KR20020013494A

KR20020013494A - 염증 반응을 치료하기 위한 조성물

Info

Publication number: KR20020013494A
Application number: KR1020017009640A
Authority: KR
Inventors: 조엘 엠. 린덴; 게일 더블유. 설리반; 이안 제이. 사렘복; 티모시 맥도날드; 마크 오쿠사; 어빙 엘. 크론; 더블유. 마이클 쉘드
Original assignee: 로버트 제이. 데커; 유니버시티 오브 버지니아 페이턴트 파운데이션
Priority date: 1999-02-01
Filing date: 2000-01-31
Publication date: 2002-02-20
Also published as: PT1150991E; CZ296404B6; BR0007864A; CA2361614C; DK1150991T3; CA2361614A1; ES2215609T3; NO321216B1; ATE263777T1; HK1047288A1; AU2745400A; MY129445A; CN1357002A; CZ20012781A3; JP2002536300A; UA72912C2; MXPA01007850A; KR100668006B1; WO2000044763A2; AR029332A1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 A_2a아데노신 수용체 길항제에 의해서 염증 상태를 치료하기 위한 화합물 및 방법을 제공한다.

<화학식 I>

Description

염증 반응을 치료하기 위한 조성물 {Compositions for Treating Inflammatory Response}

본 발명은 미국 정부 기금(NIH Grant ROL HL 37942)의 보조를 받아서 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해서 일정한 권리를 갖는다.

염증 반응은 신체로부터 유해한 성분을 제거하기 위한 목적으로 일어난다. 염증 반응을 개시시킬 수 있는 넓은 범위의 병원성 상해(insult)에는 감염, 알러젠 (allergen), 자가면역자극, 이식된 세포에 대한 면역반응, 유해한 화학물질 및 독소, 허혈/재관류, 저산소증, 기계적 및 열적 외상이 포함된다. 염증은 통상적으로 만출, 희석에 의한 감약화 및 손상성 성분 및 손상된 조직의 분리를 돕는 매우 국재화된 작용이다. 신체의 반응은 이것이 표적 성분을 제거하거나 외상성 상해에 대해 반응하는 과정에서 숙주조직에 부적절한 손상을 야기시키는 경우에는 질병의 원인이 된다.

예를 들어, 염증은 몇가지 혈관성 질환 또는 손상에서 발병과정의 한 요소이다. 그 예에는 다음이 포함된다: 허혈/재관류 손상 (N.G. Frangogiannis 등, inMyocardial Ischemia: Mechanisms, Reperfusion, Protection, M. Karmazyn, ed., Birkhuser Verlag (1996) at 236-284; H.S. Sharma 등,Med. of Inflamm., 6, 175 (1987)), 아테롬성경화증 (R. Ross,Nature, 362, 801 (1993)), 염증성 대동맥류 (N. Girardi 등,Ann. Thor. Surg., 64, 251 (1997); D.I. Walker 등,Brit. J. Surg., 59, 609 (1972); R.L. Pennell 등,J. Vasc. Surg., 2, 859 (1985)) 및 풍선혈관성형술에 이은 재발협착증 (상기 언급한 R. Ross 참조). 염증과 관련된 세포에는 백혈구 (즉, 면역계 세포- 호중구, 호산구, 림프구, 단핵세포, 호염기구, 대식세포, 수상돌기세포 및 비만세포), 혈관내피, 혈관평활근세포, 섬유아세포 및 근세포가 포함된다.

백혈구에 의한 종양괴사인자-알파(TNFα)와 같은 염증성 사이토킨의 방출은 면역계가 감염을 포함한 병원성 침습에 대항하는 수단이다. TNFα는 백혈구 및 내피세포 상에서 부착인자의 발현 및 활성화를 촉진시키며, 이차자극에 대한 증가된 염증 반응에 대해서 호중구를 프라미잉시키고, 부착한 호중구의 산화 활성을 증진시킨다 (상기 언급된 Sharma 등 참조). 또한, 대식세포/수상돌기세포는 림프구에 대해 제시하기 위한 항원을 처리하는 부세포로서 작용한다. 또한 림프구는 다시 자극되어 염증지향성(pro-inflammatory) 세포독성 세포로서 작용하게 된다.

일반적으로, 사이토킨은 호중구를 자극하여 산화적 (예를 들어, 슈퍼옥사이드 및 부산물) 및 비산화적 (예를 들어, 마이엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase) 및 그밖의 다른 효소) 염증성 활성을 증진시킨다. 사이토킨의 부적절하며 과도한 방출은 조직-손상성 산화적 및 비산화적 생성물의 방출을 통해서 역으로 악화되는 병원성 효과를 야기시킬 수 있다 (K.G. Tracey 등,J. Exp. Med., 167, 1211 (1988); 및 D.N. Mannel 등,Rev. Infect. Dis., 9 (suppl. 5), S602-S606 (1987)). 예를 들어, TNFα는 호중구를 유도하여 혈관벽에 부착시킨 다음 혈관을 통해서 손상부위로 이동시키고, 그들의 산화적 및 비산화적 염증성 생성물을 방출시킬 수 있다.

단핵세포는 염증성 병소에 서서히 모여지지만, 바람직한 조건이 주어지면 단핵세포는 장기간 상재하는 부세포 및 대식세포로 진화한다. 염증유발제 (inflammation trigger)에 의한 자극이 있으면, 단핵세포/대식세포는 또한 조직을 개조하고 주위 조직기능을 조절하는 일련의 사이토킨 (TNFα 포함), 보체, 지질, 반응성 산소종, 프로테아제, 및 성장인자를 생산하고 분비한다.

예를 들어, 염증성 사이토킨은 관절염 (C.A. Dinarello,Semin. Immunol., 4, 133, (1992)); 허혈증 (A. Seekamp 등,Agents-Actions-Supp., 41, 137 (1993)); 패혈성 쇼크 (D.N. Mannel 등,Rev. Infect. Dis., 9 (suppl. 5), S602-S606 (1987)); 천식 (N.M. Cembrzynska 등,Am. Rev. Respir. Dis., 147, 291 (1993)); 장기이식 거부반응 (D.K. Imagawa 등,Transplantation, 51, 57 (1991); 다발성 경화증 (H.P. Hartung,Ann. Neurol., 33, 591 (1993)); AIDS (T. Matsuyama 등,AIDS, 5, 1405 (1991)); 및 알칼리-화상을 입은 눈 (F. Miyamoto 등,Opthalmic Res., 30, 168 (1997))에서 병원성인 것으로 나타났다. 또한, 백혈구 내에서의 슈퍼옥사이드 형성은 인간 면역결핍성 바이러스 (HIV)의 복제를 촉진시키는데 관련된다 (S. Legrand-Poels 등,AIDS Res. Hum. Retroviruses, 6, 1389 (1990)).

아데노신 수용체 서브타입을 비선택적으로 활성화시키는 아데노신 및 아데노신의 몇가지 동족체는 염증성 산화성 물질의 호중구 생산을 감소시키는 것으로 잘 알려져 있다 (B.N. Cronstein 등,Ann. N. Y. Acad. Sci., 451, 291 (1985); P.A. Roberts 등,Biochem. J., 227, 669 (1985); D.J. Schrier 등,J. Immunol., 137, 3284 (1986); B.N. Cronstein 등,Clinical Immunol. and Immunopath., 42, 76 (1987); M.A. Iannone 등, inTopics and Perspective in Adenosine Research, E. Gerlach 등, eds., Springer-Verlag, Berlin, p. 286 (1987); S.T. McGarrity 등,J. Leukocyte Biol., 44, 411421 (1988); J. De La Harpe 등,J. Immunol., 143, 596 (1989); S.T. McGarrity 등,J. Immunol., 142, 1986 (1989); 및 C.P. Nielson 등,Br. J. Pharmacol., 97, 882 (1989)). 예를 들어, 아데노신은 세균성 펩타이드의 합성유사체 f-met-leu-phe (fMLP) 및 보체성분 C₅a와 같은 화학주성인자에 의해서 자극된 호중구로부터의 슈퍼옥사이드 방출을 억제하는 것으로 나타났다 (B.N. Cronstein 등,J. Immunol., 135, 1366 (1985)). 아데노신은 우선 TNF-α에 의해서 프라이밍된 다음에 f-met-leu-phe와 같은 이차자극제에 의해서 자극된 PMN (호중구)의 현저하게 증가된 산화적 방출을 감소시킬 수 있다 (G.W. Sullivan 등,Clin. Res., 41, 172A (1993)). 또한, 아데노신은 T-세포주에서 HIV 복제율을 감소시킬 수 있는 것으로 보고되었다 (S. Sipka 등,Acta. Biochem. Biopys. Hung., 23, 75 (1988)). 그러나, 셍체내에서 아데노신이 항염활성을 갖는다는 증거는 없다 (G.S. Firestein 등,Clin. Res., 41, 170A (1993); 및 B.N. Cronstein 등,Clin. Res., 41, 244A (1993)).

호중구 상에는 슈퍼옥사이드 방출에 대하여 상반된 효과를 가질 수 있는 둘 이상의 아데노신 수용체의 서브타입이 있는 것으로 시사되었다 (B.N. Cronstein 등,J. Clin. Invest., 85, 1150 (1990)). 호중구 상에 A_2A수용체가 존재하는 것은 반 칼커 (Van Calker) 등에 의해서 최초로 입증되었다 (D. Van Calker 등,Eur. J. Pharmacology, 206, 285 (1991)).

방사성 리간드 결합시험 및 생리학적 반응을 기초로하여 A_2A아데노신 수용체 (AR)의 작용제(agonist)로서 더욱 더 강력하고/하거나 선택적인 화합물의 점진적인 개발이 이루어져 왔다. 초기에는, A_2A수용체에 대한 선택성이 거의 또는 전혀 없는 아데노신 그 자체, 또는 5'-N-에틸카복스아미도아데노신 (NECA)과 같은 아데노신의 5'-카복스아미드와 같은 화합물이 개발되었다 (B.N. Cronstein 등,J. Immunol., 135, 1366 (1985)). 그후에, 예를 들어 CV1808 및 CGS21680과 같이 2-알킬아미노 치환체가 부가된 것은 효능 및 선택성을 증가시키는 것으로 나타났다 (M.F. Jarvis 등,J. Pharmacol. Exp. Ther., 251, 888 (1989)). WRC-0090과 같은 2-알콕시-치환된 아데노신 유도체는 관상동맥 A_2A수용체에서 작용제로서 더더욱 강력하며 선택적이다 (M. Ueeda 등,J. Med. Chem., 34, 1334 (1991)). 2-알킬히드라지노 아데노신 유도체, 예를 들어 SHA 211 (또한, WRC-0474라고도 불리움)은 또한 관상동맥 A_2A수용체에서의 작용제로서 평가되었다 (K. Niiya 등,J. Med.Chem., 35, 4557 (1992)).

비교적 비특이적인 아데노신 동족체인 R-페닐이소프로필아데노신 (R-PIA) 및 2-클로로아데노신 (Cl-Ado)와 포스포디에스테라제 (PDE) 억제제의 배합물이 호중구 산화활성을 저하시킨다는 보고가 있다 (M.A. Iannone 등,Topics and Perspectives in Adenosine Research, E. Garlach 등, eds., Springer-Verlag, Berlin, pp. 286-298 (1987)). 그러나, R-PIA 및 Cl-Ado 동족체는 실제로 A_2A아데노신 수용체 보다는 A₁아데노신 수용체의 더욱 강력한 활성화제이며, 따라서 심장근육 및 다른 조직 상의 A₁수용체의 활성화에 기인한 부작용을 야기시킴으로써 "심차단(heart block)"과 같은 결과를 유발하는 것 같다.

올슨(R.A. Olsson) 등 (미국 특허 제5,278,150호)은 하기 화학식의 선택적 아데노신 A₂수용체 작용제를 기술하였다:

여기에서, Rib는 리보실이고, R₁은 H일 수 있으며, R₂는 사이클로알킬일 수 있다. 이 화합물은 고혈압, 아테롬성경화증을 치료하고 혈관확장제로서 유용한 것으로 기술되어 있다.

올슨(Olsson) 등 (미국 특허 제5,140,015호)은 하기 화학식의 특정한 아데노신 A₂수용체 작용제를 기술하였다:

여기에서, C(X)BR₂는 CH₂OH일 수 있으며, R₁은 알킬- 또는 알콕시알킬일 수 있다. 이 화합물은 혈관확장제 또는 항고혈압제로서 유용한 것으로 기술되어 있다.

린덴(Linden) 등의 미국 특허 제5,877,180호는 관절염 및 천식과 같은 특정의 염증성 질환이 A_2A아데노신 수용체의 선택적 작용제인 화합물을 바람직하게는 타입 IV 포스포디에스테라제 억제제와의 배합물로 투여함으로써 효과적으로 치료될 수 있다는 발견을 기초로 하였다. 린덴 등의 발명의 구체예는 하기 화학식의 A_2A아데노신 수용체 유효량을 투여함으로써 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다:

여기에서, R 및 X는 특허에 기술한 바와 같다.

바람직한 구체예에서, 린덴 등의 발명은 타입 IV 포스포디에스테라제 (PDE)억제제를 A_2A아데노신 수용체 작용제와의 배합물로 투여하는 것을 포함한다. 타입 IV 포스포디에스테라제 (PDE) 억제제에는 하기 화학식의 라세미성 및 광학적 활성 4-(폴리알콕시페닐)-2-피롤리돈이 포함된다:

상기 식에서, R', R¹⁸, R¹⁹및 X는 미국 특허 제4,193,926호에 개시되고 기술된 바와 같다. 롤리프람은 상기 화학식에 포함되는 적합한 타입 IV PDE 억제제의 예이다.

