DE2952690A1 - Pharmazeutische zubereitung - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung, die durch eine Amidbindung zwischen einem hochreinen Antikörper
zu einem Tumorantigen mit einer Antitumorsubstanz erhalten worden ist.
Ein erstes charakteristisches Merkmal der Erfindung ist die Schaffung einer pharmazeutischen Zubereitung, die
keine Kebeneffekte, wie Pyrexie und anaphylaktische Schocks, bei der Verabreichung bedingt.
Das zweite charakteristische Merkmal der Erfindung ist die Schaffung eines extrem reinen Antikörpers zu einem
Tumorantigen, der zur Herstellung der vorstehend beschriebenen pharmazeutischen Zubereitung geeignet ist.
In neuerer Zeit sind verschiedene Arten pharmazeutischer Zubereitungen bekannt und in die Praxis eingeführt worden,
wobei jedoch die meisten von Ihnen Nebenwirkungen bedingen, wie Leukopenie, Alopezie sowie gastrointestinale Störungen.
Daher ist ihr Einsatz in einem gewissen Ausmaße eingeschränkt.
In neuester Zeit ist der Einsatz einer Substanz versucht worden, die durch chemisches Binden eines Antikörpers zu
einem Tumorantigen (nachfolgend als Antitumorantikörper bezeichnet) mit einer Antitumorsubstanz, wie einem Antitumormittel,
erhalten worden ist. Da jedoch der Antitumorantikörper, der für eine derartige Substanz verwendet wird,
nicht in ausreichendem Maße gereinigt ist, um Immunoglobulin zu entfernen, kann er nicht als reiner Antitumorantikörper
bezeichnet werden. In den Fällen, in welchen eine derartige Substanz, die durch Verbinden eines derartigen
Antitumorantikörpers mit einer Antitumorsubstanz erhalten worden ist, sind das Auftreten von Pyrexie und anaphylaktischem
Schock, verursacht durch das Immunoglobulin, das in
030027/0888
dem vorstehend erwähnten Antiturnorantikörper enthärten ist,
unvermeidlich.
Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, zur Vermeidung der Nebenwirkungen, die bei der Verwendung von Antitumorantikörpern
auftreten, einen extrem reinen Antitumorantikörper zu schaffen, und zwar durch Reinigen der Immunoglobulinfraktion
des Antiserums unter Anwendung einer affinitatschromatographischen Methode. Dabei wird eine pharmazeutische
Zubereitung durch Verbinden des vorstehend erwähnten gereinigten Antikörpers zu einer Antitumorsubstanz mit wenigstens
einer Aminogruppe oder Carboxylgruppe erhalten, die nicht die vorstehend beschriebenen Nebenwirkungen aufweist.
Die Erfindung betrifft daher die Schaffung einer pharmazeutischen Zubereitung mit einer geringen Cytotoxizität und
ausgezeichneter Antitumoraktivität. Ferner wird durch die Erfindung ein Antitumorantikörper mit hoher Reinheit sowie
ein Verfahren zur Herstellung desselben zur Verfügung gestellt.
Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 ein Infrarotabsorptionsspektrum einer Zubereitung,
die durch Verbinden eines gereinigten Antisarkom-180-Antikörpers aus einer Maus mit Mitomycin C gemäß
vorliegender Erfindung erhalten worden ist;
Fig. 2 ein Infrarotabsorptionsspektrum des gereinigten Antikörpers,
der durch Reinigung mittels Affinitätschromatographie eines Antiserums erhalten worden ist,
das aus einem männlichen Patienten erhalten worden ist, der an rektalem Krebs leidet;
Fig. 3 ein UV-Absorptionsspektrum des vorstehend erwähnten
gereinigten An-tikörpers;
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Fig. 4 ein Infrarotabsorptionsspektrum einer Zubereitung, die durch Verbinden eines gereinigten Antisarkom-180-Antikörpers
aus einer Maus an Doxorubicinhydrochlorid gemäß vorliegender Erfindung erhalten worden ist;
Fig. 5 ein Infrarotabsorptionsspektrum einer Zubereitung,
die durch Verbinden eines gereinigten Antisarkom-180-Antikörpers aus einer Ratte an Chlorambucil gemäß
vorliegender Erfindung erhalten worden ist;
Fig. 6 ein Infrarotabsorptionsspektrum einer Zubereitung, die durch
Verbinden eines gereinigten Antisarkom-180-Antikörpers aus einer Ratte an Uramustin gemäß vorliegender
Erfindung erhalten worden ist;
Fig. 7 ein Infrarotabsorptionsspektrum einer Zubereitung, die durch Verbinden eines gereinigten Antisarkom-180-Antikörpers
aus einem Kaninchen an Cytarabin gemäß vorliegender Erfindung erhalten worden ist und
Fig. 8 ein Infrarotabsorptionsspektrum einer Zubereitung, die durch Verbinden eines gereinigten Antisarkom-180-Antikörpers
an einer Maus an 5-Fluoruracil gemäß vorliegender Erfindung erhalten worden ist.
Das wesentliche Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine pharmazeutische Zubereitung zu schaffen, die
durch Verbinden eines gereinigten Antitumorantikörpers, erhalten durch Reinigen mittels Affinitätschromatographie,
mit einer Antitumorsubstanz mit wenigstens einer Aminogruppe oder Carboxylgruppe erhalten wird.
Der erfindungsgemäß eingesetzte Antitumorantikörper wird
durch Reinigen der Imminoglobulinfraktion erhalten, welche durch das Antigen von Tumoren induziert wird, wobei von
den Tumoren Sarkom-180, Sato's Lungenkrebs, L-1210 Leukämie,
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P-388 Leukämie, Ehrlich's Krebs, Yoshida's Sarkom, akute
lymphatische Leukämie, Rückenmarktumor oder andere menschliche
Krebse erwähnt seien. Die Reinigung erfolgt durch eine Affinitätschromatographie.
Die Herstellung der Antikörper zu den vorstehend erwähnten Tumorantigenen erfolgt nach der Methode, die in "Proceedings
of the VIth Annual Meeting of Japan Society of Immunology", Seite 198 (1976) beschrieben ist, worin nach der Methode von
M. J. Dauphin et al. (vgl. "J. Immunul., 113, Seite 948 (1974)). Bei der Durchführung der zuerst genannten Methode
unter Einsatz des Freund'sehen vollständigen Adjuvanses
werden Tumorzellen subkutan in Versuchstiere zur Immunisierung derselben eingespritzt, worauf der Antikörper aus
den immunisierten Tieren gewonnen wird. Bei der letzteren Methode wird ein Tumorantigen intraperitoneal drei- bis
j viermal in ein Tier zur Immunisierung desselben eingespritzt,
worauf der Antikörper aus dem immunisierten Tier gewonnen
\ wird.
! Erfindungsgemäß kann jeder Alloantikörper oder Genoantikör-
> per verwendet werden, der Einsatz des Alloantikörpers ist
! jedoch vorzuziehen.
f Zur Reinigung eines Antikörpers wurde bisher eine Methode
■ angewendet, die darin bestand, eine Aussalzung mit Ammonium-
) sulfat und eine Ionenaustauscherchromatographie mit einer
ι DEAE-Cellulosesäule durchzuführen, wobei häufig die Immuno-
j globulin-G-Fraktion aus einem Antiserum verwendet wurde.
£ Erfindungsgemäß wird ein spezifisches Reinigungsverfahren ' unter Verwendung einer Affinitätschromatographie durchgeführt,
um selektiv nur den spezifischen Antikörper zu den Tumorzellen aus der Immunoglobulin-G-Fraktion zu erhalten,
die nach der vorstehend beschriebenen Methode erhalten wird. Die Affinitätschromatographie basiert auf dem Prinzip, daß
man sich eine spezifische Affinität zwischen Substanzen Iebender Körper zunutze macht, beispielsweise zwischen einem
I
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Enzym und einem Substrat oder zwischen einem Antikcftrpöi·^" ^ ^
und einem Antigen, worauf eine Komponente eines derartigen Paares abgetrennt wird.
Die erfindungsgemäß durchgeführte Affinitätschromatographie
sieht (1) eine Methode vor, bei deren Durchführung Moleküle eines Antigens, die aus Turnorzellen extrahiert
werden, kovalent mit einem Träger, wie Agarosegel, verbunden werden, wobei Bromcyan verwendet wird. Nach dem Füllen
einer Säule mit dem Träger wird eine Lösung eines Antikörpers durch die Säule zum Verbinden des Antikörpers mit dem
Antigen geschickt, worauf eine ausreichende Menge eines Lösungsmittels durch die Säule hindurchgeleitet wird, um den
nichtgebundenen Antikörper herauszuwaschen. Ferner wird eine Pufferlösung mit einem niedrigen pH durch die Säule geschickt,
um die Bindung zwischen dem Antikörper und dem Antigen aufzutrennen, worauf der abgetrennte Antikörper eluiert
wird. Ferner ist (2) ein Verfahren bekannt, bei dessen Durchführung ohne Einsatz einer Säule der Antikörper mit
dem Antigen in der Weise vermischt wird, daß der Träger, an den das Antigen in der vorstehend beschriebenen Weise
gebunden worden ist, mit einer Lösung des Antikörpers vermischt wird. Nach einem Waschen der Trägerteilchen zur Entfernung
von nichtgebundenem Antikörper wird dann der Antikörper herausgelöst. Schließlich ist (3) ein Verfahren bekannt,
bei dessen Durchführung die Tumorzellen selbst anstelle des Trägers, mit dem das Antigen verbunden wird,
eingesetzt werden.
Daher handelt es sich bei dem erfindungsgemäß unter Anwendung
einer Affinitätschromatographie erhaltenen gereinigten Antikörper um ein Antitumorimmunoglobulin mit einer höheren
Reinheit als sie herkömmliche Immunoglobulinfraktionen besitzen, d. h. um einen gereinigten Antitumorantikörper.
Die Antitumorsubstanzen, die über eine Amidobindung mit dem
gereinigten Antitumorantikörper, der in der vorstehend be-
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schriebenen Weise erhalten worden ist, verbunden werden,
sind antibiotische Substanzen, wie Mitomycin C, Doxorubicinhydrochlorid,
Bleomycin, Daunorubicin, Actinomycin D sowie Sarcomycin. Infrage kommen ferner antimetabolitische
Substanzen, wie Cytarabin, 8-Azaguanin, 5-Fluoruracil,
Methotrexat sowie Natriumaminopterin, ferner Alkylierungsmittel,
wie Chlorambucil, Melphalan, Urawustin, ACNU sowie Cyclophosphamid. Jede der vorstehend erv7a.hnten Antitumorsubstanzen
ist bekannt und wird durch einen Trivia Inairen gekennzeichnet,
wobei die Strukturformeln beispielsweise in den folgenden Literaturstellen zu finden sind:
"Iyakuhin Yoran (Manual of Drugs)", herausgegeben von der Osaka Prefectural Assoc. Hospitals1 Pharmacysts.
"Biseibutsuyakuhin Kagaku (Chemistry of Drugs derived from Microorganisms)", herausgegeben von Y. Ueno et al.
Die vorstehend erwähnte Antitumorsubstanz wird mit dem
vorstehend beschriebenen Antitumorantikörper über eine Bindung entweder der Aminogruppe oder der Carboxylgruppe in
der Substanz mit entweder der Carboxylgruppe oder der Aminogruppe in dem Antikörper in der Weise verbunden, daß
die Substanz in Reaktion mit dem Antikörper unter milden Bedingungen gebracht wird. In diesem Falle ist es möglich,
erforderlichenfalls dadurch eine glattere Reaktion zu bewirken, daß eine oder mehrere Aminogruppen oder eine oder
mehrere Carboxylgruppen in die Antitumorsubstanz im voraus eingebracht werden. Die Einführung der Amino- oder Carboxylgruppen
wird vorzugsweise in der Weise durchgeführt, daß man die Antitumorsubstanz selbst oder ihr Natrium-, Kaliumoder
Silbersalz in Reaktion mit einer Verbindung der allgemeinen Formel X(CH3) COOH bringt, worin X für ein Chloroder
Bromatom steht und η eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet, oder mit einer Verbindung der Formel
HCl'NH,(CH2)-COX, worin X für ein Chlor- oder Bromatom steht
und η eine ganze Zahl von 1 bis 3 darstellt, wobei die Reak-
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tion in einem wasserlöslichen Lösungsmittel, beispielsweise Methanol, Äthanol, Dimethylsulfoxid oder Dioxan, bei
einer Temperatur von 0 bis 500C und vorzugsweise 10 bis 400C
während einer Zeitspanne von 10 Minuten bis 72 Stunden durchgeführt wird. Durch Umkristallisation des auf diese
Weise erhaltenen Reaktionsprodukts aus einem Lösungsmittel, wie Wasser, einem Alkohol, Chloroform oder Dioxan, wird
ein Derivat der Antitumorsubstanz, in welche eine oder mehrere Aminogruppen oder eine oder mehrere Carboxylgruppen
eingeführt worden sind, erhalten. Chloressigsäure wird vorzugsweise als Verbindung der Formel X(CH,) COOH eingesetzt.
Das Verbinden des gereinigten Antitumorantikörpers mit einer Antitumorsubstanz mit wenigstens einer Amino- oder Carboxylgruppe
wird in der Weise durchgeführt, daß die beiden Reaktanten in einem wasserlöslichen Lösungsmittel aufgelöst werden,
worauf ein Carbodiimid als Katalysator zur Durchführung der Reaktion bei einer Temperatur von 0 bis 500C und vorzugsweise
10 bis 400C während einer Zeitspanne von 10 bis 8 Stunden
und vorzugsweise 30 Minuten bis 5 Stunden, zugesetzt wird. Die Reaktion wird durch die Zugabe einer Pufferlösung,
wie Essigsäure/Natriumacetat, abgestoppt.
Anschließend wird zur Entfernung der nichtumgesetzten Antitumorsubstanz,
des Katalysators, der Komponenten dsr Pufferlösung sowie der Salze in der Reaktionsmischung die Reaktionsmischung einer Dialyse, Gelfitration oder Ultrafiltration
oder einer Kombination aus diesen Behandlungsschritten unterzogen. Das zur Durchführung der vorstehend beschriebenen
Reaktion als Katalysator eingesetzte Carbodiimid besteht beispielsweise aus i-Äthyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carb diimid,
I-Cyclohexyl-S-(3-morpholinoäthyl)-carbodiimid
oder Dxcyclohexylcarbodiimid.
