SK10972001A3 - Zlúčeniny a ich použitie na liečbu zápalovej odpovede - Google Patents

Description

Oblasť vynálezu

Predložený vynález sa týka spôsobov a prostriedkov na predchádzanie tkanivového poškodenia v dôsledku zápalovej aktivity.

Doterajší stav techniky

Predložený vynález sa uskutočňoval pomocou nadácie vlády USA (NIH Grant ROL HL37942). Vláda USA má určité práva na tento vynález.

Zápalová odpoveď slúži na eliminovanie škodlivých agensov z tela. Existuje široký rozsah patogénnych napadnutí, ktoré môžu iniciovať zápalovú odpoveď vrátane infekcie, alergénov, autoimunitného stimulu, imunitnej odpovede na transplantované tkanivo, škodlivých chemických látok a toxínov, ischémie/reperfúzie, hypoxie, mechanickej a tepelnej traumy. Zápal je normálne veľmi lokalizovaná akcia, ktorá slúži na vypudenie, oslabenie riedením a izoláciu poškodzujúceho agensu a poraneného tkaniva. Odpoveď tela sa stáva príčinou choroby, keď vedie k neprimeranému poškodeniu hostiteľských tkanív v procese eliminácie cieľového agensu alebo pri odpovedaní na traumatické napadnutie.

Zápal je napríklad zložkou patogenézy pri niekoľkých cievnych ochoreniach alebo poraneniach. Príklady zahŕňajú: ischemické/reperfúzne poranenie (N. G. Frangogiannis a ďalší, v Myocardial Ischemia: Mechanisms, Reperfusion, Protection,

M. Karmazyn, vyd., Birkhuser Verlag (1996) str. 236-284; H. S. Sharma a ďalší, Med. of Inflamm., 6, 175 (1987)), artériosklerózu (R. Ross, Náture, 362, 801 (1993)), zápalové aortické aneuryzmy (N. Girardi a ďalší, Ann. Thor. Surg., 64, 251 (1997); D.l. Walker a ďalší, Brit. J. Surg., 59, 609 (1972); R. L. Pennell a ďalší, J. Vasc. Surg., 2, 859 (1985)), a restenózy nasledujúce po balónovej angioplastike (pozri R. Ross citovaný vyššie). Bunky podieľajúce sa na zápale zahŕňajú leukocyty (tzn. bunky imunitného systému - neutrofily, eozinofily, lymfocyty, monocyty, bazofily, makrofágy,

-2dendritické bunky a mastocyty), bunky cievneho endotelu, bunky hladkých svalov v cievach, fibroblasty a myocyty.

Vylučovanie zápalových cytokínov, ako napríklad nádorového nekrotického faktora alfa (TNFa), leukocytmi je prostriedok, ktorým imunitný systém ničí invázie patogénov vrátane infekcií. TNFa stimuluje expresiu a aktiváciu adherenčných faktorov na leukocytoch a endoteliálnych bunkách, spúšťa zosilnenú zápalovú odpoveď neutrofilov na sekundárny stimul a zosilňuje adherentný neutrofilný oxidatívny účinok. Pozri vyššie citovaný Sharma a ďalší. Okrem toho makrofágové/dendritické bunky slúžia ako prídavné bunky spracúvajúce antigén na prezentáciu lymfocytom. Lymfocyty sa potom stávajú simulovanými a fungujú ako prozápalové cytotoxické bunky.

Vo všeobecnosti cytokíny stimulujú neutrofily, aby zosilnili oxidatívnu zápalovú aktivitu (napr. peroxid a sekundárne produkty) a neoxidatívnu zápalovú aktivitu (napr. myeloperoxidáza a iné enzýmy). Nesprávne a nadmerné vylučovanie cytokínov môže spôsobiť brzdiace, prehnané patogénne účinky prostredníctvom vylučovania tkanivo poškodzujúcich oxidatívnych a neoxidatívnych produktov (K. G. Tracey a ďalší, J. Exp. Med., 167, 1211 (1988); a D.N. Männel a ďalší, Rev. Infect. Dis., 9 (dodatok 5), S602S606 (1987)). Napríklad TNFa môže indukovať neutrofily, aby adherovali na stenu krvnej cievy a potom migrovali cez cievu na miesto poranenia a vylučovali svoje oxidatívne a neoxidatívne zápalové produkty.

Hoci sa monocyty v mieste zápalu zhromažďujú pomaly, za výhodných podmienok sa monocyty vyvíjajú na dlho pretrvávajúce rezidenčné pomocné bunky a makrofágy. Po stimulácii so spúšťačom zápalu monocyty/makrofágy produkujú a vylučujú aj rad cytokínov (vrátane TNFa), komplement, lipidy, reaktívne kyslíkové druhy, proteázy a rastové faktory, ktoré remodelujú tkanivo a regulujú funkcie okolitých tkanív.

Ukázalo sa, že zápalové cytokíny sú patogénne napríklad pri: artritíde (C. A.

Dinarello, Semin. Immunol, 4, 133 (1992)); ischémii (A. Seekamp a ďalší, AgentsActions-Supp., 41, 137 (1993)); septickom šoku (D. N. Männel a ďalší, Rev. Infect.

Dis., 9 (dodatok 5), S602-S606 (1987)); astme (N. M. Cembrzynska a ďalší, Am. Rev.

Respir. Dis., 147, 291 (1993)); odmietnutí transplantovaného orgánu (D. K. Imagawa a

-3• · · · · · » • · · · ··· · · · • · · · · · ··· ·· ·· ·· ďalší, Transplantation, 51, 57 (1991); skleróze multiplex (H. P. Hartung, Ann. Neurol, 33, 591 (1993)); AIDS (T. Matsuyama a ďalší, AIDS, 5, 1405 (1991)); a pri alkalickými látkami popálených očiach (F. Miyamoto a ďalší, Opthalmic Res., 30, 168 (1997)). Okrem toho sa vytváranie peroxidu v leukocytoch podieľalo na podpore replikácie vírusu ľudskej imunitnej nedostatočnosti (HIV) (S. Legrand-Poels a ďalší, AIDS Res. Hum. Retroviruses, 6, 1389 (1990)).

Je dobre známe, že adenozín a niektoré analógy adenozínu, ktoré neselektívne aktivujú subtypy adenozínového receptora, znižujú produkciu zápalových oxidatívnych produktov neutrofilov (B. N. Cronstein a ďalší, Ann. N.Y. Acad. Sci., 451, 291 (1985); P. A. Roberts a ďalší, Biochem. J., 227, 669 (1985); D. J. Schrier a ďalší, J. Immunol., 137, 3284 (1986); B. N. Cronstein a ďalší, Clinical Immunol and Immunopath., 42, 76 (1987); M. A. lannone a ďalší, v Topics and Perspective in Adenosine Research, E. Gerlach a ďalší, vyd. Springer-Verlag, Berlín, str. 286 (1987); S. T. McGarrity a ďalší, J. Leukocyte Biol., 44, 411421 (1988); J. De La Harpe a ďalší, J. Immunol., 143 596 (1989); S. T. McGarrity a ďalší, J. Immunol., 142, 1986 (1989); a C. P. Nielson a ďalší, Br. J. Pharmacol., 97, 882 (1989)). Ukázalo sa napríklad, že adenozín inhibuje vylučovanie peroxidu z neutrofilov stimulovaných chemoatraktantami, ako napríklad syntetickými napodobeninami bakteriálnych peptidov, f-met-leu-phe (fMLP), a zložkou komplementu C₅a (B. N. Cronstein a ďalší, J. Immunol., 135, 1366 (1985)). Adenozín môže znížiť veľmi zosilnenú oxidatívnu aktivitu PMN (neutrofilu), ktorá bola najprv spustená s TNF-α a potom stimulovaná sekundárnym stimulom, ako napríklad f-metleu-phe (G. W. Sullivan a ďalší, Clin. Res., 41, 172A (1993)). Okrem toho bolo publikované, že adenozín môže znížiť rýchlosť HIV replikácie v T-bunkovej línii (S. Sipka a ďalší, Acta. Biochim, Biopys. Hung., 23, 75 (1988)). Avšak neexistuje žiadny dôkaz, že in vivo má adenozín protizápalový účinok (G. S. Firestein a ďalší, Clin. Res., 41, 170A (1993); a B. Cronstein a ďalší, Clin. Res. 41, 244A (1993)).

Bolo navrhnuté, že existujú viaceré, nie len jeden subtyp adenozínového receptora na neutrofiloch, ktoré majú opačné účinky na vylučovanie peroxidu (B. N.

Cronstein a ďalší, J. Clin. Invest., 85, 1150 (1990)). Existencia A^ receptora na neutrofiloch bola pôvodne demonštrovaná Van Calkerom a ďalšími (D. Van Calker a ďalší, Eur. J. Pharmacology, 206, 285 (1991)).

-4Nasledoval progresívny vývoj zlúčenín, ktoré boli stále viac účinné a/alebo selektívne ako agonisty adenozínových receptorov (AR), na základe testov viazania rádioaktívneho ligandu a na základe fyziologických odpovedí. Najprv sa vyvinuli zlúčeniny, ktoré mali nízku alebo žiadnu selektivitu pre A^ receptory, ako napríklad samotný adenozín alebo 5’-karboxamidy adenozinu, ako napríklad 5'-Netylkarboxamidoadenozín (NECA) (B. N. Cronstein a ďalší, J. Immunol., 135, 1366 (1985)). Neskôr sa ukázalo, že pridanie 2-alkylamino substituentov zvyšuje účinnosť a selektivitu, napr. CV1808 a CGS21680 (M. F. Jarvis a ďalší, J. Pharmacol. Exp. Ther., 251, 888 (1989)). 2-Alkoxy-substituované adenozínové deriváty, ako napríklad WRC0090 sú ešte účinnejšie a selektívnejšie ako agonisty pri koronárnom cievnom A_2A receptore (M. Ueeda a ďalší, J. Med. Chem., 34, 1334 (1991)). Aj 2alkylhydrazinoadenozínové deriváty, napr. SHA 211 (tiež označovaný WRC-0474) boli zhodnotené ako agonisty pri koronárnom cievnom A_2A receptore (K. Niiya a ďalší, J. Med. Chem., 35, 4557 (1992)).

Bola zverejnená kombinácia relatívne nešpecifických adenozínových analógov. /?-fenylizopropyladenozínu (R-PIA) a 2-chlóradenozínu (Cl-Ado) s fosfodiesterázovým (PDE) inhibítorom, ktorá viedla ku zníženiu neutrofilnej oxidatívnej aktivity (M. A. lannone a ďalší, Topics and Perspectives in Adenosine Research, E. Garlach a ďalší, vyd. Springer-Verlag, Berlín, str. 286-298 (1987)). Avšak R-PIA a Cl-Ado analógy sú v skutočnosti účinnejšie aktivátory At adenozínových receptorov ako A_2A adenozínových receptorov, a tak je pravdepodobné, že spôsobujú vedľajšie účinky v dôsledku aktivácie A! receptorov na srdcovom svale a iných tkanivách, spôsobujú tak napríklad srdcový blok.

R. A. Olsson a ďalší (US patent č. 5278250) opisujú selektívne adenozínové A₂ receptorové agonisty vzorca:

-5kde Rib znamená ribozyl, R¹ môže znamenať H a R² môže znamenať cykloalkyl. Zlúčeniny sú opísané ako užitočné na liečbu hypertenzie, artériosklerózy a ako vazodilatátory.

Olsson a ďalší (US patent č. 5140015) opisujú určité adenozinové A₂ receptorové agonisty vzorca:

kde C(X)BR² môže znamenať CH₂OH a R¹ môže znamenať alkyl- alebo alkoxyalkyl. Zlúčeniny sú opísané ako užitočné ako vazodilatátory alebo ako antihypertenzitíva.

US patent č. 5877180 v mene Linden a ďalší, je založený na objave, že určité zápalové ochorenia, ako napríklad artritída a astma, sa môžu účinne liečiť podávaním zlúčenín, ktoré sú selektívnymi agonistami adenozínových receptorov, výhodne v kombinácii s fosfodiesterázovým inhibítorom typu IV. Jedno uskutočnenie vynálezu podľa Lindena a ďalších poskytuje spôsob liečby zápalových ochorení podávaním účinného množstva A^ adenozínového receptora vzorca:

kde R a X sú opísané v patente.

Vo výhodnom uskutočnení zahŕňa vynález podľa Lindena a ďalších podávanie fosfodiesterázového (PDE) inhibítora typu IV v kombinácii s A_2A adenozínovým ·· ··

-6receptorovým agonistom. Fosfodiesterázový (PDE) inhibítor typu IV zahŕňa racemické a opticky aktívne 4-(polyalkoxyfenyl)-2-pyrolidóny nasledujúceho vzorca:

kde R’, R¹⁸, R¹⁹ a X sú nárokované a opísané v US patente č. 4193926. Rolipram je príkladom vhodného PDE inhibítora typu IV, ktorý je zahrnutý vyššie uvedeným vzorcom G.

Cristalli (US patent č. 5593975) opisuje 2-aryletinylové, 2-cykloalkyletinylové alebo 2-hydroxyalkyletynilové deriváty, v ktorých je ribozylový bočný zvyšok substituovaný karboxyaminoskupinou alebo substituovanou karboxyaminoskupinou (R³HNC(O)-). V Miyasaka a ďalší (US patent č. 4956345) boli opísané 2alkynylpurínové deriváty, v ktorých je 2-alkynylová skupina substituovaná s (C₃C₁₆)alkylom. ’975 zlúčeniny sú opísané ako vazodilatátory a ako zlúčeniny, ktoré inhibujú agregovanie krvných doštičiek, a tým sú užitočné ako anti-ischemické, antiartériosklerotické a anti-hypertenzívne činidlá.

Avšak ďalej trvá potreba selektívnych A₂ adenozinových receptorových agonistov užitočných na terapeutické aplikácie, ktoré majú redukované vedľajšie účinky.

Podstata vynálezu

Predložený vynález zahŕňa zlúčeniny a spôsoby ich použitia na liečbu zápalovej aktivity v cicavčom tkanive. Zápalová tkanivová aktivita môže byť spôsobená patologickými agensami alebo môže byť spôsobená fýzikálnou, chemickou alebo tepelnou traumou alebo traumou po medicínskych procedúrach, ako napríklad po orgánovej, tkanivovej alebo bunkovej transplantácii, angioplastike (PCTA), zápalom nasledujúcim po ischémii/reperfúzii alebo prenesením štepu. Predložené zlúčeniny zahŕňajú novú triedu 2-alkynyladenozínových derivátov, substituovaných v etinovej polohe substituovanými cykloalkylovými skupinami. Výhodne je ribozylový bočný zvyšok substituovaný v 5’-polohe (X) N-alkyl-(alebo cykloalkyl)karboxyamino (aminokarbonyl) skupinou. Takže predložený vynález poskytuje spôsob na inhibovanie zápalovej odpovede u cicavca, ako napríklad človeka, a chráni tkanivový subjekt pred odpoveďou prostredníctvom podávania účinného množstva jednej alebo viacerých zlúčenín podľa vynálezu.

