DE2616407B2

DE2616407B2 -

Info

Publication number: DE2616407B2
Application number: DE2616407A
Authority: DE
Inventors: Rudolph Dr. 3550 Marburg Barth; Oskar Dr. 3551 Niederwetter Jaeger
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1976-04-14
Filing date: 1976-04-14
Publication date: 1979-06-21
Also published as: DK162977A; GB1565453A; JPH021807B2; US4115195A; DE2616407A1; IL51864A0; DE2616407C3; NL188206B; IL51864A; BE853604A; NL7703880A; AT362496B; MX4221E; CA1092973A; LU77110A1; IE44815L; JPS52125620A; IE44815B1; ES457600A1; NL188206C

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Tollwut-Impfstoffs

Es sind schon inaktivierte Impfstoffe und Lebend Impfstoffe zur Immunisierung gegen Tollwut bekannt Die inaktivierten Tollwut-Impfstoffe bestehen aus Suspensionen von virushaltigem Zentralnervengewebe von infizierten Tieren, wie Kaninchen oder Schafen, oder aus Suspensionen von infizierten Entenembryonen Solche Impfstoffe haben den Nachteil, daß sie infolge des hohen Gehalts an Fremdproteinen unerwünschte Nebenreaktionen nach sich ziehen, sowohl an der Injektionsstelle als auch allgemeiner Art Bei der Anwendung von Tollwutimpfstoff aus Zentralnervenge webe kann es beim Menschen sogar zu Neurokomplikationen mit bleibenden Schaden kommen, zumal fur eine ausreichende Tollwut-Schutzbehandlung zahlreiche Injektionen erforderlich sind Ähnliche Nebenreaktionen wie beim Menschen wurden auch bei Tieren beobachtet

Man hat auch schon versucht, das Tollwutvirus in Gewebekulturen aus Zellinien von Baby-Hamster Nie ren, wie BHK 21-Zellen, in NIL Zellen, in Pnmarzellen von Hamsternieren oder in Huhnerembryofibroblasten zellen zur Vermehrung zu bringen und daraus inaktivierte Impfstoffe fur das Tier herzustellen Zur Gewinnung von Tollwut Lebend-Impfstoffen fur das Tier wurden Pnmarzellen aus Nieren von Schweinen oder Hamstern oder Zellinien von Hunde- oder Rindernierenzellen verwendet Dabei wurden aber nicht die Viruskonzentrationen wie mit Zentralnervensystem-Material erzielt Ausreichend hohe Virustiter sind aber Voraussetzung fur wirksame Tollwut-Impfstoffe, insbe sondere fur inaktivierte Impfstoffe Außerdem haftet einigen der benutzten Zellen der Nachteil an, daß sie bösartige Tumoren erzeugen können

Die Verwendung von Serum, das bei der Virusvermehrung in der Zellkultur höhere Konzentrationen an Virus erbringen wurde, verbietet sich, da das Fremdserum zur Bildung unerwünschter Antikörper fuhren wurde Man hat sich damit geholfen daß man in den Produktionsgang eine Stufe zur Konzentrierung virushaltiger Losung eingeschaltet hat, ζ B eine Fallung, Zentnfugation oder Ultrafiltration, somit Maßnahmen, durch die das Produktionsverfahren schwieriger und teurer wird

Mit Huhnerembryofibroblastenzellen wurden Spitzentiter in Versuchsimpfstoffen zur Anwendung am Tier von 10⁵⁰—10⁶⁰ PFU/ml (plaque forming units/ml) oder 6,IxIO⁶ Babymaus LD₅₀/ml (LD = letale Dosis) be schrieben, somit Titerhohen die keine Gewahr fur eine gute Immunisierung geben