크리스탈리(G. Cristalli) (미국 특허 제5,593,975호)는 리보사이드 잔기가 카복시아미노 또는 치환된 카복시아미노 (R₃HNC(O)-)에 의해서 치환되는 2-아릴에티닐, 2-사이클로알킬에티닐 또는 2-하이드록시알킬에티닐 유도체를 기술하였다. 2-알키닐퓨린 유도체는 미야사카(Miyasaka) 등 (미국 특허 제4,956,345호)이 기술하였는데, 여기에서는 2-알키닐 그룹이 (C₃-C₁₆)알킬에 의해서 치환된다. '975호 특허의 화합물은 혈관확장제이며, 혈소판응집을 억제하고, 따라서 항허혈제, 항아테롬성경화증제 및 항고혈압제로서 유용한 것으로 기술되어 있다.

그러나, 부작용이 감소되고 치료학적 분야에 유용한 선택적 A₂아데노신 수용체 작용제에 대한 필요성이 지속적으로 존재한다.

발명의 요약

본 발명은 포유류 조직에서 염증성 활성을 치료하기 위한 화합물 및 이러한 치료를 위해서 이 화합물을 사용하는 방법을 포함한다. 염증성 조직활성은 병원성 성분에 기인하는 것일 수 있거나, 물리적, 화학적 또는 열적 외상, 또는 기관, 조직 또는 세포이식, 혈관형성술 (PCTA), 허혈/재관류에 이은 염증, 또는 그래프트와 같은 의료시술에 의한 외상에 기인하는 것일 수 있다. 본 발명의 화합물은 에틴 위치에서 치환된 사이클로알킬 잔기에 의해 치환된 신규한 부류의 2-알키닐아데노신 유도체로 이루어진다. 바람직하게는, 리보사이드 잔기는 5'-위치 ("X")에서 N-알킬-(또는 사이클로알킬)카복시아미노 ("아미노카보닐") 잔기에 의해 치환된다. 따라서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물의 유효량을 투여함으로써 인간환자와 같은 포유류에서 염증성반응을 억제하고 염증 반응으로부터 조직을 보호하는 방법을 제공한다.

본 발명의 화합물은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염이다:

상기 식에서,

(a) 각각의 R은 개별적으로 수소, C₁-C₆알킬, C₃-C₇사이클로알킬, 페닐 또는 페닐(C₁-C₃)-알킬이고;

(b) X는 -CH₂OH, -CO₂R², -OC(O)R²또는 C(O)NR³R⁴이며;

(c) R², R³및 R⁴는 각각 개별적으로 H, C_1-6-알킬; 1-3개의 C_1-6-알콕시, C₃-C₇사이클로알킬, C_1-6-알킬티오, 할로겐, 하이드록시, 아미노, 모노(C_1-6-알킬)아미노, 디(C_1-6-알킬)아미노 또는 C_6-10-아릴 (여기에서 아릴은 1-3개의 할로겐, C_1-6-알킬, 하이드록시, 아미노, 모노(C_1-6-알킬)아미노 또는 디(C_1-6-알킬)아미노에 의해서 치환될 수 있음)에 의해서 치환된 C_1-6-알킬; C_6-10-아릴; 또는 1-3개의 할로겐, 하이드록시, 아미노, 모노(C_1-6-알킬)아미노, 디(C_1-6-알킬)아미노 또는 C_1-6-알킬에 의해서 치환된 C_6-10-아릴이고;

(d) R¹은 (X-(Z)-)_n[(C₃-C₁₀)사이클로알킬]-(Z')-이며, 여기에서 Z 및 Z'는 개별적으로 1-3개의 S 또는 비퍼옥사이드 O가 임의로 개재된 (C₁-C₆)알킬이거나 존재하지 않으며, n은 1 내지 3이다.

본 발명은 의약적 치료법에서 사용하기 위한, 바람직하게는 염증 반응과 같은 염증을 치료하거나 염증으로부터 조직을 보호하기 위해서 사용하기 위한 화학식I의 화합물, 및 인간과 같은 포유류에서 염증과 관련된 병리학적 상태 또는 증상에 기인한 염증 반응을 치료하는 약제를 제조하기 위한 화학식 I의 화합물의 용도를 제공한다.

특정의 A_2A아데노신 수용체 작용제가 혈관확장제이며, 따라서 고혈압, 혈전증, 아테롬성경화증 등을 직접적으로 치료하는데 유용한 것으로 보고되어 있지만, 화학식 I의 화합물의 조직-보호활성은 선행기술에서 시사되지 않았다.

본 발명은 또한, 면역세포의 염증 반응을 상승적으로 감소시키기 위해서 타입 IV 포스포디에스테라제 억제제와 이들 화합물의 배합물을 사용하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한, 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와의 배합물로, 및 임의로 타입 IV 포스포디에스테라제 (PDE) 억제제와의 배합물로 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 조성물은 단위용량형으로 존재한다.

또한, 본 발명은 A_2A아데노신 수용체의 활성이 관련되며, 이 활성의 아고니즘(agonism)이 요구되는 병리학적 상태 또는 증상을 예방하거나 치료하기 위한 치료법을 필요로하는 포유류에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 투여함을 특징으로하여 인간과 같은 포유류에서 상기한 병리학적 상태 또는 증상을 예방 또는 치료하는 치료학적 방법을 제공한다. A_2A아데노신 수용체의 활성화는 호중구, 비만세포, 단핵세포/대식세포, T-세포 및/또는 호산구에영향을 미침으로써 염증을 억제하는 것으로 믿어진다. 이들 염증성 세포의 억제에 의해 조직 상해 이후에 조직보호가 유도된다.

화학식 I의 화합물을 임의로 타입 IV PDE 억제제와 함께 사용하여 치료될 수 있는 (예방적으로 치료되는 것 포함) 염증 반응에는 (a) 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 자궁내막증으로 인한 불임증, 당뇨병을 유발하는 췌장도의 파괴 및 다리궤양을 포함한 당뇨병의 염증성 결과를 포함하는 타입 I 진성당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 장질환, 골다공증 및 류마티스성 관절염과 같은 자가면역 자극 (자가면역질환); (b) 천식, 고초열, 비염, 춘계결막염 및 그밖의 다른 호산구-매개 상태와 같은 앨러지성 질환; (c) 건선, 접촉피부염, 습진, 감염성 피부궤양, 개방창, 봉와직염과 같은 피부 질환; (d) 패혈증, 패혈성 쇼크, 뇌염, 감염성 관절염, 엔도톡신 쇼크, 그람음성 쇼크, 야리쉬-헤륵스하이머 (Jarisch-Herxheimer) 반응, 대상포진, 독성 쇼크, 뇌성말라리아, 세균성 수막염, 급성 호흡장애증후군 (ARDS), 라임병, HIV 감염, (TNFα-증가된 HIV 복제, 역전사효소 억제제 활성의 TNFα 억제); (e) 소모성 질병; 암 및 HIV에 대해 이차적인 악액질; (f) 이식거부반응을 포함한 기관, 조직 또는 세포이식 (예를 들어, 골수, 각막, 신장, 폐, 간, 심장, 피부, 췌장도) 및 이식편대숙주 질환; (g) 암포테리신 B 치료로 인한 부작용, 면역억제 요법, 예를 들어 인터류킨-2 치료로 인한 부작용, OKT3 치료로 인한 부작용, GM-CSF 치료로 인한 부작용, 사이클로스포린 치료의 부작용 및 아미노글리코사이드 치료의 부작용을 포함하는 약물요법으로 인한 부작용, 면역억제로 인한 구내염 및 점막염; (h) 허혈증, 아테롬성경화증, 말초혈관질환, 혈관형성술로 인한 재발협착증, 염증성 대동맥류, 맥관염, 졸중, 척수손상, 울혈성 심부전증, 출혈성 쇼크, 허혈/재관류 손상, 지주막하 출혈로 인한 혈관경련, 뇌혈관발작으로 인한 혈관경련, 흉막염, 심막염, 및 당뇨병의 심혈관계 합병증과 같이 염증 반응에 의해서 유도되고 악화되는 순환기계 질환을 포함한 심혈관계 상태; (i) 복막투석으로 인한 심막염을 포함하는 투석; (j) 통풍; 및 (k) 화상, 산, 알칼리 등으로 인한 화학적 또는 열적 외상에 기인한 염증이 있다.

이들 중에서 특히 관심의 대상이 되는 효능은 기관, 조직 또는 세포이식, 즉 동종이계 또는 이종발생성 조직의 포유류 수용동물에 대한 이식에 기인한 염증 반응, 자가면역질환, 및 순환기계 병변 및 혈관형성술, 스텐트 설치, 내단락(shunt) 설치 또는 그래프트를 포함한 그의 치료에 기인한 염증성 상태를 치료하기 위해서 본 발명의 화합물의 사용하는 것이다. 놀랍게도, 하나 또는 그 이상의 화학식 I의 화합물의 투여는 염증 반응의 발현 후, 예를 들어 개체가 염증 반응을 개시시키는 병변 또는 외상을 입은 후에 효과적인 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 또한, 수용체에 결합시키기에 유효한 양의 화학식 I의 화합물을 사용하여 생체내 또는 시험관내에서 A_2A아데노신 수용체를 포함하는 지정된 A_2A아데노신 수용체 부위에서 반응을 측정하거나, 상기의 수용체에 화학식 I의 화합물을 결합시키는 방법을 포함한다. 리간드 결합 수용체 부위를 함유하는 조직 또는 세포가 특이적 수용체 서브타입에 대한 시험 화합물의 선택성, 혈액 또는 그밖의 다른 생리학적 액체 내의 생물활성 화합물의 양을 측정하기 위해서 사용될 수 있거나, 치료제를 리간드-수용체 컴플렉스와 접촉시키고 리간드의 치환 및/또는 치료제의 결합의 정도 또는 이 치료제에 대한 세포성 반응 (예를 들어, cAMP 축적)을 측정함으로써 수용체 부위 활성화와 연관된 질병 또는 상태의 치료를 위한 잠재적 치료제를 확인하기 위한 도구로서 사용될 수 있다.

본 발명은 염증성 활성에 기인한 조직손상을 예방하는 방법 및 예방하기 위한 조성물에 관한 것이다.

달리 기술되지 않은 한은 다음과 같은 정의가 사용된다. 할로는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도이다. 알킬, 알콕시, 아르알킬, 알킬아릴 등은 직쇄 및 측쇄 알킬그룹 둘다를 의미하지만, "프로필"과 같이 개별적인 라디칼을 언급하는 것은 단지 직쇄 라디칼만을 포함하는 것이며, "이소프로필"과 같은 측쇄 이성체는 구체적으로 언급한다. 아릴은 페닐 라디칼, 또는 적어도 하나의 환은 방향족이며 약 9개 내지 10개의 환원자를 가지는 오르토-융합된 비사이클릭 카보사이클릭 라디칼을 포함한다. 헤테로아릴은 탄소, 및 비-퍼옥사이드 산소, 황 및 N(X) (여기에서 X는 존재하지 않거나, H, O, (C₁-C₄)알킬, 페닐 또는 벤질이다)로 구성된 그룹으로부터 각각 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 구성된 5 또는 6개의 환원자를 함유하는 모노사이클릭 방향족 환의 환 탄소를 통해서 부착된 라디칼, 및 이들로부터 유도된 약 8개 내지 10개의 환원자를 갖는 오르토-융합된 비사이클릭 헤테로사이클의 라디칼, 특히는 벤즈-유도체 또는 여기에 프로필렌, 트리메틸렌 또는 테트라메틸렌 디라디칼을 융합시킴으로써 유도된 것을 포함한다.

화학식 I의 화합물은 하나 이상의 키랄 중심을 가지며, 광학적 활성형 및 라세미형으로 분리될 수 있다는 것은 당해기술분야에서 숙련된 전문가에 의해 이해될 수 있을 것이다. 바람직하게는, 화학식 I의 리보사이드 부위는 D-리보즈로부터 유도되는데, 즉, 3',4'-하이드록시 그룹은 당(sugar) 환에 대해알파이고, 2' 및 5' 그룹은베타(3R, 4S, 2R, 5S)이다. 사이클로헥실 그룹 상에 두개의 그룹이 4-위치에 존재하는 경우에, 이들은 바람직하게는 트랜스이다. 몇가지 화합물은 다형성을 나타낼 수도 있다. 본 발명은 본 명세서에 기술된 유용한 특성을 갖는 본 발명의 화합물의 라세미체, 광학적 활성형, 다형성 형태 또는 입체이성체 형태 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있는 것으로 이해되며, 여기에서 어떻게 광학적 활성형을 제조하는지 (예를 들어, 재결정화 기술 또는 효소적 기술에 의한 라세미 형태의 분할에 의해서, 광학적 활성 출발물질로부터 합성에 의해서, 키랄성 합성에 의해서, 또는 키랄성 정지상을 사용하는 크로마토그라피 분리에 의해서), 및 본 명세서에 기술된 시험방법 또는 당해기술분야에서 잘 알려져 있는 다른 유사한 시험방법을 사용하여 어떻게 아데노신 작용제 활성을 결정하는지에 대해서는 당해기술분야에서 잘 알려져 있다.

라디칼, 치환체 및 범위에 대하여 이하에서 기술하는 구체적이고 바람직한 의미는 단지 설명을 위한 것이며, 이들은 그밖의 다르게 정의된 의미 및 라디칼 및 치환체에 대해 정의된 범위 내에 있는 다른 의미를 제외시키는 것은 아니다.

구체적으로, (C₁-C₆)알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 펜틸, 3-펜틸 또는 헥실일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로,용어 "사이클로알킬"은 임의로 1-2개의 N, O 또는 S를 함유하는 비사이클로알킬 (노르보르닐, 2,2,2-비사이클로옥틸 등) 및 트리사이클로알킬 (아다만틸 등)을 포함한다. 사이클로알킬은 또한 (사이클로알킬)알킬을 포함한다. 따라서, (C₃-C₆)사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실일 수 있으며; (C₃-C₆)사이클로알킬(C₁-C₆)알킬은 사이클로프로필메틸, 사이클로부틸메틸, 사이클로펜틸메틸, 사이클로헥실메틸, 2-사이클로프로필에틸, 2-사이클로부틸에틸, 2-사이클로펜틸에틸 또는 2-사이클로헥실에틸일 수 있다.

