DE3248420A1 - Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von gaerbruehen, die entweder nahezu ausschliesslich nebramycin-5' oder ein gemisch von nebramycin-2 und nebramicyn-5' in einem beliebigen im voraus festgesetzten verhaeltnis und nebramycin-4 enthalten und in diesem verwendbarer mikroorganismusstamm - Google Patents
Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von gaerbruehen, die entweder nahezu ausschliesslich nebramycin-5' oder ein gemisch von nebramycin-2 und nebramicyn-5' in einem beliebigen im voraus festgesetzten verhaeltnis und nebramycin-4 enthalten und in diesem verwendbarer mikroorganismusstammInfo
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-
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Description
DR. STEPHAN G. BESZiDES PATENTANWALT
VNR: 101265
ZUGELASSENER VERTRETER AUCH BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT
PROFESSIONAL REPRESENTATIVE ALSO BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE
'"..*" "*"806Ö DACHÄÜ BEI MÖNCHEN
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P 1 679
zur Patentanmeldung
BIOGAL GYOGYSZERGXAR
H 4-042 Debrecen
Ungarn
betreffend
Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Gärbrühen, die entweder nahezu ausschließlich Nebramycin-^' oder ein Gemisch
von Nebramycin-2 und Nebramycin-5' in einem
beliebigen im voraus festgesetzten Verhältnis und Nebramycin—^- enthalten und in diesem verwendbarer Mikroorganismusstamm
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur mikrobiologischen
Herstellung von Gärbrühen (Kulturbrühen), die entweder nahezu ausschließlich Nebramycin-51 oder ein
Gemisch von Nebramycin-2 und Nebramycin-^' iß. einem beliebigen
im voraus festgesetzten Verhältnis und Nebramycin-4
enthalten und einen in diesem verwendbaren Mikroorganismusstamm.
Es ist bekannt, daß Streptomyces tenebrarius ein aus
mehreren Bestandteilen bestehendes als Nebramycin bezeichnetes Antibioticumgemisch erzeugt (Stark, Hoehn und
Knox, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1967>
Seite 314; britische Patentschrift 1 178 489 und US-Patentschrift
$ 691 279). Das Antibioticumgemisch enthält neben Nebenbestandteilen (Minorkomponenten) die Bestandteile
Nebramycin-2 (Apramycin), Nebramycin-4 (6*'-O-Carbamoyl-kanamycin
B) und Nebramycin-5' (6**-O-Carbamoyl-tobramycin)
{Koch, Davis und Ehoades, J. of Antibiotics 26 [1973], 74-5}. In der US-rPatent schrift 3 853 709 ist ein
ausschließlich Nebramycin-2 und Nebramycin-7 erzeugender Mikroorganismus beschrieben. In der US-Patentschrift
4 032 404 ist von japanischen Verfassern die Herstellung von Nebramycin-2 und Nebramycin-5' durch Züchtung des
Stammes Streptoalloteichus hindustanus beschrieben. Gemäß dem Verfahren der ungarischen Patentschrift 176 103
können durch die belüftete submerse Gärung der Stämme Streptomyces tenebrarius, hinterlegt am 28. Dezember 1977
unter der Bezeichnung Streptomyces tenebrarius MNG 169 beziehungsweise am 5· April lyjQwiteT der Bezeichnung
Streptomyces tenebrarius MNG 170 jeweils in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für
Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet),
die seit dem 28. Februar 1980 jedermann zugänglich sind,
Gärbrühen, die entweder Nebramycin-^, Nebramycin-51 und
Nebramycin-^· oder Nebramycin-2 und Nebramycin-^' enthalten,
gewonnen werden. Die Antibiotica können daraus nach der ungarischen Patentschrift 174· 315 isoliert werden.
Das Nebramycin-2 (Apramycin) wird erfolgreich zur Behandlung
von Krankheiten an Tieren und Pflanzen eingesetzt (US-Patentschriften 3 691 279, 3 853 709 und
3 876 767), das durch Hydrolyse des Nebramycines-4 (ßt·_o_carbamoyl-kanamycines B) hergestellte Kanamycin B
und das durch Hydrolyse des Nebramycines-51 (6fl-0-Carbamoyl-tobramycines)
hergestellte Tobramycin (Brulamycin) sind in der Humanmedizin angewandte Antibiotica mit breitem Wirkungsspektrum, die in erster Linie zur Bekämpfung
von durch polyresistente Pseudomonas-Stämme verursachten Infektionen Bedeutung haben (Preston und Wick, Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, 1970, Seite 322).
Nach dem Verfahren der ungarischen Patentschrift
176 173 wird ein Antibioticumgemisch der in der folgenden Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung gewonnen:
| Stamm | Nebramycin-2 | Menge von Nebramycin-4· Nebramycin-5' in Gew.-% |
21 |
| Streptomyces tene- brarius MNG 169 |
77 | 2 | 9 |
| Streptomyces tene- brarius MNG 170 |
91 | Spuren |
Offensichtlich, wird von den Stämmen überwiegend Nebramycin-2
biosynthetisiert. Um Nebramycin-^' von'den im Übergewicht
vorliegenden anderen Bestandteilen zu trennen, werden komplizierte und mit hohem Aufwand verbundene Verfahren
benötigt» .
Die Zusammensetzung eines biosynthetisierten Antibioticumgemisches
wird an erster Stelle durch den genetischen Informationsbestand
der Mikroorganismuszelle und nur in geringem Maße durch Gärungsbedingungen bestimmt.
