DE1695345A1

DE1695345A1 - Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von 5'-Purinnucleotiden

Info

Publication number: DE1695345A1
Application number: DE1964K0063987
Authority: DE
Inventors: Shukuo Kinoshita; Masanaru Misawa; Takashi Nara
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1963-04-10
Filing date: 1964-04-10
Publication date: 1972-04-20
Also published as: GB1060428A; NO120830B; DE1695345B2; BE646342A; ES298480A1; CH454881A; AT271738B; NL6403828A; DK105061C; DE1445977A1; SE316184B

Description

Patentanwälte

K 784 - Dr.K/H V-lng. HE¹TiZ AGULAR

3 München 27, Pienzenauec Sir. 2

K 63 987 IVd/12p

KYOWA HAKKO KOGYO CO., LSD., Iokyo_f Japan

"Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von 5'-Purin-

nucleotiden

Ausscheidung aus Patent . ... ... (Patentanmeldung K 52 642 IVd/i2p)

Die Erfindung betrifft ein ¥erfahren zur mikrobiellen Herstellung von 5^t-Purinnucl0otiden_f wobei man die Adenin oder Guanin benötigenden Mutanten JJKSC 15 187, 15 512, 15 188, 15 190 und 15 138 JLa .einem Ku! turned ium vermehrt, welches Pantothensäure rand fhiamiH;, hi©rsia verwandte Substanzen oder derartige Substanzen enthaltende Ifeturstoffe aufweist,

Erf indungsgemäß wurde water Verwendung vom ohemisch def i- I niertan Medien festgestellt, daß Pantothensäure und Thiamia odar hierzu veswaadt© Substanzen in dam Kulturmedium

denea diese entiysdeE¹ Adenin erford@raden Hataaten von &;evi-

ssnaoaiagen©© veKfsadet werd®n_s ©ine sehr be-Soll® spielen. Di© Mutantenstärame leiten sich

wi© üi®B® ebenfalls Biotin %wb. tJaeketma«

Ss ist erforderlich, eine geringe Menge Adenin zu den Adenin benötigenden Mutanten und eine geringe Menge Guanin zu den Guanin benötigenden Mutanten zuzugeben. Die zuzusetzende Menge variiert in Abhängigkeit von den Stämmen und den Kulturbedingungen und liegt normalerweise zwischen etwa 1 und 200 yug/ml als die entsprechenden Basen.

Bei den optimalen Zugabemengen jeder Base wird 5'-IMP im Falle von Adenin benötigenden Mutanten und 5'-2MP im Falle von Guanin benötigenden Mutanten gewonnen. Die Abkürzung 5'-IMP bedeutet 5^f-Ißosinsäure und die Abkürzung 5'-2MP bedeutet 5^t-2anthylsäure.

Als Impf- und Permentationsmedium wird eine geeignete Menge Pantothensäure, verwandte Verbindungen oder diese enthaltende natürliche Substanzen £U dem Grundmedium zugefügt. Die verwendeten Mengen variieren in Abhängigkeit von dem angewendeten spezifischen Stamm sowie vom Kulturmedium. Im allgemeinen liegt die zugefügte Menge zwischen etwa 0,5 bis etwa 50 Mikrogramm/ml (ug/ml), bezogen auf die Pantothensäure oder verwandte Verbindung. Die Menge des in dem Medium vorliegenden Thiamine variiert ebenfalle mit Änderung des Stammes und des Mediums. Es wird jedoch bevorzugt, daß das Medium im allgemeinen etwa 0,1 bis ©twa 10 m,gfwl₉ "bezogen auf das üftiiamin oder die verwandte Substanz₉ ©nthält.

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Diese Stoffe werden zu dem Grundmedium zugefügt, welches eine Kohlenstoff quelle, eine anorganische Stickstoffquelle, anorganische Salze, eine Aminosäurequelle und andere Verbindungen enthält, die für das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus notwendig sind. Unter den Kulturbestandteilen Bind Phosphate und Magnesiumsalze wichtig, und um günstige Ausbeuten zu erhalten, ist es notwendig, beide Bestandteile zuzusetzen, um weitaus höhere Konzentrationen zu bewirken.

Die günstigste Zugabe liegt bei 0,6 bis 1,5 f> K₂

0,6 bis 1,5"* KH₂ ^P04 ¹^ °'^{6 Ms 1f5} f ¹⁵SSO₄.7HgO. Der Zusatz soll so erfolgen, daß etwa gleiche Konzentrationen an diesen drei Salzen erhalten werden. Ein natürliches Kulturmedium, welches Pantothensäure und Thiamin oder deren verwandte Verbindungen enthält, ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung gut geeignet.

