HU190680B - Process for preparing 6''-0-carbamoyl-tobramycin microbiologically - Google Patents

Process for preparing 6''-0-carbamoyl-tobramycin microbiologically Download PDF

Info

Publication number
HU190680B
HU190680B HU813954A HU395481A HU190680B HU 190680 B HU190680 B HU 190680B HU 813954 A HU813954 A HU 813954A HU 395481 A HU395481 A HU 395481A HU 190680 B HU190680 B HU 190680B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
nebramycin
mng
tobramycin
carbamoyl
strain
Prior art date
Application number
HU813954A
Other languages
English (en)
Inventor
Istvan Ott
Miklos Fabian
Laszlo Toelgyesi
Gabor Ambrus
Tibor Balogh
Valeria Szell
Imre Moravcsik
Original Assignee
Gyogyszerkutato Intezet
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gyogyszerkutato Intezet filed Critical Gyogyszerkutato Intezet
Priority to HU813954A priority Critical patent/HU190680B/hu
Priority to BE1/10669A priority patent/BE895455A/fr
Priority to FR8221803A priority patent/FR2519023B1/fr
Priority to CH3108/85A priority patent/CH658072A5/de
Priority to CH7558/82A priority patent/CH657374A5/de
Priority to FI824483A priority patent/FI74995C/fi
Priority to NL8205011A priority patent/NL8205011A/nl
Priority to AT0470482A priority patent/AT379171B/de
Priority to DE19823248420 priority patent/DE3248420A1/de
Priority to GB08236905A priority patent/GB2114978B/en
Priority to AT400384A priority patent/AT380489B/de
Publication of HU190680B publication Critical patent/HU190680B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/46—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin
    • C12P19/48—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin the cyclohexyl radical being substituted by two or more nitrogen atoms, e.g. destomycin, neamin
    • C12P19/485—Having two saccharide radicals bound through only oxygen to non-adjacent ring carbons of the cyclohexyl radical, e.g. gentamycin, kanamycin, sisomycin, verdamycin, mutamycin, tobramycin, nebramycin, antibiotics 66-40B, 66-40D, XK-62-2, 66-40, G-418, G-52
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/46—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin
    • C12P19/48—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin the cyclohexyl radical being substituted by two or more nitrogen atoms, e.g. destomycin, neamin
    • C12P19/50—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin the cyclohexyl radical being substituted by two or more nitrogen atoms, e.g. destomycin, neamin having two saccharide radicals bound through only oxygen to adjacent ring carbon atoms of the cyclohexyl radical, e.g. ambutyrosin, ribostamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