Gärbrühen mit im voraus festgesetzten jeweils durch technische und-wirtschaftliche Bedürfnisse bedingten Verhältnissen
der Bestandteile können mit den bekannten Verfahren nicht hergestellt werden. Ferner muß bei der Erzeugung
von Nebramycin-^' dieses Antibioticum vom.im Übergewicht
vorliegenden Nebramycin-2 durch mit hohem Aufwand verbundene Arbeitsgänge getrennt werden. Stammveredelungsversuche
zur Erhöhung der Produktionsfähigkeit sind in diesen Multikomponentensystemen
äußerst arbeitsaufwendig und zeitraubend. Die Menge der einzelnen Bestandteile muß nach dünnschichtchromatographischer
Trennung individuell biologisch bestimmt werden. Es wäre überaus günstig, die Stammveredelungsversuche
in einem eine einfache Bestimmung ermöglichenden Einkomponentensystem durchzuführen. Andererseits
scheint es wahrscheinlicher, die Produktionsfähigkeit eines
solchen Stammes erhöhen zu können, der ein einziges Antibioticum erzeugt, da in diesem Fall die ganze biosynthetische
Kapazität für die Bildung einer einzigen Verbindung eingesetzt wird.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches
und mit wenig Aufwand verbundenes Gärverfahren, durch welches Gärbrühen, die entweder nahezu ausschließlich Nebramycin-51
oder ein Gemisch von Nebramycin-2 und
M * «J-
Nebramycin-51 in einem beliebigen im voraus festgesetzten
Verhältnis und Nebramycin-4 enthalten, gewonnen werden
können, sowie einen in diesem verwendbaren Mikroorganismus zu schaffen.
Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung
erreicht.
Es wurde nämlich überraschenderweise festgestellt, daß vom im folgenden angegebenen neuen Stamm von Streptomyces
tenebrarius Gärbrühen, die überhaupt kein Nebramycin-2, sondern nahezu ausschließlich Nebramycin-5' bei
nur Spuren von Nebramycin-4 enthalten, erzeugt werden können.
Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, daß Gärbrühen, die Nebramycin-2 und Nebramycin-51 in einem
beliebigen im voraus festgesetzten Verhältnis und Nebramycin-4 enthalten, durch Verwendung eines Gemisches aus
einem den Nebramycin-Komplex erzeugenden Stamm von Streptomyces tenebrarius und einen nahezu ausschließlich
Nebramycin-51 erzeugenden Stamm von Streptomyces tenebrarius in einem entsprechenden gewünschten Verhältnis erhalten
werden können. Überraschenderweise wird bei dieser gemischten Gärung von beiden Stämmen eine höhere
Konzentration des Antibioticums als bei Gärungen, weiche
mit einem einzigen Stamm durchgeführt werden, biosynthetisiert.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Gärbrühen, die entweder
nahezu ausschließlich Nebramycin-51 oder ein Gemisch
von Nebramycin-2 und Nebramycin-51 in einem beliebigen
im voraus festgesetzten Verhältnis und Nebramycin-4 enthalten,
.,welches dadurch gekennzeichnet ist, daß
a) zur Erzeugung von Gärbrühen, die nahezu aus- "
schließlich Nebramycin-5' enthalten,, der Mikroorganismus
stamm Streptomyces tenebrarius MNG 204, hinterlegt am 2„ September 1981 unter der Bezeichnung Streptomyces tenebrariua MNG 204- in
der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos
Közegeszsegügyi Intezet), eingesetzt wird
beziehungsweise
b) zur Erzeugung von Gärbrühen, die ein Gemisch von
Nebramycin-2 und Nebramycin-5' in einem beliebigen
im voraus festgesetzten Verhältnis und Nebramycin-4·
enthalten, Sporen oder vegetatives Myzel eines beliebigen den Nebramycin-Komplex erzeugenden
Stammes von Streptomyces tenebrarius und Sporen oder vegetatives Myzel eines nahezu ausschließlich
Nebramycin-5' erzeugenden Stammes von Streptomyces tenebrarius in einem entsprechenden
gewünschten Verhältnis vermischt werden
und in einem 1 oder mehr, vorzugsweise organische, Kohlenstoff
quelle (n) und Stickstoffquelle(n) und anorgaaische[s]
Salz(e) und Spurenelemente und gegebenenfalls 1 oder mehr tierische[s] und/oder pflanzliches] öl(e) und/oder Fett(e)
enthaltenden Mährmedium in submerser belüfteter Gärkultur
bei Temperaturen von 33 bis 40°C gezüchtet wird.
Zur erfindungsgemäßen Herstellung von Gärbrühen, die neben Spuren von Nebramycin-^ nur Nebramycin-5' enthalten
[Variante a) des erfindungsgemäßen Verfahrens] wird zweckmäßig wie folgt vorgegangen· Streptomyces tenebrarius
MNG 204 oder dessen Mutant, Variant oder Rekombinant wird gezüchtet» Während der Gärung werden im Nährmedium neben
- 10 -
2 100 bis 2 600yug/ml (je nach den Gärparametern) Nebramycin-5' auch noch 10 bis 180yug/ml (je nach den Gärparametern) Nebramycin-4 angereichert. Aus der Kultur wird
Nebramycin-5 * von Nebramycin-Λ und von anderen Verunreinigungen in einem einzigen chromatographischen Arbeitsgang getrennt. Das erfindungsgemäß erhaltene Nebramycin-51
kann in an sich bekannter Weise zu Tobramycin umgesetzt werden, das in an sich bekannter Weise isoliert werden
kann.
Vorzugsweise wird als den Nebramycin-Komplex erzeugender Stamm von Streptomyces tenebrariua der am 28. Dezember 1977 unter der Bezeichnung Streptomyces tenebrarius
MNG 169 oder am 5· April 1978 unter der Bezeichnung
Streptomyces tenebrarius MNG 170 jeweils in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für
Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet) hin
terlegte oder der am 16. Juni 1965 unter der Bezeichnung
ATCC 17 920 in der Stammsammlung The American Type Culture
Collection (ATCC) hinterlegte eingesetzt, wobei die Verwendung des ersteren besonders bevorzugt ist. Es kann
aber auch jeder beliebige andere den Nebramycin-Komplex erzeugende Stamm Streptomyces tenebrarius eingesetzt werden.
Es ist auch bevorzugt, als nahezu ausschließlich Nebramycin-51
erzeugenden Stamm den am 2. September 1981 unter der Bezeichnung Streptomyces tenebrarius MNG 204 in
der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet)
hinterlegten einzusetzen.
