FI74995B - Foerfarande foer mikrobiologisk framstaellning av fermenteringsmedia, som innehaoller antingen nebramycin-5' eller en blandning av nebramycin-2, nebramycin-4 och nebramycin-5'. - Google Patents

Description

74995

Menetelmä sellaisten käymislienten mikrobiologiseksi valmistamiseksi, jotka sisältävät joko nebramysiini-5':a tai nebramysiini-2:n, nebramysiini-4:n ja nebramysiini-5n seosta 5 Tämä keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 johdannon mukaista mikrobiologista menetelmää sellaisten käymislienten valmistamiseksi, jotka sisältävät joko käytännöllisesti katsoen pelkkää nebramysiini-5' tai antibioottiseosta, jossa on TO ennalta määrätyssä suhteessa nebramysiini-2:ta, nebra-mysiini-4:ää ja nebramysiini-5a.

On tunnettua, että Streptomyces tenebrarius tuottaa biosynteettisenä aineenvaihduntatuotteena nebramysiiniä, joka on useiden antibioottien mutkikas seos, (Stark, Hoehn 15 ja Knox, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1967, s.

314, GB-patenttijulkaisu 1 178 489 ja US-patenttijulkaisu : · : 3 69 1 279 ). Antibioottiseos sisältää useiden vähäisempien aineosiensa lisäksi seuraavat pääaineosat: nebramysiini-2 ( apramy siini ), nebramy siini-4 (6''-0-karbamoyyli-kanamysiini 20 B) ja nebramysiini-5' (6"-0-karbamoyyli-tobramysiini) [Koch, ·_ : Davis ja Rhoades, J. Antibiotics 2& (1973), 7453. US- ! patenttijulkaisussa 3 853 709 selostetaan mikro-organismia, joka tuottaa nebramysiini-7:ää nebramysiini-2:n lisäksi. US-patenttijulkaisun -4 032 404 japanilaiset keksijät tuotta-25 vat samanaikaisesti nebramysiini-2:ta, ja nebramysiini-5':a viljelemällä Streptoalloteichus hindustanusta. HU-patentin : '· 176 103 mukaan Streptomyces tenebrarius MNG 169 ja 170 pin- : : : nanalaisesti, ilmastetuissa olosuhteissa viljeltyinä tuotta- . ... vat käymisliemiä , jotka sisältävät joko nebramy siini-2 : ta , 30 nebramysiini-5': a ja nebramy siini-4: ää tai vastaavasti nebramy siini-2 : ta ja nebramysiini-5 1 : a, Nämä antibiootit eristetään 74995 HU- patenttijulkaisun 17^· 315 mukaisesti.

Nebramysiini-2 estää kasveille ja eläimille patogeenisten mikro—organismien kasvua (U.S.A:n patenttijulkaisut i 3 691 279, 3 853 709 ja 3 876 763), kun taas 5 kanamysiini B, joka saadaan hydrolysoimalla nebramysii— ni-U , ja tobramysiini (Brulamycin), joka saadaan hydrolysoimalla nebramysiini-51, ovat laajaspektrisiä antibiootteja, joilla on tärkeä merkitys hoidettaessa ihmisellä esiintyviä polyresistenttien bakteerien aiheut-10 tamia tartuntasairauksia (esim. Preston ja Wick, Anti microbial Agents and Chemotherapy 1970, s. 322).

Noudattamalla HU-patentin 176 103 mukaista menetelmää, saadaan koostumukseltaan seuraava antibioottiseos (taulukko 1): 15

Taulukko 1 kanta nebramysiini-2 nebramysiini-U nebramysiini-5' * !' prosenttia 20 MNG 169+ 77 2 21 ,· MNG 170++ 91 pieni määrä 9 +Taltioitu 28. joulukuuta 1977 kokoelmaan The National Collection of Microorganisms, National Institute for Public Helth, Budapest, ja saatavissa 28. helmikuuta 25 1980 lähtien.

+ + Taltioitu 5· huhtikuuta 1978 samaan kokoelmaan ja ’ saatavissa 28. helmikuuta 19Ö0 lähtien.

: On ilmeistä, että nebramysiini-2 on kummankin kan- . nan päätuote biosynteesissä, kun taas nebramysiini-5' , 30 pitää erottaa muista vallitsevista komponenteista erittäin monimutkaisilla ja kalliilla toimenpiteillä.

Mikro-organismin syntetisoiman antibiottiseoksen koostumus määräytyy ensisijaisesti solun sisältämän geneettisen informaation perusteella ja vain pienessä •55 määrin käymisolosuhteiden perusteella.