In der erfindungsgemäß nach der vorstehend beschriebenen Reaktion erhaltenen pharmazeutischen Zubereitung sind der
Antikörper und die Antitumorsubstanz über eine oder mehrere
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Amidbindungen verbunden. Das molekulare Verhältnis des Antikörpers zu der Antitumorsubstanz beträgt 1:2 bis 5
in den Fällen, in denen die Antitumorsubstanz antibiotischen Ursprungs ist, sowie 1:1 bis 10 in den Fällen, in
denen sie antimetabolischen Ursprungs ist oder auf ein Alkylierungsmittel zurückgeht.
Nachfolgend werden die toxikologische Spezivität, die pharmakologischen Wirkungen sowie die Herstellung der
gebundenen Substanz der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zubereitungen mit einer Amidbindung zwischen dem vorstehend erwähnten Antxtumorantikörper und der Antitumorsubstanz
beschrieben.
Die akute Toxizität wird durch intravenöse Verabreichung von 300 mg der pharmazeutischen Zubereitung pro kg einer
Maus als Versuchstier bestimmt. Da keine Todesfälle bei der Gruppe von behandelten Mäusen innerhalb 1 Woche nach
der Behandlung auftreten, kann man davon ausgehen, daß die pharmazeutische Zubereitung als Arzneimittel geeignet
ist.
Die in den Beispielen beschriebenen pharmazeutischen Zubereitungen
sind wirksam gegenüber verschiedenen Krebskrankheiten, wie akuter Leukämie, malignanter Lymphomie,
Carcinomen, Sarkomen, malignanter Ciliatepitheliom, akuter myelogener Leukämie, Melanom, akuter lymphatischer Leukämie,
Myelom etc.
Zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, die als Antitumormittel eingesetzt werden, sowie zu ihrer Verabreichung
kann man sich der bekannten Methoden bedienen. Als Verabreichungsmethoden kommen eine orale Verabreichung,
eine Injektion oder eine rektale Verabreichung beispielsweise infrage. Als Verabreichungsformen seien Pulver, Granulate,
Tabletten, Injektionslösungen oder Suppositorien erwähnt,
eine Verabreichung durch Injektion wird jedoch bevorzugt.
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Zur Herstellung einer Injektionslösung werden wasserlösliche
Lösungsmittel, wie physiologische Kochsalzlösungen, sterilisiertes Wasser, Ringer's Lösung etc. verwendet,
infrage kommen ferner wasserunlösliche Lösungsmittel, isotonische Mittel, analgetische Mittel, Stabilisierungsmittel,
antiseptische Mittel, Suspendiermittel, Pufferungsmittel, Emulgiermittel etc.
Beispielsweise werden 10g der pharmazeutischen Zubereitung
und 50 mg Mannit in destilliertem Wasser zur Gewinnung
von 10 ml einer wäßrigen Lösung aufgelöst. Nach einem Sterilisieren
der Lösung nach einer herkömmlichen Methode wird die sterilisierte Lösung in eine Phiole für Injektionszwecke eingefüllt. Man kann ferner die Lösung direkt gefriertrocknen
und das · gefriergetrocknete Material zum Einspritzen mit einer verdünnten wäßrigen physiologischen Kochsalzlösung
verdünnen.
Die pharmazeutische Zubereitung kann eine Konzentration von im allgemeinen 0,01 bis 90 Gew.-% und vorzugsweise
0,1 bis 60 Gew.-% aufweisen.
Die Menge der verabreichten pharmazeutischen Zubereitung hängt von dem Zustand der Krankheit ab, sie liegt jedoch
im allgemeinen zwischen 0,11 und 9 g pro Tag im Falle eines Erwachsenen und vorzugsweise zwischen 0,1 und 6 g.
Da erfindungsgemäß die Tumortropie und die Antitumoraktivitat
des Antikörpers sowie die Antitumoraktivitat der Antitumorsubstanz, die mit dem Antikörper verbunden ist,
in der pharmazeutischen Zubereitung ohne Verlust festgehalten werden, kommt die pharmazeutische Zubereitung nach
der Verabreichung an der Tumorstelle in wirksamem Zustand an und entwickelt ihre Antitumoraktivitat. Betrachtet man
daher die Menge der pharmazeutischen Zubereitung als Basis, dann hat eine Verabreichung der pharmazeutischen Zubereitung,
die eine Menge der Antitumorsubstanz von 1/10 bis
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1/20 der verabreichten Menge der Antituniorsubstanz selbst
enthält, den gleichen Inhibierungsgrad gegenüber der Proliferation
des Tumors wie die Verabreichung der Antitumorsubstanz selbst, wobei der Grad der Nebenwirkungen aufgrund
der Antitumorsubstanz, die in der pharmazeutischen Zubereitung als Komponente enthalten ist, nur 1/10 bis
1/20 des Ausmaßes der Nebenwirkungen ausmacht, die auf die Zubereitung zurückgehen, welche die gleiche Antitumorsubstanz
enthält. Diese Wirkungen gehen möglicherweise auf einen synergistischen Effekt günstiger Eigenschaften
der zwei Komponenten der pharmazeutischen Zubereitung zurück.
Nachfolgend wird die Methode zur Herstellung des erfindungsgemäßen
Antitumormittels anhand von Beispielen erläutert, desgleichen seine pharmakologische Wirksamkeit, wobei diese
Beispiele die Erfindung nicht beschränken sollen.
1-1: Herstellung und Reinigung des Antikörpers durch Anwendung einer Affinitätschromatographie (3)
Nach einem Züchten von Ascites-Typ-Sarkom-180-Zellen, die
aufeinanderfolgend unter Verwendung von ICR-Mäusen gezüchtet
worden sind, in einer wäßrigen physiologischen Kochsalzlösung, die Mitomycin C in einer Konzentration von
50 Mikrogramm/ml enthält, während 30 Minuten bei einer Tem
peratur von 37°C, wird die überstehende Flüssigkeit durch Zentrifugieren entfernt. Die proliferierten Zellen werden
dreimal mit einer wäßrigen 0,85 %igen physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Freund"sches vollständiges Adju-
vans (nachfolgend als FCA bezeichnet) wird mit den auf diese Weise behandelten Sarkom-180-Zellen, deren proliferative
Aktivität unterdrückt worden ist, vermischt, worauf die Mi schung subkutan in die Fußsohle eines Kaninchens mit einem
Körpergewicht von 2,9 kg in einer Menge von 10 Zellen/Tier
eingespritzt wird. Das Kaninchen wird durch wiederholte In jektion der Zellen 2 Wochen nach der ersten Injektion immu-
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nisiert, worauf die gleiche Anzahl der Zellen intravenös an das gleiche Kaninchen verabreicht wird.
Eine Woche nach der letzten Injektion wird das gesamte Blut
des Kaninchens mit einer Kanüle gesammelt, welche in die große Halsschlagader eingeführt worden ist. Das Antiserum
wird aus dem Blut in der folgenden Weise gewonnen und gereinigt:
Die ausgesalzene Fraktion, die durch Zugabe von Ammoniumsulfat in einer Menge von 20 bis 30 Gew.-% der Sättigungsmenge
zu 100 ml des Antiserums gebildet worden ist, wird gesammelt und erneut in 20 ml Wasser aufgelöst. Diese Lösung
wird durch Dialyse gegen eine wäßrige 10 mM-Phosphatpufferlösung (nachfolgend als PBS bezeichnet) bei einem
pH von 7,0 während 72 Stunden bei einer Temperatur von 40C
(während der Dialyse wird die äußere Dialyseflüssigkeit alle 24 Stunden ausgetauscht) entsalzt. Eine gleiche Menge
Blutzellen einer normalen ICR-Maus, die dreimal mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen worden ist, wird
mit der entsalzenen Lösung vermischt, worauf man die Mischung während 30 Minuten bei einer Temperatur von 4°C zur
Durchführung der Absorption stehen läßt. Dann wird die Mischung zur Gewinnung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert.
Die vorstehend beschriebene Methode wird viermal wiederholt, wobei die Absorptionsmethode insgesamt fünfmal
durchgeführt wird. Der auf diese Weise erhaltene Antikörper wird als Vorreinigungsantikörper (IgG) bezeichnet. Anschlie
ßend wird die Reinigung weiter nach der folgenden Methode durchgeführt: der überstehenden Lösung, die der Absorption
unterzogen worden ist, wird die gleiche Menge an Sarkom-180-Zellen
zugemischt, worauf man die Mischung 30 Minuten bei 40C zur Herstellung des Antikörpers gegenüber Sarkom-180,
gebunden an die Zellen von Sarkom-180, stehen läßt. Die
überstehende Lösung wird durch Zentrifugieren entfernt. Ei ne wäßrige Glycin/Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung mit
einem pH von 3,0 wird dem Niederschlag zur Freisetzung des
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Antikörpers zugesetzt. Die Mischung wird zur Gewinnung der überstehenden Lösung, die den Antikörper enthält,
zentrifugiert. Nach einem Einstellen des pH der überstehenden Lösung auf die Nähe des Neutralpunktes durch Zugabe
einer wäßrigen 0,1 η Natriumhydroxidlösung wird die nahezu neutralisierte Lösung gegen PBS bei einer Temperatur von
4°C während 24 Stunden dialysiert (die äußere Dialyseflüssigkeit wird alle 8 Stunden ausgetauscht). Die auf diese
Weise erhaltene dialysierte Lösung ist eine wäßrige Lösung, welche Kaninchen-Antisarkom-180-Antikörper enthält.
1-2: Cytotoxizitatstests gegenüber Tumorzellen und normalen
Zellen:
Störungen der Zellen aufgrund des vorstehend erhaltenen Kaninchen-Antisarko.m-180-Immunoantikörpers
werden in Gegenwart eines Komplements (Meerschweinchenserum) in der folgenden Weise ermittelt:
Jeweils 100 Mikroliter der vorstehend erwähnten wäßrigen Lösung des Antikörpers sowie von drei verdünnten Lösungen
des Antikörpers (Verdünnungsgrade: 10-faches, 100-faches bzw. 1000-faches) werden mit 100 Mikrolitern der wäßrigen
Suspension von Sarkom-180-Zellen oder der Milzzellen einer
normalen ICR-Maus (in eine der Suspensionen wird Eagle's Minimum Essential Medium als Lösungsmittel, enthaltend 5 χ
10 Zellen/ml, verwendet) varmischt. Die Mischungen werden
15 Minuten lang bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dann wird ein Aliquot von 100 Mikrolitern eines zweifach verdünnten
Serums eines Meerschweinchens mit Eagle's Minimum Essential Medium (nachfolgend als MEM abgekürzt) (das verdünnte
Serum wird als Komplement bezeichnet) einer jeden der vorstehend angegebenen Mischungen zugesetzt. Die fertigen
Mischungen werden 30 Minuten bei einer Temperatur von 37°C bebrütet. Nach der Bebrütung wird das bebrütete
Medium zum Sammeln von Zellenpellets zentrifugiert. Nach dem einmaligen Waschen der Pellets mit MEM wird eine wäßrige
Trypanblau-Lösung den unter dem Mikroskop zu untersuchenden
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Pellets zur Ermittlung der Mortalität der Zellen zugesetzt.
Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle I hervor. Wie aus der Tabelle I ersichtlich ist, wird der Mortalitätsgrad
der Zellen (Zellcytotoxizitätsaktivität) in drei Klassen eingeteilt und durch +, ++ und +++ abgestuft (kein Todesfall
wird durch "-" wiedergegeben). Man sieht deutlich, daß zwar der Antikörper, der nach der Reinigung des Antiserums
nach der vorstehend beschriebenen Methode anfällt, eine Cytotoxizität gegenüber Sarkcm-180-Zellen besitzt,
sich jedoch von der Toxizität des Antikörpers, der ohne Reinigung des Antiserums erhalten worden ist, nicht wesentlich
unterscheidet, wobei die Toxizität des ersteren gegenüber den Milzzellen einer normalen ICR-Maus extrem niedrig
ist, da keine Todesfälle aufgetreten sind. Man sieht, daß die Reinigung des Antiserums für die erfindungsgemäßen
Zwecke geeignet ist.
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- 17 Tabelle I
Zellmortalität
Verdünnung der wäßrigen Lösung des Antikörpers, x-fach
Vor der Reinigung des Antiserums durch Affini tat schromat oar aph ie
(3)
Nach der Reinigung des Antiserums durch Affinität schromatographie
Vergleich (Eagle-MEM)
Sarkom-180-Zellen
Milzzellen von ICR-Mäusen
Sarkom-180-Zellen
Milzzellen von ICR-Mäusen
Sarkom-180-Zellen
Milzzellen von ICR-Mäusen
10
100 1000
Es ist hinzuzufügen, daß die Milzzellen einer normalen ICR-Maus, die als repräsentative Beispiele für normale Zellen eingesetzt
worden sind, durch eine erste Extirpation der Milz, feines Zerkleinern der Milz mit einem Pinzettenpaar in
Eagle-MEM in der Weise, daß die Teilchen durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl mit einer Maschenöffnung von 200 mesh hindurchgehen,
einmaliges Waschen des Filtrats mit MEM, Zugabe von 3 ml einer wäßrigen Tris-(hydroxylmethylamino)-methan-gepufferten
0,75 %igen Ammoniumchloridlösung mit einem pH von 7,4 zu dem gewaschenen Filtrat zur Entfernung der Ejyth rocyten und
dreimaliges Waschen des auf diese Weise erhaltenen Filtrats mit MEM erhalten worden sind.
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1-3: Reinigung des Antikörpers durch Affinitätschromatographie:
Da bei der Durchführung der gemäß 1-1 angewendeten Affinitätschromatographiemethode
(3) Probleme bei der Abtrennung des reinen Antikörpers insofern auftreten, als noch eine
Störung der Mäuse milzzellen festzustellen ist, wird die
folgende Reinigung des Antikörpers unter Verwendung einer Säule durchgeführt, an die das Tumorantigen gebunden ist.
Zunächst wird eine Peinigung an dem Antigen selbst durchgeführt.
Tumorzellen des Ascitestyps Sarkom-180, die aufeinanderfolgend
unter Verwendung von ICR-Mäusen gezüchtet worden sind, werden gefriergetrocknet. Nach der Zugabe einer wäßrigen
5 mM Kaliumphosphatpufferlösung mit einem pH von 7,4 wird das Antigen aus den Zellen während 20 Stunden extrahiert.