Zur Erzeugung von Gärbrühen, die ein Gemisch von Nebramycin-2
und Nebramycin-51 in einem beliebigen im voraus
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festgesetzten Verhältnis und Nebramycin-^· enthalten
[Variante b) des erfindungsgemäßen Verfahrens] werden besonders bevorzugt Sporen oder vegetatives Myzel von Streptomyces tenebrarius MNG 169 und solche[s] von
Streptomyces tenebrarius MNG 204 im entsprechenden gewünschten Verhältnis vermischt und in einer Mischkultur gezüchtet.
[Variante b) des erfindungsgemäßen Verfahrens] werden besonders bevorzugt Sporen oder vegetatives Myzel von Streptomyces tenebrarius MNG 169 und solche[s] von
Streptomyces tenebrarius MNG 204 im entsprechenden gewünschten Verhältnis vermischt und in einer Mischkultur gezüchtet.
Die gebildeten Antibiotica können mittels an sich bekannter Verfahrensweisen, vorzugsweise nach der ungarischen
Patentschrift 174- 315* isoliert werden. Das
Verhältnis von Nebramycin-2 und Nebramycin-51 ist dem
Verhältnis der Zellenzahl des den Nebramycin-Komplex
erzeugenden Stammes von Streptomyces tenebrarius, wie Streptomyces tenebrarius MNG 169* zur Zellenzahl des nahezu ausschließlich Nebramycin-5' erzeugenden Stammes von Streptomyces tenebrarius, wie Streptomyces tenebrarius MNG 204, nahezu proportional.
erzeugenden Stammes von Streptomyces tenebrarius, wie Streptomyces tenebrarius MNG 169* zur Zellenzahl des nahezu ausschließlich Nebramycin-5' erzeugenden Stammes von Streptomyces tenebrarius, wie Streptomyces tenebrarius MNG 204, nahezu proportional.
Es ist klar, daß das vorstehend Gesagte nur in einem
solchen Gärungssystem, in welchem die gemischten Zellen mit gleicher Geschwindigkeit proliferieren beziehungsweise
sich fortpflanzen sowie ferner die Gärparameter
für die Biosynthese beider Bestandteile gleich günstig sind, gilt, während sonst das Verhältnis der Bestandteile
leicht verschoben werden kann. Das Festsetzen des jeweils günstigen Mischungsverhältnisses bedeutet für
den Fachmann kein Problem.
Vorzugsweise wird als Nährmedium für die Gärkultur ein solches, welches als Kohlenstoffquelle Glucose,
Fructose, Stärke, Dextrin und/oder Glycerin und als
Stickstoffquelle Erdnußmehl, Maisbrei, 1 oder mehr
Pepton(e), Hefeextrakt, Sojamehl, Casein und/oder
Fructose, Stärke, Dextrin und/oder Glycerin und als
Stickstoffquelle Erdnußmehl, Maisbrei, 1 oder mehr
Pepton(e), Hefeextrakt, Sojamehl, Casein und/oder
- 12 -
1 oder mehr Aminosäure(η) und oder anorganische[s] Ammoniumsslz(e)
enthält, eingesetzt. Von den Kohlenstoffquellen wird besonders bevorzugt Glucose verwendet. Von
den Stickstoffquellen wird beziehungsweise werden besonders bevorzugt Sojamehl und/oder Casein verwendet. Als
Aminosäure wird besonders bevorzugt Glutaminsäure eingesetzt. Als anorganische Stickstoffquelle(n) wird beziehungsweise
werden besonders bevorzugt Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und/oder Ammoniumsulfat verwendet. Als
von Ammoniumsalzen verschiedene anorganische Salze wird beziehungsweise werden vorzugsweise Magnesiumsulfat, Zinksulfat,
Kobaltnitrat und/oder Calciumcarbonat verwendet. Als tierische[s] und/oder pflanzliche[s] öl(e) und/oder
Fett(e) kann beziehungsweise können Palmöl, Leinöl, Sonnenblumenöl, Rapsöl, Schweinefett und/oder andere Fette,
vorzugsweise Palmöl und Leinöl im Gewichtsverhältnis von 1:1, eingesetzt werden. Als Spurenelemente können solche,
welche für die Züchtung essentiell sind, dienen. Sie sind in den Bestandteilen des Nährmediums meistens als
Verunreinigungen enthalten, können aber auch eigens zugesetzt werden.
Der oben angegebene Temperaturbereich ist derjenige, in welchem die Züchtung des Mikroorganismus beziehungsweise
der Mikroorganismen gefördert wird. Vorzugsweise wird als Temperatur 57 C angewandt.
Das Züchten wird so lange durchgeführt, bis sich in der Gärbrühe signifikante Mengen des Antibioticums anreichern.
Die Antibiotica können nach an sich bekannten Verfahrensweisen isoliert werden.
Die Menge der zur Züchtung zugeführten Luft wird der
Zusammensetzung des Nährmediums und den technischen Daten
des Gärgefäßes entsprechend gewählt. Im allgemeinen ist
- 13 -
es günstig, die SauerstoffVersorgung der Zellen so zu
gestalten, daß im austretenden Gasgemisch die Kohlendioxydkonzentration
1,0 Vol.-% nicht übersteigt sowie ferner
der reduzierende Zuckergehalt des Nährmediums zwischen
der 96-sten und 110-ten Stunde der Gärung verbraucht
wird.
Zweckmäßig wird das Sterilisieren der Nährböden 30 bis 60 Minuten lang bei 121 bis 12J0C mit Dampf vorgenommen.
Vor dem Sterilisieren wird ihr pH-Wert zweckmäßig auf 7)2 bis 7»4 eingestellt.
Bei der Gärung sind vielfach keine Zusätze zur Unterdrückung der Schaumbildung erforderlich, beispielsweise
wenn das Nährmedium als Nährstoffquelle [ein] pflanzli- ·
che[s] und/oder tierische[s] öl(e) und/oder Fett(e) enthält, da diese[s] gleichzeitig auch die Schaumbildung
hemmt beziehungsweise hemmen.
Die Züchtung kann sowohl in Schüttelkolben, wie in Laboratoriums-,
Kleinbetriebs- und Großbetriebsgärgefäßen t
durchgeführt werden.
