PL199953B1

PL199953B1 - Związek i kompozycja farmaceutyczna oraz ich zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia odpowiedzi zapalnej

Info

Publication number: PL199953B1
Application number: PL349644A
Authority: PL
Inventors: Joel M. Linden; Gail W. Sullivan; Ian J. Sarembock; Timothy Macdonald; Mark Okusa; Irving L. Kron; W.Michael Scheld
Original assignee: Univ Virginia
Priority date: 1999-02-01
Filing date: 2000-01-31
Publication date: 2008-11-28
Also published as: WO2000044763A2; PT1150991E; NZ513096A; JP4837831B2; UA72912C2; JP2002536300A; EE200100397A; MXPA01007850A; IL144188A0; AU2005201255A1; HUP0200224A3; AU2005201255B2; EP1150991A2; IL144188A; CA2361614E; CA2361614C; NO321216B1; KR100668006B1; HK1047288A1; CZ20012781A3

Abstract

Wynalazek dotyczy zwi azku o wzorze (I): w którym (a) ka zdy R oznacza niezale znie atom wodoru, C 1 -C 6 alkil, C 3 -C 7 cykloalkil, fenyl lub fenylo(C 1 -C 3 )alkil; (b) X oznacza -CH 2 OH, -CO 2 R 2 , -OC(O)R 2 , -CH 2 OC-(O)CH 3 lub C(O)NR 3 R 4 ; (c) ka zdy spo sród R 2 , R 3 i R 4 oznacza niezale znie H, C 1 -C 6 -alkil lub C 1 -C 6 -alkil podstawiony przez 1-3 podstawników wybranych z grupy obejmuj acej C 1-6 -alkoksyl, C 1-6 -alkilotio, atom fluorowca, hydroksyl, amino, mono(C 1-6 -alkilo)amino lub di(C 1-6 -alkilo)amino; (d) Z i Z' oznaczaj a indywidualnie (C 1 -C 6 )alkil, ewen- tualnie z wstawionymi 1-3 atomami S lub nienadtlen- kowymi atomami O, lub nie wyst epuj a, i n oznacza liczb e 1-3 lub jego farmaceutycznie dopuszczaln a sól. Kompozycja farmaceutyczna zawieraj aca zwi a- zek wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym no sni- kiem i zastosowanie zwi azku do sporz adzania leku przydatnego do leczenia odpowiedzi zapalnej zosta ly tak ze ujawnione. PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest związek i kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowanie związku i kompozycji do wytwarzania leku do leczenia odpowiedzi zapalnej, czyli zapobiegania uszkodzeniom tkanek spowodowanym aktywnością zapalną.

Odpowiedź zapalna służy eliminowaniu szkodliwych środków z organizmu. Istnieje szeroki zakres patogennych urazów, które mogą zapoczątkować odpowiedź zapalną w tym zakażenie, alergeny, bodźce autoimmunologiczne, odpowiedź immunologiczna w stosunku do przeszczepionej tkanki, szkodliwe środki chemiczne i toksyny, niedokrwienie/reperfuzja, niedotlenienie, uraz mechaniczny i termiczny. Normalnie, zapalenie jest działaniem wybitnie lokalnym, które służy usunięciu, osłabieniu przez rozcieńczenie i oddzieleniu czynnika uszkadzającego oraz uszkodzonej tkanki. Odpowiedź organizmu staje się czynnikiem chorobowym, gdy jej wynikiem jest nieodpowiednie uszkodzenie tkanek gospodarza w procesie eliminowania czynnika docelowego lub odpowiedź na uraz.

Przykładowo zapalenie jest składnikiem patogenezy kilku chorób lub uszkodzeń naczyniowych. Przykłady obejmują: uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (N. G. Frangogiannis i in., w Myocardial Ischemia: Mechanisms, Reperfusion, Protection, M. Karmazyn, wyd., Birkhuser Verlag (1996) str. 236-284; H. S. Sharma i in., Med. of Inflamm. 6, 175 (1987)), miażdżyca naczyń (R. Ross, Nature, 362, 801 (1993)), zapalne tętniaki aorty (N. Girardi i in., Ann. Thor. Surg., 64, 251 (1997); D. I. Walker i in., Brit. J. Surg., 59, 609 (1972); R. L. Pennell i in., J. Vasc. Surg., 2, 859 (1985)) i angioplastyka balonikowa po restenozie (patrz powyżej, R. Ross). Komórki zaangażowane w zapalenie obejmują leukocyty (tj. komórki układu immunologicznego - neutrofile, eozynofile, limfocyty, monocyty, bazofile, makrofagi, komórki dendrytyczne i komórki tuczne), śródbłonek naczyń, komórki mięśni gładkich naczyń, fibroblasty i miocyty.

Uwalnianie przez leukocyty cytokin zapalnych, takich jak czynnik martwicy guza alfa (TNFa), jest środkiem za pomocą którego układ immunologiczny zwalcza inwazje patogenów, w tym zakażenia. TNFa stymuluje ekspresję i aktywację czynników przylegania na leukocytach i komórkach śródbłonka, zapoczątkowuje wzmożoną odpowiedź zapalną neutrofili na drugorzędowe bodźce i wzmaga aktywność utleniającą neutrofili przylegających. Patrz powyżej, Sharma i in. Ponadto, makrofagi/komórki dendrytyczne działają jako dodatkowe komórki przygotowujące antygen do prezentacji limfocytom. Limfocyty z kolei są stymulowane do działania jako prozapalne komórki cytotoksyczne.

Na ogół, cytokiny stymulują neutrofile do wzmożenia utleniającej (np. produkty ponadtlenkowe i drugorzędowe) i nieutleniającej (np. mieloperoksydaza i inne enzymy) aktywności zapalnej. Nieodpowiednie i nadmierne uwalnianie cytokin może wytworzyć przeciwstawne, nadmierne efekty patogenne poprzez uwalnianie uszkadzających tkanki produktów utleniających i nieutleniających (K. G. Tracey i in., J. Exp. Med., 167, 1211 (1988); i D. N. Mannel i in., Rev. Infect. Dis., 9. (uzupełnienie 5), S602-S606 (1987)). Np. TNFa może indukować przyleganie neutrofili do ściany naczyń krwionośnych i następnie migrowanie poprzez naczynie do miejsca uszkodzenia i uwalnianie ich utleniających i nieutleniających produktów zapalnych.

Chociaż monocyty gromadzą się powoli w ogniskach zapalnych, w danych korzystnych warunkach, monocyty rozwijają się w długotrwałe rezydujące komórki pomocnicze i makrofagi. Pod wpływem stymulacji czynnikiem wywołującym zapalenie, monocyfy/makrofagi także wytwarzają i wydzielają układ cytokin (w tym TNFa), dopełniacz, tłuszcze, związki z reaktywnym tlenem, proteazy i czynniki wzrostu, które przebudowują tkankę i regulują funkcje otaczającej tkanki.

Wykazano, że np. cytokiny zapalne są patogenne w zapaleniu stawów (C. A. Dinarello, Semin. Immunol, 4, 133 (1992)); niedokrwieniu (A. Seekamp i in., Agents-Actions-Supp., 41, 137 (1993)); wstrząsie septycznym (D. N. Mannel i in., Rev. Infect. Dis., 9 (uzupełnienie 5), S602-S606 (1987)); astmie (N. M. Cembrzynska i in., Am. Rev. Respir. Dis., 142, 291 (1993)); odrzucaniu przeszczepu narządu (D. K. Imagawa i in., Transplantation, 51, 57 (1991); stwardnieniu rozsianym (H. P. Hartung, Ann. Neurol., 33, 591 (1993)); AIDS (T. Matsuyama i in., AIDS, 5, 1405 (1991)); i w oparzeniu oczu zasadami (F. Miyamoto i in., Opthalmic Res., 30, 168 (1997)). Ponadto, powstawanie ponadtlenku w leukocytach jest związane ze wspomaganiem replikacji ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) (S. Legrand-Poels i in., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 6, 1389 (1990)).

Dobrze wiadomo, że adenozyna i pewne analogi adenozyny, które nieselektywnie aktywują podtypy receptora adenozyny zmniejszają produkcję przez neutrofile zapalnych produktów utleniających (B., N. Cronstein i in., Ann. N. Y. Acad. Sci, 451,291 (1985); P. A. Roberts i in., Biochem. J., 227, 669 (1985); D. J. Schrier i in., J. Immunol., 137, 3284 (1986); B. N. Cronstein i in., Clinical Immunol. i Immunopath., 42, 76 (1987); M. A. lannone i in., w Topics and Perspective in Adenosine Research, E. Gerlach

PL 199 953 B1 i in., wyd., Springer-Verlag, Berlin, str. 286 (1987); S. T. McGarrity i in., J. Leukocyte Biol., 44, 411421 (1988); J. De La Harpe i in., J. Immunol., 142, 596 (1989); S. T. McGarrity i in., J. Immunol., 142, 1986 (1989); i C. P. Nielson i in., Br. J. Pharmacol., 97, 882 (1989)). Wykazano np., że adenozyna hamuje uwalnianie ponadtlenku z neutrofili stymulowane przez czynniki chemotaktyczne takie jak syntetyczny związek podobny do peptydów bakteryjnych, f-met-leu-phe (fMLP), i składnik dopełniacza C5a (B. N. Cronstein i in., J. Immunol., 135, 1366 (1985)). Adenozyna może znacznie zmniejszać wzmożone gwałtownie utleniające działanie PMN (neutrofil), najpierw zapoczątkowane przez TNF-α, a następnie stymulowane przez drugi bodziec taki jak f-met-leu-phe (G. W. Sullivan i in., Clin. Res., 41, 172A (1993)). Ponadto doniesiono, że adenozyna może zmniejszać szybkość replikacji HIV w linii komórek T (S. Sipka i in., Acta. Biochim. Biopys. Hung., 23, 75 (1988)). Jednakże, nie ma dowodu, że adenozyna in vivo ma aktywność przeciwzapalną (G. S. Firestein i in., Clin. Res., 41, 170A (1993); i B. N. Cronstein i in., Clin. Res., 41,244A (1993)).

Sugerowano, że na neutrofilach istnieje więcej niż jeden podtyp receptora adenozyny, który może mieć przeciwne działanie na uwalnianie ponadtlenku (B. N. Cronstein i in., J. Clin. Invest., 85, 1150 (1990)). Istnienie receptora A2A na neutrofilach jako pierwszy ujawnił Van Calker i in. (D. Van Calker i in., Eur. J. Pharmacology, 206, 285 (1991)).

Stopniowo, na bazie testów wiązania radioliganda i odpowiedzi fizjologicznych, opracowywane są związki będące coraz silniejszymi i/lub bardziej selektywnymi agonistami receptorów A2A adenozyny (AR). Początkowo opracowano związki o małej lub żadnej selektywności w stosunku do receptorów A2A, takie jak sama adenozyna lub 5'-karboksyamidy adenozyny, takie jak 5'-N-etylokarboksyamidoadenozyna (NECA) (B. N. Cronstein i in., J. Immunol., 135, 1366 (1985)). Później wykazano, że addycja podstawników 2-alkiloaminowych zwiększa moc i selektywność, np. CV1808 i CGS21680 (M. F. Jarvis i in., J. Pharmacol. Exp. Ther., 251, 888 (1989)). 2-alkoksy-podstawione pochodne adenozyny takie jak WRC-0090 są jeszcze silniejszymi i bardziej selektywnymi agonistami receptora A2A tętnicy wieńcowej (M. Ueeda i in., J. Med. Chem., 34, 1334 (1991)). Stwierdzono również, że także 2-alklilohydrazynowe pochodne adenozyny, np. SHA 211 (znana także WRC-0474) są agonistami receptora A2A tętnicy wieńcowej (K. Niiya i in., J. Med. Chem., 35, 4557 (1992)).

Istnieje jedno doniesienie o kombinacji względnie niespecyficznych analogów adenozyny, R-fenyloizopropyloadenozyny (R-PIA) i 2-chloroadenozyny (Cl-Ado) z inhibitorem fosfodiesterazy (PDE) prowadzące do obniżenia aktywności utleniającej neutrofili (M. A. lannone i in., Topics and Perspectives in Adenosine Research, E. Garlach i in., wyd., Springer-Verlag, Berlin, str. 286-298 (1987)). Jednakże, analogi R-PIA i Cl-Ado są właściwie silniejszymi aktywatorami receptorów adenozyny A1 niż receptorów adenozyny A2A ,a więc prawdopodobnie wywołają efekty uboczne spowodowane aktywacją receptorów A1 na mięśniu sercowym i innych tkankach, takie jak „blok serca”.

R. A. Olsson i in. (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5278150) ujawnia selektywnych agonistów receptora A2 adenozyny o wzorze:

w którym Rib oznacza rybozyl, R1 może oznaczać H i R2 może oznaczać cykloalkil. Związki ujawniono jako przydatne do leczenia nadciśnienia, miażdżycy naczyń i jako środki rozszerzające naczynia.

Olsson i in. (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5140015) ujawnia pewnych agonistów receptora A2 adenozyny o wzorze:

PL 199 953 B1 w którym C(X)BR2 może oznaczać CH2OH i Ri może oznaczać alkilo- lub alkoksyalkil. Związki ujawniono jako przydatne środki rozszerzające naczynia lub środki przeciwnadciśnieniowe.

Linden i in. (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5877180) ujawnia, że pewne choroby zapalne, takie jak zapalenie stawów i astma, można skutecznie leczyć przez podawanie związków, które są selektywnymi agonistami receptorów adenozyny A2A, korzystnie w połączeniu z inhibitorem fosfodiesterazy typu IV. Rozwiązanie według Linden'a i in. ujawnia sposób leczenia chorób zapalnych przez podawanie skutecznej ilości receptora A2A adenozyny o następującym wzorze:

w którym R i X mają znaczenia przedstawione w opisie patentowym.

W korzystnym rozwiązaniu wynalazku Linden'a i in. inhibitor fosfodiesterazy typu IV (PDE) podaje się w połączeniu z agonistą receptora A2A adenozyny. Inhibitor fosfodiesterazy typu IV (PDE) obejmuje racemiczne i optycznie czynne 4-(polialkoksyfenylo)-2-pirolidony o następującym wzorze:

w którym R', R¹⁸, R¹⁹ i X mają znaczenia ujawnione i opisane w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4193926. Rolipram jest przykładem odpowiedniego inhibitora PDE typu IV objętego powyższym wzorem.

W amerykańskim opisie patentowym US nr 5593975 (G. Cristalli) ujawniono pochodne 2-aryloetynylowe, 2-cykloalkiloetynylowe lub 2-hydroksyalkiloetynylowe, w których reszta rybozydowa jest podstewbna ^przez ^gru^pę katooksyammową^ bb podstewbną. ^gru^pę karlDoksyammową^ (^r3IHN^c(^o)-). ^pochodne 2-alkinylopurynowe ujawnił Miyasaka i in. (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4956345), w tych pochodnych grupa 2-alkinylowa jest podstawiona przez (C3-C16) alkil. Ujawniono, że związki '975 są środkami rozszerzającymi naczynia i hamują agregację płytek krwi, a więc są przydatne jako środki przeciw niedokrwieniu, przeciwmiażdżycowe i przeciwnadciśnieniowe.