Eine überstehende Lösung wird durch Zentrifugieren der Mischung während 10 Minuten bei 65000 G gesammelt. Die überstehende
Lösung wird weiter 30 Minuten bei 180000 G zentrifugiert. Die auf diese Weise erhaltene überstehende Flüssigkeit
wird gegen destilliertes Wasser während 70 Stunden bei einer Temperatur von 40C dialysiert (während der Dialyse wird
die äußere Flüssigkeit alle 24 Stunden ausgetauscht). Das Dialysat
wird ferner bei 65000 G zur Entfernung des Niederschlags zentrifugiert. Nach der Zugabe von Ammoniumsulfat zu der auf
diese Weise erhaltenen überstehenden Lösung zur Einstellung einer Konzentration von 2 m wird die Lösung während 10 Minuten
bei 65000 G zum Sammeln des Niederschlags zentrifugiert. Der Niederschlag wird in destilliertem Wasser aufgelöst.
Die Lösung wird gegen destilliertes Wasser während 72 Stunden dialysiert (während der Dialyse wird die äußere Flüssigkeit
alle 24 Stunden ausgetauscht).
Das auf diese Weise, erhaltene Sarkom-180-Antigen wird zur
Herstellung der Säule für die Affinitätschromatographie in
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der folgenden Weise verwendet:
Zunächst wird auf ein Agarosegel (Sepharose 4B, Produkt der Pharmacia Japan Co., Ltd.)/ das mit Wasser auf 20 ml angequollen
worden ist, das gleiche Volumen einer wäßrigen Lösung von Bromcyan mit 1 g/ml gegeben. Nach einer 8 Minuten
dauernden Reaktion unter Einhaltung eines pH der Reaktionsmischung von 11,0 wird die Mischung mit einem Glasfilter
zum Sammeln des Niederschlags filtriert, der auf dem Filter mit eisgekühltem destilliertem Wasser und einer eisgekühlten
wäßrigen 0,5 m Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen wird. Unmittelbar nach Beendigung des Waschens wird der Niederschlag
in einer wäßrigen 0,1 m Natriumhydrogencarbonatlösung suspendiert. Die vorstehend erwähnte Lösung des gereinigten
Antigens wird der Suspension zugesetzt, worauf die Mischung über Nacht zur Bewirkung der Reaktion gerührt wird. Das Produkt
wird mit einem Glasfilter gewaschen und zuerst mit einer wäßrigen 0,1 m Natriumhydrogencarbonatlösung, dann mit destilliertem
Wasser und zuletzt mit einer wäßrigen Phosphatpufferlösung von Natriumchlorid (0,85%ig, pH 7,0) gewaschen.
Das auf diese Weise gewaschene Reaktionsprodukt wird in ein Glasrohr mit einem Innendurchmesser von 13 mm und einer Länge
von 15 cm als Säule zur Durchführung der Affinitätschromatographie
eingefüllt. 3 ml der Lösung des nach der vorstehend beschriebenen Methode 1-1 mit Ausnahme der Stufe des Verbindens
mit den Sarkom-180-Zellen hergestellten Antikörpers (IgG)
werden in die Säule gegossen, worauf eine wäßrige 5 mM Phosphatpufferlösung
von Natriumchlorid (0,85 %ig, pH 7,0) in die Säule eingeleitet wird, bis in dem Ablauf kein Protein mehr
feststellbar ist. Dann wird eine wäßrige 0,5m Natriumchloridlösung mit einer wäßrigen 50 mM Glycinhydrochloridpufferlösung
in die Kolonne einlaufen gelassen, wobei die Fraktion als Eluat gesammelt wird. Das Eluat wird schnell mit Natriumhydrogencarbonat
neutralisiert und das Neutralisat gegen eine wäßrige Phosphatpufferlösung von Natriumchlorid (0,85 %ig,
pH 7,0) während 72 Stunden dialysiert (die äußere Flüssigkeit
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wird alle 24 Stunden ausgetauscht). Das auf diese Weise erhaltene Eluat ist eine wäßrige Lösung eines gegen Sarkom-
180 durch Säulenaffinitätschromatographie gereinigter Antikörper.
1-4: Cytotoxizitätstest gegenüber Tumorzellen und normalen
Zellen:
Die Cytotoxizität infolge von Kaninchenantisarkom-180-Antikörper,
erhalten gemäß 1-3, wird nach der unter 1-2 beschriebenen
Methode auf den Tumorzellen und normalen Zellen untersucht. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle II hervor.
Tabelle II Zellmortalität
| Verdünnung des Antikörpers, x-fach |
Sarkom-180- • Zellen |
1 10 100 1000 |
| Lösung des Antikörpers nach der Reiniqunq durch Säulenaffinitätschrcmato- |
Mausmilzzellen | +++ +++ ++ |
| graphie (3) | Sarkon-180- Zellen |
+ - - |
| Lösung des Antikörpers nach der Reinigunq durch Säulenaffinitätschromato graphie (1) |
Mausmilzzellen | 4 + + +++ ++ + |
| Vergleich (nur Eagle-MEM) |
Zellen, Sarkom | _ _ _ _ |
| Zellen, Milz | - | |
| - |
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29S2B90
Die in der Tabelle II tabellarisch zusammengefaßten Ergebnisse
zeigen die Herabsetzung der Toxizität gegenüber den Milzzellen und die Hervorhebung der Aktivität gegenüber den Sarkom-180-Zellen
des Antikörpers aufgrund der Reinigung des Antikörpers durch Affinitätschromatographie (1), d. h. sie zeigen die ausgezeichnete
Reinigung des Antikörpers durch Affinitätschromatographie (1) .
1-5: Bindung zwischen dem Anti-Sarkom-180-Antikörper und
einer Antitumorsubstanz
Jeder Kaninchen-Anti-Sarkom-180-Antikörper, hergestellt nach
den vorstehend erwähnten Methoden 1-1 und 1-3, sowie gereinigt nach jeder der vorstehend erwähnten Reinigungsmethoden, wird
zur Umsetzung mit verschiedenen Antitumorsubstanzen gebracht, wie Mitomycin C, Daunorubicin, Bleomycin, Actinomycin D, Sarkomycin
sowie Doxorubicin-hydrochlorid, wobei die jeweiligen Substanzen erhalten werden. Beispielsweise kann die Reaktion
des Antikörpers, hergestellt gemäß 1-1, mit Mitomycin C wie folgt durchgeführt werden:
Einer wäßrigen Lösung, die gereinigten Kaninchen-Anti-Sarkom-180-Antikörper
in einer Konzentration von 10,4 mg/ml enthält, werden 13,0 mg Mitomycin C zugesetzt. Unter Rühren, wobei der
pH der Lösung auf 4,75 eingestellt wird, werden 3,7 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid
zugesetzt, um eine Reaktion zu bewirken, wobei die Reaktionszeit in der
Tabelle III angegeben ist. Die Reaktion wird durch Zugabe von 2 ml einer wäßrigen Essigsäure/Natriumacetat-Pufferlösung mit
einem pH von 4,70 abgestoppt. Nach einem Dialysieren der Reaktionsmischung gegen 5 1 destilliertes Wasser bei einer Temperatur
von 40C während 72 Stunden (während der Dialyse wird die
äußere Flüssigkeit dreimal ausgetauscht) wird die innere Dialyseflüssigkeit
eingeengt und auf eine Säule mit einem Durchmesser von 1,5 cm und einer Höhe von 55 cm, die mit einem Dextrinderivat
(Sephadex G-25, hergestellt von Farmacia Japan Co.) gefüllt ist, aufgegeben, damit Substanzen mit niederem Moleku-
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29S2690
largewicht in der Reaktionsmischung vollständig an der Säule
absorbiert werden, worauf das Eluat bei einer Temperatur von -200C
zur Gewinnung des Produktes gefriergetrocknet wird. Die Menge an mit dem Antikörper verbundenem Mitomycin C wird im Verlaufe
der Zeit unter Anwendung einer UV-Absorptionsspektroskopie ermittelt. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle III hervor.
Mengen an Mitomycin C, das an den Antikörper gebunden
ist
Reaktionszeit
(Minuten) ,,,., / «
(Mikrogramm/mg)
10
60
Menqe an Mitomycin C/Antikörper
4.2
8.4
10.0
Eine der pharmazeutischen Zubereitungen ist ein modifiziertes Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 150000,
das in Wasser löslich ist und in anorganischen Lösungsmitteln, wie Benzol, Aceton, Methanol etc., unlöslich ist. Diese Verbindung
besitzt ein Infrarotabsorptionsspektrum gemäß Fig. 1. In einem UV-Absorptionsspektrum werden spezifische Absorptionspeaks
bei 280 und 360 nm beobachtet.
Nach den vorstehend erwähnten Methoden wird das gereinigte Kaninchen-Anti-Sarkom-
18 0-Antigen (10 mg) mit jeweils Doxorubicinhydrochlorid, Daunorubicin und Actinomycin D zur Gewinnung der
gebundenen Verbindungen in einer Menge von ungefähr 7 mg umgesetzt. Die Mengen an Doxorubicinhydrochlorid, die mit 1 mg
des Antikörperproteins verbunden sind, betragen 4,1 vMikrogramm
bzw. 9,0 Mikrogramm bei einer Reaktionszeit von 10 und 30 Minuten. Die gleichen Ergebnisse werden bei der Verwendung von IgG-Antikörper
erzielt.
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Anschließend wird gereinigter Kaninchen-Anti-Sarkom-180-Antikörper
mit Mitomycin C unter den gleichen Bedingungen, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, umgesetzt, wobei eine
Verbindung mit praktisch den gleichen physikalisch-chemischen Eigenschaften erhalten wird, wie sie die vorstehend erwähnte
Verbindung besitzt. Verbindungen, die an Daunorubicin, Bleomycin, Actinomycin D, Sarcomycin bzw. Doxorubicinhydrochlorid
gebunden sind, werden nach der vorstehend erwähnten Methode unter den angegebenen gleichen Bedingungen synthetisiert.
2-1: Herstellung eines Antikörpers zu Tumorzellen und Reinigung
desselben
Ascites-Sarkom-180-Zellen werden nacheinanderfolgend unter
Verwendung von ICR-Mäusen gezüchtet und von ihrer proliferativen Aktivität durch Mitomycin C befreit. Sie werden dann intraperitoneal
in eine ICR-Maus einmal pro Woche in einer Menge von 10 Zellen/Tier insgesamt viermal eingespritzt. Am 7. Tag der
letzten Injektion wird das Blut aus der großen Bauchvene nach einem Bauchschnitt unter Anästhesie entnommen und ein Antiserum
aus dem Blut in einer Menge von 53 ml aus 100 Tieren hergestellt. Das Sammeln des Antikörpers aus dem Antiserum und die Reinigung
des Antikörpers werden gemäß 1-1 durchgeführt. Die Methode wird nach der Absorption durch Erythrocyten der Maus abgestoppt.
2-2: Reinigung eines Antikörpers durch Affinitätschromatographie
zu 30 g gefriergetrockneter Ascites-Sarkom-180-Zellen, die aufeinanderfolgend
unter Verwendung von ICR-Mäusen gezüchtet worden sind, wird eine wäßrige Lösung von 3 m KCl, die mit einer
wäßrigen 5 mM Kaliumphosphatpufferlösung mit einem pH von 7,4 gepuffert worden ist, zum Extrahieren des Antigens während einer
Zeitspanne von 20 Stunden zugesetzt. Der Extrakt wird 10 Minuten bei 65000 G zum Sammeln der überstehenden Flüssigkeit
zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird weiter 30 Minuten bei 180000 G zum Sammeln einer überstehenden Flüssigkeit
030027/0888
zentrifugiert. Sie wird dann gegen destilliertes Wasser bei einer Temperatur von 40C während 72 Stunden dialysiert (während
der Dialyse wird die äußere Flüssigkeit alle 24 Stunden ausgetauscht) .
Die Affinitätschromatographie des auf diese Weise erhaltenen
Antigens von Sarkom-180 wird wie folgt durchgeführt:
20 ml eines mit Wasser gequollenen Agarosegels (Sepharose 4B, Farmacia Japan Co., Ltd.) werden mit 20 ml einer wäßrigen Bromcyanlösung
in einer Konzentration von 1 g/ml vermischt, wobei der pH der Mischung auf 11,0 eingehalten wird. Das Vermischen
erfolgt während 8 Minuten, um eine Reaktion zu bewirken. Die Reaktionsmischung wird durch ein Glasfilter filtriert. Das abgetrennte
Filtrat wird mit eisgekühltem destilliertem Wasser und einer eisgekühlten wäßrigen 0,5 m Natriumhydrogencarbonatlösung
aus dem Filter gewaschen und sofort in einer wäßrigen 0,1 m Natriumhydrogencarbonatlösung suspendiert. Die vorstehend
beschriebene gereinigte Antigenlösung wird der Suspension zugesetzt, worauf über Nacht bei Zimmertemperatur zur Bewirkung
der Reaktion gerührt wird. Das Produkt wird mit einem Glasfilter filtriert und zuerst mit einer wäßrigen 0,1 m Natriumhydrogencarbonatlösung,
dann mit Wasser und zum Schluß mit einer wäßrigen Phosphatpufferlösung von Natriumchlorid (0,85 %igf
pH 7,0) gewaschen. Das gewaschene Produkt wird in ein Glasrohr mit einem Innendurchmesser von 13 mm und einer Höhe von 15 cm
als Säule für eine Affinitätschromatographie eingefüllt.
3 mm des nach der vorstehend beschriebenen Methode 2-1 beschriebenen
Antiserums (einschließlich eines Antikörpers) werden in die Affinitätschromatographiesäule eingefüllt, worauf
eine wäßrige 5 mM Phosphatpufferlösung von Natriumchlorid (0,85
%ig, pH 7,0) auf die Säule auflaufen gelassen wird, bis kein Protein mehr in dem Ablauf feststellbar ist. Eine wäßrige 0,5m
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Natriurnchloridlösung, die mit einer wäßrigen 5 mM Glycin/Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung
versetzt worden ist (pH 4,0) , wird in die Säule zum Sammeln der Eluatfraktion laufen gelassen.