(C₁-C₆)알콕시는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시, 2급-부톡시, 펜톡시, 3-펜톡시 또는 헥실옥시일 수 있고; (C₂-C₆)알케닐은 비닐, 알릴, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 4-펜테닐, 1-헥세닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 4-헥세닐 또는 5-헥세닐일 수 있고; (C₂-C₆)알키닐은 에티닐, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 3-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-펜티닐, 4-펜티닐, 1-헥시닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐, 4-헥시닐 또는 5-헥시닐일 수 있으며; (C₁-C₆)알카노일은 아세틸, 프로파노일 또는 부타노일일 수 있고; 할로(C₁-C₆)알킬은 요오도메틸, 브로모메틸, 클로로메틸, 플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 2-클로로에틸, 2-플루오로에틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 또는 펜타플루오로에틸일 수 있고; 하이드록시(C₁-C₆)알킬은 하이드록시메틸, 1-하이드록시에틸, 2-하이드록시에틸, 1-하이드록시프로필, 2-하이드록시프로필, 3-하이드록시프로필, 1-하이드록시부틸, 4-하이드록시부틸, 1-하이드록시펜틸, 5-하이드록시펜틸, 1-하이드록시헥실 또는 6-하이드록시헥실일 수 있으며; (C₁-C₆)알콕시카보닐 (CO₂R²)은 메톡시카보닐, 에톡시카보닐, 프로폭시카보닐, 이소프로폭시카보닐, 부톡시카보닐, 펜톡시카보닐 또는 헥실옥시카보닐일 수 있고; (C₁-C₆)알킬티오는 메틸티오, 에틸티오, 프로필티오, 이소프로필티오, 부틸티오, 이소부틸티오, 펜틸티오 또는 헥실티오일 수 있으며; (C₂-C₆)알카노일옥시는 아세톡시, 프로파노일옥시, 부타노일옥시, 이소부타노일옥시, 펜타노일옥시 또는 헥사노일옥시일 수 있고; 아릴은 페닐, 인데닐 또는 나프틸일 수 있으며; 헤테로아릴은 푸릴, 이미다졸릴, 트리아졸릴, 트리아지닐, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 피락솔릴, 피롤릴, 피라지닐, 테트라졸릴, 퓨리딜 (또는 그의 N-옥사이드), 티에닐, 피리미디닐 (또는 그의 N-옥사이드), 인돌릴, 이소퀴놀릴 (또는 그의 N-옥사이드) 또는 퀴놀릴 (또는 그의 N-옥사이드)일 수 있다.

R에 대한 특정한 의미는 아미노, 모노메틸아미노 또는 사이클로프로필아미노이다.

R¹에 대한 특정한 의미는 카복시- 또는 (C₁-C₄)알콕시카보닐-사이클로헥실(C₁-C₄)알킬이다.

R²에 대한 특정한 의미는 H 또는 (C₁-C₄)알킬, 즉 메틸 또는 에틸이다.

R³에 대한 특정한 의미는 H, 메틸 또는 페닐이다.

R⁴에 대한 특정한 의미는 H, 메틸 또는 페닐이다.

Z에 대한 특정한 의미는 -CH₂- 또는 -CH₂-CH₂-이다.

X에 대한 특정한 의미는 CO₂R², (C₂-C₅)알카노일메틸 또는 아미도이다.

n에 대한 특정한 값은 1이다.

화학식 I의 바람직한 화합물은 각각의 R이 H이고, X가 에틸아미노카보닐이며, R¹이 4-카복시사이클로헥실메틸 (DWH-146a)이거나, R¹이 4-메톡시카보닐사이클로헥실메틸 (DWH-146e)이거나, R¹이 4-아세톡시메틸사이클로헥실메틸 (JMR-193)인 화합물이다. 이들은 이하 (DWH-146 (산) 및 메틸에스테르 (e)) 및 JMR-193으로 도시되어 있다.

메틸 4[3-(6-아미노-9(5-[(에틸아미노)카보닐]-3,4-디하이드록시테트라하이드로-Z-푸라닐-9H-2-퓨리닐)-2-프로피닐]-1-사이클로헥산카복실레이트 (DWH-146e)의 합성은 Pd¹¹촉매를 사용하여 요오도-아데노신 유도체 (N-에틸-1'-데옥시-1'-(아미노-2-요오도-9H-퓨린-9-일)-β-D-리보푸라누오라미드)를 메틸 4-(2-프로피닐)-1-사이클로헥산카복실레이트와 교차커플링시킴으로써 이루어졌다. 요오도-아데노신 유도체의 합성은 구아노신으로부터 이루어졌다. 구아노신은 우선 아세트산 무수물로 처리하여 당 하이드록실을 아세탈화시키고, 이어서 6 위치를 테트라메틸암모늄클로라이드 및 옥시염화인으로 염소화시킨다. 2 위치의 요오도화는 변형된 샌드마이어 반응에 의해서 이루어졌으며, 이어서 6-Cl 및 당 아세테이트를 암모니아로 치환시켰다. 2' 및 3' 하이드록실은 아세토나이트로 보호하였으며, 5' 하이드록실은 과망간산칼륨을 사용하여 산으로 요오드화시켰다. 2' 및 3' 아세토나이드를 탈보호시키고, 5' 산을 에탄올과 피셔(Fisher) 에스테르화 반응시킨 다음, 생성된 에틸 에스테르를 에틸아민을 사용하여 에틸 아미드로 전환시킴으로써 N-에틸-1'-데옥시-1'-(아미노-2-요오도-9H-퓨린-9-일)-β-D-리보푸라누오라미드를 수득하였다.

아세틸렌 (메틸 4-(2-프로피닐)-1-사이클로헥산카복실레이트)은 트랜스-1,4-사이클로헥산디메탄올을 출발물질로하여 합성하였다. 우선, 트랜스-디올을 모노토실화시키고, 이어서 토실레이트를 아세틸렌 음이온으로 치환시켰다. 생성된 하이드록실 아세틸렌 종의 하이드록실은 죤스(Jones) 시약을 통해서 산으로 산화시키고, 이어서 (트리메틸실릴)디아조메탄으로 메틸화시켜 메틸 4-(2-프로피닐)-1-사이클로헥산카복실레이트를 수득하였다.

교차-커플링반응은 이미 보고된 다음과 같은 조건하에서 수행하였다. N,N-디메틸포름아미드 (0.5 ㎖), 아세토니트릴 (1 ㎖), 트리에틸아민 (0.25 ㎖) 및 N-에틸-1'-데옥시-1'-(아미노-2-요오도-9H-퓨린-9-일)-β-D-리보푸라누오라미드 (25 ㎎, 0.06 mmol)의 용액에 비스(트리페닐포스핀)팔라듐디클로라이드 (1 ㎎, 2 mol%) 및 요오드화구리(I) (0.06 ㎎, 0.5 mol%)를 가하였다. 생성된 혼합물에 메틸 4-(2-프로피닐)-1-사이클로헥산카복실레이트 (54 ㎎, 0.3 mmol)를 가하고, 반응액을 N₂대기하에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에서 제거하고, 생성된 잔류물을 클로로포름 중의 20% 메탄올 중에서 섬광크로마토그라피 (R_f= 0.45)하여 4[3-(6-아미노-9(5-[(에틸아미노)카보닐]-3,4-디하이드록시테트라하이드로-Z-푸라닐)-9H-2-퓨리닐)-2-프로피닐]-1-사이클로헥산카복실레이트 (DWH-146e) 19 ㎎ (회백색 고체, mp 125℃ (분해))을 수득하였다.

DWH-146e 및 JMR193은 대조화합물인 CGS21680 (2-[p-(카복시에틸)-페닐-에틸아미노]5'-N-에틸카복스아미도아데노신)에 비해서 염증성 모델계에서 억제제로서 실질적으로 더 강력하였다. 예를 들어, DWH-146e는 CGS21680에 비해 A_2A수용체에서 약 80배 더 강력하였으며, A₃수용체에 비해 A_2A수용체에 대해서 40배 더 선택적이었다.

약제학적으로 허용되는 염의 예는 생리학적으로 허용되는 음이온을 형성하는 산에 의해서 형성된 유기산 부가염, 예를 들어 토실레이트, 메탄설포네이트, 말레이트, 아세테이트, 시트레이트, 말로네이트, 타르타레이트, 석시네이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, α-케토글루타레이트 및 α-글리세로포스페이트이다. 염산염, 황산염, 질산염, 중탄산염 및 탄산염을 포함한 적합한 무기염이 형성될 수도 있다.

약제학적으로 허용되는 염은 당해기술분야에서 잘 알려진 표준방법을 사용하여, 예를 들어 아민과 같이 충분히 염기성인 화합물을 생리학적으로 허용되는 음이온을 제공하는 적합한 산과 반응시킴으로써 수득할 수 있다. 카복실산의 알칼리금속 (예를 들어 나트륨, 칼륨 또는 리튬) 또는 알칼리토금속 (예를 들어 칼슘) 염이 또한 제조될 수도 있다.

화학식 I의 화합물은 약제학적 조성물로 제형화되어 선택된 투여경로, 즉, 경구적으로 또는 정맥내, 근육내, 국소 또는 피하 경로에 의해 비경구적으로 투여하기에 적합한 다양한 형태로 인간 환자와 같은 포유류 숙주에게 투여할 수 있다.

따라서, 본 발명의 화합물은 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용담체와 같은 약제학적으로 허용되는 비히클과의 배합물로 전신적으로, 예를 들어 경구로 투여될 수 있다. 이들은 경질 또는 연질쉘 젤라틴 캅셀 내에 봉입될 수 있거나, 정제로 압축될 수 있거나, 또는 환자식의 음식과 직접 혼합시킬 수도 있다. 치료학적 경구투여를 위해서, 활성화합물은 하나 또는 그 이상의 부형제와 배합시켜 섭취가능한 정제, 구강정제, 트로치, 캅셀제, 엘릭서, 현탁제, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 적어도 0.1%의 활성화합물을 함유하여야 한다. 조성물 및 제제의 비율은 물론 달라질 수 있으며, 편리하게는 소정의 단위용량형 당 약 2 내지 약 60 중량% 사이일 수 있다. 이러한 치료학적으로 유용한 조성물 내의 활성화합물의 양은 유효용량수준이 얻어질 수 있도록 하는 양이다.

정제, 트로치, 환제, 캅셀제 등은 또한 다음의 성분을 함유할 수 있다: 트라가칸트 고무, 아카시아 고무, 옥수수전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘포스페이트와 같은 부형제; 옥수수전분, 감자전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 마그네슘스테아레이트와 같은 윤활제; 및 슈크로즈, 프럭토즈, 락토즈 또는 아스파르탐과 같은 감미제 또는 페퍼민트, 윈터그린 오일 또는 체리향과 같은 방향제가 첨가될 수도 있다. 단위용량형이 캅셀제인 경우에, 이것은 상기 언급된 형태의 물질 이외에도 식물유 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 그밖의 다양한 다른 물질들이 피복제로서, 또는 그렇지않은 경우에는 고체 단위용량형의 물리적 형태를 변형시키기 위해서 존재할 수도 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캅셀제는 젤라틴, 왁스, 쉘락 또는 당 등에 의해 피복될 수 있다. 시럽 또는 엘릭서는 활성화합물, 감미제로서 슈크로즈 또는 프럭토즈, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리 또는 오렌지향과 같은 방향제를 함유할 수 있다. 단위용량형을 제조하는데 사용된 모든 물질들은 물론 사용된 양에서 약제학적으로 허용되며 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성화합물은 서방성 제제 및 장치 내에 통합시킬 수도 있다.

활성화합물은 또한, 주입 또는 주사에 의해서 정맥내 또는 복강내로 투여될 수도 있다. 활성화합물 또는 그의 염의 용액은 임의로 비독성 계면활성제와 혼합된 물 중에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌글리콜, 트리아세틴, 및 이들의 혼합물 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 통상적인 저장 및 사용조건 하에서, 이들 제제는 보존제를 함유하여 미생물의 성장을 예방한다.

주사 또는 주입에 적합한 약제학적 용량형에는 임의로 리포좀 내에 캅셀화시킨, 멸균 수성 용액 또는 분산액, 또는 멸균 주사용 또는 주입용 용액 또는 분산액의 즉시제조에 적합한 활성성분을 함유하는 멸균 분말이 포함될 수 있다. 모든 경우에, 궁극적인 용량형은 멸균되어야 하고, 유체이어야 하며, 제조 및 저장조건 하에서 안정하여야 한다. 액체 담체 또는 비히클은 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 액체 폴리에틸렌글리콜 등), 식물유, 비독성 글리세릴 에스테르 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 액체 분산매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 리포좀을 형성시키거나, 분산액의 경우에는 필요한 입자크기를 유지시키거나, 또는 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해서 유도될 수 있다. 대부분의 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 완충제 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 장기간의 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 성분, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 유도될 수 있다.

멸균주사용 용액은 활성화합물을 필요한 양으로 상기 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매 내에 통합시키고, 이어서 여과멸균시킴으로써 제조한다. 멸균주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조방법은 미리 멸균-여과된 용액 내에 존재하는 추가의 목적하는 성분과 함께 활성성분의 분말을 수득하는 진공건조 및 동결건조 기술이다.

국소투여를 위해서, 본 발명의 화합물은 순수한 형태로, 즉 이들이 액체인 경우에 적용될 수 있다. 그러나, 일반적으로 이들을 고체 또는 액체일 수 있는 피부학적으로 허용되는 담체와 배합하여 조성물 또는 제제로서 피부에 투여하는 것이 바람직하다.

유용한 고체담체에는 탈크, 점토, 미세결정성 셀룰로즈, 실리카, 알루미나 등과 같은 미분된 고체가 포함된다. 유용한 액체 담체에는 임의로 비독성 계면활성제의 도움을 받아 본 발명의 화합물이 유효수준으로 용해 또는 분산될 수 있는 물, 알콜 또는 글리콜 또는 물-알콜/글리콜 배합물이 포함된다. 향료 및 추가의 항미생물제와 같은 보조제를 첨가하여 소정의 용도를 위한 특성을 최적화시킬 수 있다. 생성된 액체조성물은 흡수제 패드로부터 적용될 수 있거나, 붕대를 함침시켜 사용할 수 있거나, 펌프-타입 또는 에어로졸 스프레이를 사용하여 감염된 영역 상에 분무할 수 있다.

