DE3687599T2

DE3687599T2 - Optisch aktive pyridobenzoxazinderivate.

Info

Publication number: DE3687599T2
Application number: DE8686108442T
Authority: DE
Inventors: Shohgo C O Daiichi Se Atarashi; Isao C O Daiichi Seiy Hayakawa; Nobuyuki C O Daii Higashihashi; Masazumi C O Daiichi S Imamura; Masayuki C O Daiichi S Ohshima; Katsuichi C O Daiichi S Sakano; Shuichi C O Daiichi S Yokohama
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-06-20
Filing date: 1986-06-20
Publication date: 1993-05-19
Anticipated expiration: 2006-06-21
Also published as: EP0206283A3; GR861625B; KR940003757B1; ES556292A0; US4985557A; ES8801251A1; HK91793A; DE19875012I2; FI862643A; DK285086A; YU45524B; IE861631L; DE3687599D1; NL980016I1; FI90241B; YU107386A; EP0206283A2; NO166131B; NO166131C; US5142046A

Description

Ofloxacin ((±)-9-Fluor-3-methyl-10-(4-methyl-1- piperazinyl)-7-oxo-2,3-dihydro-7H-pyrido[1,2,3-de][1,4]- benzoxazin-6-carbonsäure) ist, wie im Europäischen Patent EP-B-47 005 beschrieben, als ausgezeichnetes synthetisches antimikrobielles Mittel bekannt.
Ofloxacin besitzt ein asymmetrisches Kohlenstoffatom in 3-Stellung und wird als Racemat (spezifische Drehung [α]D = 0º) nach bekannten Verfahren erhalten. Die Erfinder haben aus racemischem Ofloxacin die optisch aktiven Verbindungen erhalten und festgestellt, daß die S(-)-Verbindung von Ofloxacin eine antimikrobielle Aktivität, die etwa 2 mal höher als diejenige der (±)-Verbindung und eine akute Toxizität (LD&sub5;&sub0;), die geringer ist als diejenige der (±)-Verbindung, bestimmt bei Mäusen nach intravenöser Verabreichung, besitzt. Andererseits haben die Erfinder gefunden, daß die R(+)- Verbindung eine antimikrobielle Aktivität besitzt, die nur etwa 1/10 bis 1/100 derjenigen der (±)-Verbindung beträgt, wohingegen diese Verbindung eine akute Toxizität aufweist, die derjenigen der (±)-Verbindung entspricht. Demnach wurde gefunden, daß die S(-)-Form von Ofloxacin äußerst wünschenswerte Eigenschaften besitzt, d. h. höhere antimikrobielle Aktivität und verringerte Toxizität und es wird daher angenommen, daß sie im Vergleich zur (±)-Verbindung ein sehr nützliches pharmazeutisches Mittel ist. Weiter besitzen sowohl die R(+)- und S(-)-Verbindung von Ofloxacin in freier Form eine im Vergleich zu (±)-Verbindung und im Vergleich zu freien Verbindungen dieses Typs deutlich erhöhte Wasserlöslichkeit und sie können daher in Injektionspräparaten verwendet werden. Diese Vorteile sind den nachfolgend gezeigten experimentellen Daten zu entnehmen.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein optisch aktives Isomer von Ofloxacin und dessen Analoga zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Isomers von Ofloxacin und dessen Analoga zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein optisch aktives Isomer von Ofloxacin und dessen Analoga, das der Formel (VI) entspricht:
worin X&sub1; ein Fluoratom bedeutet, R&sub1; eine Methylgruppe bedeutet und R&sub3; eine Methyl- oder Ethylgruppe bedeutet.
Das erfindungsgemäße optisch aktive Isomer von Ofloxacin und dessen Analoga kann nach einem der unten angegebenen Verfahren A, B und C hergestellt werden. Wichtige Zwischenprodukte sind die Verbindungen der Formel X:
worin X&sub1; ein Fluoratom bedeutet und X&sub2; für ein Halogenatom, wie ein Fluoratom oder ein Chloratom, steht, wobei vorzugsweise X&sub1; und X&sub2; für ein Fluoratom stehen;
Q für ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe
steht, worin
R&sub2; eine substituierte Sulfonylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe oder eine Aralkyloxycarbonylgruppe, wie eine p- Toluolsulfonylgruppe, eine Benzolsulfonylgruppe, eine Methansulfonylgruppe, eine t-Butoxycarbonylgruppe, eine Benzyloxycarbonylgruppe, eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe etc., bedeutet und vorzugsweise für eine substituierte Sulfonylgruppe und insbesondere eine p-Toluolsulfonylgruppe steht; und n für eine ganze Zahl von 1 bis 3 und vorzugsweise für 1 oder 2 steht. Verfahren A:
worin X&sub1;, X&sub2; und R&sub3; die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.
Die (±)-3-Hydroxymethylverbindung (I) wird, genauer gesagt, mit 3,5-Dinitrobenzoylchlorid etc. behandelt, wobei man deren Derivat, wie die (±)-3,5-Dinitrobenzoat-Verbindung (II) erhält, welches dann nach einer geeigneten Methode, wie high performance-Flüssigchromatographie (HPLC), in die beiden optisch aktiven Verbindungen optisch aufgelöst wird. Die nachfolgenden Verfahren können sowohl mit der S(-)-Verbindung und der R(+)-Verbindung durchgeführt werden, wobei man das entsprechende Endprodukt erhält. Im Hinblick auf die vorliegende Erfindung wird das Endprodukt (VI') jedoch als S(-)-Form dargestellt.
Die erhaltene optisch aktive Verbindung wird mit Natriumhydrogencarbonat etc. behandelt, um den Benzoatrest selektiv zu hydrolysieren und die Hydroxymethylverbindung (III) zu erhalten. Die Hydroxymethylverbindung wird dann unter Verwendung eines Jodierungsmittels in die 3-Jodmethylverbindung (IV) überführt, welche dann mit n-Tributylzinnhydrid etc. reduziert wird, wobei man die 3-Methylverbindung erhält. Diese Verbindung kann dann ohne isoliert und gereinigt zu werden, als solche unter sauren Bedingungen zu der 3-Methyl-6-carbonsäure (V') hydrolysiert werden. Die Carbonsäure wird dann mit N- Methyl- oder N-Ethylpiperazin unter, beispielsweise, Erhitzen und Rühren umgesetzt, wobei man die 10-(4-Methyl- oder - ethylpiperazinyl)-Verbindung (VI') als Endprodukt erhält. Verfahren B:
worin X&sub1;, X&sub2; und R&sub3; die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.
Wie oben beschrieben, ist 7,8-Difluor-2,3-dihydro-3- methyl-4H-[1,4]benzoxazin der Formel (X), worin X&sub1; und X&sub2; für ein Fluoratom stehen und Q ein Wasserstoffatom bedeutet, ein wichtiges Zwischenprodukt für die Synthese von Ofloxacin. Die Erfinder haben zahlreiche Untersuchungen nach einem vorteilhaften Verfahren zur Herstellung eines optischen Isomers dieser Verbindung durchgeführt in der Erwartung, daß eine derartige Verbindung ein brauchbares Ausgangsmaterial für die Synthese des S(-)-Isomers von Ofloxacin sein würde.
Als Ergebnis wurde nun gefunden, daß es, wenn racemisches 7-Fluor-8-halogen-2,3-dihydro-3-acetoxymethyl-4H- [1,4]benzoxazin (VII) als Substrat mit einem geeigneten Enzym, wie einer bestimmten Lipasenart, hydrolysiert wird, um 7-Fluor- 8-halogen-2,3-dihydro-3-hydroxymethyl-4H-[1,4]benzoxazin (VIII) zu bilden, einen Unterschied zwischen dem (+)-Isomer und dem (- )-Isomer in der Hydrolysegeschwindigkeit gibt.
Beispielsweise wurde die Verbindung (VII) mit Lipoproteinlipase (LPL Amano 3 aus Pseudomonas aeruginosa, hergestellt von Amano Seiyaku K.K.) oder Lipase (aus Schweinepancreas, hergestellt von Shigma Chemical Company (U.S.A.); aus Candida cylindracea, hergestellt von Shigma Chemical Company; oder aus Rhizopus delemar, hergestellt von Seikagaku Kogyo Co., Ltd.) umgesetzt und der zeitliche Reaktionsverlauf wurde mit HPLC (Säule: TSK-Gel ODS-120A, 4,6·250 mm; Lösungsmittel: Acetonitril/Wasser = 1/1 Vol; Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min) bestimmt. Bei Erreichen einer Hydrolyserate von etwa 55% wurde die Verbindung (VII) gewonnen und in das 3,5- Dinitrobenzoylderivat (IX) überführt. Das erhaltene Reaktionsprodukt wurde quantitativ mit HPLC (Säule: Sumipacks OA-4200, 4,0·250 mm; Lösungsmittel: n-Hexan/l,2- Dichlorethan/Ethanol = 92/6,4/1,6 Vol; Fließgeschwindigkeit: 1,6 ml/min) bestimmt, um das Verhältnis von (+)-Isomer/(-)- Isomer der Verbindung (VII) zu ermitteln. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt: Tabelle 1 Enzym (Herkunft) Hydrolyserate LPL Amano 3 (P. aeruginosa) Lipase (R. delemar) (C. cylindracea) (P. pancreas)