Die Eluatfraktion wird nach einer Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat
sofort gegen eine wäßrige Phosphatpufferlösung von Natriumchlorid (0,85 %ig, pH 7,0) 72 Stunden lang dialy-
siert (während der Dialyse wird die äußere Flüssigkeit alle 24 Stunden ausgetauscht). Auf diese Weise wird eine wäßrige
Lösung eines Antikörpers zu Sarkom-180 erhalten, die unter Anwendung
einer Afflnitätschromatographie gereinigt worden ist.
2-3: Cytotoxizitätstest gegen Tumorzellen und normale Zellen
Die Cytotoxizität infolge eines Mäusesarkom-180-Antikörpers
wird nach der Methode gemäß Beispiel 1 untersucht, wobei die Ergebnisse in der Tabelle IV zusammengefaßt sind.
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Zellmortalität
| Verdünnung des Antikörpers, x-fach | Sarkom-180- Zellen Mäusemilz- zellen |
1 10 100 1000 |
| Lösung des Antikör pers vor der Reinigunc durch Affinitätschro- matographie (1) (2-1) |
Sarkom-180- Zellen |
+++ ++ - |
|
Lösung des Antikör
pers nach der Reini gung durch Affinitäts- chromatoaraphie (1) (2-2) |
MäusemiIz- zellen |
+++ +++ ++ + |
|
Vergleich
(Eagle-MEM) |
Sarkom-180- Zellen |
_ _ - - |
| Mäusemilz- zellen |
- | |
| - |
Wie aus der Tabelle IV zu ersehen ist, ist die Aktivität gegenüber Sarkom-180-Zellen merklich durch die vorstehend beschriebene Affinitätschromatographie erhöht.
2-4: Verbinden von Mäuse-Anti-Sarkom-180-Antikörper mit
einer Antitumorsubstanz:
Mäuse-Anti-Sarkom-180-Antikörper, erhalten gemäß 2-1 bzw. 2-2,
werden mit Mytomycin C nach der in 1-5 beschriebenen Methode verbunden. Die zwei Substanzen werden über eine Amidobindung
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verknüpft. Nach der gleichen Methode werden jeweils Doxorubicinhydrochlorid,
Bleomycin, Daunorubicin, Actinomycin D und Sarcomycin mit dem Antikörper über eine Amidobindung
verknüpft. Die in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen pharmazeutischen Verbindungen besitzen praktisch die
gleichen physikalisch-chemischen Eigenschaften wie die gemäß 1-5 erhaltene entsprechende Verbindung. In Beispiel 3
werden die gemäß 1-5 bzw. 2-4 erhaltenen repräsentativen Verbindungen auf ihre Antitumoraktivität untersucht.
Antitumoraktivität der pharmazeutischen Zubereitung gegenüber Sarkom-180 des Festtyps
Mäuse-Sarkom-180-Zellen, die aufeinanderfolgend unter Verwendung
von ICR-Mäusen gezüchtet worden sind, werden subkutan
in die Achshöhle von jeweils Mäusen einer Gruppe transplantiert, wobei die Gruppe aus 10 Tieren besteht. Die Transplantation
erfolgt in einer Menge von 1x10 Zellen/Tier.
24 Stunden nach der Transplantation wird eine intraperitonea-Ie Injektion einer jeden der nachfolgend angegebenen Mittel
einmal pro Tag insgesamt zehnmal durchgeführt. Fünf Tage nach der letzten Injektion werden alle Mäuse zum Herausschneiden
des Tumors getötet. Das durchschnittliche Gewicht der Tumore (T) wird mit demjenigen (C) von 10 Mäusen verglichen,
denen eine wäßrige physiologische Kochsalzlösung anstelle des Mittels verabreicht worden ist. Durch die folgende
Formel wird die Inhibierungsrate der Proliferation des Tumors (Sarkom-180) durch das Mittel wiedergegeben:
(1 - ) χ 100
Die Ergebnisse sind in den Tabellen V, VI, VII und VIII zusammengefaßt.
Die vorstehend erwähnten Mittel sind folgende:
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(1) Antikörper, (2) im Handel erhältliche Tumorarzneimittel, (3) pharmazeutische Zubereitung von Kaninchen-Anti-Sarkom-180-Antikörper,
gebunden an jeweils im Handel erhältliche Antitumormittel sowie (4) pharmazeutische Zubereitung aus Mäuse-Anti-Sarkom-
18O-Antikörper, gebunden an jeweils im Handel erhältliche Antitumormittel. Die Tabelle V zeigt die pharmazeutische
Zubereitung, die mit Mitomycin C synthetisiert worden ist, die Tabelle VI eine pharmazeutische Zubereitung,
die mit Bleomycin synthetisiert worden ist, die Tabelle VII eine pharmazeutische Zubereitung, die mit Doxorubicin synthetisiert
worden ist und die Tabelle VIII die Ergebnisse der Verabreichung der Antikörper.
Mitomycin und pharmazeutische Zubereitung von Antikörpern, die an Mitomycin gebunden sind
| Mittel | Kaninchen- Antikörper |
verabreichte Menge (mg/kg) |
*HMC | Wirkung bezüglich einer Inhibierung der Proliferation (%) |
| Mitomycin C | Kaninchen- Antikörper **^2 |
insgesamt | 1 | 40 |
| Kaninchen- Antikörper **A, |
1 | 0.05 | 32 | |
| erfin- | Mäuse- Antikörper |
5 | 0.05 | 37 |
| dungs- gemäße Zuberei tung |
Mäuse- Antikörper **a |
5 | 0.05 | 40 |
| 5 | 0.05 | 39 | ||
| 5 | 0.05 | 40 | ||
| 5 |
Bemerkungen: * MMC: Mitomycin sowie
**A1 oder **A^: Antikörper, gereinigt durch Affinitätschromatographie (1) oder (3)
030027/088 8
- 29 Tubolle VI
Bleoinycin und pharmazeutische Zubereitung von /^ntikörpern,
die an Bleoniycin gebunden sind
| Mittel | erfin- dungs- geinäße Zuberei tung |
Kaninchen- Antikörper |
verabreichte Menge (mgAg) |
Bleomycin | Wirkung bezüglich einer Inhibierung der Proliferation (%) |
| Bleomycin | Kaninchen- Antikörper **A |
insgesamt | 0.5 | 45 | |
| Kaninchen- Antikörper **A |
0.5 | 0.05 | 36 | ||
| Mäuse- Antikörper |
5 | 0.05 | 42 | ||
| Mäuse- Antikörper **A |
5 | 0.05 | 45 | ||
| 5 | 0.05 | 44 | |||
| 5 | 0.05 | 45 | |||
| 5 |
030027/0888 ORIGINAL INSPECTED
Doxorubicin-HCl sowie pharmazeutische Zubereitung von Antikörpern, die an Doxorubicin-HCl gebunden
sind
| Mittel | Kaninchen- Antikörper |
verabreichte Menge (mg/kg) |
** Do. | Wirkung bezüglich einer Inhibierung der Profilation |
| Doxorubicin-hydrochlorid | Kaninchen- Antikörper** A3 |
insgesamt | 2 | 50 |
| erfin dungs gemäße Verbin dung |
Kaninchen- Antikörper* * a |
2 | 0.2 | 40 |
| Mäuse- Antikörper |
20 | 0.2 | 47 | |
| Mäuse- Antikörper* *a |
20 | 0.2 | 50 | |
| 20 | 0.2 | 49 | ||
| 20 | 0.2 | 50 | ||
| 20 |
Bemerkung: **Do.: Doxorubicin-hydrochlorid
030027/0888
Antikörper
| Antikörper | **A | Verabreichte MengWkg) |
Proliferationshemm- wirkung (%) |
| Kaninchen | 5 | 4 | |
| Kaninchen | 5 | 5 | |
| Maus | -A3 | 5 | 5 |
| Maus | -A1 | 20 | 5 |
| 20 | 5 | ||
| **Αχ | 20 | 5 | |
| 5 | 6 | ||
| **Αχ | 5 | 7 | |
| 20 | 7 | ||
| 20 | 7 |
oder **A3: Antikörper, der durch Affinitätschromatographie (1) oder
(3) gereinigt worden ist
Wie aus den Tabellen ν bis VII hervorgeht, ist die Proliferationshemmungsrate
von Sarkom-180 durch die pharmazeutische Zubereitung
tatsächlich praktisch die gleiche wie diejenige von im Handel erhältlichen Antitumormitteln in einer Dosisrate von
dem 5- bis 10-fachen der Dosisrate von im Handel erhältlichen Antitumormitteln. Dies zeigt, daß die Antitumoraktivität des
Antikörpers selbst im wesentlichen nicht in Erscheinung tritt, was auch natürlich ist. Das charakteristische Merkmal der pharmazeutischen
Zubereitung wird klar, wenn die verabreichte Menge von im Handel erhältlichen Antitumormitteln mit der Menge von
im Handel erhältlichen Antitumormitteln als einer der Komponenten der pharmazeutischen Zubereitungen verglichen wird. Wenn
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auch die Menge der letzteren nur ein Zehntel oder ein Zwanzigstel derjenigen der ersteren beträgt, ist die Hemmwirkung in
beiden Fällen praktisch die gleiche. Die vorstehend beschriebene Tatsache zeigt, daß der Antikörper, der einer der Komponenten
der pharmazeutischen Zubereitung darstellt, die kleine Menge im Handel erhältlichen Antitumormittel, das ebenfalls eine
der Komponenten der pharmazeutischen Zubereitung ist, gut an die Tumorstelle bringt. Darauf basiert die der vorliegenden Erfindung
zugrundeliegende Erkenntnis.
Die erfindungsgemäße Zubereitung hat aufgrund der vorstehend
erwähnten Funktion bei reduzierter Verabreichungsmenge an im Handel erhältlichem Antitumormittel mit an sich extrem hohen
Nebenwirkungen auf ein Zehntel bis ein Zwanzigstel der herkömmlichen Verabreichungsmenge das gleiche Ausmaß der tumorhemmenden
Aktivität.
Ferner ist darauf hinzuweisen, daß der Ursprung des Antikörpers in keiner Beziehung zu der Proliferationshemmrate des Tumors
steht. Wird die bekannte Verbindung, hergestellt durch Verbinden des Antikörpers, erzeugt unter Einsatz eines Kaninchens,
mit einer in herkömmlicher Weise gereinigten Antitumorsubstanz, an 10 Mäuse verabreicht, dann zeigen ungefähr 3 Tiere einen
allgemeinen Spasmus und werden steif, was ein Anzeichen für einen anaphylaktischen Schock ist, während bei der Verabreichung
der pharmazeutischen Zubereitung, erzeugt durch Verbinden des durch Affinitätschromatographie gereinigten Antikörpers, mit
der Antitumorsubstanz, nur im wesentlich vermindertem Ausmaße einen derartigen anaphylaktischen Schock bedingt. Die Verbindung,
die durch Verbinden des auf eine Maus zurückgehenden Antikörpers, gereinigt nach einer herkömmlichen Methode, mit
der Antitumorsubstanz hergestellt worden ist, bedingt ursprünglich nur in extremen Fällen einen anaphylaktischen Schock,
wird jedoch der Antikörper durch Affinitätschromatographie weitergereinigt, dann wird niemals ein Schock beobachtet.
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4-1: Herstellung eines Antikörpers und Reinigung desselben durch Affinitätschromatographie
Nacheinander folgend unter Verwendung von Donryu-Ratten hergestellte
Yoshida-Sarkom-Zellen werden in tiner wäßrigen physiologischen
Kochsalzlösung suspendiert. Nach der Zugabe von Mitomycin C (50 Mikrogramm/ml) zu der Suspension wird die Mischung
30 Minuten bei 37°C bebrütet und zur Entfernung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Die Zellen werden dreimal
mit einer 0,85 %igen physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Freund1sches vollständiges Adjuvans (Freud's complete adjuvant,
nachfolgend als FCA bezeichnet) wird mit den auf diese Weise von ihrer proliferativen Aktivität befreiten Yoshida-Sarkom-Zellen
vermischt, worauf die Mischung in die Fußsohle eines Kaninchens mit einem Körpergewicht von 2,9 kg in einer Menge von
10 Zellen/Tier eingespritzt wird. 2 Wochen nach der ersten Injektion wird die zweite Injektion der Zellen unter Verwendung
des gleichen Kaninchens sowie unter Anwendung einer ähnlichen Methode angewendet, um das Kaninchen zu immunisieren. 2 Wochen
nach der zweiten Injektion werden die gleichen Zellen intravenös in das gleiche Kaninchen eingespritzt. Eine Woche nach der
letzten Injektion wird das ganze Blut aus dem Kaninchen C. irch
eine Kanüle gesammelt, die in die Halsschlagader eingeführt worden ist. Das aus dem Blut hergestellte Antiserum wird wie
folgt gereinigt: zu 100 ml des Antiserums wird eine solche Menge an Ammoniumsulfat gegeben, die 20 bis 30 Gew.-% der Sättigungsmenge entspricht, um ein Aussalzen zu bewirken. Die ausgesalzene Fraktion wird erneut in 20 ml Wasser aufgelöst. Die auf
diese Weise gebildete Lösung wird gegen eine wäßrige 10 mM Phosphatpufferlösung von Natriumchlorid (nachfolgend als PBS be
zeichnet) mit einem pH von 7,0 bei einer Temperatur von 40C
während 72 Stunden dialysiert (während der Dialyse wird die äußere Flüssigkeit alle 24 Stunden ausgetauscht). Eine gleiche
Menge an Erythrocyten einer normalen Donryo-Ratte, die dreimal
mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen worden ist,
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wird mit dem Dialysat vermischt. Nach einem Stehenlassen während
30 Minuten bei 40C zur Bewirkung einer Absorption wird
die Mischung zentrifugiert, wobei eine überstehende Flüssigkeit erhalten wird. Die vorstehend beschriebene Absorptionsmethode
wird viermal wiederholt, so daß die Absorption insgesamt fünfmal durchgeführt wird. Der auf diese Weise erhaltene Antikörper
wird als vorgereinigter Antikörper bezeichnet (in herkömmlicher Weise als IgG bezeichnet).