합성 폴리머, 지방산, 지방산 염 및 에스테르, 지방알콜, 변형된 셀룰로즈 또는 변형된 무기물질과 같은 농조화제(thickener)를 또한 액체 담체와 함께 사용하여 사용자의 피부에 직접 적용하기 위한 연전가능한(spreadable) 페이스트, 겔,연고, 비누 등을 형성시킬 수도 있다.

화학식 I의 화합물을 피부에 송달하기 위해서 사용될 수 있는 유용한 피부학적 조성물의 예는 미국 특허 제4,608,392호 (Jacquet 등), 미국 특허 제4,992,478호 (Geria), 미국 특허 제4,559,157호 (Smith 등) 및 미국 특허 제4,820,508호 (Wortzman)에 기술되어 있다.

화학식 I의 화합물의 유용한 용량은 이들의 시험관내 활성 및 동물모델에서의 생체내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스 및 그밖의 다른 동물에서의 유효용량을 인간에게 외삽시키기 위한 방법은 당해기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제4,938,949호를 참고한다. 타입 IV PDE 억제제의 유용한 용량은 당해기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,877,180호 (Col. 12)를 참고한다.

일반적으로, 로숀과 같은 액체조성물 내의 화학식 I의 화합물(들)의 농도는 약 0.1-25 wt%, 바람직하게는 약 0.5-10 wt%이다. 겔 또는 분말과 같은 반고체 또는 고체조성물 내의 농도는 약 0.1-5 wt%, 바람직하게는 약 0.5-2.5 wt%이다.

치료에 사용하기 위해서 필요한 화합물, 또는 그의 활성 염 또는 유도체의 양은 선택된 개개 염에 따라서 뿐 아니라 투여경로, 치료하고자 하는 상태의 성질 및 환자의 연령 및 상태에 따라서도 달라지며, 궁극적으로는 담당의사 또는 임상의의 판단에 따른다.

그러나, 일반적으로 적합한 용량은 약 0.5 내지 약 100 ㎍/㎏, 예를 들어 1일에 복용자의 체중 ㎏당 3 내지 약 50 ㎍과 같이 1일에 체중 ㎏당 약 10 내지 약75 ㎍의 범위이며, 바람직하게는 6 내지 90 ㎍/㎏/일의 범위이고, 가장 바람직하게는 15 내지 60 ㎍/㎏/일의 범위이다.

화합물은 편리하게는 단위용량형으로, 예를 들어 단위용량형당 활성성분 5 내지 1000 ㎍, 편리하게는 10 내지 750 ㎍, 가장 편리하게는 50 내지 500 ㎍을 함유하는 단위용량형으로 투여한다.

이상적으로는, 활성성분을 투여하여 약 0.1 내지 약 10 nM, 바람직하게는 약 0.2 내지 10 nM, 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5 nM의 최고혈장농도에 도달하도록 하여야 한다. 이 농도는 예를 들어, 임의로 식염수 중의 활성성분의 0.05 내지 5% 용액을 정맥내 주사하거나, 활성성분 약 1-100 ㎍을 함유하는 환괴 (bolus)를 경구투여함으로써 도달될 수 있다. 바람직한 혈중농도는 약 0.01-5.0 ㎍/㎏/hr을 제공하도록 연속주입하거나, 활성성분(들) 약 0.4-15 ㎍/㎏을 함유하는 간헐적 주입에 의해서 유지될 수 있다.

목적하는 용량은 편리하게는 단일용량으로 존재할 수 있거나, 또는 적절한 간격으로 투여되는 분할용량으로, 예를 들어, 하루에 2, 3, 4 또는 그 이상의 서브-용량 (sub-dose)으로 존재할 수 있다. 서브-용량 그 자체는 예를 들어, 통기기 (insufflator)로부터 수회 흡입하거나, 눈에 수적을 적용하는 것과 같은 간격이 일정하지 않은 다수의 불연속적인 투여로 더 분할될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 염증을 야기시키는 상해가 있은 후에 장기간에 걸쳐서 정맥내로 투여하는 것이 바람직하다.

A_2A아데노신 수용체 작용제 (또는 길항제)로서 작용하는 본 발명의 소정의 화합물의 능력은 당해기술분야에서 잘 알려져 있는 약물학적 모델을 사용하거나, 후술하는 시험방법을 사용하여 결정될 수 있다.

본 발명은 이하의 상세한 실시예를 참고로하여 더 상세히 기술되며, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제시된 것으로 본 발명을 제한하기 위한 것은 아니다.

실시예 1

트랜스-(1-[4-하이드록시메틸)사이클로헥실]메틸)-4-메틸벤젠설포네이트 (5.2)

나트륨하이드라이드 (1.68 g, 70 mmol)를 테트라하이드로푸란 700 ㎖ 중의 [4-(하이드록시메틸)사이클로헥실]메탄-1-올 (5.1) 10 g (70 mmol)의 용액에 가하고, 1시간 동안 교반하였다. 그후, p-톨루엔설포닐클로라이드 (13.3 g, 70 mmol)를 가하고, 반응혼합물을 5시간 동안 환류시켰다. 그후, 반응액을 0℃로 냉각시키고, 더 이상의 반응성 하이드라이드가 존재하지 않을 때까지 물로 서서히 켄칭하였다. 일단 하이드라이드를 켄칭시킨 다음에는, 반응혼합물을 에테르 (700 ㎖)로 희석하여 10% 수성 탄산칼륨 (700 ㎖)으로 2회 추출하였다. 유기물을 황산나트륨을 사용하여 건조시키고, 감압하에서 용매를 제거하였다. 생성물을 아세톤-디클로로메탄 (5:95)으로 용출시키는 실리카겔 칼럼 상에서 크로마토그라피시켜 정제하여 5.2 (35%)를 수득하였다.

¹H NMR (300 ㎒, CDCl₃) δ 7.75 (d, J=8.3 ㎐, 2H), 7.32 (d, J=8.1 ㎐, 2H), 3.79 (d, J=6.35 ㎐, 2H), 3.39 (d, J=6.35 ㎐, 2H), 2.42 (s, 3H), 1.75 (m, 4H), 1.59 (m, 1H), 1.37 (m, 1H), 0.9 (m, 4H).

¹³C NMR (300 ㎒, CDCl₃) δ 145.3, 133.4, 130.3, 130.3, 128.3, 128.3, 75.8, 68.5, 40.6, 37.8, 28.9, 28.9, 28.9, 28.9, 22.1.

실시예 2

(4-프로프-2-이닐사이클로헥실)메탄-1-올 (5.3)

리튬 아세틸라이드 에틸렌디아민 컴플렉스 (90%) (6.4 g, 70 mmol)를 디메틸설폭사이드 40 ㎖ 중의 5.2 (3 g, 10 mmol)의 용액에 매우 서서히 가하였다. 반응혼합물을 5일 동안 교반한 다음, 0℃에서 서서히 물로 켄칭하였다. 이 혼합물을 에테르 (300 ㎖)로 희석하고, 포화 수성 염화암모늄 (200 ㎖)으로 3회 추출하였다. 유기물을 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하고, 생성물을 에틸아세테이트-헥산 (20:80)으로 용출시키는 실리카겔 칼럼 상에서 크로마토그라피시켜 정제하여 5.3 (85%)을 수득하였다.

¹H NMR (300 ㎒, CDCl₃) δ 3.41 (d, J=6.5 ㎐, 2H), 2.07 (dd, J=2.5, 6.5 ㎐, 2H), 1.96-1.75 (m, 5H), 1.41 (m, 2H), 0.95 (m, 4H).

¹³C NMR (300 ㎒, CDCl₃) δ 83.8, 69.6, 68.9, 40.7, 37.7, 32.3, 32.3, 29.6,29.6, 26.5.

실시예 3

4-프로프-2-이닐사이클로헥산카복실산 (5.4)

1.5 M 황산 (40 ㎖, 27 mmol) 중의 삼산화크롬 (1.1 g, 11 mmol)의 용액을 0℃에서 유지시키면서 아세톤 80 ㎖ 중의 5.3 (0.46 g, 3 mmol)을 2시간에 걸쳐 가하였다. 그후, 반응액을 실온에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 에테르 (200 ㎖)로 희석하여 물로 2회 추출하였다. 유기물을 황산나트륨을 사용하여 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하고, 생성물을 아세톤-디클로로메탄 (70:30)으로 용출시키는 실리카겔 칼럼 상에서 크로마토그라피시켜 정제하여 5.4 (75%)를 수득하였다.

¹H NMR (300 ㎒, CDCl₃) δ 2.24 (dt, J=3.66, 12.1 ㎐, 1H), 2.10 (dd, J=2.7, 6.5 ㎐, 2H), 2.04-1.89 (m, 5H), 1.76 (d, J=2.3 ㎐, 1H), 1.43 (dq, J=3.28, 13.1 ㎐, 2H), 1.03 (dq, J=3.28, 13.1 ㎐, 2H).

¹³C NMR (300 ㎒, CDCl₃) δ 183.2, 83.3, 69.9, 43.4, 36.7, 31.8, 28.9, 26.3.

실시예 4

메틸 4-프로프-2-이닐사이클로헥산카복실레이트 (5.5)

헥산 (1 ㎖, 2 mmol) 중의 (트리메틸실릴)디아조메탄 (2.0 M) 용액을 메탄올:디클로로메탄 (3:7) 15 ㎖ 중의 5.4 (0.34 g, 2 mmol)의 용액에 가하였다. 감압하에서 용매를 제거하여 출발물질을 생성물로 100% 전환시켰다.

¹H NMR (300 ㎒, CDCl₃) δ 2.24 (dt, J=3.66, 12.1 ㎐, 1H), 2.10 (dd, J=2.7, 6.5 ㎐, 2H), 2.06 (dd, J=1.54, 6.54 ㎐, 1H), 2.00-1.89 (m, 3H), 1.76 (d, J=2.3 ㎐, 1H), 1.43 (dq, J=3.28, 13.1 ㎐, 2H), 1.03 (dq, J=3.28, 13.1 ㎐, 2H).

¹³C NMR (300 ㎒, CDCl₃) δ 176.8, 83.3, 69.8, 51.9, 43.4, 36.7, 31.9, 29.2, 26.3.

실시예 5

[(2R,3R,4R,5R)-3,4-디아세틸옥시-5-(2-아미노-6-옥소하이드로퓨린-9-일)옥솔란-2-일]메틸 아세테이트 (6.2)

무수 구아노신 (6.1) 113 g (0.4 mol), 아세트산 무수물 (240 ㎖, 2.5 mol), 무수 피리딘 (120 ㎖) 및 무수 DMF (320 ㎖)의 현탁액을 3.75시간 동안 온도가 80℃를 초과하지 않도록 하면서 75℃에서 가열하였다. 그후, 맑은 용액을 3 ℓ 삼각플라스크에 옮기고, 2-프로판올로 충진시켰다. 용액을 실온으로 냉각시키면 결정화가 개시되며, 이것을 4℃에서 밤새 진행시켰다. 백색고체 여액을 여과하여 2-프로판올로 세척하고 2-프로판올로부터 재결정화시켜 6.2 (96%)를 수득하였다.

¹H NMR (300 ㎒, CDCl₃) δ 8.20 (s, 1H, H-8), 6.17 (d, J=5.41 ㎐, 1H, H-1'), 5.75 (t, J=5.39 ㎐, 1H, H-2'), 5.56 (t, J=5.0, H-3'), 4.41 (m, 3H, H-4',5'), 2.14 (s, 3H, Ac), 2.11 (s, 3H, Ac), 2.10 (s, 3H, Ac).

¹³C NMR (300 ㎒, CD₃OD) δ 171.0, 170.3, 170.2, 157.7, 154.8, 152.4, 136.7, 117.7, 85.5, 80.4, 73.0, 71.3, 64.0, 31.3, 21.2, 21.0.

실시예 6

[(2R,3R,4R,5R)-3,4-디아세틸옥시-5-(2-아미노-6-클로로퓨린-9-일)옥솔란-2-일]메틸 아세테이트 (6.3)

100 ㎖ 플라스크에 [(2R,3R,4R,5R)-3,4-디아세틸옥시-5-(2-아미노-6-옥소하이드로퓨린-9-일)옥솔란-2-일]메틸 아세테이트 (6.2) 80 g (0.195 mol), 테트라메틸암모늄클로라이드 (44 g, 0.4 mol), 무수 아세토니트릴 (400 ㎖) 및 N,N-디메틸아닐린 (25 ㎖)을 가하였다. 플라스크를 얼음염욕 (ice salt bath)에 배치하고, 2℃로 냉각시켰다. 이 용액에 POCl₃(107 ㎖, 1.15 mol)를 온도가 5℃ 이하로 유지되는 속도로 적가하였다 (45분). 그후, 플라스크를 얼음욕으로부터 꺼내어 냉각기를 장착하여 얼음욕에 배치시키고, 10분 동안 환류시켰으며, 용액은 적색/갈색으로 변화하였다. 그후, 용매를 감압하에서 제거하여 오일상 잔류물을 수득하고, 이것을 얼음 1000 g 및 CHCl₃400 ㎖를 함유하는 비이커에 옮겨서 1.5시간 동안 교반하여 잔류 POCl₃를 분해시켰다. 그후, 유기상을 제거하고, 수성상을 CHCl₃3×50 ㎖로 추출하여 유기상과 함께 모았다. 모아진 유기물을 그후 물 50 ㎖로 역추출하고, 이어서 포화 NaHCO₃200 ㎖와 함께 교반하였다. 수성 추출물이 중성이 될 때까지 NaHCO₃로 유기물을 더 추출하였다 (2×). 유기물을 마지막으로 염수로 세척한다음, MgSO₄상에서 16시간 동안 건조시켰다. 이 용액에 2-프로판올 800 ㎖를 가한 후에 용액을 감압하에서 농축시켰다. 오일성 고체에 2-프로판올 200 ㎖를 가하고, 용액을 밤새 냉동시켰다. 결정성 생성물을 여과하고, 세척한 다음에 밤새 건조시켜 6.3 (77%)을 수득하였다.