Die erhaltenen Ergebnisse führen zu dem Schluß, daß die optisch-aktiven Verbindungen (VII) und (VIII) unter Verwendung der sogenannten asymmetrischen Hydrolyse mit diesen Enzymen erhalten werden können.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren B bringt man ein racemisches 7-Fluor-8-halogen-3-dihydro-3-acetoxymethyl-4H- [1,4]benzoxazin (VII) mit einem asymmetrischen hydrolytischen Enzym zur Reaktion, wobei man eine Mischung erhält, welche die mit einem der optischen Isomeren angereicherte Ausgangsverbindung (VII) und die 3-Hydroxymethylverbindung (VIII) enthält. Man trennt die Mischung in jede Verbindung, führt eine Dinitrobenzoylierung einer oder beider dieser Verbindungen durch und acetyliert die benzoylierte 3- Hydroxymethylverbindung (VIII) zur Verbindung (IX), trennt die Verbindung in die optischen Isomere durch Kristallisation, unterwirft das erhaltene gewünschte optische Isomer einer Deacylierung und Dehydroxylierung nach bekannten chemischen Verfahren, wobei man ein optisch aktives 7-Fluor-8-halogeno- 2,3-dihydro-3-methyl-4H-[1,4)benzoxazin (X') erhält, und gewinnt dann daraus optisch aktives Ofloxacin oder dessen Analoga (VI') nach bekannten Verfahren.
Das erfindungsgemäße Verfahren B wird durch konkrete Beispiele näher erläutert.
Man löst die racemische Verbindung (VII) in einem 0,1M Phosphorsäurepuffer (pH 7,0) und gibt Lipoproteinlipase (LPL Amano 3) zu der Lösung, um die enzymatische Reaktion bei 37ºC zu bewirken. Durch diese Reaktion wird die (+)-Verbindung vorzugsweise hydrolysiert, wobei man eine Mischung der durch das (-)-Isomer angereicherten Verbindung (VII) und der durch das (+)-Isomer angereicherten Verbindung (VIII) erhält. Die Reaktionsmischung wird in geeigneter Weise durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat, gewonnen.
Die obige enzymatische Reaktion kann auch in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie in einem Gemisch aus Benzol und n-Hexan, unter Verwendung eines hydrophilen Harzes, beispielsweise DEAE-Toyopearl 650M oder Toyopearl HW-40, etc., oder Celite als Dispergierungsmittel oder unter Verwendung eines Harzes, wie Amberlite XAD-7, Butyl-Toyopearl 650M, etc. als adsorptives Fixiermittel durchgeführt werden. Darüber hinaus wird die Verwendung von Einschlußfixiermitteln, wie photovernetzten Harzen, Urethanprepolymerisaten etc. in Betracht gezogen, um die enzymatische Reaktion in einem organischen Lösungsmittel durchführen zu können.
Die Umsetzung in einem organischen Lösungsmittel mit Unterstützung der oben angegebenen geeigneten Dispergiermittel oder Fixiermittel ist vorteilhaft, weil das Substrat in höherer Konzentration als in wäßriger Lösung umgesetzt und die Nachbehandlung nach der Reaktion vereinfacht werden kann. Wenn man die Umsetzung in einem organischen Lösungsmittel durchführt, kann die Reaktionsmischung durch bloßes Abfiltrieren des Dispergiermittels oder Fixiermittels in einer geeigneten Stufe und Konzentrieren des Filtrates gewonnen werden. Darüber hinaus können die Fixiermittel mit Vorteil mehrfach wiederverwendet werden.
Die in der Reaktionsmischung enthaltenen Verbindungen (VII) und (VIII) können getrennt und nach einem üblichen Trennverfahren, wie Silicagel-Säulenchromatographie, gereinigt werden. Die auf diese Weise abgetrennte Verbindung (VII) wird beispielsweise mit 3,5-Dinitrobenzoylchlorid in Tetrahydrofuran in Gegenwart von Pyridin behandelt, wobei man das 3,5- Dinitrobenzoylderivat (IX) erhält, welches dann aus einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise ein Gemisch aus Ethylacetat und n-Hexan, umkristallisiert wird, wobei das Racemat vorzugsweise kristallisiert. Die racemischen Kristalle werden abfiltriert und das (-)-7Fluor-8-halogen-2,3-dihydro-3- acetoxymethyl-4H-[1,4]benzoxazin-3,5-dinitrobenzoylderivat (IX) mit hoher optischer Reinheit wird aus dem Filtrat erhalten.
Die Verbindung (IX) wird dann einer Deacylierung, beispielsweise durch Hydrolyse unter alkalischen Bedingungen, zu dem (-)-Isomer der Verbindung (VIII) unterworfen. Diese Verbindung wird in Pyridin gelöst und mit Thionylchlorid behandelt und das Produkt wird weiter einer Dehydroxylierung in üblicher Weise, wie einer Reduktion mit Natriumborhydrid in Dimethylsulfoxid, unterworfen, wobei man das (-)-7-Fluor-8- halogen-2,3-dihydro-3-methyl-4H-[1,4]benzoxazin (X') mit einer optischen Reinheit von 99% oder mehr erhält.
Wenn die racemische Verbindung (VII) mit einer Lipase (aus Candida cylindracea oder Porcine Pancreas) behandelt wird, wird die (-)-Verbindung vorzugsweise hydrolysiert, wobei man die mit dem (-)-Isomer angereicherte Verbindung (VIII) erhält. Die erhaltene Verbindung wird dann in Verbindung (IX) überführt, welche dann gemäß den oben beschriebenen Verfahren, wie Auftrennung durch Kristallisation, behandelt wird, um das (-)- Isomer der Verbindung (VIII) zu erhalten. Das (-)-Isomer der Verbindung (X') kann dann aus diesem Produkt in gleicher Weise wie oben beschrieben, mit hoher Reinheit hergestellt werden.
Zusätzlich zur Verwendung der oben erwähnten Enzyme können andere asymmetrische Hydrolysen, welche die erfindungsgemäße Aufgabe lösen können, auf der Grundlage der obigen Ausführungen gefunden werden. Wenn beabsichtigt ist, die (+)-Verbindungen zu erhalten, kann man auf der Grundlage der obigen Ausführungen die gleichen Verfahren, wie oben beschrieben, einsetzen.
Die (-)-Verbindung von Ofloxacin und deren Analoga können ausgehend von den neuen erfindungsgemäßen Zwischenprodukten der Formel (X') gemäß dem nachfolgend erläuterten Verfahren C hergestellt werden.
Verfahren C:
worin n, X&sub1;, X&sub2;, R&sub2; und R&sub3; die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, R&sub1; für Methyl steht und X&sub3; für eine Carboxylgruppe oder ein reaktives Derivat davon, beispielsweise ein aktiver Ester, ein Halogenid oder ein Säureanhydrid der Carbonsäure, steht.
Beim Verfahren C wird das 7-Fluor-8-halogen-1,4- benzoxazinderivat (X') mit einer cyclischen Aminosäure (XIV) oder einem reaktiven Derivat davon unter Bildung einer Amidbindung zu einer Verbindung (X'') kondensiert. Die Kondensationsreaktion kann entweder nach der aktiven Estermethode, der Säureanhydridmethode oder der DCC-Methode erfolgen. Im allgemeinen werden aber die Verbindung (X') und ein Säurechlorid (XIV), worin X für -COCl steht, in einem organischen Lösungsmittel, wie halogenierten Kohlenwasserstoffen, beispielsweise Dichlormethan, in Gegenwart eines Säureacceptors, wie Pyridin, Triethylamin oder Kaliumcarbonat, bei Raumtemperatur unter Rühren zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsprodukt kann in üblicher Weise, wie durch Kristallisation, Säulenchromatographie etc., isoliert und gereinigt werden.
Wenn bei dieser Kondensationsreaktion eines der beiden Isomere der cyclischen Aminosäure (XIV) oder des reaktiven Derivates davon, d. h. die S-Verbindung oder die R-Verbindung verwendet wird, kann die Auftrennung der Diastereomerenmischung der Verbindung (X'') auf einfache Weise erfolgen. Insbesondere können Derivate (XIV), wie S- oder R-Prolin, S- oder R- Pipecolsäure (Piperidin-2-carboxylsäure) etc. in geeigneter Weise verwendet werden. Zu den bevorzugtesten Verbindungen (XIV) zählen (S)-N-Benzolsulfonylprolin und (S)-N-p-Toluolsulfonylprolin.
Die Diastereomerenmischung der Verbindung (X'') kann durch fraktionierte Kristallisation, Chromatographie unter Verwendung von Kieselgel, etc. als Träger, oder einer Kombination dieser Methoden aufgetrennt werden.
Das auf diese Weise abgetrennte Diastereomer wird üblicherweise unter basischen Bedingungen, zu einer 7-Fluor-8- halogen-3-(S)-methyl-[1,4]benzoxazin (X) hydrolysiert. Diese Verbindung kann nach bekannten Verfahren in die 9-Fluor-10- halogen-3-(S)-methyl-7-oxo-2,3-dihydro-7H-pyrido[1,2,3- de][1,4]benzoxazin-6-carbonsäure (V) überführt werden, welche dann in die 10-(4-Methyl- oder Ethylpiperazinyl)-Verbindung (VI) umgewandelt werden kann.
Von den oben beschriebenen Verfahren A, B und C ist das Verfahren C besonders bevorzugt.

