl od firmy List Biologicals (Campbell, CA). Hanksův vyvážený solný roztok (HBSS), a souprava limulus amebocyte lysáte assay kit byla získána od firmy BioWittaker (Walkersville, MD). Lidský sérový albumin (HSA) byl od firmy Cutter Biological (Elkhart, IN). Rekombinantní lidský tumorový nekrózní faktor-alfa byl dodán firmou Dianippon Pharmaceutical Co. Ltd. (Osaka, Japonsko). ZM241385 (4-(2-[7-amino-2-(2-furyl)-[1,2,4]triazolo[2,3a][1,3,5]triazin-5-ylamino]ethyl)fenol) byl dar od Simona Pouchera, Zeneca Pharmaceuticals, Cheshire, UK. Zásobní roztoky (1 mM a 10 mM v DMSO) byly připraveny a skladovány při -20 °C.

B. Příprava lidských neutrofilů

Čištěné neutrofily (-98% neutrofily a >95% viabilita zjištěná vylučováním trypanové modři) obsahující <1 destičku na 5 neutrofilů a <50 pg/ml endotoxinu (zjištěno testem limulus amebocyte lysáte assay) byly získány z normální heparinizované (10 U/ml) žilní krve jednostupňovým separačním postupem Ficoll-hypaque (A. Ferrante a další, J. Immunol. Meth., 36,109 (1980)).

t ·· Φ· φ ·· · · φ φ φφ • · · * · · ··*«··· φ • · · 4 · φ • •Φ ♦· <· ΦΦΦ

C. Chemiluminiscence v důsledku uvolňování zánětlivých reaktivních kyslíkatých sloučenin z připravených a stimulovaných lidských neutrofilů

Chemiluminiscence zesílená luminolem, měřítko oxidační aktivity neutrofilů, je závislá jak na produkci superoxidu, tak i na mobilizaci enzymu lysosomálních granulí myeloperoxidázy. Světlo je emitováno z nestabilních kyslíkatých sloučenin s vysokým obsahem energie vytvářených aktivovanými neutrofily. Čištěné neutrofily (5 až 10 x 10⁵/ml) byly inkubovány v Hanksově vyváženém solném roztoku obsahujícím 0,1% lidský sérový albumin (1 ml) s nebo bez sloučenin DWH-146a, DWH-146e, CGS21680 nebo JMR193 s nebo bez rolipramu a s nebo bez tumorového nekrózního faktoru alfa (1 U/ml) 30 min při 37 °C ve třepané vodní lázni. Potom byla odečítána chemiluminiscence zesílená luminolem (1 x 10'⁴ M) stimulovaná f-metleu-phe (1 mcM) na přístroji Chronolog®Photometer (Crono-log Corp., Havertown, PA) při 37 °C 2 až 4 min. Chemiluminiscence je udávána jako relativní vrchol emitovaného světla (= výška křivky) v porovnání se vzorky s tumorovým nekrózním faktorem alfa a ez DWH, JMR nebo rolipramu.

D, Výsledky

Jak je ukázáno na obr. 2, jak JMR193, tak i DWH-146e snižují oxidační aktivitu lidských neutrofilů aktivovaných tumorovým nekrózním faktorem alfa stimulovanou f-met-leu-phe při měření chemiluminiscencí zesílenou luminolem účinněji než agonista adenosinového receptoru A2A CGS21680. Na vodorovné ose se ukazuje koncentrace CGS21680, DWH-146a, DWH-146e nebo

JMR193 (log nM). Svislá osa ukazuje získanou maximální aktivitu lidských neutrofilů jako relativní množství stimulovaného uvolnění oxidativní aktivity (oxidative burst) při měření chemiluminiscencí zesílenou luminolem ve srovnání s kontrolními vzorky, které nebyly

- 36 aktivovány tumorovým nekrózním faktorem alfa. Střední hodnota SEM (n = 4 až 5 oddělených experimentů).

Údaje pod vodorovnou osou na obr. 2 ukazují hodnotu EC₅₀ pro snížení aktivity lidských neutrofilů (vztaženo na údaje v obr. 2). Střední hodnota SEM (n = 4 až 5 oddělených experimentů). *p < 0,05 pokles IC50 ve srovnání s CGS21680.

JMR193 a DWH-146e snižovaly jednorázové oxidační aktivity stimulovaných neutrofilů s hodnotami EC₅₀ <1 nM (0,8 a 0,3 nM). Naopak látky s agonistickým účinkem na adenosinový receptor A_2A ve formě volných kyselin DWH-146a a CGS21680 nebyly při inhibici jednorázové oxidační aktivity tak účinné (53, popřípadě 9 nM; obr. 2). Inhibice jednorázové oxidační aktivity stimulovaných neutrofilů prostřednictvím DWH-146e byla antagonizována selektivním antagonistou adenosinového receptoru A₂a ZM241385.