Tähän asti tunnetuissa menetelmissä ei voida muun- 3 74995 taa käymisliemen sisältämien aineosien määräsuhtei- ta todellisia kaupallisia vaatimuksia vastaaviksi. Lisäksi, jos halutaan saada aikaan nebramysiini-51:a, on se erotettava vallitsevasta nebramysiini-2:sta 5 erittäin kalliilla toimenpiteillä. Tällaisten monta aineosaa sisältävien systeemien kohdalla on hyvin työlästä ja aikaavievää yrittää kohottaa tuottavuutta etsimällä ja valitsemalla sopivia kantoja. Tällöin aineosat erotetaan toisistaan ohutkerroskromatografi-10 sesti ja kvantifioidaan biologisilla määritysmenetel millä. Olisi edullista suorittaa nämä kantojen valinnat yhden aineosan systeemeillä, jolloin on mahdollista käyttää yksinkertaisia määritysmenetelmiä. Lisäksi tuottavuuden kohottaminen sellaisella kannalla, joka biosynte-15 tisoi vain yhtä antibioottia, on lupaavampaa, koska tässä tapauksessa solut voivat käyttää koko biosynteettistä kapasiteettiansa yhden ainoan yhdisteen tuottamiseen.

Tämän keksinnön tarkoituksena on kehittää uusi ja yksinkertainen käymismenetelmä, jolla voidaan valmis-20 taa sellaisia käymisliemiä, jotka sisältävät joko yksin omaan nebramysiini-51:a tai nebramysiini-2:n ja nebra-raysiini-5':n seosta missä tahansa halutussa ennalta määrätyssä suhteessa.

Kokeita tehdessämme havaitsimme yllättäen, että 25 etidiumbromidilla (2,7-diamino-10-etyyli-fenyyli- fenantridiniumbromidi) käsitelty Streptomyces tenebrarius MNG 169 tuottaa mutanttikannan, joka ei syntetisoi nebramysiini-2:ta, mutta tuottaa nebramy-siini-5':a pääkomponenttina sekä hyvin pienen määrän 30 nebramysiini-L:ää. Tämä ilmiö on melko odottamaton ja yllättävä, sillä tähän mennessä etidiumbromidia ei ole käytetty mutageenisenä aineena lainkaan.

Sellaisen mutantin eristämiseksi, joka bio-syntetisoi antibioottiseosta, jonka aineosien suhde on 35 muuttunut, Streptomyces tenebrarius MNG l69~kannan iti- 11 74995 öitä kasvatettiin nestemäisessä ravinnealustassa.

Viljelmä jaettiin viiteen osaan, joihin lisättiin 0, 0,05, 0,5, 5,0 ja 50,0 pg/ml etidiumbromidia vastaavasti. Viljelyä jatkettiin 24 tuntia ja sen jäl-5 keen osa kustakin viljelmästä laimennettiin ja levi tettiin agarlevyille ja toisella osalla siirrostettiin nestemäinen ravinnealusta, jossa oli sama määrä etidiumbromidia ja viljelyä jatkettiin vielä 2U tuntia.

Sitten edelläkuvattu levyille levittäminen ja siir-10 rostaminen toistettiin. Saadut uudet viljelmät levi tettiin levyille toistuvasti 2k tunnin välein ja inkuboitiin, joitakin erillisiä pesäkkeitä eristettiin ja niiden tuottokyky tutkittiin esimerkeissä kuvatuilla menetelmillä.

15 Useista sadoista eristetyistä mutanteista, jotka polveutuivat Streptomyces tenebrarius MNG 1 69-kannasta, -- - kaksi oli sellaista, jotka eivät tuottaneet lainkaan ! nebramysiini-2:ta, mutta sen sijaan tuottivat suhteel- ' ; lisen pieniä määriä nebramysiini-5*:a ja hyvin pieniä · 20 määriä nebramysiini-4:ää. Näiden kahden nebramysiini-5a tuottavan mutantin tuottokyvyn parantamiseksi suoritet-- " tiin kannan valintaa ja ravinneliuosten optimointiko- keitä. Kokeiden kuluessa yksi näistä mutanteista menetettiin, kun taas toisen tuottokyky kohosi viisin-25 kertaiseksi ja voitiin pitää tällä tasolla. Tämä kanta taltioitiin 2. syyskuuta 1981 The National Collection of Microorganisms-kokoelmiin (National Institute for Public Helth, Budapest, Hungary), jossa sille annettiin numero MNG 20h.

’·*·· 30 Seuraavissa taulukoissa on esitetty tiedot Streptomy ces tenebrarius-kantojen MNG 169» MNG 170 ja MNG 204 yleisistä ja biokemiallisista ominaispiirteistä, hiilen hyväksikäytön spektristä, nitraatin hyväksikäytöstä, natriumkloridi-toleranssista, antibioottiherkkyydestä sekä kantojen viljely-33 ominaispiirteistä.