Die Zusammensetzung der Gärkulturen die Antibiotieumbestandteile betreffend kann durch Dünnschichtchromatographie
und anschließende Bioautographie bestimmt werden. Dazu werden auf Silicagel-Dünnschichtplatten (Merck, Darmstadt)
0,1 bis 0,5 Ug/ml des Antibioticumkomplexes aufgetragen
und die Platten werden in einem Gemisch aus Äthanol, Methyläthy!keton und 25 gew.-%-igem Ammoniumhydroxyd
im Gewichtsverhältnis von 1:1:1 entwickelt. Nach vollständigem Trocknen wird ein mit Bacillus subtilis
ATCC 6633 beimpfter Nährboden auf die Platten geschichtet
und 16 Stunden lang bei 37°C bebrütet. Die Größe der ent-
J I 4 ö 4 L U
_ 14 -
standenen Hemmungszonen wird mit denen des Standards verglichen. Diese Bestimmung ist sowohl für die qualitative
als auch für die quantitative Wertung geeignet, wobei ihre Genauigkeit ± 10% beträgt.
Der Hauptvorteil des erfindungsgemäßeη Verfahrens besteht
darin, daß mit dem praktisch ein einziges Antibioticum erzeugenden Stamm Streptomyces tenebrarius MNG 204
eine höhere Erzeugung von Nebramycin-51 erzielt werden
kann als durch die bekannten Verfahren. Die biologische Aktivitätsbestimmung der Gärbrühen, die einen einzigen
Antibioticumbestandteil enthalten, verläuft schnell, einfach und exakt und das Isolieren des Wirkstoffes erfordert
keine mit hohem Aufwand verbundenen Reinigungsarbeitsgänge.
Ferner können durch das Vermischen der Zellen der 2 verschiedenen Stämme und ihre nachfolgende Züchtung in
Mischkultur Gärbrühen, die Nebramycin-2 und Nebramycin-51 in einem beliebigen den aktuellen technischen und wirtschaftlichen
Ansprüchen angepaßten im voraus festgesetztem Verhältnis enthalten, hergestellt werden. Es ist besonders
vorteilhaft, daß im Laufe dieser Mischgärung keiner der Stämme einen wesentlichen Teil seiner Produktionsfähigkeit
verliert und so insgesamt größere Antibioticummengen biosynthetisiert werden.
Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, daß der
im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Stamm Ötreptomyces
tenebrarius MNG 204 durch Vorbehandeln des Stammes
Streptomyces tenebrarius MNG 169 mit 2,7-Diamino-9-phenyl-
-10-äthyl-phenanthridinium-bromid [Äthidiumbromid] hergestellt
werden kann. Liese Feststellung ist unerwartet und um so überraschender als 2,7-Diamino-9-phenyl-1O-äthyl-
-phenanthridinium-bromid [Äthidiumbromid] bisher noch nie als mutagene Verbindung eingesetzt wurde.
- 15 -
Die Gewinnung dieses Stammes kann wie folgt durchgeführt
werden. Sporen von Streptomyces tenebrarius MNG 169 werden in einem flüssigen Nährmedium gezüchtet.
Die ausgewachsene Kultur wird in 5 Teile geteilt und es werden O, 0,05» 0,5» 5 beziehungsweise 50 ug/ml 2,7-Diamino-9~phenyl-10-äthyl-phenanthridinium-bromid
[Äthidiumbromid] zugesetzt. Die Züchtung wird 24 Stunden lang fortgesetzt und dann wird ein Teil der jeweiligen verdünnten
Kultur auf Agarplatten geschichtet und der andere Teil mit der gleichen Menge 2,7-Diamino-9-phenyl-10-
-äthyl-phenanthridinium-bromid [Äthidiumbromid] versetzt
und weitere 24 Stunden gezüchtet. Diese Verfahrensweise wird wiederholt, die erhaltenen neuen flüssigen Kulturen
werden nach 24 Stunden auf Agarplatten geschichtet und ·
auf diesen bebrütet, einige alleinstehende Kolonien werden isoliert und ihre Produktivität wird durch eine in
den Beispielen zusammengefaßte Verfahrensweise geprüft.
Zwischen den mehreren hundert Stämmen, welche so aus Streptomyces tenebrarius MNG 169 isoliert werden können,
gibt es 2 Mutanten, die kein Nebramycin-2, aber wenig Nebramycin^'
und Spuren von Nebramycin-4 erzeugen. Diese biochemischen Mutanten speziell können beliebig wieder—
holbar in der Weise erhalten werden, daß der Stamm Streptomyces tenebrarius MNG 169 in einem flüssigen Nährmedium
mit einem pH-Wert von 7 der folgenden Zusammensetzung gezüchtet
wird.
- 16 -
Glucose 1,0 Gew.-%
Gaseinhydrolysat
(10 gew.-%-ig) 4>° Gew-%
Hefeextrakt 0,4 Gew.-%
Kaliumdihydrogenphosphat 0,2 Gew._% Dikaliumhydrogenphosphat 0,4 Gew.-%
Magnesiumsulfathepta-
, , . 0,05 Gew.-%
hydrat '
Danach wird auf ein 5»0 lug/ml 2,7-Diamino-9-phenyl-10-
-äthyl-phenanthridinium-bromid [Äthidiumbromid] enthaltendes
Nährmedium umgeimpft. Der vorstehend beschriebene Arbeitsgang wird an der ausgewachsenen Kultur wiederholt.
Die 2 Mutanten werden nach ihrem Ausbreiten auf einem festen Schrägagar der Zusammensetzung
Dextrin 1,0 Gew.-%
Hefeextrakt 0,1 Gew.-%
Caseinhydrolysat
(10 gew.-%-ig) J
(10 gew.-%-ig) J
Fleischextrakt 0,1 Gew.-%
Kobaltdichloridhexa-
hydrat . 0^001 Gew-%
Agar 2,5 Gew.-%
*) enzymatisch hydrolysiert
isoliert. Um die Produktivität dieser Nebramycin-51 erzeugenden
Stämme zu steigern, sind Stamm-Selektionsarbeiten und Nährmedium-Optimierungsversuche durchzuführen.