Zlúčeniny podľa vynálezu majú nasledujúci všeobecný vzorec I:

kde (a) každé R znamená nezávisle vodík, C₁₆-alkyl, C₃.₇-cykloalkyl, fenyl alebo fenyl(C₁₃)alkyl;

(b) X znamená -CH₂OH, -CO₂R², -OC(O)R², -CH₂OC(O)R² alebo C(O)NR³R⁴;

(c) každý z R², R³ a R⁴ nezávisle znamená H, C^-alkyl; C₁₆-alkyl substituovaný s jedným až troma C^g-alkoxy, C₃.₇-cykloalkylmi, C₁₆-alkyltio, halogénmi, hydroxy, amino, monoíC^g-alkyljamino, di(C_V6-alkyl)amino alebo C₆.₁₀-arylmi, pričom aryl môže byť substituovaný s jedným až troma halogénmi, C_V6-alkylmi, hydroxy, amino, monofCvealkyl)amino alebo di(C₁.₆-alkyl)amino; C₆.₁₀-aryl; alebo C₆.₁₀-aryl substituovaný s jedným až troma halogénmi, hydroxy, amino, monoCC^g-alkyljamino alebo d^C^-alkyljamino alebo C_v6-alkylmi;

·· ·· ···· • · · · · · * φ· • · · · · φφ • · · · ··· · φφ • · · · ·· ···· ·· ···· · (d) R¹ znamená (X-(Z)-)_n[(C₃.₁₀)cykloalkyl]-(Z’)-, kde Z a Z’ nezávisle znamenajú C^galkyl voliteľne prerušený jednou až troma sírami alebo neperoxidovými kyslíkmi, alebo chýbajú a n znamená 1 až 3;

alebo jej farmaceutický prijateľné soli.

Vynález poskytuje zlúčeninu vzorca I na použitie na liečbu v medicíne, výhodne na použitie na liečbu alebo ochranu tkaniva voči zápalu, ako napríklad zápalovej odpovedi, ako aj použitie zlúčeniny vzorca I na výrobu liečiva na liečbu zápalovej odpovede spôsobenej patologickými stavom alebo symptómom, ktorý je spojený so zápalom, u cicavca, ako napríklad človeka.

Hoci už bolo publikované, že určité adenozínové receptorové agonisty sú vazodilatátormi a teda sú účinné na priamu liečbu hypertenzie, trombusov, artériosklerózy a podobne, v predchádzajúcom stave techniky nebola naznačená tkanivovo ochranná aktivita zlúčenin vzorca I.

Vynález zahŕňa aj použitie kombinácie týchto zlúčenín s fosfodiesterázovými inhibítormi typu IV na synergické zníženie zápalovej odpovede imunitných buniek.

Vynález poskytuje aj farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje účinné množstvo zlúčeniny vzorca I alebo jej farmaceutický prijateľnej soli v kombinácii s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom, a voliteľne v kombinácii s fosfodiesterázovým (PDE) inhibítorom typu IV. Výhodne je prostriedok prezentovaný ako jednotková dávková forma.

Okrem toho vynález poskytuje terapeutický spôsob na prevenciu alebo liečbu patologického stavu alebo symptómu u cicavca, ako napríklad človeka, na ktorých sa podieľa aktivita A^ adenozínových receptorov a je želateľný agonizmus uvedenej aktivity, pričom spôsob zahŕňa podávanie účinného množstva zlúčeniny vzorca I alebo jej farmaceutický prijateľnej soli cicavcovi, ktorý potrebuje takúto liečbu. Verí sa, že aktivácia A_2A adenozínových receptorov inhibuje zápal prostredníctvom ovplyvňovania neutrofilov, mastocytov.

Medzi zápalové odpovede, ktoré je možné liečiť (vrátane profylaktickej liečby) zlúčeninou vzorca I, voliteľne spolu s PDE inhibítorom typu IV, patria zápaly v dôsledku:

-9• · · · · · · • ·· · ····· · (a) autoimunitnej stimulácie (autoimunitné ochorenia) ako napríklad lupus erytematózus, sklerózy multiplex, neplodnosti spôsobenej endometritídou, diabetes mellitus typu I vrátane deštrukcie ostrovčekov pankreasu vedúcej k cukrovke a zápalových následkov cukrovky, vrátane vredov, Crohnovej choroby, vredovovej kolitídy, zápalového ochorenia vnútorností, osteoporózy a reumatoidnej artritídy;

(b) alergických ochorení, ako napríklad astmy, sennej nádchy, rinitídy, zápalu spojiviek a iných stavov sprostredkovaných eozinofilmi;

(c) kožných ochorení, ako napríklad psoriázy, kontaktnej dermatitídy, ekzémov, infekčných kožných vredov, otvorených rán, celulitídy;

(d) infekčných ochorení vrátane sepsy, septického šoku, encefalitídy, infekčnej artritídy, endotoxického šoku, gram negatívneho šoku, Jarisch-Herxheimerovej reakcie, pásového oparu, toxického šoku, mozgovej malárie, bakteriálnej meningitídy, syndrómu akútnych dýchacích ťažkostí (ARDS), lymskej choroby, HIV infekcie (TNFazosilnenej HIV replikácie, TNFa inhibície aktivity inhibítora reverznej transkriptázy);

(e) chorôb spôsobujúcich chudnutie: kachexie sekundárne pri rakovine a HIV;

(f) orgánovej, tkanivovej alebo bunkovej transplantácie (napr. transplantácie kostnej drene, rohovky, obličiek, pľúc, pečene, srdca, kože, ostrovčekov pankreasu) vrátane odmietnutia transplantátu a ochorenia štep versus hostiteľ;

(g) negatívnych účinkov liekovej terapie vrátene negatívnych účinkov liečby amfotericínom B, negatívnych účinkov imunosupresívnej liečby, napr. liečby interleukínom-2, negatívnych účinkov liečby s OKT3, negatívnych účinkov liečby s GM-CSF, negatívnych účinkov liečby cyklosporínom a negatívnych účinkov liečby aminoglykozidmi, stomatitídy a mukozitídy následkom imunosupresie;

(h) kardiovaskulárnych stavov vrátane obehových ochorení indukovaných alebo vyprovokovaných zápalovou odpoveďou, ako napríklad v dôsledku ischémie, artériosklerózy, periférneho cievneho ochorenia, restenózy nasledujúcej po angioplastike, zápalovej aortickej aneuryzmy, vaskulitídy, mŕtvice, poranenia miechy, kongestívneho srdcového zlyhania, hemoragického šoku, ischemického/reperfúzneho poranenia, vazospazmy nasledujúcej po subarachnoidálnej hemoragii, vazospazmy nasledujúcej po mozgovocievnej príhode, pleuritidy, perikarditídy a kardiovaskulárnych komplikácií cukrovky;

• ·· • ·· • ·· •· ·· • ···· ·*·· • ·· · • ·· ··· · ·· • ·· ·· ··· (i) dialýzy, vrátane perikarditídy následkom peritoneálnej dialýzy;

(j) dny a (k) chemickej alebo tepelnej traumy následkom popálenín, kyselín, zásad a podobne.

Hlavným záujmom a oblasťou pôsobenia je použitie predložených zlúčenín na liečbu zápalových odpovedí v dôsledku orgánovej, tkanivovej alebo bunkovej transplantácie, tzn. transplantácie alogénneho alebo xenogénneho tkaniva cicavčiemu recipientovi, v dôsledku autoimunitných ochorení a zápalových stavov následkom obehových patológií a ich liečby, vrátane angioplastiky, umiestnenia stentu, umiestnenia umelej cievky a zavedenia štepu. Neočakávane sa zistilo, že podanie jednej alebo viacerých zlúčenín vzorca I je účinné po nastúpení zápalovej odpovede, napr. potom ako bol subjekt postihnutý patologickým stavom alebo traumou, ktorá iniciuje zápalovú odpoveď.

Vynález zahŕňa aj spôsob merania odpovede alebo viazania sa zlúčeniny vzorca I na alebo s navrhnutými adenozínovými receptorovými miestami, ktoré sa nachádzajú v uvedených receptoroch, in vivo alebo in vitro, pričom zlúčenina vzorca I je v takom množstve, aby sa účinne viazala na uvedené receptory. Tkanivá alebo bunky obsahujúce ligand viažuce receptorové miesta sa môžu použiť na selektívne meranie testovanej zlúčeniny pre špecifické receptorové subtypy, na testovanie množstva biologicky aktívnej zlúčeniny v krvi alebo iných fýziologických tekutinách, alebo môžu byť použité ako nástroje na identifikáciu potenciálnych terapeutických činidiel na liečbu ochorení a stavov asociovaných s aktiváciou receptorového miesta prostredníctvom uvedenia uvedených činidiel do kontaktu s komplexmi ligand-receptor a meraním rozsahu vytesnenia ligandu a/alebo naviazania činidla alebo meraním bunkovej odpovede na uvedené činidlo (napr. meraním akumulácie cAMP).

Podrobný opis vynálezu

Ak nie je uvedené inak, používajú sa nasledujúce definície. Halogén znamená fluór, chlór, bróm alebo jód. Alkyl, alkoxy, aralkyl, alkylaryl, atď. označujú tak nerozvetvené, ako aj rozvetvené alkylové skupiny; ale uvedenie určitého radikálu, ako • 99 ·· ··99 · 9 9 · 9 9 · ·9 • 9 ···· 99 • · · · · ··· · · · napríklad propylu zahŕňa len radikál z nerozvetveným reťazcom, pričom špecificky sa potom uvádza izomér s rozvetveným reťazcom, ako napríklad izopropyľ. Aryl zahŕňa fenylový radikál alebo orto-fúzovaný bicyklický karboxylový radikál, ktorý má približne deväť až desať atómov v kruhu, pričom najmenej jeden kruh je aromatický. Heteroaryl zahŕňa radikál pripojený prostredníctvom kruhového uhlíka monocyklického aromatického kruhu obsahujúceho päť až šesť atómov v kruhu, pozostávajúceho z uhlíkov a jedného až štyroch heteroatómov, z ktorých každý je vybraný zo skupiny obsahujúcej neperoxidový kyslík, síru a N(X), kde X chýba alebo znamená H, O, 0,.4alkyl, fenyl alebo benzyl, ako aj od neho odvodený radikál orto-fúzovaného bicyklického heterocyklu s približne ôsmymi až desiatimi atómami v kruhu, najmä benz-derivát alebo derivát odvodený jeho fúzovaním s propylénom, trimetylénom alebo tetrametylénovým diradikálom.

Pre priemerného odborníka v oblasti bude zrejmé, že zlúčeniny vzorca I majú jedno alebo viac chirálnych centier a môžu byť izolované v opticky aktívnej forme a v racemickej forme. Výhodne je ribozylová bočná skupina vzorca I odvodené od Dribózy, tzn. 3’,4’-hydroxylové skupiny sú alfa voči sacharidovému kruhu a 2’ a 5' skupiny sú beta (3R, 4S, 2R, 5S). Keď sú na cyklohexylovej skupine v polohe 4 dve skupiny, výhodne sú vzájomne v polohe trans. Niektoré zlúčeniny môžu vykazovať polymorfizmus. Je zrejmé, že predložený vynález zahŕňa akúkoľvek racemickú, opticky aktívnu polymorfnú alebo stereoizomérnu formu, alebo ich zmesi, zlúčeniny podľa vynálezu, ktorá má tu opísané užitočné vlastnosti, pričom je v oblasti dobre známe ako pripraviť opticky aktívne formy (napríklad rozdelením racemickej formy rekryštalizačnými technikami alebo enzymatickými technikami, syntetizovaním z opticky aktívnych východiskových materiálov, chirálnou syntézou alebo chromatografickou separáciou použitím chirálnej stacionárnej fázy) a ako stanoviť adenozínovú agonistickú aktivitu použitím tu opísaných testov alebo použitím podobných testov, ktoré sú dobre známe v oblasti.

Konkrétne a výhodné nižšie uvedené významy radikálov, substituentov a hodnoty rozsahov sú len ilustráciou a nevylučujú iné definované významy a hodnoty alebo iné hodnoty v rámci definovaných rozsahov radikálov a substituentov.

-12• ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • ······· • · ·· ······ ·

Konkrétne, C^-alkyl môže znamenať metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, sec-butyl, pentyl, 3-pentyl alebo hexyl. Tak ako je používaný tu, zahŕňa výraz cykloalkyľ bicykloalkyl (norbornyl, 2,2,2-bicyklooktyl, atď.) a tricykloalkyl (adamantyl, atd’.), voliteľne obsahujúci 1 až 2 N, O alebo S. Cykloalkyl zahŕňa aj (cykloalkyl)alkyl. Takže C₃.₆-cykloalkyl môže znamenať cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl alebo cyklohexyl; Cg-g-cykloalkyl-C^-alkyl môže znamenať cyklopropylmetyl, cyklobutylmetyl, cyklopentylmetyl, cyklohexylmetyl; 2-cyklopropyletyl, 2-cyklobutyletyl, 2-cyklopentyletyl alebo 2-cyklohexyletyl.

C^g-alkoxy môže znamenať metoxy, etoxy, propoxy, izopropoxy, butoxy, izobutoxy, sec-butoxy, pentoxy, 3-pentoxy alebo hexyloxy; C₂.₆-alkenyl môže znamenať vinyl, alyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 1pentenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, 1-hexenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 4hexenyl alebo 5-hexenyl; C₂._e-alkinyl môže znamenať etinyl, 1-propinyl, 2-propinyl, 1butinyl, 2-butinyl, 3-butinyl, 1-pentinyl, 2-pentinyl, 3-pentinyl, 4-pentinyl, 1-hexinyl, 2hexinyl, 3-hexinyl, 4-hexinyl alebo 5-hexinyl; Cvg-alkanoyl môže znamenať acetyl, propanoyl alebo butanoyl; halogén-C^-alkyl môže znamenať jódmetyl, brómmetyl, chlórmetyl, fluórmetyl, trifluórmetyl, 2-chlóretyl, 2-fluóretyl, 2,2,2-trifluóretyl alebo pentafluóretyl; hydroxyíC^gjalkyl môže znamenať hydroxymetyl, 1-hydroxyetyl, 2hydroxyetyl, 1-hydroxypropyl, 2-hydroxypropyl, 3-hydroxypropyl, 1-hydroxybutyl, 4hydroxybutyl, 1-hydroxypentyl, 5-hydroxypentyl, 1-hydroxyhexyl alebo 6-hydroxyhexyl; C^-alkoxykarbonyl (CO₂R²) môže znamenať metoxykarbonyl, etoxykarbonyl, propoxykarbonyl, izopropoxykarbonyl, butoxykarbonyl, pentoxykarbonyl alebo hexyloxykarbonyl; C₁₆-alkyltio môže znamenať metyltio, etyltio, propyltio, izopropyltio, butyltio, izobutyltio, pentyltio alebo hexyltio; C₂.₆-alkanoyloxy môže znamenať acetoxy, propanoyloxy, butanoyloxy, izobutanoyloxy, pentanoyloxy alebo hexanoyloxy; aryl môže znamenať fenyl, indenyl alebo naftyl; a heteroaryl môže znamenať furyl, imidazolyl, triazolyl, triazinyl, oxazoyl, izoxazoyl, tiazolyl, izotiazoyl, pyraxolyl, pyrolyl, pyrazinyl, tetrazolyl, puridyl (alebo jeho A/-oxid), tientyl, pyrimidinyl (alebo jeho /V-oxid), indolyl, izochinolyl (alebo jeho A/-oxid) alebo chinolyl (alebo jeho A/-oxid).

