ES2215609T3

ES2215609T3 - Composiciones para el tratamiento de la respuesta inflamatoria.

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Publication number: ES2215609T3
Application number: ES00905833T
Authority: ES
Inventors: Joel M. Linden; Gail W. Sullivan; Ian J. Sarembock; Timothy Macdonald; Mark Okusa; Irving L. Kron; W. Michael Scheld
Original assignee: University of Virginia UVA; University of Virginia Patent Foundation
Current assignee: UVA Licensing and Ventures Group; University of Virginia UVA
Priority date: 1999-02-01
Filing date: 2000-01-31
Publication date: 2004-10-16
Anticipated expiration: 2020-01-31
Also published as: SK10972001A3; AU2005201255B2; KR20020013494A; AU2005201255A1; PT1150991E; UA72912C2; HUP0200224A3; JP4837831B2; PL199953B1; NO20013507L; NO20013507D0; DK1150991T3; SK284877B6; CA2361614A1; NO321216B1; EE05185B1; CN1191266C; KR100668006B1; IL144188A; WO2000044763A2

Abstract

Compuesto de fórmula (1): en la que (a) cada R es individualmente hidrógeno, alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C7, fenilo o fenilalquilo(C1-C3); (b) X es -CH2OH, -CO2R2, -OC(O)R2, o C(O)NR3R4; (c) cada uno de R2, R3 y R4 es individualmente H, alquilo C1-C6; alquilo C1-C6 sustituido con 1 - 3 de alcoxi C1-6, cicloalquilo C3-C7, alquiltio C1-6, halógeno, hidroxi, amino, mono(alquil C1-6)amino, di(alquil C1-6)amino, o arilo C6-10, en la que el arilo puede estar sustituido con 1 ¿ 3 de halógeno, alquilo C1- 6, hidroxi, amino, mono(alquil C1-6)amino, o di(alquil C1-6)amino; arilo C6-10; o arilo C6-10 sustituido con 1 - 3 de halógeno, hidroxi, amino, mono(alquil C1-6)amino, di(alquil C1-6)amino o alquilo C1-C6; (d) Z y Z¿ son individualmente alquilo (C1-C6), opcionalmente interrumpido por l - 3 S u O no peróxido, o están ausentes, y n es 1 - 3; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

Composiciones para el tratamiento de la respuesta inflamatoria.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para evitar la lesión tisular, es decir, debida a la actividad inflamatoria.

Antecedentes de la invención

La respuesta inflamatoria sirve para eliminar agentes nocivos del organismo. Hay una gran variedad de ataques patógenos que pueden iniciar una respuesta inflamatoria, incluyendo infección, alergenos, estímulos autoinmunes, respuesta inmune a tejidos transplantados, productos químicos nocivos y toxinas, isquemia/reperfusión, hipoxia, traumatismo mecánico y térmico. La inflamación normalmente es una acción muy localizada que sirve en la expulsión, atenuación por dilución y aislamiento del agente nocivo y del tejido lesionado. La respuesta del organismo se convierte en un agente de la enfermedad cuando da como resultado una lesión inapropiada para los tejidos huésped en el proceso de eliminar el agente diana o de responder a un traumatismo.

Como ejemplos, la inflamación es un componente de la patogenia en varias enfermedades o lesiones vasculares. Los ejemplos incluyen: lesión de isquemia/reperfusión (N. G. Frangogiannis et al., en Myorcardial Isquemia: Mechanisms, Reperfusion, Protection. M. Karmazyn, ed., Birkhuser Verlag (1996) en 236-284; H. S. Sharma et al., Med. of Inflamm., 6, 175 (1987)), ateroesclerosis (R. Ross, Nature, 362, 810 (1993)), aneurismas aórticos inflamatorios (N. Girardi et al., Ann. Thor. Surg., 64, 251 (1997); D. L. Walker et al., Brit. J. Surg., 59, 609 (1972); R. L. Pennell et al., J. Vasc. Surg., 2, 859 (1985)) y reestenosis tras angioplastia de balón (véase, R. Ross, citado anteriormente). Las células que participan en la inflamación incluyen leucocitos (es decir, las células del sistema inmune: neutrófilos, eosinófilos, linfocitos, monocitos, basófilos, macrófagos, células dendríticas, y mastocitos), el endotelio vascular, células del músculo liso vascular, fibroblastos y miocitos.

La liberación de citocinas inflamatorias, tales como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha) por los leucocitos es un medio por el que el sistema inmune combate las invasiones patógenas, incluyendo las infecciones. El TNF\alpha estimula la expresión y la activación de los factores de adherencia en leucocitos y células endoteliales, sensibiliza a los neutrófilos para mejorar la respuesta inflamatoria a estímulos secundarios e intensifica la actividad oxidativa del neutrófilo adherente. Véase, Sharma el al., citado anteriormente. Además, los macrófagos/células dendríticas actúan como células accesorias que procesan el antígeno para su presentación a los linfocitos. Los linfocitos, a su vez, llegan a estimularse para actuar como células citotóxicas pro-inflamatorias.

Generalmente, las citocinas estimulan a los neutrófilos para que intensifiquen la actividad inflamatoria oxidativa (por ejemplo, superóxidos y productos secundarios) y no oxidativa (por ejemplo, mieloperoxidasa y otras enzimas). La liberación inapropiada y en exceso de las citocinas puede producir efectos patógenos exagerados y contraproducentes mediante la liberación de productos oxidativos y no oxidativos que dañan los tejidos (K. G. Tracey et al., J. Exp. Med., 167, 1211 (1988); y D. N. Männel et al., Rev, Infect. Dis., 9 (anexo 5), S602-S606 (1987)). Por ejemplo, el TNF\alpha puede inducir a los neutrófilos a adherirse a la pared de los vasos sanguíneos y después a migrar a través del vaso hasta el sitio de la lesión y liberar sus productos inflamatorios oxidativos y no oxidativos.

Aunque los monocitos se reúnen lentamente en los focos de inflamación, dadas condiciones favorables, los monocitos se desarrollan en células accesorias residentes y macrófagos a largo plazo. Con la estimulación con un desencadenante de la inflamación, los monocitos/macrófagos también producen y segregan una serie de citocinas (incluyendo el TNF\alpha), complemento, lípidos, especies de oxígeno reactivas, proteasas y factores de crecimiento que reorganizan el tejido y regulan las funciones del tejido circundante.

Por ejemplo, se ha demostrado que las citocinas inflamatorias son pagótenas en: artritis (C. A. Dinarello, Semin. Immunol., 4, 133 (1992)); isquemia (A. Seekamp et al., Agents-Actions-Supp, 41, 137 (1993)); choque septicémico (D. N. Männel et al., Rev. Infect. Dis., 9 (anexo 5), S602-S606 (1987)); asma (N. M. Cembrzynska et al., Am. Rev. Respir. Dis., 147, 291 (1993)); rechazo en el transplante de órganos (D. K. Imagawa et al., Transplantation, 51, 57 (1991); esclerosis múltiple (H. P. Hartung, Ann. Neurol., 33, 591 (1993)); SIDA (T. Matsuyama et al., AIDS, 5, 1405 (1991)); y en ojos quemados con álcali (F. Miyamoto et al., Opthalmic Res., 30, 168 (1997)). Además, la formación de superóxido en los leucocitos se ha relacionado con la estimulación de la replicación en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (S. Legrand-Poels et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 6, 1389 (1990)).

Se sabe bien que la adenosina y algunos análogos de la adenosina que activan de manera no selectiva a los subtipos del receptor de la adenosina disminuyen la producción por parte del neutrófilo de productos oxidativos inflamatorios (B. N. Cronstein et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 451, 291 (1985); P. A. Roberts et al., Biochem. J., 227, 669 (1985); D. J. Schrier et al., J. Immunol., 137, 3284 (1986); B. N. Cronstein et al., Clinical Immunol. and Immunopath., 42, 76 (1987); M. A. Iannone et al., en Topics and Perspective in Adenosine Research, E. Gerlach et al., eds., Springer-Verlag, Berlín, pág. 286 (1987); S. T. McGarrity et al., J. Leukocyte Biol., 44, 411421 (1988); J. De La Harpe et al., J lmmunol., 143, 596 (1989); S. T. McGarrity et al., J. Immunol., 142, 1986 (1989); y C. P. Nielson et al., Br. J. Pharmacol., 97, 882 (1989)). Por ejemplo, se ha demostrado que la adenosina inhibe la liberación de superóxido de los neutrófilos estimulada por factores quimiotácticos, tales como el imitador sintético de péptidos bacterianos, f-met-leu-phe (fMLP), y el componente del complemento C_{5}a (B. N. Cronstein et al., J. Immunol., 135, 1366 (1985)). La adenosina puede disminuir la oleada oxidativa intensificada enormemente de los PMN (leucocitos polimorfonucleares) (neutrófilos) sensibilizados primero con el TNF-\alpha y estimulados después por un segundo estímulo, tal como f-met-leu-phe (G. W. Sullivan et al., Clin. Res., 41, 172A (1993)). Además, se ha notificado que la adenosina puede disminuir la velocidad de replicación del VIH en una línea de células T (S. Sipka et al., Acta. Biochem. Biopys Hung., 23, 75 (1988)). Sin embargo, no hay evidencia de que la adenosina in vivo tenga actividad antiinflamatoria (G. S. Firestein et al., Clin. Res., 41, 170A (1993); y B. N. Cronstein et al., Clin. Res., 41, 244A (1993)).

Se ha sugerido que hay más de un subtipo de receptor de adenosina en los neutrófilos que pueden tener efectos opuestos en la liberación de superóxido (B. N. Cronstein et al., J Clin. Invest., 85, 1150 (1990)). La existencia del receptor A_{2A} en los neutrófilos se demostró originalmente por Van Calker et al. (D. Van Calker et al., Eur. J. Pharmacology, 296, 285 (1991)).

Ha habido un desarrollo progresivo de compuestos que son cada vez más potentes y/o selectivos como agonistas de los receptores de la adenosina (AR) A_{2A}, basado en ensayos de unión a radioligandos y respuestas fisiológicas. Inicialmente, se desarrollaron compuestos con poca o ninguna selectividad por los receptores A_{2A}, tales como la propia adenosina o las 5'-carboxamidas de la adenosina, tal como la 5'-N-etilcarboxamidoadenosina (NECA) (B. N. Cronstein et al., J. Immunol., 135, 1366 (1985)). Posteriormente, se demostró que la adición de sustituyentes 2-alquilamino aumentaba la potencia y la selectividad, por ejemplo, CV1808 y CGS21680 (M. F. Jarvis et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 251, 888 (1989)). Los derivados de la adenosina 2-alcoxi-sustituidos, tales como WRC-0090, son todavía más potentes y selectivos como agonistas en el receptor A_{2A} en la arteria coronaria (M. Ueeda et al., J. Med. Chem., 34, 1334 (1991)). Los 2-alquilhidrazino-derivados de la adenosina, por ejemplo, SHA 211 (también denominados WRC-0474) también se han evaluado como agonistas en el receptor A_{2A} en la arteria coronaria (K. Niiya et al., J. Med. Chem., 35, 4557 (1992)).

Hay un informe sobre la combinación de análogos de adenosina relativamente no específicos, R-fenilisopropiladenosina (R-PIA) y 2-cloroadenosina (Cl-Ado) con un inhibidor de la fosfodiesterasa (PDE), dando como resultado una disminución en la actividad oxidativa del neutrófilo (M. A. Iannone et al., Topics and Perspectives in Adenosine Research, E. Garlach et al., eds., Springer-Verlag, Berlín, págs. 286-298 (1987)). Sin embargo, los análogos R-PIA y Cl-Ado son en realidad activadores más potentes de los receptores de la adenosina A_{1} que los receptores de la adenosina A_{2A} y, por tanto, probablemente produzcan efectos secundarios debido a la activación de los receptores A_{1} en el músculo cardiaco y en otros tejidos, produciendo efectos tales como el "bloqueo cardiaco".

R. A. Olsson et al. (patente de los EE.UU. número 5.278.150) describen agonistas selectivos del receptor A_{2} de la adenosina de fórmula:

1

en la que Rib es ribosilo, R_{1} puede ser H y R_{2} puede ser cicloalquilo. Los compuestos se describen como útiles para tratar la hipertensión, la ateroesclerosis y como vasodilatores.

Olsson et al. (patente de los EE.UU. número 5.140.015), describen ciertos agonistas del receptor A_{2} de la adenosina de fórmula:

2

en la que C(X)BR_{2} puede ser CH_{2}OH y R_{1} puede ser alquilo o alcoxialquilo. Los compuestos se describen como útiles como vasodilatadores o antihipertensores.