Anschließend wird der IgG weiter nach der folgenden Methode
gereinigt. Der überstehenden Flüssigkeit, die einer fünfmaligen Absorption unterzogen worden ist, wird eine gleiche Menge an
Yoshida-Sarkom-Zellen zugemischt, worauf man die Mischung 30 Minuten bei 40C zum Verbinden des Antikörpers gegenüber Yoshida-Sarkom
mit den Zellen von Yoshida-Sarkom stehen läßt, worauf die Mischung zur Entfernung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert
wird. Dem Niederschlag wird eine wäßrige Glycinhydrochlorid-Pufferlösung
mit einem pH von 3,0 zugesetzt, um den Antikörper freizusetzen. Die Mischung wird dann zum Sammeln
der überstehenden Flüssigkeit, die den Antikörper enthält, zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird mit einer
wäßrigen 0,1 m Natriumhydroxidlösung bis nahe zum Neutralpunkt behandelt und gegen PBS 24 Stunden bei 40C dialysiert (die äußere
Dialyseflüssigkeit wird alle 8 Stunden ausgetauscht). Das auf diese Weise erhaltene Dialysat ist eine wäßrige Lösung von
Kaninchen-Anti-Yoshida-Sarkom-Immuno-Antikörper.
4-2: Cytotoxizitätstest gegenüber Tumorzellen und normalen Zellen:
Die Cytotoxizität infolge des Kaninchen-Anti-Yoshida-Sarkom-Immuno-Antikörpers
gegen Zellen in Gegenwart eines Komplements (Serum eines Meerschweinchens) wird wie folgt untersucht:
Die vorstehend erwähnte wäßrige Lösung des Antikörpers wird auf das Zehnfache, Hundertfache und Tausendfache verdünnt.
Die Verdünnungen werden jeweils mit einer Suspension von Yoshida-Sarkom-Zellen oder einer Suspension der Milzzellen einer nor-
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malen Donryu-Ratte (in beiden Suspensionen wird Eagle-MEM
als Medium eingesetzt und die Konzentration der Zellen beträgt 5 χ 10 Zellen/ml) in einem Verhältnis von 100 Mikrolitern:100
Mikrolitern vermischt, worauf die Mischung 15 Minuten zur Absorption der Zellen stehengelassen wird.
100 Mikroliter des Serums eines Meerschweinchens, verdünnt mit Eagle-MEM auf das Zweifache (das verdünnte Serum wird
als Komplement bezeichnet) werden der vorstehend beschriebenen Mischung zugesetzt. Die letztlich erhaltene Mischung
wird 30 Minuten bei einer Temperatur von 37°C bebrütet und dann zentrifugiert. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag
wird einmal mit Eagle-MEM gewaschen. Nach der Zugabe von einer Trypanblau-Lösung wird die Mortalität der Zellen
in dem gewaschenen und gefärbten Niederschlag mikroskopisch beobachtet.
Die Ergebnisse des Tests gehen aus der Tabelle IX hervor. Wie der Tabelle IX zu entnehmen ist, wird dann, wenn die
Mortalität der Zellen (Zellstörungsaktivität) in drei Grade eingeteilt und mit +, ++ und +++ bezeichnet wird (wobei
kein Todesfall durch "-" bezeichnet wird), festgestellt, daß die Toxizität des nach der Reinigung des Antiserums erhaltenen
Antikörpers gegenüber Yoshida-Sarkom-Zellen nicht wesentlich von der Toxizität des Antikörpers verschieden
ist, der ohne Reinigung des Antiserums erhalten worden ist, wobei jedoch die Toxizität im ersteren Falle gegenüber den
Milzzellen einer normalen Donryu-Ratte extrem niedrig ist, so daß keine Ratten getötet werden. Dies zeigt, daß die
Reinigung des Antiserums für die erfindungsgemäßen Zwecke geeignet ist.
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Zellrnortalität
Verdünnung der wäßrigen Lösung des Antikörpers, x-fach
Lösung des Antikörpers vor der Reinigung durch Af fini-'tätschrcmatographie
(3)
Yoshida-Sarkorn-Zel len
Rattenmil^ze]len
Lösung des Antikörpers nach der Reinigung durch Affinitätschromatographie
(3)
Yoshida-Sarkom-Zellen
1 10 100 1000
RattenmiIzzellen
Yoshida-Sarkom-Zellen
Vergleich
(Eagle-MEM)
(Eagle-MEM)
Die als Beispiel für normale Zellen eingesetzten Donryu-Ratten-Milzzellen
werden nach einem Herausschneiden der Leber, einer Zerkleinerung der Leber mit einem Pinzettenpaar in Eagle-MEM,
Durchlaufenlassen der Fragmente durch ein Stahlsieb mit einer Maschenöffnung von 200 mesh, einmaliges Waschen der durchgegangenen Fragmente mit Eagle-MEM, Vermischen mit 30 ml eines
wäßrigen Tris-(hydroxylmethylamino)-methans, gepuffert mit einer 0,75 %igen Ammoniumchloridlösung mit einem pH von 7,4
zur Zerstörung der Arythrocyten in der Probe und dreimaliges Waschen der Fragmente mit Eagle-MEM erhalten.
4-3: Reinigung eines Antikörpers durch Affinitätschromatographie
(1) :
Die nachfolgend beschriebene Reinigung eines Antikörpers wird durch Affinitätschromatographie durchgeführt, wobei
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eine Säule rait einem Träger, an den ein Tumorantigen gebunden
worden ist, verwendet wird. Zunächst wird das Antigen selbst in der folgenden Weise gereinigt: Yoshida-Sarkom-Tumorzellen,
die nacheinander folgend unter Verwendung von Donryu-Ratten gezüchtet worden sind, werden gefriergetrocknet.
Zu 30 g dieser Zellen wird eine wäßrige Lösung von 3 m KCl, gepuffert mit einer wäßrigen 5 mM Kaliumphosphatpufferlösung
(pH 7,4) zugesetzt, um das Antigen während 20 Stunden zu extrahieren. Die Extraktflüssigkeit wird 10
Minuten bei 65000 G zum Sammeln der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit Weiter 30 Minuten
bei 180000 G zum Sammeln einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert, die 70 Stunden bei 40C dialysiert wird (während
der Dialyse wird die äußere Flüssigkeit alle 24 Stunden ausgetauscht) . Das Dialysat wird weiter bei 65000 G zur Entfernung
des Niederschlags zentrifugiert. Nach einem Zusatz von Airononiumsulfat zu der überstehenden Flüssigkeit zur Einstellung
einer Konzentration von 2 m wird die Mischung 10 Minuten bei 65000 G zum Sammeln eines Niederschlags zentrifugiert,
der in destilliertem Wasser aufgelöst wird. Die Lösung wird gegen destilliertes Wasser 72 Stunden dialysiert (während der
Dialyse wird die äußere Flüssigkeit alle 24 Stunden ausgetauscht) .
Unter Verwendung des auf diese Weise erhaltenen Yoshida-Sarkom-Antigens
wird die Säule für die Affinitätschromatographie in der folgenden Weise präpariert:
Zu 20 ml eines in Wasser gequollenen Agarosegels (Sepharose 4Hf hergestellt von Farmacia Japan Co., Ltd.) werden 20 ml
einer wäßrigen Bromcyanlösung mit einer Konzentration von 1 g/ml zugesetzt. Während der pH bei 11,0 gehalten wird,
läßt man die Mischung 8 Minuten zur Durchführung der Reaktion stehen, worauf die Reaktionsmischung mit einem Glasfilter
filtriert wird. Der auf dem Filter zurückbleibende Niederschlag wird mit eisgekühltem destilliertem Wasser und
dann mit einer eisgekühlten wäßrigen 0,5 m Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, worauf sich eine Dispergierung
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des gewaschenen Niederschlages in einer wäßrigen 0,1 m
Natriumhydrogencarbonatlösung anschließt.
Die vorstehend erwähnte wäßrige Lösung des gereinigten Antigens wird der Dispersion zum Reagierenlassen der zwei Komponenten
durch Rühren über Nacht bei Zimmertemperatur zugesetzt. Das Produkt wird mit einem Glasfilter filtriert und
zuerst mit einer wäßrigen 0,1m Natriumhydrogencarbonatlösung, dann mit destilliertem Wasser und zuletzt mit einer wäßrigen
Phosphatpufferlösung von Natriumchlorid (0,85 %ig, pH 7,0)
gewaschen.
Das auf diese Weise gewaschene Reaktionsprodukt wird in ein Glasrohr mit einem Durchmesser von 13 mm und einer Höhe von
15 cm zur Herstellung einer Säule für die Affinitätschromatographie
eingefüllt. In diese Säule werden 3 ml der iAntikörperlösung (IgG), hergestellt nach der vorstehend beschriebenen
Methode 4-1 (mit Ausnahme der Stufe des Verbindens mit den Yoshida-Sarkom-Zellen) einlaufen gelassen,
worauf eine wäßrige 5 mM Phosphatpufferlösung von Natriumchlorid (0,85 %ig, pH 7,0) in die Säule eingefüllt wird,
bis kein Protein mehr in dem Ablauf feststellbar ist. Dann wird eine wäßrige 0,5 m Natriumchloridlösung mit einer wäßrigen
0,50 mM Glycin/Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH
4,0) in die Säule zum Sammeln der Ablauffraktion eingeführt, die sofort mit Natriumhydrogencarbonat neutralisiert
wird. Das Neutralisat wird gegen eine wäßrige Phosphorsäurepufferlösung von Natriumchlorid (0,85 %ig, pH 7,0) 72 Stunden
dialysiert (während der Dialyse wird die äußere Flüssigkeit alle 24 Stunden ausgetauscht). Auf diese Weise erhält
man eine wäßrige Lösung von durch Affinitätschromatographie gereinigtem Antikörper gegen Yoshida-Sarkom.
4-4: Cytotoxizitätstests gegenüber Tumorzellen und normalen Zellen
Die Cytotoxizität aufgrund des in der vorstehend unter 4-3 beschriebenen Weise erhaltenen Yoshida-Sarkom-Immuno-Anti-
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körpers wird nach der in 4-2 beschriebenen Methode untersucht, wobei die Ergebnisse in der Tabelle X zusammengefaßt
sind.
Zellmortalität
| Verdünnung des Antikörpers, x-fach |
Yoshida-Sarkarr-Zel len | 1 10 100 1000 |
| Lösung des Antikör pers nach der Reini gung durch Äffini- |
Rattenmilζzellen | +++ +++ ++ |
| tätschromatographie (3) |
Yoshida-Sarkom-Zel len | + - - |
| Lösung des Antikör pers nach der Reini gung durch Affini tätschromatographie (T) |
Rattenmilzzellen | +++ · +++ ++ + |
| Vergleich (Eagle-MEM) |
Yoshida-Sarkcm-Zellen | _ |
| Rattenmilzzellen | - | |
| - |
Die Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität des Antikörpers zu Yoshida-Sarkom-Zellen merklich erhöht ist, wobei jedoch der
Antikörper zu den Rattenmilzzellen durch die Reinigung durch Säulenaffinitätschromatographie vermindert ist, und daß die
Reinigung durch Affinitätschromatographie ausgezeichnet ist.
4-5: Verbinden von Anti-Yoshida-Antikörper mit einem Antitumoralkylierungsmittel
Kaninchen-Anti-Yoshida-Sarkom-Antikörper, hergestellt und
gereinigt gemäß 4-1 und 4-3, werden mit einem der herkömm-
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lichen Antituinormittel zur Reaktion gebracht, und zwar mit
Chlorambucil, Melphalan (Phenylalaninsenf) ACNU, Uramustin
sowie Cyclophosphamid, wobei jeweils gebundene Verbindungen synthetisiert werden. Nachfolgend werden Synthesebeispiele
beschrieben:
Synthesebeispiel 1 :
Reaktion des Antikörpers mit Chlorambucil
Zu 10 ml einer wäßrigen Lösung, die gereinigten Kaninchen-Antikörper
gegen Yoshida-Sarkom, erhalten gemäß 4-1, in einer Menge von 10,0 mg/ml enthält, werden 4 0 ml Chlorambucil
unter Rühren zugesetzt, während der pH der Lösung auf 4,75 mit Chlorwasserstoffsäure eingestellt wird. 25,2 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)
carbodiimidhydrochlorid werden der Mischung zur Durchführung einer Reaktion während 40 Minuten
zugegeben. Die Reaktion wird durch Zugabe von 20 ml einer wäßrigen Essigsäure/Natriumacetat-Pufferlösung mit
einem pH von 4,75 abgestoppt.
Anschließend wird die Reaktionsmischung gegen 5 1 destilliertes Wasser 72 Stunden bei 40C dialysiert (während der Dialyse
wird die äußere Flüssigkeit dreimal ausgetauscht). Nach dem Einengen der inneren Dialyseflüssigkeit wird das Kondensat
durch eine Säule mit einem Durchmesser von 3 cm und einer Höhe von 65 cm, die mit einem Dextrinderivat (Sephadex G-200,
hergestellt von der Farmacia Japan Co., Ltd.) gefüllt ist, zur Vervollständigung der Abtrennung der Substanzen mit hohem
Molekulargewicht geschickt, während die Substanzen mit niederem Molekulargewicht in der Lösung verbleiben. Der Ablauf
aus der Säule wird 60 Minuten bei 40000 G ultrazentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit bei -200C gefriergetrocknet
wird. Dabei erhält man die gesuchte Substanz. Der Proteingehalt des Produkts wird nach der Copper-Folin-Methode
unter Verwendung von Albumin als Standard ermittelt, während die Menge an gebundenem Alkylierungsmittel nach der
Methode von Epstein (Epstein, J. Anal, ehem., 27, 1423 (1955))
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gemessen wird. Die Ergebnisse zeigen, daß in der erhaltenen
pharmazeutischen Zubereitung 10 Mikrogramm Chlorainbucil an 1 ing des Antikörpers gebunden sind.