Konkrétnym významom R je amino, monometylamino alebo cyklopropylamino.

-13Konkrétnym významom R¹ je karboxy- alebo (C₁.₄)alkoxykarbonyl-cyklohexyl(C₁.

₄)alkyl.

Konkrétnym významom R² je H alebo C_M-alkyl, tzn. metyl alebo etyl.

Konkrétnym významom R³ je H, metyl alebo fenyl.

Konkrétnym významom R⁴ je H, metyl alebo fenyl.

Konkrétnym významom Zje -CH₂ alebo -CH₂-CH₂-.

Konkrétnym významom X je CO₂R², C₂.₅-alkanoylmetyl alebo amido.

Konkrétnou hodnotou n je 1.

Výhodnými zlúčeninami vzorca I sú tie, v ktorých každé z R znamená H, X znamená etylaminokarbonyl a R¹ znamená 4-karboxycyklohexylmetyl (DWH-146a), R¹ znamená 4-metoxykarbonylcyklohexylmetyl (DWH-146e) alebo R¹ znamená 4acetoxymetylcyklohexylmetyl (JMR-193). Sú znázornené nižšie (DWH-146 (kyselina) a metylester (e)) a J M E-193.

Syntéza metyl-4[3-(6-amino-9(5-[(etylamino)karbonyl]-3,4-dihydroxy-tetrahydroZ-furanyl-9/-/-2-purinyl)-2-propynyl]-1 -cyklohexánkarboxylátu (DWH-146e) sa uskutočňovala prostredníctvom krížového párovania jód-adenozínového derivátu (Netyl-1 ’-deoxy-1 ’-(amino-2-jód-9H-purín-9-yl)-p-D-ribofuranuoramidu) s metyl-4-(2-14• ·· ·· ·· ·· ··· · · · · · · ·· • ······· • · · · · ··· · · · propynyl)-1-cyklohexánkarboxylátom s využitím Pd¹¹ katalyzátora. Syntéza jódadenozínového derivátu sa uskutočnila z guanozínu. Na guanozín sa najprv pôsobilo anhydridom kyseliny octovej, ktorá vytvorila acetaláty na sacharidových hydroxyloch a nasledovala chlorinácia v polohe 6 s chloridom tetrametylamónnym a fosforuzoxychloridom. Jodinácia v polohe 2 sa uskutočnila prostredníctvom modifikovanej Sandmeyerovej reakcie a nasledovalo nahradenie 6-CI a sacharidových acetátov s amoniakom. 2’ a 3’ hydroxyly sa chránili ako acetonid a 5’ hydroxyl sa jodizoval na kyselinu s permanganátom draselným. Výsledkom odstránenia acetonidových 2’ a 3’ ochranných skupín, Fisherovej esterifikácie 5’ kyseliny s etanolom a konverzie výsledného etylesteru na etylamid s etylamínom bol /V-etyl-ľdeoxy-ľ-(amino-2-jód-9H-purín-9-yl)-p-D-ribofuranuoramid.

Acetylén-(metyl-4-(2-propynyl)-1-cyklohexánkarboxylát) sa syntetizoval tak, že sa vychádzalo z trans-1,4-cyklohexándimetanolu. Najprv sa ŕrans-diol monotozyloval a nasledovalo nahradenie tozylátu s acetylénovým aniónom. Hydroxyl výsledných hydroxylacetylénových druhov sa oxidoval na kyselinu prostredníctvom Jonesovho reakčného činidla a nasledovala metylácia s (trimetylsilyl)diazometánom, čím vznikol metyl-4-(2-propynyl)-1-cyklohexánkarboxylát.

Krížová párovacia reakcia sa uskutočňovala v nasledujúcich, predtým zverejnených podmienkach. K roztoku A/./V-dimetylformamidu (0,5 ml), acetonitrilu (1 ml), trietylamínu (0,25 ml) a /V-etyl-ľ-deoxy-ľ-(amino-2-jód-9/-/-purín-9-yl)-p-Dribofuranuroamidu (25 mg, 0,06 mmol) sa pridal bis(trifenylfosfín)paládium dichlorid (1 mg, 2 mol%) a jodid meďný (0,06 mg, 0,5 mol%). Do výslednej zmesi sa pridal metyl-

4-(2-propynyl)-1-cyklohexánkarboxylát (54 mg, 0,3 mmol) a reakčná zmes sa miešala v N₂ atmosfére 16 hodín. Rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuu a výsledný zvyšok sa podrobil bleskovej chromatografii v 20% metanole v chloroforme (R_f = 0,45), čím vzniklo 19 mg (špinavo biela tuhá látka, t.t. 125 °C (rozložená)) metyl-4[3-(6-amino9(5-[(etylamino)karbonyl]-3,4-dihydroxytetrahydro-Z-furanyl-9H-2-purinyl)-2-propynyl]1 -cyklohexánkarboxylátu (DWH-146e).

DWH-146e a JMR193 sú podstatne účinnejšie ako inhibítory v zápalových modelových systémoch ako referenčná zlúčenina CGS21680 (2-[p-(karboxyetyl)-fenyletylamino]5’-/V-etylkarboxamidoadenozín). Napríklad DWH-146e je približne 80 krát

-15• · · · · · · • · · · ··· · · · • · · · · · ··· ·· ·· ·· účinnejšia na A_2A receptoroch a 40 krát selektívnejšie voči A^ než voči A₃ receptorom ako CGS21680.

Príkladmi farmaceutický prijateľných solí sú organické kyslé adičné soli vytvorené z kyselín, ktoré tvoria fyziologicky prijateľný anión, napríklad tozylát, metánsulfonát, malát, acetát, citrát, malonát, tartarát, vinan, benzoát, askorbát, aketoglutarát a α-glycerofosfát. Vytvorené môžu byť aj vhodné anorganické soli, vrátane chlorovodíkových, síranových, dusičnanových, uhličitanových a hydrogénuhličitanových solí.

Farmaceutický prijateľné soli sa môžu získať použitím štandardných postupov dobre známych v oblasti, napríklad reakciou dostatočne zásaditej zlúčeniny, ako napríklad aminu, s vhodnou kyselinou poskytujúcou fýziologicky prijateľný anión. Môžu sa vytvoriť napríklad aj soli karboxylových kyselín a alkalického kovu (napríklad sodíka, draslíka alebo lítia) alebo kovov alkalických zemín (napríklad vápnika).

Zlúčeniny vzorca I môžu byť vo forme farmaceutických prostriedkov a môžu sa podávať cicavčiemu hostiteľovi, ako napríklad ľudskému pacientovi, v rôznych formách adaptovaných na zvolený spôsob podania, tzn. orálny alebo parenterálny spôsob prostredníctvom intravenózneho, intramuskulárneho, topického alebo podkožného podania.

Takže predložené zlúčeniny môžu byť systematicky podávané napr. orálne v kombinácii s farmaceutický prijateľným vehikulom, ako napríklad inertným riedidlom alebo asimilovateľným jedlým nosičom. Môžu byť uzavreté v tvrdých alebo mäkkých ochranných želatínových kapsuliach, môžu byť stlačené do tabliet, alebo sa môžu priamo zaviesť do stravy pacienta. Na orálne terapeutické podanie môže byť účinná zlúčenina kombinovaná s jedným alebo viacerými excipientami a môže byť použitá vo forme stráviteľných tabliet, bukálnych tabliet, pastiliek, kapsulí, elixírov, suspenzií, sirupov, oplátok a podobne. Takéto prostriedky a prípravky by mali obsahovať najmenej 0,1 % účinnej zlúčeniny. Percento účinnej látky v prostriedkoch a prípravkoch sa môže samozrejme meniť a vhodne môže byť medzi približne 2 a približne 60 % hmotn. danej jednotkovej dávkovej formy. Množstvo účinnej zlúčeniny v takýchto terapeuticky užitočných prostriedkoch je také, aby sa získala účinná dávková hladina.

·· ·· ··

• · ······· • · ·· • · ·· • ··· · · • ·· • · ·· ···

Tablety, pastilky, pilulky, kapsule a podobne môžu obsahovať aj nasledujúce látky: spojovacie činidlá, ako napríklad gumený tragant, arabskú gumu, obilný škrob alebo želatínu; excipienty, ako napríklad fosforečnan vápenatý; dezintegračné činidlo, ako napríklad obilný škrob, zemiakový škrob, kyselinu alginovú a podobne; mazadlá, ako napríklad stearan horečnatý; a sladidlo, ako napríklad sacharózu, fruktózu, laktózu alebo aspartát alebo dochucovadlá, ako napríklad pepermint, olej z rastliny wintergreen alebo sa môže pridať čerešňová príchuť. Ak je dávkovou jednotkovou formou kapsula, môže okrem materiálov vyššie uvedeného typu obsahovať aj kvapalný nosič, ako napríklad rastlinný olej alebo polyetylénglykol. Prítomné môžu byť aj rôzne iné materiály ako nátery, alebo na to, aby sa iným spôsobom modifikovala fýzikálna forma tuhej jednotkovej dávkovej formy. Napríklad tablety, pilulky alebo kapsuly môžu byť potiahnuté želatínou, voskom, šelakom alebo cukrom a podobne. Sirup alebo elixír môže obsahovať účinnú zlúčeninu, sacharózu alebo fruktózu ako sladidlo, metyl a propylparabény ako konzervačné látky a farbičku a dochucovadlo, ako napríklad čerešňovú alebo pomarančovú príchuť. Samozrejme, že akýkoľvek materiál použitý na prípravu akejkoľvek dávkovej formy by mal byť farmaceutický prijateľný a v podstate netoxický v použitých množstvách. Okrem toho môže byť účinná zlúčenina začlenená v prípravkoch a zariadeniach na nepretržité uvoľňovanie.

Účinná zlúčenina môže byť podávaná aj intravenózne alebo intraperitoneálne infúziou alebo injekciou. Roztoky účinnej zlúčeniny alebo jej solí je možné pripraviť vo vode, voliteľne zmiešanej s netoxickou povrchovo aktívnou látkou. Disperzie môžu byť pripravené aj v glycerole, kvapalných polyetylénglykoloch, triacetíne a ich zmesiach a v olejoch. V bežných podmienkach uskladnenia a použitia obsahujú tieto prípravky konzervačné látky na zabránenie rastu mikroorganizmov.

Farmaceutické dávkové formy vhodné na injekciu alebo infúziu môžu zahŕňať sterilné vodné roztoky alebo disperzie sterilných práškov obsahujúcich účinnú zložku, ktorá je adaptovaná na okamžitú prípravu sterilných injektovateľných roztokov alebo roztokov, ktoré je možné podať infúziou, alebo disperzií, pričom je voliteľne obalená v lipozómoch. Vo všetkých prípadoch musia byť okamžité dávkové formy sterilné, tekuté a stabilné v podmienkach výroby a uskladnenia. Kvapalným nosičom alebo vehikulom môže byť rozpúšťadlo alebo kvapalné disperzné médium obsahujúce napríklad vodu,

-17• ·· ·· ·· ·· · ···· · · · · ···· • ········ • · · · · ··· « · · 4 ·· ·· · · · · ··· ···· ·· ·· ·· ··· etanol, polyol (napríklad glycerol, propylénglykol, kvapalné polyetylénglykoly a podobne), rastlinné oleje, netoxické glycerylové estery a ich vhodné zmesi. Vhodná tekutosť sa môže udržiavať napríklad vytvorením lipozómov, udržiavaním požadovanej veľkosti častíc v prípade disperzií alebo použitím povrchovo aktívnych látok. Zabránenie činnosti mikroorganizmov sa môže zabezpečiť použitím rôznych antibakteriálnych a antifungálnych činidiel, napríklad parabénov, chlórbutanolu, fenolu, kyseliny sorbovej, timerozalu a podobne. V mnohých prípadoch bude výhodné zahrnúť izotonické činidlá, napríklad sacharidy, tlmivé roztoky alebo chlorid sodný. Predĺžená absorpcia injektovateľných prostriedkov sa môže dosiahnuť použitím prostriedkov s činidlami na oddialenú absorbiu, napríklad s monostearanom hlinitým a želatínou.

Sterilné injektovateľné roztoky sa pripravujú zavedením účinnej zlúčeniny v požadovanom množstve do príslušného rozpúšťadla s rôznymi inými zložkami vymenovanými vyššie, a ak je to potrebné, s následnou sterilizáciou cez filter. V prípade sterilných práškov na prípravu sterilných injektovateľných roztokov sú výhodnými spôsobmi prípravy vákuové sušenie a techniky sušenia mrazením, ktorých výťažkom je prášok účinnej zložky a akejkoľvek ďalšej potrebnej zložky prítomnej v predtým sterilné filtrovaných roztokoch.

Na topické podanie môžu byť predložené zlúčeniny aplikované v čistej forme, tzn. keď sú to kvapaliny. Avšak vo všeobecnosti je želateľné podávať ich na kožu vo forme prostriedkov alebo formulácií v kombinácii s dermatologicky prijateľným nosičom, ktorý môže byť tuhý alebo kvapalný.

Užitočné tuhé nosiče zahŕňajú jemne rozdrvené tuhé látky, ako napríklad mastenec, íl, mikrokryštalickú celulózu, oxid kremičitý, oxid hlinitý a podobne. Užitočné kvapalné nosiče zahŕňajú vodu, alkoholy alebo glykoly alebo zmesi vodaaIkohol/glykol, v ktorých môžu byť predložené zlúčeniny rozpustené alebo dispergované v účinných množstvách, voliteľne pomocou netoxických povrchovo aktívnych látok. Na optimalizáciu vlastností na dané použitie môžu byť pridávané adjuvans, ako napríklad vône alebo ďalšie antimikrobiálne činidlá. Výsledné kvapalné prostriedky sa môžu aplikovať z absorbčných náplastí, použitím impregnovaných

-18·· ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · · • · · ······ · • · · · · · ··· ·· ·· ·· obväzov a iných náterov, alebo sa môžu striekať na postihnutú oblasť použitím aerosólových sprejov pumpového typu.