Il 74995

Taulukko 2. Streptomyce3 tenebrariue-kantojen MNG 169, MNG 170 ja MNG 204 yleiset ja biokemialliset ominaispiirteet MNG 169 MNG 170 MNG 204 5 --------------------------------------------------- ITIÖPESÄKE haarautuva, erittäin haarautuva, kierteinen, vähäistä kierteinen, 30 - 60 itiöity- 30 - 60 itiötä inistä itiötä 10

Liukenevan punainen ruskean- punainen, aineksen väri punainen ruskean punainen 15 ---------------------------------------------------- : Kasvu-ρΗ yli pH 5,0 ja alle pH 8,6

Optimaalisen kasvun 37 - 50°C

lämpötila 20 -----------------------------------------------

Melaniinin muodostuminen negatiivinen

Antibiootti- nebramy- nebramy- nebramy- 25 tuotanto siini siini siini-5» kompleksi kompleksi

Itiöityminen valossa negatiivinen 30 -------------------------------------------------- 6 74995

Taulukko 2 ( Jatk.):

Hiilen hyväksikäytän spektri

Sokeri MNG 169 MNG 170 j^NG 204 5 Glukoosi +++ +++ +++

Selluloosa - Tärkkelys +++ +++ +++

Glyseriini +++ +++ +++

Laktoosi ± ± * 10 Melibioosi -

Salisiini ± ± ±

Trehaloosi +++ +++ +++

Arabinoosi - - _

Dulsiitti - - _ 15 Fruktoosi +++ +++ +++

Inosiitti +++ +++ ++ +

Manniitti -

Raffinoosi -

Rhamnoosi - 20 Sakkaroosi t ± ±

Ksyloosi -

Adoniitti +++ +++ +++

Merkinnät: +++ = melko hyvä hyväksikäyttö, + = huono hyväksikäyttö, 25 ± = kyseenalainen hyväksikäyttö, - = ei hyväksikäyttöä

Nitraatin positii- positii- positii- *‘' · hyväksikäyttö vinen vinen vinen . NaCl-toleranssi 4 % 4 % i| (

Antibiootti- Vastustuskykyinen aminoglykosidityyppisiä anti-30 herkkyys biootteja vastaan

II

7 74995

Taulukko 3. Kantojen MNG 169. 170 ,1a 20U vlljelyominaia.

piirteet

Agari Alustahuovasto Ilmahuovasto 5 Czapek agari huono kasvu, keller- huonosti kehitty- tävä-punertava huo- nyt, huono itiöi- vasto, vaalean punai- tyminen aines liukenee

Epäorgaaninen kohtalainen-hyvä huonosti - kohtalo suola-agari kasvu, kellertävän laisesti kehitty- ruskea väri, likene- nyt, hyvä itiöi- van aineksen väri: tyminen nahkanruskea : Bennett agari hyvin kehittynyt kohtalaisesti - 15 alustahuovasto, hyvin kehittynyt vaalean keltainen ilmahuovasto, ei liukenevaa hyvä - kohtalai- ;· ainesta nen itiöityminen

Glukoosi - kohtalainen kasvu, harmaankeltainen, 20 asparagiini vaaleankeltainen kohtalainen iti- huovasto, tuskin öityminen lainkaan liukenevaa värillistä ainesta

Ca-mallas-agari kohtalaisesti - kohtalaisesti 25 hyvin kehittynyt, kehittynyt ilma- harmaanpunertavan huovasto, vaaleanruskean värinen punainen keller- alustahuovasto, tävä väri, koh- värillinen aines talainen itiöi- 30 liukenee, väri: tyminen ruskeanpunertava 74995 Tämä keksintö koskee menetelmää sellaisten käymislien-ten valmistamiseksi, jotka sisältävät nebramysiini-2:ta ja nebramysiini-5':a missä tahansa ennalta määrätyssä suhteessa, jonka menetelmän mukaan sekoitetaan halutussa suhteessa 5 keskenään alkuperäisen Streptomyces tenebrarius MNG 169- kannan Ja uuden Streptomyces tenebrarius MNG 20^-kannan itiöitä tai vegetatiivista huovastoa ja sen jälkeen viljellään niitä sekaviljelmänä. Sen käymisen kuluessa, joka suoritetaan kumpaakin kantaa sisältävällä sekaviljelmällä, 10 syntyy yllättäen suurempia antibioottimääriä kuin kantoja erikseen viljelemällä saatuihin käymisliemiin.

Edellä kuvatun perusteella tämä keksintö koskee menetelmää sellaisten käymislienten valmistamiseksi, jotka sisältävät joko nebramysiini-5':a tai antibioottiseosta, 15 jossa on ennalta määrätyssä suhteessa 0,5 - 77 t nebramysii- ni-2:ta, 2,7 - 8,6 % nebramysiini-4:ää ja 20 - 95 % nebramy siini-5 ' a. Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti a) sellaisten käymislienten valmistamiseksi, jotka sisältävät nebramysiini-5a, Streptomyces tenebrarius-lajin --· 20 uutta MNG 20iJ-kantaa, tai b) sellaisten käymislienten valmistamiseksi, jotka sisältävät ennalta määrätyssä suhteessa 0,5 - 77 % nebramy siini-2 : ta , 2,7 - 8,6 % nebramysiini-M:ää ja 20 - 95 % nebramysiini-5a, Streptomyces tenebrarius MNG 169-kannan 25 ja uuden Streptomyces tenebrarius MNG 204-kannan itiöitä tai vegetatiivista huovastoa, jotka on sekoitettu keskenään suhteessa 100:1 - 1:100, viljellään orgaanisia hiili- ja typpilähteitä, epäorgaanisia suoloja, hivenaineita ja eläimistä ja/tai kasveista peräisin 30 olevia öljyjä ja/tai rasvoja sisältävässä kasvualustassa pinnanalaisviljelmänä ilmastettuna 33 - 40°C:ssa, sopivimmin 37 °C:ssa.