Umsetzung des Antikörpers mit Melphalan
Nach der in dem Synthesebeispiel 1 beschriebenen Weise, wobei jedoch die gleiche Menge an Melphalan anstelle von Chlorambucil
eingesetzt wird und außerdem 5 1 PBS anstelle von destilliertem Wasser bei der Dialyse verwendet werden, wird der
gereinigte Kaninchenantikörper mit Melphalan verbunden, wobei eine pharmazeutische Zubereitung erhalten wird, in welcher
10 Mikrogramm Melphalan an 1 mg des Antikörpers gebunden sind.
Reaktion des Antikörpers mit Uramustin
Nach der in Synthesebeispiel 1 beschriebenen Weise, wobei jedoch 40 ma Uramustin anstelle von Chlorambucin eingesetzt werden,
läßt man den gereinigten Kaninchenantikörper mit Uramustin reagieren. Man stellt jedoch fest, daß Uramustin sich
nicht wesentlich mit dem Antikörper verbindet. Daher wird Chloressigsäure mit Uramustin zur Umsetzung gebracht, um die
Reaktivität zu erhöhen. Zu diesem Zweck werden 10 ml Methanol, 500 mg Uramustin und 139 mj Kaliummethylat aufgelöst, worauf
188 mg Chloressigsäure der Lösung zugesetzt werden. Anschließend wird 60 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Beendigung
der Reaktion wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird aus Methanol und
Chloroform umkristallisiert. Dabei erhält man 215 mg (Ausbeute 35 %) Kristalle, die der Struktur eines Uramustinderivats
gemäß folgender Formel, ermittelt durch eine Analyse, entsprechen:
0 30027/0888
CH2-COOH
CH CH2Cl
CH CH Cl (zersetzt sich bei ungefähr 2 2 2000C)
ElementarenaIyse :
gefunden :
berechnet als C Η,,Ν Ο Cl.
| c% | 50 | 4 | H% | N% | 30 |
| 38. | 70 | 4 | .00 | 13. | 54 |
| 38. | .19 | 13. | |||
Anschließend bringt man das auf diese Weise erhaltene Uramustinderivat
zur Reaktion mit dem Kaninchen-Antikörper gegen Yoshida-Sarkom, erhalten gemäß 4-1, und zwar in der gleichen
Weise wie im Falle des Snythesebeispiels 1· Dabei erhält man
die gesuchte pharmazeutische Zubereitung, in der 10 Mikrogramm Uramustin mit 1 mg des Antikörpers verbunden sind.
Umsetzung des Antikörpers mit einem Melphalanderivat
Zunächst wird ein Melphalanderivat aus Melphalan in der folgenden Weise synthetisiert:
In 10 ml Dimethylsulfoxid werden 200 mg des Silbersalzes von
Melphalan aufgelöst, worauf 100 mg Chloressigsäure der Lösung zugesetzt werden. Dann wird während 64 Stunden unter Abschirmung
von Licht gerührt. Nach einem Entfernen des Niederschlags aus der Reaktionsmischung werden Dimethylsulfoxid und Chloressigsäure
unter vermindertem Druck auf einem Wasserbad bei einer Temperatur von 800C abdestilliert.
0 30027/0888
Nach der Zugabe von Wasser zu dem Rückstand und Abkühlen der Mischung scheiden sich weiße Kristalle ab. Die abgeschiedenen
Kristalle werden unter vermindertem Druck getrocknet. Das auf diese Weise erhaltene Melphalanderivat (Ausbeute 40 %)
wird zur Reaktion mit dem Antikörper verwendet, der gemäß 4-1 erhalten worden ist, und zwar nach der in Synthesebeispiel
2 beschriebenen Methode, wobei eine pharmazeutische Zubereitung erhalten wird, in der 16 Mikrogramm des Melphalanderivats mit
1 mg des Antikörpers verbunden sind.
Der gemäß 4-3 erhaltene und gereinigte Kaninchenantikörper gegenüber Yoshida-Sarkom wird mit jeder der folgenden Verbindungen
in der gleichen Weise wie im Synthesebeispiel 1 beschrieben zur Umsetzung gebracht:
Chlorambucil, Melphalan, einem Melphalanderivat (vgl. Synthesebeispiel
4) und einem Uramustinderivat (vgl. Synthesebeispiel 3).
Die auf diese Weise jeweils synthetisierte pharmazeutische Zubereitung
ist praktisch die gleiche Zubereitung, wie sie jeweils im Falle der vorstehend erwähnten Synthesebeispiele erhalten
worden ist.
5-1: Herstellung und Reinigung eines Antikörpers gegen
Tumorzellen
Yoshida-Sarkom-Zellen des Ascites-Typs, die nacheinanderfolgend
unter Verwendung von Dunryu-Ratten gezüchtet worden sind, werden einmal pro Woche insgesamt viermal in die Bauchhöhle
einer Donryu-Ratte transplantiert. Sieben Tage nach der
vierten Transplantation wird das Blut aus der großen Bauchvene der Ratte, die einer Laparotomie unter Anästhesie unterzogen
030027/0888
worden ist, gesammelt. Das die Antikörper enthaltende Antiserum
wird aus dem Blut hergestellt, wobei die Menge 70 ml aus 100 Ratten beträgt. Die Herstellung des Antikörpers aus
dem Antiserum sowie die Reinigung desselben erfolgen nach der in 4-1 beschriebenen Weise, wobei jedoch die Methode nach der
Absorption mit Rattenerythrocyten abgestoppt wird.
5-2: Reinigung des Antikörpers durch Affinitätschromatographie
(1)
In 30 g gefriergetrockneter Yoshida-Sarkom-Zellen, die aufeinanderfolgend
durch Züchten von Donryu-Ratten hergestellt worden sind, wird eine wäßrige 3m KCl-Lösung, die mit einer wäßrigen
5 mM Kaliumphosphat-Pufferlösung mit einem pH von 7,4 gepuffert worden ist, zugesetzt, um die Extraktion des Antigens
während 20 Stunden zu bewirken. Die Extraktflüssigkeit wird 10 Minuten mit 65000 G zum Sammeln einer überstehenden Flüssigkeit
zentrifugiert, die weiter während 30 Minuten bei 180000 G zum Sammeln einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert wird.
Die Flüssigkeit wird bei einer Temperatur von 40C 72 Stunden
gegen destilliertes Wasser dialysiert (während der Dialyse wird die äußere Flüssigkeit alle 24 Stunden ausgetauscht).
Die durchgeführten Affinitätschromatographiemethoden unter
Einsatz des auf diese Weise erhaltenen Antigens von Yoshida-Sarkom sind praktisch die gleichen, wie sie im Falle des
Antigens von Sarkom-180 gemäß 1-3 von Beispiel 1 (1-3) durchgeführt
worden sind.
5-3: Störungstest gegen Tumorzellen und Normalzellen
Die Störung aufgrund des Rattenantikörpers gegenüber Yoshida-Sarkom
wird nach der in Beispiel 4 beschriebenen Methode untersucht, wobei die Ergebnisse aus der Tabelle XI hervorgehen.
030027/0888
Zellrnortalität
Verdünnung der wäßrigen Lösung des Antikörpers, x-fach
Antikörper vor der
Reinigung durch
Af f in i ta tschrorratographie (1)
Reinigung durch
Af f in i ta tschrorratographie (1)
Antikörper nach der
Reinigung durch
Affinitätschrcmatographie(1)
Reinigung durch
Affinitätschrcmatographie(1)
Vergleich
(Eagle-MEM)
(Eagle-MEM)
Ycshida-Sarkom-Zellen
Ratteiimi 1 zzellen
Yoshida-Sarkorn- Zellen
Rattenmi1ζ zellen
Yoshida-Sarkom-Zellen
Rattenmilzzellen■
10
100 1000
Wie aus der Tabelle XI ersichtlich ist, ist die Aktivität des Antikörpers gegenüber Yoshida-Sarkom-Zellen merklich durch
die Affinitätschromatographie (1) wie im Falle der vorangegangenen
Beispiele erhöht worden.
5-4: Verbinden des Rattenantikörpers gegen Yoshida-Sarkom mit Antitumor-Substanzen
Die nach den Methoden 5-1 und 5-2 erhaltenen Rattenantikörper
gegen Yoshida-Sarkom werden jeweils mit Chlorambucil nach der in 4-5 beschriebenen Methode verbunden, wobei pharmazeutische
Zubereitungen mit Amidverknüpfungen zwischen den zwei Komponenten erhalten werden.
030027/0888
Durch Anwendung der gleichen Methode auf Melphalan, ein
Melphalanderivat und ein Uramustinderivat werden jeweils
Produkte mit einer Bindung zwischen dem Antikörper und jeder der vorstehend erwähnten pharmazeutischen Zubereitungen
mit einer Amidverknüpfung erhalten.
Alle auf diese Weise erhaltenen pharmazeutischen Zubereitungen
besitzen praktisch die gleichen physikalisch-chemischen Eigenschaften wie die entsprechenden pharmazeutischen
Zubereitungen, die nach den vorstehend unter 4-5 beschriebenen Methoden erhalten worden sind.
Antitumorwirkung gegen Yoshida-Sarkom
Yoshida-Sarkom-Zellen, die aufeinanderfolgend unter Verwendung von Donryu-Ratten gezüchtet worden sind, werden in die
Bauchhöhle von insgesamt 10 Ratten in einer Gruppe von Donryu-Ratten in einer Menge von 1x10 Zellen/Tier transplantiert.
24 Stunden nach der Transplantation wird jeweils eines der nachfolgend angegebenen Mittel intraperitoneal in
jede der Ratten in den Gruppen einmal pro Tag insgesamt zehnmal injiziert. Nach einer Beobachtung der Mortalität der
Ratten wird die Lebensverlängerungsrate des Mittels durch Berechnen des Wertes erhalten, der durch Teilen der durchschnittlichen
Anzahl der Überlebenstage der behandelten Ratten in einer Gruppe (T) durch die Durchschnittsanzahl der
Überlebenstage der Vergleichstiere (C) und Multiplikation mit 100, d. h. anhand der Formel 100 χ T/C, erhalten wird.
Die Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Tests gehen aus den Tabellen xil bis XVI hervor. Die Mittel bestehen aus
Chlorambucil und Chlorambucil + Antikörper (Tabelle XII), Melphalan und Melphalan + Antikörper (Tabelle XIII), einem
Uramustinderivat und einem Uramustinderivat + Antikörper (Tabelle XIV), einem Melphalanderivat und einem Melphalanderivat
+ Antigen (Tabelle XV) und den Antikörpern selbst (Tabelle XVI).
0 3 0027/0888
| Mittel | Kaninchen-Antikörper | verabreichte Menge (irgAg) |
Lebensverlänge rungsrate (%) |
| Chlorambucil | Kaninchen-Antikörper | Mittel Chlorambucil | |
| erfin dungs gemäße Zube reitung |
♦Kaninchen-Antikörper. | 1.0 1.0 | 259 |
| Ratten-Antikörper | 10.0 0.1 | 230 | |
| * Ratten-Antikörper | 10.0 0.1 | 238 | |
| 10.0 0.1 | 240 | ||
| 10.0 0.1 | 235 | ||
| 10.0 0.1 | 245 |
Bemerkung: * gibt an, daß der Antikörper., durch Affinitätschromatcgraphie (1)
gereinigt worden ist
| Mittel | Kaninchen-Antikörper | verabreichte Menge (mg/kg) |
Melphalan | Lebensverlän- gerungsrate (%] |
| Melphalan | *Kaninchen-AntikÖrper3 | Mittel | 1.5 | 230 |
| ♦Kaninchen-Antikörper- | 1.5 | 0.15 | 230 | |
| erfin | Ratten-Antikörper | 15.0 | 0.15 | 237 |
| dungsge mäße Zu- ' berei tung |
♦Ratten-Antikörper.. | 15.0 | 0.15 | 240 |
| 15.0 | 0.15 | 230 | ||
| 15.0 | 0.15 | 245 | ||
| 15.0 |
030027/0888
Mittel
Uranus tinderivat
erfindungsjemäße Zuberei
tung
tung
Kan inchen-Ant ikörper Kaninchen-Antikörper,
Kaninchen-Antikörper.. Ratten-Antikörper
*Ratten-Antikörper1
| Menge | 5 | Lebensverlänge rungsrate (%) |
|
| I verabreichte (mgA?) |
Mittel Uramustin | 0.5 | |
| 5 | 0.5 | 290 | |
| 50 | 0.5 | 260 | |
| 50 | 0.5 | 264 | |
| 50 | 0.5 | 265 | |
| 50 | 270 | ||
| 50 | 285 |
| Mittel | Kaninchen-Antikörper | verabre (mg Mittel |
ichte Menge Ag) |
.5 | Lebensverlän gerungsrate (%) |
| Melphalanderivat | ^Kaninchen-Antikörper, | 1.5 | Melphalan | .24 | 230 |
| ^Kaninchen-Antikörper.. | 15.0 | 1 | .24 | 260 | |
| erfin dungsge mäße Zu berei tung |
Ratten-Antikörper | 15.0 | 0 | 24 | 278 |
| * Ratten-Antikörper.. | 15.0 | 0 | 24 | 280 | |
| 15.0 | 0 | 24 | 270 | ||
| 15.0 | 0 | 290 | |||
| 0. |
Bemerkung: * gibt an, daß der Antikörper., oder der Antikörper, in den
Tabellen XIII bis XV durch Affinitätschrcmatographie (1)
oder (3) gereinigt worden ist
030027/0888
| * | Kaninchen | * | lYsbelle XVI | Tßbonsverl fincjerungsrate | |
| Antikörper |
Ratte
* |
verabreichte .'-fcnge (mg/kg) |
100 | ||
| Kaninchen | Ratte | 5 | 105 | ||
| 5 | 105 | ||||
| 20 | 105 | ||||
| 20 | 110 | ||||
| 5 | 120 | ||||
| 5 | 120 | ||||
| 20 | 120 | ||||
| 20 | |||||
* gibt an, daß der Antikörper durch Affinitätschromatographie (1) oder
(3) gereinigt worden ist
Wie aus den Tabellen XII bis XV erkennbar ist, ist die Lebensverlängerungsrate
der pharmazeutischen Zubereitung bei Ratten praktisch die gleiche wie diejenige der im Handel erhältlichen
Antitumprsubstanz bei einer Verabreichung in einer Dosisrate
von dem 5- bis 10-fachen derjenigen der im Handel erhältlichen Antitumorsubstanz. Diese Tatsache ist natürlich und zeigt,
daß die Tumor-hemmende Aktivität des Antikörpers nicht bei dem Grad der Dosisrate entwickelt wird (vgl. Tabelle XVI).
Die Eigenschaften der pharmazeutischen Zubereitung werden deutlich,
wenn die Verabreichungsmenge der im Handel erhältlichen Antitumorsubstanz als Komponente der pharmazeutischen Zubereitung
mit der Verabreichungsmenge einer derartigen Antitumorsubstanz selbst als Mittel verglichen wird. Die erstere ist
nur ein Zehntel oder ein Zwanzigstel der letzteren, im ersteren -Falle wird jedoch im wesentlichen die gleiche Lebensverlängerungsrate
wie im letzteren Falle erzielt. Dies ist das Ergebnis des wirksamen Transports der im Handel erhältlichen Antitumorsubstanz
an die Tumorstelle durch den Antikörper, der ei-
030027/0888
ne andere wirksame Komponente der pharmazeutischen Zubereitung
ist. Auf dieser Erkenntnis beruht die vorliegende Erfindung.