Jednakże, ciągle istnieje zapotrzebowanie na przydatnych do zastosowań terapeutycznych selektywnych agonistów receptora adenozyny A2A o zmniejszonych efektach ubocznych.

Odpowiedzią na wymienione zapotrzebowanie jest związek według wynalazku, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku, oraz zastosowanie związku i/lub kompozycji do wytwarzania leku przydatnego w leczeniu aktywności zapalnej w tkankach ssaków. Aktywność zapalna tkanki może wynikać z czynników patologicznych lub może wynikać z fizycznego, chemicznego lub termicznego urazu, lub urazu jatrogennego, takiego jak transplantacja organów, tkanek lub komórek, plastyka naczynia (PCTA), zapalenie po niedokrwieniu/reperfuzji lub szczepienie. Niniejsze związki obejmują nową klasę 2-alkinylo-pochodnych adenozyny, podstawionych w pozycji etynu przez podstawione grupy cykloalkilowe. Korzystnie, reszta rybozydowa jest podstawiona w pozycji 5' („X”) przez grupę N-alkil-(lub cykloalkilo) karboksyaminową („aminokarbonyl”). Zatem, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób hamowania odpowiedzi zapalnej u ssaków, takich jak człowiek, i zabezpieczania tkanki poddanej tej odpowiedzi, przez podawanie skutecznej ilości jednego lub więcej związków według wynalazku.

Istotą związku według wynalazku jest jego struktura chemiczna, reprezentowana następującym wzorem ogólnym (I):

PL 199 953 B1

w którym (a) każdy R oznacza niezależnie atom wodoru, Ci-C₆alkil, C3-Cycykloalkil, fenyl lub fenylo(Ci-C3)alkil;

(b) X ^{oznacza -}CH2OH^{, -}CO2R^{2, -}OC⁽O⁾R^{2 -}CH₂OC⁽O⁾CH³ lub C⁽O)NR³R^4; (c) każdy spośród r2, r3 i r4 oznacza niezależnie H, Ci-C₆alkil lub Ci-C₆alkil podstawiony przez 1-3 podstawników wybranych z grupy obejmującej Ci-C₆alkoksyl, Ci-C₆-alkilotio, atom fluorowca, hydroksyl, amino, mono (Ci-C₆alkilo) amino lub di (Ci-C₆alkilo) amino;

(d) Z i Z' oznaczają indywidualnie (Ci-C₆)alkii, ewentualnie z wstawionymi i-3 atomami S lub nienadtlenkowymi atomami O, lub nie występują, i n oznacza liczbę i-3; lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Dla związku według wynalazku korzystne jest, gdy 5'-X oznacza -CH2OH lub -C(O)NR³r4, najkorzystniej -C(O)NR³R4, w których r3 oznacza H, a r4 oznacza (C_rC₄) alkil. Równie korzystne jest gdy każdy R oznacza H lub (C_rC₄) alkil, oraz gdy Z' oznacza -CH2- lub -CH2-CH2-, a najkorzystniej gdy jeśli Z' oznacza -CH2- lub -CH2-CH2-, to Z oznacza -CH2- lub -CH2-CH2-. Dla związku według wynalazku korzystne jest też, gdy C3-Cio-cykloalkil obejmuje cykloheksyl lub cyklopentyl, a najkorzystniej gdy jeśli C3-io-cykloalkil obejmuje cykloheksyl lub cyklopentyl, to X oznacza (Ci-C₄)alkoksykarbonyl, C(O)NR³r4 lub acetoksymetyl, a X-Z oznacza HO2C-Z-, a X-Z i Z' są w konfiguracji trans przy C3-Cio-cykloalkilu.

Korzystne związki o wzorze (I) według wynalazku obejmują te związki, w których R oznacza H, 5'-X oznacza etyloaminokarbonyl, a (X-Z-)_n[(C3-C₁₀)-cykloalkilo]-Z'-C=C- oznacza 2-(4-metoksykarbonylocykloheksylometylo)etynyl lub 2-(4-karboksycykloheksylometylo)etynyl, albo też te w których R oznacza H, 5'-X oznacza etyloaminokarbonyl, a (X-Z-)_n[(C3-Ci₀)-cykloalkilo]-Z' -C=C- oznacza 2-(4-acetoksymetylocykloheksylometylo)etynyl. Najkorzystniej, gdy związkiem według wynalazku jest octan [4-(3-{9-(2R, 3R, 4S, 5S)-5-(N-etylokarbamoilo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-6-aminopuryn-2-ylo}prop-2-ynylo)cyklo-heksylo]metylu lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, lub [(2S, 3S, 4R, 5R)-5-(6-amino-2-{3-[4-(hydroksymetylo)cykloheksylo]prop-i-ynylo}puryn-9-ylo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-N-etylokarboksyamid lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, lub 4-(3-{9-[(2R,3R,4S,5S)-5-(N-etylokarbamoilo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-6-aminopuryn-2-ylo)}prop-i-ynylo)cykloheksanokarboksylan metylu lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, lub też kwas 4-(3-{9-[(2R, 3R, 4S, 5S)-5-(N-etylokarbamoilo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-6-aminopuryn-2-ylo)}prop-i-ynylo)cykloheksanokarboksylowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek o wzorze I lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem lub nośnikiem. Dla kompozycji korzystnie jest, gdy związkiem o wzorze (I) jest związek w którym 5'-X oznacza -CH2OH lub -C(O)NR³R4, najkorzystniej -C(O)NR³R4, gdzie r3 oznacza H, a R4 oznacza (Ci-C4)alkil. Równie korzystne jest gdy w kompozycji związkiem o wzorze (I) jest związek w którym każdy R oznacza H lub (Ci-C4)alkil, oraz gdy Z' oznacza -CH2- lub -CH2-CH2-, a najkorzystniej gdy jeśli Z' oznacza -CH2- lub -CH2-CH2-, to Z oznacza -CH2- lub -CH2-CH2-. Dla kompozycji według wynalazku korzystne jest też, gdy związkiem o wzorze (I) jest związek w którym C3-Cio-cykloalkil obejmuje cykloheksyl lub cyklopentyl, a najkorzystniej gdy jeśli C3-Cio-cykloalkil obejmuje cykloheksyl lub cyklopentyl, to X oznacza (Ci-C4) alkoksykarbonyl, C(O)NR³r4 lub acetoksymetyl, a X-Z oznacza HO2C-Z-, a X-Z i Z' są w konfiguracji trans przy (C3-Cio)-cykloalkilu.

Korzystne kompozycje według wynalazku są te, które zawierają związki o wzorze (I), w których R oznacza H, 5'-X oznacza etyloaminokarbonyl, a (X-Z-)_n[(C3-C₁₀)-cykloalkilo]-Z'-C=C-oznacza 2-(4metoksykarbonylocykloheksylometylo)etynyl lub 2-(4-karboksycykloheksylometylo)etynyl, albo też te w których R oznacza H, 5'-X oznacza etyloaminokarbonyl, a (X-Z-)_n(C3-Ci₀)-cykloalkilo]-Z'-C=C- oznacza 2-(4-acetoksymetylocykloheksylometylo)etynyl. Najkorzystniej, gdy związkiem zawartym w kompozycji

PL 199 953 B1 według wynalazku jest octan [4-(3-{9-(2R, 3R, 4S, 5S)-5-(N-etylokarbamoilo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-6-aminopuryn-2-ylo}prop-2-ynylo)cykloheksylo]metylu, lub [(2S, 3S, 4R, 5R)-5-(6-amino-2-(3-[4-(hydroksymetylo)cykloheksylo]prop---ynylo}puryn-9-ylo)-3.4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-N-etylokarboksyamid, lub 4-(3-{9-[(2R. 3R. 4S. 5S)-5-(N-etylokarbamoilo)-3.4-dihydroksy-oksolan-2-ylo]-6-aminopuryn-2-ylo)}prop---ynylo)cykloheksanokarboksylan metylu. lub też kwas 4-(3-{9-[(2R. 3R. 4S. 5S)-5-(N-etylokarbamoilo)-3.4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-6-aminopuryn-2-ylo)}prop---ynylo)cykloheksanoka-boksylowy. lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. Dla kompozycji farmaceutycznej według wynalazku korzystne jest. gdy zawiera dodatkowo rolipram.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kombinacji związków według wynalazku o wzorze (I) do sporządzania leku przydatnego do leczenia odpowiedzi zapalnej komórek immunologicznych. Zastosowanie korzystnie odnosi się do leków przydatnych w leczeniu odpowiedzi zapalnej zwłaszcza wtedy. gdy jest ona wynikiem choroby niedokrwiennej. choroby miażdżycy naczyń. choroby autoimmunologicznej. jest spowodowana uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym. gdy choroba występuje w sercu. nerce lub płucu. gdy jest spowodowana udarem. urazowym uszkodzeniem mózgu lub uszkodzeniem rdzenia kręgowego. gdy jest spowodowana transplantacją organów. tkanek lub komórek. oraz zakażeniem. chorobą skóry. angioplastyką naczynia. wstawieniem stentu. wstawieniem połączenia omijającego lub szczepieniem. chorobą alergiczną. chorobą wyniszczającą. leczeniem immunosupresyjnym. lub jest wynikiem patologicznego stanu lub jego objawu u ssaka. gdzie są zaangażowane receptory A2A adenozyny i pożądany jest agonizm takiej aktywności. Dla zastosowania według wynalazku korzystne jest. gdy lek zawiera dodatkowo rolipram. a także ciekły nośnik. a najkorzystniej. gdy lek jest przystosowany do podawania pozajelitowego.

Chociaż pewnych agonistów receptora A2A adenozyny opisano jako środki rozszerzające naczynia. a więc przydatne do bezpośredniego leczenia nadciśnienia. skrzepu. miażdżycy naczyń itp.. to nie ujawniono dotąd w tej dziedzinie aktywności związków o wzorze (I) zabezpieczającej tkanki. Uważa się. że aktywacja receptorów A2A adenozyny hamuje zapalenie przez działanie na neutrofile. komórki tuczne. monocyty/makrofagi. komórki T i/lub eozynofile. Wynikiem hamowania tych komórek zapalnych jest zabezpieczenie tkanki po urazach tkankowych.

Kompozycję farmaceutyczną zawierającą skuteczną ilość związku o wzorze I. lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli. można stosować w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem lub nośnikiem i ewentualnie w połączeniu z inhibitorem fosfodiesterazy typu IV (PDE). Korzystnie. kompozycja występuje w jednostkowej postaci dawkowania.

Spośród odpowiedzi zapalnych. w stosunku do których można stosować lek (w tym stosować profilaktycznie) związek o wzorze I. ewentualnie inhibitor PDE typu IV. są zapalenia spowodowane:

(a) stymulacją (choroby autoimmunologiczne), takie jak toczeń rumieniowaty. stwardnienie rozsiane. bezpłodność wskutek endometriozy. cukrzyca typu I obejmująca zniszczenie wysepek trzustkowych prowadzące do cukrzycy zapalne konsekwencje cukrzycy. obejmujące owrzodzenia kończyn. choroba Crohn'a. wrzodziejące zapalenie okrężnicy. zapalna choroba jelit. osteoporoza i reumatoidalne zapalenie stawów;

(b) chorobami alergicznymii takimi jak astma. katar sienny. nieżyt nosa, wiosenne zapalenie spojówek i inne stany. w których pośredniczą eozynofile;

(c) chorobami skóry. takimi jak łuszczyca. kontaktowe zapalenie skóry. wyprysk. infekcyjne owrzodzenia skóry. otwarte rany. zapalenie tkanki łącznej;

(d) choroba mi z^i^^^rn^rmi obejmującymi posocznicę, septyczny, zapalenie mózgu, zakaźne zapalenie stawów. wstrząs endotoksynowy. wstrząs wywołany przez bakterie Gram-ujemne. reakcja Jarischa-Herxheimera. półpasiec. wstrząs toksyczny. malaria mózgu. bakteryjne zapalenie opon mózgowych. zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS). choroba z Lyme. zakażenie HIV. (wzmożona przez TNFa replikacja HIV. hamowanie przez TNFa aktywności inhibitora odwrotnej transkryptazy);

(e) chorobami wyniszczającymi. takimi jak kacheksja wtórna do raka i HIV;

(f) transplantację organów. tkanek lub komórek (np. szpiku kostnego. rogówki. nerki. płuc. wątroby. serca. skóry. wysepek trzustkowych). obejmująca odrzucenie przeszczepu i reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi;

(g) szkodliwymi skutkami leczenia lekami. obejmującymi szkodliwe skutki leczenia amfoterycyną B. szkodliwe skutki leczenia immunosupresyjnego. np. leczenia interleukiną 2. szkodliwe skutki leczenia OKT3. szkodliwe skutki leczenia GM-CSF. szkodliwe skutki leczenia cyklosporyną i szkodliwe skutki leczenia aminoglikozydami. zapalenie jamy ustnej i zapalenie śluzówki spowodowane immunosupresją;

PL 199 953 B1 (h) sts^m^rm seecowo-naczyniowymii obejmującymi choroby krążeniowe wywołane lub zaostrzone odpowiedzią zapalną, takie jak niedokrwienie, miażdżyca naczyń, choroby naczyń obwodowych, cestenoza po plastyce naczynia, zapalny tętniak aorty, zapalenie naczyń, udar, uszkodzenie rdzenia kręgowego, zastoinowe uszkodzenie serca, wstrząs krwotoczny, uszkodzenie niedokrwienno/reperfuzyjne, skurcz naczyń po krwotoku podpajęczynówkowym, skurcz naczyń po udarze naczyniowym mózgu, zapalenie opłucnej, zapalenie osierdzia i sercowo-naczyniowe powikłania cukrzycy;

(i) dializą, w tym zapalenie osierdzia, spowodowane dializą otrzewnową;

(j) dną moczanową; i (k) lub termicznym urazem spowodowanym oparzeniami termicznymi kwasem, alkaliami itp.

Szczególnie interesujące i efektywne jest zastosowanie niniejszych związków do leczenia odpowiedzi zapalnej spowodowanej transplantacją organów, tkanek lub komórek, tj., transplantacją allogenicznej lub ksenogenicznej tkanki biorcy, który jest ssakiem, chorób autoimmunologicznych i stanów zapalnych spowodowanych patologiami krążeniowymi i ich leczeniem, w tym plastyka naczynia, umieszczenie stentu, wszczepienie połączenia omijającego lub szczepienie. Nieoczekiwanie, stwierdzono, że podawanie jednego lub więcej związku o wzorze (I) było skuteczne po zapoczątkowaniu odpowiedzi zapalnej, np. po wystąpieniu u pacjenta patologii lub urazu, który zapoczątkowuje odpowiedź zapalną.

Tkankę lub komórki zawierające miejsca receptorowe wiążące ligand można stosować do pomiaru selektywności związków testowych pod względem specyficznych podtypów receptorów, ilości bioaktywnego związku we krwi lub innych płynach fizjologicznych, lub można stosować jako narzędzie do zidentyfikowania potencjalnych środków terapeutycznych do leczenia chorób lub stanów związanych z aktywacją miejsca receptorowego, metodą kontaktowania wymienionych środków z wymienionymi kompleksami ligand-receptor i pomiaru zakresu wyparcia liganda i/lub wiązania środka, lub odpowiedzi komórkowej na wymieniony środek (np. nagromadzenie cAMP).