Tämän keksinnön mukaisen edullisen menetelmän mukaisesti suoritetaan sellaisten käymislienten valmistus, jotka 35 sisältävät nebramysiini-5’:a ja hyvin pienen määrä nebramy siini-4:ää, siten, että viljellään Streptomyces tenebrarius MNG 204-kantaa. Käymisen

II

9 74995 aikana kertyy käymisliemeen viljelyolosuhteista riippuen 10 - 180 yg/ml nebramysiini-h:ää ja 2100 - 2600 yg/ral nebramysiini-5':a. Nebramysiini-5' erotetaan käymisliemestä ja nebramysiini-k ja erilaiset epä-5 puhtaudet poistetaan yhdellä ainoalla kromatografisella erotuksella ja sen jälkeen nebramysiini-5' hydrolysoidaan tobramysiiniksi sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Haluttaessa voidaan nebramysiini-5' muuntaa tobramysiiniksi jo viljelmässä ja erottaa siitä.

10 Vielä erään tämän keksinnön mukaisen menetelmän edullisen toteutustavan mukaan, valmistetaan sellaisia käymisliemiä, jotka sisältävät nebramysiini-2:n ja nebramysiini-5':n seosta missä tahansa ennalta määrätyssä suhteessa sekä nebramysiini-U:ää, siten, että .. . 15 Streptomyces tenebrarius MNG l69:n ja Streptomyces tenebrarius MNG 20U:n itiöitä tai vegetatiivista huovas-"* · toa sekoitetaan keskenään tarvittavassa suhteessa ja sekaviljelmää viljellään. Muodostuneet antibiootit erotetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä, mielellään HU-patentin 17^ 315 mukaisesti. Biosyn-tetisoituneiden nebramysiini-2:n ja nebramysiini-5':n määrällinen suhde, on lähes verrannollinen Streptomyces tenebrarius MNG 169” ja MNG 20U-kantojen solujen lukumäärään, kun ne lisätään identtisessä kasvuvaiheessa.

25 Jokaiselle alan perustietämyksen omaavalle on ·. selvää, että edellä selostettu tilanne toteutuu vain sellaisissa käymissysteemeissä, joissa keskenään sekoitetut solulajit kasvavat ja jakaantuvat lähes identtisellä nopeudella, ja joissa käymisolosuhteet '30 ovat edulliset molempien aineosien biosynteesille. Muu ten suhde saattaa siirtyä jompaan kumpaan suuntaan. Asiantuntijalle ei seossuhteen määrittäminen voi tuottaa minkäänlaisia vaikeuksia.

Tämän keksinnön mukaisesti viljellään mikro-35 organismeja kasvualustassa, joka sisältää orgaanisen 10 74995 hiililähteen, kuten tärkkelystä, glyserolia, fruktoosia ja/ tai muita vastaavia yhdisteitä, mielellään glukoosia; orgaanisen typpilähteen, kuten pähkinäjauhoa, maissin-1iuotusvettä, peptonia, hiivauutetta ja/tai' muita vastaa-5 via valmisteita, mielellään soijajauhoa , kase iin ia ja/tai aminohappoja, mielellään glutamiinihappoa; epäorgaanisen typpilähteen, mielellään ammoniumkloridia, ammo-niumnitraattia ja/tai ammoniumsulfaattia: epäorgaanisia suoloja, mielellään magnesiumsulfaattia, 10 sinkkisulfaattia, kobolttinitraattia ja/tai kalsium karbonaattia; eläimistä ja/tai kasveista peräisin olevia rasvoja ja/tai öljyjä, kuten palmuöljyä, pellavan-siemenöljyä, auringonkukkaöljyä , rapsiöljyä, sianrasvaa tms., mielellään palmuöljyn ja pellävansieraen-15 öljyn 1:1-seoksena; ja lisäksi mikroorganisraien kas vulle välttämättömiä hivenaineita, ja viljely tapahtuu ilmastettuna pinnanalaiskasvatuksena mikro-organismin kasvun takaavassa lämpötilassa, mielellään 33 - U0 °C:ssa, _ niin kauan, että varteenotettava määrä antibiootteja "20 on kertynyt. Antibiootit erotetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä.