Antimikrobielle Aktivität

Die antimikrobielle Aktivität der optischen Isomere [(-) und (+)] von Ofloxacin und einer analogen Verbindung davon gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wurde mit derjenigen von Ofloxacin (Racemat) verglichen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 gezeigt. Der Test wurde gemäß der von The Japan Society of Chemotherapy spezifizierten Standardmethode durchgeführt. Tabelle 2 Minimale Inhibierende Konzentration (MIC; ug/ml) Microorganismus S(-)-Ofloxacin* Racemisches Ofloxacin R(+)-Ofloxacin Verbindung des Beispiels 17 E. coli, NIHJ K. pneumoniae, Type 2 Ser. marcescens, Ps. aeruginosa, Ps. maltophilia, S. aureaus, Smith Str. pyogenes,

Akute Toxizität

Die akute intravenöse Toxizität der (±), R(+) und SC-)- Formen von Ofloxacin bei männlichen Mäusen ist in der nachfolgenden Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Verbindungen Dosis Zahl der Mäuse Tage nach Behandlung Mortalität bei Mäusen Form

Löslichkeit

Die Löslichkeit der (±), R(+) und S(-)-Formen von Ofloxacin in Wasser bei einer Temperatur im Bereich von 23 bis 26ºC ist in der nachfolgenden Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Verbindungen Wasserlöslichkeit (ug/ml)
(±) 2,400
R(+) 25,800
S(-) 22,500
Die Überführung der Zwischenprodukte der Formel (X) in das gewünschte Ofloxacin oder eine analoge Verbindung davon, kann nach bekannten Verfahren, die beispielsweise im U.S.-Patent 4,382,892, Europäischen Patent EP-B-47 005, in der Japanischen Patentanmeldung (OPI) Nos. 29789/83 and 43977/83 offenbart sind, durchgeführt werden.
Die Erfindung wird nun anhand der nachfolgenden Beispiele, die jedoch die Erfindung nicht begrenzen sollen, näher erläutert. Die Beispiele 1 bis 7 beschreiben die Herstellung von Ofloxacin nach Verfahren A; die Beispiele 8 bis 11 beschreiben die Herstellung von Ofloxacin nach Verfahren B; und die Beispiele 12 bis 17 beschreiben die Herstellung von Ofloxacin und analogen Verbindungen nach Verfahren C.

BEISPIEL 1

Herstellung der Benzoyloxyverbindung

1 g (±)-9,10-Difluor-3-hydroxymethyl-7-oxo-2,3-dihydro-7H- pyrido[1,2,3-de][1,4]benzoxazin-6-carbonsäure-ethylester (1) und 500 mg Pyridin wurden in 100 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) suspendiert.
1,6 g 3,5-Dinitrobenzoylchlorid wurden zugegeben und anschließend wurde bei 90ºC unter Rückfluß erhitzt. Nachdem sich die Suspension aufgelöst hatte, bildete sich ein farbloser Niederschlag. Die Reaktion wurde 1,5 Stunden fortgesetzt. Nach dem Abkühlen wurde der Niederschlag abfiltriert, mit Methanol und Diethylether gewaschen und getrocknet, wobei man 1,2 g (±)- 9,10-Difluor-3-(3,5-dinitrobenzoyloxy)methyl-7-oxo-2,3-dihydro- 7H-pyrido[1,2,3-de][1,4]benzoxazin-6-carbonsäureethylester (II) als farbloses Pulver mit einem Schmelzpunkt von 240-242ºC erhielt.
NMR (CDCl&sub3;/5% DMSO-d&sub6;) δ(ppm);
1,30 (3H, t, J=7,0Hz, -CH&sub2;CH&sub3;), 4,26 (2H, q, J=7,0Hz, -CH&sub2;CH&sub3;), 4,4-4,5 (5H, m), 7,76 (1H, dd, J=11,0Hz, 7,0Hz, C&sub8;-H), 8,8 (1H, s, C&sub5;-H), 9,0 (2H, d, J=3.0Hz, aromatische Ringprotonen) und 9,2 (1H, t, J=3,0Hz, aromatisches Ringproton).

BEISPIEL 2

Optische Auflösung

6 mg der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Benzoyloxyverbindung wurden in etwa 0,6 ml Dimethylformamid (DMF), das durch Destillation gereinigt worden ist, gelöst. Die Lösung wurde durch ein Millipore-Filter filtriert und einer HPLC unter Verwendung einer Sumipacks OA-4200-Säule (2 cm·25 cm) und n-Hexan/1,2-Dichlorethan/Ethanol = 6/3/1 (auf das Volumen bezogen) als Lösungsmittel mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min unterworfen.
Da die ersten Fraktionen (Fraktionen der (+)-Verbindung) eine geringe Menge der racemischen Verbindung (I) aufgrund einer partiellen Hydrolyse beim Lösen in DMF enthielten, wurden sie weiter durch Kieselgelchromatographie unter Verwendung von Chloroform bis 10% Methanol/Chloroform als Eluierungsmittel gereinigt. Diese Reinigungsverfahren wurden wiederholt, wobei man jeweils 250 mg der beiden optisch aktiven Verbindungen [(-)-Isomer und (+)-Isomer] aus 600 mg der Benzoyloxyverbindung II) erhielt.
(+)-Isomer: Retentionszeit: 56-76 min. (Säulentemperatur: 22ºC); Schmelzpunkt: 235-240ºC; [α]23/D = +90,8º (c = 0,852, DMF)
(-)-Isomer: Retentionszeit: 78-98 min. (Säulentemperatur: 22ºC); Schmelzpunkt: 244-249ºC; (α)23/D = 92,5º (c = 0,889, DMF)

BEISPIEL 3

Herstellung von Ethyl (-)-9,10-Difluor- 3-Hydroxymethyl-7-Oxo-2,3-Dihydro- 7H-Pyrido[1,2,3-de] [1,4]Benzoxazin- 6-Carboxylat (III)

In einer Mischung aus 10 ml Ethanol und 4 ml einer gesättigten wäßrigen Natriumbicarbonatlösung wurden 120 mg der optisch aktiven Benzoyloxyverbindung [(-)-Isomer] suspendiert und die Suspension wurde 2 Stunden unter Rühren bei 50 bis 60ºC erhitzt. Nach Einengen wurde Wasser zu der Reaktionsmischung gegeben, und unlösliches Material wurde abfiltriert, und nacheinander mit Wasser, 95%igem Ethanol und Diethylether gewaschen, wobei man 68 mg der optisch aktiven 3-Hydroxymethylverbindung [(III), (-)-Isomer] in Form farbloser Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 235-240ºC erhielt.
Elementaranalyse für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub3;F&sub2;NO&sub5;:
Berechnet (%): C 55,39, H 4,03, N 4,31
Gefunden (%): C 55,44, H 4,01, N 4,49
[α]23/D = -125,9º (c = 0,918, DMF)
In gleicher Weise wie oben beschrieben, wurde die (+)-3- Hydroxymethylverbindung aus der (+)-Benzoyloxyverbindung synthetisiert. Schmelzpunkt: 231-234ºC. [α]23/D = +125,90 (c = 0,715, DMF).