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines Tollwut Impfstoffs durch Adaption des Tollwutvirus an Huhnerembryofibroblasten-Zellkulturen gefunden, bei dem das Tollwutvirus bei der Adaption in steigenden Verdünnungen von ]0~' bis 10~⁵ zur Beimpfung der Zellkulturpassagen und bei der Vermehrung in Verdun nungen zwischen 10~² und 10 ⁵ zur Beimpfung der

ίο Vermehrungskulturen verwendet wird, und die virushaltige Suspension gegebenenfalls nach Inaktivierung zu einem Impfstoff aufgearbeitet wird

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform wird bei einer Temperatur von 30-38⁰C, vorzugsweise 32-37°C, gearbeitet

In der schweizerischen Patentschrift 4 55 148 ist bereits ein Verfahren zur Herstellung eines Tollwutimpfstoffes unter Verwendung von Huhnerembryozell kultur beschrieben, von diesem Verfahren unterscheidet sich das erfindungsgemaße Verfahren insbesondere in folgenden Punkten

Bei dem bekannten Verfahren wird von einem adaptierten Virus ausgegangen, das in Huhnerembryozellkulturen zu wachsen vermag Ein gewöhnlicher (Straßen )Virusstamm ist nicht geeignet Eine solche Beschrankung ist im Falle der vorliegenden Erfindung nicht notwendig

Beim bekannten Verfahren erfolgt die Verdünnung des geernteten Virus in aufeinanderfolgenden lOfach-Stufen Weiter verwendet wird das Virus von dem am meisten verdünnten Impfmaterial, das Wachstum zeigt Dieses Verfahren wird »Grenzverdunnung« genannt Das Prinzip hierbei ist, daß diejenige Virusverdunnung verwendet wird, in der das Virus im Tierversuch gerade

J5 noch nachweisbar ist Im Gegensatz zu diesem bekannten Verfahren wird erfindungsgemaß in sich erhöhenden Verdünnungen gearbeitet, die im Bereich von 10-' bis 10~⁵ liegen können Maßgebend fur den Übergang von einer Verdünnung zur nächsthöheren Virusverdunnung ist die Vermehrungskinetik des Virus in der vorangegangenen Passage Fur die Weiterverar beitung wird hier nicht die Virusverdunnung verwendet, in der das Virus gerade noch nachweisbar ist, sondern diejenige, die die beste Virusvermehrung zeigt Dieses Verfahren ermöglicht es, auch Tollwutvirusstamme, die noch nicht an Huhnerembryofibroblastenzellen adap tiert sind, als Ausgangsmatenal fur die Gewinnung hoher Virusausbeuten in diesen Zellen zu verwenden
Beim bekannten Verfahren wird zur Erzielung guter Ergebnisse die Verwendung von Impfmaterial empfohlen, das aus einer Suspension von etwa 1% Embryomatenal des Flury-Stammes des Tollwutvirus besteht Das entspricht einer Verdünnung von 10~² Gemäß der Erfindung stellt die Viruskonzentration der Passagenreihe 10~³ das Saatmatenal fur einen inaktivierten Tollwutimpfstoff dar Im Verbrauch von lOmal weniger des wertvollen Saatmaienals gegenüber dem Stand der Technik wird ein weiterer Vorteil der Erfindung gesehen

Aus dem obenerwähnten Begriff der »Grenzverdunnungsreinigungspassagen« kann geschlossen werden, daß die Virusverdunnungen nicht zum Zwecke Adaption des Virus an ein Zellsystem hergestellt wurden (was ohnehin nicht notwendig ist, da zwangsläufig von

b5 adaptierten Zellen ausgegangen werden muß), sondern zur Reinigung des Virusstammes, insbesondere zum Ausschluß von Fremdviren Demgegenüber ist es das Ziel der Erfindung durch eine stufenweise sich

erhöhende Virusverdunnung, die sich an der Vermehrungskinetik orientiert, eine erhöhte Virusausbeute /.α erzielen und dabei Saatvirus einzusparen