Poniżej przedstawiono szczegółowy opis wynalazku. W opisie zastosowano następujące definicje, jeśli nie wskazano tego inaczej. Atom fluorowca oznacza atom fluoru, chloru, bromu lub jodu. Alkil, alkoksyl, aryloalkil, alkiloaryl itp. obejmują zarówno prostołańcuchowe jak i rozgałęzione grupy alkilowe; ale odwołanie do konkretnego rodnika, jak „propyl”, obejmuje rodnik tylko prostołańcuchowy, a izomer rozgałęziony, jak „izopropyl”, jest objęty specyficznym dla niego terminem. Aryl obejmuje rodnik fenylowy lub orto-skondensowany bicykliczny rodnik karbocykliczny zawierający około dziewięciu do dziesięciu atomów w pierścieniu, przy czym co najmniej jeden pierścień jest aromatyczny. Heteroaryl obejmuje rodnik przyłączony poprzez atom węgla monocyklicznego pierścienia aromatycznego zawierającego pięć lub sześć atomów w pierścieniu obejmujących atomy węgla i jeden do sześciu heteroatomów, każdy wybrany z grupy obejmującej nienadtlenkowy atom tlenu, atom siarki i N(X), w którym X nie występuje lub oznacza H, O, (C₁-C₄) alkil, fenyl lub benzyl, jak również rodnik pochodzący od orto-skondensowanego bicyklicznego heterocyklu o około ośmiu do dziesięciu atomach w pierścieniu, szczególnie benzopochodną, lub pochodzący przez skondensowanie z nim podwójnego rodnika propylenowego, trimetylenowego lub tetrametylenowego.

Dla znawców w dziedzinie powinno być zrozumiałe, że związki o wzorze (I) mają więcej niż jedno centrum chiralne i można je wydzielić w formach optycznie czynnych i racemicznych. Korzystnie, grupa rybozydowa o wzorze (I) pochodzi od D-rybozy, tj. grupy 3', 4'-hydroksylowe znajdują się w pozycji alfa w stosunku do pierścienia cukru i grupy 2' i 5' znajdują się w pozycji beta (3R, 4S, 2R, 5S). Gdy dwie grupy przy grupie cykloheksylowej znajdują się w pozycji 4, korzystnie występują w konfiguracji trans. Niektóre związki mogą wykazywać polimorfizm. Należy rozumieć, że zakresem niniejszego wynalazku są objęte dowolne racemiczne, optycznie czynne, polimorficzne lub stereoizomeryczne formy, lub ich mieszaniny, związku według wynalazku, które posiadają opisane tu przydatne właściwości, w tej dziedzinie dobrze znane jest otrzymywanie form optycznie czynnych (np. przez rozdzielanie form racemicznych metodą rekrystalizacji lub z zastosowaniem technik enzymatycznych, metodą syntezy z optycznie czynnych substancji wyjściowych, metodą syntezy chiralnej lub metodą rozdzielania chromatograficznego z zastosowaniem chiralnej fazy stacjonarnej) oraz określanie aktywności agonisty wobec adenozyny z zastosowaniem opisanych w dalszej części opisu testów lub innych podobnych testów, które są dobrze znane w dziedzinie.

Wyszczególnione poniżej korzystne wartości liczbowe dla poszczególnych rodników czy podstawników oraz zakresy, mają jedynie charakter ilustracyjny i nie wykluczają innych określonych wartości lub innych wartości mieszczących się w określonych zakresach dla rodników i podstawników.

PL 199 953 B1

Szczególnie (Οι-Οβ) alkil może obejmować metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izo-butyl, sec-butyl, pentyl, 3-pentyl lub heksyl. Stosowany tu termin „cykloalkil” obejmuje bicykloalkil (norbornyl, 2,2,2-bicyklooktyl itp.) i tricykloalkil (adamantyl itp.), ewentualnie zawierające 1-2 atomów takich jak N, O lub S. Cykloalkil także obejmuje (cykloalkilo)alkil. Zatem, (C3-C6)cykloalkil może obejmować cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl lub cykloheksyl; (C3-C6)cykloalkilo (C^Ce) alkil może obejmować cyklopropylometyl, cyklobutylometyl, cyklopentylometyl, cykloheksylometyl, 2-cyklopropyloetyl, 2-cyklobutyletyl, 2-cyklopentyletyl lub 2-cykloheksyloetyl. (Ci-Ce)alkoksyl może obejmować metoksyl, etoksyl, propoksyl, izopropoksyl, butoksyl, izo-butoksyl, sec-butoksyl, pentoksyl, 3-pentoksyl lub heksylooksyl; (C2-C₆)alkenyl może obejmować winyl, allil, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, 1-heksenyl, 2-heksenyl, 3-heksenyl, 4-heksenyl lub 5-heksenyl; (C2-Ce)alkinyl może obejmować etynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, 1-butynyl, 2-butynyl, 3-butynyl, 1-pentynyl, 2-pentynyl, 3-pentynyl, 4-penty-nyl, 1-heksynyl, 2-heksynyl, 3-heksynyl, 4-heksynyl lub 5-heksynyl; (C1-Ce)alkanoil może obejmować acetyl, propanoil lub butanoil; fluorowco (C1-C6) alkil może obejmować jodometyl, bromometyl, chlorometyl, fluorometyl, trifluorometyl, 2chloroetyl, 2-fluoroetyl, 2,2,2-trifluoroetyl lub pentafluoroetyl; hydroksy (C1-C₆) alkil może obejmować hydroksymetyl, 1-hydroksyetyl, 2-hydroksyetyl, 1-hydroksypropyl, 2-hydroksypropyl, 3-hydroksypropyl, 1-hydroksybutyl, 4-hydroksybutyl, 1-hydroksypentyl, 5-hydroksypentyl, 1-hydroksyheksyl, lub 6-hydroksyheksyl; (C1-C6) alkoksykarbonyl (CO2R²) może obejmować metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, propoksykarbonyl, izopropoksykarbonyl, butoksykarbonyl, pentoksykarbonyl lub heksylooksykarbonyl;

(C1-C6) alkilotio może obejmować metylotio, etylotio, propylotio, izopropylotio, butylotio, izobutylotio, pentylotio lub heksylotio; (C2-Ce)alkanoilooksyl może obejmować acetoksyl, propanoilooksyl, butanoilooksyl, izobutanoilooksyl, pentanoilooksyl lub heksanoilooksy; aryl może obejmować fenyl, indenyl lub naftyl; i heteroaryl może obejmować furyl, imidazolil, triazolil, triazynyl, oksazoil, izoksazoil, tia-zolil, i.zotiazoil, piraxolil, pirolil, pirazynyl, tetrazolil, purydyl (lub jego N-tlenek), tientyl, pirymidynyl (lub jego N-tlenek), indolil, izochinolil (lub jego N-tlenek) lub chinolil (lub jego N-tlenek).

Korzystne związki o wzorze (I) obejmują te, w których R oznacza atom wodoru, monometyl lub cyklopropyl, a (X-Z-)n[(C3-C1o)-cykloalkilo]-Z' - oznacza karboksy- lub (CrC^alkoksykarbonylocykloheksylo(C1-C4) alkil, a r2 oznacza atom wodoru lub (C1-C4) alkil, tj. metyl lub etyl, a R³ oznacza atom wodoru, metyl lub fenyl, a R⁴ oznacza atom wodoru, metyl lub fenyl, a Z oznacza -CH2- lub -CH2-CH2-, a X oznacza CO2R2, (C2-C5)alkanoilometyl lub amido, oraz n oznacza liczbę 1.

Szczególnie korzystne związki o wzorze (I) obejmują te, w których każdy R oznacza H i 5'-X oznacza etyloaminokarbonyl, a (X-Z-)n[(C3-C1o)-cykloalkilo]-Z' - oznacza 4-metoksykarbonylocykloheksylometyl (DWH-146 e) lub 4-karboksycykloheksylometyl (DWH-146 kwas), albo (X-Z-)n(C3-C_w)cykloalkilo]-Z'- oznacza 4-acetoksymetylo-cykloheksylometyl (JMR-193). Przedstawiono je poniżej jako DWH-146 (kwas) lub 5 ester metylowy (e) oraz JMR-193).

Syntezę 4[3-(6-amino-9(5-[(etyloamino)karbonylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-Z-furanylo-9H-2-purynylo)-2-propynylo]-1-cykloheksanokarboksylanu metylu (DWH-146e) przeprowadzono metodą sprzęgania krzyżowego pochodnej jodo-adenozynowej (N-etylo-1'-deoksy-1'-(amino-2-jodo-9H-puryn-9-ylo)-3-D-rybofuranouramidu) z 4-(2-propynylo)-1-cykloheksanokarboksylanem metylu z zastosowaniem

PL 199 953 B1 katalizatora Pd¹¹. Syntezę pochodnej jodo-adenozynowej przeprowadzono z zastosowaniem guanozyny. Guanozynę najpierw traktowano bezwodnikiem octowym, który acetyluje grupy hydroksylowe cukru, a następnie chlorowano pozycję 6 z zastosowaniem chlorku tetrametyloamoniowego i tlenochlorku fosforu. Jodowanie pozycji 2 przeprowadzono przez zmodyfikowaną reakcję Sandmeyer'a, a następnie przez podstawienie pozycji 6-Cl i octanów cukru amoniakiem. Grupy 2' i 3' hydroksylowe zabezpieczono jako acetonid i grupę 5' hydroksylową jodowano do kwasu z zastosowaniem nadmanganianu potasu. Odbezpieczenie pozycji 2' i 3' acetonidu, estryfikacja Fisher'a grupy 5' kwasowej z zastosowaniem etanolu i konwersja uzyskanego estru etylowego w etyl amid z zastosowaniem etyloaminy dały N-etylo-1'-deoksy-1'-(amino-2-jodo-9H-puryn-9-ylo)-3-D-rybofuranouramid.

Acetylen (4-(2-propynylo)-1-cykloheksanokarboksylan metylu) zsyntetyzowano wychodząc z trans-1,4-cykloheksanodimetanolu. Początkowo trans-diol monotosylowano, a następnie tosylan podstawiono anionem acetylenowym. Hydroksyl uzyskanych związków hydroksyacetylenowych utleniono do kwasu z zastosowaniem odczynnika Jones'a, a następnie metylowano stosując (trimetylosililo)diazometan, uzyskując 4-(2-propynylo)-1-cykloheksanokarboksylan metylu.

Reakcję sprzęgania krzyżowego przeprowadzono w następujących uprzednio opisanych warunkach. Do roztworu N-N-dimetyloformamidu (0,5 ml), acetonitrylu (1 ml), trietyloaminy (0,25 ml) i N-etylo-1'-deoksy-1'-(amino-2-jodo-9H-puryn-9-ylo)-e-D-rybofuranouramidu (25 mg, 0,06 mmola) dodano dichlorek bis(trifenylofosfino)palladu (1 mg, 2% molowe) i jodek miedzi (I) (0,06 mg, 5% molowych). Do uzyskanej mieszaniny dodano 4-(2-propynylo)-1-cykloheksanokarboksylan metylu (54 mg, 0,3 mmola) i mieszaninę reakcyjną mieszano w atmosferze azotu przez 16 godzin. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskaną pozostałość poddano szybkiej chromatografii w mieszaninie 20% metanolu w chloroformie (Rf=0,45), uzyskując 19 mg (białawe ciało stałe, temperatura topnienia 125°C (rozkład)) 4[3-(6-amino-9(5-[(etyloamino)karbonylo]-3,4-dihydro>ksytetrahydro>-Z-furanylo)-9H-2-purynylo)-2-propynylo]-1-cykloheksanokarboksylanu (DWH-146e).

DWH-146e i JMR193 są znacznie silniejszymi inhibitorami w modelowych układach zapalnych niż związek wzorcowy, CGS21680 (2-[p-(karboksyetylo)fenyloetyloamino]5'-N-etylokarboksyamidoadenozyna). Np. DWH-146e jest około 80 razy silniejszy przy receptorach A2A i 40 razy bardziej selektywny wobec receptorów A2A w porównaniu do A3 niż związek CGS21680.

Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych soli obejmują organiczne sole addycyjne z kwasami utworzone z kwasami, które tworzą fizjologicznie dopuszczalny anion, np. tosylan, metanosulfonian, jabłczan, octan, cytrynian, malonian, winian, bursztynian, benzoesan, askorbinian, α-ketoglutaran i α-glicerofosforan. Można także utworzyć odpowiednie sole nieorganiczne obejmujące chlorowodorek, siarczan, azotan, wodorowęglan i węglan.

Farmaceutycznie dopuszczalne sole można otrzymać stosując standardowe metody dobrze znane w tej dziedzinie, np. przez poddanie dostatecznie zasadowego związku takiego jak amina reakcji z odpowiednim kwasem, uzyskując fizjologicznie dopuszczalny anion. Można także utworzyć sole kwasów karboksylowych z metalem alkalicznym (np. sole sodu, potasu lub litu) lub metalem ziem alkalicznych (np. sole wapnia).

Związki o wzorze I można komponować jako kompozycje farmaceutyczne i podawać ssakowi, takiemu jak człowiek, w rozmaitych postaciach przystosowanych do wybranego sposobu podawania, tj. doustnie lub pozajelitowo, dożylnie, domięśniowo, miejscowo lub podskórnie.

Zatem, związki według wynalazku można podawać ogólnoustrojowo, np. doustnie, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym rozczynnikiem, takim jak obojętny rozcieńczalnik lub przyswajalny jadalny nośnik. Można je zamknąć w kapsułkach żelatynowych o twardej lub miękkiej powłoce, prasować w tabletki lub wprowadzać bezpośrednio z pożywieniem w diecie pacjenta. Do doustnego podawania terapeutycznego, aktywny związek można połączyć z jednym lub więcej rozczynnikami i używać w postaci doustnych tabletek, tabletek podpoliczkowych, pastylek, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków itp. Takie kompozycje i preparaty powinny zawierać co najmniej 0,1% aktywnego związku. Procentowa zawartość kompozycji i preparatów może się oczywiście zmieniać i może dogodnie stanowić pomiędzy około 2 do około 60% wagowych danej jednostkowej postaci dawkowania. Ilość aktywnego związku w takich terapeutycznie przydatnych kompozycjach jest taka, aby zapewnić skuteczny poziom dawkowania.