Jak je ukázána na obr. 3, látka JMR193 (1 nM) s rolipramem (100 nM) synergicky snižovala stimulované uvolňování reaktivních kyslíkatých sloučenin. Lidské neutrofily byly aktivovány tumorovým nekrózním faktorem alfa (1 U/ml) a stimulovány f-met-leu-phe (1 μΜ). Svislá osa ukazuje procenta inhibice oxidační aktivity při měření chemiluminiscencí zesílenou luminolem. Střední SEM (n = 4 oddělené experimenty). *p < 0,05 synergický účinek mezi JMR193 a rolipramem ve srovnání s aditivními účinky.

Jak je ukázáno na obr. 4, vysoce selektivní agonista adenosinového receptoru A_2A, látka ZM241385 (100 nM) (ZM) působila proti oxidační aktivitě lidských neutrofilů inhibované JMR193 (10 nM) při měření chemiluminiscencí zesílenou luminolem. Střední SEM čtyř oddělených experimentů. *p = 0,0004 ZM241385 působila proti oxidační aktivitě inhibované JMR193.

·· ·· « · · ·· • · · · ···· ···

E. [cAMP] lidských neutrofilů a adherence neutrofilů na biologicky povrch jamková tkáňová kultivační miska byla potažena lidským fibrinogenem (5 mg/ml v 1,5% hydrogenuhličitanu sodném; 0,5 ml/jamku; Sigma Chemical) přes noc při 37 °C v 5% CO2. Neutrofily (3 až 4 x 10^e/0,5 ml/vzorek) byly inkubovány v jamce potažené destičky 45 min v 0,5 ml HBSS obsahující 0,1% HSA a ADA (1 U/ml) v přítomnosti a nepřítomnosti rekombinantního lidského TNFa (10 U/ml), DWH-146e (3 - 300 nM), rolipramu (300 nM), a/nebo ZM241385 (100 nM). Po inkubaci bylo do jamek přidáno 0,5 ml HCI (0,2 N) a byla prováděna inkubace ještě 45 min při laboratorní teplotě pro extrakci cAMP. Vzorky byly potom centrifugovány v mikrocentrifuze 2 min pro odstranění úlomků rozbitých buněk. Vzorky 0,5 ml byly zmrazený pro analýzu cAMP (B. Brooker a další, Science, 194, 270 (1976)). Jamky byly potom dvakrát promyty normálním fyziologickým roztokem a zbývající monovrstva byla štěpena 0,2 ml 0,2N NaOH s obsahem SDS 2 hod při laboratorní teplotě. Vzorky proteinu byly potom zmrazený (-70 °C) pro pozdější analýzu proteinu pro určení relativní adherence PMN (K. P. Stowell a další, Anal. Biochem., 85, 572 (1978)).

Výsledky

DWH-146e (30 až 300 nM) samostatně a synergicky s rolipramem (300 nM) zvyšoval obsah cAMP v lidských neutrofilech a spolu s rolipramem synergicky snižoval adherenci neutrofilů na povrch potažený fibrinogenem (obr. 5). Účinky DWH-146e (300 nM) + rolipram (300 nM) na produkci cAMP neutrofily a adherenci byly snižovány selektivním antagonistou adenosinového receptoru A2A, látkou ZM241385 (ZM; 100 nM). Střední SEM pěti oddělených experimentů. *p < 0,05 zvýšená koncentrace [cAMP] neutrofilů ve ·· ·· · ·· ·· · • · · * ··· · » ··· • · ······

- 38 -· · ······ ···· ···· ··· ·· ·· ··· srovnání s experimentem bez DWH-146e; **p < 0,05 snížená adherence neutrofilů ve srovnání s experimentem bez DWH-146e.

F. Oxidační aktivita adherentních lidských neutrofilů

Metody

Použitím metod modifikovaných z části E byly neutrofily (2 x 10⁶/ml) ze separace Ficoll-Hypaque inkubovány 15 min při 37 °C v 0,45 ml Hanksova vyváženého solného roztoku obsahujícího 0,1% lidský sérový albumin a adenosindeaminázu (1 U/ml), rolipram (300 nM) a DWH-146e (3 až 300 nM). Po inkubaci se přidává cytochrom C (120 μΜ) a kataláza (0,062 mg/ml) v přítomnosti a v nepřítomnosti rekombinantního lidského tumorového nekrózního faktoru alfa (1 U/ml) a 200 pl alikvoty buněčné suspenze byly okamžitě převedeny do dvou opakovaných jamek 96-jamkové kultivační destičky pro tkáně s plochým dnem, která byla přes noc potahována lidským fibrinogenem. Optická densita vzorků byla odečítána při 550 nm proti odpovídajícím vzorkům se superoxiddismutázou (200 U/ml).