Spolu s kvapalnými nosičmi sa môžu využiť aj látky zväčšujúce objem, ako napríklad syntetické polyméry, mastné kyseliny, soli a estery mastných kyselín, mastné alkoholy, modifikované celulózy alebo modifikované minerálne materiály, na vytvorenie roztieraterných pást, gélov, masti, mydiel a podobne, na aplikáciu priamo na kožu používateľa.

Príklady užitočných dermatologických prostriedkov, ktoré môžu byť použité na dodanie zlúčenín vzorca I do pokožky, sú opísané v Jacquet a ďalší (US patent č. 4608392), Geria (US patent č. 4992478), Smith a ďalší (US patent č. 4559157) a Wortzman (US patent č. 4820508).

Užitočné dávky zlúčenín vzorca I je možné stanoviť porovnaním ich in vitro aktivity a in vivo aktivity v živočíšnych modeloch. Spôsoby extrapolácie účinných dávok z myší a iných živočíchov na ľudí sú v oblasti známe; napríklad pozri US patent č. 4938949. V oblasti sú známe užitočné dávky PDE inhibítorov typu IV. Pozri napríklad US patent č. 5877180, stĺpec 12.

Vo všeobecnosti bude koncentrácia zlúčeniny (zlúčenín) vzorca I v kvapalnom prostriedku, ako napríklad v pleťovej vode, od približne 0,1 % hmotn. do 25 % hmotn., výhodne od približne 0,5 % hmotn. do 10 % hmotn. Koncentrácia v semi-tuhom alebo tuhom prostriedku, ako napríklad v géli alebo v prášku, bude približne 0,1 % hmotn. až 5 % hmotn., výhodne približne 0,5 % hmotn. až 2,5 % hmotn.

Množstvo zlúčeniny alebo jej aktívnej soli alebo derivátu, potrebné na použitie na liečbu, sa bude meniť nie len v závislosti na konkrétnej vybranej soli, ale aj v závislosti na spôsobe podania, povahe stavu, ktorý sa má liečiť, a v závislosti na veku a stave pacienta, a bezprostredne bude závisieť na posúdení ošetrujúceho praktického alebo klinického lekára.

Avšak, vo všeobecnosti bude vhodná dávka v rozsahu od približne 0,5 pg/kg do približne 100 pg/kg, napr. od približne 10 pg/kg do približne 75 pg/kg telesnej hmotnosti na deň, ako napríklad 3 pg až približne 50 pg na kilogram telesnej hmotnosti príjemcu na deň, výhodne v rozsahu 6 až 90 pg/kg/deň, najvýhodnejšie v rozsahu 15 až 60 pg/kg/deň.

• ·· ·· ·· ·· • · · · ···· ·· • · ···· ·· • · ·· ······ · • · e · · · · ··· ···· ·· ·· ··

-19Zlúčenina sa vhodne podáva v jednotkovej dávkovej forme; obsahujúcej napríklad 5 až 1000 gg, vhodne 10 až 750 gg, najvhodnejšie 50 až 500 gg účinnej zložky na jednotkovú dávkovú formu.

Ideálne by sa aktívna zložka mala podávať tak, aby bol dosiahnutý vrchol plazmatickej koncentrácie aktívnej zlúčeniny v rozsahu od približne 0,1 nM do približne 10 nM, výhodne od približne 0,2 mM do 10 nM, najvýhodnejšie od približne 0,5 nM do približne 5 nM. To sa dá dosiahnuť napríklad intravenóznou injekciou 0,05% až 5% roztoku aktívnej zložky, voliteľne vo fyziologickom roztoku, alebo orálnym podaním vo forme bolus dávky obsahujúcej približne 1 gg až 100 gg aktívnej zložky. Požadované krvné hladiny sa môžu udržiavať kontinuálnou infúziou, aby sa poskytlo približne 0,01 až 5,0 gg/kg/hodinu, alebo periodickými infúziami obsahujúcimi približne 0,4 až 15 gg/kg aktívnej zložky (aktívnych zložiek).

Schopnosť danej zlúčeniny podľa vynálezu fungovať ako A_2A adenozínový receptorový agonista (alebo antagonista) sa môže stanoviť použitím farmakologických modelov, ktoré sú v oblasti dobre známe, alebo použitím nižšie opísaných testov.

Vynález bude ďalej opísaný odvolávaním sa na nasledujúce podrobné príklady, ktoré sú poskytnuté na ilustráciu vynálezu a nie sú mienené ako obmedzujúce vynález.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Trans-(1-[4-(hydroxymetyl)cyklohexyl]metyl)-4-metylbenzénsulfonát (5.2)

Hydrid sodný (1,68 g, 70 mmol) sa pridal do roztoku 10 g (70 mmol) [4(hydroxymetyl)cyklohexyl]metán-1-olu (5.1) v 700 ml tetrahydrofuránu a miešal sa 1 hodinu a potom sa pridal p-toluénsulfonyl chlorid (13,3 g, 70 mmol) a reakčná zmes sa refluxovala 5 hodín. Reakčná zmes sa potom ochladila na 0 °C a pomaly sa zastavovala s vodou, až kým v zmesi nebol žiadny reaktívny hydrid. Keď sa hydrid odstavil, reakčná zmes sa nariedila s éterom (700 ml) a dvakrát sa extrahovala s 10% vodným uhličitanom draselným (700 ml). Organické látky sa vysušili použitím síranu sodného a rozpúšťadlo sa odstránilo pri zníženom tlaku. Produkt sa purifikoval ··

-20chromatografiou na silikagélovej kolóne a eluoval sa so zmesou acetón-dichlórmetán (5:95), čím vznikla zlúčenina 5.2 (35 %).

¹H NMR (300 MHz, CDCI₃) δ 7,75 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 7,32 (d, J= 8,1 Hz, 2H), 3,79 (d,

J= 6,35 Hz, 2H), 3,39 (d, J=6,35 Hz, 2H), 2,42 (s, 3H), 1,75 (m, 4H), 1,59 (m, 1H),

1,37 (m, 1H), 0,9 (m, 4H). ¹³C NMR (300 MHz, CDCIJ δ 130,3, 130,3, 128,3, 128,3,

75.8, 68,5, 40,6, 37,8, 28,9, 28,9, 28,9, 28,9, 22,1.

Príklad 2 (4-Prop-2-ynylcyklohexyl)metán-1 -ol (5.3)

Lítiumacetylid etyléndiamínový komplex (90 %) (6,4 g, 70 mmol) sa veľmi pomaly pridal ku roztoku zlúčeniny 5.2 (3 g, 10 mmol) v 40 ml dimetylsulfoxidu. Reakčná zmes sa 5 dní miešala a potom sa pomaly zastavila vodou pri 0 °C. Zmes sa nariedila s éterom (300 ml) a trikrát sa extrahovala s nasýteným vodným chloridom amónnym (200 ml). Organické látky sa vysušili so síranom sodným. Rozpúšťadlo sa odstránilo pri zníženom tlaku a produkt sa purifikoval chromatografiou na silikagélovej kolóne a eluoval sa so zmesou acetát-hexány (20:80), čím vznikla zlúčenina 5.3 (85 %) ¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 3,41 (d, J= 6,5 Hz, 2H), 2,07 (dd, J= 2,5, 6,5 Hz, 2H), 1,96-1,75 (m, 5H), 1,41 (m, 2H), 0,095 (m, 4). ¹³C NMR (300 MHz, CDCI3) δ 83,8, 69,6,

68.9, 40,7, 37,7, 32,3, 32,3, 29,6, 29,6, 26,5.

Príklad 3

Kyselina 4-prop-2-ynylcyklohexánkarboxylová (5.4)

Roztok oxidu chrómového (1,1 g, 11 mmol) v 1,5M kyseline síričitej (40 ml, 27 mmol) sa udržiaval pri 0 °C, zatiaľ čo sa počas 2 hodín pridávala zlúčenina 5.3 (0,46 g, 3 mmol) v 80 ml acetónu. Reakčná zmes sa potom miešala ďalšie dve hodiny pri laboratórnej teplote. Reakčná zmes sa potom nariedila s éterom (200 ml) a dvakrát sa extrahovala s vodou. Organické látky sa vysušili so síranom sodným. Rozpúšťadlo sa odstránilo pri zníženom tlaku a produkt sa purifikoval chromatografiou na silikagélovej kolóne a eluoval sa so zmesou acetón-dichlórmetán (70:30), čím vznikla zlúčenina 5.4 (75 %).

• ·· ·· ·· ·· ··· · · ·· · · ·· • · · · · · ·· • · · · · ··· · · ·

-21 Ή NMR (300 MHz, CDCI₃) δ 2,24 (dt, J= 3,66,12,1 Hz, 1H), 2,10 (dd, J= 2,7,6,5 Hz,

2H), 2,04-1,89 (m, 5H), 1,76 (d, J= 2,3 Hz, 1H), 1,43 (dq, J= 3,28,13,1 Hz, 2H), 1,03 (dq, J= 3,28,13,1 Hz, 2H). ¹³C NMR (300 MHz, CDCI₃) δ 183,2, 83,3, 69,9, 43,4, 36,7,

31,8, 28,9,26,3.

Príklad 4

Metyl 4-prop-2-ynylcyklohexánkarboxylát (5.5)

Roztok (trimetylsilyl)diazometánu (2,0 M) v hexánoch (1 ml, 2 mmol) sa pridával do roztoku zlúčeniny 5.4 (0,34 g, 2 mmol) v 15 ml zmesi metanoLdichlórmetán (3:7). Rozpúšťadlá sa odstránili pri zníženom tlaku, čoho výsledkom bola 100% konverzia východiskovej látky na produkt.

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 2,24 (dt, J= 3,66,12,1 Hz, 1H), 2,10 (dd, J= 2,7,6,5 Hz, 2H), 2,06 (dd, J= 1,54,6,54 Hz, 1H), 2,00-1,89 (m, 3H), 1,76 (d, J= 2,3 Hz, 1H), 1,43 (dq, J= 3,28,13,1 Hz, 2H), 1,03 (dq, J= 3,28,13,1 Hz, 2H). ¹³C NMR (300 MHz, CDCI3) δ 176,8, 83,3, 69,8, 51,9, 43,4, 36,7, 31,9, 29,2, 26,3.

Príklad 5 [(2R,3R,4R,5R)-3,4-diacetyloxy-5-(2-amino-6-oxohyropurín-9-yl)oxolán-2-yl]metyl acetát (6.2)

Suspenzia 113 g (0,4 mol) suchého guanozínu (6.1), anhydridu kyseliny octovej (240 ml, 2,5 mol), suchého pyridínu (120 ml) a suchého DMF (320 ml) sa zahrievala 3,75 hodiny na 75 °C, pričom nebolo umožnené, aby teplota presiahla 80 °C. Číry roztok sa potom preniesol do 3I Erlenmyerovej fľaše a doplnil sa 2-propanolom. Po ochladení roztoku na laboratórnu teplotu sa iniciovala kryštalizácia a nechala sa pokračovať pri 4 °C cez noc. Biely tuhý filtrát sa prefiltroval, premyl sa 2-propanolom a rekryštalizoval z 2-propanolu, čím vznikla zlúčenina 6.2 (96 %).

Ή NMR (300 Mhz, CDCI₃) δ 8,20 (s, 1H, H-8), 6,17 (d, J= 5,41 Hz, 1 H, Η-Γ) 5,75 (t,

J= 5,39 Hz, 1H, H-2'), 5,56 (t, J= 5,0, H-3'), 4,41 (m, 3H, H-4', 5'), 2,14 (s, 3H, Ac),

2,11 (s, 3H, Ac), 2,10 (s, 3H, Ac). ¹³C NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 171,0,170,3,1702,

85,5, 80,4, 73,0, 71,3, 64,0, 31,3, 21,2, 21,0.

-22• ·· ·· ·· ·· ··· · · ·· · · ·· • · · · · · ·· • · · · · ··· · · · ··· ···· ·· ·· ·· ···

Príklad 6 [(2/?,3R,4R,5R)-3,4-diacetyloxy-5-(2-amino-6-chlórpurín-9-yl)oxolán-2-yl]metyl acetát (6.3)

Do 1000mi fľaše sa pridalo 80 g (0,195 mol) [2/?,3/?,4R,5R)-3,4-diacetyloxy-5(2-amino-6-oxohyropurin-9-yl)oxolán-2-yl]metyl acetátu (6.2), tetrametylamónium chlorid (44 g, 0,4 mol), bezvodný acetonitril (400 ml) a Λ/,/V-dimetylanilín (25 ml). Fľaša sa umiestnila do ľadového slaného kúpeľa a ochladila sa na 2 °C. Do tohto roztoku sa po kvapkách pridal POCI₃ (107 ml, 1,15 mol) rýchlosťou, pri ktorej sa teplota udržiavala pod 5 °C (45 minút). Fľaša sa potom zobrala z ľadového kúpeľa, vybavila sa kondenzátorom, umiestnila sa do olejového kúpeľa a umožnil sa reflux počas 10 minút, zatiaľ čo roztok zmenil farbu na červenohnedú. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo pri zníženom tlaku a výťažkom bol olejovitý zvyšok, ktorý sa preniesol do kadičky s 100 g ľadu a 400 ml CHCI₃ a reakčná zmes sa miešala 1,5 hodiny, aby sa rozložil všetok zvyšný POCI₃. Organická fáza sa potom odstránila a vodná fáza sa trikrát extrahovala s 50 ml CHCI₃ a spojila sa s organickou fázou. Spojená organická látka sa potom znova extrahovala s 50 ml vody a nasledovalo miešanie s 200 ml nasýteného NaHCO₃. Organická látka sa ďalej extrahovala s NaHCO₃, až kým nebol vodný extrakt neutrálny (2x). Organická látka sa nakoniec extrahovala s roztokom chloridu sodného a potom sa sušila na MgSO₄16 hodín. Do roztoku sa potom pridalo 800 ml 2-propanolu a potom sa roztok skoncentroval pri zníženom tlaku. K olejovitej tuhej látke sa pridalo 200 ml 2-propanolu a roztok sa na noc uložil do chladničky. Kryštalický produkt sa prefiltroval, premyl a cez noc sa nechal vysušiť, čím vznikla zlúčenina 6.3 (77 %).

¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 8,31 (s, 1H, H-8), 7,00 (s, 2H, NH2) 6,06 (d, J=5, 8Hz,

IH, H-ľ), 5,83 (t, J= 6, 16 Hz, 1H, H-2'), 5,67 (m, 1H, H-3'), 4,29 (m, 3H, H-4', 5'), 2,07 (s, 3H, Ac), 1,99 (s, 3H, Ac), 1,98 (s, 3H, Ac). ¹³C NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 171,0,

170,4, 170,2, 160,8, 154,6, 150,8, 142,2, 124,5, 85,8, 80,6, 72,8, 71,2, 63,9, 21,4,

21,3,21,1.