- 17 -
Während dieser Arbeiten kann die Produktionsfähigkeit von einer der genannten 2 Mutanten auf das 5-fache erhöht werden. Dieser Stamm ist Streptomyces tenebrarius MNG 204.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch der Mikroorganismusstamm Streptomyces tenebrarius MNG 204, verwendbar
im erfindungsgemäßen Verfahren, hinterlegt am 2. September 1981 unter der Bezeichnung Streptomyces tenebrarius
MNG 204 in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen
Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszägos Közegeszsegügyi
Intezet). Er unterscheidet sich zwar in morphologischer
Hinsicht vom Stamm Streptomyces tenebrarius MNG 169 nicht, sein genetischer Införmationsbestand ist jedoch
von den Informationsbestanden des letzteren und der anderen bekannten Stämme Streptomyces tenebrarius grundlegend
verschieden, was sich beispielsweise darin äußert, daS der Stamm Streptomyces tenebrarius MNG 204 nahezu ausschließlich
Nebramycin-51 erzeugt.
Dieser eignet sich auch für weitere Stammveredelungsversuche
mit schnellen Ergebnissen, da in diesem Fall die ganze biosynthetische Kapazität der Zelle für die Erzeugung
eines einzigen Antibioticums eingesetzt ist.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
- 18 -
O ί. H O H ί. U
a) Herstellung von Nebramycin-51 enthaltenden
Gärbrühen in Laboratoriumsgärgefäßen
Mit Sporen oder vegativem Myzel von Streptomyces tene
brarius MNG 204· wurden mit destilliertem Wasser bereitete
Schrägagare der folgenden Zusammensetzung beimpft:
Dextrin 1,0 Gew. -)Ό
Hefeextrakt 0,1 Gew.-%
Caseinhydrolysat
,.. ο/ · λ*) 2,0 Gew.-%
(10 gew._%-ig) J
Fleischextrakt . 0,1 Gew.-%
Kobaltdichloridhexahydrat
°
Agar 2,5 Gew.-%
*) enzymatisch hydrolysiert
Der pH-Wert des Nährbodens wurde vor dem Sterilisieren mit Natriumhydroxyd auf 7»2 eingestellt und dann wurde der
Nährboden 20 Minuten lang bei 1210C sterilisiert.
Die Kulturen wurden 4- Tage lang bei 37°C bebrütet.
Dann wurden die Sporen und Myzelien mit sterilem destilliertem Wasser von der Oberfläche des Nährbodens abgetrennt
und mit der erhaltenen Zellsuspension wurden dann 2 χ 100 ml in 500 ml Erlenmeyer-Kolben sterilisiertes mit
Leitungswasser bereitetes Impfmaterialnährmedium (Inokulum-Nährmedium)
der folgenden Zusammensetzung beimpft:
- 19 -
Sojamehl 2,0 Gew.-%
Caseinhydrolysat
(10 gew.-%-ig)*) 3,0 Gew.-%
Ammoniumnitrat 0,1 Gew.-%
Ammoniumchlorid 0,5 Gew.~%
Calciumcarbonat 0,3 Gew.-%
Magnesiumsulfathepta-
hydrat 0,5 Gew.-%
Gemisch, von Palmöl und
Leinöl im Gewichtsver- 3»0 Gew.-%
hältnis von 1:1
i
Glucose (als 50 gew.-%-ige
Glucose (als 50 gew.-%-ige
Lösung getrennt sterili- 2,0 Gew.-% siert)
*) enzymatisch hydrolysiert
Der pH-Wert des Nährmediums wurde mit einer Natriumhydroxydlösung
auf 7,2 eingestellt und dann wurde es 20 Minuten lang bei 121°G in einem Autoklaven sterilisiert.
Die Züchtung wurde auf einem Schütteltisch mit einer Frequenz von 280 Minuten und einer Amplitude von 2,4- cm
1A- bis 18 Stunden lang bei 37°C vorgenommen.
Mit 200 ml dieses reifen Impfmateriales (Inokulums)
wurden 5 1 eines mit Leitungswasser bereiteten und 4-5 Minuten
lang bei 121°C in einem Laboratoriumsgärgefäß (Arbeitsvolumen
10 1) sterilisierten Hauptgärmediums der folgenden Zusammensetzung beimpft:
- 20 -
| - 20 - | Sojamehl | 3,0 | Gew | .-% |
| Caseinhydrolysat (10 gew.-%-ig)*' |
5,0 | Gew | .-% | |
| Ammoniumnitrat | 0,1 | Gew | .-% | |
| Ammoniumchlorid | 0,5 | Gew | .-% | |
| L-Glutaminsäure | 0,8 | Gew | .-% | |
| Calciumcarbonat | 0,5 | Gew | .-% | |
| Magnesiumsulfathepta- hydrat |
0,5 | Ge„ | .-% | |
| Kobaltdinitrathexa- hydrat |
0,001 | Gew. | .-% | |
| Gemisch von Palmöl und Leinöl im Gewichtsver hältnis von 1 : 1 |
3,0 | Gew, | .-% | |
| Glucose (als 50 gew.-%-ige Lösung getrennt sterili siert) |
4,2 | Gew, | .-% | |
*) enzymatisch hydrolysiert
Der pH-Wert des Nährmediums wurde vor dem Sterilisieren mit einer wäßrigen Ammoniumhydroxydlösung auf 7»2 eingestellt.
Die Gärung selbst wurde bei 37 C, bei einer Rührerdrehzahl
von 360/Minute und bei steriler Luftzufuhr von 3 l/Minute durchgeführt.
Nach 144· Stunden enthielten 100 ml der Gärbrühe neben
9 mg Nebramycin-4- 260 mg Nebramycin-5'. Es war kein
Nebramycin-2 nachweisbar.