G. Výsledky

Jak je ukázáno na obr. 6, inhibice uvolňování superoxidu adherentními lidskými neutrofily stimulovaného tumorovým nekrózním faktorem alfa (TNF) na povrchu potaženém fibrinogenem, byla uskutečňována rolipramem (300 nM) a DWH-146e. Látka DWH-146e snížila uvolnění oxidativní aktivity (burst) adherentních neutrofilů a synergicky snížila uvolnění oxidativní aktivity v přítomnosti rolipramu, který sám o sobě oxidační aktivitu neutrofilů neovlivňoval. Na vodorovné ose je ukázána koncentrace látky DWH-146e v nM a svislá osa udává množství superoxidu uvolněného neutrofily při měření snížením cytochromu c. Byl pozorován významný synergický účinek DWH-146e a inhibitoru PDE typu IV rolipramu na snížení oxidační • · « · ···· ··· • · · · · · ·

- 39 • ······ ··· ··· · · ·· ··· aktivity adherentních lidských neutrofilů stimulované tumorovým nekrózním faktorem alfa. Střední SEM opakování z 4 až 5 oddělených experimentů: *p < 0,05 snížené uvolňování superoxidu ve srovnání s experimentem bez DWH-146e; **p < 0,05 snížené uvolňování superoxidu ve srovnání s rolipramem a bez DWH146e.

Příklad 18

Léčení ischemického/reperfuzního (l/R) poškození v ledvině látkou DWH-146e

Pro zjištění, zda aktivace adenosinového receptorů A₂a indukovaná látkou DWH-146e snižuje plasmatickou koncentraci kreatininu ve 24 a 48 hod po l/R poškození u krys, byly krysy vystaveny po dobu 45 min ischemii a 24 nebo 48 hod reperfuzi. Kontinuálně byla pomocí miničerpadla podávána látka DWH-146e (0,004 pg/kg/min) nebo vehikulum počínaje 5 hod před l/R. Jak je ukázáno na obr. 7, látka DWH-146e významně snižovala koncentraci kreatininu v plasmě ve 24 hodinách u sedmi ze sedmi krys (P < 0,05) a ve 48 hodinách u šesti ze šesti krys léčených DWH-146e (P < 0,001).

Pro zjištění, zda je nebo není účinek DWH-146e na snížení koncentrace kreatininu v plasmě u krys vystavených l/R podmíněný receptorem A_2A, byly krysí ledviny vystaveny 45 min trvající ischemii a potom 48 hodinové reperfuzi. DWH-146e (0,004 pg/kg/min) byla podávána současně pomocí miničerpadla počínaje 5 hod před ischemii. Jak je ukázáno na obr. 8, zlepšení renální funkce bylo odstraněno antagonistou A_2A, látkou ZM-241385 (0,003 pg/kg/min ekvimolární rychlost dodávání v porovnání s DWH-146e) (*p < 0,001 pro vehikulum proti DWH; **p < 0,05 pro DWH proti DWH/ZM. n = 5 pro vehikulum, DW; n = 6 pro DWH/ZM. Po ANOVA následovala Bonferroniova korekce).

DWH-146e má preventivní účinky na otok ledviny, nekrózu a hromadění červených krvinek ve vnitřní medule v koncentracích, které nemají žádné hemodynamické účinky.

Ochrana proti poškození ledvin poskytovaná látkou DWH-146e (0,01 pg/kg/min s.c. 48 hod) korelovala s dramatickou inhibicí adherence neutrofilů na cévní endothelium. Předpokládá se, že inhibice interakce mezi neutrofily a cévním endotheliem působením látky DWH-146e je odpovědná alespoň z části za ochranu proti poškození ledvin.

Pro zjištění, zda aktivace adenosinového receptoru A_2a snižuje množství neutrofilů ve vnější medule krys vystavených l/R použitím látky Neurolucida®, byla ledvina pozorována ve stonásobném zvětšení na celé ledvině. PMN byly počítány pozorováním řezu ledviny se zvětšením 250 x. Řezy ledviny byly překryty optickými ráměčky pozorovanými pod mikroskopem a v každém rámečku byly počítány všechny PMN. Tento systém zabrání vícenásobnému počítání PMN. Jak je ukázáno na obr. 9, hustota neutrofilů byla 15,65/mm² pro vehikulum a 3,02/mm v případě léčení DWH-146e.

Příklad 19

Vliv DWH-146e na reperfuzní poškození plic

A. Metody

Bylo použito modelu izolované ventilované králičí plíce promývané úplnou krví. Plíce byly odebírány po injekci PGEi do plicní arterie a proplachu Euro-Collinsovým ochranným roztokem, a plíce byly uchovávány 18 hod při 4 °C. Plíce skupiny I (n = 9) sloužily jako kontroly. Plíce skupiny II (n = 9) byly opakovaně promývány úplnou krví, která byla nejprve protlačována filtrem pro zachycení leukocytů. Ve skupině III (n = 9) byla do krve pro reperfuzi přidávána látka DWH146e (25 pg/kg) ihned před reperfuzi, a tato látka byla podávána • · · · · · · · ♦ · · • · · · · · ·

- 41 během celého období reperfuze (1 pg/kg/min). U všech plic byla prováděna reperfuze 30 min a byl zaznamenáván tlak v plicní arterii (PAP), odpor plicních cév (PVR), poddajnost dýchacích cest (CPL) a arteriální okysličení. Pro kvantifikaci sekvestrace neutrofilů byla zaznamenávána aktivita mykloperoxidázy (MPO) a pro demonstraci plicního otoku byly zaznamenávány poměry mokré/suché hmotnosti.