Linden et al. (patente de los EE.UU. número 5.877.180), se basan en el descubrimiento de que ciertas enfermedades inflamatorias, tales como la artritis y el asma, pueden tratarse eficazmente mediante la administración de compuestos que son agonistas selectivos de los receptores A_{2A} de la adenosina, preferiblemente en combinación con un inhibidor de la fosfodiesterasa de tipo IV. Una realización de la invención de Linden et al., prevé un método para tratar enfermedades inflamatorias mediante la administración de una cantidad eficaz de un receptor A_{2A} de la adenosina de la fórmula siguiente:

3

en la que R y X son tal como se describe en la patente.

En una realización preferida, la invención de Linden et al. supone la administración de un inhibidor de la fosfodiesterasa (PDE) de tipo IV en combinación con el agonista del receptor A_{2A} de la adenosina. El inhibidor de la fosfodiesterasa (PDE) de tipo IV incluye las 4-(polialcoxifenil)-2-pirrolidonas racémicas y ópticamente activas de la siguiente fórmula:

4

en la que R', R^{18}, R^{19} y X son tal como se describen en la patente de los EE.UU. número 4.193.926. El rolipram es un ejemplo de inhibidor de PDE de tipo adecuado incluido dentro de la fórmula anterior.

G. Cristalli (patente de los EE.UU. número 5.593.975) describe derivados de 2-ariletinilo, 2-cicloalquiletinilo o 2-hidroxialquiletinilo, en los que el residuo de ribosida se sustituye por carboxiamino o carboxiamino sustituido (R_{3}HNC(O)-). Miyasaka et al. (patente de los EE.UU. número 4.956.345) han descrito derivados de 2-alquinilpurina, en los que el grupo 2-alquinilo se sustituye por alquilo (C_{3}-C_{16}). Los compuestos de la patente 5.593.975 se describen como vasodilatadores y para inhibir la agregación plaquetaria y, por tanto, son útiles como agentes anti-isquémicos, antiateroescleróticos y anti-hipertensores.

Sin embargo, existe una necesidad continuada de agonistas selectivos del receptor A_{2} de la adenosina, útiles para aplicaciones terapéuticas, que tengan efectos secundarios reducidos.

Sumario de la invención

La presente invención comprende compuestos que son útiles para el tratamiento de la actividad inflamatoria en tejido de mamíferos. La actividad tisular inflamatoria puede deberse a agentes patológicos o puede deberse a traumatismo físico, químico o térmico, o al traumatismo de intervenciones médicas, tales como transplantes de órganos, tejidos o células, la angioplastia (PCTA (angioplastia transluminal coronaria percutánea)), la inflamación tras la isquemia/reperfusión, o el injerto. Los presentes compuestos comprenden una clase novedosa de derivados de 2-alquiniladenosina, sustituidos en la posición etino por restos de cicloalquilo sustituidos. Preferiblemente, el residuo de ribosida está sustituido en la posición 5' ("X") por un resto N-alquil- (o cicloalquil) carboxiamino ("aminocarbonilo"). Por tanto, la presente invención prevé compuestos que pueden usarse para inhibir la respuesta inflamatoria en un mamífero, tal como un sujeto humano, y para proteger el tejido sometido a la respuesta, mediante la administración de una cantidad eficaz de uno o más compuestos de la invención.

Los compuestos de la invención tienen la siguiente fórmula general (I):

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5

en la que (a) cada R es individualmente hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, cicloalquilo C_{3}-C_{7}, fenilo o fenilalquilo(C_{1}-C_{3});

(b) X es -CH_{2}OH, -CO_{2}R^{2}, -OC(O)R^{2}, o C(O)NR^{3}R^{4};

(c) cada uno de R^{2}, R^{3} y R^{4} es individualmente H, alquilo C_{1}-C_{6}; alquilo C_{1}-C_{6} sustituido con 1-3 de alcoxi C_{1-6}, cicloalquilo C_{3}-C_{7}, alquiltio C_{1-6}, halógeno, hidroxi, amino, mono(alquil C_{1-6})amino, di(alquil C_{1-6})amino, o arilo C_{6-10}, en donde el arilo puede estar sustituido con 1-3 de halógeno, alquilo C_{1-6}, hidroxi, amino, mono(alquil C_{1-6})amino, o di(alquil C_{1-6})amino; arilo C_{6-10}; o arilo C_{6-10} sustituido con 1-3 de halógeno, hidroxi, amino, mono(alquil C_{1-6})amino, di(alquil C_{1-6})amino o alquilo C_{1}-C_{6};

(d) Z y Z' son individualmente alquilo (C_{1}-C_{6}), opcionalmente interrumpido por l-3 S u O no peróxido, o están ausentes, y n es 1-3; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

La invención prevé un compuesto de fórmula I para su uso en el tratamiento médico, preferiblemente para su uso en el tratamiento o la protección tisular frente a la inflamación, tal como una respuesta inflamatoria, así como el uso de un compuesto de fórmula I para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una respuesta inflamatoria debida a un síntoma o estado patológico en un mamífero, tal como un humano, que esté asociado con inflamación.

Aunque se ha notificado que ciertos agonistas del receptor A_{2A} de la adenosina son vasodilatadores y, por tanto, útiles para tratar directamente la hipertensión, los trombos, la ateroesclerosis y similares, la técnica anterior no sugiere la actividad protectora de tejidos de los compuestos de fórmula (I).

La invención también incluye el uso de una combinación de estos compuestos con inhibidores de la fosfodiesterasa de tipo IV para disminuciones sinérgicas en la respuesta inflamatoria de las células inmunes.

La invención también prevé una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en combinación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, en combinación con un inhibidor de la fosfodiesterasa (PDE) de tipo IV. Preferiblemente, la composición se presenta como una forma farmacéutica unitaria.

Adicionalmente, la invención prevé un método terapéutico para evitar o tratar un síntoma o estado patológico en un mamífero, tal como un humano, en el que está implicada la actividad del receptor A_{2A} de la adenosina y se desea el agonismo de dicha actividad, que comprende la administración a un mamífero que necesite tal tratamiento de una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I, o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Se cree que la activación del receptor A_{2A} de la adenosina inhibe la inflamación afectando a neutrófilos, mastocitos, monocitos/macrófagos, células T y/o eosinófilos. La inhibición de estas células inflamatorias da como resultado la protección tisular tras el ataque tisular.

Entre las respuestas inflamatorias que pueden tratarse (incluyendo las profilácticamente tratadas) con un compuesto de fórmula I, opcionalmente con un inhibidor de la PDE de tipo IV, está la inflamación debida a:

(a) estimulación autoinmune (enfermedades autoinmunes), tal como el lupus eritematoso, la esclerosis múltiple, la esterilidad a partir de endometriosis, la diabetes mellitus de tipo I que incluye la destrucción de los islotes pancreáticos, lo que conduce a la diabetes y las consecuencias inflamatorias de la diabetes, incluyendo úlceras en las piernas, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria del intestino, osteoporosis y artritis reumatoide;

(b) enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis polínica, rinitis, conjuntivitis primaveral y otros estados mediados por eosinófilos;

(c) enfermedades cutáneas tales como soriasis, dermatitis de contacto, eccema, úlceras cutáneas infecciosas, heridas abiertas, celulitis;

(d) enfermedades infecciosas incluyendo septicemia, choque septicémico, encefalitis, artritis infecciosa, choque endotóxico, choque por gram negativas, reacción de Jarisch-Herxheimer, zóster, choque tóxico, malaria cerebral, meningitis bacteriana, síndrome disnéico agudo (ARDS), enfermedad de Lyme, infección por VIH (aumento de la replicación del VIH por el TNF\alpha, inhibición por TNF\alpha de la actividad del inhibidor de la transcriptasa inversa);

(e) síndromes de fatiga: leishmaniosis derivada de cáncer y VIH;

(f) transplante de órgano, tejido o célula (por ejemplo, médula ósea, córnea, riñón, pulmón, hígado, corazón, piel, islotes pancreáticos) incluyendo el rechazo del transplante y el injerto frente a la enfermedad del huésped;

(g) efectos adversos del tratamiento farmacológico, incluyendo efectos adversos del tratamiento con anfotericina B, efectos adversos del tratamiento inmunosupresor, por ejemplo, tratamiento con interleucina 2, efectos adversos del tratamiento con OKT3 (anticuerpos monoclonales anti-CD3), efectos adversos del tratamiento con GM-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos), efectos adversos del tratamiento con ciclosporina, y efectos adversos del tratamiento con aminoglucósidos, estomatitis y mucositis debidas a inmunosupresión;

(h) estados cardiovasculares, incluyendo enfermedades circulatorias inducidas o agravadas por una respuesta inflamatoria, tales como isquemia, ateroesclerosis, enfermedad vascular periférica, reestenosis tras la angioplastia, aneurisma aórtico inflamatorio, vasculitis, accidente cerebrovascular, lesión de la médula espinal, insuficiencia cardiaca congestiva, choque hemorrágico, lesión por isquemia/reperfusión, vasoespasmo tras hemorragia subaracnoidea, vasoespasmo tras accidente cerebrovascular, pleuritis, pericarditis y las complicaciones cardiovasculares de la diabetes;

(i) diálisis, incluyendo pericarditis, debida a diálisis peritoneal;

(j) gota; y

(k) traumatismo químico o térmico debido a quemaduras, ácidos, álcalis y similares.

De particular interés y eficacia es el uso de los presentes compuestos para tratar las respuestas inflamatorias debidas al transplante de órganos, tejidos o células, es decir, el transplante de tejido alogénico o xenogénico en un receptor mamífero, las enfermedades autoinmunes y los estados inflamatorios debidos a patologías circulatorias y al tratamiento de las mismas, incluyendo angioplastia, colocación de endoprótesis vascular (stent), colocación de derivación o injerto. Se encontró inesperadamente que la administración de uno o más compuestos de fórmula (1) era eficaz tras el comienzo de la respuesta inflamatoria, por ejemplo, una vez que el paciente ya estaba aquejado con la patología o el traumatismo que inicia la respuesta inflamatoria.

También se describe un método para medir la respuesta o para unir un compuesto de fórmula I en o a sitios del receptor A_{2A} designado de la adenosina que comprenden dichos receptores, in vivo o in vitro, con una cantidad de un compuesto de fórmula I eficaz para unirse a dichos receptores. Puede usarse tejido o células que comprenden los sitios del receptor de unión al ligando para medir la selectividad de los compuestos de prueba para los subtipos específicos del receptor, la cantidad de compuesto bioactivo en la sangre u otros fluidos fisiológicos, o puede usarse como herramienta para identificar los agentes terapéuticos potenciales para el tratamiento de enfermedades o estados asociados con la activación del sitio del receptor, poniendo en contacto dichos agentes con dichos complejos ligando-receptor y midiendo el grado de desplazamiento del ligando y/o la unión del agente, o la respuesta celular a dicho agente (por ejemplo, acumulación de AMPc).

Descripción detallada de la invención

Se usan las siguientes definiciones, a menos que se describa lo contrario. Halo es flúor, cloro, bromo o yodo. Alquilo, alcoxi, aralquilo, alquilarilo, etc. indican grupos alquilo de cadena lineal y ramificada; aunque la referencia a un radical individual, tal como "propilo" abarca sólo el radical de cadena lineal, haciéndose referencia específicamente a un isómero de cadena ramificada tal como el "isopropilo". Arilo incluye un radical fenilo o un radical carbocíclico bicíclico condensado en orto que tienen aproximadamente de nueve a diez átomos en el anillo en el que al menos un anillo es aromático. Heteroarilo incluye un radical unido mediante un carbono del anillo de un anillo aromático monocíclico que contiene cinco o seis átomos en el anillo, que consiste en carbono y de uno a cuatro heteroátomos seleccionados cada uno del grupo que consiste en oxígeno no peróxido, azufre y N(X), en donde X está ausente o es H, O, alquilo (C_{1}-C_{4}), fenilo o bencilo, así como un radical de un heterociclo bicíclico condensado en orto de aproximadamente ocho a diez átomos en el anillo derivado del mismo, particularmente un benzoderivado o un derivado mediante condensación de un dirradical de propileno, trimetileno o tetrametileno al mismo.