(54) BljdrsÁB 6**—Ο—kÍir-b;^moil — tobramicin előállí tására mikrobiológiai úton (57) Kivonat
A találmány tárgya eljárás nebramicin-5’-t (6-0-karbamoil-tobramicint) tartalmazó fermentlevek előállítására, amely abban áll, hogy az új Streptomyces tenebrarius MNG 204 sorszámú törzset vagy ennek egy mutánsát szerves szán- és nitrogén-forrást, szervetlen sókat, nyomelemeket, állati és/vagy növényi olajokat és/vagy zsírokat tartalmazó táptalajon süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között 33 °C és 40 eC közötti hőmérsékleten, előnyösen 37 ’C-on tenyésztik.
A találmány tárgya eljárás 6”-O-karbamoil-tobramicint tartalmazó fermentlevek előállítására mikrobiológiai úton.
Ismeretes, hogy a Streptomyces tenebrarius több komponensből álló, nebramicinnek elnevezett antibiotikum-keveráket bioszin te tízéi (Stark, Hoehn és Knox, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1967, 314. oldal; 1 178 489 számú nagy-britanniai és 3 691 279 ezámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az antibiotikum-keverék több minor komponens mellett nebramicin-2 (apramicin), nebramicin-4 (6”-0-karbamoil-kanamicin B) és nebramicin-5’ {6-0-karbamoil-tobramicin) major komponenseket tartalmaz (Koch, Davis és Rhoades, J. of Antibiotics, 26, 745, 1973). A 3 853 709 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban a szerzők nebramicin-2 mellett nebramicin-7-et termelő mikroorganizmust írnak le. Japán szerzők a 4 032 404 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Streptoalloteichus hindustanus törzs tenyésztésével oldják meg a nebramicin-2 és nebramicin-5' együttes előállítását. A 176 103 számú magyar szabadalmi leírás szerint eljárva a Streptomyces tenebrarius MNG 169 és 170 sorszámú törzsek süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények közötti tenyésztésével sorrendben nebramicin-2-t, nebramicin-4-et és nebraraícin-5’-t, illetve nebramicin-2-t és nebramicin-5'-t tartalmazó fermentleveket kapnak. Ezekből az antibiotikumokat a 174 315 számú magyar szabadalmi leírás ezerint izolálják.
A nebramicin-2 növényi és állati megbetegedéseket okozó mikroorganizmusok növekedését gátolja (3 691 279, 3 853 709 és 3 876 763 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások), a nebramicin-4 hidrolízisével előállított kanamicin B és elsősorban a nebramicin-5’ hidrolízise után kapott tobramicin (Brulamycin) pedig forgalomban lévő szélesspektrumú, polirezisztens baktériumok okozta fertőzések leküzdésében jelentős szerepet játszó, a hufnán terápiában használt antibiotikumok (például Preston és Wick, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1970, 322. oldal).
A 176 103 számú magyar szabadalmi leírás szerint eljárva az 1. táblázatban megadott összetételű antibiotikum-keveréket kapjuk:
1. táblázat
Törzs Nebramicin-2 Nebramicin-4 Nebramicin-5’
MNG 169 77 2 21
MNG 170 91 nyomokban 9
Látható, hogy a törzsek túlnyomó részben nebramicin-2-t bioszintetizálnak. A nebramicin-5’-t a túlsúlyban lévő egyéb komponensektől bonyolult és költséges eljárással különítik el.
Egy mikroorganizmus állal bioszintetizált antibiotikum-komplex összetételét döntően a sejt genetikai információ-készlete határozza meg, kisebb részben a fermentációs körülmények.
Az ismert eljárásokkal, ha nebramicin-5’-t kívánnak termelmi, úgy azt költséges eljárásokkal kell elkülöníteni a túlsúlyban lévő nebramicin-2-tól.
A törzsek termelőképességének foko-zását célzó törzsnemeeítési kísérletek kiértékelése a többkomponensű rendszereknél munka- és időigényes. A komponensek mennyiségét vékonyréteg-kromatográfiás elválasztásukat követően külön-külön, biológiai értékméréssel határozzák meg. Előnyös lenne a törzsnemeeítési kísérleteket egyszerű mérést megengedő egykomponensű rendszerrel végezni. Másrészt az egyetlen antibiotikumot termelő mikroorganizmus termelőképességének fokozódása valószínűbb, hiszen a sejtek teljes bioszintetikus kapacitásukat egyetlen vegyüld felépítésére fordítják.