B. Výsledky

Arteriální okysličení ve skupina II a III bylo podstatně vyšší než okysličení skupiny I po 30 min reperfuze (514,27 ± 35,80 a 461,12 + 43,77 ve srovnání s 91,41 ± 20,58 mm Hg (1 mm Hg = 133 Pa), p< 0,001. Jak je ukázáno na obr. 10, skupina III plic vykázala progresivní postižení pO₂ v průběhu reperfuze. Odstraňování leukocytů u plic ve skupině II zlepšilo arteriální okysličení v časné fázi reperfuze. *p = 0,004 (skupina II proti skupinám I a III); **p < 0,001 (skupiny II a III proti skupině I).

Jak je ukázáno na obr. 11, střední PVR ve skupině II byla podstatně snížena v porovnání s kontrolními plícemi (*p < 0,001). PVR skupiny III plic byla podstatně nižší než hodnota i u těch plic, u kterých byla prováděna reperfuze krví bez leukocytů (**p < 0,001 proti skupinám 1 a II). Plicní cévní odpor byl podstatně snížen u skupiny III (22,783 ± 357 dyn.s.cm'⁵) ve srovnání jak se skupinou II, tak se skupinou I (31,057 ± 1743 a 36,911 ± 2173 dyn.s.cm’⁵, p < 0,001). Poddajnost dýchacích cest byla zlepšená u skupin II a III ve srovnání se skupinou I (1,68 ± 0,08 a 1,68 ± 0,05 proti 1,36 ± 0,13, p = 0,03). Mikrovaskulární permeabilita u skupiny III byla snížena na 106,82 ± 17,09 ve srovnání s 165,70 ± 21,83 ng barviva Evansovy modři/g tkáně u skupiny I (p = 0,05). Jak je ukázáno na obr. 12, myeloperoxidázová aktivita ve skupině III byla podstatně nižší než ve skupině I (*p = 0,03). MPO = myeloperoxidáza. Myeloperoxidázová aktivita ve skupině III byla 39,88 ± 4,87 ve srovnání s 88,70 ± 18,69 • · • ·

AOD/g/min ve skupině I (p = 0,03) a myeloperoxidázová aktivita ve skupině II byla 56,06 ± 7,46.

C. Závěry

DWH-146e snižovala sekvestraci plicních neutrofilů a dramaticky zlepšovala funkci plicního štěpu. Neutrofily jsou důležitými složkami kaskády zánětlivých dějů reperfuzního poškození a jejich zdroj může zahrnovat jak cirkulující krev, tak i samotný plicní štěp. Selektivní aktivace adenosinového receptorů A₂a přerušuje zánětlivou odpověď zprostředkovanou neutrofily a snižuje reperfuzní poškození plic po transplantaci.

S použitím světelné mikroskopie ukazovaly kontrolní plíce ve skupině I těžkou infiltraci leukocytů a tvorbu edému v alveolárních prostorách po 18 hod ischemického uchovávání a 30 min reperfuze. Ve skupině II byla mnohem nižší infiltrace u plic, které byly vystaveny reperfuzi krví zbavenou leukocytů a u plic skupiny III (které dostaly DWH-146e v průběhu reperfuze, byla infiltrace mnohem menší). .

Příklad 20

Vliv DWH-146e na tvorbu neointimy po arteriálním poškození

Aktivace leukocytů s uvolňováním zánětlivých cytokinů probíhá po perkutánním koronárním zásahu a může mít úlohu při restenóze. U myši se vyskytuje tvorba robustní neointimy v přítomnosti intaktní endotheliální výstelky po podvázání společné srdeční arterie. S použitím tohoto modelu byly myši C57/BL6 rozděleny náhodně do skupin, z nichž jedna dostala v době podvázání karotidy sedmidenní infuzi látky DWH-146e (n = 7) pomocí osmotického čerpadla nebo infuzi vehikula (n = 8).

Po 14 dnech po podvázání karotidy ukázala histomorfometrie podstatně snížení plochy neointimy (0,005 ± 0,004 mm² proti 0,021 ± 0,014 mm², p = 0,02) a poměru neointální k mediální oblasti (0,13 ± 0,07 proti 0,64 ± 0,44, p = 0,01) u léčených zvířat ve srovnání s kontrolami. Střední plocha byla u těchto dvou skupin podobná (0,034 ± 0,007 mm² proti 0,036 ± 0,009 mm², p = 0,81). Tento prospěšný účinek při omezení růstu neointimy přetrvával 28 dnů. Obr. 13 shrnuje účinek DWH-146e na inhibici růstu neointimy v myším modelu LCCA. Tyto experimenty ukazují, že v modelu podvázání srdeční arterie u myši vede prodloužená stimulace A_2A (7 dnů) látkou DWH-146e k podstatnému snížení vytváření neointimy po dobu alespoň 21 dnů, patrně jejím účinkem na aktivaci a funkci leukocytů.