Los expertos en la técnica apreciarán que los compuestos de fórmula (I) tienen más de un centro quiral y pueden aislarse en las formas racémicas y ópticamente activas. Preferiblemente, el resto de ribosida de la fórmula (I) se deriva de la D-ribosa, es decir, los grupos hidroxi en 3',4' son alfa en el anillo del azúcar y los grupos en 2' y 5' son beta (3R, 4S, 2R, 5S). Cuando los dos grupos en el grupo ciclohexilo están en la posición 4, son preferiblemente trans. Algunos compuestos pueden mostrar polimorfirmos. Se entiende que la presente invención engloba cualquier forma racémica, ópticamente activa, polimórfica o estereoisómera, o mezclas de las mismas, de un compuesto de la invención que posea las propiedades útiles descritas en el presente documento, conociéndose bien en la técnica cómo preparar las formas ópticamente activas (por ejemplo, mediante resolución de la forma racémica mediante técnicas de recristalización o técnicas enzimáticas, mediante síntesis de materiales de partida ópticamente activos, mediante síntesis quiral o mediante separación cromatográfica usando una fase estacionaria quiral) y cómo determinar la actividad agonista de la adenosina utilizando las pruebas descritas en el presente documento o utilizando otras pruebas similares que son bien conocidas en la técnica.

Los valores específicos y preferidos enumerados más adelante para radicales, sustituyentes e intervalos, son únicamente a modo de ejemplo; no excluyen otros valores definidos ni otros valores dentro de los intervalos definidos para radicales y sustituyentes.

Específicamente, alquilo (C_{1}-C_{6}) puede ser metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, pentilo, 3-pentilo o hexilo. Tal como se usa en el presente documento, el término "cicloalquilo" engloba bicicloalquilo (norbornilo, 2.2.2-biciclooctilo, etc.) y tricicloalquilo (adamantilo, etc.), que comprende opcionalmente 1-2 N, O o S. Cicloalquilo también engloba (cicloalquil)alquilo. Por tanto, cicloalquilo (C_{3}-C_{6}) puede ser ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo; cicloalquil (C_{3}-C_{6}) alquilo (C_{1}-C_{6}) puede ser ciclopropilmetilo, ciclobutilmetilo, ciclopentilmetilo, ciclohexilmetilo, 2-ciclopropiletilo, 2-ciclobutiletilo, 2-ciclopentiletilo o 2-ciclohexiletilo.

Alcoxi (C_{1}-C_{6}) puede ser metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi, sec-butoxi, pentoxi, 3-pentoxi o hexiloxi; alquenilo (C_{2}-C_{6}) puede ser vinilo, alilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 4-pentenilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 4-hexenilo, o 5-hexenilo; alquinilo (C_{2}-C_{6}) puede ser etinilo, 1-propinilo, 2-propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 3-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-pentinilo, 4-pentinilo, 1-hexinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 4-hexinilo o 5-hexinilo; alcanoílo (C_{1}-C_{6}) puede ser acetilo, propanoílo o butanoílo; haloalquilo (C_{1}-C_{6}) puede ser yodometilo, bromometilo, clorometilo, fluorometilo, trifluorometilo, 2-cloroetilo, 2-fluoroetilo, 2,2,2-trifluoroetilo o pentafluoroetilo; hidroxialquilo (C_{1}-C_{6}) puede ser hidroximetilo, 1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo, 1-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 1-hidroxibutilo, 4-hidroxibutilo, 1-hidroxipentilo, 5hidroxipentilo, 1-hidroxihexilo o 6-hidroxihexilo; alcoxicarbonilo (C_{1}-C_{6}) (CO_{2}R^{2}) puede ser metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, butoxicarbonilo, pentoxicarbonilo o hexiloxicarbonilo; alquiltio (C_{1}-C_{6}) puede ser metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, butiltio, isobutiltio, pentiltio o hexiltio; alcanoiloxi (C_{2}-C_{6}) puede ser acetoxi, propanoiloxi, butanoiloxi, isobutanoiloxi, pentanoiloxi o hexanoiloxi; arilo puede ser fenilo, indenilo o naftilo; y heteroarilo puede ser furilo, imidazolilo, triazolilo, triazinilo, oxazoílo, isoxazoílo, tiazolilo, isotiazoílo, piraxolilo, pirrolilo, pirazinilo, tetrazolilo, puridilo (o su N-óxido), tientilo, pirimidinilo (o su N-óxido), indolilo, isoquinolilo (o su N-óxido) o quinolilo (o su N-óxido).

Un valor específico para R es amino, monometilamino o ciclopropilamino.

Un valor específico para R^{1} es carboxi- o alcoxicarbonil (C_{1}-C_{4})-ciclohexilalquilo (C_{1}-C_{4}).

Un valor específico para R^{2} es H o alquilo (C_{1}-C_{4}), es decir, metilo o etilo.

Un valor específico para R^{3} es H, metilo o fenilo.

Un valor específico para R^{4} es H, metilo o fenilo.

Un valor específico para Z es -CH_{2}- o -CH_{2}-CH_{2}-.

Un valor específico para X es CO_{2}R^{2}, alcanoilmetilo (C_{2}-C_{5}) o amido.

Un valor específico para n es 1.

Compuestos preferidos de fórmula (I) son aquellos en los que cada R es H, X es etilaminocarbonilo y R^{1} es 4-carboxiciclohexilmetilo (DWH-146a), R^{1} es 4metoxicarbonilciclohexilmetilo (DWH-146e) o R^{1} es 4-acetoximetilciclohexilmetilo (JMR-193). Se representan a continuación (DWH-146 (ácido) y metiléster (e)) y JMR-193.

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La síntesis de 4[3-(6-amino-9(5-[(etilamino)carbonil]-3,4-dihidroxitetrahidro-Z-furanil-9H-2-purinil)-2-propinil]-1-ciclohexanocarboxilato de metilo (DWH-146e) se llevó a cabo mediante un acoplamiento cruzado de un derivado de yodo-adenosina (N-etil-1'-desoxi-1'-(amino-2-yodo-9H-purin-9-il)-\beta-D-ribofuranuoramida) con 4-(2-propinil)-1-ciclohexanocarboxilato de metilo mediante la utilización de un catalizador de Pd^{11}. La síntesis del derivado de yodo-adenosina se llevó a cabo a partir de guanosina. La guanosina se trata en primer lugar con anhídrido acético, que forma un acetato con los hidroxis del azúcar, seguido por la cloración de la posición 6 con cloruro de tetrametilamonio y oxicloruro de fósforo. La yodación de la posición 2 se llevó a cabo mediante una reacción de Sandmeyer modificada, seguida por el desplazamiento de los 6-Cl y los acetatos del azúcar con amoniaco. Los hidroxilos en 2' y 3' se protegieron como acetonida y el hidroxi en 5' se yodó a ácido con permanganto de potasio. La desprotección de la acetonida en 2' y 3', la esterificación de Fisher del ácido en 5' con etanol y la conversión del etil éster resultante en la etilamida con etilamina dio N-etil-1'-desoxi-1'-(amino-2-yodo-9H-purin-9-il)-\beta-D-ribofuranoramida.

El acetileno (4-(2-propinil)-1-ciclohexanocarboxilato de metilo) se sintetizó partiendo de trans-1,4-ciclohexanodimetanol. Inicialmente, el trans-diol se transformó en la forma monotosilada seguido por el desplazamiento del tosilato con un anión acetileno. El hidroxi de la especie de hidroxil acetileno resultante se oxidó a ácido mediante el reactivo de Jones seguido por la metilación con (trimetilsilil)diazometano para dar 4-(2-propinil)-1-ciclohexanocarboxilato de metilo.

La reacción de acoplamiento cruzado se llevó a cabo en las siguientes condiciones previamente notificadas. A una disolución de N,N-dimetilformamida (0,5 mL), acetonitrilo (1 mL), trietilamina (0,25 mL) y N-etil-1'-desoxi-1'-(amino-2-yodo-9H-purin-9-il)-\beta-D-ribofuranuroamida (25 mg, 0,06 mmoles) se añadió dicloruro de bis(trifenilfosfina)paladio (1 mg, 2% molar) y yoduro de cobre (I) (0,06 mg, 0,5% molar). A la mezcla resultante se añadió 4-(2-propinil)-1-ciclohexanocarboxilato de metilo (54 mg, 0,3 mmoles) y la reacción se agitó bajo atmósfera de N_{2} durante 16 horas. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo resultante se sometió a cromatografía ultrarrápida en metanol al 20% en cloroformo (Rf = 0,45) para dar 19 mg (sólido blanquecino, pf 125ºC (descompuesto)) de 4[3-(6-amino-9(5-((etilamino)carbonil]-3,4-dihidroxitetrahidro-Z-furanil)-9H-2-purinil)-2-propinil]-1-ciclohexanocarboxilato de metilo (DWH-146e).

DWE-146e y JMR193 son sustancialmente más potentes comoinhibidores en los sistemas de modelo inflamatorio que el compuesto de referencia, CGS21680 (2-[p(carboxietil)-fenil-etilamino]5'-N-etilcarboxamidoadenosina). Por ejemplo, DWH-146e es aproximadamente 80 veces más potente en los receptores A_{2A} y 40veces más selectivo para los receptores A_{2A} frente a A_{3} que CGS21680.

Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables son sales de adición de ácido orgánico formadas con ácidos que forman un anión fisiológico aceptable, por ejemplo, tosilato, metanosulfonato, malato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzoato, ascorbato, \alpha-cetoglutarato y \alpha-glicerofosfato. También pueden formarse sales inorgánicas adecuadas, incluyendo sales de clorhidrato, sulfato, nitrato, bicarbonato y carbonato.

Pueden obtenerse sales farmacéuticamente aceptables usando procedimientos estándar bien conocidos en la técnica, por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto suficientemente básico, tal como una amina, con un ácido adecuado, formándose un anión fisiológicamente aceptable. También pueden obtenerse sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio, potasio o litio) o de metales alcalino-térreos (por ejemplo, calcio) de ácidos carboxílicos.

Los compuestos de fórmula I pueden formularse como composiciones farmacéuticas y administrarse a un huésped mamífero, tal como un paciente humano, en una variedad de formas adaptadas a la vía de administración escogida, es decir, por vía oral, parenteral, intravenosa, intramuscular, tópica o subcutánea.

Por tanto, los presentes compuestos pueden administrarse sistémicamente, por ejemplo, por vía oral, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. Pueden incluirse en cápsulas de gelatina de vaina dura o blanda, pueden darse forma como comprimidos o pueden incorporarse directamente con los alimentos de la dieta del paciente. Para la administración terapéutica por vía oral, el compuesto activo puede combinarse con uno o más excipientes y usarse en la forma de comprimidos ingeribles, comprimidos sublinguales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos el 0,1% del compuesto activo. Naturalmente, el porcentaje de las composiciones y preparaciones puede variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 60% del peso de una forma farmacéutica unitaria dada. La cantidad de compuesto activo en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá un nivel de dosificación eficaz.

Los comprimidos, pastillas, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: aglutinantes tales como la goma tragacanto, la goma arábiga, el almidón de maíz o la gelatina; excipientes tales como el fosfato de dicalcio; un agente disgregante tal como el almidón de maíz, el almidón de patata, el ácido algínico y similares; un lubricante tal como el estearato de magnesio; y puede añadirse un agente edulcorante tal como la sacarosa, la fructosa, la lactosa o el aspartamo o un agente saborizante tal como la menta, el aceite de gaulteria o el saborizante de cereza. Cuando la forma farmacéutica unitaria es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido, tal como un aceite vegetal o polietilenglicol. Pueden estar presentes otros materiales diversos como recubrimientos o, en caso contrario, para modificar la forma física de la forma farmacéutica unitaria sólida. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con gelatina, cera, goma laca o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa o fructosa como agente edulcorante, metilo y propilparabenos como conservantes, un colorante y saborizante como un sabor a cereza o a naranja. Naturalmente, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma farmacéutica unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxica en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo puede incorporarse en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida.

El compuesto activo también puede administrarse por vía intravenosa o intraperitoneal mediante infusión o inyección. Las disoluciones del compuesto activo o sus sales pueden prepararse en agua, mezclada opcionalmente con un tensioactivo no tóxico. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, triacetina y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y utilización, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para la inyección o la infusión pueden incluir dispersiones o disoluciones acuosas estériles o polvos estériles que comprenden el principio activo, que se adaptan a la preparación improvisada de soluciones o dispersiones estériles para inyección o infusión, opcionalmente encapsuladas en liposomas. En todos los casos, la forma farmacéutica final debe ser estéril, líquida y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. El vehículo líquido puede ser un disolvente o medio de dispersión líquido que comprende, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicoles líquidos y similares), aceites vegetales, ésteres de glicerilo no tóxicos y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante la formación de liposomas, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones o mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede llevarse a cabo mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, tampones o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las disoluciones inyectables estériles se preparan incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. En el caso de los polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización, que dan un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional presente en las disoluciones estériles previamente filtradas.