BEISPIEL 4

Herstellung von Ethyl (-)-9,10-Difluor- 3-Jodmethyl-7-oxo-2,3-Dihydro-7H-Pyrido- [1,2,3-de][1,4]-Benzoxazin-6-Carboxylat (IV)

In 12 ml wasserfreiem DMF wurden 63 mg der (-)-3- Hydroxymethylverbindung (III) suspendiert und die Suspension wurde unter Rühren auf 70 bis 80ºC erhitzt, wobei sich eine Lösung bildete. Anschließend ließ man auf Raumtemperatur abkühlen. Zu der Lösung wurden 340 mg Triphenylphosphitmethiodid gegeben, anschließend wurde 1,5 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in Chloroform gelöst. Die Lösung wurde mit wäßriger Natriumthiosulfatlösung und anschließend mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung extrahiert. Die Chloroformschicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde durch Destillation entfernt. Zum Rückstand wurde Diethylether gegeben, anschließend wurde gerührt und der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert, mit Diethylether gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man 78 mg der entsprechenden Jodmethylverbindung (IV) als weißes Pulver mit einem Schmelzpunkt von 214-217ºC erhielt.
Elementaranalyse für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub2;F&sub2;INO&sub4;:
Berechnet (%): C 41,40, H 2,78, N 3,22
Gefunden (%): C 41,16, H 2,58, N 2,99
Die (+)-Verbindung wurde in gleicher Weise wie oben beschrieben erhalten.

BEISPIEL 5

Herstellung der S(-)-9,10-Difluor-3-Methyl- 7-Oxo-2,3-Dihydro-7H-Pyrido[1,2,3-de] [1,4]- Benzoxazin-6-Carbonsäure (V')

In 18 ml absolutem Ethanol wurden 78 mg der Jodmethylverbindung (IV) suspendiert und die Suspension wurde unter Rühren auf 60 bis 70ºC erhitzt, wobei sich eine Lösung bildete. Anschließend ließ man auf Raumtemperatur abkühlen. Zu der erhaltenen Lösung wurden 0,2 ml n-Tributylzinnhydrid gegeben und die Mischung wurde 1 Stunde bei 50 bis 60ºC und anschließend 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation entfernt und der Rückstand wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 8 g Kieselgel als Träger und Chloroform:Methanol (40:1 auf das Volumen bezogen) als Eluierungsmittel unterworfen, wobei man die rohe Methylverbindung erhielt. Das Rohprodukt wurde in 2 ml Eisessig gelöst und mit 4 ml konzentrierter Salzsäure versetzt. Nach 40 minütigem Erhitzen unter Rückfluß wurde die Reaktionsmischung konzentriert. Zu dem Konzentrat wurde Wasser gegeben und die so ausgefällten Kristalle wurden abfiltriert, nacheinander mit Wasser, Ethanol und Diethylether gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man 22 mg der S(-)- Verbindung (V') in Form von Kristallen mit einem Schmelzpunkt von 300ºC oder darüber erhielt.
Elementaranalyse für C&sub1;&sub3;H&sub9;F&sub2;NO&sub4;:
Berechnet (%): C 55,52, H 3,23, N 4,98
Gefunden (96): C 55,79, H 3,20, N 4,91
[α]23/D = -65,6º (c = 0,950, DMSO)

BEISPIEL 6

Herstellung von S(-)-9-Fluor-3-Methyl- 10-(4-Methyl-1-Piperazinyl)-7-Oxo-2,3- Dihydro-7H-Pyrido[1,2,3-de][1,4]- Benzoxazin-6-Carbonsäure

In 3 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid wurden 21 mg der S(-)-9,10-Difluor-3-methyl-7-oxo-2,3-dihydro-7H-pyrido[1,2,3- de][1,4)benzoxazin-6-carbonsäure (V') und 30 mg N-Methylpiperazin gelöst und die Lösung wurde 1 Stunde bei 130 bis 140ºC gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation entfernt und zum Rückstand wurden 2 ml Ethanol gegeben. Der so ausgefällte Feststoff wurde abfiltriert und nacheinander mit einer geringen Menge an Ethanol und Diethylether gewaschen. Das erhaltene Pulver mit einem Gewicht von 14 mg wurde über eine Säule aus 5 g Kieselgel gegeben und mit der unteren Schicht einer Mischung von Chloroform-Methanol-Wasser (7:3:1 auf das Volumen bezogen) eluiert, wobei man die Titelverbindung S(-)-9-Fluor-3-methyl-10-(4-methyl-1-piperazinyl)-7-oxo-2,3- dihydro-7H-pyrido[1,2,3-de][1,4]benzoxazin-6-carbonsäure (VI') erhielt. Die nach der Filtration verbliebene Mutterlauge wurde einer Dünnschichtchromatographie (Silicagel; 20 cm·20 cm, 5 mm (t)) unterworfen und mit der unteren Schicht einer Mischung von Chloroform-Methanol-Wasser (15:3:1 auf das Volumen bezogen) entwickelt. Die beiden gereinigten Produkte wurden vereinigt, wobei man 14 mg der Titelverbindung in Form von Kristallen mit einem Schmelzpunkt von 220-228ºC (unter Zersetzung) erhielt. Elementaranalyse für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub0;FN&sub3;O&sub4;:
Berechnet (%): C 59,82, H 5,58, N 11,63
Gefunden (%): C 60,01, H 5,69, N 11,53
[α]24/D = -68,8º (c = 0,711, 0,05N NaOH)
MS (m/e): 361 (M&spplus;)
NMR (CDCl&sub3;) δ (ppm):
1,63 (3H, d, C&sub3;-CH&sub3;), 2,38 (3H, s, N-CH&sub3;), 2,54-2,60 (4H, m, 2·CH&sub2; N), 3,40-3,44 (4H, m, 2·CH&sub2; N), 4,35- 4,52 (3H, m, CH und CH&sub2;), 7,76 (1H, d, aromatischer Ring C&sub8;-H) und 8,64 (1H, s, C&sub5;-H)
Die (+)-Verbindung wurde in gleicher Weise wie oben beschrieben, erhalten. Schmelzpunkt: 218-226ºC (unter Zersetzung). [α]24/D = +68,7º (c = 0,560, 0,05H NaOH). MS (m/e): 361 (M&spplus;).

BEISPIEL 7

Herstellung von S(-)9-Fluor-3-Methyl- 10-(4-Methyl-12-Piperazinyl)-7-Oxo-2,3- Dihydro-7H-Pyrido[1,2,3-de][1,4]Benzoxazin- 6-Carbonsäure (VI')

In 30 ml Diethylether wurden 281 mg der gemäß Beispiel 5 erhaltenen S(-)-9,10-Difluor-3-methyl-7-oxo-2,3-dihydro-7H- pyrido[1,2,3de][1,4]benzoxazin-6-carbonsäure (V') gelöst und ein großer Überschuß Bortrifluoridethyletherat wurde unter Rühren bei Raumtemperatur zugegeben. Anschließend ließ man die Mischung 45 Minuten reagieren. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, mit Diethylether gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Die erhaltene Chelatverbindung mit einem Gewicht von 310 mg wurde in 6 ml Dimethylsulfoxid gelöst und 0,32 ml Triethylamin und 0,13 ml N-Methylpiperazin wurden zu der Lösung gegeben. Die Mischung wurde 17 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde mit Diethylether gewaschen und anschließend in 20 ml 95%igem Ethanol, das 0,5 ml Triethylamin enthielt, gelöst. Die Lösung wurde 8 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 5%iger verdünnter Salzsäure gelöst und die Lösung wurde zwischen Chloroform und Wasser verteilt. Die wäßrige Phase wurde mit IN Natriumhydroxid auf pH 11 und anschließend mit 1N Salzsäure auf pH 7,4 eingestellt. Die Lösung wurde dreimal mit je 50 ml Chloroform extrahiert und der Extrakt wurde über Natriumsulfat getrocknet. Das Chloroform wurde durch Destillation entfernt. Umkristallisation des erhaltenen Pulvers aus Ethanol-Diethylether ergab 120 mg der Titelverbindung in Form durchsichtiger feiner nadelartiger Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 225-227ºC (unter Zersetzung). [α]24/D = -76,9º (c = 0,385, 0,05N NaOH) Elementaranalyse für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub0;FN&sub3;O&sub4;.1/2H&sub2;O:
Berechnet (%): C 58,37, H 5,72, N 11,35
Gefunden (%): C 58,17, H 5,58, N 11,27