Tabletki, pastylki, pigułki, kapsułki itp. mogą także zawierać co następuje: spoiwa takie jak guma tragakantowa, guma arabska, skrobia kukurydziana lub żelatyna; rozczynniki takie jak difosforan wapnia; środek rozdrabniający taki jak skrobia kukurydziana, skrobia ziemniaczana, kwas alginowy itp.; lubrikant taki jak stearynian magnezu; i środek słodzący taki jak sacharoza, fruktoza, laktoza lub

PL 199 953 B1 aspartam; lub środek smakowy taki jak mięta pieprzowa, olejek strzęślowy lub aromat wiśniowy. Gdy jednostkową postacią dawkowania jest kapsułka może ona zawierać, oprócz substancji powyższego typu, ciekły nośnik taki jak olej roślinny lub glikol polietylenowy. Różne inne substancje mogą występować jako powłoki lub innego rodzaju modyfikatory formy fizycznej stałej jednostkowej postaci dawkowania. Na przykład tabletki, pigułki, lub kapsułki można pokryć żelatyną, woskiem, szelakiem lub cukrem itp. Syrop lub eliksir może zawierać aktywny związek, sacharozę lub fruktozę jako środek słodzący, metylo- i propyloparabeny jako środki konserwujące, barwnik i aromat taki jak wiśniowy lub pomarańczowy. Oczywiście, dowolna substancja użyta do przygotowania dowolnej jednostkowej postaci dawkowania powinna być farmaceutycznie dopuszczalna i zasadniczo nietoksyczna w stosowanych ilościach. Ponadto, aktywny związek można wprowadzać do preparatów i urządzeń do przedłużonego uwalniania.

Aktywny związek można też podawać dożylnie lub dootrzewnowo metodą wlewu lub iniekcji. Roztwory aktywnego związku lub jego sole można przygotować w wodzie, ewentualnie zmieszać z nietoksycznym surfaktantem.

Dyspersje można także wytworzyć w glicerolu, ciekłych glikolach polietylenowych, trójoctanie glicerylu i ich mieszaninach, oraz w olejach. W normalnych warunkach przechowywania i zastosowania, te preparaty zawierają środek konserwujący zapobiegający wzrostowi mikroorganizmów.

Farmaceutyczne postacie dawkowania odpowiednie do iniekcji lub wlewu mogą obejmować zawierające aktywny składnik sterylne wodne roztwory lub dyspersje, lub sterylne proszki, które są przystosowane do przygotowywania na poczekaniu sterylnych roztworów lub dyspersji do wstrzykiwania lub do wlewów, ewentualnie zamkniętych w liposomach. We wszystkich przypadkach, ostateczna postać dawkowania musi być sterylna, płynna i trwała w warunkach wytwarzania i przechowywania. Ciekły nośnik lub rozczynnik może stanowić rozpuszczalnik lub ciekły ośrodek dyspersyjny, obejmujący np. wodę, etanol, poliol (np. glicerol, glikol propylenowy, ciekłe glikole polietylenowe itp.), oleje roślinne, nietoksyczne estry glicerylu i odpowiednie ich mieszaniny. Właściwą płynność można utrzymywać przez np. wytwarzanie liposomów, utrzymanie wymaganego wymiaru cząstki w przypadku dyspersji lub zastosowanie surfaktantów. Zapobieganie działaniu mikroorganizmów można zapewnić z zastosowaniem różnych środków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych, np. parabenów, chlorobutanolu, fenolu, kwasu sorbinowego, tymerozalu itp. W wielu przypadkach korzystna będzie obecność środków izotonicznych, np. cukrów, buforów lub chlorku sodu. Przedłużoną absorpcję kompozycji do wstrzykiwania można wywołać przez zastosowanie w kompozycjach środków opóźniających absorpcję, np. monostearynianu Clin.u i żelatyny.

Sterylne roztwory do wstrzykiwania wytwarza się metodą wprowadzenia aktywnego związku w wymaganej ilości do odpowiedniego rozpuszczalnika z różnymi innymi składnikami wyliczonymi powyżej, jeśli są one wymagane, po czym przeprowadza się jałowienie przez filtrację. W przypadku sterylnych proszków do otrzymywania sterylnych roztworów do wstrzykiwania, korzystnymi metodami przygotowywania są techniki suszenia próżniowego i liofilizacji, które dają proszek aktywnego składnika wraz z dowolnym dodatkowym pożądanym składnikiem występującym w uprzednio przesączonych w celu wyjałowienia roztworach.

Związki według wynalazku do podawania miejscowego można stosować w czystej postaci, tj. w cieczy. Jednakże, na ogół będzie pożądane stosowanie ich na skórę w postaci kompozycji lub preparatów w połączeniu z dermatologicznie dopuszczalnym nośnikiem, który może stanowić ciało stałe lub ciecz.

Przydatne nośniki stałe obejmują silnie rozdrobnione ciała stałe takie jak talk, glinka, mikrokrystaliczna celuloza, krzemionka, tlenek glinu itp. Przydatne nośniki ciekłe obejmują wodę, alkohole lub glikole lub mieszaniny woda-alkohol/glikol, w których niniejsze związki można rozpuścić lub rozproszyć w skutecznej ilości, ewentualnie przy pomocy nietoksycznych surfaktantów. W celu optymalizacji właściwości dla danego zastosowania można dodać środki wspomagające takie jak środki aromatyczne i dodatkowe środki przeciwbakteryjne. Uzyskane kompozycje płynne można stosować z podkładkami absorbującymi, stosowanymi do impregnacji bandaży i innych opatrunków lub rozpylać na dotkniętą powierzchnię z zastosowaniem rozpylaczy z pompką lub typu aerozoli.

Z ciekłymi nośnikami można także stosować zagęszczacze takie jak syntetyczne polimery, kwasy tłuszczowe, sole i estry kwasów tłuszczowych, alkohole tłuszczowe, zmodyfikowane celulozy lub zmodyfikowane substancje nieorganiczne, uzyskując dające się rozpylać pasty, żele, maście, mydła itp., do zastosowania bezpośrednio na skórę użytkownika.

Przykłady przydatnych kompozycji dermatologicznych, które można stosować do dostarczania związków o wzorze I na skórę ujawnił Jacquet i in. (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4608392),

PL 199 953 B1

Geria (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4992478), Smith i in. (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4559157) i Wortzman (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4820508).

Przydatne dawki związków o wzorze I można określić przez porównanie ich aktywności in vitro i in vivo na modelach zwierzęcych. Metody ekstrapolacji skutecznych dawek u myszy i innych zwierząt na ludzi są znane w tej dziedzinie, np. patrz opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4938949. Przydatne dawki inhibitorów PDE typu IV są również znane w tej dziedzinie. Np. patrz opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5877180, Col. 12.

Na ogół stężenie związku (związków) o wzorze (I) w ciekłej kompozycji, takiej jako płyn, będzie wynosiło od około 0,1-25% wagowych, korzystnie od około 0,5-10% wagowych. Stężenie w kompozycji półstałej lub stałej, takiej jak żel lub proszek, będzie wynosiło około 0,1-5% wagowych, korzystnie około 0,5-2,5% wagowych.

Ilość związku lub jego aktywnej soli lub pochodnej wymagana do zastosowania w leczeniu będzie się zmieniać nie tylko zależnie od konkretnej wybranej soli, lecz także od sposobu podawania, własności leczonego stanu i wieku oraz stanu pacjenta, i ostatecznie będzie ją ustalał lekarz prowadzący lub klinicysta.

Jednakże, odpowiednia dawka będzie na ogół w zakresie od około 0,5 do około 100 ąg/kg, np. od około 10 do około 75 ąg/kg masy ciała na dzień, jak 3 do około 50 ąg na kilogram masy ciała biorcy na dzień, korzystnie w zakresie 6 do 90 ąg/kg/dzień, najkorzystniej w zakresie 15 do 60 ąg/kg/ dzień.

Związek dogodnie podaje się w jednostkowej postaci dawkowania; np. zawierającej 5 do 1000 ąg, dogodnie 10 do 750 ąg, najdogodniej 50 do 500 ąg aktywnego składnika na jednostkową postać dawkowania.

Idealnie, aktywny składnik powinno się podawać do osiągnięcia szczytowego stężenia aktywnego związku w osoczu wynoszącego od około 0,1 do około 10 nM, korzystnie, około 0,2 do 10 nM, najkorzystniej, około 0,5 do około 5 nM. Można to osiągnąć np. przez dożylną iniekcję 0,05 do 5% roztworu aktywnego składnika, ewentualnie w soli fizjologicznej, lub przez podawanie doustne dużej pigułki zawierającej około 1-100 ąg aktywnego składnika. Pożądane poziomy we krwi można utrzymywać metodą ciągłego wlewu, uzyskując około 0,01-5,0 ąg/kg/godz. lub metodą przerywanych wlewów zawierających około 0,4-15 ąg/kg aktywnego składnika (składników).

Pożądana dawka może dogodnie występować jako dawka pojedyncza lub jako dawki podzielone podawane w odpowiednich przedziałach czasu, np. jako dwie, trzy, cztery lub więcej mniejszych dawek na dzień. Tę mniejszą dawkę można dalej podzielić, np. na pewną liczbę oddzielnych rozmieszczonych w luźnych odstępach podań leku; takich jak liczne inhalacje z insuflatora lub przez zastosowanie wielu kropli do oka. Np. pożądane jest stosowanie niniejszych kompozycji dożylnie w długim okresie czasu po urazie wywołującym zapalenie.

Zdolność danego związku według wynalazku do działania jako agonista (lub antagonista) receptora A2A adenozyny można określić stosując modele farmakologiczne, które są dobrze znane w tej dziedzinie, lub stosując opisane niżej testy.

Poniżej wynalazek opisano na zasadzie odwołania do poniższych szczegółowych przykładów, które podano jedynie dla ilustracji wynalazku, a nie ograniczenia jego zakresu.

P r z y k ł a d 1

Trans-(1-[4-hydroksymetylo)cykloheksylo]metylo)-4-metylo-benzenosulfonian (5.2)

Wodorek sodu (1,68 g, 70 mmoli) dodano do roztworu 10 g (70 mmoli) [4-(hydroksymetylo)cykloheksylo]metan-1-olu (5.1) w 700 ml tetrahydrofuranu i mieszano przez 1 godzinę, następnie dodano chlorek p-toluenosulfonylu (13,3 g, 70 mmoli) i mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 5 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 0°C i reakcję powoli zatrzymano wodą aż do zaniku reaktywnego wodorku. Gdy obecności wodorku już dłużej nie stwierdzano, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono eterem (700 ml) i ekstrahowano 2 razy 10% wodnym roztworem węglanu potasu (700 ml). Części organiczne osuszono stosując siarczan sodu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, eluując mieszaniną aceton:dichlorometan (5:95), uzyskując związek 5.2 (35%). ¹H NMR (300 MHz, CDCfe) δ 7,75(d, J=8,3Hz, 2H), 7,32(d, J=8,1Hz, 2H), 3,79(d, J=6,35Hz, 2H), 3,39(d, ,7=6,35Hz, 2H), 2,42(s, 3H), 1,75(m, 4H), 1 59 (m, 1H), 1,37 (m, 1H), 0,9(m, 4H). ⁵C NMR (300 MHz, CDCla) δ 145,3, 133,4, 130,3, 130,3, 128,3, 128,3, 75,8, 68,5,

40,6, 37,8, 28,9, 28,9, 28,9, 28,9, 22,1.

P r z y k ł a d 2 (4-prop-2-ynylocykloheksylo)metan-1 -ol (5.3)

PL 199 953 B1

Kompleks acetylenku litu z etylenodiaminą (90%) (6,4 g, 70 mmoli) dodano bardzo powoli do roztworu związku 5.2 (3 g, 10 mmoli) w 40 ml sulfotlenku dimetylu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 5 dni, a następnie reakcję powoli zatrzymano w temperaturze 0°C wodą. Tę mieszaninę rozcieńczono eterem (300 ml) i ekstrahowano 3 razy nasyconym wodnym roztworem chlorku amonu (200 ml). Części organiczne osuszono siarczanem sodu. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, eluując mieszanm^ą octón e^ty|utóe^ksan^y (²⁰^⁰) uz^ys^kuj^ąc zw^iąze^{k 5}.³ (8⁵%). ¹H N^MR (^{300 M}Hz^, CDCh) δ 3,41(d, J=6,5 Hz, 2H), 2,07(dd, J=2,5, 6,5 Hz, 2H), 1,96-1,75(m, 5H), 1,41(m, 2H),095(m, 4). ⁵C NMR (300 MHz, CDCI3) δ 83,8, 69,6, 68,9, 40,7, 37,7, 32,3, 32,3, 29,6, 29,6, 26,5.

P r z y k ł a d 3

Kwas 4-prop-2-ynylocykloheksanokarboksylowy (5.4)

Roztwór tritlenku chromu (1,1 g, 11 mmoli) w 1,5M roztworze kwasu siarkowego (40 ml, 27 mmoli) utrzymywano w temperaturze 0°C podczas dodawania związku 5,3 (0,46 g, 3 mmole) w 80 ml acetonu, przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną następnie mieszano przez dodatkowe 2 godziny w temperaturze pokojowej, rozcieńczono eterem (200 ml) i ekstrahowano 2 razy wodą. Części organiczne osuszono siarczanem sodu. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, eluując mieszaniną aceton : dicMorometón (⁷⁰ : ³⁰) uz^ys^kuj^ąc zw^iąze^{k 5,4} (⁷⁵%). ¹IH ^NMR (³⁰⁰ IM^ c^dc|3) ^{δ 2,24}(^dL ^J=^3,66,

12.1 Hz, 1H), 2,10(dd, J=2,7, 6,5 Hz, 2H), 2,04-1,89(m, 5H), 1,76(d, J=2,3 Hz, 1H) , 1,43(dq, J=3,28,

13.1 Hz, 2H), 1,03(dq, J=3,28, 13,1 Hz, 2H). 1³C NMR (300 MHz, CDCI3) δ 183,2, 83,3, 69,9, 43,4,

36,7, 31,8, 28,9, 26,3.

P r z y k ł a d 4

4-prop-2-ynyIocykIoheksanokarboksyIan metylu (5.5)

Roztwór (trimetylosililo)diazometanu (2,0M) w heksanach (1 ml, 2 mmole) dodano do roztworu związku 5.4 (0,34 g, 2 mmole) w 15 ml mieszaniny metanol:dichlorometan (3:7). Rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując w efekcie 100% konwersję substancji wyjściowej w produkt. ¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 2,24(dt, J=3,66, 12,1 Hz, 1H), 2,10(dd, J=2,7, 6,5 Hz, 2H), 2,06(dd, J=1,54, 6,54 Hz, 1H), 2,00-1,89 (m, 3H), 1,76(d, J=2, 3 Hz, 1H), 1,43(dq, 7 = 3,28, 13,1 Hz, 2H), 1,03(dq, J=3,28, 13,1 Hz, 2H). 1³C NMR (300 MHz, CDCI3) δ 176,8, 83,3, 69,8, 51,9, 43,4, 36,7, 31,9, 29,2, 26,3.

P r z y k ł a d 5

Octan [(2R, 3R, 4R, 5R)-3,4-diacetyIoksy-5-(2-amino-6-hydroksypuryn-9-yIo)oksoIan-2-yIo]metyIu (6.2)

Zawiesinę 113 g (0,4 mola) suchej guanozyny (6.1), bezwodnika octowego (240 ml, 2,5 mola), suchej pirydyny (120 ml) i suchego DMF (320 ml) ogrzewano przez 3,75 godziny w temperaturze 75°C, nie przekraczając temperatury 80°C. Następnie klarowny roztwór przeniesiono do kolby Erlenmyera o pojemności 3 I, wypełnionej 2-propanoIem. Po oziębieniu roztworu do temperatury pokojowej zapoczątkowano krystalizację i mieszaninę pozostawiono w temperaturze 4°C przez noc. Białe ciało stałe przesączono, przemyto 2-propanoIem i krystalizowano z 2-propanoIu, uzyskując związek 6.2 (96%). ¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 8,20(s, 1H, H-8), 6,17(d, J=5,41 Hz, 1H, H-1') 5,75(t, J=5,39 Hz, 1H, H-2'), 5^,56 (t, J=5A H^-3') 4,41(m, 3H, H^-4\ 5') 2,14(s, 3H, Ac) ^, 2,11(s, 3H, Ac) ^, 2,10(s, 3H, Ac) . ¹³C NMR (300 MHz, CDCI3) δ 171,0, 170,3, 1702, 157,7, 154,8, 152,4, 136,7, 117,7, 85,5, 80,4, 73,0, 71,3, 64,0, 31,3, 21,2, 21,0.