Para la administración tópica, pueden aplicarse los presentes compuestos en forma pura, es decir, cuando son líquidos. Sin embargo, generalmente será deseable administrarlos a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un vehículo dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un líquido.

Vehículos sólidos útiles incluyen sólidos finamente divididos tales como talco, arcilla, celulosa microcristalina, sílice, alúmina y similares. Vehículos líquidos útiles incluyen agua, alcoholes o glicoles o mezclas de agua-alcohol/glicol, en los que pueden disolverse o dispersarse los presentes compuestos a niveles eficaces, opcionalmente con la ayuda de tensioactivos no tóxicos. Pueden añadirse adyuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos adicionales para optimizar las propiedades para un uso dado. Las composiciones líquidas resultantes pueden aplicarse a partir de almohadillas absorbentes, utilizadas para impregnar vendajes y otros apósitos, o pulverizarse sobre la zona afectada usando pulverizadores de tipo aerosol o bomba.

También pueden emplearse espesantes tales como polímeros sintéticos, ácidos grasos, ésteres y sales de ácidos grasos, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales minerales modificados con vehículos líquidos para formar pastas, geles, pomadas, jabones y similares que se puedan extender, para su aplicación directamente a la piel del usuario.

Ejemplos de composiciones dermatológicas útiles que pueden usarse para la administración de los compuestos de fórmula I a la piel se describen en Jacquet et al. (patente de los EE.UU. número 4.608.392), Geria (patente de los EE.UU. número 4.992.478), Smith et al. (patente de los EE.UU. número 4.559.157) y Wortzman (patente de los EE.UU. número 4.820.508).

Las dosis útiles de los compuestos de fórmula I pueden determinarse comparando su actividad in vitro e in vivo en modelos animales. Los métodos para la extrapolación de las dosis eficaces en ratones y otros animales a humanos se conocen en la técnica; por ejemplo, véase la patente de los EE.UU. número 4.938.949. Las dosis útiles de los inhibidores de la PDE de tipo IV se conocen en la técnica. Por ejemplo, véase la patente de los EE.UU. número 5.877.180, Col. 12.

Generalmente, la concentración del(de los) compuesto(s) de fórmula (I) en una composición líquida, tal como una loción, será(n) desde aproximadamente el 0,1-25% en peso, preferiblemente desde aproximadamente el 0,5-10% en peso. La concentración de una composición sólida o semisólida, tal como un gel o un polvo, será de aproximadamente el 0,1-5% en peso, preferiblemente aproximadamente 0,5-2,5% en peso.

La cantidad de compuesto, o de una sal activa o derivado del mismo, requerida para su uso en el tratamiento variará, no sólo con la sal particular seleccionada, sino también con la vía de administración, la naturaleza del estado que se está tratando y la edad y el estado del paciente y en última instancia dependerá del criterio del médico o clínico que atienda.

En general, sin embargo, una dosis adecuada estará en el intervalo de desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 100 \mug/kg, por ejemplo, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 75 \mug/kg de peso corporal por día, tal como desde 3 hasta aproximadamente 50 \mug por kilogramo de peso corporal del receptor por día, preferiblemente en el intervalo de desde 6 hasta 90 \mug/kg/día, más preferiblemente en el intervalo de desde 15 hasta 60 \mug/kg/día.

El compuesto se administra convenientemente en una forma farmacéutica unitaria; por ejemplo, que contenga desde 5 hasta 1000 \mug, convenientemente desde 10 hasta 750 \mug, más convenientemente, desde 50 hasta 500 \mug del principio activo por forma farmacéutica unitaria.

Idealmente, el principio activo debe administrarse para lograr concentraciones plasmáticas pico del compuesto activo de desde aproximadamente 0,l hasta aproximadamente 10 nM, preferiblemente, desde aproximadamente 0,2 hasta 10 nM, más preferiblemente, desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 5 nM. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la inyección intravenosa de una disolución del 0,05 al 5% del principio activo, opcionalmente en solución salina, o administrado oralmente como un bolo que contiene aproximadamente 1-100 \mug del principio activo. Los niveles sanguíneos deseables pueden mantenerse mediante infusión continua para proporcionar aproximadamente 0,01-5,0 \mug/kg/h o mediante infusiones intermitentes que contengan aproximadamente 0,4-15 \mug/kg del(de los) principio(s) activo(s).

La dosis deseada puede presentarse convenientemente en una dosis única o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más subdosis por día. La propia subdosis puede dividirse adicionalmente, por ejemplo, en varias administraciones distintas separadas de manera flexible; tal como inhalaciones múltiples a partir de un insuflador o mediante la aplicación de una pluralidad de gotas en el ojo. Por ejemplo, es deseable administrar las presentes composiciones por vía intravenosa durante un periodo de tiempo prolongado tras el ataque que da lugar a la inflamación.

La capacidad de un compuesto dado de la invención para actuar como un agonista (o antagonista) del receptor A_{2A} de la adenosina puede determinarse usando modelos farmacológicos que son bien conocidos en la técnica, o usando las pruebas descritas más adelante.

La invención se describirá adicionalmente en referencia a los siguientes ejemplos detallados. Las siguientes son marcas comerciales: Celite, Ficoll, Zeneca e ICN.

Ejemplo 1 Trans-(1-[4-hidroximetil)ciclohexil]metil)-4metilbencenosulfonato (5.2)

Se añadió hidruro de sodio (1,68 g, 70 mmoles) a una disolución de 10 g (70 mmoles) de [4-hidroximetil)ciclohexil]metan-1-ol (5.1) en 700 mL de tetrahidrofurano y se agitó durante 1 hora. Después se añadiócloruro de p-toluenosulfonilo (13,3 g, 70 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 5 horas. La reacción se enfrió entonces hasta 0ºC y se extinguió lentamente con agua hasta que no hubo hidruro reactivo. Una vez extinguido el hidruro, la mezcla de reacción se diluyó con éter (700 mL) y se extrajo 2 veces con carbonato de potasio acuoso al 10% (700 mL). Las fases orgánicas se secaron usando sulfato de sodio y el disolvente se eliminó a presión reducida. El producto se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con acetona-diclorometano (5:95) para dar 5.2 (35%). RMN H^{1} (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,75 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,32 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 3,79 (d, J = 6,35 Hz, 2H), 3,39 (d, J = 6,35 Hz, 2H), 2,42 (s, 3H), 1,75 (m, 4H), 1,59 (m, 1H), 1,37 (m, 1H), 0,9 (m, 4H). RMN C^{13} (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 145,3, 133,4, 130,3, 130,3, 128,3, 128,3, 75,8, 68,5, 40,6, 37,8, 28,9, 28,9, 28,9, 28,9, 22,1.

Ejemplo 2 4-Prop-2-inilciclohexil)metan-1-ol (5.3)

El complejo acetiluro de litio-etilendiamina (90%) (6,4 g, 70 mmoles) se añadió muy lentamente a una disolución de 5.2 (3 g, 10 mmoles) en 40 mL de dimetilsulfóxido. Se permitió que la mezcla de reacción se agitara durante 5 días y después se extinguió lentamente a 0ºC con agua. Esta mezcla se diluyó con éter (300 mL) y se extrajo 3 veces con cloruro de amonio acuoso saturado (200 mL). Las fases orgánicas se secaron con sulfato de sodio. El disolvente se eliminó a presión reducida y el producto se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con acetato de etilo-hexanos (20:80) para dar 5.3 (85%). RMN H^{1} (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 3,41 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 2,07 (dd, J = 2,5, 6,5 Hz, 2H), 1,96-1,75 (m, 5H), 1,41 (m, 2H), 0,095 (m, 4). RMN C^{13}(300 MHz, CDCl_{3}) \delta 83,8, 69,6, 68,9, 40,7, 37,7, 32,3, 32,3, 29,6, 29,6, 26,5.

Ejemplo 3 Ácido 4-prop-2-inilciclohexanocarboxílico (5.4)

Una disolución de trióxido de cromo (1,1 g, 11 mmoles) en ácido sulfúrico 1,5 M (40 mL, 27 mmoles) se mantuvo a 0ºC mientras se añadía 5.3 (0,46 g, 3 mmoles) en 80 mL de acetona durante 2 horas. La reacción se agitó entonces durante 2 horas adicionales a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con éter (200 mL) y se extrajo 2 veces con agua. Las fases orgánicas se secaron con sulfato de sodio. El disolvente se eliminó a presión reducida y el producto se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con acetona-diclorometano (70:30) para dar 5.4 (75%). RMN H^{1} (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 2,24 (dt, J = 3,66, 12,1 Hz, 1H), 2,10 (dd, J = 2,7, 6,5 Hz, 2H), 2,04-1,89 (m, 5H), 1,76 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 1,43 (dq, J = 3,28, 13,1 Hz, 2H), 1,03 (dq, J = 3,28, 13,1 Hz, 2H). RMN C^{13} (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 183,2, 83,3, 69,9, 43,4, 36,7, 31,8, 28,9, 26,3.

Ejemplo 4 4-Prop-2-inilciclohexanocarboxilato de metilo (5.5)

Se añadió una disolución de (trimetilsilil)diazometano (2,0 M) en hexanos (1 mL, 2 mmoles) a una disolución de 5.4 (0,34 g, 2 mmoles) en 15 mL de metanol: diclorometano (3:7). Los disolventes se eliminaron a presión reducida dando como resultado una conversión del 100% del material de partida a producto. RMN H^{1} (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 2,24 (dt, J = 3,66, 12,1 Hz, 1H), 2,10 (dd, J = 2,7, 6,5 Hz, 2H), 2,06 (dd, J = 1,54, 6,54 Hz, 1H), 2,00-1,89 (m, 3H), 1,76 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 1,43 (dq, J = 3,28, 13,1 Hz, 2H), 1,03 (dq, J = 3,28, 13,1 Hz, 2H). RMN C^{13} (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 176,8, 83,3, 69,8, 51,9, 43,4, 36,7, 31,9, 29,2, 26,3.

Ejemplo 5 Acetato de [(2R,3R,4R,5R)-3,4-diacetiloxi-5-(2-amino-6-oxohidropurin-9-il)oxolan-2-il]metilo (6.2)

Una suspensión de 113 g (0,4 moles) de guanosina anhidra (6.1), anhídrido acético (240 mL, 2,5 moles), piridina anhidra (120 mL) y DMF (dimetilformamida) anhidra (320 mL) se calentó durante 3,75 horas a 75ºC sin dejar que la temperatura sobrepasara los 80ºC. La disolución transparente se transfirió entonces a un matraz Erlenmyer de 3 L y se llenó con 2-propanol. Al enfriar la disolución a temperatura ambiente se inició la cristalización y se permitió que continuara a 4ºC durante la noche. Se filtró el filtrado sólido blanco, se lavó con 2-propanol y se recristalizó a partir de 2-propanol para dar 6.2 (96%). RMN H^{1} (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,20 (s, 1H, H-8), 6,17 (d, J = 5,41 Hz, 1 H, H-1') 5,75 (t, J = 5,39 Hz, 1H, H-2'), 5,56 (t, J = 5,0, H-3'), 4,41 (m, 3H, H-4',5'), 2,14 (s, 3H, Ac), 2,11 (s, 3H, Ac), 2,10 (s, 3H, Ac). RMN C^{13} (300 MHz, CD_{3}OD) \delta 171,0, 170,3, 1702, 157,7, 154,8, 152,4, 136,7, 117,7, 85,5, 80,4, 73,0, 71,3, 64,0, 31,3, 21,2, 21,0.