Príklad 7

-23• ·· ·· ·· ·· ··· · · ·· · · ·· • ······· • · · · · ··· · · · [(2R,3R,4R,5R)-3,4-diacetyloxy-5-(6-chlór-2-jódpurín-9-yl)oxolán-2-yl]metyl acetát (6.4)

Izoamyl nitrit (5 ml, 37 mmol) sa pridal ku zmesi 5,12 g (12 mmol) [(2R,3R,4R,5R)-3,4-diacetyloxy-5-(2-amino-6-chlórpurin-9-yl)oxolán-2-yl]metyl acetátu (6.3) , l₂ (3,04 g, 12 mmol), CH₂I₂ (10 ml, 124 mmol) a Cul (2,4 g, 12,6 mmol) v THF (60 ml). Zmes sa za refluxu zahrievala 45 minút a potom sa nechala ochladiť na laboratórnu teplotu. Do tohto roztoku sa pridalo 100 ml nas. Na₂S₂O₃, ktorá odstránila červenkastú farbu spôsobenú jódom. Vodná fáza sa trikrát extrahovala chloroformom, spojila sa, vysušila na MgSO₄ a skoncentrovala pri zníženom tlaku. Produkt sa potom purifikoval na silikagélovej kolóne použitím zmesi CHCI₃-MeOH (98:2) na izoláciu [(2R,3/?,4R,5/?)-3,4-diacetyloxy-5-(6-chlór-2-jódpurín-9-yl)oxolán-2-yl]metyl acetátu (6.4) (80 % kryštalizovaných z EtOH).

¹H NMR (300 MHz, CDCI₃) δ 8,20 (s, 1H H-8), 6,17 (d, J = 5,41 Hz, 1H, H-ľ), 5,75 (t, J = 5,39 Hz, 1H, H-2'), 5,56 (t, J= 5,40 Hz, 1H, H-3'), 4,38 (m, 3H, H-4’, 5'), 2,14 (s, 1H, Ac), 2,11 (s, 1H, Ac), 2,10 (s, 1H, Ac).

Príklad 8 (4S,2/?,3R,5/?)-2-(6-amino-2-jódpurín-9-yl)-5-(hydroxymetyl)oxolán-3,4-diol (6.5)

Do fľaše obsahujúcej 6,0 g (11,1 mmol) [(ZR.SR^R.SRj-S^-diacetyloxy-ô-íechlór-2-jódpurín-9-yl)oxolán-2-yl]metyl acetátu (6.4) sa pridalo 100 ml kvapalného NH₃ pri -78 °C a roztok sa miešal 6 hodín. Po tomto čase sa nechal ochladiť cez noc na laboratórnu teplotu a súčasne sa evaporoval NH₃, čím vznikol hnedý olej. Produkt sa kryštalizoval z izopropanolu, čím vznikla zlúčenina 6.5 (80 %), 1.1. 143 až 145 °C, r.f. = 0,6 v 20% MeOH/CHCI₃.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,24 (s, 1H), 7,68 (s, 2H), 5,75 (d, J= 6,16,1H), 5,42 (d, J= 5,40 Hz, 1H), 5,16 (d, J = 4,62 Hz, 1H), 4,99 (t, J= 5,39 Hz, 1H), 4,67 (d, J= 4,81 Hz, 1H), 4,06 (d, J= 3,37 Hz, 1H), 3,89 (m, 1H), 3,54 (m, 2H).

Príklad 9 [(1f?,2R,4/?,5R)-4-(6-amino-2-jódpurín-9-yl)-7,7-dimetyl-3,6,8-trioxabicyklo[3,3,0]okt-2yl]metán-1-ol (6.6) • ·

-24K roztoku 2,0 g (5,08 mmol) (4S,2/?,3/?,5/?)-2-(6-amino-2-jódpurín-9-yl)5(hydroxymetyl)oxolán-3,4-diolu (6.6) v 100 ml acetónu sa pridalo 9,6 g kyseliny ptoluénsulfónovej a 5 ml dimetoxypropánu. Reakčná zmes sa miešala pri laboratórnej teplote 1 hodinu, kedy sa pridalo 15 g NaHCO_3l a potom sa miešala ďalšie 3 hodiny. Zvyšok sa prefiltroval a dvakrát premyl s EtOAc. Filtrát sa potom skoncentroval pri zníženom tlaku. Zvyšok sa podrobil chromatografii na silikagélovej kolóne a eluoval zmesou MeOH-CHCI₃ (1:99), čím vznikla zlúčenina 6.6 (72 %) vo forme tuhej látky, t.t. 185 až 187 °C.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,22 (s, 1H, H-8), 7,69 (s, 2H), NH2), 6,00 (d, J= 2,70 Hz, 1H, H-ľ), 5,21 (m, 1H, H2'), 5,07 (bs, 1H, OH), 4,88 (m, 1H, H-3'), 4,13 (m, 1H, H4'), 3,47 (m, 2H, H5'), 1,49 a 1,28 (s, 3H, C (CH₃)₂).

Príklad 10

Kyselina (2S,1/?,4R,5/?)-4-(6-amino-2-jódpurin-9-yl)-7,7-dimetyl-3,6,8-trioxabicyklo[3,3,0]oktán-2-karboxylová (6.7)

K rozmiešanému roztoku 1,6 g (3,7 mmol) [(1/?,2R,4F?,5/?)-4-(6-amino-2jódpurín-9-yl)-7,7-dimetyl-3,6,8-trioxabicyklo[3,3,0]okt-2-yl]metán-1-olu (6.6) v 200 ml H₂O sa pridalo 0,60 g KOH a po kvapkách roztok 1,70 g (10,8 mmol) KMnO₄ v 50 ml H₂O. Zmes sa uložila na tmavé miesto pri laboratórnej teplote na 225 hodín. Reakčná zmes sa potom ochladila na 5 až 10 °C a odfarbila sa roztokom 4 ml 30% H₂O₂ v 16 ml vody, zatiaľ čo teplota sa udržiavala pod 10 °C použitím ľadového slaného kúpeľa. Zmes sa prefiltrovala cez Celit a filtrát sa skoncentroval za zníženého tlaku na približne 10 ml a potom sa okyslil na pH 4 s 2N HCI. Výsledný precipitát sa odfiltroval a premyl s éterom, čim vznikla, po vysušení, zlúčenina 6.7 (70 %) vo forme bielej tuhej látky, t.t. 187 až 190 °C.

Ή NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,11 (s, 1H, H-8), 7,62 (s, 2H, NH₂), 7,46 (s, 1H,

COOH), 6,22 (s, 1H, H-ľ), 5,42 (d, J= 5,71 Hz, 1H, H-2'), 5,34 (d, J= 6,16 Hz, 1H, H3'), 4,63 (s, 1H, H4'), 1,46 a 1,30 (s, 3H, C(CH₃)₂).

Príklad 11

-25• · · · · · · • · · · ··· · · · • · · · · · ··· ·· ·· ··

Kyselina (2S,3R,4/?,5/?)-5-(6-amino-2-jódpurín-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolán-2karboxylová (6.8)

Roztok 1,72 g (3,85 mmol) kyseliny (2S,1R,4/?,5R)-4-(6-amino-2-jódpurín-9-yl)7,7-dimetyl-3,6,8-trioxabicyklo[3,3,0]oktán-2-karboxylovej (6.7) v 80 ml 50% HCOOH sa miešal pri 80 °C 1,5 hodiny. Reakčná zmes sa evaporovala pri zníženom tlaku, rozpustila sa v H₂O a roztok sa znova evaporoval. Tento postup sa opakoval až kým nebol zo zvyšku odstránený zápach kyseliny mravčej. Výťažkom rekryštalizácie z vody bolo 1,33 g (85 %) zlúčeniny 6.8 vo forme bielej tuhej látky, t.t. 221 až 223 °C.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,31 (s, 1H, H-8), 7,68 (s, 2H, NH₂), 5,90 (d, J= 6,55 Hz, 1H, H-ľ), 4,42 (m, 1H, H-2'), 4,35 (d, J= 2,31 Hz, 1H, H-4'), 4,22 (m, 1H, H-3’).

Príklad 12 [(2S,3R,4R,5R)-5-(6-amino-2-jódpurín-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolán-2-yl]-A/etylkarboxamid (6.9)

K ochladenému (5 °C) a rozmiešanému roztoku 1,29 g (3,17 mmol) kyseliny (2S,3/?,4/?,5/?)-5-(6-amino-2-jódpurín-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolán-2-karboxylovej (6.8) v 150 ml absolútneho etanolu sa po kvapkách pridalo ľadom chladených 1,15 ml SOCI₂. Zmes sa cez noc miešala pri laboratórnej teplote a potom sa nastavila na pH 8 s nasýteným vodným NaHCO₃. Zmes sa prefiltrovala a filtrát sa potom skoncentroval pri zníženom tlaku, čím vznikla biela tuhá látka, ktorá sa vysušila a znova rozpustila v 20 ml suchého etylamínu pri -20 °C počas 3 hodín a potom cez noc pri laboratórnej teplote. Reakčná zmes sa nariedila s absolútnym etanolom a precipitovaný produkt sa odfiltroval a premyl so suchým éterom, čím vzniklo 530 mg (72 %) zlúčeniny 6.9 vo forme čistej tuhej látky, t.t. 232 až 234 °C.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,34 (s, 1H, H-8), 8,12 (t, 1H, NH), 7,73 (s, 2H, NH₂), 5,85, (d, J= 6, 93 Hz, 1H, H-ľ), 4,54 (m, 1H, H-2'), 4,25 (d, J=1, 92Hz, 1H, H-4'), 4,13 (m, 1H, H-3'), 3,28 (m, 2H, CH2CH3), 1,00 (t, J= 7,2 Hz, 3H, CH₂CH₃).

Príklad 13

Metyl-4-(3-{9-[(4S,5S,2/?,3R)-5-(/V-etylkarbamoyl)-3,4-dihydroxolán-2-yl]-6-aminopurín2-yl)]}prop-2-ynyl)cyklohexánkarboxylát (DWH-146e)

-26• ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • · ···· ·· • · · · · ··· · · ·

K odplynenému roztoku 25 mg (0,063 mmol) [(2S,3/?,4R,5R)-5-(6-amino-2jódpurín-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolán-2-yl]-N-etylkarboxamidu (6.9), 16,9 mg (0,094 mmol) zlúčeniny 5.5 a 0,75 mg Cul v 5 ml trietylamínu (TEA) a 5 ml acetonitrilu sa pridalo 15 mg Pd(PPH₃)₄. Roztok sa miešal 24 hodín pri 70 °C a potom sa prefiltroval cez Celit a podrobil sa chromatografii na silikagéli a eluoval sa zmesou MeOH-CHCI₃ (5:95), čím vznikla zlúčenina DWH-146e (24 %).

Príklad 14 (4-prop-2-ynylcyklohexyl)metyl acetát (5.6)

Anhydrid kyseliny octovej (0,92 ml, 8,25 mmol) a pyridín (0,2 ml, 2,5 mmol) sa pridali k roztoku zlúčeniny 5.3 (250 mg, 1,65 mmol) v 25 ml éteru. Reakčná zmes sa miešala pri laboratórnej teplote 24 hodín. Do reakčnej zmesi sa pridala voda a organická látka sa ďalej extrahovala s 10% NaHCO₃. Organická vrstva sa vysušila na MgSO₄ a evaporovala sa. Zvyšok sa podrobil chromatografii na silikagéli a eluoval sa so zmesou EtOAc-Hexány (5:95), čím vznikla zlúčenina 5.6 (47 %).

Príklad 15 [4-(3-{9-[(4S,5S,2R,3R)- 5-(/V-etylkarbamoyl)-3,4-dihydroxolán-2-yl]-6-aminopurín-2yl}prop-2-ynyl)cyklohexenyl]metyl acetát (JME193)

K odplynenému roztoku 125 mg (0,29 mmol) [(2S,3R,4/?,5R)-5-(6-amino-2jódpurín-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolán-2-yl]-/\/-etylkarboxamidu (6.9), 150 mg (0,77 mmol) zlúčeniny 5.6 a 1,0 mg Cul v 1,3 ml TEA a 4 ml DMF sa pridalo 25 mg Pd(PPh₃)₄. Roztok sa miešal 72 hodín pri 60 °C a potom sa prefiltroval cez Celit a podrobil sa chromatografii na silikagéli so zmesou MeOH-CHCI₃ (5:95), čím vznikla zlúčenina JMR193 (10 %).

Príklad 16 [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-{3-[4-(hydroxymetyl)-cyklohexyl]prop-2-ynyl}purín-9-yl)3,4-dihydroxyoxolán-2-yl]-A/-etylkarboxamid

A. (4-prop-2-ynylcyklohexyl)metán-1 -ol

-27• ·· ·· ·· ·· ·· · · ···· ··· • ······· • · · · · ··· · · ·

Lítium acetylidetyléndiamínový komplex (90 %) (6,4 g, 70 mmol) sa veľmi pomaly pridal do roztoku írans-[4-(hydroxymetyl)cyklohexyl]metyl-4metylbenzénsulfonátu (3 g, 10 mmol) v 40 ml dimetylsulfoxidu. Reakčná zmes sa miešala 5 dní a potom sa pomaly zastavila pri 0 °C vodou. Táto zmes sa potom nariedila s éterom (300 ml) a trikrát premyla s nasýteným vodným chloridom amónnym (200 ml). Organické látky sa vysušili so síranom sodným. Rozpúšťadlo sa odstránilo pri zníženom tlaku. Produkt sa purifikoval chromatografiou na silikagélovej kolóne a eluoval sa so zmesou etylacetát-hexány (20:80), čím vznikol produkt (85 %).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 3,41 (d, J= 6,5 Hz, 2H), 2,07 (dd, J= 2,5,6,5 Hz, 2H), 1,96-1,75 (m, 5H), 1,41 (m, 2H)„ 095 (m, 4). ¹³C NMR (300 MHz, CDCI3) d 83,8, 69,6,

68,9, 40,7, 37,7, 32,3, 32,3, 29,6, 29,6, 26,5.