Hivenaineet voivat joko olla läsnä muiden ravinteiden sisältämänä epäpuhtauksina tai ne voidaan lisätä ravinnealustaan erikseen.

25 Ilman virtauksen voimakkuutta säädellään väliaineen koostumuksen, sekoittimen suorituskyvyn ja fermentorin muiden teknisten ominaisuuksien mukaan. Hapen syöttöä on tavallisesti edullista säädellä siten, että voidaan : : : varmistaa poistuvan kaasuseoksen CO^-pitoisuuden pysymi- :"*30 nen alle 1,0 prosentissa, ja että pelkistävä sokeri . tulee kuluneeksi kasvualustasta loppuun 96. ja 110. tunnin välisenä aikana.

Käymisen aikana ei lisätä mitään vaahdonestoainet-ta, koska kasvualustaan lisätyt eläimistä ja/tai kasveis-35 ta peräisin olevat öljyt ja/tai rasvat estävät viljel män vaahtoamisen.

11 74995

Itse viljely voidaan suorittaa ravistelupullois-sa, laboratorio-, pilot-plant- tai teollisuusfermento-reissä.

Viljelmien sisältämät antibioottiseokset erote-5 taan komponentteihinsa ohutkerroskromatografisesti sili- kageelillä ja määritetään bioautografisesti. Silika-geeliohutkerroslevyille (Merck, Darmstadt) laitetaan pisteinä antibioottiliuoksia,jotka sisältävät antibiootti s eo sta 0,1 - 0,5 yg/ml, ja suoritetaan kromatogra-10 finen erotus käyttämällä eluenttina etanoli-metyy1ietyy1ike- toni-(25$)ammoniumhydroksidi-seosta (1:1:1), Perusteellisen kuivauksen jälkeen levyn pinnalle levitetään kasvuliuosta, joka sisältää Bacillus substilis ATCC 6633-kantaa, ja inkuboidaan '[6 tuntia 37 °C:ssa. Sitten 15 niiden vyöhykkeiden kokoa, joissa kasvu on estynyt, ver rataan tunnettuihin kokoihin. Tällä tavalla voidaan suo-: · : rittaa kvalitatiivinen ja kvantitatiivinen määritys ;V: —10 % standardipoikkeamana.

Keksinnönmukaisen menetelmän pääedut ovat seuraavat: .:.^0 Streptomyces tenebrarius MNG 20^, joka tuottaa vain yhtä antibioottilaatua, saa aikaan korkeampia antibiootti-pitoisuuksia kuin aikaisempi emokantansa. Lisäksi tällä uudella kannalla tehty valintatyöskentely lupaa nopeita tuloksia, koska tämä kanta saattaa olla vapaa käyttämään koko biosynteettistä kapasiteettiaan yhden ainoan antibioottiaineosan muodostamiseen. Näiden yhden ainoan antibioottiaineosan sisältävien käymislien-ten biologinen määritys on nopeata, yksinkertaista ja tarkkaa eikä antibiootin erottaminen vaadi kalliita puhdistustoimenpiteitä. Kun kahden eri kannan soluja viljellään sekaisin sekavil jelmänä, voidaan tuottaa sellaisia käymisliemiä, jotka sisältävät nebramysiini-2:ta ja nebramysiini-51:a missä tahansa ennalta määrätyssä seossuhteessa todellisia kaupallisia ja taloudellisia 35 vaatimuksia vastaavasti. Lisäetuna voidaan vielä mai nita se, että tämän sekakäymisen aikana ei kumpikaan 12 74995 kanta menetä tuottavuuttaan oleellisessa määrin ja kumpikin syntetisoi kaikenkaikkiaan suurempia antibiotti-määriä.

Keksintöä valaistaan, seuraa-5 villa esimerkeillä.

Esimerkki 1 a) Nebramysiini-5':a sisältävien käymislienten valmistaminen laboratoriofermentoreissa 10

Agarvinopinnat valmistetaan käyttämällä tislattua vettä ja ne sisälsivät seuraavat aineosat

dekstriiniä 1,0 JS

hiivauutetta 0,1 % kaseiinihydrolysaattia (10 %)+ 2,0 % lihauutetta 0,1 % kobolttidikloridiheksahydraattia 0,001 % agaria 2,5 % +entsymaattisesti hydrolysoitu •'•20 ja niihin siirrostetaan Streptomyces tenebrarius MNG 20U-kannan itiöitä tai vegetatiivista huovastoa. Kasvualustan pH säädetään natriumhydroksidin vesiliuoksella arvoon 7,2 ja sen jälkeen sitä steriloidaan 20 minuut-2 t ia 121 °C : ssa.