Ejemplo 6 Acetato de [(2R,3R,4R,5R)-3,4-diacetiloxi-5-(2-amino-6-cloropurin-9-il)oxolan-2-il]metilo (6.3)

A un matraz de 1000 mL se añadieron 80 g (0,195 moles) de acetato de [(2R,3R,4R,5R)-3-4-diacetiloxi-5-(2-amino-6-oxohidropurin-9-il)oxolan-2-il]metilo (6.2), cloruro de tetrametilamonio (44 g, 0,4 moles), acetonitrilo anhidro (400 mL) y N,Ndimetilanilina (25 mL). El matraz se colocó en un baño salino helado y se enfrío hasta 2ºC. A esta disolución se añadió gota a gota POCl_{3} (107 mL 1,15 moles) a una tasa que mantuviera la temperatura por debajo de los 5ºC (45 minutos). El matraz se extrajo entonces del baño de hielo, se equipó con un condensador, se colocó en un baño de aceite y se dejó a reflujo durante 10 minutos mientras que la disolución cambiaba a un color rojo/marrón. El disolvente se eliminó entonces a presión reducida para dar un residuo aceitoso que se transfirió a un vaso de precipitados que contenía 1000 g de hielo y 400 mL de CHCl_{3} y se permitió que se agitara durante 1,5 horas para descomponer cualquier POCl_{3} restante. La fase orgánica se eliminó entonces y la fase acuosa se extrajo con 3 \times 50 mL de CHCl_{3} y se reunió con la fase orgánica. La fase orgánica reunida se extrajo de nuevo con 50 mL de agua seguido por agitación con 200 mL de NaHCO_{3} saturado. La fase orgánica se extrajo adicionalmente con NaHCO_{3} hasta que el extracto acuoso fue neutro (2X). La fase orgánica se extrajo finalmente con salmuera y después se secó sobre MgSO_{4} durante 16 horas. A la disolución se añadieron 800 mL de 2-propanol tras lo que la disolución se concentró a presión reducida. Al sólido aceitoso se añadieron 200 mL de 2-propanol y la disolución se refrigeró durante la noche. El producto cristalino se filtró, se lavó y se dejó secar durante la noche para dar 6.3 (77%). RMN H^{1} (300 MHz, CD_{3}OD) \delta 8,31 (s, 1H, H-8), 7,00 (s, 2H, NH_{2}) 6,06 (d, J = 5,8 Hz, 1H, H-1'), 5,83 (t, J = 6,16 Hz, 1H, H-2'), 5,67 (m, 1H, H-3'), 4,29 (m, 3H, H-4',5'), 2,07 (s, 3H, Ac), 1,99 (s, 3H, Ac), 1,98 (s, 3H, Ac). RMN C^{13} (300 MHz, CD_{3}OD) \delta 171,0, 170,4, 170,2, 160,8, 154,6, 150,8, 142,2, 124,5, 85,8, 80,6, 72,8, 71,2, 63,9, 21,4, 21,3, 21,1.

Ejemplo 7 Acetato de [(2R,3R,4R,5R)-3,4-diacetiloxi-5-(6-cloro-2-yodopurin-9-il)oxolan-2-il]metilo (6.4)

Se añadió nitrito de isoamilo (5 mL, 37 mmoles) a una mezcla de 5,12 g (12 mmoles) de acetato de [(2R,3R,4R,5R)-3-,4-diacetiloxi-5-(2-amino-6-cloropurin-9-il)oxolan-2-il]metilo (6.3), I_{2} (3,04 g, 12 mmoles), CH_{2}I_{2} (10 mL, 124 mmoles), y CuI (2,4 g, 12,6 mmoles) en THF (tetrahidrofurano) (60 mL). La mezcla se calentó a reflujo durante 45 minutos y después se dejó enfriar a temperatura ambiente. A esta disolución se añadieron 100 ml de Na_{2}S_{2}O_{3} saturado que eliminó el color rojizo debido al yodo. La fase acuosa se extrajo 3X con cloroformo, se reunió, se secó sobre MgSO_{4} y se concentró a presión reducida. El producto se purificó entonces sobre una columna de gel de sílice usando CHCl_{3}-MeOH (98:2) para recoger acetato de [(2R,3R,4R,5R)-3,4-diacetiloxi-5-(6-cloro-2-yodopurin-9il)oxolan-2-il]metilo (6.4) (80% cristalizado a partir de EtOH). RMN H^{1} (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,20 (s, 1H H-8), 6,17 (d, J = 5,41 Hz, 1H, H-1'), 5,75 (t, J = 5,39 Hz, 1H, H-2'), 5,56 (t, J = 5,40 Hz, 1H, H-3'), 4,38 (m, 3H, H-4',5'), 2,14 (s, 1H, Ac), 2,11 (s, 1H, Ac), 2,10 (s, 1H, Ac).

Ejemplo 8 (4S,2R,3R,5R)-2-(6-amino-2-yodopurin-9-il)-S(hidroximetil)oxolan-3,4-diol (6.5)

A un matraz que contenía 6,0 g (11,1 mmoles) de acetato de [2R,3R,4R,5R)-3,4-diacetiloxi-5-(6-cloro-2-yodopurin-9-il)oxolan-2-il]metilo (6.4) se añadieron 100 ml de NH_{3} líquido a -78ºC y se permitió que la disolución se agitara durante 6 horas. Tras este tiempo se dejó que volviera a temperatura ambiente durante la noche con evaporación concurrente de NH_{3} para dar un aceite marrón. El producto se cristalizó a partir de isopropanol caliente para dar 6.5 (80%), p.f. 143-145ºC, f.r. = 0,6 en MeOH al 20%/CHCl_{3}. RMN H^{1} (300 MHz, DMSO-d_{6},) \delta 8,24 (s, 1H), 7,68 (s, 2H), 5,75 (d, J = 6,16, 1H), 5,42 (d, J = 5,40 Hz, 1H), 5,16 (d, J = 4,62 Hz, 1 H), 4,99 (t, J = 5,39 Hz, 1 H), 4,67 (d, J = 4,81 Hz, 1 H), 4,06 (d, J = 3,37 Hz, 1H), 3,89 (m, 1H), 3,54 (m, 2H).

Ejemplo 9 [(1R,2R,4R,5R)-4-(6-amino-2-yodopurin-9-il)-7-7-dimetil-3,6,8-trioxabiciclo[3.3.0]oct-2-il]metan-1-ol (6.6)

A una disolución de 2,0 g (5,08 mmoles) de (4S,2R,3R,5R)-2-(6-amino-2-yodopurin-9-il)-5(hidroximetil) oxolan-3,4-diol (6.6) en 100 mL de acetona se añadieron 9,6 g de ácido p-toluenosulfónico y 5 ml de dimetoxipropano. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, momento en el que se añadieron 15 g de NaHCO_{3} y después se agitó durante 3 horas adicionales. El residuo se filtró y se lavó 2X con EtOAc. El filtrado se concentró entonces a presión reducida. El residuo se cromatografió sobre una columna de gel de sílice con MeOH-CHCl_{3} (1:99) para dar 6.6 (72%) como un sólido, p.f. 185-187ºC. RMN H^{1} (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 8,22 (s, 1H, H-8), 7,69 (s, 2H), NH_{2}), 6,00 (d, J = 2,70 Hz, 1H, H-1'), 5,21 (m, 1H, H2'), 5,07 (sa, 1H, OH), 4,88 (m, 1H, H-3'), 4,13 (m, 1H, H-4'), 3,47 (m, 2H, H-5'), 1,49 y 1,28 (s, 3H, C(CH_{3})_{2}).

Ejemplo 10 Ácido (2S,1R,4R,5R)-4-(6-amino-2-yodopurin-9-il)-7,7-dimetil-3,6,8-trioxabiciclo[3.3.0]octano-2-carboxílico (6.7)

A una disolución agitada de 1,6 g (3,7 mmoles) de [(1R,2R,4R,5R)-4-(6-amino-2-yodopurin-9-il)-7-7-dimetil-3,6,8-trioxabiciclo[3.3.0]oct-2-il]metan-1-ol (6.6) en 200 mL de H_{2}O se añadieron 0,60 g de KOH y, gota a gota, una disolución de 1,70 g (10,8 mmoles) de KMnO_{4} en 50 mL de H_{2}O. La mezcla se reservó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 225 horas. La mezcla de reacción se enfrió entonces hasta 5-10ºC y se decoloró mediante una disolución de 4 mL de H_{2}O_{2} al 30% en 16 mL de agua, mientras que la temperatura se mantuvo por debajo de los 10ºC usando un baño salino helado. La mezcla se filtró a través de Celite y el filtrado se concentró a presión reducida hasta aproximadamente 10 mL y después se acidificó hasta pH 4 con HCl 2 N. El precipitado resultante se filtró y se lavó con éter para dar 6.7 (70%) tras el secado como un sólido blanco, p.f. 187-190ºC. RMN H^{1} (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 8,11 (s, 1H, H-8), 7,62 (s, 2H, NH_{2}), 7,46 (s, 1H, COOH), 6,22 (s, 1H, H-1'), 5,42 (d, J = 5,71 Hz, 1H, H-2'), 5,34 (d, J = 6,16 Hz, 1H, H-3'), 4,63 (s, 1H, H-4'), 1,46 y 1,30 (s, 3H, C(CH_{3})_{2}).

Ejemplo 11 Ácido (2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-yodopurin-9-il)-3,4-dihidroxioxolan-2-carboxílico (6.8)

Una disolución de 1,72 g (3,85 mmoles) de ácido (2S,1R,4R,5R)-4-(6-amino-2-yodopurin-9-il)-7,7-dimetil-3,6,8-trioxabiciclo[3.3.0]octano-2-carboxílico (6.7) en 80 mL de HCOOH al 50% se agitó a 80ºC durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se evaporó a presión reducida, se disolvió en H_{2}O y la disolución se evaporó de nuevo. Este proceso se repitió hasta que no se produjo olor por el ácido fórmico en el residuo. La recristalización a partir de agua dio 1,33 g (85%) de 6.8 como un sólido blanco, p.f. 221-223ºC, dec. RMN H^{1} (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 8,31 (s, 1H, H-8), 7,68 (s, 2H, NH_{2}), 5,90 (d, J = 6,55 Hz, 1H, H-1'), 4,42 (m, 1H, H-2'), 4,35 (d, J = 2,31 Hz, 1H, H-4'), 4,22 (m, 1H, H-3').

Ejemplo 12 [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-yodopurin-9-il)-3,4-dihidroxioxolan-2-il]-N-etilcarboxamida (6.9)

A una disolución enfriada (5ºC) y agitada de 1,29 g (3,17 mmoles) de ácido (2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-yodopurin-9-il)-3,4-dihidroxioxolan-2-carboxílico (6.8) en 150 mL de etanol absoluto se añadió gota a gota 1,15 mL SOCl_{2} enfriado en hielo. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche y después se llevó a pH 8 con NaHCO_{3} acuoso saturado. La mezcla se filtró, y después se concentró el filtrado a presión reducida para dar un sólido blanco que se secó y después se volvió a disolver en 20 mL de etilamina anhidra a -20ºC durante 3 horas y después a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con etanol absoluto y el producto precipitado se filtró y se lavó con éter anhidro para dar 530 mg (72%) de 6.9 como un sólido puro, p.f. 232-234ºC. RMN H^{1} (300 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 8,34 (s, 1H, H-8), 8,12 (t, 1H, NH), 7,73 (s, 2H, NH_{2}), 5,85, (d, J = 6,93 Hz, 1H, H-1'), 4,54 (m, 1H, H-2'), 4,25 (d, J = 1,92 Hz, 1H, H-4'), 4,13 (m, 1H, H-3'), 3,28 (m, 2H, CH_{2}CH_{3}), 1,00 (t, J = 7,2 Hz, 3H, CH_{2}CH_{3}).

Ejemplo 13 Metil-4-(3-{9-[(4S,5S,2R,3R)-5-(N-etilcarbamoil)-3,4-dihidroxioxolan-2-il]-6-aminopurin-2-il)}prop-2-inil)ciclohe-xanocarboxilato (DWH-146e)

A una disolución desgasificada de 25 mg (0,063 mmoles) de [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-yodopurin-9-il)-3,4-dihidroxioxolan-2-il]-N-etilcarboxamida (6.9), 16,9 mg (0,094 mmoles) (5.5) y 0,75 mg CuI en 5 mL cada uno de trietilamina (TEA) y acetonitrilo, se añadieron 15 mg de Pd(PPh_{3})_{4}. La disolución se agitó durante 24 horas a 70ºC, tiempo tras el cual la disolución se filtró a través de celite y se cromatografió sobre gel de sílice con MeOH-CHCl_{3} (5:95) para dar DWH-146e (24%).

Ejemplo 14 Acetato de (4-prop-2-inilciclohexil)metilo (5.6)

Se añadió anhídrido acético (0,92 mL, 8,25 mmoles) y piridina (0,2 mL, 2,5 mmoles) a una disolución de 5.3 (250 mg, 1,65 mmoles) en 25 mL de éter. Se permitió que la reacción se agitara a temperatura ambiente durante 24 horas. Se añadió agua a la reacción y la fase orgánica se extrajo adicionalmente con NaHCO_{3} al 10%. La fase orgánica se secó con MgSO_{4} y se evaporó. El residuo se cromatografió sobre gel de sílice con EtOAc-Hexanos (5:95) para dar 5.6 (47%).