Endlich wird nach dem bekannten Verfahren ein Impfstoff mit einem Titer von 10⁴³ Mause Letaldosen 50/ml erhalten Aus diesem verhältnismäßig niedrigen Titer kann geschlossen werden, daß mit dem bekannten Verfahren nur Tollwut-Lebendimpfstoffe hergestellt werden können Die niedrige Viruskonzentration, der angegebene Wirkungstest und das Fehlen eines Hinweises auf einen Inaktivierungsvorgang deuten darauf hin, daß mit Hilfe des bekannten Verfahrens nur Lebendimpfstoffe zur Verwendung am Tier hergestellt werden können Demgegenüber werden gemäß der Erfindung Virussuspensionen mit Titern von 10⁸⁰ bis 10⁸⁶ oder 10⁷⁴ LD₅₀/ml erreicht Diese Werte sind 1000-bis 10 OOOmal hoher als die des Standes der Technik Ein so hoher Virustiter laßt auch die Herstellung von inaktivierten Tollwutimpfstoffen zu

Das ermöglicht nicht nur die Herstellung eines Lebend-Impfstoffes zur Verwendung am Tier, sondern auch die Herstellung eines inaktivierten Impfstoffes zur Verwendung am Menschen gemäß dem erfindungsge maßen Verfahren

Fur das erfindungsgemaße Verfahren sind alle fur die 2d Tollwutvirus Impfstoff Herstellung gebräuchlichen Tollwutstamme geeignet, ζ B die Tollwutvirusstamme Flury, LEP und Flury HEP, der Tollwutvirus fixe Stamm VPIl, der Tollwutvirus fixe Stamm Pasteur und der PM Stamm (PM = Pitman-Moore) JO

Huhnerembryonen fur die Fibroblastenzellen sind billig, leicht zu beschaffen und ergeben eine gute Zellausbeute Zweckmäßig verwendet man fur einen Tollwutimpfstoff zur Anwendung am Menschen Huhnerembryonen aus sogenannten SPF Eiern, das sind Eier von Huhnern, die in eigens zu diesem Zweck eingerichteten Hühnerfarmen spezifisch pathogenfrei aufgezogen und gehalten werden Gewebekulturen von SPF Eiern sind frei von unerwünschten Fremdviren, die in Eiern der üblichen Huhnerhaltung beobachtet wurden, wie das Virus der infektiösen Bursitis, der infektiösen Laryngotracheitis, der Influenza Typ A, der Geflugelpocken, der aviaren Encephalomyelitis der Einschlußkorperchen Hepatitis, der infektiösen Bron chitis, der Geflugelleukose, der Marek-Krankheit, der 4) Newcastle-Krankheit, von aviaren Reoviren, von aviaren Adenoviren, von Mycoplasma gallisepticum von Mycoplasma synoviae und von Salmonella pullo rum Die Benutzung von Huhnerembryofibroblastenzel len zur Herstellung eines Tollwutimpfstoffes zur Anwendung am Menschen ist neu und bisher nicht beschrieben worden

Erfindungsgemaß geht man fur die Herstellung des Tollwut-Impfstoffs so vor, daß man das Tollwutvirus an primäre Huhnerembryoblastenzellen adaptiert, das adaptierte Virus in primären Huhnerembryofibroblastzellen vermehrt und die virushaltige Suspension gegebenenfalls nach Inaktivierung auf bekannte Weise zu einem Impfstoff aufarbeitet Nur mit den erfindungsgemaß adaptierten Tollwutviren lassen sich bei der Virusvermehrung so hohe Viruskonzentiationen erzielen, daß ein brauchbarer Tollwutimpfstoff daraus hergestellt werden kann

Als Ausgangsmatenal benutzt man zweckmäßig virushaltiges Saugetiergehirn, insbesondere Gehirn von Kaninchen, ζ B Stamm VP 11 oder Stamm Pasteur oder Stamm PM oder Huhnerembryohomogenisat, ζ Β Stamm Flury LEP oder Flury HEP und bringt es auf eine Einschichtzellage von primären Huhnerembryofibro blastenzellen