B. [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-{3-[4-(hydroxymetyl)cyklohexyl]prop-1-ynyl}purín-9-yl)-

3,4-dihydroxyoxolán-2-yl]-/V-etylkarboxamid (JMR2037)

PD(PPh₃)₄₁ 10 mg, sa pridalo do odplyneného roztoku 28 mg (0,065 mmol) [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-jódpurín-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolán-2-yl]-A/-etylkarboxamidu, 30 mg (0,20 mmol) (4-prop-2-ynylcyklohexyl)metán-1-olu a 1,0 mg Cul v 1 ml trietylaminu (TEA), 1 ml DMF a 1 ml acetonitrilu. Roztok sa miešal 60 hodín pri laboratórnej teplote, potom sa prefiltroval cez Celit a podrobil sa chromatografii na silikagéli s MeOH-CHCI₃ (7:93), čím vzniklo 5 mg (17 %) zlúčeniny JMR2037. Zlúčenina z názvu príkladu sa testovala použitím tu opísaných väzobných testov a zistilo sa, že sa viaže na rekombinantné ľudské A^ receptory, Ki má hodnotu 694 ± 69 nM.

Príklad 17

Väzobné štúdie s rádioaktívnym ligandom

Viazanie na A^ receptore sa stanovovalo použitím rádioaktívneho ligandu ¹²⁵lZM241385. Obrázok 2B znázorňuje kompetíciu viazania na rekombinantné ľudské A_2A adenozínové receptory selektívnymi agonistami. DWH-146e je vysoko selektívna voči rekombinantnému ľudskému (hA2A) subtypu. Selektivita voči A₃ receptoru (nie je znázornené) je menej výrazná, ale ešte vždy je 50-násobná. DWH-146e je približne 5-28• · · · · · · • · · · ··· · · · • · · · · · ··· ·· ·· ·· krát účinnejšia ako WRC0470 a približne 50-krát účinnejšia ako CGS21680 (obrázok

1). Neočakávane zaujímavým zistením je, že ester, DWH-146e, je približne 50-krát účinnejší ako kyselina, DWH146a (obrázok 1).

Príklad 17A

Účinok DWH-146e a JMR193 na neutrofilnú oxidatívnu aktivitu

A. Materiály f-met-leu-phe (fMLP), luminol, peroxid dismutáza, cytochróm C, fibrinogén, adenozín deamináza a trypánová modrá sa získali od firmy Sigma Chemical. Ficollhypaque sa nakupoval od ICN (Aurora, OH) a Cardinal Scientific (Šanta Fe, NM) a Accurate Chemicals and Scientific (Westerbury, NY). Endotoxín (lipopolysacharid; E. coli K235) bol od List Biologicals (Campbell, CA). Hanksov vyvážený slaný roztok (HBSS) a limulus amébocytový lyzátový testovací kit boli od BioWittaker (Walkersville, MD). Ľudský sérový albumín (HSA) bol od Cutter Biological (Elkhart, IN). Rekombinantný ľudský nádorový nekrotický faktor alfa bol dodaný firmou Dianippon Phermaceutical Co. Ltd. (Osaka, Japonsko). ZM241385 (4-(-[7-amino-2-(2-furyl)- [1,2,4]-triazolo[2,3a][1,3,5]triazín-5-yl-amino]etyl)fenol) bol dar od Šimona Pouchera, Zeneca Pharmaceuticals, Cheshire, UK. Urobili sa zásobné roztoky (1mM a 10mM v DMSO) a uskladnili sa pri -20 °C.

B. Príprava ľudských neutrofilov

Purifikované neutrofily (približne 98 % neutrofilov a viac ako 95 % z nich bolo živých, čo sa dokázalo farbením trypánovou modrou) obsahujúce menej ako 1 krvnú doštičku na 5 neutrofilov a menej ako 50 pg/ml endotoxínu (limulus amébocytový lyzačný test) sa získali z normálnej heparinizovanej (10 U/ml) žilovej krvi jednokrokovou Ficoll-hypaque separačnou procedúrou (A. Ferrante a ďalší, J. Immunol. Meth., 36, 109 (1980)).

C. Vylučovanie zápalových reaktívnych kyslíkových druhov z iniciovaných a stimulovaných neutrofilov

• ··	··	··	·· ·
·· · ·	• ·	• ·	« · ··
• ·	• e	• ·	• · ·
• ·	• · ·	··· ·	• · ·
• ·	• ·	•	• · ·
··· ····	··	··	·· ··

Chemiluminiscencia

Luminolom zosilnená chemiluminiscencia, čo je miera neutrofilnej oxidatívnej aktivity, je závislá tak na produkcii peroxidu, ako aj na mobilizácii lyzozomálnej granulárnej enzýmovej myeloperoxidázy. Svetlo sa emituje z nestabilných kyslíkových druhov s vysokou energiou, ktoré sú generované aktivovanými neutrofilmi. Purifikované neutrofily (5 až 10x10⁵/ml) sa inkubovali v Hanksovom vyváženom slanom roztoku obsahujúcom 0,1% ľudský sérový albumín (1 ml) s alebo bez DWH146a, DWH-146e, CGS21680 alebo JMR193, s alebo bez rolipramu a s alebo bez nádorového nekrotického faktora alfa (1 U/ml), 30 minút pri 37 °C, pričom sa trepali vo vodnom kúpeli. Potom sa odčítala luminolom (1x1 θ’⁴ M) zosilnená f-met-leu-phe (1 mcM) stimulovaná chemiluminiscencia s Chronolog® Fotometrom (Crono-leg Corp., Havertown, PA) pri 37 °C v minútach 2 až 4. Chemiluminiscencia je uvedená ako relatívny vrchol emitovania svetla (= najvyšší bod krivky) v porovnaní so vzorkami s nádorovým nekrotickým faktorom alfa a bez DWH, JMR alebo rolipramu.

D. Výsledky

Ako je znázornené na obrázku 2, tak JMR193, ako aj DWH-146e znižovali oxidatívnu aktivitu ľudských neutrofilov spustenú nádorovým nekrotickým faktorom alfa a stimulovanú f-met-leu-phe, účinnejšie ako adenozínový A^ receptorový agonista CGS21680, čo bolo merané luminolom zosilnenou chemiluminiscenciou. Horizontálna os udáva koncentráciu CGS21680, DWH-146a, DWH-146e alebo JMR193 (log nM). Vertikálna os udáva výsledný vrchol ľudskej neutrofilnej aktivity ako relatívne množstvo stimulovaného vylučovania reaktívnych kyslíkových druhov, ako bolo zmerané luminolom zosilnenou chemiluminiscenciou, v porovnaní s kontrolnými vzorkami, ktoré neboli iniciované nádorovým nekrotickým faktorom alfa. Priemery SEM (n = 4 až 5 oddelených experimentov)

Údaje pod horizontálnou osou na obrázku 2 udávajú EC₅₀ na redukciu ľudskej neutrofilnej aktivity (na základe údajov na obrázku 2). Priemery SEM (n = 4 až 5 oddelených experimentov). *p<0,05 pre znižovanie IC₅₀ v porovnaní s CGS21680.

JMR193 a DWH-146e znižovali stimulovaný neutrofilný oxidatívny náraz, pričom ich EC_S0 boli nižšie ako 1 nM (0,8 nM, respektíve 0,3 nM). Na rozdiel od toho,

-30• ·· ·· ·· ·· ··· · · ·· · · ·· • · ···· ·· • · · · · ··· · · · • · · · · · · ··· ···· ·· ·· ·· · neboli DWH-146 a CGS21680 - voľné kyselinové adenozínové receptorové antagonisty, tak účinné pri inhibícii stimulovaného neutrofilného nárazu (53 nM, respektíve 9 nM; obrázok 2). DWH-146e inhibícia stimulovaného neutrofilného oxidatívneho nárazu bola antagonizovaná selektívnym A^ AR antagonistom ZM241385.

Ako je znázornené na obrázku 3, JMR193 (1 nM) s rolipramom (100 nM) synergicky znižovali stimulované vylučovanie reaktívnych kyslíkových druhov. Ľudské neutrofily boli iniciované nádorovým nekrotickým faktorom alfa (1 U/ml) a stimulované s f-met-leu-phe (1 μΜ). Vertikálna os udáva percento inhibície oxidatívnej aktivity, ako bolo merané luminolom zosilnenou chemiluminiscenciou. Priemery SEM (n = 4 oddelené experimenty). *p < 0,05 pre synergiu medzi JMR193 a rolipramom v porovnaní so sčítanou aktivitou.

Ako je znázornené na obrázku 4, vysoko selektívny A^ adenozinový receptorový antagonista ZM241385 (100 nM) (ZM) pôsobil proti inhibícii ľudskej neutrofilnej oxidatívnej aktivity prostredníctvom JMR193 (10 nM), ako bolo merané luminolom zosilnenou chemiluminiscenciou. Priemery SEM 4 oddelených experimentov. *p = 0,004 pre ZM241385 pôsobenie proti JMR193 inhibícii oxidatívnej aktivity.

F. Adherencia ľudského neutrofilového [cAMP], a neutrofilov na biologický povrch

24-Jamkové tkanivové kultivačné platne sa pokrývali ľudským fibrinogénom (5 mg/ml v 1,5% uhličitane sodnom; 0,5 ml/jamku; Sigma Chemical) cez noc, pri 37 °C, v 5% CO₂. V jamkách pokrytej platne sa inkubovali neutrofily (3 až 4 x 10⁶/0,5 ml/vzorka) 45 minút v 0,5 ml HBSS s obsahom 0,1% HSA a ADA (1 U/ml), v prítomnosti alebo bez prítomnosti rekombinantného ľudského TNFa (10 U/ml), DWH-146e (3 až 300 nM), rolipramu (300 nM) a/alebo ZM241385 (100 nM). Po inkubovaní sa do jamiek pridalo 0,5 ml HCI (0,2N) a inkubovanie pokračovalo ďalších 45 minút pri laboratórnej teplote, aby sa extrahovalo cAMP. Vzorky sa potom centrifugovali v mikrocentrifúge 2 minúty, aby sa odstránili zvyšky buniek. 0,5 ml vzoriek sa zmrazilo na cAMP analýzu (B. Brooker a ďalší, Science, 194, 270 (1976)). Jamky sa dvakrát premyli s normálnym fýziologickým roztokom a zvyšná monovrstva sa štiepila s 0,2 ml 0,2N NaOH ·· ·· ··· · · ·· · · ·· • · ···· ·· • · ·· ······ · • · · · · · · _ 31 - ..............

obsahujúcim SDS 2 hodiny pri laboratórnej teplote. Proteínové vzorky sa potom zmrazili (- 70 °C) na ďalšiu proteínovú analýzu, aby sa stanovila relatívna PMN adherencia (K. P. Stowell a ďalší, Anál. Biochem., 85, 572 (1978)).

Výsledky

DWH-146e (30 až 300 nM) samostatne a synergický s rolipramom (300 nM) zvyšovala obsah ľudského neutrofilového cAMP a s rolipramom synergický znižovala neutrofilovú adherenciu na fibrinogénom pokrytý povrch (obrázok 5). Účinky DWH146e (300 nM) a rolipramu (300 nM) na produkciu neutrofilového cAMP a na adherenciu boli negatívne ovplyvňované selektívnym A^ adenozínovým receptorovým antagonistom, ZM241385 (ZM; 100 nM). Priemerné SEM 5 oddelených experimentov. *p<0,05 pre znižovanie neutrofilového [cAMP] v porovnaní so situáciou bez DWH146e; **p<0,05 pre znižovanie neutrofilnej adherencie v porovnaní so situáciou bez DWH-146e.

F. Adherenčná ľudská neutrofilová oxidatívna aktivita

Metódy

Použitím metód modifikovaných na základe časti E. sa neutrofily (2x10⁶/ml) z Ficoll-Hypaque separácie inkubovali 15 minút pri 37 °C v 0,45 ml Hanksovho vyváženého slaného roztoku obsahujúceho 0,1% ľudský sérový albumín a adenozín deaminázu (1U/ml), rolipram (300 nM) a DWH-146e (3 až 300 nM). Po inkubovaní sa pridal cytochróm C (120 μΜ) a kataláza (0,062 mg/ml) v prítomnosti alebo v neprítomnosti rekombinantného ľudského nádorového nekrotického faktora alfa (1 U/ml) a 200μί alikvoty bunkovej suspenzie sa okamžite dvojmo preniesli do jamiek 96jamkovej tkanivovej kultivačnej platne s plochým dnom, ktorá sa predtým cez noc pokryla ľudským fibrinogénom. Optická hustota vzoriek sa odčítavala pri 550 nm oproti známym vzorkám peroxid dismutázy (200 U/ml).

G. Výsledky

Ako je znázornené na obrázku 6, inhibícia vylučovania peroxidov z adherovaných ľudských neutrofilov stimulovaných nádorovým nekrotickým faktorom

-32• ·· ·· ·· ·· ··· · · ·· · · ·· • ······· • · ·· ······ · alfa (TNF) na fibrinogénom pokrytom povrchu sa uskutočňovala prostredníctvom rolipramu (300 nM) a DWH-146e. DWH-146e znižovala oxidatívny náraz adherujúcich neutrofilov a synergický znižovala oxidatívny náraz v prítomnosti rolipramu, ktorý samotný nevplýva na neutrofilnú oxidatívnu aktivitu. Horizontálna os udáva koncentráciu DWH-146e v nM a vertikálna os udáva množstvo peroxidu vylúčené neutrofilmi, čo sa meralo prostredníctvom redukcie cytochrómu c. Existuje značná synergia medzi DWH-146e a rolipramom, PDE inhibítorom typu IV, pri znižovaní oxidatívnej aktivity adherenčných ľudských neutrofilov stimulovaných nádorovým nekrotickým faktorom alfa. Priemery SEM replík zo 4 až 5 oddelených experimentov. *p<0,05 pre znižovanie vylučovania peroxidu v porovnaní so situáciou bez DWH-146e; **p<0,05 pre znižovanie vylučovania peroxidu v porovnaní so situáciou bez rolipramu a bez DWH-146e.

Príklad 18

Liečba ischemického/reperfúzneho (l/R) poranenia v obličke s DWH-146e

Na stanovenie toho, či prostredníctvom DWH-146e indukovaná adenozínová receptorová aktivácia redukuje alebo neredukuje plazmatický kreatinín 24 a 48 hodín po l/R poranení u potkanov, podrobili sa potkanie obličky na 45 minút ischémii a na 24 alebo 48 hodín reperfúzii. Kontinuálne prostredníctvom minipumpy sa podávala DWH-146e (0,004 pg/kg/min) alebo vehikulum, pričom sa začalo 5 hodín pred l/R. Ako je znázornené na obrázku 7, DWH-146e významne znižuje plazmatický kreatinín v 7/7 potkanoch (P<0,05) a v 6/6 potkanoch ošetrených s DWH-146e (P<0,001) v 24., respektívne v 48. hodine.