Die pharmazeutische Zubereitung zeigt aufgrund der vorstehend beschriebenen Funktion das gleiche Ausmaß der Tumorhemmungsaktivität
trotz der Verminderung der eingesetzten Menge der herkömmlichen im Handel erhältlichen Antitumorsubstanz
auf ein Zehntel bis auf ein Zwanzigstel, wobei die Nebenwirkungen der im Handel erhältlichen Substanzen extrem hoch sind.
Ferner ist insbesondere darauf hinzuweisen, daß das Auftreten eines anaphylaktischen Schocks, das in dem Falle festgestellt
wird, in welchem der unter Verwendung von Kaninchen hergestellte Antikörper,der nach einer herkömmlichen Methode gereinigt
worden ist, mit einer im Handel erhältlichen Antitumorsubstanz verbunden wird und die gebundene Substanz an Ratten verabreicht
wird, in dem Falle wesentlich reduziert ist, in welchem der Antikörper nach dem erfindungsgemäßen affinitätschromatographischen
Verfahren gereinigt worden ist. Eine derartige Verminderung des Auftretens von anaphylaktischen Schocks wird
im Falle des Antikörpers gegenüber Sarkom-180 gemäß Beispiel 3 festgestellt. Die vorteilhafte Wirkung der Affinitätschromatographie
zeigt sich wiederum im Falle einer Bekämpfung von Yoshida-Sarkom. In dem Falle, in welchem ein Antikörper verwendet wird,
der unter Verwendung von Mäusen hergestellt und durch Affinitätschromatographie gereinigt wird, zeigt die Verabreichung der
pharmazeutischen Zubereitung, die unter Verwendung dieses Antikörpers hergestellt worden ist, keine anaphylaktischen Schocks
bei Ratten.
7-1: Herstellung und Reinigung eines Antikörpers gegenüber
Tumorzellen
50 ml Blut werden aus einem menschlichen Patienten von 50 Jah-
030027/0888
ren, der an rektalem Krebs leidet, gesammelt. 22 ml eines Antiserums,
das einen Antikörper enthält, werden aus dom Blut erhalten.
7-2: Reinigung des Antikörpers durch Affinitätschromatographie
(D
Dem gefriergetrockneten Tumor, der aus dem vorstehend erwähnten
Patienten herausoperiert worden ist, werden 50 ml einer 3m Kaliumchloridlösung zugesetzt, die mit einer 5 mM Kaliumphosphatpufferlösung
auf einen pH von 7,4 gepuffert worden ist, um das Antigen während 20 Stunden zu extrahieren.
Nach einem Zentrifugieren der Extraktflüssigkeit während 10
Minuten bei 65000 G wird die überstehende Flüssigkeit gesammelt und gegen destilliertes Wasser 72 Stunden bei 40C dialysiert
(während der Dialyse wird die äußere Flüssigkeit alle 24 Stunden ausgetauscht). Die Affinitätschromatographie des auf diese
Weise erhaltenen Antigens des Tumors des Patienten wird in der gleichen Weise wie unter 1-3 in Beispiel 1 beschrieben
worden ist durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Lösung des Antiserums verwendet wird, die den Antikörper, erhalten gemäß
7-1 aus dem Patienten, und nicht den Antikörper, erhalten aus einer Maus, enthält.
Der auf diese Weise erhaltene Antikörper ist ebenfalls in Wasser löslich, jedoch in organischen Lösungsmitteln, wie Methanol,
Äthanol, Aceton und Benzol, unlöslich und zeigt Infrarot- und UV-Absorptionsspektren, wie sie durch die Fig. 2 bzw. 3
wiedergegeben werden. Das Molekulargewicht beträgt ungefähr 150000, während ein Rf-Wert von 0 bis 0,1 bei einem Scheibenelektrophoresediagramm
ermittelt wird.
030027/0888
8-1 : Herstellung und Reinigung eines Antikörpers unter Anwendung einer Affinitätschromatographie (3)
Mitomycin C (50 Mikrogramm/ml) wird zu den P-388 Tumorzellen
des Ascites-Typs zugegeben, die unter Verwendung von DBA/2-Mäusen erhalten worden sind und in einer wäßrigen
physiologischen Kochsalzlösung suspendiert worden sind.
Nach einem Bebrüten der Mischung während 30 Minuten bei 37CC
wird die überstehende Flüssigkeit durch Zentrifugieren entfernt, worauf die Zellen dreimal mit einer wäßrigen 0,85 %igen
physiologischen Kochsalzlösung gewaschen werden-
Die Impfmethoden der auf diese Weise behandelten P388-Tumorzellen,
die von ihrer proliferativen Aktivität befreit worden sind, auf Kaninchen sowie die sich anschließenden Methoden
zur Gewinnung der wäßrigen Lösung des Kaninchen-Anti-P-388-Tumorantikörpers entsprechen der Methode 1-1 gemäß Beispiel
1 .
8-2: Cytotoxizitätstest gegenüber Tumorzellen und normalen Zellen
Die Cytotoxizität infolge des auf diese Weise erhaltenen Kaninchen-Antikörpers gegenüber P-388-Tumor auf Zellen wird
in Gegenwart eines Komplements (Serum eines Meerschweinchens) nach der in 1-2 gemäß Beispiel 1 beschriebenen Methode ermittelt,
wobei die Ergebnisse in der Tabelle XVII zusammengefaßt sind.
030027/0888
Zellmortalität
Verdünnung der wäßrigen Lösung des Antigens, x-fach
Antikörperlösung vor der Reinigung durch Affinitätschromatographie
(3)
Antikörperlcsung nach dei Reinigung durch Affinitätschrcinatographie
(3)
Vergleich
(Eagle-MEM)
(Eagle-MEM)
P-383-Tuimrzellen
Rattoruni Iz zoll en
P-338-Tunorzellen
Rattenmi Izzellen
P-388-Tuirorzellen
Rattenmi lzzellen
10
100 1000
T+ +
~i Γ
Zusätzlich werden die Milzzellen von DBA/2-Mäusen, die als
Beispiel für normale Zellen verwendet werden, nach der in 1-2 gemäß Beispiel 1 beschriebenen Methode behandelt.
8-3: Reinigung des Antikörpers unter Anwendung einer Affinitätschromatographie
(1)
Der Antikörper von Mäuse-Anti-P-388-Tumor wird unter Verwendung einer Säule mit einem Träger gereinigt, an den Antigen
von P-388-Tumor gebunden worden ist. Die Methoden selbst sind die gleichen wie sie in 1-3 gemäß Beispiel 1 beschrieben worden
sind, mit der Ausnahme, daß die Tumor-P-388-Zellen verwendet
werden, die nacheinander folgend unter Verwendung von DBA/2-Mäusen anstelle der Sarkom-180-Zellen des Ascites-Typs verwendet
werden, die aufeinanderfolgend unter Verwendung von ICR-
030027/0888
Mäusen erhalten worden sind.
8-4: Cytotoxizität gegenüber Tumorzellen und normalen Zellen
Die Cytotoxizität infolge des Kaninchen-Immino-Antikörpers gegen
P-388-Tumor wird nach der in 8-2 beschriebenen Methode ermittelt, wobei die Ergebnisse aus der Tabelle XVIII hervorgehen.
Tabelle XVIII
Zellrtortalität
| Verdünnung der Lösung Antikörpers, x-fach |
des | 1 | 10 | 100 1000 | - |
| Lösung des Antikörpers nach der Reinigung durch Affijiitätschromatonraphie |
P-388-Tumorzellen | ♦♦♦ | - | ||
| (3) | Mäusemilzzellen | ♦ | - | - | - |
| Lösung des Antikörpers nach der Reinigung durch Affinitätschromatographie |
P-388-Tumorzellen | ||||
| (1) | Mäusemilzzellen | - | - | ||
| Vergleich (Eagle-MEM) |
P-388-Tumorzellen | - | - | ||
| Mäusemilzzellen | - | - |
030027/0888
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die /aktivität des
Antikörpers gegenüber P-388-Tumorzellen merklich erhöht ist,
und die Toxizität des Antikörpers gegenüber den Milzzellen durch die Reinigung durch Affinitätschromatographie herabgesetzt
wird, und zwar wie im Falle der anderen bereits erwähnten Antikörper, woraus hervorgeht, daß die Reinigung
infolge der Affinitätschromatographie (1) eine ausgezeichnete Wirkung bedingt.
8-5: Verbinden des Anti-P-388-Tumorantikörpers mit Antitumor-Anti-Metaboliten
Kaninchen-Anti-P-388-Antikörper, hergestellt nach der Methode gemäß 8-1 und 8-3, sowie gereinigt nach den dort angegebenen
Methoden, läßt man mit jeweils Cytarabin, Methotrexat und 5-Fluoruracil zur Synthese von Verbindungen reagieren,
die eine Amidbindung zwischen dem Antikörper und dem Antimetaboliten
aufweisen. Nachfolgend werden Beispiele zur Durchführung der Verbindung angegeben.
In eine wäßrige Lösung, die 10,0 mg gereinigten Kaninchen-Anti-P-388-Tumorantikörper
in 1 ml enthält, werden 20,0 mg Cytarabin gegeben, worauf 30 mg 1-Ä'thyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid
der Mischung zugegeben werden, die man während der nachfolgend angegebenen Zeitspanne reagieren
läßt. Dann werden 2 ml einer wäßrigen Essigsäure/Natriumacetat-Pufferlösung
zum Abstoppen der Reaktion zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird gegen 5 1 destilliertes Wasser
72 Stunden bei 4°C dialysiert (während der Dialyse wird die äußere Flüssigkeit alle 24 Stunden ausgetauscht). Nach einem
Einengen der inneren Flüssigkeit wird diese durch eine Säule mit einem Durchmesser von 1,5 cm und einer Höhe von
55 cm geschickt, die mit einem Dextrinderivat gefüllt ist (Sephadex G-25, hergestellt von der Farmacia Japan Co., Ltd.),
030027/0888
um die Substanzen mit niederem Molekulargewicht in der Reaktionsmischung
vollständig an der Säule zu adsorbieren. Der Ablauf wird bei einer Temperatur von -200C zur Gewinnung der
gesuchten Substanz gefriergetrocknet. Die gebundene Menge an Cytarabin, und zwar als Funktion der Reaktionszeitspanne,
geht aus der Tabelle XIX hervor.
Reaktionszeit (Minuten) Cytarabin (Mikrogramm)/Antikörper (mg)
10 4,8
30 8,2
60 11,0
In eine wäßrige Lösung, die 10 mg Kaninchen-Antikörper gegenüber P-388-Tumor enthält, hergestellt und gereinigt gemäß
8-1 von Beispiel 8, und zwar in 1 ml, werden 6,0 mg Methotrexat zugesetzt. Der pH der Lösung wird auf 4,75 durch Zugabe
von Chlorwasserstoffsäure unter Rühren eingestellt, wobei 2,5 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid
zur Bewirkung der Reaktion während der weiter unten angegebenen Zeitspanne zugesetzt werden. Die Reaktion
wird dann durch Zugabe von 2 ml einer wäßrigen Essigsäure/ Natriumacetat-Pufferlösung abgestoppt. Die Reaktionsmischung
wird gegen 5 1 destilliertes Wasser 72 Stunden bei 4°C dialysiert (während der Dialyse wird die äußere Flüssigkeit alle
24 Stunden ausgetauscht).
Die dialysierte innere Flüssigkeit wird wie im Falle des Synthesebeispiels
6 behandelt, wobei die gesuchte pharmazeutische Zubereitung erhalten wird. Die Menge an gebundenem Methotrexat
geht aus der Tabelle XX als Funktion der Reaktionszeitspanne hervor.
030027/0888
Reaktionszeit (Minuten) Methotrexat, Mikrogramn/Antikör-
per (mg)
10 3,6
30 6,5
90 15,0
Verbinden von 5-Fluoruracil mit dem Antikörper
Unter Verwendung von Kaninchen-Antikörper gegenüber P-388-Tumor,
hergestellt und gereinigt gemäß 8-1 von Beispiel 8, sowie 34,7 mg 5-Fluoruracil wird eine Reaktion nach der in
Synthesebeispiel 7 beschriebenen Weise durchgeführt, wobei jedoch das erhaltene Produkt im wesentlichen keinen 5-Fluoruracilanteil
enthält. Nach einem Einführen einer Carboxylgruppe in 5-Fluoruracil nach der folgenden Methode wird die
Bindereaktion nach der in 8-1, Beispiel 8, beschriebenen Methode durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltene gebundene
pharmazeutische Zubereitung enthält 10 Mikrogramm 5-Fluoruracil pro mg des Antikörpers.
Das carboxylierte 5-Fluoruracil wird wie folgt synthetisiert;
Zu 10 ml Methanol werden 500 mg 5-Fluoruracil und 86 mg Kaliumhydroxid zugesetzt, worauf man 3 ml destilliertes
Wasser der Mischung zugibt. Zu der auf diese Weise gebildeten transparenten Flüssigkeit werden 145 mg Chloressigsäure
auf einmal zugesetzt, worauf die Mischung 60 Stunden bei Zinunertemperatur gerührt wird. Nach Beendigung der Reaktion
wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand aus Äthanol und Chloroform umkri-
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stallisiert. Dabei erhält man 495 mg (Ausbeute 49 %) weißer Kristalle, die als die Verbindung identifiziert werden, welche
die nachfolgend angegebene Struktur besitzt, wobei die Identifizierung durch Infrarotspektroskopie und Elementaranalyse
erfolgt:
schmilzt bei 160 - 165°C unter „ Zersetzung)
CH2-COOH
Elementaranalyse
gefunden berechnet als
| C | 40% | 2 | H | 10 | N |
| 27. | 43 | 1 | .00% | 10 | .30% |
| 27. | .91 | .66 | |||
,H1-6 b
Kaninchen-Antikörper gegenüber P-388-Tumor, hergestellt und gereinigt gemäß 8-3 von Beispiel 8, läßt man mit jeweils
Cytarabin, 8-Azaguanin, Methotrexat, Aminoputerinnatrium
sowie dem Derivat von 5-Fluoruracil (vgl. Synthesebeispiel
8) zur Gewinnung von jeweils gebundenen pharmazeutischen Zubereitungen umsetzen, die im wesentlichen der pharmazeutischen
Zubereitung ähnlich sind, die gemäß den Synthesebeispielen 6 bis 8 erhalten worden ist.