A találmány célja olyan új és egyszerűen kivitelezhető fermentációs eljárás kidolgozása, amellyel gyakorlatilag csak nebramicin-5’-t tartalmazó fermentlevek állíthatók elő. Kísérleteink során megfigyeltük, hogy a Str. tenebrarius MNG 169 törzsből etidium-bromidos (2,7-diamino-lo-etil-fenil-fenantridium-bromid) kezelést követően, meglepő módon nebramicin-2-t egyáltalán nem, nyomnyi mennyiségű nebramicin-4-et, és főkomponensként nebramicin-5’-t bioszintetizáló törzs izolálható. A jelenség annál is inkább váratlan és meglepő, mert az etidium-bromidot nem használják mutációt kiváltó szerként.
A 176 103 sz. magyar szabadalmi leírásban ismertetetthez képest megváltozott komponensösszetételű antibiotikum keveréket bioszintetizáló sejtek izolálására a Streptomyces tenebrarius MNG 169 törzs spóráit folyékony halmazállapotú táptalajban tenyésztettük. A tenyészetet kinövése után öt részre osztottuk és 0, 0,05, 0,5 5,0 illetve 50,0 pg/rnl etidium-bromidot adagoltunk hozzá. 24 órán ét folytattuk a tenyésztést, majd megfelelő hígítást követően a tenyészetek egy részét agarlemezekre szélesztettük, másik részével pedig azonos mennyiségű etidium-bromidot tartalmazó folyékony halmazállapotú táptalajokat oltottunk. Ezeket 24 órán át ismét tenyésztettük, majd fentiek szerint megismételtük a szélesztést és a tovabboltás t. Az új folyékony halmazállapotú tenyészeteket 24 óra múlva ismét szélesztettük. Az agarlemezeket inkubáltuk, majd több különálló telepet izoláltunk és termelőképességüket a példákban ismertetett módon vizsgáltuk.
A Streptomyces tenebrariue MNG 169-ből származó több száz vizsgált izolátum közül kát törzs nebramicin-2-t nem, nebramicin-4-et nyomokban, nebremicin-5’-t pedig viszonylag kis mennyiségben termelt. A nebramicin-5’-t termelő két törzs termelőképességének fokozására törzsnemesítési és táptalajoptimalizálási kísérleteket végeztünk. Ezek során az egyik elpusztult, a másik termelőképessége viszont többszörösére fokozódott és ezt a ezintet stabilan megtartotta. A törzset letétbe helyeztük az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzetközi Törzsgyűjteményében, ahol az MNG 204 sorszámot kapta.
A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás nebramicin-5'-t (6”-karbamoíl-tobramicint) tartalmazó fermentlevek előállítására, amely abban áll, hogy az új Streptomyces tenebrarius MNG 204 sorszámú törzset szerves szén és nitrogónforrást, szervetlen sókat, nyomelemeket, állati és/vagy növényi eredetű, olajokat és/vagy zsírokat tartalmazó táptalajon süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között, 33 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 37 °C-on tenyésztjük.
A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint úgy járunk el, hogy az új Streptomyces tenebrarius MNG 204 sorszámú törzset, vagy ennek egy mutánsát vagy variánsát tenyésztjük. A mikroorganizmosok tenyésztését szerves szénforrást, például keményítőt, glicerint, fruktózt vagy más hasonló vegyűleteket, előnyösen glükózt; szerves nitrogónforrást, például földimogyorólisztet, kukoricalekvárt, peptont, ólesztőkivonatot vagy más hasonló készítményeket, előnyösen szójalisztet, kazeint, aminosavakat, előnyösen glutaminsavat; szervetlen nitrogónforrást, előnyösen ammóniumkloridot, ammóniumnitrátot és ammónium-szulfátot, szervetlen sókat, előnyösen magnézium-szulfátot, cink-szulfátot, kobaldnitrátot és kalcium-karbonátot; állati és/vagy növényi zsírokat és/vagy olajokat, például pálmaolajat, lenolajat napraforgóolajat, repceolajat, disznózsírt vagy másokat, előnyösen pálmaolaj és lenolaj 1:1 arányú elegyét, és a mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez elengedhetetlenül szükséges nyomelemeket tartalmazó táptalajon süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között a mikroorganizmus növekedését biztosító 33 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten előnyösen 37 ’C-on addig végezzük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum nem halmozódik fel.
A nyomelemeket az egyéb táptalajöszezetevők általában szennyezőanyagként tartalmazzák, de külön is hozzáadhatjuk a táptalajhoz.
Az átáramoltatott levegő mennyiségét a táptalaj összetétele, a keverő hatásfoka és a fermentor műszaki adatai alapján kell megválasztani. Általában előnyös, ha a sejtek oxigénellátását úgy állítjuk be, hogy az elmenő gázelegy COj-tartalma ne emelkedjen 1,0% fölé és a táptalajból a redukáló cukor a 96. és a 110. óra között fogyjon el.