Příklad 21

Inhibice uvolňování TNFa lidských monocytů stimulovaného endotoxiny

A. Materiály

Ficoll-hypaque byl získán od firmy ICN (Aurora, OH) a Cardinal Scientific (Santa Fe, NM) a Accurate Chemicals a Scientific (Westbury, NY). Endotoxin (lipopolysacharid; E. coli 0111B4) byl od firmy List Biologicals (Campbell, CA). Hanksův vyvážený solný roztok (HBSS) a souprava limulus amebocyte lysáte assay kit byla od firmy BioWittaker (Walkersville, MD). Lidský sérový albumin (HSA) byl od firmy Cutter Biological (Elkhart, IN). ZM241385 (4-(2-[7-amino-2-(2furyl)[1,2,4]triazol[2,3-a][1,3,5]triazin-5-yl-amino]ethyl)fenol) byl dalr od Simona Pouchera, Zeneca Pharmaceuticals, Cheshire, UK. Zásobní roztoky (1 mM a 10 mM v DMSO) byly připraveny a uchovávány při -20 °C.

B. Produkce TNFa purifikovanými lidskými adherentními monocyty Metody

Monovrstva bohatá na monocyty (>65 % monocytů) byla připravena inkubací 1 ml frakce mononukleárních monocytů (5 x 10⁵/ml) ze separace Ficoll-Hypaque (A. Ferrante a další, J. Immunol. Meth., 36, 109 (1980)) v jamkách 24-jamkové destičky pro tkáňové kultury (1 hod; 37 °C; 5% CO₂). Neadherentní leukocyty byly odstraněny promýváním a do jamek obsahujících adherentní mononukleární buňky bylo přidáno kultivační médium (1 ml Hanksův vyvážený solný roztok, který obsahoval 0,1% lidský sérový albumin, adenosindeaminázu [5 U/ml] a 1% teplem inaktivované autologní sérum). Jak bylo uvedeno, byly přidány následující složky:

(1) endotoxin (100 ng/ml) a selektivní antagonista adenosinového receptoru A₂a ZM 241385 (100 nM) a (2) selektivní agonisté adenosinového receptoru A₂a JMR193 (1 až 1000 nM), DWH146e (1 až 1000 nM) a CGS21680 (10 až 1000 nM). Vzorky byly potom inkubovány 4 hod (37 °C; 5% CO₂) a supernatanty byly sklizeny. Případné suspendované buňky byly odstraněny centrifugací a bezbuněčné vzorky byly zmraženy (-70 °C). TNFa byl testován v bezbuněčných supernatantech (n = 6) kitem ELISA (Coulter/lmmunotech. Miami, FL).

C. Výsledky

Jak je ukázáno na obr. 10 a 14, látky s agonistickým účinkem na adenosinový receptor A₂a snižovaly produkci TNFa adherentními monocyty stimulovanými endotoxinem. Selektivní antagonista A₂aAR ZM241385 (100 nM) antagonizoval účinky JMR193 na produkci TNFa (obr. 15).

DWH146e a JMR193 tedy snižují produkci TNFa lidskými monocyty stimulovanou endotoxinem LPS mechanismem, který je závislý na agonistické vazbě na adenosinové receptory A_2a.

Příklad 22

Aktivita DWH-146e v modelu myší peritonitidy

Předběžné experimenty s experimentální peritonitidou zahrnovaly injekci zymosanu (Zym) jako silného stimulátoru zánětu (Y. Zhang a další, Eur. J. Pharmacol., 313, 237 (1996)). Jak je ukázáno na obr. 16, po injekci zymosanu byla střední koncentrace leukocytů stanovená v Neubauerově hemocytometru 7325 ± 1893/mm³.

Intraperitoneální injekce DWH-146e v dávce 2,5 pg/kg jednu hodinu před zymosanem inhibovala vývoj peritonitidy se střední ± SEM koncentrací leukocytů 2012 ± 374/mm³ o 6 hod později (p < 0,05). Tyto studie tedy ukazují, že adenosinový receptor A₂a je nástrojem při zprostředkování přechodu PMN do peritonea po podání zymosanu.

Příklad 23

Kardioprotekce zprostředkovaná protizánětlivym účinkem látky JMR193

Sloučeniny podle vynálezu byly testovány indukcí poškození myokardu (stunning), formy poškození srdce, ke kterému dochází po opakovaných přechodných obdobích přerušeného průtoku krve srdcem, opakovaným uzavřením přívodu krve koronární arterií.