9-1: Herstellung und Reinigung eines Antikörpers zu Tumorzellen
p-388-Tumorzellen des Ascitestyps, die nacheinander folgend
unter Verwendung von DSA/2-Mäusen hergestellt und von ihrer
030027/0888
proliferativen Aktivität durch M.itomvcin C befreit worden
sind, werden intraperitoneal in DBA/2-Mäuse einmal pro Woche in einer Rate von 10 Zellen/Tier eingeimpft. Sieben
Tage nach der vierten Beimpfung wird das Blut aus der großen Bauchvene nach einer Laparotomie unter Anästhesie gesammelt,
worauf das Antiserum, das den Antikörper enthält, aus dem Blut gewonnen wird. Die Gesamtmenge des Antiserums
betragt 53 ml aus 100 Mäusen. Die Herstellung und Reinigung des Antikörpers aud dem Antiserum wird nach der in Beispiel
8 unter 8-1 beschriebenen Methode durchgeführt.
9-2: Reinigung des Antikörpers durch Affinitätschromatographie:
Die gefriergetrockneten Zellen von P-388-Tumor des Ascitestyps werden in der gleichen Weise wie die Zellen von Yoshida-Sarkom
gemäß 4-3, Beispiel 4, behandelt, wobei jedoch das Aussalzen durch Ammoniumsulfat und das anschließende Zentrifugieren
entfallen. Auf diese Weise wird eine wäTrige Lösung des Antikörpers gegen P-388-Tumor des Ascitestyps, gereinigt
durch Affinitätschromatographie, erhalten.
9-3: Störungstest gegen Tumorzellen und normale Zellen
Die Störung infolge des Mäuseantikörpers gegenüber P-388-Tumor des Ascitestyps, erhalten gemäß 9-2, wird nach der in
Beispiel 1 beschriebenen Methode untersucht, wobei die Ergebnisse aus der Tabelle XXI hervorgehen.
030027/0888
Zellmortalität
| Verdünnung der Lösung des Antikörpers, x-fach |
P-388-Tumorzellen | 1 10 100 1000 | _ | - |
| Antikörper vor der Rei nigung durch Äffinitäts- chramatographie (1) |
Käusemilzzellen | +++ ++ | ||
| Antikörper nach der Rei nigung durch Aff initäts- chrcmatographie (1) |
P-388-Tumorzellen | _ | ||
| Vergleich | Mäusemilzzellen | +++ · +++ ++ + | ||
| (Eaale-MEM) | P-388-Turrorzel len | _ | ||
| Mäusemilzzellen |
Wie aus der Tabelle XXI ersichtlich ist, wird die Aktivität des Antikörpers gegenüber P-388-Tumorzellen merklich bei Anwendung
der in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Affinitätschromatographiemethoden
erhöht.
9-4: Verbinden von Mäuseantikörper gegenüber P-388-Tumor mit Antitumorantimetaboliten
Die Mäuseantikörper gegen P-388-Tumor, erhalten nach den Methoden gemäß 9-1 und 9-2 in Beispiel 9, werden jeweils mit
Antimetaboliten verbunden, und zwar mit Cytarabin, Methotrexat, Aminoputerinnatrium, 8-Azaguanin sowie 5-Fluoruracil,
und zwar nach der unter 8-5 in Beispiel 8 beschriebenen Weise. Dabei erhält man pharmazeutische Zubereitungen, in denen
der Antikörper mit dem Antimetaboliten über eine Amidbindung
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verknüpft ist. Diese pharmazeutischen Zubereitungen besitzen praktisch die gleichen physikalisch-chemischen Eigenschaften
wie die entsprechende pharmazeutische Zubereitung, die gemäß 8-5, Beispiele , erhalten worden ist.
Antitumorwirkung der pharmazeutischen Zubereitung gegenüber P-388-Tumor
P-388-Tumorzellen, die aufeinanderfolgend unter Verwendung
von DBA/2-Mäusen gezüchtet worden sind, werden in die Bauchhöhle von jeweils 10 DBA/2-Mäusen einer Gruppe in einer Menge
von 1 χ 10 Zellen/Tier transplantiert. 24 Stunden nach der Transplantation wird eine wäßrige Lösung eines jeden der
folgenden Antitumormittel intraperitoneal an die Mäuse einmal pro Tag während 5 aufeinanderfolgender Tage insgesamt fünfmal
verabreicht. Nach einer Beobachtung der Mortalität der Mäuse wird die durchschnittliche Anzahl der Überlebenstage
der behandelten Gruppe von Mäusen (T) und die Mortalität von Vergleichstieren (transplantiert, jedoch ohne Verabreichung)
(C) nach der Beziehung (100 χ T/C) ermittelt. Die Ergebnisse gehen aus den Tabellen XXII bis XXVI hervor. Die Tabelle XXVI
zeigt die Ergebnisse, die erzielt werden, wenn nur der Antikörper verabreicht wird.
Die in diesem Beispiel eingesetzten Antitumormittel sind folgende:
(1) Antimetabolische Antitumormittel: Cytarabin, Methotrexat, Aminoputerinnatrium sowie 5-Fluoruracilderivat,
(2) gebundene pharmazeutische Zubereitung aus dem Kaninchen-Antikörper,
der nicht durch Affinitätschromatographie gereinigt worden ist, und einem der vorstehend erwähnten
antimetabolisehen· Antitumormitteln
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(3) gebundene pharmazeutische Zubereitung aus dem Kaninchen-Antikörper,
der durch Afflnitätschromatographie (1) gereinigt worden ist, und einem der vorstehend erwähnten antimetabolischen
Antitumormitteln,
(4) gebundene pharmazeutische Zubereitung aus dem Mäuse-Antikörper,
der nicht durch Afflnitätschromatographie gereinigt
worden ist, und einem der vorstehend erwähnten antimetabolischen Antitumormittel und
(5) gebundene pharmazeutische Zubereitung aus den Mäuse-Antikörper,
der durch Affinitätschromatographie (1)gereinigt worden ist, und einem der vorstehend erwähten antimetabolischen
Antitumormittel.
| Mittel | Kaninchen-Antikörper | verabreichte Menge | Lebensver längerungs |
| Cytarabin | *Kaninchen-Antikörpar | Mittel Cytarabin (mg/kg) (mg/kg) |
rate (%) |
| erfin- dungsge- ' mäße Zu berei tung |
Mäuse-Antikörper | 20 20 | 220 |
| *Mäuse-Antikörper | 200 2 | 200 | |
| 200 2 | 210 | ||
| 200 2 | 210 | ||
| 200 2 | 215 |
Bemerkung: * gibt an, daß der Antikörper durch Affinitätschromatographie
(1) gereinigt worden ist
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Tabelle XXIII
| Mittel | Kaninchen-Antikörper | verabreichte Menge | 3 | Lebensverlän |
| Methotrexat | *Kaninchen-Antikörper | Mittel Methotrexat (mg/kg) (mg/kg) |
0.3 | gerungsrate (%) |
| Mäuse-Antikörper | 3 | 0.3 | 2 50 | |
| erfin- dungsge- |
*Mäuse-Antikörper | 30 | 0.3 | 190 |
| mäße Zu berei tung |
30 | 0.3 | 210 | |
| 30 | 230 | |||
| 30 | 240 |
| Mittel | "Kaninchen-Antikörper | verabreichte Menge | Lebensverlän gerungsrate (%) |
| AminopterinnatriuTQ | *Kaninchen-Antikörper | Mittel Aminopterin- (mg/kg) natrium |
270 |
| Mäuse-Antikörper | 3 3 | 240 | |
| erfin- | *Mäuse-Antikörper | 30 . 0.3 | 245 |
| dungsge- näße Zu berei tung |
30 0.3 | 250 | |
| 30 0.3 | 260 | ||
| 30 0.3 |
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| Mittel | Kaninchen-Antikörper | verabreichte Menge | Lebensver längerungs rate (%) |
| 5-Fluoruracilderivat | ♦Kaninchen-Antikörper | Mittel 5-Fluoruracil- (mg/kg) derivat (mgAg) |
185 |
| erfin dungsge mäße Zu bereitung |
Mäuse-Antikörper | 50 50 | 160 |
| *Mäuse-Antikörper | 500 5 | 170 | |
| 500 5 | 165 | ||
| 500 5 | 180 | ||
| 500 5 |
| Antikörper | * | Dosisrate (mgAg) | LebensVerlängerungsrate (%) |
| Kaninchen | Kaninchen *■ |
5 | 100 |
| Maus * |
5 | 105 | |
| Maus * |
20 | 105 | |
| 20 | 105 | ||
| 110 | |||
| 5 | 120 | ||
| 20 | 120 | ||
| 20 | 120 |
Benerkung: * zeigt, daß das Antigen durch Äff initätschranatographie (1)
gereinigt worden ist
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Das wesentliche Merkmal der erfindunosgemäßen Zubereitung
tritt zuerst dann zutage, wenn die verabreichte Menge eines im Handel erhältlichen Antitumormittel selbst zu der
verabreichten Menge des gleichen Antitumormittels als Komponente der pharmazeutischen Zubereitung verglichen wird. Trotz
der Tatsache, daß die letztere nur ein Zehntel bis ein Zwanzigstel der ersteren beträgt, ist die Lebensverlängerungsrate
infolge der letzteren praktisch gleich derjenigen infolge der ersteren. Diese Tatsache ist auf die Erscheinung
zurückzuführen, daß der Antikörper in günstiger Weise das im Handel erhältliche Antitumormittel an d ie Tumorstelle
in dem Tierkörper transportiert. Die pharmazeutische Zubereitung entwickelt aufgrund der vorstehend erwähnten Funktion
ihre Antitumoraktivität in dem gleichen Ausmaße wie das im Handel erhältliche Antitumormittel mit extrem hohen
Nebenwirkungen, wobei die Menge eines derartigen im Handel erhältlichen Antitumormittels auf 1/10 bis 1/20 herabgesetzt
wird.
Ferner ist insbesondere darauf hinzuweisen, daß in dem Falle, daß der Antikörper, der unter Verwendung eines Kaninchens
hergestellt wird, mit jeweils einem im Handel erhältlichen Antitumormittel verbunden und an Mäuse verabreicht wird, ein
anaphylaktischer Schock, wie ein allgemeiner Spasmus sowie eine Versteifungswirkung, im Falle von ungefähr drei Mäusen
von ungefähr 10 Mäusen auftreten, während im Falle einer pharmazeutischen Zubereitung, die durch Verbinden des gleichen
Antitumormittels mit dem Antikörper hergestellt worden ist, der unter Verwendung eines Kaninchens hergestellt worden
ist, wobei die Reinigung durch Affinitätschromatographie erfolgt ist, im wesentlichen keine derartigen anaphylaktischen
Schocks auftreten. Die pharmazeutische Zubereitung, die durch Verbinden des Antikörpers, hergestellt unter Verwendung
von Mäusen und gereinigt durch Affinitätschromatographie, mit dem gleichen im Handel erhältlichen Antitumormittel erhalten
worden ist, zeigt keine derartigen anaphylaktischen
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Schocks. Diese Erkenntnis geht aus den Beispielen 3 und 6 hervor, welche die Wirksamkeit der Affinitätschromatographie
zur Entfernung der Ursache derartiger anaphylaktischer Schocks zeigen.
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-Cf
L e e r s e i t e
Claims (8)
- Γ' ι.ϊ.ι. it-i'.oit ι·: · πι·;ι' ι κ ι, · st ü <"> \ · π ι;η γ ι; ι.γλ τ ι. .\ ία .ν NV Λ ι. ι ■>:DR. WOLFGANG MÜLLER-BORt (PATtNTANWALTVON 1027-1975) OR. PAUL DEUFEL. DIPL-CHEM. DR ALf FiED SCHÖN, DIPL.-CHKM. WERNER HERTEL. DIPL.-I'HYS.K 1439Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha,
8 Horidome-cho 1-chome, Nihonbashi,
Chuo-ku, Tokyo, JapanPharmazeutische ZubereitungPatentansprüchePharmazeutische Zubereitung mit Antitumoraktivität, die keine Pyrexie und Anaphylaxie verursacht, gekennzeichnet durch eine Antitumorsubstanz mit wenigstens einer Aminogruppe oder Carboxylgruppe, die an einen Antitumorantikörper über eine Amidbindung gebunden ist, der durch
Afflnitätschromatographie gereinigt worden ist.*. 4 · POSTFACH* ÖBOTL'ir· WAIiE LrxH; ITlTOMtXCHEN Ke-SlEBEUTSTR. 4 · POSTFACH" OTOTL'ir· WAVE LTXtijlTHlSr AT -TKL. <0S9) 47 4005 · TELEX 3-24 Ϊ85_ 2 — - 2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antitumorantikörper durch Reinigung einer Immunoglobulin-G-Fraktion unter /anwendung einer Affinitätschromatographie erhalten worden ist.
- 3. Zubereitung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antitumorantikörper ein Antitunioralloantikörper ist, der durch Affinitätschromatographie gereinigt worden ist.
- 4. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antitumorsubstanz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus antibiotischen Substanzen, antimetabolischen Substanzen sowie Alkylierungsmitteln besteht.
- 5. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminogruppe oder die Carboxylgruppe der Antitumorsubstanz in der Weise eingeführt wird, daß die Antitumorsubstanz in Reaktion mit einer Verbindung der folgenden FormelX(CH2JnCOOHgebracht wird, worin X für ein Chlor- oder Bromatom steht und η eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet.
- 6. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminogruppe oder die Carboxylgruppe der Antitumorsubstanz in der Weise eingeführt wird, daß die Antitumorsubstanz in Reaktion mit einer Verbindung der FormelHCl-NH0(CH0) COX δ Zngebracht wird, worin X für ein Chlor- oder Bromatom steht und η eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet.
- 7. Zubereitung nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Affinitätschromatographie ein Träger verwendet worden ist, an welchem Moleküle des030027/0888Tuinorantigens gebunden sind.
- 8. Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in eine Kolonne eingepackt worden ist.030027/0888
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