A táptalaj Bterilezését 30-60 percen át 121-123 °C hőmérsékleten gőzzel végezzük. A táptalaj ph-ját sterilezés előtt 7,2-7,4 közötti értékre célszerű beállítani. A fermentáció közben habzásgátlót nem kell adagolnunk, mivel a tápanyagforrásként adagolt növényi vagy állati zsírok vagy olajok egyúttal a tenyészet habzását is gátolják.
A tenyésztés történhet lombikban, laboratóriumi, kísétleti üzemi vagy üzemi férmentorokban.
A tenyészetek antibiotikum komponens-összetételét szilikagél vékonyréteg-kromatográfiát követően bioautográfiával határozzuk meg. A szilikagél (Merck, Darmstadt) vékonyrétegre 0,1-0,5 μg/ral közötti mennyiségű antibiotikumot cseppentünk, majd futtatóelegyként etil-alkohol, metil-etil-keton és 25%-os ammónium-hidroxid 1:1:1 arányú elegyét használva kromatografálunk. A gél teljes száradása után Bacillus subtilis ATCC 6633 mikroorganizmust tartalmazó táptalajt rétegezőnk a lemez felületére, és 37 °C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk. Ezután standarddel összehasonlítva meghatározzuk a gátlási zónák nagyságát. A mérés mennyiségi és minőségi kiértékelésre alkalmas, pontossága ±10 %,
A fermentáció során a táptalajban 2100-2600 pg/ml nebramicin-5’mellett, a tenyésztés paramétereitől függően 10-180 pg/ml nebramicin-4 halmozódik fel. A tenyészetből a nebramicin-5’-t egyetlen kromatográfiás lépésben választjuk el a nebramicin-4-től és a szennyező anyagoktól, majd ismert módon tobramicinné hidrolizáljuk. Eljárhatunk oly módon is hogy a nebramicin-5’-t a tenyészetben alakítjuk át tobrámicinné, és ezt különítjük el (174 315 ez. szabadalmi leírás ).
A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: a gyakorlatilag egyetlen komponenst termelő Str. tenebrarius MNG 204 törzzsel a korábbinál magasabb termelési szint érhető el. A törzzsel végzendő további törzsnemesítési kísérletek gyors eredményt ígérnek, hiszen a sejt teljes bioszintetikus kapacitását egyetlen antibiotikum előállítására fordíthatja. Az egyetlen antibiotikum-komponenst tartalmazó fermentlevek aktivitásának meghatározása gyors, egyszerű és pontos, a hatóanyag elkülönítése nem igényel költséges tisztítást.
A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbiakban kiviteli példákkal részletesen szemléltetjük.
1. példa
a.) Nabraraicin-5’-t tartalmazó fermentlé előállítása laboratóriumi fermentorban
A Str. tenebrarius MNG 204 spóráival
vagy vegetatív tenyészetével az alábbi ősz-
szetételű, desztillált vízzel készült ferde-
agarokat oltjuk:
dextrin 1.0%
élesztőkivonat 0.1%
kazein-hidrolizátum(10%-os)’ 2,0%
húskivonat 0.1%
kobalt-diklorid-hexahidrát 0.001%
agar 2.5%
* enzimatikusan hidrolizált
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be, majd 121 ’C hómérsékleten 20 percen át sterilezzük.
Négy napon át 37 ’C hőmérsékleten ínkubéljuk a tenyészeteket, majd a táptalaj felületóról steril desztillált vízzel leválasztjuk a spórákat és az így kapott spóraszuszpenzióval 2x100 ml, 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban sterilezett alábbi összetételű, csapvlzzel készült inokulum táptalajt oltunk:
szójaliszt 2.0% kazein-hidrolizátum (10%-os)’ 3.0% ammónium-nitrát 0.1% ammónium-klorid 0.3% kalcium-karbonát 0.3% magnéziura-szulfát-heptahidrát 0.5% pálmaolaj és lenolaj 1:1 arányú elegye 3.0 glükóz (külön, 50%-os oldatként sterilezve) 2.0% * enzimatikusan hidrolizált
A táptalaj pH-ját vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be, majd 121 ’C hőmérsékleten 20 percen át autoklávban sterilezzük.
A beoltott tenyészeteket 14-18 órán át 2,4 cm átmérőjű kör mentén percenként 280-at forduló síkrázógépen 37 ’C hőmérsékleten tenyésztjük.
200 ml, Így előállított, érett inokulummal 10 1 hasznos térfogatú laboratóriumi fermentorban 121 ’C hőmérsékleten 45 percen át sterilezett, 5 1 térfogatú, csapvizzel készült alábbi összetételű főfermentációs táptalajt oltunk:
szójaliszt 3.0% kazein-hidrolizátum (10%-os)’ 5.0% ammónium-nitrát 0.1% ammónium-klorid 0.5%
L-glutamineav 0.8% kalcium-karbonát 0.5% magnézium-szulfát-heptahidrát 0.5% kobalt-dinitrát-hexahidrát 0.001% pálmaolaj és lenolaj 1:1 arányú elegye 3.0% glükóz (külön, 50%-os oldatként sterilezve) 4.2% * enzimatikusan hidrolizált
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt vizes ammónium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be.