Na stanovenie toho, či je alebo nie je účinok DWH-146e na redukciu plazmatického kreatinínu v potkanoch, ktoré sa podrobili l/R, sprostredkovaný A_2A receptorom, sa podrobili potkanie obličky na 45 minút ischémii a nasledovalo 48 hodín reperfúzie. Kontinuálne prostredníctvom minipumpy sa podávala DWH-146e (0,004 pg/kg/min), pričom sa začalo 5 hodín pred ischémiou. Ako je znázornené na obrázku

8, zlepšenie funkcie obličky sa zvrátilo A^ antagonistom ZM-241385 (0,03 μg/kg/min ekvimolárna dodávacia rýchlosť v porovnaní s DWH-146e) (*P<0,001 pre vehikulum

-33• · · · · · · • · · · ··· · · · • · · · · · ··· ·· ·· ·· vs. DWH; **P<0,05 pre DWH vs. DWH/ZM. N = 5 pre vehikulum, DWH; N = 6 pre

DWH/ZM. Po ANOVA nasledovala Bonferroniho korekcia).

DWH-146e v koncentráciách, ktoré nemajú žiadne hemodynamické účinky, predchádza obličkovému edému, nekróze a zhromažďovaniu červených krviniek vo vnútornej dreni.

Ochrana proti poškodeniu obličiek poskytovaná prostredníctvom DWH-146e (0,01 pg/kg/min s.c. na 48 hodín) bola korelovaná s dramatickou inhibíciou neutrofilnej adherencie na cievny endotel. Verí sa, že inhibicia interakcie medzi neutrofilmi a cievnym endotelom prostredníctvom DWH-146e je zodpovedná, aspoň čiastočne, za ochranu voči poškodeniu obličiek.

Na stanovenie toho, či A_2A-AR aktivácia redukuje alebo neredukuje neutrofily vo vonkajšej dreni potkanov, ktorí sa podrobili l/R použitím Nurolucida®, sa obličky pozorovali pod 100x zväčšením a odobrala sa celá oblička. PMNs sa počítali pozorovaním obličkových rezov pod 250x zväčšením. Obličkové rezy sa prekryli optickými rámikmi viditeľnými pod mikroskopom a v každom rámiku sa spočítali všetky PMNs. Tento systém zabránil tomu, aby sa určitým PMN spočítal viac ako raz. Ako je vidieť na obrázku 9, hustota neutrofilov bola 15,65/mm² pre vehikulum a 3,02/mm² pre ošetrenie s DWH-146e.

Príklad 19

Účinok DWH-146e na pľúcne reperfúzne poranenie

A. Metódy

Použitý bol izolovaný ventilovaný králičí pľúcny model s perfúziou celkovej krvi. Z donorových králikov sa odobrali pľúca potom, ako im bola podaná pľúcna arteriálna PGE, injekcia a potom, ako boli prepláchnuté Euro-Collins konzervačným roztokom, a pľúca sa uskladnili na 18 hodín pri 4 °C. Pľúca zo skupiny I (n=9) slúžili ako kontrolné subjekty. Pľúca zo skupiny II (n=9) sa reperfuzovali s celou krvou, ktorá sa najprv pasážovala cez filter odstraňujúci leukocyty. V skupine III (n=9) sa do krvného reperfuzátu pridala DWH-146e (25 pg/kg) tesne pred reperfúziou a podávala sa počas trvania reperfúzie (1 pg/kg/min). Všetky pľúca sa 30 minút podrobovali reperfúzii a

-34• · · · · · · • · · · ····· · • · · · · · ··· ·· ·· ·· zaznamenával sa pľúcny arteriálny tlak (PAP), odolnosť pľúcnych ciev (PVR), harmónia dýchacích ciest (CPL) a cievna oxygenácia. Myeloperoxidázová aktivita (MPO) sa zaznamenávala na kvantifikáciu spracovania neutrofilov a meral sa pomer mokrej a suchej hmotnosti na demonštráciu pľúcnych edémov.

Výsledky

Cievna oxygenácia v skupine II a v skupine III bola významne vyššia ako v skupine I po 30 minútach reperfúzie (514,27 ± 35,80 a 461,12 ± 43,77 vs. 91,41 ± 20,58 mm Hg, p<0,001). Ako je znázornené na obrázku 10, pľúca zo skupiny II vykazovali progresívne podieľanie sa na pO₂ celkovej reperfúzii. V skorej fáze reperfúzie zlepšilo odstránenie leukocytov v pľúcach skupiny II cievnu oxygenáciu. * p=0,04 (skupina II versus skupina I a III); **p<0,001 (skupiny II a II versus skupina I).

Ako je znázornené na obrázku 11, priemerná PVR v skupine II bola významne znížená v porovnaní s kontrolnými pľúcami (*p<0,001). PVR pľúc skupiny II bola významne nižšia aj ako PVR pľúc, ktoré sa podrobili reperfúzii s krvou zbavenou leukocytov (**p<0,001 versus skupiny I a II). Pľúcna cievna rezistencia bola významne redukovaná v skupine III (22,783 ± 357 dyny.s.cm'⁵) v porovnaní so skupinou II a skupinou I (31,057 ± 1743 a 36,911 ± 2173 dyny.s.cm'⁵, p<0,001). Harmónia dýchacích ciest sa zlepšila v skupinách II a III v porovnaní so skupinou I (1,68 ± 0,08 a 1,68 ± 0,05 vs. 1,36 ±0,13, p=0,03). Mikrovaskulárna permeabilita v skupine III bola redukovaná na 106,82 ± 17,09 v porovnaní so 165,70 ± 21,83 ng Evans-modrej farbičky/gm tkaniva v skupine I (p=0,05). Ako je znázornené na obrázku 12, myeloperoxidázová aktivita v skupine III bola významne nižšia ako v skupine I (*p=0,03). MPO = myeloperoxidáza. Myeloperoxidázová aktivita skupiny III bola 39,88 ± 4,87 v porovnaní s 88,70 ± 18,69 AOD/gm/min v skupine I (p=0,03) a myeloperoxidázová aktivita v skupine II bola 56,06 + 7,46.

C. Závery

DWH-146e redukuje pľúcnu neutrofilnú sekvestráciu a dramaticky zlepšuje funkciu pľúcneho štepu. Neutrofily sú dôležitými zložkami zápalovej kaskády reperfúzneho poranenia a ich zdroj môže zahŕňať tak obiehajúcu krv, ako aj samotný ·· ·· ·· ··

-35• · · · · · · • ·· ······ · ··· ···· ·· ·· ·· · pľúcny štep. Selektívna adenozín-A^ aktivácia prerušuje neutrofilmi sprostredkovanú zápalovú odpoveď a redukuje pľúcne reperfúzne poranenie nasledujúce po transplantácii.

Pod svetelným mikroskopom vykazovali kontrolné pľúca v skupine 1 ťažkú infiltráciu leukocytov a vytváranie edémov v alveolárnych priestoroch po 18 hodinách ischemického uskladnenia a 30 minútach reperfúzie. Táto infiltrácia bola oveľa menšia v pľúcach skupiny II, ktoré sa podrobili reperfúzii s krvou zbavenou leukocytov a v pľúcach skupiny III (ktoré obdržali počas reperfúzie DWH-146e).

Príklad 20

Účinok DWH-146e na vytváranie neointimy po arteriálnom poranení

Aktivácia leukocytov s vylučovaním zápalových cytokínov nastáva po perkutánnej koronárnej intervencii a môže hrať úlohu pri restenóze. V myši nastáva po ligácii spoločnej srdcovej artérie vytváranie robustnej neointimy v prítomnosti intaktného endotelového ohraničenia. Použitím tohto modelu sa C57/BL6 myši náhodne rozdelili v čase ligácie karotídy na dve skupiny, ktorým sa 7 dní podávala infúziou DWH-146e (n=7) alebo vehikulum (n=8) prostredníctvom osmotickej pumpy.

dní po ligácii karotídy sa histomorfometricky demonštrovala významná redukcia v oblasti neointimy (0,005 ± 0,004 mm² vs. 0,021 ± 0,014 mm², p=0,02) a pomeru neointimy a strednej oblasti (0,13 ± 0,07 vs. 0,64 ± 0,44, p=0,01) u ošetrených zvierat v porovnaní s kontrolami. Stredná vrstva bola podobná v oboch skupinách (0,034 + 0,007 mm² vs. 0,036 ± 0,009 mm², p=0,81). Táto výhoda, spočívajúca v obmedzení rastu neointimy, pretrvávala 28 dní. Obrázok 13 sumarizuje účinok DWH146e na inhibíciu rastu neointimy v myšacom LCCA modeli. Tieto experimenty demonštrujú, že v myšacom modeli ligácie karotídy je výsledkom pretrvávajúcej A_2A stimulácie (7 dní) prostredníctvom DWH-146e významná redukcia vytvárania neointimy trvajúca najmenej 21 dní, čo je pravdepodobne sprostredkované jej vplyvom na aktiváciu a funkciu leukocytov.

Príklad 21

Inhibícia vylučovania TNFa endotoxínom stimulovanými ľudskými monocytmi ·· ·· ·· ··

A. Materiály

Ficoll-Hypaque sa nakupoval od ICN (Aurora, OH) a Cardinal Scientific (Šanta Fe, NM) a Accurate Chemicals and Scientific (Westerbury, NY). Endotoxin (lipopolysacharid; E. coli 0111B4) bol od List Biologicals (Campbell, CA). Hanksov vyvážený slaný roztok (HBSS) a limulus amébocytový lyzátový testovací kit boli od BioWittaker (Walkersville, MD). Ľudský sérový albumín (HSA) bol od Cutter Biological (Elkhart, IN). ZM241385 (4-(-[7-amino-2-(2-furyl)-[1,2,4]-triazolo[2,3a][1,3,5]triazín-5-ylamino]etyl)fenol) bol dar od Šimona Pouchera, Zeneca Pharmaceuticals, Cheshire, UK. Urobili sa zásobné roztoky (1mM a 10mM v DMSO) a uskladnili sa pri -20 °C.

B. Produkcia TNFa purifikovanými ľudskými adherenčnými monocytmi Metódy

Monovrstva bohatá na monocyty (< 65 % monocytov) sa pripravila inkubovaním 1 ml mononukleárnej leukocytovej frakcie (5x10⁵/ml) z Ficoll-Hypaque separácie (A. Ferrante a ďalší, J. Immunol. Meth., 36, 109, (1980)) v jamkách 24-jamkovej tkanivovej kultivačnej platne (1 hodina; 37 °C, 5 % CO₂). Neadherované leukocyty sa odstránili premývaním a do jamiek obsahujúcich adherované mononukleárne bunky sa pridalo kultivačné médium (1 ml Hanksovho vyváženého slaného roztoku, obsahujúceho 0,1% ľudský sérový albumín, adenozín deaminázu [5 U/ml] a 1% teplom inaktivované autológne sérum). Pridali sa nasledujúce zložky, ako je uvedené;

(1) endotoxin (100 ng/ml) a A^ AR selektívny antagonista ZM241385 (100 nM) a (2) A_2A adenozínové receptorové selektívne antagonisty JMR193 (1 až 1000 nM), DWH146e (1 až 1000 nM) a CGS21680 (10 až 1000 nM). Vzorky sa potom inkubovali 4 hodiny (37 °C, 5% CO₂) a odobrali sa supernatanty. Akékoľvek suspendované bunky sa odstránili centrifugáciou a bezbunkové vzorky sa zmrazili (-70 °C). TNFa sa testoval v bezbunkových supernatantoch (n=6) ELISA kitom (Coulter/lmmunotech, Miami, FL).

C. Výsledky

-37·· ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · · • · · · ··· · · · • · · · · · ··· ·· ·· ··

Ako je znázornené na obrázku 14, adenozínové receptorové agonisty znižovali produkciu TNFa endotoxínom-stimulovanými adherenčnými monocytmi. A^ AR selektívny antagonista ZM241385 (100 nM) antagonizoval účinky JMR193 na produkciu TNFa (obrázok 15).

Takže DWH-146e a JMR193 znižujú LPS endotoxínom stimulovanú produkciu TNFa ľudskými monocytmi mechanizmom, ktorý je závislý na agonistickom naviazaní na A^ adenozínové receptory.

Príklad 22

Aktivita DWH-146e v hlodavčom modeli zápalu pobrušnice

Predchádzajúce pokusy s experimentálnym zápalom pobrušnice zahŕňali injekciu zymosanu (Zym) ako potenciálneho stimulu zápalu (Y. Zhang a ďalší, Eur. J. Pharmacol., 313, 237 (1996)). Ako je znázornené na obrázku 16, po injekcii zymosanu bola priemerná koncentrácia leukocytov, stanovená Neubauerovým hemocytometrom, 7,325 ± 1,893/mm³. Intraperitoneálna injekcia DWH-146e v dávke 2,5 gg/kg hodinu pred podaním zymosanu inhibovala vývoj zápalu pobrušnice s priemernou ± SEM leukocytovou koncentráciou 2,012 ± 374/mm³, o 6 hodín neskôr (p<0,05). Takže tieto štúdie demonštrujú, že A^ AR sa podieľa na sprostredkovaní prechodu PMN do peritonea po stimulovaní zymosanom.

Príklad 23

Ochrana srdca sprostredkovaná protizápalovým účinkom JMR193

Zlúčeniny podľa vynálezu boli testované prostredníctvom indukcie myokardického omráčenia, čo je forma poranenia srdca, ktorá nastáva po opakovaných, prechodných periódach prerušovania koronárneho obehu krvi prostredníctvom opakovaného prerušovania dodávania krvi koronárnou artériou.

A. Účinok štyroch cyklov zastavenie-reperfúzia

Ľavé predné zostupujúce (LAD) koronárne cievy skupiny psov sa izolovali a kruhovo ohraničili kovovou svorkou. 4 krát po piatich minútach sa u psov zastavilo dodávanie krvi LAD artériou. Po každom zastavení sa na 10 minút obnovil prietok krvi.

·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • ······· • · · · · ··· · · · • · · · · · · __ ··· ···· ·· ·· ·· ·

-38Jednej skupine šiestich psov sa infúziou podával roztok obsahujúci acetátovú zlúčeninu (JMR193) pripravenú v príklade 15 (0,01 pg/kg/min) po každej zastavovacej perióde. Druhej skupine šiestich psov sa infúziou podával roztok obsahujúci vehikulum (nosič). Po každom cykle zastavenia a reperfúzie sa monitorovala 3 hodiny srdcová funkcia zvierat.

Výsledky sú ilustrované na obrázkoch 17 a 18. Obrázok 17 znázorňuje hrubnutie systolickej ľavej komory (LV) u 6 kontrolných psov. Srdcové hrubnutie bolo redukované na približne 50 % 3 hodiny po poslednom zastavení. Obrázok 18 znázorňuje LV hrubnutie u 6 psov, ktoré dostali i.v. infúziu testovanej zlúčeniny JMR193 (0,01 pg/kg/min), pričom sa začalo v začiatočnej perióde a pokračovalo sa v priebehu celého experimentu. Srdcová funkcia sa pri JMR193 infúzii vrátila takmer do normálu už 90 minút po reperfúzii.