Geht man gemäß dem Stand der Technik vor und übertragt unverdünntes Virusmaterial, um eine höchstmögliche Zellzahl zu infizieren, so werden wenig Zellen besiedelt, es ändert sich bei den folgenden Passagen die Zahl der infizierten Zellen nicht oder sie geht sogar zurück Von einer Adaption des Virus an die Zelle kann nicht gesprochen werden, auf diese Weise ist sie nicht zu erreichen

Verdünnt man demgegenüber die fur die Passagen vorgesehene virushaltige Suspension auf 10"¹ bis 10~⁵, so kann ein Tollwutvirus erhalten werden, das fur die Herstellung eines Tollwutimpfstoffes geeignet ist Maßgebend fur den Übergang von einer Verdünnung zur nächsthöheren ist die Vermehrungskinetik des Virus in der vorangegangenen Passage Da sich Virusstamme auch schon bei der Verdünnung 10~² gut vermehren lassen, werden zunächst Passagen mit den Verdünnungen 10-' und 10"²des Ausgangsmatenalsausgeführt

Zur Kontrolle der Virusvermehrung werden gleichartig behandelte und infizierte Deckglaskulturen in Leighton-Rohrchen mitgefuhrt Wenn die Deckglaskultur mit einem fluoreszeinmarkierten Antitollwut-Gam maglobuhn gefärbt wird, kann das gefärbte Präparat unter dem Fluoreszenz-Mikroskop ausgewertet und aus dem Prozentsatz der mit Tollwutvirus infizierten Zellen auf die Vermehrungskinetik geschlossen werden Es werden genügend Kontrollen angesetzt, damit die Virusbesiedlung der Zellen taglich verfolgt werden kann Fur jede Ablesung werden 1—2 Rohrchen benotigt

Zunächst werden die Zellen mit Virus nur zögernd besiedelt, die Besiedlung nimmt aber bei erfmdungsgemaßem Vorgehen im Laufe der Passagen zu

Wenn bei einer Passage in 3—4 Tagen 100% der Zellen mit Virus infiziert sind, wird auf die Verdünnung 10"² bzw 10~³ und danach — wenn erforderlich — auf die Verdünnung 10 ⁴ übergegangen Mit dem Übergang zu höheren Verdünnungen nimmt im Laufe der Passagierung auch der Virustiter bei lOO°/oig besiedel tem Zellrasen zu

Die virushaltige Suspension der letzten Passage wird als Saat Material fur die Virusvermehrung bei der Produktion des Impfstoffs verwendet Infolge des hohen Titers des Saat-Materials und der durch die erfindungsgemaße Adaption erreichten Zellbesiedlung wird bei der Produktion nur sehr wenig vom Saat Material gebraucht, das wertvolle Material wird somit sehr sparsam verwendet Durch die staatlich geforderten ausführlichen Prüfungen wird das Saat-Material sehr teuer

Auf etwa 20 000 Zellen wird 1 LD₅₀ des Saat-Materials benotigt, um einen ausreichend hohen Virustiter bei der Herstellung des Impfstoffs zu erzielen, demgegen über braucht man gemäß dem Stand der Technik zur Beimpfung einer Zelle etwa 1 —I0LD50 oder PFU (plaque forming unit)

LD50 in der Maus und PFU im Gewebe sind in etwa vergleichbar

Die Adaption ist sicher und schnell Es werden Virustiter erzielt, die das lOfache oder mehr gegenüber den Methoden des Standes der Technik betragen Konzentnerungsschritte sind damit überflüssig gewor den Werden sie trotzdem angeschlossen, ζ Β fur Impfstoffe, die am Menschen angewandt werden, kann der Virustiter nochmals auf das lOOfache gesteigert werden

Beispiel 1

Adaption eines Tollwutvirus und Herstellung eines inaktivierten Impfstoffs zur Anwendungen Mensch und Tier

Als Ausgangsmaterial dient der Tollwut-Virus-fixe Stamm VPIl, der vom WHO Reference Centre for Rabies, Institut Pasteur, Paris, in Form einer gefriergetrockneten Substanz aus Kaninchengehirn bezogen werden kann.