P r z y k ł a d 6

Octan [(2R, 3R, 4R, 5R)-3,4-diacetyIoksy-5-(2-amino-6-chIoropuryn-9-yIo)oksoIan-2-yIo]metyIu (6.3)

W kolbie o pojemności 1000 ml umieszczono 80 g (0,195 mola) octanu [(2R, 3R, 4R, 5R)-3,4-diacetyIoksy-5-(2-amino-6-hydroksypuryn-9-yIo)oksoIan-2-yIo]metyIu (6.2), chlorek tetrametyloamoniowy (44 g, 0,4 mola), bezwodny acetonitryl (400 ml) i N-N-dimetyloanilinę (25 ml). Kolbę umieszczono w łaźni lód/sól i ochłodzono do temperatury 2°C. Do tego roztworu dodano kroplami POCI3 (107 ml 1,15 mola) z taką szybkością, aby utrzymać temperaturę poniżej 5°C (45 minut). Następnie kolbę usunięto z łaźni lodowej, zaopatrzono w skraplacz, umieszczono w łaźni olejowej i pozostawiono w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 10 minut, podczas których roztwór zmienił zabarwienie na czerwono-brunatne. Następnie rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując oleistą pozostałość, którą przeniesiono do zlewki zawierającej 1000 g lodu i 400 ml CHCI3, i pozostawiono z mieszaniem przez 1,5 godziny w celu rozłożenia całego pozostałego POCI3. Następnie fazę organiczną usunięto i fazę wodną ekstrahowano 3 x 50 ml CHCI3 i połączono z fazą organiczną. Następnie połączone fazy organiczne ekstrahowano ponownie 50 ml wody, a następnie zmieszano z 200 ml

PL 199 953 B1 nasyconego roztworu NaHCO3. Części organiczne ekstrahowano następnie roztworem NaHCO3 aż do zobojętnienia wodnego ekstraktu (2x). Na koniec części organiczne ekstrahowano solanką i następnie suszono nad MgSO₄ przez 16 godzin. Do roztworu dodano 800 ml 2-propanolu, po czym roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Do oleistego ciała stałego dodano 200 ml 2-propanolu i roztwór chłodzono przez noc. Krystaliczny produkt przesączono, przemyto i pozostawiono do wysuszenia ^przez no^ uz^ys^kuj^ąc zw^iąze^{k 6}.³ (77%). ¹IH ^NMR (³⁰⁰ CDOD) δ 8,31(s, 1H, ^H-⁸) 7,00(s, ²H NH2) 6,06(d, J=5,8 Hz, 1H, H-1'), 5,83 (t, J=6,16 Hz, 1H, H-2'), 5,67(m, 1H, H-3'), 4,29 (m, 3H, H-4', 5'), 2,07(s, 3H, Ac), 1,99(s, 3H, Ac), 1,98(s, 3H, Ac). ⁵C NMR (300 MHz, CD3OD) δ 171,0, 170,4, 170,2, 160,8, 154,6, 150,8, 142,2, 124,5, 85,8, 80,6, 72,8, 71,2, 63,9, 21,4, 21,3, 21,1.

P r z y k ł a d 7

Octan [(2R, 3R, 4R, 5R)-3,4-diacetyloksy-5-(6-chloro-2-jodopuryn-9-ylo)oksolan-2-ylo]metylu (6.4)

Azotyn izoamylu (5 ml, 37 mmoli) dodano do mieszaniny 5,12 g (12 mmoli) octanu [(2R, 3R, 4R, 5R)-3,4-diacetyloksy-5-(2-amino-6-chloropuryn-9-ylo)oksolan-2-ylo]metylu (6.3), I2 (3,04 g, 12 mmoli), CH2I2 (10 ml, 124 mmole) i Cul (2,4 g, 12,6 mmola) w THF (60 ml). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 45 minut, a następnie pozostawiono do ochłodzenia do temperatury pokojowej. Do tego roztworu dodano 100 ml nasyconego roztworu Na2SO3, który usunął czerwonawe zabarwienie powodowane przez jod. Części wodne ekstrahowano 3x chloroformem, części chloroformowe połączono, osuszono nad MgSO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie produkt oczyszczono w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym, stosując mieszaninę CHCh: MeOH (98:2), zbierając octan [(2R,3R,4R,5R)-3,4-diacetyloksy-5-(6-chloro-2-jodo-puryn-9-^ylo)o^kso^lan-²-^ylo]me^tylu (⁶.·4) (⁸⁰%^{, k}r^ys^taNzowan^y z E^tOH). ¹IH ^NMR (^{300 C}D^C|3 ^{δ 8,20} (s, ^1H

H-8), 6,17(d, J=5,41 Hz, 1H, H-1'), 5,75(t, J=5,39 Hz, 1H, H-2'), 5,56(t, J=5,40 Hz, 1H, H-3'), 4,38(m, 3H, H-4', 5'), 2,14(s, 1H, Ac), 2,11(s, 1H, Ac), 2,10(s, 1H, Ac).

P r z y k ł a d 8 (4S, 2R, 3R, 5R)-2-(6-amino-2-jodopuryn-9-ylo)-5-(hydroksymetylo)oksolano-3,4-diol (6.5)

Do kolby zawierającej 6,0 g (11,1 mmola) octanu [(2R, 3R, 4R, 5R)-3,4-diacetyloksy-5-(6-chloro-2-jodopuryn-9-ylo)oksolan-2-ylo]metylu (6.4) dodano 100 ml ciekłego NH3 w temperaturze -78°C i roztwór mieszano przez 6 godzin. Po tym czasie mieszaninę pozostawiono do uzyskania temperatury pokojowej przez noc z równoczesnym odparowaniem NH3, uzyskując brunatny olej. Produkt krystalizowano z gorącego izopropanolu, uzyskując związek 6.5 (80%), temperatura topnienia 143-145°C, r. f. =0,6 w 20% MeOH/CHCl3. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,24(s, 1H) , 7,68(s, 2H) , 5,75(d, J=6,16, 5,42(d, J=5,40 Hz, 1H), 5,16(d, J=4,62 Hz, 4,99(t, J=5,39 Hz, 1H), 4,67(d, J=4,81 Hz, 1H), 4,06(d, J=3,37 Hz, 1H), 3,89(m, 1H), 3,54(m, 2H).

P r z y k ł a d 9

[(1R, 2R, 4R, 5R)-4-(6-amino-2-jodopuryn-9-ylo)-7-7-dimetylo-3, 6, 8-trioksabicyklo[3.3.0] okt-2-ylo]metan-1-ol (6.6)

Do roztworu 2,0 g (5,08 mmola) (4S, 2R, 3R, 5R)-2-(6-amino-2-jodopuryn-9-ylo)-5(hydroksyletylo) oksolano-3,4-diolu (6.6) w 100 ml acetonu dodano 9,6 g kwasu p-toluenosulfonowego i 5 ml dimetoksypropanu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a po tym czasie dodano 15 g NaHCO3 i następnie mieszano przez dodatkowe 3 godziny, pozostałość przesączono i przemyto 2x EtAc. Następnie przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość poddano chromatografii w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym, stosując MeOH:CHCh (1:99), uzyskując związek 6.6 (72%) w postaci ciała stałego, temperatura topnienia 185-187°C. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8, 22 (s, 1H, H-8), 7,69 (s, 2H), NH2), 6,00(d, J=2,70 Hz, 1H, H-l'), 5,21(m, 1H, H-2'), 5,07 (szeroki s, 1H, OH), 4,88(m, 1H, H-3'), 4,13(m, 1H, H-4'), 3, 47 (m, 2H, H-5'), 1,49 i 1,28(s, 3H, C(CH3)2).

P r z y k ł a d 10

Kwas (2S, 1R, 4R, 5R)-4-(6-amino-2-jodopuryn-9-ylo)-7,7-dimetylo-3,6,8-trioksabicyklo[3.3.0]-oktano-2-karboksylowy (6.7)

Do mieszanego roztworu 1,6 g (3,7 mmola) [(1R, 2R, 4R, 5R)-4-(6-amino-2-jodopuryn-9-ylo)-77-dimetylo-3,6,8-trioksabicyklo [3. 3. 0] okt-2-ylo]metan-1-olu (6.6) w 200 ml H2O dodano 0,60 g KOH i wkroplono roztwór 1,70 g (10,8 mmola) KMnO4 w 50 ml H2O. Mieszaninę odstawiono w ciemne miejsce, w temperaturze pokojowej, na 225 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 5-10°C i odbarwiono z zastosowaniem 4 ml 30% roztworu H2O2 w 16 ml wody, podczas gdy temperaturę utrzymywano poniżej 10°C, stosując łaźnię lód-sól. Mieszaninę przesączono przez celit i przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do około 10 ml, a następnie zakwaszono do wartości

PL 199 953 B1 pH 4, stosując 2N roztwór HCl. Uzyskany osad odsączono i przemyto eterem, uzyskując związek 6,7 (70%), po osuszeniu w postaci białego ciała stałego, temperatura topnienia 187-190°C. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,11 (s, 1H, H-8), 7,62(s, 2H, NH2), 7,46(s, 1H, COOH), 6,22(s, 1H, H-1'), 5,42(d, J=5,71 Hz, 1H, H-2') , 5,34(d, J=6,16 Hz, 1H, H-3'), 4,63(s, 1H, H-4'), 1,46 i 1,30(s, 3H, C(CR3)2).

P r z y k ł a d 11

Kwas (2S, 3S, 4R, 5R)-5-(6-amino-2-jodopuryn-9-ylo)-3,4-dihydroksyoksolano-2-karboksylowy (6.8)

Roztwór 1,72 g (3,85 mmola) kwasu (2S, 1R, 4R, 5R)-4-(6-amino-2-jodopuryn-9-ylo)-7,7-dimetylo-3,6,8-trioksabicyklo-[3.3.0]oktano-2-karboksylowego (6.7) w 80 ml 50% roztworu HCOOH mieszano w temperaturze 80°C przez 1,5 godziny. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszczono w H2O i roztwór zatężono ponownie. Ten proces powtarzano aż do zaniku zapachu kwasu mrówkowego w pozostałości. Krystalizacja z wody dała 1,33 g (85%) związku 6.8 w postaci białego ciała stałego, temperatura topnienia 221-223°C, rozkład; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,31 (s, 1H, H-8), 7,68(s, 2H, NH2), 5,90(d, J=6,55 Hz, 1H, H-1'), 4,42(m, 1H, H-2'), 4,35(d, J=2,31 Hz, 1H.H-4'), 4,22(m, 1H, H-3').

P r z y k ł a d 12

[(2S, 3S, 4R, 5R)-5-(6-amino-2-jodopuryn-9-ylo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-N-etylokarboksyamid (6.9)

Do ochłodzonego (5°C) i mieszanego roztworu 1,29 g (3,17 mmola) kwasu (2S, 3S, 4R, 5R)-5-(6-amino-2-jodopuryn-9-ylo)-3,4-dihydroksyoksolano-2-karboksylowego (6.8) w 150 ml absolutnego etanolu dodano kroplami 1,15 ml oziębionego lodem SOCh. Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, a następnie wartość pH uregulowano do 8 nasyconym wodnym roztworem NaHCO3. Mieszaninę przesączono, a następnie przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując białe ciało stałe, które osuszono, po czym ponownie rozpuszczano w 20 ml suchej etyloaminy w temperaturze -20°C przez 3 godziny, a następnie w temperaturze pokojowej przez noc. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono absolutnym etanolem i wytracony produkt odsączono i przemyto suchym eterem, uzyskując 530 mg (72%) związku 6.9 w postaci czystego ciała stałego, temperatura topnienia 232-234°C. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,34(s, 1H, H-8), 8,12(t, 1H, NH), 7,73(s, 2H, NH2), 5,85, (d, J=6,93 Hz, 1H, H-1'), 4,54 (m, 1H, H-2'), 4,25(d, J=1,92 Hz, 1H, H-4'), 4,13 (m, 1H, H-3'), 3,28(m, 2H, CH2CH3), 1,00(t, J=7,2 Hz, 3H, CH2CH3).

P r z y k ł a d 13

4-(3-{9-[(4S, 5S, 2R, 3R)-5-(N-etylokarbamoilo)-3,4-dihydro-ksyoksolan-2-ylo]-6-aminopuryn-2-ylo)}prop-2-ynylo)cykloheksanokarboksylan metylu (DWH-146e)

Do odgazowanego roztworu 25 mg (0,063 mmola) [(2S, 3S, 4R, 5R)-5-(6-amino-2-jodopuryn-9-ylo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-N-etylokarboksyamidu (6.9), 16,9 mg (0,094 mmola) związku (5.5) i 0,75 mg Cul w 5 ml każdego z trietyloaminy (tEA) i acetonitrylu dodano 15 mg Pd(PPh3)4. Roztwór mieszano przez 24 godziny w temperaturze 70°C, a po tym czasie roztwór przesączono przez celit i poddano chromatografii na żelu krzemionkowym stosując MeOH:CHCh (5:95), uzyskując związek DWH-146e (24%).

P r z y k ł a d 14

Octan (4-prop-2-ynylocykloheksylo)metylu (5.6)

Bezwodnik octowy (0,92 ml, 8,25 mmola) i pirydynę (0,2 ml, 2,5 mmola) dodano do roztworu związku 5.3 (250 mg, 1,65 mmola) w 25 ml eteru. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia przez 24 godziny. Do mieszaniny reakcyjnej dodano wodę i warstwę organiczną ekstrahowano następnie 10% NaHCO3. Warstwę organiczną osuszono nad MgSO4 i zatężono. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym stosując EtOAc:heksany (5:95), uzyskując związek 5.6 (47%).

P r z y k ł a d 15

Octan [4-(3-{9-(4S,5S,2R,3R)-5-(N-etylokarbamoilo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-6-aminopuryn-2-ylo}prop-2-ynylo)cykloheksylo]metylu (JMR193)

Do odgazowanego roztworu 125 mg (0,29 mmola) [(2S, 35, 4R, 5R)-5-(6-amino-2-jodopuryn-9-ylo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-N-etylokarboksyamidu (6.9), 150 mg (0,77 mmola) związku (5.6) i 1,0 mg Cul w 1,3 ml TEA i 4 ml DMF dodano 25 mg Pd(PPh3)4. Roztwór mieszano przez 72 godziny w temperaturze 60°C, a po tym czasie roztwór przesączono przez celit i poddano chromatografii na żelu krzemionkowym, z zastosowaniem MeOH:CHCh (5:95), uzyskując związek JMR193 (10%).

