CH657374A5 - Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von nebramycin-5'. - Google Patents

Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von nebramycin-5'. Download PDF

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Kulturbrühen, die ausschliesslich Nebramycin-5' enthalten.
Es ist bekannt, dass Streptomyces tenebrarius ein aus mehreren Komponenten bestehendes, als Nebramycin bezeichnetes Antibiotikumgemisch produziert (Stark, Hoehn und Knox, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1967, S. 314; GB-PS 1 178 489 und US-PS 3 691 279). Das Antibiotikumgemisch enthält neben Minorkomponenten die Komponenten Nebramycin-2 (Apramycin), Nebramycin-4 (6"-0-Carbamoyl-kanamycin B) und Nebramycin-5' (6"-0-Carba-moyl-tobramycin) [Koch, Davis und Rhoades, J. of Antibio-tics 26,745 (1973)]. In der US-PS 3 853 709 ist ein ausschliesslich Nebramycin-2 und Nebramycin-7 produzierender Mikroorganismus beschrieben. In der US-PS 4 032 404 beschreiben japanische Autoren die Herstellung von Nebramycin-2 und Nebramycin-5' durch Züchtung des Stammes Streptoalloteichus hindustanus. Gemäss dem Verfahren der HU-PS 176 103 können durch die belüftete, sub-merse Fermentation der Streptomyces-tenebrarius-MNG-169- und -MNG-170-Stämme Fermentbrühen, die entweder Nebramycin-2, Nebramycin-5' und Nebramycin-4, oder Nebramycin-2 und Nebramycin-5' enthalten, gewonnen werden. Die Antibiotika können daraus nach der HU-PS 174315 isoliert werden.
Das durch Hydrolyse des Nebramycin-5' hergestellte Tobramycin (Brulamycin) sind in der Humanmedizin angewandte Antibiotika mit breitem Wirkungsspektrum, die in erster Linie zur Bekämpfung von durch polyresistente Pseu-domonas-Stämme verursachten Infektionen Bedeutung haben (Preston und Wiek, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1970, S. 322).
Mit dem Verfahren der HU-PS 176 173 wird ein Antibiotikumgemisch folgender Zusammensetzung gewonnen.
Tabelle 1
Stamm
Nebramycin-2
%
Nebramycin-4
Nebramycin-5'
MNG 196*
77
2
21
MNG 170*
91
Spuren
9
* Stamm MNG 169 wurde am 28. Dezember 1977 und Stamm MNG 170 am 5. April 1978 in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszägos Kôzegészségûgyi Intézet) unter der Bezeichnung MNG 169 und MNG 170 deponiert. Beide Stämme sind seitdem 28. Februar 1980 für jedermann zugänglich.
Offensichtlich biosynthetisierten die Stämme hauptsächlich Nebramycin-2. Um Nebramycin-5' von den in Übergewicht anwesenden anderen Komponenten zu trennen, benötigt man komplizierte und kostspielige Methoden. Die s Zusammensetzung eines biosynthetisierten Antibiotikumgemisches wird an erster Stelle durch den genetischen Informationsbestand der Mikroorganismus-Zelle und erst zu geringem Mass durch Fermentationsbedingungen bestimmt.
Fermentbrühen mit einem im voraus festgesetzten, jeweils io durch Marktverhältnisse bedingten Komponentverhältnis können mit den gegenwärtig bekannten Verfahren nicht hergestellt werden. Ferner muss bei der Nebramycin-5'-Produk-tion dieses Antibiotikum von dem im Übergewicht anwesenden Nebramycin-2 durch kostpielige Prozeduren getrennt 15 werden. Stammveredelungsversuche für die Erhöhung der Produktionsfähigkeit sind in diesen Multikomponenten-Systemen äusserst arbeitsaufwendig und zeitraubend. Die Menge der einzelnen Komponenten muss nach dünn-schichtchromatografischer Trennung individuell biologisch 20 bestimmt werden. Es wäre überaus günstig, die Stammveredelungsversuche in einem einfache Bestimmung ermöglichenden Einkomponentensystem durchzuführen. Andrerseits scheint es wahrscheinlicher, die Produktionsfähigkeit eines solchen Stammes erhöhen zu können, der ein einziges 25 Antibiotikum produziert, da in diesem Fall die ganze biosynthetische Kapazität für die Bildung einer einzigen Verbindung eingesetzt wird.
Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines neuen, einfachen Fermentationsverfahrens, womit Fermentbrühen, die 30 ausschliesslich Nebramycin-5' enthalten, gewonnen werden können.