¹H NMR (300 ㎒, CD₃OD) δ 8.31 (s, 1H, H-8), 7.00 (s, 2H, NH₂), 6.06 (d, J=5.8 ㎐, 1H, H-1'), 5.83 (t, J=6.16 ㎐, 1H, H-2'), 5.67 (m, 1H, H-3'), 4.29 (m, 3H, H-4',5'), 2.07 (s, 3H, Ac), 1.99 (s, 3H, Ac), 1.98 (s, 3H, Ac).

¹³C NMR (300 ㎒, CD₃OD) δ 171.0, 170.4, 170.2, 160.8, 154.6, 150.8, 142.2, 124.5, 85.8, 80.6, 72.8, 71.2, 63.9, 21.4, 21.3, 21.1.

실시예 7

[(2R,3R,4R,5R)-3,4-디아세틸옥시-5-(6-클로로-2-요오도퓨린-9-일)옥솔란-2-일]메틸 아세테이트 (6.4)

이소아밀니트라이트 (5 ㎖, 37 mmol)를 THF (60 ㎖) 중의 [(2R,3R,4R,5R)-3,4-디아세틸옥시-5-(2-아미노-6-클로로퓨린-9-일)옥솔란-2-일]메틸 아세테이트 (6.3) 5.12 g (12 mmol), I₂(3.04 g, 12 mmol), CH₂I₂(10 ㎖, 124 mmol) 및 CuI (2.4 g, 12.6 mmol)의 혼합물에 가하였다. 혼합물을 45분 동안 환류가열한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 이 용액에 포화 Na₂S₂O₃100 ㎖를 가하고, 요오드로 인한 적색을 제거하였다. 수층을 클로로포름으로 3회 추출하고, 모아서 MgSO₄상에서 건조시키고 감압하에서 농축시켰다. 그후, 생성물을 CHCl₃-MeOH (98:2)를 사용하는 실리카겔 칼럼 상에서 정제하여 [(2R,3R,4R,5R)-3,4-디아세틸옥시-5-(6-클로로-2-요오도퓨린-9-일)옥솔란-2-일]메틸 아세테이트 (6.4) (EtOH로부터 80% 결정화됨)를 수집하였다.

¹H NMR (300 ㎒, CDCl₃) δ 8.20 (s, 1H, H-8), 6.17 (d, J=5.41 ㎐, 1H, H-1'), 5.75 (t, J=5.39 ㎐, 1H, H-2'), 5.56 (t, J=5.40 ㎐, 1H, H-3'), 4.38 (m, 3H, H-4',5'), 2.14 (s, 1H, Ac), 2.11 (s, 1H, Ac), 2.10 (s, 1H, Ac).

실시예 8

(4S,2R,3R,5R)-2-(6-아미노-2-요오도퓨린-9-일)-5-(하이드록시메틸)옥솔란-3,4-디올 (6.5)

[(2R,3R,4R,5R)-3,4-디아세틸옥시-5-(6-클로로-2-요오도퓨린-9-일)옥솔란-2-일]메틸 아세테이트 (6.4) 6.0 g (11.1 mmol)을 함유하는 플라스크에 -78℃에서 액체 NH₃100 ㎖를 가하고, 용액을 6시간 동안 교반하였다. 그후에, 용액을 밤새 실온으로 조정하면서 NH₃를 동시에 증발시켜 갈색 오일을 수득하였다. 생성물을 뜨거운 이소프로판올로부터 결정화시켜 6.5 (80%)를 수득하였다: 융점 143-145℃, r.f. = 20% MeOH/CHCl₃중의 0.6.

¹H NMR (300 ㎒, DMSO-d₆) δ 8.24 (s, 1H), 7.68 (s, 2H), 5.75 (d, J=6.16 ㎐, 1H), 5.42 (d, J=5.40 ㎐, 1H), 5.16 (d, J=4.62 ㎐, 1H), 4.99 (t, J=5.39 ㎐, 1H), 4.67 (d, J=4.81 ㎐, 1H), 4.06 (d, J=3.37 ㎐, 1H), 3.89 (m, 1H), 3.54 (m, 2H).

실시예 9

[(1R,2R,4R,5R)-4-(6-아미노-2-요오도퓨린-9-일)-7,7-디메틸-3,6,8-트리옥사비사이클로[3.3.0]옥트-2-일]메탄-1-올 (6.6)

아세톤 100 ㎖ 중의 (4S,2R,3R,5R)-2-(6-아미노-2-요오도퓨린-9-일)-5-(하이드록시메틸)옥솔란-3,4-디올 (6.5) 2.0 g (5.08 mmol)의 용액에 p-톨루엔설폰산 9.6 g 및 디메톡시프로판 5 ㎖를 가하였다. 반응액을 실온에서 1시간 동안 교반하며, 이때 NaHCO₃15 g을 가한 다음, 추가로 3시간 동안 교반하였다. 잔류물을 여과하고 EtOAc로 2회 세척하였다. 그후, 여액을 감압하에서 농축시켰다. 잔류물을 MeOH-CHCl₃(1:99)를 사용하는 실리카겔 칼럼상에서 크로마토그라피시켜 고체로서 6.6 (72%)을 수득하였다: 융점 185-187℃.

¹H NMR (300 ㎒, DMSO-d₆) δ 8.22 (s, 1H, H-8), 7.69 (s, 2H, NH₂), 6.00 (d, J=2.70 ㎐, 1H, H-1'), 5.21 (m, 1H, H-2'), 5.07 (bs, 1H, OH), 4.88 (m, 1H, H-3'), 4.13 (m, 1H, H-4'), 3.47 (m, 2H, H-5'), 1.49 및 1.28 (s, 3H, C(CH₃)₂).

실시예 10

(2S,1R,4R,5R)-4-(6-아미노-2-요오도퓨린-9-일)-7,7-디메틸-3,6,8-트리옥사비사이클로[3.3.0]옥탄-2-카복실산 (6.7)

H₂O 200 ㎖ 중의 [(1R,2R,4R,5R)-4-(6-아미노-2-요오도퓨린-9-일)-7,7-디메틸-3,6,8-트리옥사비사이클로[3.3.0]옥트-2-일]메탄-1-올 (6.6) 1.6 g (3.7 mmol)의 교반용액에 KOH 0.60 g을 가하고, H₂O 50 ㎖ 중의 KMnO₄1.70 g (10.8 mmol)의 용액을 적가하였다. 혼합물을 실온에서 225시간 동안 암소에 방치하였다. 그후, 반응혼합물을 5-10℃로 냉각시키고, 물 16 ㎖ 중의 30% H₂O₂4 ㎖의 용액에 의해서 탈색시키면서 온도는 얼음-염욕을 사용하여 10℃ 이하로 유지시켰다. 혼합물을 셀라이트를 통해서 여과하고, 여액을 감압하에서 약 10 ㎖로 농축시킨 다음, 2 N HCl로 pH 4로 산성화시켰다. 생성된 침전을 여과하여 에테르로 세척하고 건조시킨 후에 백색고체로서 6.7 (70%)을 수득하였다: 융점 187-190℃.

¹H NMR (300 ㎒, DMSO-d₆) δ 8.11 (s, 1H, H-8), 7.62 (s, 2H, NH₂), 7.46 (s, 1H, COOH), 6.22 (s, 1H, H-1'), 5.42 (d, J=5.71 ㎐, 1H, H-2'), 5.34 (d, J=6.16 ㎐, 1H, H-3'), 4.63 (s, 1H, H-4'), 1.46 및 1.30 (s, 3H, C(CH₃)₂).

실시예 11

(2S,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-2-요오도퓨린-9-일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-카복실산 (6.8)

50% HCOOH 80 ㎖ 중의 (2S,1R,4R,5R)-4-(6-아미노-2-요오도퓨린-9-일)-7,7-디메틸-3,6,8-트리옥사비사이클로[3.3.0]옥탄-2-카복실산 (6.7) 1.72 g (3.85 mmol)의 용액을 80℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 감압하에서 증발시키고, H₂O에 용해시켜 용액을 다시 증발시켰다. 잔류물 중의 포름산의 냄새가 소실될 때까지 이 공정을 반복하였다. 물로부터 재결정화시켜 6.8을 백색고체로서 1.33 g (85%) 수득하였다: 융점 221-223℃ (분해).

¹H NMR (300 ㎒, DMSO-d₆) δ 8.31 (s, 1H, H-8), 7.68 (s, 2H, NH₂), 5.90 (d, J=6.55 ㎐, 1H, H-1'), 4.42 (m, 1H, H-2'), 4.35 (d, J=2.31 ㎐, 1H, H-4'), 4.22 (m, 1H, H-3').

실시예 12

[(2S,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-2-요오도퓨린-9-일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-N-에틸카복스아미드 (6.9)

무수 에탄올 150 ㎖ 중의 (2S,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-2-요오도퓨린-9-일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-카복실산 (6.8) 1.29 g (3.17 mmol)의 냉각 (5℃) 및 교반용액에 빙냉된 SOCl₂1.15 ㎖를 적가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 포화 수성 NaHCO₃로 pH 8로 조정하였다. 혼합물을 여과한 다음, 여액을 감압하에서 농축시켜 백색고체를 수득하고, 이것을 건조시킨 다음에 -20℃에서 3시간 동안 및 그후에는 실온에서 밤새 무수 에틸아민 20 ㎖에 재용해시켰다. 반응혼합물을 무수 에탄올로 희석하고, 침전된 생성물을 여과하여 무수 에테르로 세척하여 순수한 고체로서 6.9를 530 ㎎ (72%) 수득하였다: 융점 232-234℃.

¹H NMR (300 ㎒, DMSO-d₆) δ 8.34 (s, 1H, H-8), 8.12 (t, 1H, NH), 7.73 (s, 2H, NH₂), 5.85 (d, J=6.93 ㎐, 1H, H-1'), 4.54 (m, 1H, H-2'), 4.25 (d, J=1.92 ㎐, 1H, H-4'), 4.13 (m, 1H, H-3'), 3.28 (m, 2H, CH₂CH₃), 1.00 (t, J=7.2 ㎐, 3H, CH₂CH₃).

실시예 13

메틸-4-(3-{9-[(4S,5S,2R,3R)-5-(N-에틸카바모일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-6-아미노퓨린-2-일)}프로프-2-이닐)사이클로헥산-카복실레이트 (DWH-146e)

트리에틸아민 (TEA) 및 아세토니트릴 각 5 ㎖ 중의 [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-2-요오도퓨린-9-일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-N-에틸카복스아미드 (6.9) 25 ㎎ (0.063 mmol), (5.5) 16.9 ㎎ (0.094 mmol) 및 CuI 0.75 ㎎의 탈기된 용액에 Pd(PPh₃)₄15 ㎎을 가하였다. 이 용액을 70℃에서 24시간 동안 교반한 후에 용액을 셀라이트를 통해서 여과하고, MeOH-CHCl₃(5:95)를 사용하는 실리카겔 상에서 크로마토그라피시켜 DWH-146e (24%)를 수득하였다.

실시예 14

(4-프로프-2-이닐사이클로헥실)메틸 아세테이트 (5.6)

아세트산 무수물 (0.92 ㎖, 8.25 mmol) 및 피리딘 (0.2 ㎖, 2.5 mmol)을 에테르 25 ㎖ 중의 5.3 (250 ㎎, 1.65 mmol)의 용액에 가하였다. 반응액을 주위온도에서 24시간 동안 교반하였다. 반응액에 물을 가하고, 유기물을 10% NaHCO₃로 더 추출하였다. 유기층을 MgSO₄로 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 EtOAc-헥산 (5:95)을 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그라피시켜 5.6 (47%)을 수득하였다.

실시예 15

[4-(3-{9-(4S,5S,2R,3R)-5-(N-에틸카바모일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-6-아미노퓨린-2-일}프로프-2-이닐)사이클로헥실]메틸 아세테이트 (JMR193)

TEA 1.3 ㎖ 및 DMF 4 ㎖ 중의 [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-2-요오도퓨린-9-일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-N-에틸카복스아미드 (6.9) 125 ㎎ (0.29 mmol), (5.6) 150 ㎎ (0.77 mmol) 및 CuI 1.0 ㎎의 탈기된 용액에 Pd(PPh₃)₄25 ㎎을 가하였다. 이 용액을 60℃에서 72시간 동안 교반한 후에 용액을 셀라이트를 통해서 여과하고, MeOH-CHCl₃(5:95)를 사용하는 실리카겔 상에서 크로마토그라피시켜 JMR193 (10%)을 수득하였다.

실시예 16

[(2S,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-2-{3-[4-(하이드록시메틸)사이클로헥실]프로프-2-이닐}퓨린-9-일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-N-에틸-카복스아미드

A. (4-프로프-2-이닐사이클로헥실)메탄-1-올

리튬아세틸라이드 에틸렌디아민 컴플렉스 (90%) (6.4 g, 70 mmol)를 디메틸설폭사이드 40 ㎖ 중의 트랜스-[4-(하이드록시메틸)사이클로헥실]메틸-4-메틸벤젠설포네이트 (3 g, 10 mmol)의 용액에 매우 서서히 가하였다. 반응혼합물을 5 일동안 교반한 다음, 0℃에서 물로 서서히 켄칭하였다. 이 혼합물을 에테르 (300 ㎖)로 희석하고, 포화 수성 염화암모늄 (200 ㎖)으로 3회 세척하였다. 유기물을 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압하에서 제거하였다. 생성물을 에틸아세테이트-헥산 (20:80)으로 용출시키는 실리카겔 칼럼 상에서 크로마토그라피시켜 정제함으로써 생성물 (85%)을 수득하였다.

¹H NMR (300 ㎒, CDCl₃) d 3.41 (d, J=6.5 ㎐, 2H), 2.07 (dd, J=2.5, 6.5 ㎐, 2H), 1.96-1.75 (m, 5H), 1.41 (m, 2H), 0.95 (m, 4H).

¹³C NMR (300 ㎒, CDCl₃) d 83.8, 69.6, 68.9, 40.7, 37.7, 32.3, 32.3, 29.6, 29.6, 26.5.