P r z y k ł a d 16

[(2S, 3S, 4R, 5R)-5-(6-amino-2-{3-[4-(hydroksymetylo)-cykloheksylo]prop-2-ynylo}puryn-9-ylo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-N-etylokarboksyamid

PL 199 953 B1

A. (4-prop-2-ynylocykloheksylo)metan-1-ol

Kompleks acetylenku litu z etylenodiaminą (90%) (6,4 g, 70 mmoli) dodano bardzo powoli do roztworu 4-metylobenzenosulfonianu trans-[4-(hydroksymetylo)cykloheksylo]metylu (3 g, 10 mmoli) w 40 ml sulfotlenku dimetylu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 5 dni i następnie reakcję powoli zatrzymano w temperaturze 0°C wodą. Tę mieszaninę rozcieńczono eterem (300 ml) i przemyto 3 razy nasyconym, wodnym roztworem chlorku amonu (200 ml). Części organiczne osuszono siarczanem sodu. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, eluując mieszaniną octan etylu: heksany (20:80), uzyskując produkt (85%). ¹H NMR (300 MHz, CDCh) δ 3,41(d, J=6,5 Hz, 2H), 2,07(dd, J=2, 5, 6,5 Hz, 2H), 1,96-1,75(m, 5H), 1,41(m, 2H), 0,095(m, 4). ⁿC NMR (300 MHz, CDCh) δ 83,8, 69,6, 68,9, 40,7,

37,7, 32,3, 312,3, 29,6, 29,6, 26,5.

B. [(2S, 3S, 4R, 5R)-5-(6-amino-2-{3-[4-(hydroksymetylo))Cykloheksylo]-prop-1-ynylo}puryn-9-ylo)-3,4-dihydroksyoks°lan-2-ylo]-N-etylokarboksyamid (JMR2037) mg Pd(PPh3)4 dodano do odgazowanego roztworu 28 mg (0,065 mmola) [(2S, 3S, 4R, 5R)-5-(6-amino-2-jodopuryn-9-ylo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-N-etylokarboksyamidu, 30 mg (0,20 mmola) (4-prop-2-ynylocykloheksylo)metan-1-olu i 1,0 mg Cul w 1 ml trietyloaminy (tEA), 1 ml DMF i 1 ml acetonitrylu. Roztwór mieszano przez 60 godzin w temperaturze pokojowej, a po tym czasie roztwór przesączono przez celit i poddano chromatografii na żelu krzemionkowym stosując MeOH:CHCl3 (7:93), uzyskując 5 mg (17%) związku JMR2037. Tytułowy związek zbadano stosując tu ujawnione testy wiązania i stwierdzono, że przyłącza się on do rekombinowanych ludzkich receptorów A2A Ki 694 ± 69 nM.

P r z y k ł a d 17

Badania wiązania radioliganda

Wiązanie do receptorów A2A oszacowano z zastosowaniem radioliganda 1²⁵I-ZM241385. Fig. 2B przedstawia współzawodnictwo selektywnych agonistów do wiązania do rekombinowanych ludzkich receptorów adenozyny A2A. Związek DWH-146e jest silnie selektywny wobec rekombinowanego ludzkiego receptora podtypu A2A (hA2A). Selektywność wobec receptora A3 (nie pokazano) jest mniej znacząca, ale wciąż wynosi około 50 razy. Związek DWH-146e jest odpowiednio około 5 i 50 razy silniejszy od związków WRC0470 i CGS21680, (Fig. 1). Nieoczekiwanie stwierdzono, że co interesujące ester związku DWH-146e także jest około 50 razy silniejszy od kwasowej formy związku DWH-146e (Fig. 1).

P r z y k ł a d 17A

Wpływ DWH-146e i JMR193 na aktywność utleniającą neutrofili

A. Materiały.

f-met-leu-phe (fMLP), luminol, dyzmutazę ponadtlenkową, cytochrom C, fibrynogen, dezaminazę adenozyny i błękit trypanowy otrzymano z firmy Sigma Chemical. Ficoll-hypaque zakupiono od firm ICN (Aurora, OH) i Cardinal Scientific (Santa Fe, NM) i Accurate Chemicals and Scientific (Westerbury, NY). Endotoksyna (lipopolisacharyd; E. coli K235) pochodziła z firmy List Biologicals (Campbell, CA). Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) i zestaw testowy lizatu limulus amebocyte pochodziły z firmy BioWittaker (Walkersville, MD). Albumina osocza ludzkiego (HSA) pochodziła z firmy Cutter Biological (Elkhart, IN). Rekombinacyjny ludzki czynnik martwicy guza alfa dostarczono z firmy Dianippon Pharmaceutical Co. Ltd. (Osaka, Japonia). Związek ZM241385 (4-(2-[7-amino-2-(2-furylo)-[1,2,4]triazolo[2,3-a][1,3,5]triazyn-5-yloamino]etylo)-fenol) otrzymano od Simona Pouchera, Zeneca Pharmaceuticals, Cheshire, UK. Roztwory podstawowe (1 mM i 10 mM w DMSO) wytworzono i przechowywano w temperaturze -20°C.

B. Przygotowanie neutrofili ludzkich

Oczyszczone neutrofile (~98% neutrofili i >95% zdolnych do życia, co oceniono metodą wyłączania błękitem trypanowym) zawierające <1 płytek krwi na 5 neutrofili i < 50 pg/ml endotoksyny (test lizatu limulus amebocyte) otrzymano z normalnej heparynizowanej (10 U/ml) krwi żylnej metodą jednoetapowej procedury rozdzielania Ficoll-hypaque (A. Ferrante i in., J. Immunol. Meth., 36, 109 (1980)).

C. Uwalniania zapalnych reaktywnych związków tlenowych z wzbudzonych i stymulowanych ludzkich neutrofili chemiluminescencyjnych

Chemiluminescencja wzmagana przez luminol, miara aktywności utleniającej neutrofili, jest zależna od zarówno produkcji ponadtlenku jak i mobilizacji ziarnistości lizosomalnych enzymu mieloperoksydazy. Światło jest emitowane z nietrwałych wysokoenergetycznych związków tlenowych wytwarzanych przez aktywowane neutrofile. Oczyszczone neutrofile (5-10 x 10⁵/ml) inkubowano w zrównoważonym roztworze soli Hanksa zawierającym 0,1% albuminy osocza ludzkiego (1 ml) z lub bez DWH-146a, DWH146e, CGS21680 lub JMR193, z lub bez rolipramu i z lub bez czynnika martwicy guza alfa (1 U/ml)

PL 199 953 B1 przez 30 minut w temperaturze 37°C we wstrząsanej łaźni wodnej. Następnie wzmaganą przez luminol (1 x 10⁴ M), stymulowaną przez f-met-leu-phe (1 mcM) chemiluminescencję odczytywano przy użyciu Chronolog® Fotometer (Crono-log Corp., Havertown, PA), w temperaturze 37°C, przez 2-4 minut. Chemiluminescencję opisano jako względną szczytową wartość wyemitowanego światła (= wysokość krzywej) w porównaniu z próbkami z czynnikiem martwicy guza alfa i bez DWH, JMR lub rolipramu.

D. Wyniki

Jak pokazano w fig. 2, zarówno JMR193 jak i DWH-146e obniżały zapoczątkowaną przez czynnik martwicy guza alfa, stymulowaną przez f-met-leu-phe aktywność utleniającą ludzkich neutrofili, co zmierzono metodą wzmaganej przez luminol chemiluminescencji, skuteczniej niż agonista CGS21680 receptora A2A adenozyny. Pozioma oś przedstawia stężenie CGS21680, DWH-146e, DWH-146e lub JMR193 (log nM). Pionowa oś przedstawia uzyskaną szczytową aktywność ludzkich neutrofili jako względną wielkość stymulowanego uwalniania reaktywnych związków tlenowych, zmierzoną wzmaganą przez luminol chemiluminescencją w porównaniu z próbkami kontrolnymi, które nie były wzbudzone czynnikiem martwicy guza alfa. Średnie SEM (n = 4-5 oddzielnych doświadczeń).

Dane poniżej osi poziomej w fig. 2 przedstawiają EC50 zmniejszania aktywności ludzkich neutrofili (w oparciu o dane w fig. 2). Średnie SEM (n = 4-5 oddzielnych doświadczeń), *p < 0,05, IC50 obniżone w porównaniu z CGS21680.

JMR193 i DWH-146e obniżały gwałtownie utleniające działanie stymulowanych neutrofili z wartościami EC50 poniżej 1 nM (odpowiednio 0,8 i 0,3 nM). W przeciwieństwie, wolne formy kwasowe agonistów receptora adenozyny A2A DWH-146a i CGS21680 nie były tak skuteczne w hamowaniu gwałtownie utleniającego działania (odpowiednio 53 i 9 nM; fig. 2). Hamowanie przez DWH-146e gwałtownie utleniającego działania stymulowanych neutrofili antagonizował selektywny antagonista AR A2A, ZM241385.

Jak pokazano w fig. 3, JMR193 (1 nM) z rolipramem (100 nM) synergistycznie obniżał stymulowane uwalnianie reaktywnych związków tlenowych. Ludzkie neutrofile wzbudzono czynnikiem martwicy guza alfa (1 U/ml) i stymulowano f-met-leu-phe (1 μΜ). Pionowa oś przedstawia procentowe hamowanie aktywności utleniającej, co zmierzono metodą chemiluminescencji wzmaganej przez luminol. Średnie SEM (n = 4 oddzielne doświadczenia), *p < 0,05, synergia pomiędzy JMR193 i rolipramem w porównaniu z aktywnością addycyjną.

Jak pokazano w fig. 4, wysoce selektywny antagonista receptora A2A adenozyny ZM241385 (100 nM) (ZM) przeciwdziałał aktywności utleniającej ludzkich neutrofili hamowanej przez JMR193 (10 nM), co zmierzono metodą chemiluminescencji wzmaganej przez luminol. Średnie SEM z 4 oddzielnych doświadczeń, *p = 0,0004, ZM241385 przeciwdziałał hamowanej przez JMR193 aktywności utleniającej.

E. [cAMP] neutrofili ludzkich i przyleganie neutrofili do powierzchni biologicznej

24-studzienkową płytkę do hodowli tkankowej pokryto ludzkim fibrynogenem (5 mg/ml w 1,5% wodorowęglanie sodu; 0,5 ml/studzienkę; Sigma Chemical), pozostawiono przez noc w temperaturze 37°C, w 5% CO2. Neutrofile (3-4 x 10^s/0,5 ml/próbkę) inkubowano w studzience pokrytej płytki przez 45 minut w 0,5 ml HBSS zawierającym 0,1% HSA i ADA (1 U/ml), w obecności i braku rekombinacyjnego ludzkiego TNFa (10 U/ml), DWH-146e (3-300 nM), rolipramu (300 nM) i/lub ZM241385 (100 nM). Po inkubacji, do studzienek dodano 0,5 ml HCl (0,2 N) i inkubowano przez kolejne 45 minut w temperaturze pokojowej aby wyekstrahować cAMP. Próbki następnie odwirowano w wirówce przez 2 minuty w celu usunięcia resztek komórek. 0,5 ml próbki zamrożono do analizy cAMP (B. Brooker i in., Science, 194, 270 (1976)). Studzienki przemyto dwukrotnie normalną solanką i pozostałą warstwę trawiono 0,2 ml 0,2N NaOH zawierającego SDS, przez 2 godziny, w temperaturze pokojowej. Następnie próbki białka zamrożono (-70°C) dla późniejszej analizy białka w celu określenia względnego przylegania PMN (K. P. Stowell i in. , Anal. Biochem, 85, 572(1978)).

Wyniki

DWH-146e (30-300 nM) sam i synergistycznie z rolipramem (300 nM) zwiększał zawartość cAMP neutrofili ludzkich i synergistycznie z rolipramem obniżał przyleganie neutrofili do powierzchni pokrytej fibrynogenem (fig. 5). Wpływom DWH-146e (300 nM) + rolipram (300 nM) na produkcję cAMP neutrofili i przyleganie przeciwdziałał selektywny antagonista receptora A2A adenozyny, ZM241385 (ZM; 100 nM). Średnia SEM z 5 oddzielnych doświadczeń, *p < 0,05, zwiększony [cAMP] neutrofili w porównaniu do braku DWH-146e; **p < 0,05, obniżone przyleganie neutrofili w porównaniu do braku DWH-146e.

PL 199 953 B1

F. Aktywność utleniająca przylegających neutrofili ludzkich

Metody. Stosując metody zmodyfikowane z paragrafu E, neutrofile (2 x 10⁶/ml) rozdzielone na Ficoll-Hypaque inkubowano 15 minut, w temperaturze 37°C, w 0,45 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa zawierającego 0,1% albuminy osocza ludzkiego i dezaminazę adenozyny (1 U/ml), rolipram (300 nM) i DWH-146e (3-300 nM). Po inkubacji dodano cytochrom C (120 μΜ) i katalazę (0,062 mg/ml), w obecności i przy braku rekombinacyjnego ludzkiego czynnika martwicy guza alfa (1U/ml) i 200 μl próbki zawiesiny komórkowej przeniesiono bezpośrednio do podwójnych studzienek 96-studzienkowej płaskodennej płytki do hodowli tkankowej, którą pokryto przez noc ludzkim fibrynogenem. Gęstość optyczną próbek odczytano przy długości fali 550 nm wobec zestawionych próbek ponadtlenku dyzmutazy (200 U/ml).

G. Wyniki

Jak pokazano w fig. 6, hamowanie uwalniania ponadtlenku z przylegających neutrofili ludzkich stymulowanego przez czynnik martwicy guza alfa (TNF) na powierzchni pokrytej fibrynogenem przeprowadzono z zastosowaniem rolipramu (300 nM) i DWH-146e. DWH-146e obniżał gwałtownie utleniające działanie przylegających neutrofili i synergistycznie obniżał gwałtownie utleniające działanie w obecności rolipramu, który sam z siebie nie wpływał na aktywność utleniającą neutrofili. Oś pozioma przedstawia DWH-146e stężenie w nM, a oś pionowa przedstawia ilość ponadtlenku uwalnianego przez neutrofile, co zmierzono metodą redukcji cytochromu C. Występowała znaczna synergia z DWH-146e i inhibitorem PDE typu IV, rolipramem, do zmniejszania stymulowanej przez czynnik martwicy guza alfa aktywności utleniającej przylegających neutrofili ludzkich. Średnie SEM powtórzeń z 4-5 oddzielnych doświadczeń, *p < 0,05, obniżone uwalnianie ponadtlenku w porównaniu do braku DWH-146e; **p < 0,05, obniżone uwalnianie ponadtlenku w porównaniu z obecnością rolipramu i bez DWH-146e.

P r z y k ł a d 18

Leczenie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (I/R) w nerce przy użyciu DWH-146e

W celu określenia, czy wywołana przez DWH-146e aktywacja receptora A2A adenozyny zmniejsza poziom kreatyniny osoczowej w 24 i 48 godzin po uszkodzeniu I/R u szczurów czy też nie, nerki szczura poddano 45-minutowemu niedokrwieniu i 24- lub 48-godzinnej reperfuzji. DWH-146e (0,004 μg/kg/minutę) lub rozczynnik podawano w sposób ciągły przez minipompę rozpoczynając 5 godzin przed I/R. Jak pokazano w fig. 7, DWH-146e znacznie obniżał poziom kreatyniny osoczowej u 7/7 szczurów (P < 0,05) i u 6/6 szczurów leczonych DWH-146e (P < 0,001), odpowiednio w 24 i 48 godzin.