Das Virus hat einen Titer von 1O⁵·² LDso/ml gemessen durch intracerebrale Injektion an 11 bis 15 g schweren weißen Mäusen des Stammes NMRI.

Der Inhalt der Ampulle wird in 1 ml Aqua dest. is aufgelöst und in einer Verdünnung von 10~² auf primäre Hühnerembryofibroblasten-Zellen (HEFZ) gebracht.

7 Deckglaskulturen in Leighton-Röhrchen vom selben Zellansatz werden ebenfalls mit der Verdünnung 10-²⁰ beimpft (Passage I 1). Nach einer Inkubation von 5 Tagen bei +37⁰C waren weniger als 25% der HEFZ

infiziert.

Der virushaltige zellfreie Überstand wird in der Verdünnung 10-'·° auf die 2. Passage primärer HEFZ gebracht (Passage I 2). Nach 6 Tagen Inkubation bei + 37⁰C waren etwa 25% der Zellen infiziert. Der virushaltige zellfreie Überstand wird in Verdünnung 10-¹^⁰ und IO-²·⁰ auf primäre HEFZ übertragen (Passage 12). Nach 4 Tagen Inkubation waren bei Verdünnung IO-¹⁰ 70%, bei Verdünnung 10-²⁰90%der Zellen infiziert.

Es wird weiter wie folgt vorgegangen:

Die Verdünnung 10 ¹⁰ durchgeführte Passage wird in dieser Verdünnung weitergeführt.

Die in Verdünnung 10~²⁰ durchgeführte Passage wird in dieser Verdünnung weitergeführt.

Von der in Verdünnung 10~²⁰ durchgeführten Passage wird eine neue Passagereihe abgezweigt, die in der Verdünnungsstufe IO-³⁰ weitergeführt wird (Passage 1 4).

Im weiteren Verlauf der Adaption ergab sich folgendes Bild:

Passage Nr.

Verdünnungsstufe

Ernte/Tag

% infizierte Zellen Virustiter

LD₅₀/ml

Bemerkungen

15	10"'	3	75	IO⁷·¹
	ΙΟ"²	3	100	₁₀7,6
	ΙΟ"³	3	100	IO⁶·⁹
16	KT¹	3	75	IO⁷·²
	ΙΟ"²	3	100	IO⁶·¹
	ΙΟ"³	3	75	IO⁶·²
17	10-'	4	50	IO⁷·¹
	10"²	4	75	io⁸·⁰
	ΙΟ"³	4	100	IO⁶·³
I 11	10"¹	5	25	IO⁷·⁴
	HT²	5	50	10⁷·²
	10-³	5	50	io⁷·⁸
I 12	10"'	3	25	io⁶·⁸
	io-²	3	50	IO⁷·⁶
	10-³	3	50	io⁶·⁹
I 13	ΙΟ"²	3	25	io⁸·⁰
	10-³	3	75	io⁶·⁴
I 17	ΙΟ"²	3	80	io⁷·⁸
	10-³	3	100	io⁸·⁰
I 18	10"²	3	75	io⁸·⁶
	10-³	3	95
I 19	io-²	3	50
	10-³	3	95
126	10"²	3	90
	10-³	3	100
127	10"²	3	100
	10-³	3	100
128	io-²	3	100
	10-³	3	100
129	10"²	3	90
	10-³	3	100
130	10"²	3	90
	10-³	3	100
131	io-²	3	90
	10-³	3	100
131	10-³	3	100
131	10-³	3	100