A tenyésztést 37 ’C hőmérsékleten végezzük. A fermentor keveröjének fordulatszámát 360/perc-re állítjuk be. A táptalajon percenként 3 1 steril levegőt vezetünk át.
A tenyésztés 144. órájában a fermentlé 100 ml-enként 260 mg nebramicin-5’-t tartalmaz, 9 mg nebramicin-4 mellett. Nebramicin-2 nem mutatható ki.
Főfermentációs táptalajként más összetételű táptalajokat is használhatunk. így például az a.) pont szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy főfermentációs táptalajként az alábbi összetételű táptalajt használjuk:
szójaliszt 3.3% ammónium-klorid 0.6% magnézium-szulfát-heptahidrát 0.7% kalcium-karbonát 0.5% kobalt-dinitrát-hexahidrát 0.001% pálmaolaj 2.5% glükóz (50%-os oldatként külön sterilezve)’ 2.1% ’A tenyésztéshez használt fermentor sejtanyagcserét befolyásoló geometriájától és szerelvényeitől függően a táptalaj glükóz-koncentrációját 4.0%-ig növelhetjük.
A tenyésztés 144. órájában a fermentlé 100 milliliterenként 180 mg nebramicin-5’-t tartalmaz kevés (legfeljebb 3 mg) nebramicin-4 mellett. Nebramicin-2 nem mutatható ki.
b.) Nebramicin-5’-t tartalmazó fermentlé előállítása 1000 literes üzemi fermentorban
Nagymennyiségű nebramicin-5’-t tartalmazó fermentlé előállítására az a.) pontban megadottak szerint eljárva 100 ml inokulum táptalajt beoltunk a Streptomyces tenebrarius MNG 204 törzs spóráival vagy vegetatív tenyészetével és tenyésztjük a mikroorganizmust. 14-18 óra múlva 100 liter steril inokulum táptalajt oltunk a tenyészettel és 37 ’C hőmérsékleten fermentálunk. A táptalajon percenként 100 liter levegőt vezetünk át és percenként 360-at forduló keverőt működtetünk. 16 óra múlva 50 liter inokulummal beoltunk 1000 liter, saválló acélból készült fermentorban sterilezett, az a.) pontban megadott összetételű főfermentációs táptalajt. A fermentáció közben pecenként 500 liter levegőt vezetünk át a tenyészeten, és percenként 200-at forduló keverővei keverjük. A tenyésztést 37 ’C hőmérsékleten végezzük. A tenyészet antibiotikum-tartalmának változását a 2. táblázatban adjuk meg.
2. táblázat
Fermentációs idő (óra) Nebramicin-komponens 5
2 (pg/ml) 4 5’
24 0 0 50
48 0 0 400
72 0 5 1200 10
96 0 30 1740
120 0 40 2320
144 - 0 60 2650
c.) A nebrajnicin-5' dekarbamoilezóse és á tobr amicin izolálása
3,0 liter 2600 ^ig/ml nebramicin-5’-t és 90 pg/ml nebramicin-4-et tartalmazó ferment- 20 léhez 22 g nátriura-hidroxidot adunk. A fermentlevet ezután keverés közben 90-100 °C hőmérsékletre melegítjük, és 25 percen át ezen a hőmérsékleten tartjuk. A reakcióidő letelte utón szobahőmérsékletre hűtjük, majd 25 pH-ját 50%-os vizes kénsav oldattal 2,0-re állítjuk be. Az így kapott savanyú fermentléhez állandó keverés közben 6 g oxálsavat adunk, majd pH-jót tömény ammónium-hidroxiddal 7,0-re állítjuk be és 30 percen át 30 keverjük. Ezután szűrjük, majd a micéliumot 2x600 ml vízzel mossuk. A szűrletet és a moeófolyadékot egyesítjük. Az így előállított kalciumion-mentes oldatot 200 ml Amberlite CG-50 (NH<*-ciklusban) gyantából (Rohm and 35 Haas Co., Philadelphia, USA) készült oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot 400 ml ionmentes vízzel mossuk, majd 1000 ml 0,05N, 2000 ml 0,lN és végül 3000 ml 0,15N ammónium-hidroxid oldattal eluáljuk. Az eluáláskor 40
250 ml térfogatú frakciókat különítünk el. A tobramicint tartalmazó 13-18. frakciókat egyesítjük, az oldat pH-ját 50%-os kénsav oldattal 7,0-re állítjuk be és 120 ml Amberlite CG-50 (NH^-ciklusban) gyantán kromatografóljuk. 200 ml ionmentes vízzel mossuk a gyantaágyat, majd az antibiotikumot 1000 ml 0,05N, 2000 ml 0,lN, 2000 ml 0,15N és végül 2000 ml 0,2N ammónium-hidroxid oldattal eluáljuk. 60 ml térfogatú frakciókat szedünk. A 45-56. frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékot foszfor-pentoxid felett szárítjuk. így 0,7 g 70% kanamicin B-t. 12% N-13 komponenst (6’-N-karbamoil-tobramicin). 10% ismeretlen komponenst és 8% tobramicint tartalmazó terméket kapunk. Az 57-58. frakciókat desztillálva 0,2 g, 60% tobramicint és közel 40% kanamicin B-t, továbbá 0,1-0,2% N-13komponenst tartalmazó desztillációs maradókhoz jutunk. Az 59-69. frakciók desztillációját követően 5,7 g, 0,1-0,15% Ν-13-komponenst tartalmazó tobramicinhez jutunk. A nyers tobramicint 96%-os vizet etanolból kikristályosítva 4,2 g tiszta tobramicint kapunk.