Ejemplo 15 Acetato de [4-(3-{9-(4S,5S,2R,3R)-5-(N-etilcarbamoil)-3,4-dihidroxioxolan-2-il]-6-aminopurin-2-il}prop-2-inil)ciclohexil]metilo (JMR193)

A una disolución desgasificada de 125 mg (0,29 mmoles) de [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-yodopurin-9-il)-3,4-dihidroxioxolan-2-il]-Netilcarboxamida (6.9), 150 mg (0,77 mmoles) de (5.6) y 1,0 mg de CuI en 1,3 mL de TEA y 4 mL de DMF se añadieron hasta 25 mg de Pd(PPh_{3})_{4}. La disolución se agitó durante 72 horas a 60ºC, tiempo tras el cual la disolución se filtró a través de celite y se cromatografió sobre gel de sílice con MeOH-CHCl_{3} (5:95) para dar JMR193 (10%).

Ejemplo 16 [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-{3-[4-(hidroximetil)ciclohexil]prop-2-inil}purin-9-il)-3,4-dihidroxioxolan-2-il]-N-etil-carboxamida A. (4-prop-2-inilciclohexil)metan-1-ol

Un complejo de acetiluro de litio-etilendiamina (90%) (6,4 g, 70 mmoles) se añadió muy lentamente a una disolución de 4-metilbencenosulfonato de trans-[4-(hidroximetil)ciclohexil]metilo (3 g, 10 mmoles) en 40 mL de dimetilsulfóxido. Se permitió que la mezcla de reacción se agitara durante 5 días y después se extinguió lentamente a 0ºC con agua. Esta mezcla se diluyó con éter (300 mL) y se lavó 3 veces con cloruro de amonio acuoso saturado (200 mL). Las fases orgánicas se secaron con sulfato de sodio. El disolvente se eliminó a presión reducida. El producto se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con acetato de etilo-hexanos (20:80) para proporcionar el producto (85%). RMN H^{1} (300 MHz, CDCl_{3}) d 3,41 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 2,07 (dd, J = 2,5, 6,5 Hz, 2H), 1,96-1,75 (m, 5H), 1,41 (m, 2H), 0,095 (m, 4). RMN C^{13} (300 MHz, CDCl_{3}) d 83,8, 69,6, 68,9, 40,7, 37,7, 32,3, 32,3, 29,6, 29,6, 26,5.

B. [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-{3-[4-(hidroximetil)ciclohexil]prop-1-inil}purin-9-il)-3,4-dihidroxioxolan-2-il]-N-etilcarboxamida (JMR2037)

Se añadieron 10 mg de Pd(PPh_{3})_{4} a una disolución desgasificada de 28 mg (0,065 mmoles) de [(2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-yodopurin-9-il)-3,4dihidroxioxolan-2-il]-N-etilcarboxamida, 30 mg (0,20 mmoles) de (4-prop-2-inilciclohexil)metan-1-ol y 1,0 mg de CuI en 1 mL de trietilamina (TEA), 1 mL de DMF y 1 mL de acetonitrilo. La disolución se agitó durante 60 horas a temperatura ambiente, tiempo tras el cual la disolución se filtró a través de celite y se cromatografió sobre gel de sílice con MeOH-CHCl_{3} (7:93) para dar 5 mg (17%) de JMR2037. El compuesto del título se probó usando los ensayos de unión descritos en el presente documento y se encontró que se unía a los receptores A_{2A} recombinantes humanos, Ki de 694 \pm 69 nM.

Ejemplo 17 Estudios de unión a radioligando

La unión a los receptores A_{2A} se evaluó con el radioligando ^{125}I-ZM241385. La figura 2B representa la competencia mediante agonistas selectivos para la unión a los receptores A_{2A} recombinantes humanos de la adenosina. DWH-146e es sumamente selectivo para el subtipo A_{2A} (hA2A) recombinante humano. La selectividad para el receptor A_{3} (no mostrado) es menos impresionante, pero todavía de aproximadamente 50 veces. DWH-146e es aproximadamente 5 y 50 veces más potente que WRC0470 y CGS21680, respectivamente (figura 1). Un hallazgo inesperado e interesante es que el éster, DWIH-146e también es aproximadamente 50 veces más potente que el ácido, DWH-146
(figura 1).

Ejemplo 17A Efecto de DWH-146e y JMR193 sobre la actividad oxidativa de los neutrófilos A. Materiales

f-met-leu-phe (fMLP), luminol, superóxido dismutasa, citocromo C, fibrinógeno, adenosina desaminasa y azul tripano se obtuvieron de Sigma Chemical. Ficoll-hypaque se adquirió de ICN (Aurora, OH) y Cardinal Scientific (Santa Fe, NM) y Accurate Chemicals and Scientific (Westerbury, NY). La endotoxina (lipopolisacárido; E. coli K235) procedieron de List Biologicals (Campbell, CA). La solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y el kit de ensayo de lisado de amebocito del cangrejo Limulus procedieron de BioWittaker (Walkersville, MD). La albúmina sérica humana (HSA) procedió de Cutter Biological (Elkhart, IN). El factor de necrosis tumoral alfa recombinante humano se suministró por Dianippon Pharmaceutical Co. Ltd. (Osaka, Japón). ZM241385 (4-(2-[7-amino-2-(2-furil)-[1,2,4]-triazolo[2,3-a][1,3,5]triazin-5-il-amino]etil)fenol) fue un obsequio de Simon Poucher, Zeneca Pharmaceuticals, Cheshire, Reino Unido. Las soluciones madre (1 mM y 10 mM en DMSO) se prepararon y se almacenaron a -20ºC.

B. Preparación de los neutrófilos humanos

Los neutrófilos purificados (\sim98% de neutrófilos y >95% de viables mediante exclusión con azul tripano) que contenían <1 plaquetas por 5 neutrófilos y < 50 \mug/ml de endotoxina (ensayo de lisado de amebocito del cangrejo Limulus) se obtuvieron de sangre venosa heparinizada normal (10 U/ml) mediante un procedimiento de separación de Ficoll-hypaque de una etapa (A. Ferrante et al., J. Immunol. Meth., 36, 109 (1980)).

C. Liberación de las especies inflamatorias de oxígeno reactivas a partir de quimioluminiscencia de neutrófilos humanos sensibilizados y estimulados

La quimioluminiscencia intensificada por luminol, una medida de la actividad oxidativa de los neutrófilos, es dependiente de la producción de superóxido y de la movilización de la enzima mieloperoxidasa del gránulo lisosómico. La luz es emitida a partir de las especies de oxígeno inestables de alta energía generadas por los neutrófilos activados. Los neutrófilos purificados (5-10 \times 10^{5}/ml) se incubaron en solución salina equilibrada de Hanks que contenía un 0,1% de albúmina sérica humana (1 ml) con o sin DWH-146a, DWH-146e, CGS21680 o JMR193 con o sin rolipram y con o sin factor de necrosis tumoral alfa (1 U/ml) durante 30 minutos a 37ºC en un baño de agua con agitación. Después se leyó la quimioluminiscencia estimulada con f-met-leu-phe (1 mcM) intensificado con luminol (1 \times 10^{-4} M) con un fotómetro Chronolog® (Crono-log Corp., Havertown, PA) a 37ºC durante 2-4 minutos. La quimioluminiscencia se notifica como la luz emitida pico relativa (= altura de la curva) en comparación con las muestras con factor de necrosis tumoral alfa y sin DWH, JMR o rolipram.

D. Resultados

Tal como se muestra en la figura 2, JMR193 y DWH-146e disminuyeron la actividad oxidativa de los neutrófilos humanos estimulados por f-met-leu-phe sensibilizado por el factor de necrosis tumoral alfa, medida por la quimioluminiscencia intensificada por luminol, más eficazmente que el agonista CGS21680 del receptor A_{2A} de la adenosina. El eje horizontal da la concentración de CGS21680, DWH-146a, DWH-146e o JMR193 (log nM). El eje vertical da la actividad pico resultante de los neutrófilos humanos como la cantidad relativa de liberación estimulada de las especies de oxígeno reactivas medida con quimioluminiscencia intensificada por luminol, en comparación con las muestras control que no se sensibilizaron con el factor de necrosis tumoral alfa. EEM (error estándar de la media) (n = 4-5 experimentos separados).

Los datos por debajo del eje horizontal en la figura 2 dan la CE_{50} (concentración eficaz media) para reducir la actividad de neutrófilos humanos (basado en los datos de la figura 2). EEM (n = 4-5 experimentos separados). *p < 0,05,CI_{50} (concentración inhibitoria media) disminuida en comparación con CGS21680.

JMR193 y DWH-146e disminuyeron la oleada oxidativa de neutrófilos estimulados con EC_{50} inferiores a 1 nM (0,8 y 0,3 nM, respectivamente). Por el contrario, los agonistas DWH-146a y CGS21680 del receptor A_{2A} de la adenosina de ácido libre no fueron tan eficaces en inhibir la oleada oxidativa (53 y 9 nM, respectivamente; figura 2). La inhibición de DWH-146e de la oleada oxidativa de neutrófilos estimulados se antagonizó por los antagonistas del receptor de adenosina ZM241385 selectivos del receptor A_{2A} de la adenosina.

Tal como se muestra en la figura 3, JMR193 (1 nM) con rolipram (100 nM) disminuyó sinérgicamente la liberación estimulada de las especies de oxígeno reactivas. Los neutrófilos humanos se sensibilizaron con el factor de necrosis tumoral alfa (1 U/ml) y se estimularon con f-met-leu-phe (1 \muM). El eje vertical da el porcentaje de inhibición de la actividad oxidativa medido por la quimioluminiscencia intensificada por luminol. EEM (n = 4 experimentos separados). *p < 0,05 sinergia entre JMR193 y rolipram en comparación con la actividad aditiva.

Tal como se muestra en la figura 4, el antagonista ZM241385 (100 nM) (ZM) sumamente selectivo del receptor A_{2A} de la adenosina contrarrestó la actividad oxidativa de neutrófilos humanos inhibida por JMR193 (10 nM), medida por la quimioluminiscencia intensificada por luminol. EEM de 4 experimentos separados. *p = 0,0004. ZM241385 contrarrestó la actividad oxidativa inhibida por JMR193.

E. Neutrófilo humano [AMPc]_{i} y adherencia del neutrófilo a una superficie biológica

Una placa de cultivo tisular de 24 pocillos se recubrió con fibrinógeno humano (5 mg/ml en bicarbonato de sodio al 1,5%; 0,5 ml/pocillo; Sigma Chemical) durante la noche a 37ºC en CO_{2} al 5%. Los neutrófilos (3-4 \times 10^{6}/0,5 ml/muestra) se incubaron dentro de un pocillo de la placa recubierta durante 45 minutos en 0,5 ml de HBSS que contenía HSA al 0,1% y ADA (adenosina desaminasa) (1 U/ml) en presencia y ausencia de TNF\alpha recombinante humano (10 U/ml), DWH-146e (3-300 nM), rolipram (300 nM), y/o ZM241385 (100 nM). Tras la incubación, se añadieron 0,5 ml de HCl (0,2 N) a los pocillos y se incubaron durante 45 minutos más a temperatura ambiente para extraer el AMPc. Las muestras se centrifugaron entonces en una microfuga durante 2 minutos para eliminar los desechos celulares. La mitad de las muestras se congelaron para realizar análisis de AMPc (B. Brooker et al., Science, 194, 270 (1976)). Los pocillos se lavaron dos veces con solución salina normal y la monocapa restante se digirió con 0,2 ml de NaOH 0,2N que contenía SDS (dodecil sulfato sódico) durante 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras de proteínas se congelaron entonces (-70ºC) para el análisis de proteínas posterior para determinar la adherencia relativa de los PMN (K. P. Stowell et al., Anal. Biochem., 85, 572 (1978)).

Resultados

DWH-146e (30-300 nM) solo y sinérgicamente con rolipram (300 nM) aumentó el contenido de AMPc de neutrófilos humanos y con rolipram disminuyó sinérgicamente la adherencia del neutrófilos a una superficie recubierta con fibrinógeno (figura 5). Los efectos de DWH-146e (300 nM) + rolipram (300 nM) sobre la producción de AMPc por neutrófilos y su adherencia se contrarrestaron por el antagonista selectivo del receptor A_{2A} de la adenosina, ZM241385 (ZM; 100 nM). EEM de 5 experimentos separados. *p < 0,05 [AMPc] del neutrófilo aumentado, en comparación con ausencia de DWH-146e; **p < 0,05 adherencia del neutrófilo disminuida en comparación con nausencia de DWH-146e.

F. Actividad oxidativa del neutrófilo humano adherente

Métodos. Usando métodos modificados de la sección E, los neutrófilos (2 \times 10^{6}/ml) procedentes de la separación con Ficoll-Hypaque se incubaron durante 15 minutos a 37ºC en 0,45 ml de solución salina equilibrada de Hanks que contenía albúmina sérica humana al 0,1% y adenosina desaminasa (l U/ml), rolipram (300 nM) y DWH-146e (3-300 nM). Tras la incubación, se añadieron citocromo C (120 \muM) y catalasa (0,062 mg/ml) en presencia y ausencia de factor de necrosis tumoral alfa recombinante humano (l U/ml) y se transfirieron inmediatamente alícuotas de 200 \mul de suspensión celular a pocillos por duplicado de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo plano que había sido recubierta durante la noche con fibrinógeno humano. Se leyó la densidad óptica de las muestras a 550 nm frente a muestras correspondientes de superóxido dismutasa (200 U/ml).