REFERENZBEISPIEL 1

Herstellung von (+)-3-Acetoxymethyl-7,8- Difluor-2,3-Dihydro-4H-[1,4]Benzoxazin

In 1,0 1 Aceton wurden 60,0 g 2,3-Difluor-6-nitrophenol und 70,0 g 1-Acetoxy-3-chlor-2-propan gelöst und anschließend wurden zu der Lösung unter Rühren bei Raumtemperatur 33,1 g Kaliumcarbonat gegeben. Nach weiterem 30minütigem Rühren wurden 6,6 g Kaliumjodid zugegeben und die Mischung wurde 4 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nachdem man Abkühlen ließ, wurde die Reaktionsmischung filtriert und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde in 4,0 l eines Lösungsmittelgemisches aus Ethylacetat:Benzol (1:1 auf das Volumen bezogen) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 1,2 kg Kieselgel und Benzol/Ethylacetat (10/1) als Eluens unterworfen, wobei man 32,8 g der Verbindung (A) als öliges Produkt erhielt. Verbindung (A) wurde in 300 ml Methanol gelöst und 115 ml Raney-Nickel wurden zugegeben, um die katalytische Reduktion bei Atmosphärendruck zu bewirken. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel und Benzol/Ethylacetat (10/1 auf das Volumen bezogen) als Eluens gereinigt. Das Produkt wurde aus Benzol-n-Hexan umkristallisiert, wobei man 17,9 g (±)-3-Acetoxymethyl-7,8- difluor-2,3-dihydro-4H-[1.4]benzoxazin (VII) als farblose Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 73-74ºC erhielt. Elementaranalyse für C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub1;F&sub2;NO&sub3;:
Berechnet (%): C 54,32, H 4,56, N 5,76
Gefunden (%): C 54,09, H 4,42, N 5,76

BEISPIEL 8

Herstellung des (-)-3-Acetoxymethyl-7,8- Difluor-2,3-Dihydro-4H-[1,4]Benzoxazin- 3,5-Dinitrobenzoyl-Derivates (IX)

a) 10 g (±)-3-Acetoxymethyl-7,8-difluor-2,3-dihydro-4H- [1,4]benzoxazin (VII) wurden als Substrat in 1,00 1 eines Lösungsmittelgemisches aus Benzol/n-Hexan (4/1 auf das Volumen bezogen) gelöst. Ein Harz in feuchtem Zustand wurde durch Suspendieren von 100 ml DEAE-Toyopearl 650M in einem 0,05M Phosphorsäurepuffer (pH 7,0) und anschließendes Absaugen hergestellt. Zu der so hergestellten Substratlösung wurden 200 mg Lipoprotein-Lipase (LPL Amano 3) gegeben. Man ließ das Reaktionssystem bei 37ºC 6 Stunden unter Rühren reagieren. Die Reaktionsmischung wurde abgesaugt und das Harz mit 200 ml Benzol gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat mit einem Gewicht von 9,68 g wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 200 g Kieselgel als Träger und Benzol/Ethylacetat (10/1 auf das Volumen bezogen) als Eluens unterworfen, wobei man 4,67 g 3-Acetoxymethyl-7,9- difluor-2,3-dihydro-4H-[1,4]benzoxazin erhielt.
Man löste die erhaltene Verbindung in 200 ml Tetrahydrofuran, gab 5,76 g 3,5-Dinitrobenzoylchlorid und 3,3 ml Pyridin zu und erhitzte 3 Stunden auf 60ºC. Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert und das Konzentrat wurde in 400 ml Ethylacetat gelöst, nacheinander mit verdünnter Salzsäure, einer wäßrigen Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert. Zugabe von n-Hexan zu dem Konzentrat führte zur Ausfällung schwach gelber Kristalle des Racemats. Nach ausreichender Ausfällung wurde der Niederschlag abfiltriert und das Filtrat wurde zur Trockene eingeengt, wobei man 3,93 g des 3,5-Dinitrobenzoylderivats von (-)-3-Acetoxymethyl-7,8-difluor- 2,3-dihydro-4H-[1,4]benzoxazin (IX) erhielt.
b) Zu etwa 2,0 ml Amberlite XAD 7 wurden 2,0 ml eines 0,05M Phosphorsäurepuffers (pH 7,0), der 20 mg Lipoprotein-Lipase (LPL Amano 3) enthielt, gegeben. Man ließ das System 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen, um das Enzym am Harz zu adsorbieren. Das Harz wurde abgesaugt und mit 10 ml eines 0,05M Phosphorsäurepuffers (pH 7,0) gewaschen. Zu dem so hergestellten Harz in feuchtem Zustand wurde eine Lösung von 250 mg (±)-3-Acetoxymethyl-7,8-difluor-2,3-dihydro-4H- [1,4]benzoxazin als Substrat in 25 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Benzol und n-Hexan (4:1 auf das Volumen bezogen) gegeben. Anschließend ließ man 4 Stunden unter Rühren bei 37ºC reagieren. Die Reaktionsmischung wurde in gleicher Weise wie oben unter a) beschrieben aufgearbeitet, wobei man 117 mg des optisch aktiven 3-Acetoxymethyl-7,8- difluor-2,3-dihydro-4H-[1,4]benzoxazins erhielt. In gleicher Weise wurden 65 mg des 3,5-Dinitrobenzoylderivats des (-)-3- Acetoxymethyl-7,8-difluor-2,3-dihydro-4H-[1,4]benzoxazins erhalten.
c) Zu 3,60 l eines 0,1M Phosphorsäurepuffers (pH 7,0) wurden 3,60 g (±)-3-Acetoxymethyl-7,8-difluor-2,3-dihydro-4H- [1,4]benzoxazin als Substrat gegeben und die Mischung wurde 18 Stunden bei 37ºC gerührt, wobei sich eine Lösung bildete. Zu der erhaltenen Lösung wurden 50 mg Lipoprotein-Lipase (LPL Amano 3) gegeben und anschließend ließ man das System bei 37ºC 190 Minuten unter Rühren reagieren. Die Reaktionsmischung wurde drei mal mit je 2,0 l Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 70 g Kieselgel als Träger und Chloroform als Eluens unterworfen, wobei man 1,07 g des optisch aktiven 3- Acetoxymethyl-7,8-difluor-2,3-dihydro-4H-[1,4]benzoxazins erhielt. Die erhaltene Verbindung wurde in gleicher Weise wie oben unter a) beschrieben behandelt, wobei man 0,9 g des 3,5- Dinitrobenzoylderivats des (-)-3-Acetoxymethyl-7,8-difluor-2,3- dihydro-4H-[1,4]benzoxazins erhielt.
d) Zu 3,70 l eines 0,1M Phosphorsäurepuffers (pH 7,0) wurden 3,70 g (±)-3-Acetoxymethyl-7,8-difluor-2,3-dihydro-4H- [1,4]benzoxazin als Substat gegeben und anschließend wurde 3,5 Stunden bei 37ºC gerührt, wobei sich eine Lösung bildete. Zu der erhaltenen Lösung wurden 2,22 g Lipase (aus Candida cylindracea) gegeben, anschließend ließ man das System bei 37ºC 7,5 Stunden unter Rühren reagieren. Die Reaktionsmischung wurde drei Mal mit je 2,0 l Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 70 g Kieselgel unterworfen und zuerst mit Benzol/Ethylacetat (5/1 auf das Volumen bezogen) entwickelt, wobei 3-Acetoxymethyl-7,8-difluor-2,3-dihydro-4H- [1,4]benzoxazin eluiert wurde und anschließend mit Benzol/Ethylacetat (1/1 auf das Volumen bezogen) entwickelt, wobei 7,8-Difluor-2,3-dihydro-3-hydroxymethyl-4H- [1,4]benzoxazin eluiert wurde.
Das letztere Eluat mit einem Gewicht von 1,31 g wurde in 60 ml Tetrahydrofuran gelöst, mit 1,70 g 3,5-Dinitrobenzoylchlorid versetzt und anschließend 20 Stunden auf 37ºC erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert und das Konzentrat wurde in 400 ml Ethylacetat gelöst, nacheinander mit wäßriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, wobei man 2,52 g des Reaktionsproduktes erhielt. Man löste das Reaktionsprodukt in 10 ml Pyridin, gab 10 ml Acetanhydrid zu und erhitzte 20 Stunden auf 37ºC. Die Reaktionsmischung wurde in gleicher Weise wie oben unter a) aufgearbeitet und umkristallisiert, um die Racematkristalle zu entfernen und auf diese Weise die optische Reinheit zu erhöhen. Da das Produkt noch in geringen Mengen Reaktionsnebenprodukte enthielt, wurde es weiter durch Toyopearl HW-40- Säulenchromatographie (Säule: 2,5·95 cm; Entwicklungsmittel: Methanol/Acetonitril = 1/1 auf das Volumen bezogen) und anschließend durch Kieselgel-Säulenchromatographie (Säule: 1,8·34 cm; Entwicklungsmittel: Chloroform/Aceton = 20/1 auf das Volumen bezogen) gereinigt, wobei 0,44 g des 3,5- Dinitrobenzoylderivats des (-)-3-Acetoxymethyl-7,8-difluor-2,3- dihydro-4H-[1,4]benzoxazins erhalten wurden.
MS (m/z): 437 (M&spplus;)
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 200 MHz) δ (ppm):
2,14 (3H, s, -OCOCH&sub3;), 4,26 (2H, d, J=7,0Hz, -CH&sub2; OCOCH&sub3;), 4,45 (1H, dd, J=3,0Hz, 12,0Hz, C&sub2;-H), 4,71 (IH, d, J=12,0Hz, C&sub2;- H), 4,94 (1H, m, C&sub3;-H), 6,60 (2H,m, aromatische Ringprotonen), 8,73 (2H, d, J=2,0Hz, aromatische Ringprotonen) und 9,19 (1H, t- aromatisches Ringproton).