W celu określenia, czy we wpływie DWH-146e na redukcję kreatyniny osoczowatej u szczurów poddanych działaniu I/R pośredniczy receptor A2A czy też nie, nerki szczura poddano 45-minutowemu niedokrwieniu, a następnie 48-godzinnej reperfuzji. DWH-146e (0,004 μg/kg/minutę) podawano w sposób ciągły poprzez minipompę rozpoczynając 5 godzin przed niedokrwieniem. Jak pokazano w fig. 8, poprawa funkcji nerki została odwrócona przez antagonistę A2a ZM-241385 (0,003 μg/kg/minutę - równomolowe tempo dostarczania w porównaniu z DWH-146e) (*p < 0,001 dla rozczynnika wobec DWH; **p < 0,05 DWH wobec DWH/ZM, n = 5 dla rozczynnika, DW; n =6 dla DWH/ZM. ANOVA, a następnie korekcja typu Bonferroni).

DWH-146e, w stężeniach, które nie mają efektów hemodynamicznych, zapobiega obrzękowi nerek, martwicy i gromadzeniu się krwinek czerwonych w rdzeniu wewnętrznym.

Zabezpieczenie przeciw uszkodzeniu nerek, jakie dał DWH-146e (0,01 μg/kg/minutę s.c. przez 48 godzin) skorelowano z ogromnym hamowaniem przylegania neutrofili do śródbłonka naczyń. Uważa się, że hamowanie prze DWH-146e wzajemnego oddziaływania pomiędzy neutrofilami i śródbłonkiem naczyń jest odpowiedzialne, co najmniej częściowo, za zabezpieczenie przeciw uszkodzeniu nerek.

W celu określenia, czy aktywacja A2A-AR zmniejsza ilość neutrofili w zewnętrznym rdzeniu u szczurów poddanych działaniu I/R czy też nie, z zastosowaniem Neurolucida®, obejrzano nerkę pod 100 x mag i wydzielono całą nerkę. PMN obliczono oglądając przekroje nerki pod 250 x mag. Na przekroje nerki nałożono ramy optyczne widzialne pod mikroskopem i wszystkie PMN obliczono w zakresie każdej ramy. Ten system zapobiega liczeniu PMN więcej niż raz. Jak pokazano w fig. 9, gęstość neutrofili wynosiła 15,65/mm² dla rozczynnika i 3,02/mm² dla leczenia DWH-146e.

P r z y k ł a d 19

Wpływ DWH-146e na reperfuzyjne uszkodzenie płuc

A. Metody. Zastosowano model wydzielonego, poddanego perfuzji pełną krwią, przewentylowanego płuca królika. Od królików-dawców pobrano płuco po iniekcji PGE1 do tętnicy płucnej i spłukaniu roztworem konserwującym Euro-Collins, i płuca zabezpieczono na 18 godzin w temperaturze 4°C. Płuca grupy I (n=9) służyły jako kontrolne. Płuca grupy II (n=9) poddano reperfuzji pełną krwią, którą naj18

PL 199 953 B1 pierw przepuszczono przez filtr usuwający leukocyty. W grupie III (n=9), DWH-146e dodano do reperfuzatu krwi (25 pg/kg) bezpośrednio przed reperfuzją i podawano przez okres reperfuzji (1 pg/kg/minutę). Wszystkie płuca były poddane reperfuzji przez 30 minut, a rejestrowano ciśnienie w tętnicy płucnej (PAP), opór naczyń płucnych (PVR), podatność dróg oddechowych (CPL) i nasycenie krwi tętniczej tlenem. Aktywność mikloperoksydazy (MPO) rejestrowano aby ocenić ilościowo sekwestrację neutrofili i zmierzono stosunki wagowe mokry/suchy w celu wykazania obrzęku płuc.

B. Wyniki. Nasycenie krwi tętniczej tlenem w grupie II i grupie III było znacznie większe niż w grupie I po 30 minutach reperfuzji (514,27 ± 35,80 i 461,12 ±43,77 wobec 91,41 ± 20,58 mm Hg; p<0,001. Jak pokazano w fig. 10, płuca grupy III przedstawiały postępujące zaangażowanie w pO2 poprzez reperfuzję. Wykorzystanie leukocytów w płucach grupy II poprawiało nasycenie krwi tętniczej tlenem we wczesnej reperfuzji. *p = 0,004 (grupa II w zależności od grupy I i III); **p < 0,001 (grupy II i III w zależności od grupy I).

Jak pokazano w fig. 11, średnia PVR w grupie II była znacznie zmniejszona w porównaniu z płucami kontrolowanymi (*p < 0,001). PVR płuc grupy III było znacznie niższe niż nawet tych płuc, które poddano reperfuzji krwią, ubogą w leukocyty (**p < 0,001 w zależności od grupy I i II). Opór naczyń płucnych znacznie się zmniejszył w grupie III (22, 783 ± 357 dyn*s*cm⁵) w porównaniu z zarówno ^gru^{pą II} ja^{k i g}ru^{pą I} (^{31, 057} ± ^{1743 i 36, 911} ±^{2173 dy}n*s*cm^{5, p} < ^0,001Ł ^Po^datoo^{ść d}ró^g oddechowych była lepsza w grupach II i III w porównaniu z grupą I (1,68 ± 0,08 i 1,68 ± 0,05 wobec 1,36 ± 0,13, p = 0,03). Przepuszczalność drobnych naczyń w grupie III zmniejszyła się do 106,82 ± 17,09 w porównaniu z 165,70 ± 21,83 ng niebieski barwnik Evans/gm tkanka w grupie I (p=0,05). Jak pokazano w fig. 12, aktywność mieloperoksydazy w grupie III była znacznie niższa niż w grupie I (*p = 0,03). MPO = mieloperoksydaza. Aktywność mieloperoksydazy w grupie III wynosiła 39,88 ± 4,87 w porównaniu z 88,70 ± 18,69 AOD/gm/minutę w grupie I (p = 0,03) i w grupie II aktywność mieloperoksydazy wynosiła 56,06 ± 7,46.

C. Wnioski. DWH-146e zmniejszał sekwestrację neutrofili w płucach i ogromnie poprawiał funkcjonowanie przeszczepu płucnego. Neutrofile są ważnymi składnikami zapalnej kaskady uszkodzenia reperfuzyjnego i ich źródło może obejmować zarówno krążącą krew jak i sam przeszczep płuca. Selektywna aktywacja adenozyny-A2A przerywa odpowiedź zapalną, w której pośredniczą neutrofile i zmniejsza uszkodzenie reperfuzyjne płuca po transplantacji.

W mikroskopie świetlnym, kontrola płuca w grupie I wykazała poważny naciek leukocytów i powstawanie obrzęku w przestrzeniach pęcherzykowych po 18 godzinach przechowywania w stanie niedokrwienia i 30 minutach reperfuzji. W grupie II, płuca które poddano reperfuzji krwią ubogą w leukocyty i płuca grupy III (które otrzymywały DWH-146e podczas reperfuzji, ten naciek był dużo mniejszy.

P r z y k ł a d 20

Wpływ DWH-146e na powstawanie nowej błony wewnętrznej po uszkodzeniu tętnicy

Aktywacja leukocytów z uwalnianiem cytokin zapalnych występuje po przezskórnej interwencji wieńcowej i może odgrywać rolę w restenozie. U myszy, silne powstawanie nowej błony wewnętrznej w obecności nienaruszonego wyściółki śródbłonkowej występuje po podwiązaniu tętnicy szyjnej wspólnej. Stosując ten model, myszy C57/BL6 dobrano losowo w czasie podwiązania tętnicy szyjnej do 7-dniowego wlewu DWH-146e, (n=7), lub rozczynnika (n=8) przez pompę osmotyczną.

W 14 dni po podwiązanie tętnicy szyjnej, histomorfometria wykazała znaczącą redukcję pownerzctirn nowej ^błon^y wewn^ętrznej (^0,005 ± ^0,004 mm² wo^bec ^0,021 ± ^0,014 mm^{2, p} = ^⁰¹) ⁱ stosunku nowej błony wewnętrznej do powierzchni przyśrodkowej (0,13 ± 0,07 wobec 0,64 ± 0,44, p = 0,01) u leczonych zwierząt w porównaniu z kontrolnymi. Powierzchnia przyśrodkowa była podobna w dwóch grupach (0,034 + 0,007 mm2 wobec 0,036 ± 0,009 iW, p = 0,81). Ta korzyść w postaci ograniczania wzrostu nowej błony wewnętrznej utrzymywała się do 28 dni. Fig. 13 podsumowuje efekt DWH-146e hamowania wzrostu nowej błony wewnętrznej w modelu mysim LCCA. Te doświadczenia wykazują, że w modelu podwiązania mysiej tętnicy szyjnej, przedłużona stymulacja A2A (7 dni) DWH-146e prowadzi do znaczącego zmniejszenia powstawania nowej błony wewnętrznej przez co najmniej 21 dni, prawdopodobnie poprzez jego wpływ na aktywację i działanie leukocytów.

P r z y k ł a d 21

Hamowanie uwalniania TNFa ludzkich monocytów stymulowanego przez endotoksynę

A. Materiały

Ficoll-hypaque zakupiono z firmy ICN (Aurora, OH) i Cardinal Scientific (Santa Fe, NM), i Accurate Chemicals and Scientific (Westerbury, NY). Endotoksyna (lipopolisacharyd; E. coli 0111B4) pochodziła z firmy List Biologicals (Campbell, CA). Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) i zestaw

PL 199 953 B1 testowy lizatu limulus amebocyte pochodziły z firmy BioWittaker (Walkersville, MD). Albumina osocza ludzkiego (HSA) pochodziła z firmy Cutter Biological (Elkhart, IN). ZM241385 (4-(2-[7-amino-2-(2-furylo)[1,2,4]triazolo[2,3-a][1,3,5]triazyn-5-yloamino]etylo)fenol) otrzymano od Simona Pouchera, Zeneca Pharmaceuticals, Cheshire, UK. Roztwory podstawowe (1 mM i 10 mM w DMSO) wytworzono i przechowywano w temperaturze -20°C.

B. Produkcja TNFa metodą oczyszczania ludzkich przylegających monocytów

Metody: Warstwę bogatą w monocyty (> 65% monocytów) wytworzono metodą inkubowania 1 ml frakcji jednojądrowych leukocytów (5 x 10⁵/ml) z rozdzielania Ficoll-Hypaque (A. Fenante i in., J. Immunol. Meth., 36, 109 (1980)) w studzienkach 24-studzienkowej płytki do hodowli tkankowej (1 godz.; 37°C; 5% CO2). Nieprzylegające leukocyty usunięto przez mycie i do studzienek zawierających przylegające komórki jednojądrowe dodano ośrodek hodowlany (1 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa, zawierającego 0,1% albuminy osocza ludzkiego, dezaminazę adenozyny [5 U/ml] i 1% osocza autologicznego inaktywowanego ciepłem). Następnie dodano w tej kolejności (1) endotoksynę (100 ng/ml) i selektywnego antagonistę A2A AR, ZM241385 (100 nM), i (2) selektywnych agonistów receptora A2A adenozyny JMR193 (1-1000 nM), DWH146e (1-1000 nM) i CGS21680 (10-1000 nM). Próbki następnie inkubowano przez 4 godziny (37°C; 5% CO2) i zebrano supernatanty. Wszystkie zawieszone komórki usunięto metodą odwirowania i próbki bez komórek zamrożono (-70°C). TNFa oceniano w supernatantach bez komórek (n=6) stosując zestaw ELISA (Coulter/Immunotech, Miami, FL).

C. Wyniki

Jak pokazano w fig. 10, 14, agoniści receptora A2A adenozyny obniżali produkcję TNFa przylegających monocytów stymulowaną przez endotoksynę. Selektywny antagonista A2A AR, ZM241385 (100 nM), antagonizował wpływy JMR193 na produkcję TNFa (Fig. 15).

Zatem, DWH146e i JMR193 zmniejszają stymulowaną przez endotoksynę LPS produkcję TNFa przez ludzkie monocyty mechanizmem, który jest zależny od wiązania agonisty do receptorów adenozyny A2A.

P r z y k ł a d 22

Aktywność DWH-146e w modelu zapalenia otrzewnej u myszy.

Wstępne doświadczenia z doświadczalnym zapaleniem otrzewnej obejmowały iniekcję zymosanu (Zym) jako silnego bodźca zapalenia (Y. Zhang i in., Eur. J. Pharmacol, 313, 237 (1996)). Jak pokazano w fig. 16, po iniekcji zymosanu, średnie stężenie leukocytów jak określono w hemocytometrze neubauera wynosiło 7,325 ± 1,893/mm³. Dootrzewnowa iniekcja DWH-146e w dawce 2,5 ąg/kg godzinę przed zymosanem hamowała rozwój zapalenia otrzewnej ze średnim ± SEM stężeniem leukocytów 2,012 ± 374/mm3 6 godzin później (p < 0,05). Zatem, te badania wykazują, że A2A AR jest pomocny w pośredniczeniu w przechodzeniu PMN do otrzewnej po prowokacji zymosanem.

P r z y k ł a d 23

Kardioprotekcja, w której pośredniczy przeciwzapalny efekt JMR193

Związki według wynalazku testowano metodą indukowania blokowania mięśnia sercowego, formy uszkodzenia serca, które występuje po powtarzających się, przejściowych okresach przerywanego wieńcowego przepływu krwi, przez wielokrotne zamykanie zaopatrzenia tętnicy wieńcowej w krew.

A. Efekt czterech cykli zamknięcia-reperfuzji

Lewą przednią zstępującą (LAD) tętnicę wieńcową w grupie psów wydzielono i otoczono zwierzakiem pętlowym. Dopływ krwi do tętnicy LAD psów zamykano 4-krotnie, na 5 minut. Po każdym zamknięciu przepływ krwi przywracano na dziesięć minut. Grupie sześciu psów podawano we wlewie roztwór zawierający związek octanu (JMR193), wytworzony w przykładzie 15 (JMR193), (0,01 ąg/kg/minutę) po każdym okresie zamknięcia. Innej grupie sześciu psów podano we wlewie roztwór zawierający rozczynnik (nośnik). Po ostatnim cyklu zamknięcia-reperfuzji czynność serca zwierząt monitorowano przez 3 godziny.

Wyniki zilustrowano w fig. 17 i 18. Fig. 17 wskazuje skurczową odpowiedź w postaci pogrubienia lewej komory (LV) u 6 psów kontrolnych. Pogrubienie serca zmniejszyło się o w przybliżeniu 50% 3 godziny po ostatnim zamknięciu. Fig. 18 wskazuje odpowiedź w postaci pogrubienia LV u 6 psów które otrzymywały wlew dożylny związku testowego, JMR193 (0,01 ąg/kg/minutę), rozpoczęty podczas okresu zerowego i kontynuowany przez czas doświadczenia. Czynność serca, przy wlewie JMR193, powróciła prawie do normalnej już 90 minut po reperfuzji.