- 21 -
Als Hauptgärmedium konnten auch andere Nährmedien
verschiedener Zusammensetzung eingesetzt werden. So konnte wie oben beschrieben, jedoch mit dem Unterschied, daß
ein Hauptgarmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet
wurde, vorgegangen werden.
| Sojamehl | 3,3 | Gew.»% |
| Ammoniumchlorid | 0,6 | Gew.-% |
| Magnesiumsulfathepta- hydrat |
0,7 | Gew.~% |
| Calciumcarbonat | 0,5 | Gew.-% |
| Kobaltdinitrathexahydrat | 0,001 | Gew.-% |
| Palmöl | 2,5 | Gew.-$ |
| Glucose (als 50 gew.~%-ige Lösung getrennt sterili siert)0^ |
2,1 | Gew.-% |
0^ In Abhängigkeit von der Geometrie und den Teilen
des für die Züchtung verwendeten Gärgefäßes konnte die Glucosekonzentration im Nährmedium
bis auf 4,0 Gew.-% erhöht werden.
Nach 144 Stunden enthielten 100 ml der Gärbrühe neben
wenig (höchstens 3 mg) Nebramycin-4 180 mg Nebramycin-51.
Es war kein Nebramycin-2 nachweisbar.
b) Herstellung von Ne brainy ein-5* enthaltenden
Gärbrühen in 1 000 1 Betriebsgärgefäßen
Zur Herstellung von Gärbrühent die große Mengen von
Nebramycin^' enthielten, wurde nach der Verfahrensweise
des Abschnittes a) vorgegangen. Mit der Zellsuspension
- 22 -
_ 22 -
des Stammes Streptomyces tenebrarius MNG 204· wurden 100 ml
des Impfmaterialnährmediums (Inokulum-Nährmediums) beimpft und der Mikroorganismus wurde gezüchtet. Nach 14- bis 18
Stunden wurden mit dieser Kultur 100 1 des Impfmaterialnährmediums (Inokulum-Mediums) beimpft und es wurde bei
37°C, einer Luftzufuhr von 100 l/Minute und einer Rührerdrehzahl von 360/Minute gezüchtet. Nach 16 Stunden wurden
mit 50 1 dieses Impfmateriales (Inokulums) 1 000 1 des
Hauptgärmediums der im Abschnitt a) angegebenen Zusammensetzung in einem Gärgefäß aus rostfreiem Stahl beimpft.
Die Gärung wurde bei 37 C, bei einer Luftzufuhr von 500 l/Minute und einer Rührerdrehzahl von 200/Minute
durchgeführt. Die Antibioticumzusammensetzung während der Gärung ist in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt.
| Gärungs zeit in Stunden |
M 2 |
enge der einze] Nebramycine in ug/ml 4- |
Lnen 5' |
| 24- | O | O | 50 |
| 4-8 | O | 0 | 4OO |
| 72 | 0 | 5 | 1 200 |
| 96 | 0 | 30 | 1 74Ό |
| 120 | 0 | 4-0 | 2 320 |
| 14-4- | 0 | 60 | 2 650 |
- 23 -
ORIGINAL INSPECTED
; - 23 -
c) Decarbamoylieren von Nebramycin^1 und
Isolierer^ von Tobramycin
Es wurden zu 3 1 jier wie im obigen Abschnitt a) beschrieben erhaltenen Gärbrühe, die 2 600 ug/ml Nebramycin-51
und 90 ug/ml Nebramycin-^- enthielt, 22 g Natriumhydroxyd
zugegeben. Die Gärbrühe wurde unter Rühren auf 90 bis 1000C gebracht und 25 Minuten lang auf dieser Temperatur
gehalten. Nach dem Ende der Reaktion wurde das Gemisch, auf Raumtemperatur abgekühlt und sein pH-Wert mit
einer 50%-igen Schwefelsäure auf 2,0 eingestellt. Dieser
sauren Gärbrühe wurde
unter ständigem Rühren 2,0 g Oxal
säure' zugesetzt, ihr pH-Wert wurde mit einer konzentrierten
Ammoniumhydroxydlösung auf 7,0 eingestellt und es wurde
30 Minuten lang gerührt. Nachfolgend wurde filtriert und das Myzel mit 2 χ 600 ml Wasser gewaschen. Das Filtrst
und die Waschlösung wurden vereinigt und an einer aus 200 ml Amberlite CG-50 (NH4 +) (Rohm und Haas, Co., Philadelphia,
USA) bereiteten Kolonne chromatographiert. Die Kolonne wurde mit 400 ml ionenfreiem Wasser gewaschen und
nachfolgend der Reihe nach mit 1 000 ml einer 0,05 n Ammoniumhydroxydlösung
mit 2 000 ml einer 0,1 η Ammoniumhydroxydlösung und mit 3 000 .ml einer 0,15 η Ammoniumhydrdxydlösung
in Fraktionen von je 250 ml eluiert. Die Tobramycin enthaltenden Fraktionen (13 bis 18) wurden vereinigt,
ihr pH-Wert wurde mit einer 50%-ig^n Schwefelsäure
auf 7»0 eingestellt und es wurde an 120 ml Amberlite CG-50
(NH^+) chromatographiert. Der Ionenaustauscher wurde mit
200 ml ionenfreiem Wasser gewaschen und das Antibioticum
wurde nachfolgend der Reihe nach mit 1 000 ml einer 0,05 η AmmoniumhydroxydlösunE mit 2 000 ml einer 0,1 η Ammoniumhydroxydlösung, 2 000 ml einer 0,15 σι Ammoniumhydroxydlösung
und schließlich mit 2 000 ml einer 0,2 η AmmoniumhydroxydlÖsung in Fraktionen von je 60 ml eluiert.