BEISPIEL 9

Herstellung von (-)-7,8-Difluor-2,3-Dihydro- 3-Hydroxymethyl-4H-[1,4]Benzoxazin (VIII)

In 135 ml Tetrahydrofuran wurden 3,03 g des 3,5- Dinitrobenzoylderivates des (-)-3-Acetoxymethyl-7,8-difluor- 2,3-dihydro-4H-[1,4]benzoxazins gelöst und zu der Lösung wurden 135 ml Ethanol und 30 ml 1,0N Kaliumhydroxid gegeben. Nach 30minütigem Rühren der Reaktionsmischung bei Raumtemperatur wurden zur Neutralisation 3 ml Essigsäure zugegeben. Die Mischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert und das Konzentrat wurde in 400 ml Chloroform gelöst, nacheinander mit wäßriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Feststoff wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 40 g Kieselgel und Eluierung mit Chloroform/Methanol (50/1 auf das Volumen bezogen) unterworfen, wobei 1,17 g (-)-7,8-Difluor-2,3-dihydro- 3-hydroxymethyl-4H-[1,4]benzoxazin erhalten wurden.
[α]22/D = -14,1º (c = 1,80, CHCl&sub3;)
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 200 MHz) δ (ppm):
3,5-4,4 (5H, m), 6,30-6,42 (IH, m, aromatisches Ringproton) und 6,54-6,74 (1H, m, aromatisches Ringproton).

BEISPIEL 10

Herstellung von (-)-7,8-Difluor-2,3- Dihydro-3-Methyl-4H-[1,4]Benzoxazin (X')

Man gab 1,17 g (-)-7,8-Difluor-2,3-dihydro-3- hydroxymethyl-4H-[1,4]benzoxazin in 20 ml Pyridin und tropfte unter Eiskühlung 2,77 g Thionylchlorid zu. Anschließend wurde 40 Minuten auf 50 bis 60ºC erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert und das Konzentrat wurde in 300 ml Chloroform gelöst und mit 100 ml wäßriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die Waschflüssigkeit wurde zwei mal mit je 200 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformschichten wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 40 g Kieselgel und Eluierung mit Chloroform unterworfen, wobei 1,18 g des Reaktionsprodukts als farbloses öliges Produkt erhalten wurden. Das Produkt wurde in 30 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Man gab 0,41 g Natriumborhydrid zu und erhitzte anschließend 1 Stunde auf 80 bis 90ºC. Die Reaktionsmischung wurde in 500 ml Benzol gelöst, mit Wasser zur Entfernung von Dimethylsulfoxid gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 40 g Kieselgel und Eluierung mit Benzol unterworfen, wobei 0,80 g (-)-7,8-Difluor- 2,3-dihydro-3-methyl-4H-[1,4]benzoxazin als farbloses öliges Produkt erhalten wurden.
[α]25/D = -9,6º (c = 2,17, CHCl&sub3;):
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 200 MHz) δ (ppm):
1,20 (3H, d, J=6,0Hz, -CH&sub3;), 3,53 (1H, m, C&sub3;-H), 3,81 (1H, dd, J=8,0Hz, 10,0Hz, C&sub2;-H), 4,31 (1H, dd, J=3,0Hz, 10,0Hz, C&sub2;- H), 6,24 - 6,36 (1H, m, aromatisches Ringproton) und 6,52 - 6,70 (1H, m, aromatisches Ringproton)
Optische Reinheit: > 99%e.e.
Das Produkt wurde in das 3,5-Dinitrobenzoylderivat überführt und quantitativ durch HPLC unter Verwendung einer Sumipacks OA-4200-Säule; 4,0·250 mm und eines Lösungsmittelgemisches aus n-Hexan/1,2-Dichlorethan/Ethanol (90/9,1/0,9 auf das Volumen bezogen) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/min bestimmt.

BEISPIEL 11

Herstellung von S(-)-Ofloxacin

Zu 1,13 g (-)-7,8-Difluor-2,3-dihydro-3-methyl-4H- [1,4]benzoxazin wurden 1,58 g Diethylethoxymethylenmalonat gegeben, die Mischung wurde 70 Minuten bei 130 bis 140ºC gerührt. Die Reaktionsmischung wurde als solche einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 50 g Kieselgel und Eluierung mit Chloroform unterworfen, wobei 2,47 g Diethyl [(-)-7,8-difluor-3-methyl-2,3-dihydro-4H- [1,4]benzoxazin-4-yl]methylenmalonat erhalten wurden. Das Produkt wurde in 5 ml Acetanhydrid und 10 ml einer Mischung aus Acetanhydrid und konzentrierter Schwefelsäure (2/1 auf das Volumen bezogen) unter Rühren und unter Eiskühlung gelöst. Anschließend wurde noch 40 Minuten bei 50 bis 60ºC gerührt. Zu der Reaktionsmischung wurden Eis und eine wäßrige Natriumbicarbonatlösung gegeben und das Reaktionsprodukt wurde dreimal mit je 150 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert. Sobald sich ein Niederschlag abzuscheiden begann, wurde eine geringe Menge Diethylether zugegeben und der Niederschlag wurde abfiltriert. Der Niederschlag wurde mit einer geringen Menge Diethylether gewaschen, wobei 1,32 g (-)- Ethyl 9,10-difluor-3-methyl-7-oxo-2,3-dihydro-7H-pyrido[1,2,3- de][1,4]benzoxazin-6-carboxylat erhalten wurden.
1,20 g der erhaltenen Verbindung wurden in 12 ml Essigsäure gelöst und zu der Lösung wurden 25 ml konzentrierte Salzsäure gegeben. Anschließend wurde 90 Minuten bei 120 bis 130ºC unter Rückfluß erhitzt. Nachdem man die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur stehen ließ, fielen farblose nadelartige Kristalle aus, die abfiltriert und nacheinander mit einer geringen Menge Wasser, Ethanol und Diethylether gewaschen wurden, wobei 0,96 g (-)-9,10-Difluor-3-methyl-7-oxo-2,3- dihydro-7H-pyrido[1,2,3-de][1, 4)benzoxazin-6-carbonsäure erhalten wurden.
Man suspendierte 324 mg der erhaltenen Verbindung in 30 ml Diethylether, gab einen großen Überschuß Bortrifluoridethyletherat zu und rührte anschließend 30 Minuten bei Raumtemperatur, wobei sich eine Chelatverbindung bildete. Das Produkt wurde abfiltriert und mit einer geringen Menge Diethylether gewaschen, wobei 373 mg eines Pulvers erhalten wurden. Man löste das Pulver in 7 ml Dimethylsulfoxid, gab 136 mg N-Methylpiperazin und 228 mg Triethylamin zu, und rührte anschließend 17 Stunden bei Raumtemperatur. Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und zu dem Feststoff wurden 15 ml 95%iges Methanol und 0,31 ml Triethylamin gegeben. Die erhaltene Mischung wurde 3 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand wurde filtriert und nacheinander mit einer geringen Menge Ethanol und Diethylether gewaschen, wobei 350 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden. Umkristallisation aus einem Gemisch von Ethanol und konzentriertem wäßrigen Ammoniak ergab 230 mg S(-)- Ofloxacin.
Schmelzpunkt: 225-227ºC (unter Zersetzung).
[α]23/D = -76,9º (c = 0,39, 0,05N NaOH)
Ms(m/e): 361 (M+)
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 200 MHz) 6 (ppm):
1,63 (3H, d, C&sub3;-CH&sub3;), 2,38 (3H, s, N-CH&sub3;), 2,54-2,60 (4H, m, 2·CH&sub2;N), 3,40-3,44 (4H, m, 2·CH&sub2; N), 4,35-4,52 (3H, m, CH und CH&sub2;), 7,76 (1H, d, aromatischer Ring C&sub8;-H) und 8,64 (1H, s, C&sub5;-H)