A. Vliv čtyř cyklů okluze-reperfuze

Levá přední sestupná (LAD) koronární arterie skupiny psů byla izolována a byl kolem ní umístěn kličkový okludor. Zásobování krví LAD arterií psů bylo uzavřeno čtyřikrát na 5 min. Po každém uzavření

- 4A - · · ·····byl obnoven na 10 min průtok krve. Jedné skupině šesti psů byla podávána infuze roztoku obsahujícího acetátovou sloučeninu (JMR193), připravenou v příkladu 15 (JMR193) (0,01 pg/kg/min), po každém období uzavření. Druhá skupina šesti psů dostávala infuzi s roztokem obsahujícím vehikulum (nosič). Po posledním cyklu uzavření-reperfuze byla monitorována srdeční funkce zvířat 3 hod.

Výsledky jsou ilustrovány na obr. 17 a 18. Obr. 17 ukazuje systolické zbytnění levé komory (LV) u šesti kontrolních psů. Zbytnění bylo sníženo o přibližně 50 % 3 hod po posledním uzavření. Obr. 18 ukazuje zbytnění LV u šesti psů, kteří dostali i.v. infuzi testované sloučeniny, JMR193 (0,01 pg/kg/min) počínaje počátečním obdobím a v průběhu experimentu. Srdeční funkce s infuzi JMR193 se vrátila téměř k normálu již 90 min po reperfuzi.

B. Vliv deseti cyklů okluze-reperfuze

U dvou dalších skupin psů bylo provedeno 10 (namísto 4) cyklů uzavření-reperfuze, přičemž každé uzavření trvalo 5 min a byly vloženy doby 5 min reperfuze. V tomto příkladu byla dvěma zvířatům podávána infuze roztoku obsahujícího acetátovou sloučeninu (JMR193) připravenou v příkladu 15 (0,01 pg/kg/min) po každém období uzavření. Dalším třem zvířatům byla podávána infuze s roztokem obsahujícím vehikulum (nosič). Po posledním cyklu uzavření/reperfuze byla 3 hod monitorována srdeční funkce zvířat.

Výsledky jsou ilustrovány na obr. 19 a 20. Obr. 19 ukazuje systolické zbytnění levé komory u tří kontrolních psů. To bylo vážnější poškození srdce než v příkladu 23A a toto rozšíření bylo zcela nepřítomné časně po reperfuzi a zůstávalo bez pohybu 3 hodiny. Obr. 20 ukazuje zbytnění u dvou psů, kteří dostávali i.v. infuzi testované sloučeniny JMR193 (0,01 pg/kg/min), počínaje obdobím před experimentem a v průběhu celého experimentu. Ve srovnání s kontrolní skupinou bylo u psů, kteří dostávali infuzi JMR193,

1ÍW*.W^.»I«iE,ÍÍS3íJ

dosaženo podstatného a významného zlepšení srdeční funkce bezprostředně po reperfuzi, které přetrvávalo 3 hod.

C. Vliv acetátové sloučeniny JMR193 na příjem neutrofílů v průběhu uzavření-reperfuze

Některým zvířatům byly podávány radioaktivně značené neutrofily. (Neutrofily byly izolovány z psí krve, inkubovány se sloučeninou obsahující ^99mTc a znovu vstříknuty psům.) Neutrofily značené ^99mTc byly intravenózně podávány jako markér pro zjištění míry zánětu v reperfuzní zóně po čtyřech cyklech ischemie-reperfuze. Zánět z cyklů uzavření-reperfuze způsobil adherenci radioaktivních neutrofílů a byl kvantifikován gama-kamerou. Adherence neutrofílů byla inhibována sloučeninou JMR193. Výsledky jsou ukázány na obr. 21, kde je lokalizace neutrofílů značených ^99mTc u psů léčených samotných vehikulem (plné čáry), vyšší než u psů léčených JMR193 (proužkované čáry). Snížení množství radioaktivně značených neutrofílů v centrální ischemické zóně způsobené infuzí JMR193 ilustruje snížení (*) srdečního zánětu.

Studie popsané v příkladech 23A a 23B ukazují, že srdeční zánět hraje významnou poškozující úlohu při vyvinutí poškození srdce. Navíc podání agonisty adenosinového receptoru A₂a, jako je například JMR-193, buď zabrání mírnému poškození (obr. 17 a 18) nebo podstatně oslabí srdeční dysfunkci doprovázející vážné poškození (obr. 19 a 20).

Všechny publikace, patenty a patentové dokumenty jsou zařazeny odkazem. Vynález byl popsán s odkazem na různá specifická a výhodná provedení a postupy. Je však třeba rozumět, že lze provést různé změny a úpravy, přičemž nedojde k odchýlení od podstaty a rozsahu vynálezu.

Claims (54)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1.