Viljelmiä inkuboidaan 1+ vuorokautta 37 °C:ssa, sitten itiöt huuhdellaan pois pinnasta steriilillä tisla-V; tulla vedellä ja saatua itiösuspensiota siirrostetaan siirrostusalustoihin (2 x 100 ml), jotka on valmistet-*" 2o tu 5°® ml:n Erlenmeyer-kolveihin vesijohtovettä käyttä mällä. Siirrostusalustan koostumus on seuraava: " soijajauhoa 2,0 % kaseiinihydrolysaattia (10 %)+ 3,0 % ammoniumnitraattia 0,1 % 35 ammoniumkloridia 0,3 % kalsiumkarbonaattia 0,3 % magnesiumsulfaattiheptahydraattia 0,5 %

II

13 74995 1:1 seos palmuöljyä ja peliä- 0,5 % vansiemenöljyä glukoosia (steriloidaan erikseen 2,0 % 50 % liuoksena) + entsymaattise sti hydrolysoitu

Kasvualustan pH säädetään natriumhydroksidin vesi-liuoksella arvoon 7,2 ja sen jälkeen steriloidaan 20 minuuttia 121 °C:ssa paineastiassa.

Siirrostettuja viljelmiä kasvatetaan 1U — 18 tuntia 10 37 °C:ssa kiertoravistelulaitteessa (halkaisija 2,h cm, nopeus 280 1/min).

200 ml tätä kehittynyttä siirrostetta siirroste- taan laboratoriöfermentoriin, jonka työskenbelytilavuus on 10 litraa, ja joka sisältää 5 1 pääkäymisalustaa, joka 15 on valmistettu vesijohtoveteen, steriloitu 1+5 minuuttia 121 °C:ssa ja koostumukseltaan seuraava: : ' soijajauhoa 3,0 % kaseiinihydrolysaattia ( 10 %)* 5,0 % ammoniumnitraattia 0,1 % 7 20 ammoniumkloridia 0,5 % L-glutamiinihappoa 0,8 % kalsiumkarbonaattia 0,5 % magnesiumsulfaattiheptahydraattia 0,5 % kobolttidinitraattiheksahydraattia 0,001 % 25 1:1 seos palmuöljyä ja pellavan- 3,0 % glukoäs?an?si^riloitu erikseen 1+, 2 % : 50 % liuoksena) +entsymaattisesti hydrolysoitu

Kasvualustan pH säädetään ammoniumhydroksidilla ar- 30 ...

voon 7,2 ennen sterilointia.

Kasvatus suoritetaan 37 °C:ssa käyttämällä sekoitti-men nopeutena 360 1/min ja steriilin ilmavirran nopeutta 3 1/min.

Kun kasvatus on jatkunut 11+U tuntia, mitataan 100 35 ml:sta käymislientä 260 mg nebramysiini-5*:a ja 9 mg neb ramy s i ini-1+: ää. Nebramy si ini-2 : ta ei havaita.

14 74995

Myös muita, koostumukseltaan erilaisia kasvualustoja voidaan käyttää pääkäymisessä. Niinpä, kun edetään kohdan a) mukaisesti käyttämällä seuraavaaa kasvualustaa 5 soijajauhoa 3,3 % ammoniumkloridia 0,6 % magnesiumsulfaattiheptahydraattia 0,7 % kaisiumkarbonaattia 0,5 % kobolttidinitraattiheksahydraattia 0,001 % 10 palmuöljyä 2,5 % glukoosia (steriloitu erikseen 2,1 % 50 % liuoksena)* ♦Kasvatuksessa käytetyn fermentorin geometriasta ja lisälaitteista riiippuen, 15 sillä ne vaikuttavat solujen aineenvaihduntaan, voidaan ·.·. glukoosiväkevyyttä nostaa 4,0 prosenttiin asti.

saadaan samanlaiset tulokset.

Kun kasvatus on jatkunut 144 tuntia, 100 ml käy- .[;20 mislientä sisältää hyvin pienen määrän nebramysiini- .'j 4 : ää (korkeintaan 3 mg) ja 180 mg nebramysiini-5 ' '· a · : : Nebramysiini-2:ta ei havaita.

b) Nebramysiini-51·a sisältävien käymislienten valmis-25 taminen 1000 litran pilot plant-fermentorissa

Suuria nebramysiini-5’-määriä sisältävien käymis-lienten valmistuksessa noudatetaan kohdan a) mukaista menettelyä. 100 ml:aan siirrostusalustaa siirrostetaan Streptorayces tenebrarium MNG 204-kannan itiöitä tai 30 vegetatiivista huovastoa ja kasvatetaan 14 — 18 tuntia ja sen jälkeen 100 litraan steriiliä siirrostusalustaa siirrostetaan tämä viljelmä ja kasvatetaan 37 °C:ssa käyttämällä 100 1/min ilmavirtausta ja 360 1/rain sekoitusta. 16 tunnin kuluttua 1000 litraan steriloitua 35 pääkäymisliuosta (sama koostumus kuin kohdassa a)) siir rostetaan ruostumattomassa teräsfermentorissa 50 litralla tätä siirrostetta. Pääkäyminen suoritetaan 37 °C:ssa 11 15 74995 käyttämällä 500 1/min ilmavirtaa ja 200 1/min sekoitusta. Antibiottipitoisuuden muutokset on esitetty taulukossa 2.