In unseren Versuchen wurde überraschenderweise gefunden, dass der mit Äthidiumbromid (2,7-Diamino-10-äthyl-phenyl-phenanthridinium-bromid) vorbehandelte 35 Streptomyces-tenebrarius-MNG-169-Stamm überhaupt kein Nebramycin-2, nur Spuren von Nebramycin-4 und Nebra-mycin-5' als Hauptkomponente biosynthetisiert. Dieser Befund ist unerwartet und um so überraschender, als Äthidiumbromid bis jetzt noch nie als mutagene Verbindung einge-40 setzt wurde.
Für die Gewinnung eines Stammes, der ein Antibiotikumgemisch mit verändertem Komponentverhältnis biosynthetisiert, wurden die Sporen von Streptomyces tenebrarius MNG 169 in einem flüssigen Nährmedium gezüchtet. Die 45 ausgewachsene Kultur wurde in fünf Teile geteilt und 0,0,05, 0,5,5 und 50 [ig/ml Äthidiumbromid zugefügt. Die Züchtung wurde für 24 Stunden fortgesetzt, dann wurde ein Teil der verdünnten Kultur auf Agarplatten geschichtet, der andere Teil dagegen mit einer gleichen Menge von Äthidi-50 umbromid versetzt und für weitere 24 Stunden gezüchtet. Diese Prozedur wurde wiederholt, die erhaltenen, neuen, flüssigen Kulturen wurden nach 24 Stunden auf Agarplatten geschichtet, einige alleinstehende Kolonien isoliert und ihre Produktivität mit einem in den Beispielen zusammengefas-55 sten Verfahren geprüft.
Zwischen den mehreren Hunderten von Stämmen, die aus Streptomyces tenebrarius MNG 169 isoliert wurden, gab es zwei Mutante, die kein Nebramycin-2, aber wenig Nebra-60 mycin-5' und Spuren von Nebramycin-4 produzierten. Um die Produktivität dieser Nebramycin-5' produzierenden Stämmen zu steigern, wurden Stamm-Selektionsarbeiten und Nährmedium-Optimierungsversuche durchgeführt. Während dieser Arbeiten ging einer der Stämme verloren, die ö5 Produktionsfähigkeit des anderen dagegen konnte auf das Fünffache erhöht werden. Dieser Stamm wurde am 2. September 1981 in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszägos
3
657374
Kôzegészségûgyi Intézet) unter der Bezeichnung MNG 204 deponiert.
Aufgrund dieser Beobachtungen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Fermentationsbrühen, die ausschliesslich Nebramycin-5' enthalten, indem man Streptomyces tenebrarius MNG 204 einsetzt und vorzugsweise in einem Nährmedium, das organische Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze, Spurenelemente, tierische und/oder pflanzliche Öle und/oder Fette enthält, in sub-merser, belüfteter Fermentationskultur, bei Temperaturen von 33°C bis 40°C, vorzugsweise bei einer Temperatur von 37°C, züchtet.
Für die Herstellung von Fermentbrühen, die neben Spuren von Nebramycin-4 nur Nebramycin-5' enthalten,
wird in der Weise vorgegangen, dass Streptomyces tenebrarius MNG 204 oder dessen Mutant, Variant oder Rekombi-nant gezüchtet wird. Während der Fermentation werden im Nährmedium neben 2100-2600 ng/ml Nebramycin-5' - von Fermentationsparametern bedingt - auch noch 10-180 (ig/ml Nebramycin-4 angereichert. Aus der Kultur wird Nebramycin-5' in einem einzigen chromatographischen Schritt von Nebramycin-4 und von anderen Verunreinigungen getrennt, in an sich bekannter Weise in Tobramycin umgesetzt, und das Tobramycin isoliert.
Der Mikroorganismus wird vorteilhaft in einem Nährmedium, das organische Kohenstoffquellen, z.B. Stärke, Glyzerin, Fruktose und ähnliche Verbindungen, vorzugsweise Glucose, organische Stickstoffquellen, z.B. Erdnussmehl, Maisbrei, Pepton, Hefeextrakt oder ähnliche Präparate, vorzugsweise Sojamehl, Kasein, Aminosäuren, insbesondere Glutaminsäure, anorganische Stickstoffquellen, vorzugsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumsulfat, anorganische Salze, vorzugsweise Magnesiumsulfat, Zinksulfat, Kobaltnitrat und Kalciumkarbonat, tierische und/oder pflanzliche Fette und/oder Öle, z.B. Palmöl, Leinöl, Sonnenblumenöl, Rapsöl, Schweinefett oder andere Fette, vorzugsweise Palmöl und Leinöl im Gewichtsverhältnis von 1:1, sowie für die Züchtung essentielle Spurenelemente enthält, in submerser, belüfteter Kultur, in einem die Züchtung des Mikroorganismus fördernder Temperaturbereich, vorzugsweise zwischen 33°C und 40°C, so lange gezüchtet, bis sich in der Kulturbrühe signifikante Mengen des Antibiotikums anreichern. Das Antibiotikum wird mit an sich bekannten Methoden isoliert.