   Sloučenina vzorce (I):

   (X-Z-)_n-[C₃-C₁₀ cycloalkyl]-

   OH OH kde (a) každá skupina R je nezávisle atom vodíku, Ci-Cg-alkyl, C₃-C7-cykloalkyl, fenyl nebo fenyl(Ci-C₃)-alkyl;

   (b) X je -CH₂OH, -CO₂R², -OC(O)R², CH₂OC(O)R² nebo

   C(O)NR³R⁴;

   (c) každá ze skupin R², R³ a R⁴ je nezávisle H, Ci_6-alkyl; C1.6-alkyl substituovaný 1 až 3 skupinami Ci.₆-alkoxy, C₃-C₇-cykloalkyl, C₁_6-alkylthio, halogen, hydroxy, amino, mono(Ci-6-alkyl)amino, di(Ci_₆-alkyl)amino, nebo Ce-io-aryl, kde aryl může být substituovaný 1 až 3 skupinami halogen, Ci.6-alkyl, hydroxy, amino, mono(Ci_6~alkyl)amino, nebo di(Ci-e-alkyl)amino; C₆-io-aryl; nebo C₆-io-aryl substituovaný 1 až 3 skupinami halogen, hydroxy, amino, mono(C-i-6-alkyl)amino, di(C₁.₆-alkyl)amino, nebo Ci_6-alkyl;

   (d) Z a Z’ jsou nezávisle (Ci-Cejalkyl, popřípadě přerušený 1 až 3 atomy S nebo neperoxidového O, nebo jsou nepřítomné, a n je 1 až 3; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, kde 5’-X je -CH₂OH nebo

   C(O)NR³R⁴.
3. 3. Sloučenina podle nároku 2, kde 5’-Xje C(O)NR³R⁴.
4. 4. Sloučenina podle nároku 3, kde R³ je H a R⁴ je (Ci-C₄)alkyl.
5. 5. Sloučenina podle nároku 1, kde každá skupina R je H nebo (Ci-C₄)alkyl.
6. 6. Sloučenina podle nároku 1, kde Z’ je -CH₂- nebo -CH₂-CH₂-.
7. 7. Sloučenina podle nároku 6, kde Z je -CH₂- nebo -CH₂-CH₂-.
8. 8. Sloučenina podle nároku 1, kde C₃-C₁₀cykloalkyl je cyklohexyl nebo cyklopentyl.
9. 9. Sloučenina podle nároku 8, kde X je (Ci-C₄)alkoxykarbonyl, C(O)NR³R⁴ nebo acetoxymethyl.
10. 10. Sloučenina podle nároku 8, kde X-Z je HO2C-Z-.
11. 11. Sloučenina podle nároku 8, kde X-Z a Z’ jsou v konfiguraci trans na skupině C₃-Ciocykloalkyl.
12. 12. Sloučenina podle nároku 1, kde R je H, 5’-X je ethylaminokarbonyl a (X-Z-)_n[(C₃-Cio)-cykloalkyl]-Z’-C=C- je 2-(4-methoxykarbonylcyklohexylmethyl)ethinyl nebo 2-(4-karboxycyklohexylmethyl)ethinyl.

    ·« φφ φ φ φ φ φφ «φ φφ

    Φ··φ ·♦··
13. 13. Sloučenina podle nároku 1, kde R je H, 5’-X je ethylaminokarbonyl a (X-Z-)_n[(C3-C₁₀)-cykloalkyl]-Z’-C=C- je 2-(4-acetoxymethylcyklohexylmethyl)ethinyl.
14. 14. [4-(3-{9-(2R,3R,4S,5S)-5-(N-ethylkarbamoyl)-3,4-dihydroxy-oxolan-2-yl]-6-aminopurin-2-yl}prop-2-inyl)cyklohexyl]methyl-acetát nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.
15. 15. [(2R,3R,4S,5S)-5-(6-amino-2-{3-[4-(hydroxymethyl)cyklohexylj-prop-1-inyl}purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-/\/-ethyl-karboxamid nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.
16. 16. Methyl-4-(3-{9-[(2R,3R,4S,5S)-5-(N-ethylkarbamoyl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-6-aminopurin-2-yl}prop-1-inyl)-cyklohexankarboxylát nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.
17. 17. Kyselina 4-(3-{9-[(2R,3R,4S,5S)-5-(N-ethylkarbamoyl)-3,4-di-hydroxyoxolan-2-yl]-6-aminopurin-2-yl}prop-1-inyl)cyklohexan-karboxylová nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
18. 18. Sloučenina podle nároku 1 pro použití v lékařství.
19. 19. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 17 pro použití při inhibici zánětlivé odpovědi.
20. 20. Sloučenina podle nároku 18, kde 5’-X je -CH₂OH nebo C(O)NR³R⁴.