Claims (1)

  1. Szabadalmi igénypont
    Eljárás nebramicin-5’-t (6-0-karbamoil-tobramicint) tartalmazó fermentlevek előállítására, azzal jellemezve, hogy az új Streptomyces tenebrarius MNG 204 sorszámú törzset vagy ennek egy mutánsát szerves szén- és nitrogén-forrást, szervetlen sókat, nyomelemeket, állati és/vagy növényi olajokat és/vagy zsi-rokat tartalmazó táptalajon süllyesztett, le-vegóztetett fermentációs körülmények között 33 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 37 °C-on tenyésztjük.
    Rajz nélkül
    A kiadásért felel a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 6 88.78.66-4 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkő István vezérigazgató
HU813954A 1981-12-28 1981-12-28 Process for preparing 6''-0-carbamoyl-tobramycin microbiologically HU190680B (en)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU813954A HU190680B (en) 1981-12-28 1981-12-28 Process for preparing 6''-0-carbamoyl-tobramycin microbiologically
BE1/10669A BE895455A (fr) 1981-12-28 1982-12-23 Procede microbiologique pour preparer de la nebramycine-2, de la nebramycine-5' et de la nebramycine-4
FR8221803A FR2519023B1 (fr) 1981-12-28 1982-12-27 Procede microbiologique pour preparer de la nebramycine-2, de la nebramycine-5' et de la nebramycine-4
CH3108/85A CH658072A5 (de) 1981-12-28 1982-12-27 Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von nebramycin-2, nebramycin-5' und nebramycin-4.
CH7558/82A CH657374A5 (de) 1981-12-28 1982-12-27 Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von nebramycin-5'.
FI824483A FI74995C (fi) 1981-12-28 1982-12-28 Foerfarande foer mikrobiologisk framstaellning av fermenteringsmedia, som innehaoller antingen nebramycin-5' eller en blandning av nebramycin-2, nebramycin-4 och nebramycin-5'.
NL8205011A NL8205011A (nl) 1981-12-28 1982-12-28 Microbiologische werkwijze voor de bereiding van nebramycine-2, nebramycine-5' en nebramycine-4.
AT0470482A AT379171B (de) 1981-12-28 1982-12-28 Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von nebramycin-5'
DE19823248420 DE3248420A1 (de) 1981-12-28 1982-12-28 Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von gaerbruehen, die entweder nahezu ausschliesslich nebramycin-5' oder ein gemisch von nebramycin-2 und nebramicyn-5' in einem beliebigen im voraus festgesetzten verhaeltnis und nebramycin-4 enthalten und in diesem verwendbarer mikroorganismusstamm
GB08236905A GB2114978B (en) 1981-12-28 1982-12-30 Microbiological process for preparing nebramycin-2 nebramycin-5 and nebramycin-4
AT400384A AT380489B (de) 1981-12-28 1984-12-17 Verfahren zur mikrobiologischen herstellung eines gemisches von nebramycin-2, nebramycin-5' und nebramycin-4