B. Efekt dziesięciu cykli zamknięcia-reperfuzji

Dwie dodatkowe grupy psów poddano dziesięciu (raczej niż 4) cyklom zamknięcia-reperfuzji, gdzie każde zamknięcie trwało 5 minut, z włączonymi 5-minutowymi okresami reperfuzji. W tym przy20

PL 199 953 B1 kładzie, dwóm zwierzętom podawano we wlewie roztwór zawierający związek octanowy (JMR193), wytworzony w przykładzie 15 (0,01 pg/kg/minutę), po każdym okresie zamknięcia. Innym trzem zwierzętom podano we wlewie roztwór zawierający rozczynnik (nośnik). Po ostatnim cyklu zamknięciareperfuzji czynność serca zwierząt monitorowano przez 3 godziny.

Wyniki zilustrowano w fig. 19 i 20. Fig. 19 wskazuje skurczową odpowiedź w postaci pogrubienia lewej komory (LV) u 3 psów kontrolnych. Był to poważniejszy uraz serca, niż w przykładzie 23A, i w wyniku pogrubienie LV nie wystąpiło po reperfuzji i pozostawała ona akinetyczna przez 3 godziny. Fig. 20 wskazuje pogrubienie LV u 2 psów, które otrzymywały wlew dożylny związku testowego, JMR193 (0,01 pg/kg/minutę) rozpoczęty podczas okresu zerowego i kontynuowany przez czas doświadczenia. W porównaniu z grupą kontrolną, psy które otrzymywały wlew JMR193 wykazały istotną i znaczną poprawę czynności serca bezpośrednio po reperfuzji, która utrzymywała się przez 3 godziny.

C. Wpływ związku octanowego JMR193 na wychwyt neutrofili podczas zamknięcia-reperfuzji

Pewnym zwierzętom podawano znakowane radiologicznie neutrofile. (Neutrofile wydzielono z krwi psa, inkubowano ze związkiem zawierającym ^99mTc, i ponownie wstrzyknięto psom.) Znakowane ^99mTc neutrofile podawano dożylnie jako znacznik w celu określenia poziomu zapalenia w strefie reperfuzji, po czterech cyklach niedokrwienia-reperfuzji. Zapalenie wynikające z cykli zamknięcia-reperfuzji spowodowało przyleganie radioaktywnych neutrofili i było ocenione ilościowo gammakamerą. Przyleganie neutrofili hamował związek JMR193. Wyniki zilustrowano w fig. 21 gdzie lokalizacja znakowanych 99mTc neutrofili u psów leczonych jedynie rozczynnikiem (słupki pełne) jest większa niż u psów leczonych JMR193 (słupki zakreskowane). Zatem, redukcja znakowanych radiologicznie neutrofili w centralnej strefie niedokrwienia spowodowaną wlewem JMR193 ilustruje zmniejszenie (*) zapalenia serca.

Badania opisane w przykładach 23A i 23B wskazują, że zapalenie serca odgrywa znaczącą rolę uszkadzającą w wywoływaniu blokowaniu mięśnia sercowego. Ponadto, podawanie agonisty receptora A2A adenozyny takiego jak np. JMR-193 albo zapobiega łagodnemu blokowaniu (Fig. 17 i 18) lub znacznie osłabia zaburzenie czynności serca towarzyszące poważnemu blokowaniu (Fig. 19 i 20).

Wszystkie publikacje, opisy patentowe i dokumenty patentowe załączono tu na zasadzie odsyłacza, co jest równoznaczne z indywidualnym załączeniem na zasadzie odsyłacza. Wynalazek opisano w odniesieniu do różnych specyficznych i korzystnych rozwiązań i technik. Jednakże, powinno być zrozumiałe, że można poczynić wiele zmian i modyfikacji pozostając w zakresie myśli przewodniej i zakresu według wynalazku.

Claims

Zastrzeżenia patentowe (a) każdy R oznacza niezależnie atom wodoru, C1-C6alkil, C3-C7cykloalkil, fenyl lub fenylo(C_rC3)alkil;

(b) X o^znac^za ^-CH2OH^{, -}CO2R^{2, -}OC⁽O⁾R^{2 -}CH2OC⁽O⁾CH3 fob C⁽O)NR³R^4; (c) każdy spośród R , R i R oznacza niezależnie H, C1-C₆-alkil lub C1-C₆-alkil podstawiony przez 1-3 podstawników wybranych z grupy obejmującej C_rC6-alkoksyl, C1-C₆-alkilotio, atom fluorowca, hydroksyl, amino, mono(C1-C6-alkilo) amino lub di (C1-C6-alkilo) amino;

PL 199 953 B1 (d) Z i Z' oznaczają indywidualnie (C--CC) alkil, ewentualniez wstawionymi 1-3 atomamiS lub nienadtlenkowymi ctzmcmi O, lab ain występują, i a znaczne lizabę --3; lab jngz fcrmcznatyznain dzpbsnznclac sól.
2. Zwiąnek według ncstrn. -, znamienny tym, że 5'-X znacznc -CH2OH lub -C(O)NR³R⁴.
3. Zwiąnek według ncstrn. 2, znamienny tym, że 5'-X znacznc -C(O)NR³R⁴.
4. Zwiąnek według ncstrn. 3, znamienny tym, że r3 znacznc H, c r4 znacznc (C--C4) dkil.
5. Zwiąnek według ncstrn. -, znamienny tym, że kcżdy R znacznc H lub (C--C4) dkil.
6. Zwiąnek według ncstrn. -, znamienny tym, że Z' znacznc -CH2- lub -CH2-CH2-.
7. Zwiąnek według ncstrn. 6, znamienny tym, że Z znacznc -CH2- lub -CH2-CH2-.
8. Zwiąnek według ncstrn. -, znamienny tym, że C3-C-0- zyklzdkil zbejmuje zyklzheksyl lub zyklzpeatyl.
9. ZZiązne weełua zncsz. 8, zznmieeny tym, zżX oznaczn CCrCC alkoOksWarbbnyl, C(O)NN³R⁴lub czetzksymetyl.

-0. Zwiąnek według ncstrn. 8, znamienny tym, że X-Z znacznc HO2C-Z-.

- -. Zziąznnweełua zzcsz. 8 , znnaiieenn tym, żż Χ-Ζ ί ZZs ąw konngubaaji t aaca p rzn Cc-C^zyklzdkilu.

-2. Zwiąnek według ncstrn. -, znamienny tym, że R znacznc H, 5'-X znacznc etylzcmiazkcrbzayl, c (X-Z-)n[(C3-C-₀)-zyklzdkilz]-Z'-C=C- znacznc 2-(4-metzksykcrbzaylzzyklzheksylzmetylz) etyayl lub 2-(4-kcrbzksyzyklzheksylzmetylz)etyayl.

-3. Zwiąnek według nastra. -, znamienny tym, że R znacznc H, 5'-X znacznc etylzcmiazkcrbzayl, c (X-Z-)n[(C3-C-₀)-zyklzdkilz]-Z'-C=C- znacznc 2-(4-czetzksymetylzzyklzheksylzmetylz) etyayl.

-4. Zwiąnek według ncstrn. -, znamienny tym, że jest mm zztca [4-(3-{9-(2R, 3R, 4S, 5S)-5-(N-etylzkcrbcmzilz)-3,4-dihydrzksyzkszlca-2-ylz]-6-cmiazpurya-2-ylz}przp-2-yaylz)zyklzheksylz]metylu lub jegz fcrmczeutyznaie dopusnzndna sól.

-5. Zwiąnek według ncstrn. -, znamienny tym, że jest mm [(2S, 3S, 4R, 5R)-5-(6-cmiaz-2-{3[4-(hydroksymetylo)zyklpheksylo]prΌp---ynylo}purwn-9-ylo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-N-etylokarboksycmid lub jegz fcrmczeutyznaie dopusnzndna sól.

-6. Zwiąnek według ncstrn. -, znamienny tym, że jest mm 4-(3-{9-[(2R, 3R, 4S, 5S)-5-(N-etylokarbamoilo)-3,4-dihydrΌksyoksolan-2-ylo]-6-aminopurwn-2-ylo)}prop---ynylo)zykloheksanokarboksylca metylu lub jegz fcrmczeutyznaie dopusnzndna sól .

-7. Zwiąnek według nastra. -, znamienny tym, że jest mm kwcs 4-(3-{9-[(2R, 3R, 4S, 5S)-5-(N-etylzkcrbcmzilz)-3,4-dihydrzksyzkszlca-2-ylz]-6-cmiazpurya-2-ylz)}przp---yaylz)zyklzhekscazkcrbzksylzwy lub jegz fcrmczeutyznaie dopusnzndna sól.

-8. Kzmpznyzjc fcrmczeutyznac, znamienna tym, że ncwierc nwiąnek zkreślzay w ncstrn. wran n fcrmczeutyznaie dopusnzndnym azśaikiem.

-9. Kzmpznyzjc według ncstrn. -8, znamienna tym, że w nwiąnku zkreślzaym w ncstrn. -, 5'-X ^-CH₂OH lub - C(O)NR³R⁴.

20. Kzmpznyzjc według ncstrn. -8, znamienna tym, że w nwiąnku zkreślzaym w ncstrn. -, 5'-X znacznc - ^c(°)^nr3r4.

2-. Kzmpznyzjc według ncstrn. 20, znamienna tym, że w nwiąnku zkreślzaym w ncstrn. w ^kt^ór^ym ⁵'-^X znacznc -^c(°)^{nr3r4, r3} znacznc H, c ^r4 znacznc (^C--^C4)c^lkil.

22. Kzmpznyzjc według ncstrn. - 8, znamienna tym, że w nwiąnku zkreślzaym w ncstrn. -, kcżdy R znacznc H lub (C--C4)dkil.

23. Kzmpznyzjc według ncstrn. -8, znamienna tym, że w nwiąnku zkreślzaym w ncstrn. -, Z' znacznc -CH2- lub -CH2-CH2-.

24. Kzmpznyzjc według ncstrn. -8, znamienna tym, że w nwiąnku zkreślzaym w ncstrn. -, Z znacznc -CH2- lub -CH2-CH2-.

25. Kzmpznyzjc według nastra. -8, znamienna tym, że w nwiąnku zkreślzaym w ncstrn. -, C3-C-0 zyklzdkil zbejmuje zyklzheksyl lub zyklzpeatyl.

26. Kzmpznyzjc według nastra. 25, znamienna tym, że w nwiąnku zkreślzaym w ncstrn. - w którym zyklzdkil C3-C-0 zbejmuje zyklzheksyl lub zyklzpeatyl, X znacznc (C-^^lkzksykcrbzayl lub acntoksymetyl.

27. Kzmpznyzjc według ncstrn. 25, znamienna tym, że w nwiąnku zkreślzaym w ncstrn. -, w którym C3-C-0 zyklzdkil zbejmuje zyklzheksyl lub zyklzpeatyl, X-Z znacznc H°2C-Z-.

28. Kzmpznyzjc według ncstrn. 25, znamienna tym, że w nwiąnku zkreślzaym w ncstrn. -, w którym C3-C-0-zyklzdkil zbejmuje zyklzheksyl lub zyklzpeatyl, X-Z i Z' są w kzafigurczji traas prny C3-C-0-zyklzalkilu.

PL 199 953 B1

29. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że w związku określonym w zastrz. 1, R oznacza H, X oznacza etyloaminokarbonyl, a (X-Z-)..[(C_:,-C-0-cykloalkil]-Z'-C C- oznacza 2-(4-metoksykarbonylocykloheksylometylo)etynyl lub 2-(4-karboksycykloheksylometylo)etynyl.

30. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że w związku określonym w zastrz. 1, R oznacza H, X oznacza etyloaminokarbonyl, a (X-Z-)n[(C3-C1o)-cykloalkil]-Z'-C=C- oznacza 2-(4-acetoksymetylocykloheksylometylo)etynyl.

31. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że związkiem określonym w zastrz. 1 jest octan [4-(3-{9-(2R, 3R, 4S, 5S)-5-(N-etylokarbamoilo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-6-aminopuryn-2-ylo}prop-1-ynylo)cykloheksylo]metylu.

32. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że związkiem określonym w zastrz. 1 jest [(2S, 3S, 4R, 5R)-5-(6-amino-2-{3-[4-(hydroksymetylo)cykloheksylo]prop-1-ynylo}puryn-9-ylo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-N-etylokarboksyamid.

33. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że związkiem określonym w zastrz. 1 jest 4-(3-{9-[(2R, 3R, 4S, 5S)-5-(N-etylokarbamoilo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-6-aminopuryn-2-ylo)}prop-1-ynylo)cykloheksanokarboksylan metylu.

34. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że związkiem określonym w zastrz. 1 jest kwas 4-(3-{9-[(2R, 3R, 4S, 5S)-5-(N-etylokarbamoilo)-3,4-dihydroksyoksolan-2-ylo]-6-aminopuryn-2-ylo)}prop-1-ynylo)cykloheksanokarboksylowy.

35. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że zawiera dodatkowo rolipram.

36. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1-17 do sporządzania leku przydatnego do leczenia odpowiedzi zapalnej.

36, znamienne tym , że odpowiedź zapalna jest wynikiem że odpowiedź zapalna jest wynikiem że odpowiedź zapalna jest wynikiem

37. Zastosowanie według zastrz choroby niedokrwiennej.

38. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym choroby miażdżycy naczyń.

39. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym choroby autoimmunologicznej.

40. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że odpowiedź zapalna jest spowodowa · na uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym.

41. Zastosowanie z zastrz. 36, znamienne tym, że odpowiedź zapalna występuje w sercu, nerce lub płucu.

42. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że odpowiedź zapalna jest spowodowa· na udarem, urazowym uszkodzeniem mózgu lub uszkodzeniem rdzenia kręgowego.

43. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że odpowiedź zapalna jest spowodowa· na transplantacją organów, tkanek lub komórek.

44. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym że odpowiedź zapalna jest spowodowa19, znamienny tym, że odpowiedź zapalna jest spowodowa36, znamienne tym, że odpowiedź zapalna jest spowodowana zakażeniem.

45. Zastosowanie według zastrz. na chorobą skóry.

46. Zastosowanie według zastrz.

na angioplastyką naczynia, wstawieniem stentu, wstawieniem połączenia omijającego lub szczepieniem.

36, znamienne tym, że odpowiedź zapalna jest spowodowa36, znamienne tym, że odpowiedź zapalna jest spowodowa36, znamienne tym, że odpowiedź zapalna jest spowodowa47. Zastosowanie według zastrz . na chorobą alergiczną.

48. Zastosowanie według zastrz . na chorobą wyniszczającą.

49. Zastosowanie według zastrz . na leczeniem immunosupresyjnym.

50. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że odpowiedź zapalna jest wynikiem patologicznego stanu lub jego objawu u ssaka, gdzie są zaangażowane receptory A2A adenozyny i pożądany jest agonizm takiej aktywności.

51. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że lek zawiera dodatkowo rolipram.

52. Zastosowanie według zastrz. 51, znamienne tym, że lek zawiera ciekły nośnik.

53. Zastosowanie według zastrz. 51, znamienne tym, że lek jest przystosowany do podawania pozajelitowego.