B. [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-2-{3-[4-(하이드록시메틸)사이클로헥실]-프로프-1-이닐}퓨린-9-일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-N-에틸카복스아미드 (JMR2037)

트리에틸아민 (TEA) 1 ㎖, DMF 1 ㎖ 및 아세토니트릴 1 ㎖ 중의 [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-2-요오도퓨린-9-일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-N-에틸카복스아미드 28 ㎎ (0.065 mmol), (4-프로프-2-이닐사이클로헥실)메탄-1-올 30 ㎎ (0.20 mmol) 및 CuI 1.0 ㎎의 탈기된 용액에 Pd(PPh₃)₄10 ㎎을 가하였다. 이 용액을 실온에서 60시간 동안 교반한 후에 용액을 셀라이트를 통해서 여과하고, MeOH-CHCl₃(7:93)를 사용하는 실리카겔 상에서 크로마토그라피시켜 JMR2037 5 ㎎ (17%)를 수득하였다. 표제화합물은 본 명세서에 기술된 결합시험을 사용하여 시험하였으며, 694 ±69 nM의 Ki로 재조합체 인간 A_2A수용체에 결합하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 17

방사성 리간드 결합시험

A_2A수용체에 대한 결합은 방사성 리간드(radiolignad)¹²⁵I-ZM241385를 사용하여 평가하였다. 도 2B는 재조합체 인간 A_2A아데노신 수용체에 대한 결합에 관해 선택적 작용제에 의한 경쟁작용을 도시한 것이다. DWH-146e는 재조합체 인간 A_2A(hA2A) 서브타입에 대해서 매우 선택적이다. A₃수용체에 대한 선택성 (도시하지 않음)은 덜 현저하지만 여전히 약 50-배이다. DWH-146e는 WRC0470와 CGS21680에 비해 각각 약 5배 및 50배 이상 더 강력하다 (도 1). 예기치 못한 흥미로운 발견은 에스테르인 DWH-146e가 산인 DWH-146a보다 약 50배 더 강력하다는 점이다 (도 1).

실시예 17A

호중구 산화활성에 대한 DWH-146e 및 JMR193의 영향

A. 재료

f-met-leu-phe (fMLP), 루미놀, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 사이토크롬 C, 피브리노겐, 아데노신 데아미나제 및 트립판블루는 시그마 케미칼(Sigma Chemical)로부터 입수하였다. 피콜-하이파크(Ficoll-hypaque)는 ICN(Aurora, OH), 및 카르디날 사이언티픽(Cardinal Scientific, Santa Fe, NM) 및 어큐레이트 케미칼스 앤드 사이언티픽(Accurate Chemicals and Scientific, Westerbury, NY)으로부터 구입하였다. 엔도톡신 (리포폴리사카라이드; 이. 콜라이(E. coli) K235)는 리스트 바이올로지칼스(List Biologicals, Campbell, CA)로부터 입수하였다. 행크스 평형화 염용액 (Hanks balanced salt solution; HBSS) 및 리물루스 아메바양세포 용해물 시험키트 (limulus amebocyte lysate assay kit)는 바이오 위태커(BioWittaker, Walkersville, MD)로부터 입수하였다. 인간 혈청알부민 (HSA)은 커터 바이올로지칼 (Cutter Biological, Elkhart, IN)로부터 입수하였다. 재조합체 인간 종양괴사인자-알파는 디아니폰 파마슈티칼 컴퍼니 리미티드(Dianippon Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japan)로부터 공급받았다. ZM241385 (4-(2-[7-아미노-2-(2-푸릴)-[1,2,4]-트리아졸로[2,3-a][1,3,5]트리아진-5-일아미노]에틸)페놀)는 시몬 파우쳐(Simon Poucher, Zeneca Pharmaceuticals, Cheshire, UK)로부터 선물을 받았다. 모액 (DMSO 중의 1 mM 및 10 mM)은 -20℃에서 제조하여 저장하였다.

B. 인간 호중구 제조

5개의 호중구 당 < 1개의 혈소판 및 < 50 pg/㎖ 엔도톡신 (리물루스 아메바양세포 용해물 시험)을 함유하는 정제된 호중구 (~98% 호중구 및 트립판 블루 배제에 의해 > 95% 생존가능)는 일단계 피콜-하이파크 분리방법에 의해서 표준 헤파린 처리된 10 U/㎖) 정맥혈액으로부터 수득하였다 (A. Ferrante 등,J. Immunol. Meth., 36, 109 (1980)).

C. 프라이밍되고 자극된 인간 호중구로부터 염증 반응성 산소종의 방출-화학발광

호중구 산화활성의 척도인 루미놀-증진된 화학발광은 슈퍼옥사이드 생성 및 라이소좀성 과립효소 마이엘로퍼옥시다제의 가동화 (mobilization) 둘다에 따라 좌우된다. 빛은 활성화된 호중구에 의해 생성된 불안정한 고에너지 산소종으로부터 방출된다. 정제된 호중구 (5-10×10⁵/㎖)를 진탕수욕 중 37℃에서 롤리프람의 존재 또는 부재하 및 종양괴사인자-알파 (1 U/㎖)의 존재 또는 부재하에서 DWH-146a, DWH-146e, CGS21680 또는 JMR193의 존재 또는 부재하에 0.1% 인간 혈청알부민 (1 ㎖)을 함유하는 행크스 평형화 염용액 중에서 30분 동안 배양하였다. 그후, 루미놀 (1×10^-4M) 증진된 f-met-leu-phe (1 mcM) 자극된 화학발광을 37℃에서 2-4 분 동안 크로노로그 광도측정계 (Chronolog™ Photometer; Crono-log Corp., Havertown, PA)로 판독하였다. 화학발광은 종양괴사인자-알파가 존재하고 DWH, JMR 또는 롤리프람이 부재하는 샘플과 비교하여 방출된 상대적 피크광 (= 커브의 높이)으로서 기록한다.

D. 결과

도 2에서 보는 바와 같이, JMR193 및 DWH-146e는 둘다 루미놀-증진된 화학발광에 의해서 측정할 때 종양괴사인자-알파로 프라이밍되고 f-met-leu-phe로 자극된 인간 호중구 산화활성을 아데노신 A_2A수용체 작용제 CGS21680에 비해서 더욱 효과적으로 저하시킨다. 수평축은 CGS21680, DWH-146a, DWH-146e 또는 JMR193의 농도 (log nM)를 나타낸다. 수직축은 생성된 최고 인간 호중구활성을 종양괴사인자-알파에 의해서 프라이밍되지 않은 대조샘플과 비교하여 루미놀-증진된 화학발광에 의해서 측정한 것으로서, 자극에 따른 반응성 산소종의 방출의 상대적 양으로 나타낸 것이다. 평균치 SEM (n=4-5 별개의 실험).

도 2에서 수평축 아래의 데이타는 인간 호중구 활성을 감소시키는 EC₅₀을 나타낸 것이다 (도 2에서의 데이타를 기초로 함). 평균치 SEM (n=4-5 별개의 실험). *p < 0.05 CGS21680에 비해 저하된 IC₅₀.

JMR193 및 DWH-146e는 1 nM 미만의 EC₅₀값 (각각 0.8 및 0.3 nM)으로 자극된 호중구 산화적 방출을 감소시켰다. 반대로, 유리산 A_2A아데노신 수용체 작용제 DWH-146a 및 CGS21680은 산화적 방출을 억제하는데 효과가 없었다 (각각 53 및 9 nM; 도 2). 자극된 호중구 산화적 방출의 DWH-146e 억제는 선택적 A_2AAR 길항제 ZM241385에 의해서 길항되었다.

도 3에서 보는 바와 같이, 롤리프람 (100 nM)과 함께 사용한 JMR193 (1 nM)은 자극에 따른 반응성 산소종의 방출을 상승적으로 저하시켰다. 인간 호중구는 종양괴사인자-알파 (1 U/㎖)로 프라이밍시키고, f-met-leu-phe (1 μM)로 자극시켰다. 수직축은 루미놀-증진된 화학발광에 의해서 측정된 것으로 산화활성의 억제율 (%)을 나타낸다. 평균치 SEM (n=4 별개의 실험, *p < 0.05 상가적 활성에 비해서 JMR193과 롤리프람 사이의 상승작용).

도 4에서 보는 바와 같이, 고도로 선택적인 A_2A아데노신 수용체 길항제 ZM241385(100 nM)(ZM)는 루미놀-증진된 화학발광에 의해서 측정된 것으로 JMR193(10 nM)에 의해 억제된 인간 호중구 산화활성에 대해 반대작용을 하였다. 4회의 별개의 실험의 평균치 SEM. *p = 0.0004 ZM241385는 JMR193 억제된 산화활성에 대해 반대작용을 하였다.

E. 인간 호중구 [cAMP] 및 생물학적 표면에 대한 호중구 부착

24 웰 조직배양 플레이트를 5% CO₂중의 37℃에서 밤새 인간 피브리노겐 (1.5% 중탄산나트륨 중의 5 ㎎/㎖; 0.5 ㎖/웰; Sigma Chemical)으로 피복시켰다. 호중구 (3-4×10⁶/0.5 ㎖/샘플)를 피복된 플레이트의 웰 내에서 재조합체 인간 TNFα (10 U/㎖), DWH-146e (3-300 nM), 롤리프람 (300 nM) 및/또는 ZM241385 (100 nM)의 존재 및 부재하에, 0.1% HSA 및 ADA (1 U/㎖)를 함유하는 HBSS 0.5 ㎖ 중에서 45분 동안 배양하였다. 배양한 후에, 웰에 HCl (0.2 N) 0.5 ㎖을 가하고, 실온에서 45분 동안 더 배양하여 cAMP를 추출하였다. 그후, 샘플을 2분 동안 마이크로퍼지 (microfuge) 내에서 원심분리시켜 세포파편을 제거하였다. 0.5 ㎖ 샘플들을 cAMP 분석을 위해서 동결시켰다 (B. Brooker 등,Science, 194, 270 (1976)). 웰을 노르말 식염수(normal saline)로 2회 세척하고, 나머지 단일층을 실온에서 SDS를 함유하는 0.2 N NaOH 0.2 ㎖로 2시간 동안 분해시켰다. 그후, 단백질 샘플을 상대적 PMN 부착을 측정하는 추후의 단백질 분석을 위해서 동결 (-70℃)시켰다 (K.P. Stowell 등,Anal. Biochem.85, 572 (1978)).

결과

DWH-146e (30-300 nM)는 단독으로 및 롤리프람 (300 nM)과 함께 상승적으로인간 호중구 cAMP 함량을 증가시켰으며, 롤리프람과 함께 상승적으로 피브리노겐-피복된 표면에 대한 호중구 부착을 저하시켰다 (도 5). 호중구 cAMP 생성 및 부착에 대한 DWH-146e (300 nM)+롤리프람 (300 nM)의 효과는 선택적 A_2A아데노신 수용체 길항제인 ZM241385 (ZM; 100 nM)에 의해 저해되었다. 5회의 별개 실험의 평균치 SEM. *p < 0.05 DWH-146e가 부재하는 경우와 비교하여 증가된 호중구 [cAMP]. **p < 0.05 DWH-146e가 부재하는 경우와 비교하여 저하된 호중구 부착.

F. 부착성 인간 호중구 산화활성

방법: 상기 E 항의 방법을 변형시킨 방법을 사용하여 피콜-하이파크 분리로 얻은 호중구 (2×10⁶/㎖)를 0.1% 인간혈청알부민 및 아데노신 데아미나제 (1 U/㎖), 롤리프람 (300 nM) 및 DWH-146e (3-300 nM)를 함유하는 행크스 평형화 염용액 0.45 ㎖ 중에서 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 배양한 후에, 인간 종양괴사인자-알파 (1 U/㎖)의 존재 및 부재하에서 사이토크롬 C (120 μM) 및 카탈라제 (0.062 ㎎/㎖)를 가하고, 세포현탁액의 200 ㎕ 분취액을 인간 피브리노겐으로 밤새 피복시킨 96 웰 편평-바닥 조직배양 플레이트의 중복웰에 즉시 옮겼다. 샘플의 흡광도는 적합한 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (200 U/㎖) 샘플에 대비해서 550 ㎚에서 판독하였다.

G. 결과

도 6에서 보는 바와 같이, 피브리노겐-피복된 표면 상에서 종양괴사인자-알파 (TNF)로 자극된 부착성 인간 호중구 슈퍼옥사이드 방출의 억제는 롤리프람 (300nM) 및 DWH-146e에 의해서 이루어졌다. DWH-146e는 부착성 호중구의 산화적 방출을 저하시켰으며, 그 자체로는 호중구 산화활성에 영향을 미치지 못하는 롤리프람의 존재하에서 산화적 방출을 상승적으로 저하시켰다. 수평축은 DWH-146e의 농도를 nM로 나타낸 것이고, 수직축은 사이토크롬 c 환원에 의해서 측정된 것으로서 호중구에 의해서 방출된 슈퍼옥사이드의 양을 나타낸 것이다. 여기에서, DWH-146e와 타입 IV PDE 억제제인 롤리프람은 뚜렷한 상승작용을 나타내어 종양괴사인자-알파로 자극된 부착성 인간 호중구 산화활성을 저하시켰다. 4-5회의 별개의 실험으로부터의 반복된 값의 평균치 SEM. *p < 0.05 DWH-146e가 부재하는 경우와 비교하여 저하된 슈퍼옥사이드 방출. **p < 0.05 롤리프람은 존재하고 DWH-146e는 부재하는 경우와 비교하여 저하된 슈퍼옥사이드 방출.