- 24 -
Die Fraktionen 45 bis 56 wurden vereinigt und unter vermindertem
Druck eingedampft. Der Destillationsrückstand wurde über Phosphorpentoxyd getrocknet. So wurde 0,7 g
eines 70 Gew.-% Kanamycin B, 12 Gew.-% 61-N-Carbamoyl-
-tobramycin [Komponente N-13], 10 Gew.-% unbekannten Bestandteil
und 8 Gew.-% Tobramycin enthaltenden Produktes erhalten. Beim Eindampfen der Fraktionen 57 bis 58 wurde
0,2 g eines Destillationsrückstandes, welcher 60 Gew.-%
Tobramycin, nahe 4-0 Gew.-% Kanamycin B und 0,1 bis 0,2 Gew.-% 6'-N-Carbamoyl-tobramycin [Komponente N-13] enthielt,
gewonnen. Das Eindampfen der Fraktionen 59 bis ergab 5»7 E eines Tobramycinprapafates, welches 0,1 bis
0,15 Gew.-% 6'-N-Carbamoyl-tobramycin [Komponente N-13]
erhielt. Beim Umkristallisieren dieses Rohproduktes aus 96%-igem Äthanol wurden4,2 g reines Tobramycin gewonnen.
Herstellung von Nebramycin-2 und Nebramycin-51
in einem im voraus festgesetzten Verhältnis enthaltenden Gärbrühen
Nach der Verfahrensweise des Beispieles 1, Abschnitt a)
wurden 10 χ 100 ml Impfmaterialnährmedium (Inokulum-Nährmedium)
der dort angegebenen Zusammensetzung mit der Zellsuspension von Streptomyces tenebrarius MNG 204 und weitere'
10 χ 100 ml Impfmaterialnährmedium (Inokulum-Nährmedium)
mit einer Zellsuspension von Streptomyces tenebrarius MNG 169 beimpft. Es wurde gemäß der Verfahrensweise
des Beispieles 1, Abschnitt a) 14 bis 18 Stunden lang gezüchtet und ferner wurden 100 ml in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben
und 5 1 in einem 10 1 Gärgefäß sterilisiertes
Hauptgärmedium der im Beispiel 1, Abschnitt a) angegebenen Zusammensetzung getrennt mit beiden Stämmen
- 25 -
-■25 -
beziehungsweise mit ihrer nachfolgend festgesetzten
Mischkultur beimpft.
Die Züchtung wurde 14-4- Stunden lang unter den Bedingungen
des Beispieles 1, Abschnitt a) fortgesetzt und der Gehalt an den Antibioticumbestandteilen der Gärbrühe wurde
durch Dünnschichtchromatographie und anschließende Bioautographie und Vergleichen mit dem Standard bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengestellt.
- 26 -
- .26 -
2-üchtungs- j
bedingungen
bedingungen
Mikroorganismus 1
Mikroorganismus 2
Menge der einzelnen Nebramycine
in
ug/ml 4
5'
Schüttelkolben
ι Streptomyces j tenebrarius j MIiG 169
040
180
ml
1
Streptomyces tenebrarius MKG 204
ml
2
Streptomyces tenebrarius MNG 169
4,5 ml
Streptomyces tenebrarius MNG 204
0,5 ml
640
175
Λ
Streptomyces tenebrarius MNG 169
4,0 ml
Streptomyces tenebrarius MNG 204
1,0 ml
140
195
! 1
"T
- -ar-
Fortsetzung der Tabelle
| Züchtungs- bedin gungen |
Mikroorganismus 1 |
3,5 | ml | Mikroorganismus 2 |
1,5 | ml | Menge der 2 |
einzelnen Ne in jüg/ml 4 |
ibramycine 5' |
610 |
| 5 | Streptomyces tenebrarius MNG 169 |
3,0 | ml | Streptomyces tenebrarius MNG 204 |
2,5 | ml | 4 740 | 180 ■ |
1 | 690 |
| 6 | Streptomyces tenebrarius MNG 169 |
2,5 | ml | Streptomyces tenebrarius MNG 204 |
2,5 | ml | 3 140 | 240 | 1 | 840 |
| 7 . | Streptomyces tenebrarius MNG 169 |
2,0 | ml | Streptomyces tenebrarius MNG 204 . |
3,0 | ml | 2 850 | 170 | 1 | 880 |
| j 8 |
Streptomyces tenebrarius MNG 169 |
Streptomyces tenebrarius MNG 204 |
2 510 | 190 | 1 | |||||
| Züchtungs- bedin gung en |
Mikroorganismus Λ |
1,5 | ml | Mikroorganismus 2 |
Menge der t 2 |
einzelnen in jag/ml 4 |
Ne | bramycine 51 |
| 9 | Streptomyces tenebrarius MNG 169 |
1,0 | ml | Streptomyces tenebrarius MNG 204 3,5 ml |
1 320 | 240 | 2 430 | |
| 10 | Streptomyces tenebrarius MNG 169 |
0,5 | ml | Streptomyces tenebrarius MNG 204 4,0 ml |
470 | 12C | 2 340 | |
| 11 | bxreptomyces tenebrarius l'iliG Io 9 |
200 | ml | Streptoinyces tenebrarius MNG 204 4,5 ml |
150 | 95 | 2 340 | |
| Gärgefäß I |
Streptomyces tenebrarius MNG 169 · |
3 900 | 210 | 870 |
| Züchtungs- bedin gungen |
Mikroorganismus | Mikroorganismus 2 |
Menge der 2 |
einzelnen Ne in uß/ml 4 |
bramycine 51 |
| II | Streptoii^yces tenebrarius MNG 204 200 ml |
0 | 90 | 2 300 | |
| III | Streptomyces" tenebrarius MNG 169 175 ml |
Streptomyces tenebrarius MNG 204 25 ml |
4 380 | 240 | 1 130 |
| IV | Streptomyces tenebrarius MNG 169 150 ml |
Streptomyces tenebrarius MNG 204 50 ml |
3 050 | 340 | 1 530 I |
| ! ν I I |
Streptomyces tenebrarius MNG 169 125 ml |
Streptomyces tenebrarius MNG 204 75 ml |
2 450 | 220 | 1 640 |
| i "" -""" I |
CjO NJ •Ο-OO
- 30 Fortsetzung der Tabelle 5
| Züchtungs- bedin- gungen |
Mikroorganismus 1 |
100 | ml | Mikroorganismus 2 |
100 | ml | Menge der 2 |
einzelnen in tig/ml ' 4 |
Ne | bramycine 5' |
| VI | Streptomyces tenebrarius KNG 169 |
75 | ml | Streptomyces tenebrarius MlTG 204 |
125 | ml | 2 320 | 420 | 2 150 | |
| VII | Streptomyces tenebrarius MNG 169 |
50 | ml | Streptomyces tenebrarius MNG 204 |
150 | ml | 1 420 | 300 | 2 470 | |
| VIII | Streptomyces tenebrarius MNG 169 |
25 | ml | Streptomyces tenebrarius MNG 204 |
175 | ml | 980 | 160 | 2 540 | |
| IX | Streptomyces tenebrarius MNG 169 |
Streptomyces tenebrarius MNG 204 |
280 | 140 | 2 310 | |||||
Aus der obigen Tabelle 5 geht hervor, daß bei Verwendung
von ütreptomyces tenebrarius MNG 204· und MNG 169
Gärbrühen, die Nebramycin-^?' und Nebramycin-2 in einem
beliebigen im voraus festgesetzten Verhältnis enthalten,
hergestellt werden können. Das Antibioticum kann aus der Gärbrühe nach der ungarischen Patentschrift"174· 315 isoliert
werden.