Taulukko U

5 Käymisen kestoaika (h) Nebramysiinilaatu (yg/ml) 2 U 5' 10 ' 2 U 0 0 50 U8 0 0 U 00 72 05 1200 15 96 0 30 17^0 120 0 U0 2320 1UU 0 60 2650 20 ! c) Nebramysiini-5' :n dekarbamoylointi ja tobramysiin in erottaminen 22 g natriumhydroksidia lisätään 3,0 litraan käymis-25 liuosta, joka sisältää 2600 yg/ml nebramysiini-5' :a ja 90 yg/ml nebramysiini-U:ää, liemi kuumennetaan jat-; kuvasti sekoittaen 90 - 100 °C:een ja pidetään tässä läm- • Potilassa 25 minuuttia. Reaktion päätyttyä seos jäähdy tetään huoneenlämpötilaan ja sen pH säädetään arvoon 2,0 30 50-prosenttisella rikkihapon vesiliuoksella. Tähän hap- pamaan käymisliuokseen lisätään 6 g oksaalihappoa jatkuvan sekoituksen alaisena ja sen jälkeen sen pH säädetään arvoon 7,0, seosta sekoitetaan vielä 30 minuuttia, suodatetaan ja huovasto pestään kahdesti 600 ml :11a vettä.

35 Suodos ja pesuliuokset yhdistetään ja saadulle kalsium- ionittomalle liuoksella suoritetaan ioninvahtokromato-grafinen erotus pylväässä, joka on valmistettu 200 ml:sta 16 74995

Amberlite CG-50 (NH^) (Rohm and Haas Co., Philadelphia, USA). Pylväs pestään ensin UOO ml:lla deionoitua vettä ja eluoidaan ensin 1000ml:lla 0,05 N, sitten 2000 ml:lla 0,1 N ja lopuksi 3000 ml:lla 0,15 N ammoniumhydroksidi-5 liuosta. Eluoinnin aikana kerätään 250 ml suuruisia jakeita. Jakeet 13 - 18, jotka sisältävät tobramysii-nin, yhdistetään, liuoksen pH säädetään rikkihapon 50 % vesiliuoksella arvoon 7,0 ja suoritetaan ioninvaihto-kromatografia 120 ml:lla Amberlite CG-50 (NH^). Pylväs 10 pestään 200 ml:lla deionoitua vettä ja antibiootti elu oidaan ensin 1000 mltlla 0,05 N ja sitten 2000 ml:lla 0,1 N ja 2000 ml:lla 0,15 N ja lopuksi 2000 ml:lla 0,2 N ammoniumhydroksidiliuosta. Kerätään 60 ml:n jakeet. Jakeet hj> - 56 yhdistetään ja haihdutetaan ali-15 paineessa. Kun jäännös kuivataan fosforipentoksidilla, saadaan tuote, joka sisältää 0,7 g (70 %) kanamysiini B:tä, 12 % komponenttia N — 1 3 (6 ' -N-karbamoyyli-tobra- mysiini), 10 % tuntematonta komponenttia ja 8 % tobra-mysiiniä. Kun jakeet 57 - 58 haihdutetaan, saadaan jään-• |· 20 nös , joka sisältää 0,2 g (60 %) tobramy siiniä, lähes 1+0 % kanamysiini B:tä ja 0,1 - 0,2 % komponenttia N-13.

Kun jakeet 59 ~ 69 tislataan, saadaan 5S7 g tobramysiiniä, joka sisältää 0,1 - 0,15 % komponenttia N-13. Kun epäpuhdas tobramysiini uudelleenkiteytetään 96-prosentti-25 sesta etanolista, saadaan h ,2 g puhdasta tobramysiiniä.

Esimerkki 2

Sellaisten käymislienten tuottaminen, jotka sisältävät nebramysiini-2:ta ja nebramysiini-5':a ennalta määrätys-30 sä suhteessa

Esimerkin 1 kohdan a) toimintatapaa noudattamalla 10 kappaletta 100 ml:n eriä mainittua siirrostusalustaa siirrostetaan Streptomyces tenebrarium MNG 20l+-kannan itiösuspensiolla ja 10 kappaletta 100 ml:n eriä samaa 35 siirrostusalustaa siirrostetaan Streptomyces tenebrarium 11 17 74995 MNG l69“kannan itiösuspensiolla. Mikro-organismeja kasvatetaan esimerkin 1 kohdan a) mukaisesti, sitten 100 ml:n erät pääkäymisalustaa steriloidaan 500 ml:n Erlenmeyer-kolveissa ja 5 litran erät pääkäymisalustaa 5 steriloidaan 10 litran fermentorissa (koostumus esimer kin 1 kohdan a) mukainen) ja siirrostetaan molemmilla kannoilla joko erikseen tai siten, että kannat ensin sekoitetaan keskenään määrätyssä suhteessa.