실시예 18

DWH-146e를 사용한 신장에서의 허혈/재관류 (I/R) 손상의 치료

DWH-146e 유도된 A_2A아데노신 수용체 활성화가 랫트에서 I/R 손상이 있은지 24 및 48시간 째에 혈장 크레아티닌을 감소시키는지 여부를 측정하기 위해서, 랫트 신장을 45분 허혈 및 24 또는 48시간의 재관류에 적용시켰다. DWH-146e (0.004 ㎍/㎏/분) 또는 비히클은 I/R하기 5시간 전에 시작하여 미니펌프 (minipump)를 통해서 연속적으로 투여하였다. 도 7에서 보는 바와 같이, DWH-146e는 24 및 48시간에 각각 DWH-146e로 치료된 7/7 랫트 (P < 0.05) 및 6/6 랫트 (P <0.001)에서 혈장 크레아티닌을 현저하게 저하시켰다.

I/R에 적용된 랫트에서 혈장 크레아티닌의 감소에 대한 DWH-146e의 효과가 A_2A-수용체 매개된 것인지 여부를 결정하기 위해서, 랫트 신장을 45분 허혈에 이어서 48시간 재관류시켰다. DWH-146e (0.004 ㎍/㎏/분)은 허혈시키기 5시간 전에 시작하여 미니펌프를 통해서 연속적으로 투여하였다. 도 8에서 보는 바와 같이, 신장기능에 있어서의 개선은 A_2A길항제 ZM-241385 (0.003 ㎍/㎏/분- DWH-146e와 비교하여 동몰량 송달속도)에 의해서 역전되었다 (*P < 0.001 비히클 대 DWH; **P < 0.05 DWH 대 DWH/ZM. 비히클, DW의 경우에 N = 5; DWH/ZM의 경우에 N = 6, ANOVE에 이어서 본페로니 보정 (Bonferroni correction)).

DWH-146e는 혈류역학적 효과를 갖지 않는 농도에서 신장부종, 괴사 및 내부 수질 내의 적혈구 저류를 예방한다.

DWH-146e (0.01 ㎍/㎏/분, 피하, 48시간)에 의해 제공된 신장손상에 대한 예방은 혈관내피에 대한 호중구 부착의 현저한 억제와 상관관계가 있었다. DWH-146e에 의한 호중구와 혈관내피 사이의 상호작용의 억제는 적어도 부분적으로는 신장손상에 대한 예방의 원인이 될 수 있다.

A_2A-AR 활성화가 뉴로루시다 (Neurolucida)™를 사용하여 I/R에 적용시킨 랫트의 외부 수질에서 호중구를 감소시키는지 여부를 측정하기 위하여, 신장을 100×배율로 검경하고 전체 신장을 적출하였다. PMN은 250× 배율로 신장 절편을 검경하여 계수하였다. 신장 절편을 현미경 하에서 검경되는 광학 프레임(optical frame) 상에 올려 놓고, 각 프레임 내의 모든 PMN을 계수하였다. 이 계는 PMN이한번 이상 계수되는 것을 방지한다. 도 9에서 보는 바와 같이, 호중구 밀도는 비히클의 경우에는 15.65/㎟ 이고 DWH-146e 처리된 경우에는 3.02/㎟이었다.

실시예 19

폐 재관류손상에 대한 DWH-146e의 영향

A. 방법

단리되고 전혈액-관류되고 통기된 토끼 폐모델을 사용하였다. 공여체 토끼는 폐동맥성 PGE₁주사 및 유로-콜린스(Euro-Collins) 보존용액 플러쉬한 후에 폐를 수확하였으며, 폐는 18시간 동안 4℃에서 보존하였다. 그룹 I의 폐 (n=9)는 대조피검체로서 제공되었다. 그룹 II의 폐 (n=9)는 우선 백혈구-고갈 필터를 통해서 통과시킨 전혈액으로 재관류시켰다. 그룹 III (n=9)에서는 DWH-146e를 재관류하기 직전에 혈액 재관류액에 가하여 (25 ㎍/㎏), 재관류 기간 동안 계속해서 투여하였다 (1 ㎍/㎏/분). 모든 폐는 30분 동안 재관류시켰으며, 폐동맥압 (PAP), 폐혈관저항 (PVR), 기도적응성 (airway compliance; CPL) 및 동맥 산소화를 기록하였다. 마이엘로퍼옥시다제 활성(MPO)을 기록하여 호중구 분리를 정량화하였으며, 습식/건식 중량비를 측정하여 폐부종을 입증하였다.

B. 결과

그룹 II 및 그룹 III에서 동맥 산소화는 재관류시킨지 30분 후에 그룹 I의 경우보다 현저하게 더 높았다 (514.27±35.80 및 461.12±43.77 대 91.41±20.58 mmHg, p < 0.001). 도 10에서 보는 바와 같이, 그룹 III의 폐는 재관류 중에 pO₂에서 진행성 침습을 나타내었다. 그룹 II 폐에서 백혈구 고갈은 조기 재관류에서 동맥 산소화를 개선시켰다. *p = 0.004 (*그룹 II 대 그룹 I 및 III); **p < 0.001 (그룹 II 및 III 대 그룹 I).

도 11에서 보는 바와 같이, 그룹 II에서 평균 PVR은 대조용 폐와 비교했을 때 현저하게 감소되었다 (*p < 0.001). 그룹 III 폐의 PVR은 백혈구-고갈된 혈액에 의해 재관류를 수행한 경우의 폐보다 현저하게 더 낮았다 (**p < 0.001 대 그룹 I 및 II). 페혈관저항은 그룹 II 및 그룹 I (31,057±1743 및 36,911±2173 다인ㆍsㆍ㎝^-5, p < 0.001) 둘다와 비교하여 그룹 III에서 현저하게 감소하였다 (22,783±357 다인ㆍsㆍ㎝^-5). 기도적응성은 그룹 I과 비교하였을 때 그룹 II 및 III에서 개선되었다 (1.68±0.08 및 1.68±0.05 대 1.36±0.13, p=0.03). 그룹 III에서 미소혈관 투과성은 그룹 I에서의 조직 gm당 165.70±21.83 ng 에반스-블루 염료에 비해서 106.82±17.09로 감소하였다 (p=0.05). 도 12에서 보는 바와 같이, 그룹 III에서의 마이엘로퍼옥시다제 활성은 그룹 I에서보다 현저하게 더 낮았다 (*p=0.03). MPO=마이엘로퍼옥시다제. 그룹 III 마이엘로퍼옥시다제 활성은 그룹 I에서의 88.70±18.69 △OD/gm/분과 비교하여 39.88±4.87이었으며, 그룹 II 마이엘로퍼옥시다제 활성은 56.06±7.46이었다.

C. 고찰

DWH-146e는 폐 호중구 분리를 감소시켰으며, 폐 그래프트 기능을 현저하게 개선시켰다. 호중구는 재관류 손상의 염증성 다단계 반응의 중요한 성분이며, 그들의 공급원에는 순환혈액 및 폐 그래프트 자체 둘다가 포함될 수 있다. 선택적 아데노신-A_2A활성화는 호중구-매개 염증 반응을 차단하며, 이식 후의 폐 재관류 손상을 감소시킨다.

광현미경 하에서, 그룹 I의 대조군 폐는 18시간의 허혈성 저장 및 30분의 재관류 후에 폐포 공극에서 심각한 백혈구 침윤 및 부종 형성을 나타내었다. 그룹 II에서의 백혈구-고갈된 혈액으로 재관류시킨 폐 및 그룹 III의 폐 (재관류 중에 DWH-146e를 투여함)에서는 이러한 침윤이 훨씬 덜 하였다.

실시예 20

동맥손상 후에 신동맥내막 형성에 대한 DWH-146e의 영향

염증성 사이토킨의 방출에 의한 백혈구 활성화는 경피적인 관상개입 후에 나타나며, 재발협착증에서 역할을 나타낼 수 있다. 마우스에서, 총경동맥의 결찰 후에 완전한 내피성 라이닝의 존재하에서 강건한 신동맥내막 형성이 나타난다. 이러한 모델을 사용하여 C57/BL6 마우스를 경동맥 결찰의 시점에서 삼투성 펌프를 통한 DWH-146e (n=7) 또는 비히클 (n=8)의 7일 주입에 대해 무작위화시켰다.

경동맥 결찰 후 14일 째에, 조직형태측정으로 대조군과 비교한 처리된 동물에서 신동맥내막 면적 (0.005±0.004 ㎟ 대 0.021±0.014 ㎟, p=0.02) 및 신동맥내막 대 중막 면적비 (0.13±0.07 대 0.64±0.44, p=0.01)에 있어서의 현저한 감소가 입증되었다. 중막 면적은 두가지 그룹에서 유사하였다 (0.034±0.007 ㎟ 대 0.036±0.009 ㎟, p=0.81). 신동맥내막 성장을 제한하는 데 있어서 이러한 잇점은 28일까지 지속되었다. 도 13은 마우스 LCCA 모델에서 신동맥내막 성장을 억제하는 DWH-146e의 효과를 요약한 것이다. 이들 실험은 마우스 경동맥 결찰 모델에서 DWH-146e에 의한 장기간의 A_2A자극(7일)이 아마도 백혈구 활성화 및 기능에 대한 그의 효과를 통해서 적어도 21일 동안 신동맥내막 형성에 있어서의 현저한 감소를 야기시켰음을 입증한다.

실시예 21

엔도톡신으로 자극된 인간 단핵세포 TNFα 방출의 억제

A. 재료

피콜-하이파크는 ICN(Aurora, OH) 및 카르디날 사이언티픽(Santa Fe, NM) 및 어큐레이트 케미칼스 앤드 사이언티픽 (Westbury, NY)으로부터 구입하였다. 엔도톡신 (리포폴리사카라이드; 이. 콜라이(E. coli) 0111B4)는 리스트 바이올로지칼스 (Campbell, CA)로부터 입수하였다. 행크스 평형화 염용액 (HBSS) 및 리물루스 아메바양세포 용해물 시험키트는 바이오 위태커(Walkersville, MD)로부터 입수하였다. 인간 혈청알부민 (HSA)은 커터 바이올로지칼(Elkhart, IN)로부터 입수하였다. ZM241385 (4-(2-[7-아미노-2-(2-푸릴)[1,2,4]-트리아졸로[2,3-a][1,3,5]트리아진-5-일아미노]에틸)페놀)는 시몬 파우쳐 (Cheshire, UK)로부터 선물을 받았다. 모액 (DMSO 중의 1 mM 및 10 mM)은 -20℃에서 제조하여 저장하였다.

B. 정제된 인간 부착성 단핵세포에 의한 TNFα의 생산

방법:

단핵세포가 풍부한 단일층 (>65% 단핵세포)은 피콜-하이파크 분리 (A. Ferrante 등,J. Immunol. Meth., 36, 109 (1980))로부터 얻은 단핵성 백혈구 분획 (5×10⁵/㎖) 1 ㎖를 24 웰 조직배양 플레이트의 웰에서 배양 (1시간; 37℃; 5% CO₂)함으로써 제조하였다. 비-부착성 백혈구는 세척하여 제거하고, 배양매질 (0.1% 인간 혈청알부민, 아데노신 데아미나제 [5 U/㎖] 및 1% 열-불활성화된 자가유래 혈청을 함유하는 행크스 평형화 염용액 1 ㎖)을 부착성 단핵세포를 함유하는 웰에 가하였다. 언급한 바와 같이, 다음의 물질들이 첨가되었다: (1) 엔도톡신 (100 ng/㎖) 및 A_2AAR 선택적 길항제 ZM241385 (100 nM) 및 (2) A_2A아데노신 수용체 선택적 작용제 JMR193 (1-1000 nM), DWH-146e (1-1000 nM) 및 CGS21680 (10-1000 nM). 그후, 샘플을 4시간 동안 배양하고 (37℃; 5% CO₂), 상등액을 수거하였다. 현탁된 세포는 원심분리에 의해서 제거하고, 세포-비함유 샘플을 동결시켰다 (-70℃). THFα는 ELISA 키트 (Coulter/Immunotech, Miami, FL)에 의해 세포-비함유 상등액 (n=6)에서 시험하였다.

C. 결과

도 10과 도 14에서 보는 바와 같이, A_2A아데노신 수용체 작용제는 TNFα의 엔도톡신으로 자극된 부착성 단핵세포 생산을 저하시켰다. A_2AAR 선택적 길항제 ZM241385 (100 nM)는 TNFα 생산에 대한 JMR193의 효과에 대해 길항하였다(도 15).

따라서, DWH-146e와 JMR193은 A_2A아데노신 수용체에 대한 작용제 결합에 의존하는 기전에 의해서 인간 단핵세포에 의한 LPS 엔도톡신으로 자극된 TNFα 생산을 저하시켰다.

실시예 22

쥐 복막염 모델에서 DWH-146e의 활성

실험적 복막염을 사용한 예비실험에는 염증의 강력한 자극으로서 자이모산 (zymosan; Zym)의 주사가 포함된다 (Y. Zhang 등,Eur. J. Pharmacol., 313, 237 (1996)). 도 16에서 보는 바와 같이, 자이모산을 주사한 후에 노이바우어 혈구계 (Neubauer hemocytometer)에서 측정할 때 평균 백혈구 농도는 7,325±1,893/㎣이었다. 자이모산을 투여하기 1시간 전에 DWH-146e를 2.5 ㎍/㎏의 용량으로 복강내 주사하면 6시간 후에 2,012±374/㎣의 평균±SEM 백혈구 농도로 복막염의 발생을 억제하였다 (p < 0.05). 따라서, 이들 연구는 A_2AAR이 자이모산 공격 후에 복막 내로의 PMN 관통을 매개하는 기구임을 입증한다.

실시예 23

JMR193의 항염효과에 의해 매개되는 심장보호

본 발명의 화합물은 관상동맥의 혈액 공급을 반복적으로 폐색시킴으로써, 관상혈류가 일시적으로 차단되는 기간이 반복된 후에 나타나는 심장손상 형태인 심근 스터닝 (myocardial stunning)을 유도하여 시험하였다.

A. 폐색-재관류 사이클 4회의 영향

일군의 개의 좌전방 하행(left anterior descending; LAD) 관상동맥을 단리하여 스네어 폐색기(snare occluder)로 둘러쌌다. 개의 LAD 동맥 혈액공급은 5분 동안 4회 폐색시켰다. 각 폐색 후에 혈류는 10분 동안 회복시켰다. 6마리의 개로 구성된 한 그룹은 각 폐색기간 후에 실시예 15에서 제조된 아세테이트 화합물 (JMR193)을 함유하는 용액 (0.01 ㎍/㎏/분)을 주입시켰다. 6마리 개의 두번째 그룹은 비히클 (담체)을 함유하는 용액을 주입하였다. 최종 폐색-재관류 사이클이 끝난 후에, 동물의 심장기능을 3시간 동안 모니터하였다.