BEISPIEL 12

Herstellung von 3s-(+)-7,8-Difluor-2,3- Dihydro-3-Methyl-4-[(S)-N-p-toluolsulfonylprolyl]-4H-[1,4]Benzoxazin (X'')

Eine Lösung des Säurechlorids, das aus 61,9 g (S)-N-ptoluolsulfonylprolin und Thionylchlorid hergestellt wurde, in 350 ml trockenem Dichlormethan, wurde zu einer Lösung von 32,8 g (±)-7,8-Difluor-2,3-dihydro-3-methyl-4H-[1,4]benzoxazin und 28 ml Pyridin in 300 ml trockenem Dichlormethan unter Rühren bei Raumtemperatur gegeben. Anschließend wurden weitere 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde nacheinander mit 10%iger Salzsäure, gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Dichlormethan wurde durch Destillation entfernt und der ölige Rückstand wurde in 200 ml Ethylacetat gelöst. Zu der Lösung wurden langsam und unter Rühren 750 ml n-Hexan getropft, wobei sofort Kristalle ausfielen ((-)-Isomer der Verbindung (X''), worin X&sub1;= X&sub2;= F; R&sub1; = CH&sub3;; R&sub2;= p-Toluolsulfonyl; und n = 1). Die ausgefallenen Kristalle wurden abfiltriert und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 500 g Kieselgel und Eluierung mit Benzol/Ethylacetat (50/1 - 25/1 auf das Volumen bezogen) unterworfen, wobei ein öliges Produkt erhalten wurde. Man löste das ölige Produkt in 500 ml Ethanol und ließ die Lösung einen Tag bei Raumtemperatur stehen, wobei Kristalle ausfielen. Das Ethanol wurde abdestilliert und zu den so gewonnenen Kristallen wurden Diethylether und n-Hexan gegeben, anschließend wurde filtriert. Der Feststoff wurde unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 33,4 g 3S-(+)-7,8- Difluor-2,3-dihydro-3-methyl-4-[(S)-N-p-toluolsulfonylprolyl)- 4H-[1,4]benzoxazin ((+)-Isomer der Verbindung (X''), worin X1 = X&sub2;= F; R&sub1;= CH&sub3;; R&sub2;= p-Toluolsulfonyl; und n = 1) mit einem Schmelzpunkt von 107-108ºC erhalten wurden.
[α]D = +70,7º (c = 0,953, Chloroform)
IR λ KBr/max cm&supmin;¹): 1685, 1510, 1490
Elementaranalyse für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub2;F&sub2;N&sub2;O&sub4;S:
Berechnet (%): C 57,79, H 5,08, N 6,42
Gefunden (%): C 58,05, H 5,14, N 6,47

BEISPIEL 13

Herstellung von S-(-)-7,8-Difluor-2,3- Dihydro-3-Methyl-4H-[1,4]Benzoxazin (X)

Man löste die 32,8 g des gemäß Beispiel 12 erhaltenen (+)- Isomers in 1 l Ethanol, gab 300 ml IN Natriumhydroxid zu und erhitzte 3 Stunden unter Rückfluß. Das Ethanol wurde durch Destillation entfernt und der ölige Rückstand wurde mit Benzol extrahiert. Der Extrakt wurde mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Entfernung des Benzols destilliert. Der Rückstand wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 200 g Kieselgel als Träger und Benzol als Eluens unterworfen, wobei 12,7 g (Ausbeute: 91,4%) S-(-)-7,8-difluor-2,3-dihydro-3- methyl-4H-[1,4]benzoxazin als öliges Produkt erhalten wurden.
[α] D = -9,6º (c = 2,17, Chloroform)
Die absolute Konfiguration dieser Verbindung wurde durch Röntgenstrukturanalyse des Hydrochlorids als S-Konfiguration festgestellt.

BEISPIEL 14

Herstellung von Ethyl (S)-(-)-9,10-Difluor- 3-Methyl-7-Oxo-2,3-Dihydro-7H-Pyrido[1,2,3-de]- [1,4]Benzoxazin-6-Carboxylat (XII)

Zu 15,8 g des gemäß Beispiel 13 erhaltenen (S)-(-)- Benzoxazinderivats wurden 24,0 g Diethylethoxymethylenmalonat gegeben und die Mischung wurde 1 Stunde unter vermindertem Druck auf 130 bis 140ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionsmischung in 50 ml Acetanhydrid gelöst und 80 ml einer Mischung aus Acetanhydrid und konzentrierter Schwefelsäure (2:1 auf das Volumen bezogen) wurden langsam zu der Lösung unter Rühren und unter Eiskühlung getropft. Nachdem eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde die Reaktionsmischung in einem heißen Bad 30 Minuten bei 50 bis 60ºC gerührt. Zu der Reaktionsmischung gab man Eiswasser und pulverförmiges Kaliumcarbonat zur Neutralisation. Die Reaktionsmischung wurde mit Chloroform extrahiert und der Extrakt wurde nacheinander mit einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung und einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Chloroform wurde durch Destillation entfernt und zu dem Rückstand wurde Diethylether gegeben. Die so gebildeten Kristalle wurden abfiltriert, wobei 20,0 g der Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 257-258ºC erhalten wurden.
[α]D = -68,1º (c = 0,250, Essigsäure)

BEISPIEL 15

Herstellung der S-(-)-9,10-Difluor Methyl-7-Oxo-2, 3-Dihydro-7H-Pyrido- [1,2,3-de][1,4]Benzoxazin-6-Carbonsäure

Man löste 19,5 g der gemäß Beispiel 14 erhaltenen Esterverbindung in 150 ml Essigsäure, gab 400 ml konzentrierte Salzsäure zu und erhitzte anschließend 3 Stunden unter Rückfluß. Nach dem Abkühlen wurden die ausgeschiedenen Kristalle abfiltriert, nacheinander mit Wasser, Ethanol und Diethylether gewaschen und getrocknet, wobei 16,2 g der entsprechenden Carbonsäure mit einem Schmelzpunkt von 300ºC oder darüber erhalten wurden.
[α]D= -65,6º (c = 0,985, DMSO)

BEISPIEL 16

Herstellung der S-(-)-9-Fluor-3-Methyl- 10-(4-Methyl-1-Piperazinyl)-7-oxo-2,3-Dihydro- 7H-Pyrido[1,2,3-de][1,4]Benzoxazin-6- Carbonsäure (S-(-)-Ofloxacin-Isomer