Die Spurenelemente sind in den Bestandteilen des Nährmediums meistens als Verunreinigungen enthalten, können aber auch separat zugefügt werden.
Die Menge der zur Züchtung zugeführten Luft wird der Zusammensetzung des Nährmediums und den technischen Daten des Fermentors entsprechend gewählt. Im allgemeinen ist es günstig, die Sauerstoffversorgung der Zellen so zu gestalten, dass im austretenden Gasgemisch die CCh-Kon-zentration 1.0% nicht überschreitet, ferner, dass der reduzierende Zuckergehalt des Nährmediums zwischen der 96. und 110. Stunde der Fermentation verbraucht wird.
Die Nährböden werden 30 bis 60 Minuten lang bei 121 bis 123°C mit Dampf sterilisiert. Vor dem Sterilisieren wird ihr pH-Wert zweckmässig auf 7,2 bis 7,4 eingestellt.
Bei der Fermentation sind keine Zusätze zur Unterdrük-kung der Schaumbildung erforderlich, da das Nährmedium als Nährstoffquelle pflanzliche und/oder tierische Fette und/ oder Öle enthält, die gleichzeitig auch die Schaumbildung hemmen.
Die Züchtung kann sowohl in Schüttelkolben wie in Laboratoriums-, Kleinbetriebs- und Grossbetriebsfermentoren durchgeführt werden.
Die Antibiotikumkomponente-Zusammensetzung der Kulturen wird durch Dünnschichtchromatographie und anschliessende Bioautographie bestimmt. Auf Silicagel (Merck, Darmstadt) Dünnschichtplatten werden 0,1 bis 0,5 Ltg/ml des Antibiotikumkomplexes aufgetragen, und die Platten in System Äthanol-Methyläthylketon-25% Ammoni-5 umhydroxid 1:1:1 entwickelt. Nach vollständigem Trocknen wir ein mit Bacillus subtilis ATCC 6633 beimpfter Nährboden auf die Platte geschichtet und bei 37°C 16 Stunden lang bebrütet. Die Grösse der entstandenen Hemmungszonen wird mit denen des Standards verglichen. Diese io Bestimmung ist sowohl für qualitative wie auch für quantitative Wertung geeignet, Genaugikeit ± 10%.
Der Hauptvorteil des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass mit dem praktisch ein einziges Antibiotikum produzierenden Streptomyces-tenebrarius-MNG-204-15 Stamm höhere Produktion erzielt werden kann als mit dem früheren Verfahren. Weitere Stammveredelungs-Versuche versprechen schnelle Ergebnisse, da in diesem Fall die ganze biosynthetische Kapazität der Zelle für die Produktion eines einzigen Antibiotikums eingesetzt ist. Die biologische Akti-20 vitätsbestimmung von Kulturbrühen, die eine einzige Antibiotikumkomponente enthalten, verläuft schnell, einfach und exakt, das Isolieren des Wirkstoffes benötigt keine kostspieligen Reinigungsprozeduren.
Die Erfindung wird an Hand des nachstehenden Beispiels 25 näher erläutert, ohne den Schutzumfang auf dieses Beispiel einzuschränken.
Beispiel a) Herstellung von Nebramycin-5' enthaltenden Kultur-30 brühen in Laboratoriumsfermentoren.
Mit den Sporen oder der vegetativen Kultur von Streptomyces tenebrarius MNG 204 werden mit destillierten Wasser bereitete Schrägagare der folgenden Zusammensetzung beimpft:
Dextrin Hefeextrakt
Kasein-hydrolysat (10%ig)* Fleischextrakt 40 Kobaltdichlorid-hexahydrat Agar
* enzymatisch hydrolysiert
1,0%
0,1%
2,0%
0,1%
0,001%
2,5%
Der pH-Wert des Nährbodens wird vor dem Sterilisieren 4s mit Natriumhydroxid auf 7,2 eingestellt und dann wird der Nährboden 20 Minuten lang bei 121°C sterilisiert.