    ·♦ • · · · • · • · • · “···♦ ···· <·

    0· •9 •9 •9 • *· ·· •· • ·· •· ··
21. 21. Sloučenina podle nároku 18, kde 5’-X je C(O)NR³R⁴.
22. 22. Sloučenina podle nároku 21, kde R³ je H a R⁴ je (Ci-C₄)alkyl.
23. 23. Sloučenina podle nároku 18, kde každá skupina R je H nebo (Ci-C₄)alkyl.
24. 24. Sloučenina podle nároku 18, kde Z’ je -CH₂- nebo -CH₂-CH₂-.
25. 25. Sloučenina podle nároku 18, kde Z je -CH₂- nebo -CH₂-CH₂-.
26. 26. Sloučenina podle nároku 18, kde C₃-Ci₀cykloalkyl zahrnuje cyklohexyl nebo cyklopentyl.
27. 27. Sloučenina podle nároku 26, kde X je (Ci-C₄)alkoxykarbonyl nebo acetoxymethyl.
28. 28. Sloučenina podle nároku 26, kde X-Z je HO₂C-Z-.
29. 29. Sloučenina podle nároku 26, kde X-Z a Z’ jsou v konfiguraci trans na skupině C₃-Ciocykloalkyl.
30. 30. Sloučenina podle nároku 18, kde R je Η, X je ethylaminokarbonyi a (X-Z-)_n[(C₃-Ci₀)-cykloalkyl]-Z’-CsC- je 2-(4-methoxykarbonylcyklohexylmethyl)ethinyl nebo 2-(4-karboxycyklohexylmethyl)ethinyl.
31. 31. Sloučenina podle nároku 18, kde R je Η, X je ethylaminokarbonyl a (X-Z-)_n[(C₃-Cio)-cykloalkylj-Z’-C=C- je 2-(4-acetoxymethylcyklohexylmethyl)ethinyl.
32. 32. Sloučenina podle nároku 18, kterou je (4-(3-{9-(2R,3R,4S,5S)-5-(N-ethylkarbamoyl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-ylj-6-aminopurin-2-yl}prop-1-inyl)cyklohexyl]methylacetát.
33. 33. Sloučenina podle nároku 18, kterou je [(2R,3R,4S,5S)-5-(6-amino-2-{3-[4-(hydroxymethyl)cyklohexyl]prop-1-inyl}purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-/\/-ethylkarboxamid.
34. 34. Sloučenina podle nároku 18, kterou je methyl-4-(3-{9-[(2R,3R,4S,5S)-5-(N-ethylkarbamoyl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-6-aminopurin-2-yl}prop-1-inyl)-cyklohexankarboxylát.
35. 35. Sloučenina podle nároku 18, kterou je kyselina 4-(3-(9-[(2R,3R,4S,5S)-5-(N-ethylkarbamoyl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-6-aminopurin-2-yl}prop-1-inyl)cyklohexankarboxylová.
36. 36. Sloučenina podle nároku 18, kde použití v lékařství dále zahrnuje použití inhibitoru fosfodiesterázy typu IV.
37. 37. Sloučenina podle nároku 18, kde inhibitorem je rolipram.
38. 38. Sloučenina podle nároku 19, kde zánětlivá odpověď je důsledkem ischemie.
39. 39. Sloučenina podle nároku 19, kde zánětlivá odpověď je důsledkem aterosklerózy.
40. 40. Sloučenina podle nároku 19, kde zánětlivá odpověď je důsledkem autoimunitního onemocnění.
41. 41. Sloučenina podle nároku 19, kde zánětlivá odpověď je důsledkem ischemického-reperfuzního poškození.
42. 42. Sloučenina podle nároku 19, kde zánětlivá odpověď je na srdci, ledvině nebo plíci.

    43. Sloučenina podle nároku 19, kde zánětlivá odpověď je důsledkem mrtvice , traumatického poranění mozku nebo poranění míchy. 44. Sloučenina podle nároku 19, kde zánětlivá odpověď je

    důsledkem transplantace orgánu, tkáně nebo buněk.
43. 45. Sloučenina podle nároku 19, kde zánětlivá odpověď je důsledkem infekce.
44. 46. Sloučenina podle nároku 19, kde zánětlivá odpověď je důsledkem onemocnění kůže.
45. 47. Sloučenina podle nároku 19, kde zánětlivá odpověď je důsledkem angioplastiky, umístění stentu, umístění zkratu nebo štěpu.
46. 48. Sloučenina podle nároku 19, kde zánětlivá odpověď je důsledkem alergického onemocnění.
47. 49. Sloučenina podle nároku 19, kde zánětlivá odpověď je důsledkem vyčerpávajícího onemocnění.
48. 50. Sloučenina podle nároku 19, kde zánětlivá odpověď je důsledkem imunosupresivní terapie.
49. 51. Sloučenina podle nároku 19, kde zánětlivá odpověď je důsledkem patologického stavu nebo příznaku u savce, kde se předpokládá aktivita adenosinových receptorů A₂a a požaduje se agonistický účinek na tuto aktivitu.
50. 52. Použití sloučeniny podle některého z nároků 1 až 17 pro výrobu farmaceutického prostředku použitelného pro léčení zánětlivé odpovědi.
51. 53. Použití podle nároku 52, kde farmaceutický prostředek obsahuje inhibitor fosfodiesterázy typu IV.
52. 54. Použití podle nároku 53, kde inhibitorem fosfodiesterázy je rolipram.
53. 55. Použití podle nároku 53, kde farmaceutický prostředek obsahuje kapalný nosič.
54. 56. Použití podle nároku 53, kde farmaceutický prostředek je upravený pro parenterální podávání.