G. Resultados

Tal como se muestra en la figura 6, la inhibición de la liberación de superóxido del neutrófilo humano adherente estimulado por el factor de necrosis tumoral alfa (TNF) sobre una superficie recubierta de fibrinógeno se llevó a cabo mediante rolipram (300 nM) y DVVH-146e. DWH-146e disminuyó la oleada oxidativa de los neutrófilos adherentes y disminuyó sinérgicamente la oleada oxidativa en presencia de rolipram, que por sí mismo no afectó a la actividad oxidativa del neutrófilo. El eje horizontal da la concentración de DWH-146e en nM y el eje vertical da la cantidad de superóxido liberado por los neutrófilos, medida por la reducción del citocromo c. Hubo una marcada sinergia con DWH-146e y el inhibidor de PDE de tipo IV, rolipram, para disminuir la actividad oxidativa del neutrófilo humano adherente estimulado por el factor alfa de necrosis tumoral. EEM de los duplicados de 4-5 experimentos separados. *p < 0,05 liberación de superóxido disminuida en comparación con sin DWH-146e; **p < 0,05 liberación de superóxido disminuida en comparación con presencia de rolipram y sin DWH-146e.

Ejemplo 18 Tratamiento de lesión por isquemia/reperfusión (I/R) en el riñón con DWH-146e

Para determinar si la activación del receptor A_{2A} de la adenosina inducida por DWH-146e reduce o no la creatinina plasmática a las 24 y 48 horas tras la lesión por I/R en ratas, los riñones de la rata se sometieron a 45 minutos de isquemia y a 24 ó 48 horas de reperfusión. Se administró DWH-146e (0,004 \mug/kg/min) o un vehículo de manera continua mediante una minibomba comenzando 5 horas antes de I/R. Tal como se muestra en la figura 7, DWH-146e disminuyó significativamente la creatitina plasmática en 7/7 ratas (P < 0,05) y en 6/6 ratas tratadas con DWH-146e (P < 0,001), a las 24 y 48 horas, respectivamente.

Para determinar si el efecto de DWH-146e sobre la reducción de la creatinina plasmática en ratas sometidas a I/R está o no mediado por el receptor A_{2A}, los riñones de la rata se sometieron a 45 minutos de isquemia seguido por 48 horas de reperfusión. Se administró continuamente DWH146e (0,004 \mug/kg/min) mediante una minibomba comenzando 5 horas antes de la isquemia. Tal como se muestra en la figura 8, la mejoría de la función renal se invirtió por el antagonista de A_{2A}, ZM-241385 (0,003 \mug/kg/min-velocidad de administración equimolar en comparación con DWH-146e) (*P < 0,001 para el vehículo frente a DWH; **P < 0,05 DWH frente a DWH/ZM. N = 5 para el vehículo, DW; N = 6 para DWH/ZM. ANOVA seguido por corrección de Bonferroni).

DWH-146e, a concentraciones que no tienen efectos hemodinámicos, evita el edema renal, la necrosis y la concentración de eritrocitos en la médula interna.

La protección frente a la lesión renal proporcionada por DWH-146e (0,01 \mug/kg/min s.c. durante 48 horas) estuvo relacionada con una drástica inhibición de la adherencia de los neutrófilos al endotelio vascular. Se cree que esta inhibición por DWH-146e de la interacción entre los neutrófilos y el endotelio vascular es la responsable, al menos en parte, de la protección frente a la lesión renal.

Para determinar si la activación del receptor A_{2A} de la adenosina reduce los neutrófilos en la médula externa de las ratas sometidas a I/R, usando Neurolucida®, se observó el riñón bajo ampliación de 100 X y se extrajo todo el riñón. Se contaron los PMN observando las secciones del riñón a una ampliación de 250 X. Las secciones del riñón se recubrieron con estructuras ópticas observadas al microscopio y se contaron todos los PPM dentro de cada estructura. Este sistema evita contar los PMN más de una vez. Tal como se muestra en la figura 9, la densidad de neutrófilos fue de 15,65/mm^{2} para el vehículo y de 3,02/mm^{2} para el tratamiento con DWH-146e.

Ejemplo 19 Efecto de DWH-146e sobre la lesión por reperfusión en el pulmón A. Métodos

Se usó un modelo de pulmón completo de conejo ventilado, perfundido con sangre y aislado. Se extrajo el pulmón de los conejos donantes tras la inyección de PGE_{1} (prostaglandina E_{1}) arterial pulmonar y la purga con solución de conservación Euro-Collins, y los pulmones se conservaron durante 18 horas a 4ºC. Los pulmones del grupo I (n = 9) sirvieron como sujetos control. Los pulmones del grupo II (n = 9) se reperfundieron con sangre completa que se hizo pasar primero a través de un filtro para eliminar los leucocitos. En el grupo III (n = 9), se añadió DWH-146e al reperfundido sanguíneo (25 \mug/kg) inmediatamente antes de la reperfusión y se administró durante todo el periodo de reperfusión (1 \mug/kg/min). Todos los pulmones se reperfundieron durante 30 minutos y se registró la tensión arterial pulmonar (PAP), la resistencia vascular pulmonar (PVR), la distensibilidad de las vías respiratorias (CPL) y la oxigenación arterial. Se registró la actividad de la mieloperoxidasa (MPO) para cuantificar el secuestro de neutrófilos y se midieron las razones de peso húmedo/seco para demostrar el edema pulmonar.

B. Resultados

La oxigenación arterial en el grupo II y en el grupo III fue significativamente superior que la del grupo I tras 30 minutos de reperfusión (514,27 \pm 35,80 y 461,12 \pm 43,77 frente a 91,41 \pm 20,58 mm Hg, p<0,001. Tal como se muestra en la figura 10, los pulmones del grupo III mostraron una afectación progresiva en la pO_{2} durante toda la reperfusión. La eliminación de leucocitos en los pulmones del grupo II mejoró la oxigenación arterial al comienzo de la reperfusión. *p = 0,004 (grupo II frente a grupos I y III); **p<0,001 (grupos II y III frente a grupo I).

Tal como se muestra en la figura 11, la PVR media en el grupo II se redujo significativamente cuando se comparó con los pulmones control (*p<0,001). La PVR de los pulmones del grupo III fue significativamente menor que incluso la de los pulmones que sufrieron reperfusión con sangre desleucocitada (**p<0,001 frente a los grupos I y II). La resistencia vascular pulmonar se redujo significativamente en el grupo III (22.783 \pm 357 dinas\cdots\cdotcm^{-5}) en comparación tanto con el grupo II como con el grupo I (31.057 \pm 1743 y 36.911 \pm 2173 dinas\cdots\cdotcm^{-5}, p<0,001). La distensibilidad de las vías respiratorias mejoró en los grupos II y III cuando se comparó con el grupo I (1,68 \pm 0,08 y 1,68 \pm 0,05 frente a 1,36 \pm 0,13, p = 0,03). La permeabilidad microvascular en el grupo III se redujo hasta 106,82 \pm 17,09 en comparación con 165,70 \pm 21,83 ng de colorante azul de Evans/g de tejido en el grupo I (p = 0,05). Tal como se muestra en la figura 12, la actividad de la mieloperoxidasa en el grupo III fue significativamente menor que en el grupo I (*p = 0,03). MPO = mieloperoxidasa. La actividad de la mieloperoxidasa en el grupo III fue de 39,88 \pm 4,87 en comparación con 88,70 \pm 18,69 \DeltaDO/gm/min en el grupo I (p = 0,03), y la actividad de la mieloperoxidasa del grupo II fue de 56,06 \pm 7,46.

C. Conclusiones

DWH-146e redujo el secuestro de neutrófilos en el pulmón y mejoró espectacularmente la función del injerto pulmonar. Los neutrófilos son componentes importantes de la cascada inflamatoria de la lesión por reperfusión y su origen puede incluir tanto la sangre circulante como el propio injerto pulmonar. La activación selectiva del receptor A_{2A} de la adenosina interrumpe la respuesta inflamatoria mediada por los neutrófilos y reduce la lesión por reperfusión en el pulmón tras el transplante.

Con microscopía óptica, los pulmones control en el grupo I mostraron grave infiltración de leucocitos y formación de edema en los espacios alveolares tras 18 horas de almacenamiento isquémico y 30 minutos de reperfusión. En el grupo II, los pulmones que sufrieron reperfusión con sangre desleucocitada y en los pulmones del grupo III (que recibieron DWH-146e durante la reperfusión), esta infiltración fue mucho menor.

Ejemplo 20 Efecto de DWH-146e sobre la formación neointimal tras la lesión arterial

La activación de los leucocitos con liberación de citocinas inflamatorias se produce tras la intervención coronaria percutánea y puede desempeñar un papel en la restenosis. En el ratón, la formación de una neoíntima resistente en presencia de un revestimiento endotelial intacto se produce tras la ligadura de la arteria carótida común. Utilizando este modelo, se aleatorizaron ratones C57/BL6 en el momento de la ligadura de la carótida a una bomba osmótica mediante infusión de 7 días de DWH-146e, (n = 7), o a vehículo (n = 8).

A los 14 días tras la ligadura de la carótida, la histomorfometría demostró una reducción significativa en el área neointimal (0,005 \pm 0,004 mm^{2} frente a 0,021 \pm 0,014 mm^{2}, p = 0,02) y en la razón del área neointimal con respecto a la de la media (0,13 \pm 0,07 frente a 0,64 \pm 0,44, p = 0,01) en los animales tratados, en comparación con los controles. El área de la media fue similar en los dos grupos (0,034 \pm 0,007 mm^{2} frente a 0,036 \pm 0,009 mm^{2}, p = 0,81). Este beneficio en limitar el crecimiento neointimal continuó hasta los 28 días. La figura 13 resume el efecto de DWH-146e para inhibir el crecimiento neointimal en el modelo de ratón LCCA. Estos experimentos demuestran que, en un modelo de ligadura de la arteria carótida del ratón, la estimulación prolongada de A_{2A} (7 días) por DWH-146e da como resultado una reducción significativa en la formación neointimal durante al menos 21 días, posiblemente a través de su efecto sobre la activación y la función de los leucocitos.

Ejemplo 21 Inhibición de la liberación de TNF\alpha de monocitos humanos estimulada por endotoxina A. Materiales

Ficoll-hypaque se adquirió de ICN (Aurora, OH) y Cardinal Scientific (Santa Fe, NM) y Accurate Chemicals and Scientific (Westbury, NY). La endotoxina (lipopolisacárido; E. coli 0111B4) procedió de List Biologicals (Campbell, CA). La solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y el kit de ensayo de lisado de amebocito del cangrejo Limulus procedió de BioWittaker (Walcersville, MD). La albúmina sérica humana (HSA) procedió de Cutter Biological (Elkhart, IN). ZM241385 (4-(2-[7-amino-2-(2-furil)[1,2,4]-triazolo[2,3-a][1,3,5]triazin-5-il-amino]etil)fenol) fue un obsequio de Simon Poucher, Zeneca Pharmaceuticals, Cheshire, Reino Unido. Las soluciones madre (1 mM y 10 mM en DMSO) se prepararon y se almacenaron a -20ºC.

B. Producción de TNF\alpha mediante monocitos adherentes humanos purificados

Métodos: Se preparó una monocapa rica en monocitos (>65% de monocitos) incubando 1 ml de la fracción de leucocitos mononucleares (5 \times 10^{5}/ml) procedente de una separación con Ficoll-Hypaque (A. Ferrante et al., J. Immunol. Meth., 36, 109 (1980)) en los pocillos de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos (1 h; 37ºC; CO_{2} al 5%). Los leucocitos no adherentes se eliminaron mediante lavado y se añadió medio de cultivo (1 ml de solución salina equilibrada de Hanks, que contenía albúmina sérica humana al 0,1%, adenosina desaminasa [5 U/ml] y suero autólogo inactivado por calor al 1%) a los pocillos que contenían las células mononucleares adherentes. Tal como se ha establecido, se añadió lo siguiente: (1) endotoxina (100 ng/ml) y el antagonista selectivo del receptor A_{2A} de la adenosina ZM241385 (100 nM) y, (2) los agonistas selectivos del receptor A_{2A} de la adenosina JMR193 (1-1000 nM), DWH146e (1-1000 nM) y CGS21680 (10-1000 nM). Las muestras se incubaron entonces durante 4 horas (37ºC; CO_{2} al 5%) y se recogieron los sobrenadantes. Todas las células suspendidas se eliminaron por centrifugación y se congelaron las muestras libres de células (-70ºC). El TNF\alpha se sometió a ensayo en los sobrenadantes libres de células (n = 6) mediante un kit ELISA (Coulter/Immunotech, Miami, FL).