Virusstamm noch nicht
genügend adaptiert

Stamm ausreichend adaptiert

1. Wiederholung

2. Wiederholung

Die Passage 31 stellt das Saatmaterial für einen inaktivierten Tollwut-Impfstoff ad us. hum. dar. Man sieht überraschenderweise, daß sich in den Passagen I 26 bis I 31 die Viruskonzentration der Passagereihe 10-w durchschnittlich um den Faktor 9 gegenüber der Passagereihe 10"²⁰ erhöht hat. Dies wird durch die zweimalige Wiederholung der Passage 31 bestätigt, bei der in einem Fall die Viruskonzentration um den Faktor 40, beim 2. Fall um den Faktor 100 höher war.

Herstellung eines Impfstoffs ad us. hum.

Versuchsimpfstoffe, hergestellt aus

Saatmaterial des erfindungsgemäß an primäre

HEFZ adaptierten Stammes Flury LEP

Das nach dem oben angegebenen Verfahren hergestellte Saatmaterial wurde erfindungsgemäß in einer Verdünnung von 10-³⁰ auf primäre HEFZ gebracht und bei +32⁰C inkubiert. Die Ernte der virushaltigen Suspension ergab nach Klärung in einer kontinuierlichen Durchlaufzentrifuge einen Virustiter von 10⁷-⁴ LDso/ml.

Das Virus wird danach auf bekannte Weise mit ß-Propiolacton inaktiviert und der so gewonnene Impfstoff im NIH-Test, einem Mäuseschutz-Test, in dem der zu prüfende Impfstoff mit einem Standard-Impfstoff mit dem antigenen Wert 1 verglichen wird, bestimmt.

Der Virustiter kann noch weiter gesteigert werden. Die erhaltene Virussuspension wird dazu im kontinuierlichen Dichtegradienten weitergereinigt und konzentriert. Dabei ergibt sich ein Konzentrationsfaktor von etwa 100 :1 und ein Virustiter von 10⁹·³ LDso/ml. Dieses Viruskonzentrat wird auf eine Konzentration von 10:1

eingestellt, mit /3-Propiolacton inaktiviert und ebenfalls dem NIH-Test unterworfen.

Der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff ergab einen antigenen Wert von 4,8.

Man kann erkennen, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Impfstoff hergestellt werden kann, der einen für die Anwendung am Menschen genügenden antigenen Wert besitzt. Beim NIH-Test werden Impfstoffe als wirksam freigegeben, deren antigener Wert mindestens 0,3 des antigenen Wertes eines Standard-Impfstoffs beträgt. Der obige Impfstoff war l,2mal besser als der mitgeführte Standard-Impfstoff A 18, der an dem internationalen WHO-ToIlwutstandard-Impfstoff eingestellt ist, und 4,8mal besser, wenn das Virusmaterial noch gereinigt und konzentriert worden ist.

Beispiel 2

Adaption eines Produktionsstammes

und Herstellung eines Tollwut-Lebendimpfstoffs

zur Anwendung am Tier

Als Ausgangsmaterial dient der Tollwut-Virusstamm Flury HEP, der von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, in Form einer homogenisierten, gefriergetrockneten Substanz aus virushaltigen Kükenembryonen bezogen werden kann. Die Adaption wird in der unter Beispiel 1 beschriebenen jo Weise vorgenommen, mit der Ausnahme, daß die Kulturen bei +32⁰C inkubiert und auch die Verdünnungsstufe 10-"■ benutzt wurde. Die Adaption des Virusstammes HEP nahm folgenden Verlauf:

Passage Nr.	Verdünnungs stufe	Ernte/Tag	% infiz. Zellen	Virus titer	Bemerkungen
				LD₅₀/ml
K 1	ΙΟ"² ΙΟ'²	4 3	25 74	10^s·⁷
K2	ΙΟ"² ίο-'	4 4	25 70	1Q6.5
K3	ίο-² ίο-'	5 5	25 25	IO⁴·⁸	Stamm noch nicht adapt.
Κ7	ίο-² ίο-'	4 4	100 100	IO⁷·⁵
Κ8	ίο-' ΙΟ""	4 4	100 90	1Q6.8 io⁷·'	Versuchsimpfstoff hergestellt
Κ9	10 ' ΙΟ""	4 4	100 90	io⁷·' IO⁷·⁵	Versuchsimpfstoff hergestellt
K 12	ΙΟ"' ΙΟ"⁴	3 4	100 100	io⁶·⁷ ΙΟ⁷·'
K 13	10"' 10""	OJ OJ	100 100	10⁷·° ίο⁷·⁵

Auch hier ist ersichtlich, daß bei der Verwendung der nächsthöheren Verdünnung des Beimpfungsmaterials für die folgende Passage höhere Virustiter erzielt werden. Es wurden 2 Versuchsimpfstoffe wie folgt hergestellt: Das virushaltige Erhaltungsmedium der Passagen K 8 und K 9 wurde mit 33% einer Stabilisatorlösung, bestehend aus polymerisierter, abgebauter Gelatine hergestellt gemäß DBP U 18 792 und Natriumglutamat, versetzt. Der Versuchsimpfstoff 1 hatte nach der Gefriertrocknung einen Virusgehalt von lOWJCIDso/ml.

Der Versuchsimpfstoff 2 hatte nach der Gefriertrocknung einen Virusgehalt von 10^7üTCID₅₀/ml.

In den Empfehlungen der WHO, Laboratory Techniques in Rabies 3^rd ed. Genf, 1973, wird für Lebendimpfstoffe ein Mindesttiter von 10⁵·² LD₅₀ oder TCID₅₀

909 525/353

gefordert. Die erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffe enthielten mehr als das Zehnfache der geforderten Mindestviruskonzentration.

Beispiel 3

Adaption eines Produktionsstammes/

Herstellung eines inaktivierten Impfstoffs

zur Anwendung am Tier

Als Ausgangsmaterial dient der Tollwut-Virus-Stamm Flury LEP, der von der American Type Culture Collection bezogen werden kann. Der Stamm lag vor als gefriergetrocknetes, virushaltiges Hühnerembryo-Homogenisat, adaptiert an den Zellstamm Wi 38. Die Adaption an primäre HEFZ erfolgte erfindungsgemäß durch sich an der Prozentzahl der infizierten Zellen

orientierende, langsam in Zehnerpotenzen fortschreitende Verdünnung des Infektionsmaterials für die Folgepassagen. Das Saatmaterial für die Herstellung des inaktivierten, im Handel befindlichen Impfstoffs Madivak wurde aus der Passage C 22 (Verdünnungspassage 10'³⁰) hergestellt und hatte einen Virustiter von 10⁷·². Erfindungsgemäß werden die Produktionschargen mit einer Verdünnung von 10 ^J0des Saatmaterials oder einer in erfindungsgemäßer Weise behandelten Zwischenpassage aus dem wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten Saatmaterial produziert.

Der Impfstoff hatte einen NIH-Wert von 2,6, dagegen hatte ein nach dem Stand der Technik hergestellter Impfstoff, der von anderen Gewebekulturen (Zellstamm PK 15) gewonnen wurde, im NIH-Test einen antigenen Wert von 0,4.

Claims

Patentanspruch

Verfahren zur Herstellung eines Tollwut Impf Stoffs durch Adaption des Tollwutvirus an Huhner embryofibroblasten Zellkulturen, dadurch gekennzeichnet, daß das Tollwutvirus bei der Adaption in steigenden Verdünnungen von 10 'bis 10~⁵ zur Beimpfung der Zellkulturpassagen und bei der Vermehrung in Verdünnungen zwischen 10~² und 10"⁵ zur Beimpfung der Vermehrungskulturen verwendet und die virushaltige Suspension gegebenenfalls nach Inaktivierung zu einem Impfstoff aufgearbeitet wird