Kasvatusta pidetään yllä 1UU tuntia esimerkissä 1 10 kuvatuissa käymisolosuhtei ssa. Sitten antibioottilaa- tujen pitoisuudet määritetään ohutkerroskromatografi-sesti ensin erottamalla ja suorittamalla sen jälkeen bioautografia ja vertaamalla standardikokoihin. Tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 3.

18 74995

Taulukko 5 ----1 - Kasva- Mikro-organismi 1 Mikro-organismi 2 Nebramysiinilaatu j ^ tus (ml) (ml) __(yg/ml )_j Z 4 5»

Raviste- lupullo · j 10 1 MNG 169 5 ml 5040 180 1310 2 MNG 204 9 ml 0 SO 2190 3 WIG 169 4 »9 ml. MNG 204 0,5 ml 5640 175 1280 4 4,0 ml 1,0 ml 5140 195 1370 15 5 3,6 ml 1,5 ml 4740 130 1610 ..... 6 3,0 ml 2,5 ml 3140 240 1690 7 3,5 ml 2,5 ml 2850 170 1340 8 2,0 ml 3,0 ml 2310 190 1820 9 1,5 ml 3,5 ml 1320 240 2430 2&:| 10 1,0 ml 4,0 ml. 470 120 2340 11 0,c :::1 4,5 ml 1 50 95 2340 j

. i I

Fermen- I

tori 25 I MNG 169 200 ml 3900 210 870 j II MNG 204 200 ml 0 90. 2300 j

--f I

-j III MM G 1 69 175 ml MNG 204 25 ml 4320 240 1130 | IV .. 150 ml 50 ml 30 50 340 1530 !

. i I

30- V 125 ml 75 ml. 2450 220 1640 : VI 100 ml 100 ml 2320 420 2150 . VII 75 ml 125 ml 1420 300 2470 VIII 50 ml 150 ml 920 160 2540 j IX 25 ml 175 ml 230 140 2310 35 1-!-:--1

II

19 74995

Taulukon 3 tuloksista ilmenee selvästi, että Streptomyces tenebrarius MNG 20l+-kantaa ja Streptomyces tenebrarius MNG l69~kantaa viljelemällä voidaan tuottaa sellaisia käymisliemiä, jotka sisältävät nebramysiini-5 2:ta ja nebramysiini-5a missä tahansa ennalta määrä tyssä suhteessa. Antibiootit voidaan erottaa käymis-liemestä myös HU-patentin 17^ 315 mukaisesti.

Fermentoreissa I - IX saatujen lienten bioautografia on esitetty kuvassa 1.

10

Claims (2)

74995 20

1. Menetelmä sellaisten käymislienten mikrobiologiseksi valmistamiseksi, jotka sisältävät joko nebramysiini-5':a (6"-0-karbamoyylitobramysiiniä) tai antibioottiseosta, jossa 5 on ennalta määrätyssä suhteessa 0,5 - 77 % nebramysiini-2:ta, 2,7 - 8,6 i nebramysiini-4:ää ja 20 - 95 % nebramysiini-5' :a, tunnettu siitä, että a) sellaisten käymislienten valmistamiseksi, jotka sisältävät nebramysiini-5a, Streptomyces tenebrarius-lajin 10 uutta MNG 204-kantaa, tai b) sellaisten käymislienten valmistamiseksi, jotka sisältävät ennalta määrätyssä suhteessa 0,5 - 77 t nebramysiini-2: ta, 2,7 - 8,6 % nebramysiini-4:ää ja 20 - 95 1» nebramysiini-5a, Streptomyces tenebrarius MNG 169-kannan 15 (talletus tehty 28. joulukuuta 1977 The National Collection of Microorganisms-kokoelmiin Budapestissa) ja uuden Streptomyces tenebrarius MNG 204-kannan (talletus tehty 2. syyskuuta 1981 the National Collection of Microorganisms-kokoelmiin, Budapestissa) itiöitä tai vegetatiivista huovastoa, jotka on 20 sekoitettu keskenään suhteessa 100:1 - 1:100, viljellään orgaanisia hiili- ja typpilähteitä, epäorgaanisia suoloja, hivenaineita ja eläimistä ja/tai kasveista peräisin olevia öljyjä ja/tai rasvoja sisältävässä kasvualustassa pinnanalaisviljelmänä ilmastettuna 33 - 40°C:ssa, sopivimmin 25 37eC:ssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että orgaanisena hiililähteenä käytetään tärkkelystä, glyserolia, fruktoosia ja/tai sopivimmin glukoosia, ja orgaanisena typpilähteenä käytetään pähkinäjauhoa, 30 maissiniiuotusvettä, peptonia, hiivauutetta, sopivimmin soijajauhoa, kaseiinia ja/tai aminohappoja, sopivimmin glu-tamiinihappoa. Il