B. Účinok desiatich cyklov zastavenia-reperfúzie

Dve ďalšie skupiny psov sa podrobili desiatim (a nie 4) cyklom zastaveniareperfúzie, pričom každé zastavenie trvalo 5 minút a striedalo sa s 5 minútami reperfúzie. V tomto príklade sa dvom zvieratám infúziou podával roztok obsahujúci acetátovú zlúčeninu (JMR193), pripravenú v príklade 15 (0,01 pg/kg/min), po každej perióde zastavenia. Ďalším trom zvieratám sa infúzne podával roztok obsahujúci vehikulum (nosič). Po každom cykle zastavenia-reperfúzie sa 3 hodiny monitorovala funkcia srdca zvierat.

Výsledky sú ilustrované na obrázkoch 19 a 20. Obrázok 19 znázorňuje hrubnutie systolickej ľavej komory u 3 kontrolných zvierat. Išlo o ťažší zásah do srdca ako v príklade 23A a výsledkom bolo, že LV hrubnutie hneď po reperfúzii úplne chýbalo a LV ostala akinetická 3 hodiny. Obrázok 20 znázorňuje LV hrubnutie u 2 psov, ktorým sa podávala i.v. infúzia testovacej zlúčeniny, JMR193 (0,01 pg/kg/min), pričom sa začalo na základnej úrovni a pokračovalo sa v priebehu experimentu. V porovnaní s kontrolnou skupinou vykazovali psi, ktoré obdržali JMR193 infúziu, významné a značné zlepšenie funkcie srdca okamžite po reperfúzii, čo pretrváva 3 hodiny.

·· ·· ·· ·· · ·· • · • ···· • · · ··· · · • · · · ·· ·· ··

C. Účinok acetátovej zlúčeniny JMR193 na príjem neutrofilov počas zastaveniareperfúzie

Niektorým zvieratám boli podávané rádioaktívne označené neutrofily. (Neutrofily sa izolovali z krvi psov, inkubovali sa so zlúčeninou obsahujúcou ⁹⁹ⁿTc, a znova sa injekčné zaviedli do psov). ^99mTc-značené neutrofilmi sa podávali intravenózne ako marker na stanovenie úrovne zápalu v reperfúznej zóne po štyroch cykloch ischémie-reperfúzie. Zápal z cyklov zastavenia-reperfúzie spôsobil adherenciu rádioaktívnych neutrofilov a bol kvantifikovaný gama-fotoaparátom. Neutrofilová adherencia sa inhibovala prostredníctvom JMR193. Výsledky sú ilustrované na obrázku 21, kde je lokalizácia ^99mTc-značených neutrofilov u psov ošetrených len s vehikulom (čierne stĺpce) väčšia než u psov ošetrených s JMR193 (šrafované stĺpce). Takže redukcia rádioaktívne označených neutrofilov v centrálnej ischemickej zóne spôsobená JMR193 infúziou ilustruje redukciu (*) srdcového zápalu.

Zo štúdií opísaných v príklade 23A a 23B vyplýva, že srdcový zápal hrá významnú zraňujúcu úlohu pri spôsobovaní myokardického omráčenia. Okrem toho, podávanie adenozínového A^ receptorového agonistu, ako napríklad JMR193, buď zabraňuje miernemu omráčeniu (obrázky 17 a 18), alebo významne oslabuje myokardickú dysfunkciu sprevádzajúcu ťažké omráčenie (obrázky 19 a 20).

Všetky publikácie, patenty a patentové dokumenty sú tu zahrnuté ich citáciou. Vynález bol opísaný s odvolaním sa na rôzne konkrétne a výhodne uskutočnenia a techniky. Avšak je potrebné tomu rozumieť tak, že je možné uskutočniť nohé variácie a modifikácie bez toho, aby sa vybočilo z ducha a rozsahu vynálezu.

Claims (54)

1. PATENTOVÉ NÁROKY ·· • · · ··· · · · • ···· ·· • · · ·· ·· • ·· ···

   1. Zlúčenina vzorca I:

   (I)

   OH OH kde

   a) každé R znamená nezávisle vodík, C^-alkyl, C₃.₇-cykioalkyl, fenyl alebo feny^C^)alkyl;

   b) X znamená -CH₂OH, -CO₂R², -OC(O)R², -CH₂OC(O)R² alebo C(O)NR³R⁴;

   c) každý z R^z, R³ a R⁴ nezávisle znamená H, C_M-alkyl; C^g-alkyl substituovaný s jedným až troma C_V6-alkoxy, C₃.₇-cykloalkylmi, C-^-alkyltio, halogénmi, hydroxy, amino, mono(C₁._e-alkyl)amino, d^C^-alkyljamino alebo C₆.₁₀-arylmi, pričom aryl môže byť substituovaný s jedným až troma halogénmi, C₁₆-alkylmi, hydroxy, amino, mono(C₁.₆’ alkyl)amino alebo di(C₁.₆-alkyl)amino; C₆.₁₀-aryl; alebo C₆.₁₀-aryl substituovaný s jedným až troma halogénmi, hydroxy, amino, monoíC^-alkyOamino alebo dKC^-alkyljamino alebo C^e-alkylmi;

   d) Z a Z’ nezávisle znamenajú C^-alkyl voliteľne prerušený jednou až troma sírami alebo neperoxidovými kyslíkmi, alebo chýbajú a n znamená 1 až 3;

   alebo jej farmaceutický prijateľné soli.
2. 2. Zlúčenina podľa nároku 1, kde 5’-X znamená -CH₂OH alebo -C(O)NR³R⁴.
3. 3. Zlúčenina podľa nároku 2, kde 5’-X znamená -C(O)NR³R⁴.
4. 4. Zlúčenina podľa nároku 3, kde R³ znamená H a R⁴ znamená C_Malkyl.

   ·· ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · ··· · · · • · · · · · • ···· ·· ··
5. 5. Zlúčenina podľa nároku 1, kde každé R znamená H alebo C₁₄alkyl.
6. 6. Zlúčenina podľa nároku 1, kde Z’ znamená -CH₂- alebo -CH₂-CH₂-.
7. 7. Zlúčenina podľa nároku 6, kde Z znamená -CH₂- alebo -CH₂-CH₂-.
8. 8. Zlúčenina podľa nároku 1, kde C₃.₁₀-cykloalkyl znamená cyklohexyl alebo cyklopentyl.
9. 9. Zlúčenina podľa nároku 8, kde X znamená C^-alkoxykarbonyl, C(O)NR³R⁴ alebo acetoxymetyl.
10. 10. Zlúčenina podľa nároku 8, kde X-Z znamená HO₂C-Z-.
11. 11. Zlúčenina podľa nároku 8, kde X-Z a Z’ sú na C₃.₁₀-cykloalkyle v polohe trans.
12. 12. Zlúčenina podľa nároku 1, kde R znamená H, 5’-X znamená etylaminokarbonyl a (X-Z-)_n[C₃.₁₀-cykloalkyl]-Z’-C=C- znamená 2-(4-metoxykarbonylcyklohexylmetyl)etinyl alebo 2-(4-karboxycyklohexylmetyl)etinyl.
13. 13. Zlúčenina podľa nároku 1, kde R znamená H, 5’-X znamená etylaminokarbonyl a (X-Z-)_n[C₃.₁₀-cykloalkyl]-Z’-CsC- znamená 2-(4-acetoxymetylcyklohexylmetyl)etinyl.
14. 14. [4-(3-{9-(2/?,3R,4S,5S)-5-(/\/-Etylkarbamoyl)-3,4-dihydroxyoxolán-2-yl]-6 aminopurín-2-yl}prop-2-ynyl)cyklohexyl]metylacetát alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.

    -4215.

    [(2R,3R,4S,5S)-5-(6-amino-2-{3-[4-(hydroxymetyl)cyklohexyl]prop-1·· ·· ·· • · · ·· · • · · ·· • ··· · ·· • · ·· ·· ·· ·· · ynyl}purín-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolán-2-yl]-/V-etylkarboxamid alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
15. 16. Metyl 4-(3-{9-[(2/?,3R,4S,5S)-5-(A/-etylkarbamoyl)-3,4-dihydroxyoxolán-2-yl]6-aminopurín-2-yl)}prop-1-ynyl)cyklohexánkarboxylát alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
16. 17. Kyselina 4-(3-{9-[(2R,3R,4S,5S)-5-(A/-etylkarbamoyl)-3,4-dihydro-xyoxolán-

    2-yl]-6-aminopurín-2-yl)}prop-1-ynyl)cyklohexánkarboxylová alebo jej farmaceutický prijateľná soľ.

    flí f 1
17. 18. Zlúčenina podľa nároku iMa použitie na medicínsku liečbu.
18. 19. Zlúčenina podľa kteféhokotvek-z· nárokev- pričom medicínskou liečbou je inhibícia zápalovej odpovede.
19. 20. Zlúčenina podľa nároku 18, kde 5’-X znamená CH₂OH alebo C(O)NR³R⁴.
20. 21. Zlúčenina podľa nároku 18, kde 5’-X znamená -C(O)NR³R⁴.
21. 22. Zlúčenina podľa nároku 21, kde R³ znamená H a R⁴ znamená C_M-alkyl.
22. 23. Zlúčenina podľa nároku 18, kde každé R znamená H alebo C^-alkyl.
23. 24. Zlúčenina podľa nároku 18, kde Z’ znamená -CH₂- alebo -CH₂-CH₂-.
24. 25. Zlúčenina podľa nároku 18, kde Z znamená -CH₂- alebo -CH₂-CH₂-.
25. 26. Zlúčenina podľa nároku 18, kde C₃._w-cykloalkyl znamená cyklohexyl alebo cyklopentyl.

    • ·· ·· ·· ·· • ········ • · · · · ··· · · · · ·· ·· ···· ··· ···· ·· ·· ·· ···
26. 27. Zlúčenina podľa nároku 26, kde X znamená C^-alkoxykarbonyl, alebo acetoxymetyl.
27. 28. Zlúčenina podľa nároku 26, kde X-Z znamená HO₂C-Z-.
28. 29. Zlúčenina podľa nároku 26, kde X-Z a Z’ sú na C₃.₁₀-cykloalkyle v polohe trans.
29. 30. Zlúčenina podľa nároku 18, kde R znamená H, X znamená etylaminokarbonyl a (X-Z-)_n[C₃.₁₀-cykloalkyl]-Z’-C=C- znamená 2-(4-metoxykarbonylcyklohexylmetyl)etinyl alebo 2-(4-karboxycyklohexylmetyl)etinyl.
30. 31. Zlúčenina podľa nároku 18, kde R znamená H, X znamená etylaminokarbonyl a (X-Z-)_n[C₃.₁₀-cykloalkyl]-Z’-OC- znamená 2-(4-acetoxymetylcyklohexylmetyl)etinyl.
31. 32. Zlúčenina podľa nároku 18, ktorou je [4-(3-{9-(2R,3R,4S,5S)-5-(/Vetylkarbamoyl)-3,4-dihydroxyoxolán-2-yl]-6-aminopurín-2-yl}prop-1-ynyl)cyklohexyl]metylacetát.
32. 33. Zlúčenina podľa nároku 18, ktorou je [(2R,3R,4S,5S)-5-(6-amino-2-{3-[4(hydroxymetyl)cyklohexyl]prop-1-ynyl}purín-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolán-2-yl]-/\/etylkarboxamid.
33. 34. Zlúčenina podľa nároku 18, ktorou je metyl 4-(3-{9-[(2R,3R,4S,5S)-5-(/Vetylkarbamoyl)-3,4-dihydroxyoxolán-2-yl]-6-aminopurín-2-yl)}prop-1-ynyl)cyklohexánkarboxylát.

    -4435. Zlúčenina podľa nároku 18, ktorou je kyselina 4-(3-{9-[(2/?,3/?,4S,5S)-5-(/Vetylkarbamoyl)-3,4-dihydroxyoxolán-2-yl]-6-aminopurín-2-yl)}prop-1-ynyl)cyklohexánkarboxylová.

    A ·· ·· ·· ·· ·· · · • • • · • · • • · • • • · • · • · • · • ··· • · • • · • • • • • ··· ···· ·· ·· ·· •
34. 36. Zlúčenina podľa nároku 18, pričom medicínska liečba ďalej zahŕňa použitie fosfodiesterázového inhibítora typu IV.
35. 37. Zlúčenina podľa nároku jX, kde inhibítorom je rolipram.
36. 38. Zlúčenina podľa ischémiou.
37. 39. Zlúčenina podľa aterosklerózou.
38. 40. Zlúčenina podľa autoimunitným ochorením.

    nároku 19, pričom zápalová nároku 19, pričom zápalová nároku 19, pričom zápalová odpoveď je spôsobená odpoveď je spôsobená odpoveď je spôsobená
39. 41. Zlúčenina podľa nároku 19, pričom zápalová odpoveď je spôsobená ischemickým/reperfúznym poranením.
40. 42. Zlúčenina podľa nároku 19, pričom zápalová odpoveď je v srdci, obličke alebo pľúcach.
41. 43. Zlúčenina podľa nároku 19, pričom zápalová odpoveď je spôsobená mŕtvicou, traumatickým poranením mozgu alebo poranením miechy.
42. 44. Zlúčenina podľa nároku 19, pričom zápalová odpoveď je spôsobená transplantáciou orgánu, tkaniva alebo bunky.
43. 45. Zlúčenina podľa nároku 19, pričom zápalová odpoveď je spôsobená infekciou.
44. 46. Zlúčenina podľa nároku 19, pričom zápalová odpoveď je spôsobená kožným ochorením.
45. 47. Zlúčenina podľa nároku 19, pričom zápalová odpoveď je spôsobená angioplastikou, umiestnením stentu, umiestnením umelej cievky alebo umiestnením štepu.
46. 48. Zlúčenina podľa nároku 19, pričom zápalová odpoveď je spôsobená alergickým ochorením.
47. 49. Zlúčenina podľa nároku 19, pričom zápalová odpoveď je spôsobená chorobou chradnutia - stratou váhy.
48. 50. Zlúčenina podľa nároku 19, pričom zápalová odpoveď je spôsobená imunosupresívnou liečbou.
49. 51. Zlúčenina podľa nároku 19, pričom zápalová odpoveď je spôsobená takým patologickým stavom alebo symptómom cicavca, na ktorom sa podieľa aktivita A_2A adenozínových receptorov, a pri ktorom je želateľný agonizmus tejto aktivity.
50. 52. Použitie zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 17 na prípravu lieku užitočného na liečbu zápalovej odpovede.
51. 53. Použitie podľa nároku 52, pričom liek obsahuje inhibítor fosfodiesterázy typu IV.
52. 54. Použitie podľa nároku 53, pričom fosfodiesterázovým inhibítorom je rolipram.
53. 55. Použitie podľa nároku 53, pričom liek obsahuje kvapalný nosič.
54. 56. Použitie podľa nároku 53, pričom liečivo je adaptované na parenterálne podanie.