Die Kulturen werden 4 Tage lang bei 37°C bebrütet. Dann werden die Sporen mit sterilem, destilliertem Wasser von der Oberfläche des Nährbodens abgetrennt, und mit der erhaltenen Sporensuspension werden dann 2 x 100 ml, in 500 ml Erlenmeyer Kolben sterilisierte, mit Leitungswasser bereitete Inokulum-Nährmedien der folgenden Zusammensetzung beimpft:
so
55
Sojamehl
2,0% 3,0% 0,1% 0,3% 0,3% 0,5%
Kasein-hydrolysat (10%ig)*
Ammoniumnitrat Ammoniumchlorid Kalciumkarbonat 60 Magnesiumsulfat-heptahydrat Gemisch von Palmöl und Leinöl im Gewichtsverhältnis von 1 :1 3,0%
Glucose (als 50%ige Lösung getrennt sterilisiert) 2,0%
* enzymatisch hydrolysiert
65
Der pH-Wert des Nährmediums wird mit einer Natriumhydroxid Lösung auf 7,2 eingestellt, dann wird es 20 Minuten lang bei 121 °C in einem Autoklaven sterilisiert.
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4
Die Züchtung wird auf einem Schütteltisch mit einer Frequenz von 280 Minuten und einer Amplitude von 2,4 cm 14 bis 18 Stunden lang bei 37°C vorgenommen.
Mit 200 ml dieses reifen Inokulums werden 5 Liter des mit Leitungswasser bereiteten, 45 Minuten lang bei 121 °C in einem Laboratoriumsfermentor (Arbeitsvolumen 10 Liter) sterilisierten Hauptfermentations-Mediums folgender Zusammensetzung beimpft :
Sojamehl 3,0%
Kasein-hydrolysat ( 10%ig)* 5,0%
Ammoniumnitrat 0,1 %
Ammoniumchlorid 0,5%
L-Glutaminsäure 0,8%
Kalciumkarbonat 0,5%
Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,5%
Kobaltdinitrat-hexahydrat 0.001 % Gemisch von Palmöl und Leinöl im Gewichtsverhältnis 1 :1 3,0%
Glucose (als 50%ige Lösung getrennt sterilisiert) 4,2%
* enzymatisch hydrolysiert
Der pH-Wert des Nährmediums wird vor dem Sterilisieren mit wässrigem Ammoniumhydroxid auf 7,2 eingestellt.
Die Fermentation selbst wird bei 37°C, bei einer Rührerdrehzahl von 360/Minute und steriler Luftzufuhr von 3 Liter/Minute durchgeführt.
Nach 144 Stunden enthält 100 ml der Kulturbrühe neben 9 mg von Nebramycin-4 260 mg von Nebramycin-5'. Kein Nebramycin-2 ist nachweisbar.
Als Hauptfermentationsmedium können auch Nährmedien unterschiedlicher Zusammensetzung eingesetzt werden. So kann man gemäss a) vorgehen, mit dem Unterschied, dass ein Hauptfermentationsmedium folgender Zusammensetzung benützt wird :
Sojamehl 3,3%
Ammoniumchlorid 0,6%
Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,7%
Kalciumkarbonat 0,5%
Kobaltdinitrat-hexahydrat 0,001 %
Palmöl 2,5% Glucose (als 50%ige Lösung getrennt sterilisiert)* 2,1 %
* Von der Geometrie und Bestandteilen des für die Züchtung benützten Fermentors abhängig kann die Glucose-Konzentration im Nährmedium bis zu 4,0°î> erhöht werden.
Nach 144 Stunden enthält 100 ml der Kulturbrühe neben wenig Nebramycin-4 (höchstens 3 mg) 180 mg von Nebramycin-5' . Kein Nebramycin-2 ist nachweisbar.
b) Herstellung von Nebramycin-5' enthaltenden Kulturbrühen in Betriebsfermentoren von 1000 Liter.
Für die Herstellung von Kulturbrühen, die grosse Mengen von Nebramycin-5' enthalten, wird gemäss a) vorgegangen. Mit den Sporen oder vegetativem Mycel des Streptomyces-tenebrarius-MNG-204-Stammes werden 100 ml des Inokulum-Nährmediums beimpft und der Mikroorganismus gezüchtet. Nach 14 bis 18 Stunden werden mit dieser Kultur 100 Liter des Inokulum-Mediums beimpft und bei 37°C, einer Luftzufuhr von 100 Liter/Minute und Rührerdrehzahl von 360/Minute gezüchtet. Nach 16 Stunden werden mit 50 Liter dieses Inokulums 1000 Liter des Hauptfermentationsmediums der in a) festgesetzten Zusammensetzung in einem rostfreien Fermentor beimpft. Die Fermentation wird bei einer Luftzufuhr von 500 Liter/Minute, einer Rührerdrehzahl von 200/Minute bei 37°C durchgeführt. Die Antibiotikum-Zusammensetzung während der Fermentation ist in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2
Fermentationszeit in Stunden
Nebramycin-Komponente in [ig/ml 2 4
5'
24
0
0
50
48
0
0
400
72
0
5
1200
96
0
30
1740
120
0
40
2320
144
0
60
2650
c) Decarbamoylierung von Nebramycin-5' und Isolieren von Tobramycin.