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU813954A HU190680B (en) 1981-12-28 1981-12-28 Process for preparing 6''-0-carbamoyl-tobramycin microbiologically

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU190680B true HU190680B (en) 1986-10-28

Family

ID=10966213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU813954A HU190680B (en) 1981-12-28 1981-12-28 Process for preparing 6''-0-carbamoyl-tobramycin microbiologically

Country Status (9)

Country Link
AT (1) AT379171B (hu)
BE (1) BE895455A (hu)
CH (2) CH658072A5 (hu)
DE (1) DE3248420A1 (hu)
FI (1) FI74995C (hu)
FR (1) FR2519023B1 (hu)
GB (1) GB2114978B (hu)
HU (1) HU190680B (hu)
NL (1) NL8205011A (hu)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3691279A (en) * 1970-04-15 1972-09-12 Lilly Co Eli Antibiotic nebramycin and preparation thereof
US3853709A (en) * 1970-10-26 1974-12-10 Lilly Co Eli Process for preparing nebramycin factors ii and vii
US4032404A (en) * 1976-07-14 1977-06-28 Bristol-Myers Company Fermentation process for producing apramycin and nebramycin factor V'

Also Published As

Publication number Publication date
FR2519023B1 (fr) 1985-10-25
FR2519023A1 (fr) 1983-07-01
GB2114978B (en) 1985-09-11
CH657374A5 (de) 1986-08-29
CH658072A5 (de) 1986-10-15
BE895455A (fr) 1983-06-23
NL8205011A (nl) 1983-07-18
ATA470482A (de) 1985-04-15
FI824483A0 (fi) 1982-12-28
AT379171B (de) 1985-11-25
GB2114978A (en) 1983-09-01
FI74995B (fi) 1987-12-31
DE3248420C2 (hu) 1990-11-08
DE3248420A1 (de) 1983-07-21
FI824483L (fi) 1983-06-29
FI74995C (fi) 1988-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0089370B1 (en) Production of gamma-decalactone
US3043749A (en) Preparation of 2-keto-l-gulonic acid
RO119235B1 (ro) Procedeu de preparare a derivaţilor de (s)-hidroxi-fenil-alchenil-chinolină prin reducere microbiană şi cultură de microbacterium pentru realizarea acestuia
IL24529A (en) Process for preparing cephalosporin derivatives
Boeck et al. NEW AZASTEROIDAL ANTIFUNGAL ANTIBIOTICS FROM GEOTRICHU FLAVO-BRUNNEUM I. DISCOVERY AND FERMENTATION STUDIES
US3716579A (en) Ester derivatives of pleuromutilin
US3600279A (en) Method for producing d-pantoic acid
DE2811303C3 (de) Enzymatische Komplexe, die zur Umwandlung racemischer Hydantoine in optisch aktive Aminosäuren geeignet sind, sowie deren Anwendung
HU190680B (en) Process for preparing 6&#39;&#39;-0-carbamoyl-tobramycin microbiologically
US4076589A (en) Process for the production of dihydroxyacetone
US3558431A (en) Oxidation process
US3769169A (en) Fermentation process
CA1154393A (en) Antibiotic em 4940
US3634197A (en) Production of 3-amino-3-deoxy-d-glucose
US3975235A (en) Process for the production of cephamycin type antibiotic substances
JPH022589B2 (hu)
Marshall et al. Precursor directed biosynthesis of paulomycins A and B. The effects of valine, isoleucine, isobutyric acid and 2-methylbutyric acid
US3901880A (en) (s)-alanyl-3-(+60 -(s)-chloro-3-(s)-hydroxy-2-oxo-azetidinylmethyl)-(s)-alanine
US3201323A (en) Production of glutamic acid
US3551294A (en) Erythromycin process
US4220718A (en) Antibiotics produced by Cytospora sp. W.F.P.L. 13A
HU195252B (en) Process for producing fermentation broth containing apramycin, 6-two commas above-o-carbamoyl-tobramycin and 6-two commas above-canamycin-b with microbiological method
US3433710A (en) Process for the preparation of 7-chloro-5-hydroxytetracycline
US4123329A (en) Process for producing L-lysine by fermentation
US4208481A (en) Use of phenylalkanes as precursors in benzylpenicillin fermentation

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee