KR890002087B1 - 발효에 의한 젠타마이신의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
본 발명은 패혈증 및 각종 감염증의 치료에 쓰이는 항생제인 젠타마이신을 발효에 의해 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
종래 발효에 의한 젠타마이신의 제조방법으로는 미국 특허 제3,136,704호에서와 같이 마이크로모노스포라 퍼퓨리아(Micromonospora pupurea ATCC 15835) 균주를 영양배지에서 배양한 후, 생성된 젠타마이신을 분리 정제하여 제조하는 방법이 있으나, 이 방법은 발효 완료액에 축척되는 항생제의 역가(160-285μg/ml)가 낮아 생산원가가 높은 단점이 있었다. 따라서 본 발명자들은 종래의 이러한 발효에 의한 젠타마이신 생산 방법을 개량하고저 마이크로모노스포라 퍼퍼리아 ATCC 15835를 돌연변이 시킨 후, 고농도의 젠타마이신 첨가배지에 생육시켜 젠타마이신 내성을 가지는 변이주를 개발하였으며, 이 변이주가 특정 환경조건 즉, 배양온도 30-32℃ 배양 pH 7-8, 통기량 1.0-1.5vvm, 텍스트린과 포도당을 일정 비율로 첨가시킨 배지에서 적절한 양의 탄산칼슘을 첨가해 주었을때 고농도의 젠타마이신을 축척함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다. 친주(M.purpurea ATCC 15835)를 발아배지(포도당 1g/l, 쇠고기 추출물 3g/l, 트립톤 5g/l, 효모 추출물 5g/l, 전분 24g/l, 탄산칼슘 2g/l)에서 3-5일 배양하고 나서 유리솜(glass wool)을 사용하여 이 배양액에 함유된 균사체를 여과 분리시킨 다음 이를 한천 보존 배지(포도당 10g/l, 전분 20g/l, 효모추출물 5g/1NZ-아민 A형 5g/l, 탄산칼슘 1g/l)에 도말하여 3-4분 동안 자외선을 조사하여 변이를 일으킨 후 5-10일간 32℃에서 콜로니가 나타날 때까지 배양한 후, 콜로니들의 역가실험을 통하여 역가가 높은 변이주를 선별하고 선별된 변이주를 젠타마이신이 함유된(0.2-0.4mg/ml) 발아배지에서 5-8일간 배양 후, 고농도의 젠타마이신을 함유(1.0-2.0mg/ml)하는 한천 보존배지에 도말하여 5-10일간 32℃에서 생육 가능한 변이주를 분리함으로써 고농도 젠타마이신에 내성을 가진 변이주(KFCC-10346)를 얻었다.
본 발명에 의한 변이주(KFCC-10346)의 균주 특성을 동정한 결과, 균사체는 규칙적이고 무격막이며 직경은 약 0.5μm이었다. 배양적 특성은 친주(ATCC-15835) 보다 변이주의 발아 속도가 빠르고 발효시 배양액의 색깔도 친주가 심홍색인데 비해 변이주는 오렌지색을 띄운다. 생리적 특성은 최적 온도 28-35℃ 범위이며 최적 pH는 6-8이다.
본 발명의 변이주는 여러가지 탄소원 및 질소원을 이용할 수 있는 능력이 있다. 탄소원으로서는 전분, 덱스트린, 포도당, 자당, 맥아당, 유당등이며, 필요에 따라서는 두가지 탄소원을 혼합하여 사용할 수도 있는데(예를들면 덱스트린과 포도당) 이렇게 함으로서 젠타마이신 발효 농도를 높힐 수 있다. 질소원으로서는 염화암모늄, 황산암모늄, 암모니아, 펩톤, 트립톤, 쇠고기 추출물, NZ-아민 A형, 효모추출물, 옥수수 침지액, 대두박 가수분해물 등 무기 및 유기 암모늄 및 질소성유기물 등 여러 종류가 사용 가능하다. 미네랄 및 무기물로서는 인산 제1수소칼륨, 인산 제2수소칼륨, 황산 마그네슘, 황산 칼륨, 염화 나트륨, 황산 제1철, 염화철, 황산구리, 황산아연, 붕산, 염화망간, 염화코발트 등 미량원소들이 사용될 수 있으며, 비타민과 아미노산을 첨가해 줄 수 있으나 전술한 그의 배지 성분에 의해서 배지에 공급되면 특별히 첨가하지 않아도 좋다. 탄산 칼슘을 5-10g/l 첨가하면 발효중 발효액의 수소이온 농도가 중성 부근에 유지될 뿐 아니라 배지원으로 균체 증식에도 좋은 조건을 유지시켜 주게 된다.
변이주의 배양은 호기적 조건하에서 통기진탕 또는 교반 배양하는데 일반적으로 공기중의 산소가 발효액상에 잘 혼합되고 잘 유입되게 하기 위해서는 적당히 교반 및 통기를 하여야 한다. 특히 통기 진탕시에는 플라스크에 대한 배지량이 중요하다. 즉 플라스크에 배지량이 적당한 상태(250ml 플라스크에 배지량 30ml 이하)로 배양하여 최적 조건을 유지시켜 줄 필요가 있다. 이러한 조건에서 배지 최적화를 시도하면 공업화 규모의 배양조건과 보다 유사하게 되어 공업화시 대형 발효조에서 배치 최적화를 시도할 때, 플라스크와 발효조간의 배양 특성차이를 더욱 줄일 수 있어 경제적이다. 배양 온도는 28-35℃가 좋고 바람직하기로는 30-32℃ 범위에서 통상적으로 4-7일 배양하면 젠타마이신이 잘 생성 축척된다. 이때 전처리할 발효 완료액의 펜타마이신 정량 분석는 S.aureus ATCC 6538P를 이용하여 간소한 미생물 분석법(Microbial Assay)으로 하였다. 발효 완료액의 전처리를 위하여 발효 완료액 30ml에 20% 수산(oxalic acid) 0.96ml을 가한후, 6N 황산을 사용하여 pH를 2.0으로 조절하고 30-32℃에서 30분간 교반시킨다. 이 액을 원심 분리하여 상등액을 취하여 여기서 14% 암모니아수를 가하여 pH를 7.0으로 조절한 후, 젠타마이신 역가 측정용 시료로 사용하였다. 분석용 젠타마이신 표준 용액 및 시험용액 제조는 0.1몰 인산 완충용액(pH 8.0)을 사용하여 희석 조제하였고 정량 원반평판(paper disc, 직경 0.25인치 BBL사)에 표준용액과 시험용액을 20μl씩 점적하여 말린 후, 정량 평판 배지위에 무균적으로 놓고 37℃에서 18시간 배양하였다. 젠타마이신의 정량은 이 항생 물질에 의해 나타나는 저해 직경과 젠타마이신의 대수 농도값과의 관계에 의한 직선을 구하고 이를 사용하여 결정하였다.
미생물 분석에 사용한 기층 및 증층배지는 디프코사 항생물질 배지조성 11번을 사용하였고 시험균주(S.aureus) 배양을 위한 배지는 소고기 추출물 3g/l, 펩톤 5g/l, 포도당 2g/l를 사용하였다.
다음의 실시예에서 본 발명을 구체적으로 설명한다.
[실시예 1]
발아배양:본 발명의 변이주(KFCC-10346)를 전술한 발아배지 50ml를 함유하는 250ml 배플(Baffle)이 있는 진탕 배양용 플라스크에 1백금이씩 접종한 후, 32℃에서 진탕 회전 배양기(200rpm)를 사용하여 3일간 배양하였다.
종균배양:살균된 발아배지 50ml를 함유하는 250ml 진탕배양용 플라스크에 상기의 발아배양에서 얻어진 배양액을 5ml 식균한 후 발아배양과 같은 조건에서 2일간 배양하여 종균으로 사용하였다.
본 배양:상기의 종균 배양에서 얻어진 배양액 3ml를 다음 조성을 가지는 살균된 본 배양 배지 30ml(250ml 플라스크 사용)에 무균적으로 식균하였다. 본 배양 배지조성은 텍스트린 70g/l, 포도당 5g/l, 대두박 35g/l, 탄산칼슘 7g/l, 염화코발트 0.001g/l이었다.
본 배양은 32℃에서 6일간 진탕 회전 배양하였고 배양 완료후 생성된 젠타마이신의 역가는 1500-1700μg/ml범위이었다.
[실시예 2]
실시예 1과 같은 조건으로 배양하고 발효 본 배양시 250ml 배플(Baffle)이 있는 진탕 배양용 플라스크에 배지양을 변화시켰을 때 젠타마이신 생성량을 표 1에 표시하였다.
[표 1]
250ml배플(Baffle) 플라스크에서 배지량별 젠타마이신 생성량
[실시예 3]
실시예 1과 같은 조건으로 배지중 탄소원으로 덱스트린과 포도당을 첨가하여 이 두가지 탄소원을 변수로 하여 실험한 결과 젠타마이신 생성량은 다음 표 2와 같았다.
[표 2]
덱스트린과 포도당 비율별 젠타마이신 생성량
[실시예 4]
실시예 1과 같은 조건으로 하고 탄산칼슘의 농도를 변화시켜 균체량과 젠타마이신 생성량을 시험해 본 결과 다음 표 3과 같았다.
[표 3]
탄산칼슘량에 따른 균체량과 젠타마이신 생성량
Claims (3)
- 마이크로 모노스포라속에 속하며 고농도의 젠타마이신 첨가 배지에서 생육이 가능한 변이주 마이크로 모노스포라 퍼퓨리아(KFCC-10346)를 영양 배지에서 호기적으로 배양하여 배지에 젠타마이신을 생성, 축적함을 특징으로 하는 발효에 의한 젠타마이신의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 탄소원 중 덱스트린과 포도당 비율을 일정 범위(덱스트린 60-75g/l, 포도당 0-15g/l)로 조절함을 특징으로 하는 젠타마이신의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 배지중에 탄산칼슘량을 5-10g/l로 조절함을 특징으로 하는 젠타마이신의 제조방법.
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