Zu 3 Liter Kulturbrühe, die 2600 ng/ml Nebramycin-5' und 90 (ig/ml Nebramycin-4 enthält, werden 22 g Natriumhydroxid zugefügt. Die Kulturbrühe wird unter Rühren bis 90-100°C erhitzt und 25 Minuten lang an dieser Temperatur gehalten. Nach beendeter Reaktion wird das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und sein pH-Wert mit 50%iger Schwefesäure auf 2,0 eingestellt. Dieser sauren Kulturbrühe werden bei ständigem Rühren 2,0 g Oxalsäure zugefügt, ihr pH-Wert mit einer konzentrierten Ammoniumhydroxid-Lösung auf 7,0 eingestellt, und 30 Minuten lang gerührt. Nachfolgend wird filtriert und das Mycel mit 2 x 600 ml Wasser gewaschen. Filtrat und Waschlösung werden vereinigt und an einer, aus 20 ml Amberlite CG-50 (NH4+) (Rohm und Haas, Co., Philadelphia, USA) bereiteten Kolonne chromatographiert. Die Kolonne wird mit 400 ml ionenfreiem Wasser gewaschen und nachfolgend der Reihe nach mit 1000 ml 0,05 N, 2000 ml 0,1 N, und 3000 ml 0,15 N Ammoniumhydroxid in Fraktionen von je 250 ml eluiert. Die Tobramycin enthaltenden Fraktionen (13 bis 18) werden vereinigt, ihr pH-Wert mit 50%iger Schwefelsäure auf 7,0 gestellt, und an 120 ml Amberlite CG-50 (NHt+) chromatographiert. Der Ionenaustauscher wird mit 200 ml ionenfreiem Wasser gewaschen, und das Antibiotikum nachfolgend der Reihe nach mit 1000 ml 0.05 N, 2000 ml 0.1 N, 2000 ml 0.15 N und am Ende mit 2000 ml 0.2 N Ammoniumhydroxid in Fraktionen von je 60 ml eluiert. Fraktionen 45 bis 46 werden vereinigt und bei vermindertem Druck eingedampft. Der Destillationsrückstand wird über Phosphorpent-oxid getrocknet und enthält 0,7 g (70%) Kanamycin B, 12% Komponente N-13 (6'-N-Carbamoyl-tobramycin), 10% unbekannte Komponente und 8% Tobramycin. Beim Eindampfen von Fraktionen 57 bis 58 wird ein Destillationsrückstand, der 60% Tobramycin, nahe 40% Kanamycin B und 0,1 bis 0,2% Komponente N-13 enthält, gewonnen. Das Eindampfen von Fraktionen 59 bis 69 führt zu einem Tobramycin Präparat (5,7 g), das 0,1 bis 0,15% Komponente N-13 enthält. Beim Umkristallisieren dieses Rohproduktes aus 96%igem Äthanol werden 4,2 g reines Tobramycin gewonnen.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
B

Claims (4)

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1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Kulturbrühen, die ausschliesslich Nebramycin-5' enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass für die Produktion der Kulturbrühen Streptomyces tenebrarius MNG 204 eingesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Sporen oder das vegetative Mycel des ausschliesslich Nebramycin-5' produzierenden Streptomyees-tenebrarius-Stammes MNG 204 verwendet.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass mit einem Nährmedium, das als organische Kohlenstoffquelle Stärke, Glyzerin, Fruktose, vorzugsweise Glucose, und als organische Stickstoffquelle Erd-nussmehl, Maisbrei, Pepton, Hefeextrakt, vorzugsweise Sojamehl oder Kasein, Aminosäuren, insbesondere Glutaminsäure, enthält, gearbeitet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung des Mikroorganismus bei einer Temperatur von 37°C durchgeführt wird.
CH7558/82A 1981-12-28 1982-12-27 Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von nebramycin-5'. CH657374A5 (de)

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