결과는 도 17과 도 18에 설명되어 있다. 도 17은 6마리의 대조군 개에서 수축기 좌심실 비후화 반응을 나타낸다. 심장 비후화는 마지막 폐색시킨지 3시간 후에 약 50% 감소되었다. 도 18은 기준기간 동안에 시작하여 실험 과정 내내 시험 화합물인 JMR193 (0.01 ㎍/㎏/분)을 정맥내 주입한 6마리의 개에게서의 LV 비후화 반응을 나타낸다. JMR193 주입의 경우 심장기능은 재관류시킨지 90분 후 정도의 이른 시간에 거의 정상으로 복귀되었다.

B. 폐색-재관류 사이클 10회의 영향

추가의 2군의 개를 10회 (4회가 아님)의 폐색-재관류 사이클에 적용시키는데, 여기에서 각 폐색은 5분씩이고, 5분의 재관류가 중간에 삽입된다. 본 실시예에서, 2마리의 동물에게는 각 폐색기간 후에 실시예 15에서 제조된 아세테이트 화합물 (JMR193)을 함유하는 용액 (0.01 ㎍/㎏/분)을 주입시켰다. 또 다른 3마리의 동물에게는 비히클 (담체)을 함유하는 용액을 주입하였다. 최종 폐색-재관류 사이클이 끝난 후에, 동물의 심장기능을 3시간 동안 모니터하였다.

결과는 도 19와 도 20에 설명되어 있다. 도 19는 3마리의 대조군 개에서 보이는 수축기 좌심실 비후화 반응을 도시한다. 이것은 실시예 23A에서보다 더 심한 심장상해였으며, 그 결과 LV 비후화는 재관류시킨 후에 초기에 전혀 존재하지 않았고 3시간 동안 무동성(akinetic)으로 유지되었다. 도 20은 기준기간 동안에 시작하여 실험 과정 내내 시험 화합물인 JMR193 (0.01 ㎍/㎏/분)을 정맥내 주입한 2마리의 개에게서의 LV 비후화 반응을 나타낸다. 대조군과 비교하여, JMR193을 주입한 개는 재관류시킨 직후에 심장기능에 있어서 유의적이며 뚜렷한 개선을 나타내었고, 이것은 3시간 동안 지속되었다.

C. 패색-재관류 중에 호중구 이용에 대한 아세테이트 화합물 JMR193의 영향

몇마리의 동물에게 방사성표지된 호중구를 투여하였다 (호중구는 개의 혈액으로부터 분리하여^99mTc를 함유하는 화합물과 함께 배양하여, 개에게 재주사하였다).^99mTc-표지된 호중구는 4회의 허혈-재관류 사이클에 이어서 재관류 구역에서 염증의 수준을 측정하기 위한 마커로서 정맥내로 투여하였다. 폐색-재관류 사이클로로 인한 염증은 방사성 호중구의 부착을 야기시켰으며, 감마-카메라로 정량하였다. 호중구 부착은 JMR193에 의해서 억제되었다. 결과는 도 21에 설명하였으며, 여기에서 비히클만으로 처리된 개 (검은색 바아)에서^99mTc-표지된 호중구의 국재화는 JMR193 처리된 (줄무니 바아) 개에서보다 더 크다. 따라서, JMR193 주입에 의해서 야기된 중앙 허혈구역에서의 방사성 표지된 호중구의 감소는 (*) 심장염증의 감소를 설명하는 것이다.

실시예 23A 및 23B에 기술된 연구는 심장염증이 심근 스터닝을 야기시키는데유의적인 손상적 역할을 나타낸다는 것을 시사한다. 또한, 예를 들어 JMR193과 같은 아데노신 A_2A수용체 작용제의 투여는 약한 스터닝을 예방하거나 (도 17 및 도 18), 또는 심각한 스터닝에 수반하는 심근기능부전을 약화시킨다 (도 19 및 도 20).

모든 문헌, 특허 및 특허서류들은 개별적으로 참고로 포함된 것 처럼 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 발명은 구체적이며 바람직한 다양한 구체예 및 기술에 관하여 기술하였다. 그러나, 본 발명의 의의 및 범주 내에서 다수의 변형 및 개조가 이루어질 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:

<화학식 I>

상기 식에서,

(a) 각각의 R은 개별적으로 수소, C₁-C₆알킬, C₃-C₇사이클로알킬, 페닐 또는 페닐(C₁-C₃)-알킬이고;

(b) X는 -CH₂OH, -CO₂R², -OC(O)R²또는 C(O)NR³R⁴이며;

(c) R², R³및 R⁴는 각각 개별적으로 H, C_1-6-알킬; 1-3개의 C_1-6-알콕시, C₃-C₇사이클로알킬, C_1-6-알킬티오, 할로겐, 하이드록시, 아미노, 모노(C_1-6-알킬)아미노, 디(C_1-6-알킬)아미노 또는 C_6-10-아릴 (여기에서 아릴은 1-3개의 할로겐, C_1-6-알킬, 하이드록시, 아미노, 모노(C_1-6-알킬)아미노 또는 디(C_1-6-알킬)아미노에 의해서 치환될 수 있음)에 의해서 치환된 C_1-6-알킬; C_6-10-아릴; 또는 1-3개의 할로겐, 하이드록시, 아미노, 모노(C_1-6-알킬)아미노, 디(C_1-6-알킬)아미노 또는 C_1-6-알킬에 의해서 치환된 C_6-10-아릴이고;

(d) R¹은 (X-(Z)-)_n[(C₃-C₁₀)사이클로알킬]-(Z')-이며, 여기에서 Z 및 Z'는 개별적으로 1-3개의 S 또는 비퍼옥사이드 O가 임의로 개재된 (C₁-C₆)알킬이거나 존재하지 않으며, n은 1 내지 3이다.
제1항에 있어서, X가 -CH₂OH 또는 -C(O)NR³N⁴인 화합물.
제2항에 있어서, R³가 H이고 R⁴가 (C₁-C₄)알킬인 화합물.
제1항에 있어서, 각각의 R이 H 또는 (C₁-C₄)알킬인 화합물.
제1항에 있어서, Z'가 -CH₂- 또는 -CH₂-CH₂-인 화합물.
제5항에 있어서, Z가 -CH₂- 또는 -CH₂-CH₂-인 화합물.
제1항에 있어서, R¹이 사이클로헥실 또는 사이클로펜틸을 포함하는 화합물.
제7항에 있어서, X가 (C₁-C₄)알콕시카보닐, C(O)NR³R⁴또는 아세톡시메틸인 화합물.
제7항에 있어서, X가 카복시인 화합물.
제7항에 있어서, X-Z와 Z'가 트랜스 구조인 화합물.
제1항에 있어서, R이 H이고, X가 에틸아미노카보닐이며, R¹이 2-(4-메톡시카보닐-사이클로헥실메틸)에티닐 또는 2-(4-카복시-사이클로헥실메틸)에티닐인 화합물.
제1항에 있어서, R이 H이고, X가 에틸아미노카보닐이며, R¹이 2-(4-아세톡시메틸-사이클로헥실메틸)에티닐인 화합물.
[4-(3-{9-(4S,5S,2R,3R)-5-(N-에틸카바모일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-6-아미노퓨린-2-일}프로프-2-이닐)사이클로헥실]메틸 아세테이트.
[(2S,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-2-{3-[4-(하이드록시메틸)사이클로헥실]프로프-2-이닐}퓨린-9-일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-N-에틸카복스아미드.
메틸-4-(3-{9-[(4S,5S,2R,3R)-5-(N-에틸카바모일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-6-아미노퓨린-2-일)}프로프-2-이닐)사이클로헥산 카복실레이트.
4-(3-{9-[(4S,5S,2R,3R)-5-(N-에틸카바모일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-6-아미노퓨린-2-일)}프로프-2-이닐)사이클로헥산 카복실산.
의약적 치료에서 사용하기 위한 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:

<화학식 I>

상기 식에서,

(a) 각각의 R은 개별적으로 수소, C₁-C₆알킬, C₃-C₇사이클로알킬, 페닐 또는 페닐(C₁-C₃)-알킬이고;

(b) X는 -CH₂OH, -CO₂R², -OC(O)R²또는 C(O)NR³R⁴이며;

(c) R², R³및 R⁴는 각각 개별적으로 H, C_1-6-알킬; 1-3개의 C_1-6-알콕시, C₃-C₇사이클로알킬, C_1-6-알킬티오, 할로겐, 하이드록시, 아미노, 모노(C_1-6-알킬)아미노, 디(C_1-6-알킬)아미노 또는 C_6-10-아릴 (여기에서 아릴은 1-3개의 할로겐, C_1-6-알킬, 하이드록시, 아미노, 모노(C_1-6-알킬)아미노 또는 디(C_1-6-알킬)아미노에 의해서 치환될 수 있음)에 의해서 치환된 C_1-6-알킬; C_6-10-아릴; 또는 1-3개의 할로겐, 하이드록시, 아미노, 모노(C_1-6-알킬)아미노, 디(C_1-6-알킬)아미노 또는 C_1-6-알킬에 의해서 치환된 C_6-10-아릴이고;

(d) R³및 R⁴는 각각 개별적으로 수소, C_3-7-사이클로알킬, 또는 R²의 의미이며;

(e) R¹은 (X-(Z)-)_n[(C₃-C₁₀)사이클로알킬]-(Z')-이고, 여기에서 Z 및 Z'는 개별적으로 1-3개의 S 또는 비퍼옥사이드 O가 임의로 개재된 (C₁-C₆)알킬이거나 존재하지 않으며, n은 1 내지 3이다.
의약적 치료가 염증 반응의 억제인 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 화합물.
제17항에 있어서, X가 -CH₂OH 또는 -C(O)NR³N⁴인 화합물.
제19항에 있어서, R³가 H이고 R⁴가 (C₁-C₄)알킬인 화합물.
제17항에 있어서, 각각의 R이 H 또는 (C₁-C₄)알킬인 화합물.
제17항에 있어서, Z'가 -CH₂- 또는 -CH₂-CH₂-인 화합물.
제17항에 있어서, Z가 -CH₂- 또는 -CH₂-CH₂-인 화합물.
제17항에 있어서, R¹이 사이클로헥실 또는 사이클로펜틸을 포함하는 화합물.
제24항에 있어서, X가 (C₁-C₄)알콕시카보닐 또는 아세톡시메틸인 화합물.
제24항에 있어서, X가 카복시인 화합물.
제24항에 있어서, X-Z와 Z'가 트랜스 구조인 화합물.
제17항에 있어서, R이 H이고, X가 에틸아미노카보닐이며, R' (R1)이 2-(4-메톡시카보닐-사이클로헥실메틸)에티닐 또는 2-(4-카복시-사이클로헥실메틸)에티닐인 화합물.
제17항에 있어서, R이 H이고, X가 에틸아미노카보닐이며, R²(R1)이 2-(4-아세톡시메틸-사이클로헥실메틸)에티닐인 화합물.
제17항에 있어서, [4-(3-{9-(4S,5S,2R,3R)-5-(N-에틸카바모일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-6-아미노퓨린-2-일}프로프-2-이닐)사이클로헥실]메틸 아세테이트인 화합물.
제17항에 있어서, [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-2-{3-[4-(하이드록시메틸)사이클로헥실]프로프-2-이닐}퓨린-9-일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-N-에틸카복스아미드인 화합물.
제17항에 있어서, 메틸-4-(3-{9-[(4S,5S,2R,3R)-5-(N-에틸카바모일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-6-아미노퓨린-2-일)}프로프-2-이닐)사이클로헥산 카복실레이트인 화합물.
제17항에 있어서, 4-(3-{9-[(4S,5S,2R,3R)-5-(N-에틸카바모일)-3,4-디하이드록시옥솔란-2-일]-6-아미노퓨린-2-일)}프로프-2-이닐)사이클로헥산 카복실산인 화합물.
제17항에 있어서, 의약적 치료가 추가로 타입 IV 포스포디에스테라제 억제제의 사용을 포함하는 화합물.
제17항에 있어서, 억제제가 롤리프람인 화합물.
제18항에 있어서, 염증 반응이 허혈에 기인하는 화합물.
제18항에 있어서, 염증 반응이 아테롬성경화증에 기인하는 화합물.
제18항에 있어서, 염증 반응이 자가면역질환에 기인하는 화합물.
제18항에 있어서, 염증 반응이 허혈/재관류 손상에 기인하는 화합물.
제18항에 있어서, 염증 반응이 심장, 신장 또는 폐에 존재하는 화합물.
제18항에 있어서, 염증 반응이 졸중, 외상성 뇌손상 또는 척수손상에 기인하는 화합물.
제18항에 있어서, 염증 반응이 기관, 조직 또는 세포이식에 기인하는 화합물.
제18항에 있어서, 염증 반응이 감염에 기인하는 화합물.
제18항에 있어서, 염증 반응이 피부 질환에 기인하는 화합물.
제18항에 있어서, 염증 반응이 혈관형성술, 스텐트 설치, 내단락 설치 또는 그래프트에 기인하는 화합물.
제18항에 있어서, 염증 반응이 앨러지성 질환에 기인하는 화합물.
제18항에 있어서, 염증 반응이 소모성 질병에 기인하는 화합물.
제18항에 있어서, 염증 반응이 면역억제 요법에 기인하는 화합물.
염증 반응을 치료하는데 유용한 의약을 제조하기 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
제49항에 있어서, 의약이 타입 IV 포스포디에스테라제 억제제를 포함하는 용도.
제50항에 있어서, 포스포디에스테라제 억제제가 롤리프람인 용도.
제50항에 있어서, 의약이 액체 담체를 포함하는 용도.
제50항에 있어서, 의약이 비경구 투여에 적합한 용도.