C. Resultados

Tal como se muestra en las figuras 10 y 14, los agonistas del receptor A_{2A} de la adenosina disminuyeron la producción de TNF\alpha por los monocitos adherentes estimulados por endotoxina. El antagonista selectivo del receptor A_{2A} de la adenosina ZM241385 (100 nM) antagonizó los efectos de JMR193 sobre la producción de TNF\alpha (figura 15).

Por tanto, DWH146e y JMR193 disminuyen la producción de TNF\alpha estimulada por la endotoxina LPS por parte de los monocitos humanos mediante un mecanismo que es dependiente de la unión al agonista a los receptores A_{2A} de la adenosina.

Ejemplo 22 Actividad de DWH-146e en el modelo de peritonitis murino

Experimentos preliminares con peritonitis experimental han incluido la inyección de zimosan (Zym) como un potente estímulo de la inflamación (Y. Zhang et al., Eur. J. Pharmacol., 313, 237 (1996)). Tal como se muestra en la figura 16, tras la inyección de zimosan, la concentración media de leucocitos determinada en un hemocitómetro Neubauer fue de 7,325 \pm 1,893/mm^{3}. La inyección intraperitoneal de DWH-146e a una dosis de 2,5 \mug/kg una hora antes de zimosan inhibió el desarrollo de peritonitis con una media \pm EEM de concentración de leucocitos de 2,012 \pm 374/mm^{3} 6 horas más tarde (p < 0,05). Por tanto, estos estudios demuestran que el receptor de adenosina A_{2A} desempeña un papel decisivo en mediar los PMN que atraviesan el peritoneo tras la exposición a zimosan.

Ejemplo 23 Cardioprotección mediada por el efecto antiinflamatorio de JMR193

Los compuestos de la invención se probaron induciendo aturdimiento (stunning) miocárdico, una forma de lesión cardiaca que se produce tras periodos transitorios y repetitivos de flujo sanguíneo coronario interrumpido, mediante la oclusión repetida del riego sanguíneo de la arteria coronaria.

A. Efecto de cuatro ciclos de oclusión-reperfusión

La arteria coronaria anterior descendente izquierda (LAD) de un grupo de perros se aisló y se realizó una oclusión mediante la utilización de una sutura. El riego sanguíneo de la arteria LAD de los perros se ocluyó 4 veces durante 5 minutos. Tras cada oclusión se restauró el flujo sanguíneo durante diez minutos. Un grupo de seis perros se infundió con una disolución que contenía el compuesto de acetato (JMR193), preparado en el ejemplo 15 (JMR193), (0,01 \mug/kg/min) tras cada periodo de oclusión. Un segundo grupo de seis perros se infundió con una disolución que contenía el vehículo (portador). Tras el último ciclo de oclusión-reperfusión, se monitorizó la función cardiaca de los animales durante 3 horas.

Los resultados se ilustran en las figuras 17 y 18. La figura 17 muestra la respuesta de espesamiento ventricular izquierdo (LV) sistólico en los 6 perros control. El espesamiento cardiaco se redujo en aproximadamente el 50% 3 horas después de la última oclusión. La figura 18 muestra la respuesta de espesamiento LV en los 6 perros que recibieron una infusión i.v. del compuesto de prueba, JMRl93 (0,01 \mug/kg/min), comenzando durante el periodo inicial y continuando durante todo el experimento. La función cardiaca, con infusión de JMRl93, volvió a ser casi normal ya a los 90 minutos tras la reperfusión.

B. Efecto de diez ciclos de oclusión-reperfusión

Dos grupos adicionales de perros se sometieron a diez (en lugar de 4) ciclos de oclusión-reperfusión, en los que cada oclusión fue de 5 minutos, intercalados por 5 minutos de reperfusión. En este ejemplo, dos de los animales se infundieron con una disolución que contenía el compuesto de acetato (JMR193), preparado en el ejemplo 15, (0,01 \mug/kg/min) tras cada periodo de oclusión. Otros tres animales se infundieron con una disolución que contenía el vehículo (portador). Tras el último ciclo de oclusión-reperfusión, se monitorizó la función cardiaca de los animales durante 3 horas.

Los resultados se ilustran en las figuras 19 y 20. La figura 19 muestra la respuesta de espesamiento ventricular izquierdo sistólico en los 3 perros control. Fue un ataque cardiaco más grave que en el ejemplo 23A y, como resultado, hubo una ausencia completa de espesamiento LV inmediatamente tras la reperfusión y permaneció acinético durante 3 horas. La figura 20 muestra el espesamiento LV en los 2 perros que recibieron una infusión i.v. del compuesto de prueba, JMRl93 (0,01 \mug/kg/min), comenzando durante el periodo inicial y continuando durante todo el experimento. En comparación con el grupo control, los perros que recibieron la infusión de JMRl93 mostraron una mejora marcada y significativa en la función cardiaca inmediatamente después de la reperfusión, que continuó durante 3 horas.

C. Efecto del compuesto de acetato JMRl93 en la captación de neutrófilos durante la oclusión-reperfusión

Se administró a algunos animales neutrófilos marcados radiactivamente. (Los neutrófilos se aislaron de sangre de perro, se incubaron con un compuesto que contenía ^{99m}Tc y se volvieron a inyectar en los perros.) Los neutrófilos marcados con ^{99m}Tc se administraron por vía intravenosa como un marcador para determinar el nivel de inflamación en la zona de reperfusión, tras cuatro ciclos de isquemia-reperfusión. La inflamación producida por los ciclos de oclusión-reperfusión produjo la adherencia de los neutrófilos radiactivos y se cuantificó con una cámara gamma. La adherencia de los neutrófilos se inhibió por el JMRl93. Los resultados se muestran en la figura 21, en la que la localización de los neutrófilos marcados con ^{99m}Tc en los perros tratados con el vehículo solo (barras coloreadas) es mayor que en los perros tratados con JMRl93 (barras rayadas). Por tanto, la reducción de los neutrófilos marcados radiactivamente en la zona isquémica central producida por la infusión con JMRl93 ilustra la reducción de la inflamación cardiaca (*).

Los estudios descritos en los ejemplos 23A y 23B indican que la inflamación cardiaca desempeña un papel significativo perjudicial en la producción de aturdimiento de miocardio. Además, la administración de un agonista del receptor A_{2A} de la adenosina tal como, por ejemplo, JMR-193, o bien evita el aturdimiento leve (figuras 17 y 18) o atenúa significativamente la disfunción miocárdica que acompaña al aturdimiento grave (figuras 19 y 20).

Claims

1. Compuesto de fórmula (1):

8

(b) X es -CH_{2}OH, -CO_{2}R^{2}, -OC(O)R^{2}, o C(O)NR^{3}R^{4};

(c) cada uno de R^{2}, R^{3} y R^{4} es individualmente H, alquilo C_{1}-C_{6}; alquilo C_{1}-C_{6} sustituido con 1-3 de alcoxi C_{1-6}, cicloalquilo C_{3}-C_{7}, alquiltio C_{1-6}, halógeno, hidroxi, amino, mono(alquil C_{1-6})amino, di(alquil C_{1-6})amino, o arilo C_{6-10}, en la que el arilo puede estar sustituido con 1-3 de halógeno, alquilo C_{1-6}, hidroxi, amino, mono(alquil C_{1-6})amino, o di(alquil C_{1-6})amino; arilo C_{6-10}; o arilo C_{6-10} sustituido con 1-3 de halógeno, hidroxi, amino, mono(alquil C_{1-6})amino, di(alquil C_{1-6})amino o alquilo C_{1}-C_{6};

(d) Z y Z' son individualmente alquilo (C_{1}-C_{6}), opcionalmente interrumpido por l-3 S u O no peróxido, o están ausentes, y n es 1-3; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Compuesto según la reivindicación 1 en el que 5'-X es -CH_{2}OH o -C(O)NR^{3}R^{4}.

3. Compuesto según la reivindicación 2 en el que 5'-X es -C(O)NR^{3}R^{4}.

4. Compuesto según la reivindicación 3 en el que R^{3} es H y R^{4} es alquilo (C_{1}-C_{4}).

5. Compuesto según la reivindicación 1 en el que cada R es H o alquilo (C_{1}-C_{4}).

6. Compuesto según la reivindicación 1 en el que Z' es -CH_{2}- o -CH_{2}-CH_{2}-.

7. Compuesto según la reivindicación 6 en el que Z es -CH_{2}- o -CH_{2}-CH_{2}-.

8. Compuesto según la reivindicación 1 en el que el cicloalquilo C_{3}-C_{10} es ciclohexilo o ciclopentilo.

9. Compuesto según la reivindicación 8 en el que X es alcoxicarbonilo (C_{1}-C_{4}), C(O)NR^{3}R^{4} o acetoximetilo.

10. Compuesto según la reivindicación 8 en el que X-Z es HO_{2}C-Z-.

11. Compuesto según la reivindicación 8 en el que X-Z y Z' son trans en cicloalquilo C_{3}-C_{10}.

12. Compuesto según la reivindicación 1 en el que R es H, 5'-X es etilaminocarbonilo, y (X-Z-)_{n}[(C_{3}-C_{10})-cicloalquil]-Z'-C\equivC- es 2-(4-metoxicarbonil-ciclohexilmetil)etinilo o 2-(4-carboxi-ciclohexilmetil)etinilo.

13. Compuesto según la reivindicación 1 en el que R es H, 5'-X es etilaminocarbonilo, y (X-Z-)_{n}[(C_{3}-C_{10})-cicloalquil]-Z'-C\equivC- es 2-(4-acetoximetil-ciclohexilmetil)etinilo.

14. Acetato de [4-(3-{9-(2R,3R,4S,5S)-5-(N-etilcarbamoil)-3,4-dihidroxioxolan-2-il]-6-aminopurin-2-il}prop-2-inil)ciclohexil]metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

15. [(2R,3R,4S,5S)-5-(6-amino-2-{3-[4-(hidroximetil)ciclohexil]prop-1-inil}purin-9-il)-3,4-dihidroxioxolan-2-il]-N-etilcarboxamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

16. 4-(3-{9-[(2R,3R,4S,5S)-5-(N-etilcarbamoil)-3,4dihidroxioxolan-2-il]-6-aminopurin-2-il)}prop-1-inil)ciclohexanocarboxilato de metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

17. Ácido 4-(3-{9-[(2R,3R,4S,5S)-5-(N-etilcarbamoil)-3,4-dihidroxioxolan-2-il]-6-aminopurin-2-il)}prop-1-inil)ciclohexanocarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

18. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para su uso en el tratamiento médico.

19. Compuesto según la reivindicación 18, en el que el tratamiento médico es la inhibición de una respuesta inflamatoria.

20. Compuesto según la reivindicación 18, en el que el tratamiento médico comprende además el uso de un inhibidor de la fosfodiesterasa de tipo IV.

21. Compuesto según la reivindicación 20 en el que el inhibidor es rolipram.

22. Compuesto según la reivindicación 19 en el que la respuesta inflamatoria se debe a isquemia, ateroesclerosis, una enfermedad autoinmune, lesión por isquemia/reperfusión, accidente cerebrovascular, lesión cerebral traumática, lesión de la médula espinal, transplante de órgano, transplante de tejido, transplante de células, una enfermedad cutánea, infección, angioplastia, colocación de endoprótesis vascular (stent), colocación de derivación o injerto, una enfermedad alérgica; síndrome de fatiga, tratamiento inmunosupresor o un estado o síntoma patológico en un mamífero, en el que participa la actividad de los rectores A_{2A} de la adenosina y se desea el agonismo de tal actividad.

23. Compuesto según la reivindicación 19 en la que la respuesta inflamatoria es en el corazón, el riñón o el pulmón.

24. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para preparar un medicamento útil para tratar una respuesta inflamatoria.

25. Uso según la reivindicación 24 en el que el medicamento comprende un inhibidor de la fosfodiesterasa de tipo IV.

26. Uso según la reivindicación 25 en el que el inhibidor de la fosfodiesterasa es el rolipram.

27. Uso según la reivindicación 25 en el que el medicamento comprende un vehículo líquido.

28. Uso según la reivindicación 25 en el que el medicamento está adaptado para la administración parenteral.