Das bioautographische Bild der Kulturen I bis IX ist in der Figur dargestellt.
s sung
Leerseite
Claims (6)
- Patentansprüchea) zur Erzeugung von Gärbrühen, die nahezu ausschließlich Nebramycin-5' enthalten, den Mikroorganismusstamm Streptomyces tenebrarius MNG 204, hinterlegt am 2. September 1981 unter der Bezeichnung Streptomyces tenebrarius MNG 204 in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezat), einsetztbeziehungsweiseb) zur Erzeugung von Gärbrühen, die ein Gemisch von Nebramycin-2 und Nebramycin-5' in einem beliebigen im voraus festgesetzten Verhältnis und Nebramycin-4- enthalten, Sporen oder vegetatives Myzel eines beliebigen den Nebramycin-Komplex erzeugenden Stammes von Streptomyces tenebrarius und Sporen oder vegetatives Myzel eines nahezu ausschließlich Nebramycin-5' erzeugenden Stammes von Streptomyce.s tenebrarius in einem entsprechenden gewünschten Verhältnis vermischtund in einem 1 oder mehr Kohlenstoffquelle(n) und Stickstof fquelle(n) und anorganische^] Salz(e) und Spurenelemente und gegebenenfalls 1 oder mehr tierische[s]und/oder pflanzliche[s] öl(e) und/oder Fett(e) enthaltenden Nährmedium in submerser belüfteter Gärkultur bei Temperaturen von 33 bis 4O°C züchtet.
- 2.) Verfahren nach Anspruch 1 b), dadurch gekennzeichnet, daß man als den Nebramycin-Komplex erzeugenden Stamm von Streptomyces tenebrarius den am 28. Dezember 1977 unter der Bezeichnung Streptomyces tenebrarius MNG 169 oder am 5. April 1978 unter der Bezeichnung Streptomyces tenebrarius MNG 170 ,jeweils in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Qrszagos Közegeszsegügyi Intezet) hinterlegten oder der am 16. Juni 1965 unter der Bezeichnung ATCC 17 92.0 dnder Stammsammlung The American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegte einsetzt.
- 3.) Verfahren nach Anspruch 1 b), dadurch gekennzeichnet» daß man als nahezu ausschließlich Nebramycin-51 erzeugenden Stamm den am 2. September 1981 unter der Bezeichnung Streptomyces tenebrarius MNG 204- in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet) hinterlegten einsetzt.
- 4.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß man als Nährmedium für die Gärkultur ein solches, welches als Kohlenstoffquelle Glucose, Fructose, Stärke, Dextrin und/oder Glycerin und als Stickstoffquelle Brdnußmehl, Maisbrei, 1 oder mehr Pepton(e), Hefeextrakt, Sojamehl, Casein und/oder 1 oder mehr Aminosäure(n) und/oder anorganisch^s] Ammoniumsalz(e) enthält, einsetzt.
- 5.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung des Mikroorganismus beziehungsweise der Mikroorganismen bei einer Temperatur von 37 G durchführt.
- 6.) Mikroorganismusstamm Streptomyces tenebrarius MNG 204, verwendbar im Verfahren nach Anspruch 1 bis 5» hinterlegt am 2. September 1981 unter der Bezeichnung Streptomyces tenebrarius MNG 204- in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszägos Közeg6szsegügyi Intezet).Beschreibung
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU813954A HU190680B (en) | 1981-12-28 | 1981-12-28 | Process for preparing 6''-0-carbamoyl-tobramycin microbiologically |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3248420A1 true DE3248420A1 (de) | 1983-07-21 |
| DE3248420C2 DE3248420C2 (de) | 1990-11-08 |
Family
ID=10966213
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19823248420 Granted DE3248420A1 (de) | 1981-12-28 | 1982-12-28 | Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von gaerbruehen, die entweder nahezu ausschliesslich nebramycin-5' oder ein gemisch von nebramycin-2 und nebramicyn-5' in einem beliebigen im voraus festgesetzten verhaeltnis und nebramycin-4 enthalten und in diesem verwendbarer mikroorganismusstamm |
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|---|---|---|---|---|
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| US3853709A (en) * | 1970-10-26 | 1974-12-10 | Lilly Co Eli | Process for preparing nebramycin factors ii and vii |
| US4032404A (en) * | 1976-07-14 | 1977-06-28 | Bristol-Myers Company | Fermentation process for producing apramycin and nebramycin factor V' |
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1981
- 1981-12-28 HU HU813954A patent/HU190680B/hu not_active IP Right Cessation
-
1982
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- 1982-12-27 CH CH3108/85A patent/CH658072A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-12-27 CH CH7558/82A patent/CH657374A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-12-27 FR FR8221803A patent/FR2519023B1/fr not_active Expired
- 1982-12-28 AT AT0470482A patent/AT379171B/de not_active IP Right Cessation
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- 1982-12-28 FI FI824483A patent/FI74995C/fi not_active IP Right Cessation
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