Man suspendierte 14,3 g der gemäß Beispiel 15 erhaltenen Carbonsäure in 600 ml Diethylether, gab 70 ml Bortrifluoriddiethyletherat zu und rührte anschließend 5 Stunden bei Raumtemperatur. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert, zu dem Rückstand wurde Diethylether gegeben und anschließend wurde filtriert. Der Feststoff wurde mit Diethylether gewaschen und getrocknet. Man löste das Produkt in 100 ml Dimethylsulfoxid und gab 14,2 ml Triethylamin und 7,3 ml N-Methylpiperazin zu der Lösung. Nach 18stündigem Rühren der Mischung bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Zu dem Rückstand wurde Diethylether gegeben, anschließend wurde filtriert. Man suspendierte das isolierte gelbe Pulver in 400 ml 95%igem Methanol und gab 25 ml Triethylamin zu. Die Mischung wurde 25 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde in 500 ml 10%iger Salzsäure gelöst und dreimal mit Chloroform gewaschen. Die gewaschene Lösung wurde mit einer wäßrigen 4N Natriumhydroxidlösung auf einen pH von 11 und anschließend mit IN Salzsäure auf einen pH von 7,3 eingestellt. Die Lösung wurde dreimal mit je 2 l Chloroform extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet. Das Chloroform wurde abdestilliert und die erhaltenen Kristalle wurden aus Ethanol/Diethylether umkristallisiert, wobei 12,0 g der Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 226-230ºC (unter Zersetzung) erhalten wurden.
[α]D = 76,9º (c = 0,655, 0,05N NaOH)

BEISPIEL 17

Herstellung der (S)-(-)-9-Fluor-3-Methyl- 10-(4-Ethyl-1-Piperazinyl)-7-Oxo-2,3- pihydro-7H-Pyrido[1,2,3-de][1,4]Benzoxazin- 6-Carbonsäure (VI)

In gleicher Weise wie im Beispiel 16 beschrieben, wurde unter Verwendung von N-Ethylpiperazin anstelle von N- Methylpiperazin die Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 229-230ºC (unter Zersetzung) hergestellt.
Elementaranalyse für C&sub1;&sub9;H&sub2;&sub2;FN&sub3;O&sub4;:
Berechnet (%): C 60,79 H 5,91 N 11,19
Gefunden (%): C 60,97 H 5,91 N 11,30
[α]D = -67,0º (c = 0,585, H&sub2;O)
NMR (CDCl&sub3;) δ (ppm):
1,16 (3H, t, J=7Hz, -CH&sub2;CH&sub3;), 1,63 (3H, d, J=7Hz, CH&sub3;), 2,53 (2H, q, J=7Hz, CH&sub2;CH&sub3;), 2,57-2,69 (4H, m, 2·CH&sub2;), 3,40-3,53 (4H, m, 2·CH&sub2;), 4,32-4,58 (3H, m, CH und CH&sub2;), 7,77 (1H, d, J=12Hz, C&sub8;-H), 8,67 (1H, S, C&sub5;-H)
Nachdem die Erfindung detailliert und unter Bezug auf spezifische Ausführungsformen beschrieben wurde, ist dem Fachmann klar, daß zahlreiche Veränderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Wesen und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. S(-)-Pyridobenzoxazin-Verbindungen der Formel (VI)

worin X&sub1; für ein Fluoratom steht, R&sub1; eine Methylgruppe und R&sub3; eine Methyl- oder eine Ethylgruppe darstellt.

2. S(-)-9-Fluor-3-methyl-10-(4-methyl-1-piperazinyl)-7-oxo- 2,3-dihydro-7H-pyrido[1,2,3-de][1,4]benzoxazin-6-carbonsäure gemäß Anspruch 1.

3. S(-)-9-Fluor-3-methyl-10-(4-ethyl-1-piperazinyl)-7-oxo- 2,3-dihydro-7H-pyrido[1,2,3-de][1,4]benzoxazin-6-carbonsäure gemäß Anspruch 1.

4. Verfahren zur Herstellung der S-(-)-Pyridobenzoxazine der Formel VI nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß man

A) eine Verbindung der allgemeinen Formel I'

worin X&sub1; wie in Anspruch 1 definiert ist, X&sub2; für ein Halogenatom steht und A für eine Methylengruppe steht,

mit 3,5-Dinitrobenzoylchlorid behandelt, wobei man das (±)-3,5-Dinitrobenzoat der allgemeinen Formel II'

erhält,

die so erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel II' optisch auflöst, wobei man die S-(-)-Verbindung erhält, und den Benzoatrest selektiv hydrolysiert, wobei man die Hydroxymethylenverbindung der allgemeinen Formel III'

erhält,

die so erhaltene Verbindung mit einem Jodierungsreagens in die 3-Jodmethylenverbindung der allgemeinen Formel IV'

umwandelt,

die so erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel IV' reduziert, wobei man die 3-Methylverbindung erhält, und diese unter sauren Bedingungen hydrolysiert, wobei man die 3-Methyl-6-carbonsäureverbindung der allgemeinen Formel V

worin R&sub1; wie in Anspruch 1 definiert ist, erhält, und

die so erhaltene Verbindung mit einem N-Alkylpiperazin der folgenden Formel

worin R&sub3; wie in Anspruch 1 definiert ist, umsetzt, wobei man eine Verbindung der allgemeinen Formel VI

erhält, oder

ein 7,8-Dihalogen-2,3-dihydro-3-acetoxymethylen-4H- [1,4]benzoxazin der allgemeinen Formel VII' mit einem asymetrischen hydrolytischen Enzym umsetzt, wobei man ein Gemisch erhält, das die mit einem der optischen Isomeren angereicherte Ausgangsverbindung VII' und eine 3- Hydroxymethylenverbindung VIII'

worin A wie oben definiert ist, enthält,

das Gemisch in beide Verbindungen auftrennt, entweder eine oder beide dieser Verbindungen dinitrobenzoyliert und die benzoylierte 3-Hydroxymethylenverbindung VIII' weiter acetyliert, wobei man die Verbindung der allgemeinen Formel IX'

erhält,

die Verbindung durch Kristallisation in die optischen Isomere auftrennt, das so erhaltene 3-(-)-Isomer nach bekannten chemischen Verfahren deacyliert und dehydroxyliert, wobei man ein optisch aktives 7,8-Dihalogen-2,3-dihydro-3-alkyl-4H- [1,4]benzoxazin (X)

worin X&sub1;, X&sub2; und R&sub1; wie oben definiert sind, erhält, und daraus, wie in Verfahren C beschrieben, eine optisch aktive Verbindung der Formel VI erhält, oder

C) ein 7,8-Dihalogen -1,4-benzoxazinderivat der allgemeinen Formel (X')

worin X&sub1;, X&sub2; und R&sub1; wie oben definiert sind, kondensiert

mit einer cyclischen Aminosäure oder einem reaktiven Derivat davon der allgemeinen Formel XIV

worin R&sub2; eine substituierte Sulfonylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe oder eine Aralkoxycarbonylgruppe darstellt,

n für eine ganze Zahl von 1 bis 3 steht, und X&sub3; für eine Carboxylgruppe oder ein reaktives Derivat davon steht,

wobei man eine Verbindung der allgemeinen Formel X''

erhält,

das Diastereomerengemisch der erhaltenen Verbindung der allgemeinen Formel X'' trennt und das so erhaltene, getrennte Diastereomer hydrolysiert, wobei man ein 7,8- Dihalogen-3-(S)-methyl-[1,4]benzoxazin der allgemeinen Formel (X)

erhält,

die so erhaltene Verbindung anhand von bekannten Reaktionen zu einer 9,10-Dihalogen-3-(S oder R)-methyl-7- oxo-2,3-dihydro-7H-pyrido[1,2,3-de][1,4]-benzoxazin-6- carbonsäure der allgemeinen Formel (V)

umsetzt, und

die so erhaltene Verbindung wie in Verfahren A) beschrieben in eine Verbindung der allgemeinen Formel VI umwandelt.

5. Verfahren zur Herstellung einer S(-)-Pyridobenzoxazinverbindung der Formel (VI)

worin X&sub1; ein Fluoratom darstellt, R&sub1; für eine Methylgruppe und R&sub3; für eine Methyl- oder Ethylgruppe steht, wobei man eine S(-)-9- Fluor-10-Halogenpyridobenzoxazinverbindung der Formel (V)

worin X&sub1; und R&sub1; wie oben definiert sind und X&sub2; für ein Halogenatom steht, oder das Reaktionsprodukt davon mit Borontrifluorid mit einem N-Alkyl-piperazin der folgenden Formel

worin R&sub3; wie oben definiert ist, umsetzt.

6. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend mindestens eine Verbindung der Ansprüche 1 bis 3, gegebenenfalls zusammen mit einem üblichen Träger und/oder Diluens.

7. Verwendung mindestens einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines antimikrobiell wirksamen pharmazeutischen Mittels.