Für die gemäß der Erfindung verwendeten Stämme von Brevibacterium ammoniagenes werden als mit Pantothensäure verwandte Substanzen Pantothensäuresalze, wie z.B. Calciumpantothenat, ß-Alanin, Pantethein, Coenzym A und dergleichen angesehen und können anstelle von Pantothensäure verwendet werden.

Als natürliche Substanzen, welche Pantothensäure enthalten und die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, können Fleischextrakt, Leberextrakt, Reiskleie, Melasse, lös-

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liehe Fischsubstanz und dergleichen genannt werden.

Zu den natürlichen Stoffen, welche Vit. B 1 enthalten, gehören z.B. Reishülsen und Kleie, Hefeextrakt, Leber- · extrakt und dergleichen.

Als mit Ihiamin verwandte Substanzen, die für die vor- ^ liegende Erfindung geeignet sind, seien Thiaminsalze,

wie z.B. ThiaminhydroChlorid, !Dhiaminmononitrat und dergleichen, sowie andere verwandte Verbindungen erwähnt.

Die Erfindung ist also besonders dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Pantothensäurereihe und eine Verbindung der Xhiaminreihe in ein Kulturmedium gibt, das zur Fermentierung der vorstehend aufgeführten, Adenin benötigenden Mutanten oder Guanin benötigenden Mutanten von Brevibacterium ammoniagenes «aet unter Bildung von 5¹-" Purinnucleotide!!, wie z.B. 5'-IMP, 5'-GMP, 5'-AMP, 5^f-XMP usw. verwendet wird. Im Falle der Fermentation von Adenin oder Guanin erfordernden Mutanten von Brevlbaoterium ammoniagenes wird die Kultivierung zur Bildung des 5¹-Purinnucleotids in einem Medium durchgeführt, welches eine geringe Menge Adenin (für Adenin erfordernde Mutanten) oder Guanin (für Guanin erfordernde Mutanten) enthält.

Die Fermentationsmethode entspricht im wesentlichen üblichen Methoden. Die Temperatur beträgt 25 bis 38 ⁰C, wobei das Optimum bei etwa 30 ⁰C liegt. Normalerweise ist für

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Haschen- und Kolbenkulturen Schütteln erwünscht, und für Sank- und Schalengärbehälter sind Submersion türen geeignet. Die Zucht iigungs zeit beträgt 24- bis 168 Stunden und die Menge an S'-Purinnueleotid erreicht ihr Maximum bei 72 bis 120 stündiger Kultivierungezeit, Die Isolierung erfolgt in an sich üblicher Weise.

Die folgenden Beispiele dienen sur Erläuterung der Erfindung ohne diese zu begrenzen.

Beispiel 1

Es wurde Brevibacterium ammoniagenes Mr. 7208 AXOC Kr. 15 187 (eine von ASCO 6872 abgeleitete* Menin erfordernde Matante) verwendet. Das durch Zugabe von 50 /Ug/ml Adenin zu dem *» Medium aus 2 $> GHueose, 1_s0 ?£ öaeaminosäuren (frei von Vitamin), 0,1 £ K₂HPO₄₉ 0,03 % MgSO₄.7H₂O, 0,3 # NaOl, 0,01 # SeSO^.7HgO und 30 Aig/l Biotin (pH 7$3) erhaltene Medium wurde als Impfmedium verwendet und als Fermentationsmedium das durch Zugabe von 50 /ug/ml Adenin zu dem Medium aus 10 in Glucose, 1 i» K₂HPO₄₇ 1 1» KH₂PO₄, 1 % MgSO₄.7H₂O, 0,01 i> OaOl₂.2H₂O, 30 yug/l Biotin, 3 mg/ml Hvporanthin erhaltene Medium. Der Stamm wurde unter Zugabe einer geeigneten Menge OaI-ciumpantothenat (oder ß-Alanin) und Thiamin zum lermentationsmedium kultiviert. Andere Kultivierungsbedingungen waren üblich. Die sich nach 120 stündiger Kultivierung ansammelnde Menge an 5⁹-Inosinsäur@ (Watriumsalz) ist in Tabelle I wiedergegeben.

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Tabelle I

zugesetzte Verbindung der Panto thenreihe

kein Zusatz

Calciumpantothenat 10 ytxg/ml

ß-Alanin 10 /Ug/ml

zugesetztes

Thiamin

(jag/ml)

2 2

angesammelte 5'-Ιήο-sinsäure (Na-SaIz) (rag/ml)

Spur

4,9 5,2

Beispiel 2

Is wurde Brevibaoterium ammoniagenes Nr. 7244 ATGG 15188 (Adenin- und Xanthin benötigende Mutante, abgeleitet von ATOG Nr. 6872) verwendet. Das in Beispiel 1 beschriebene Impfmedium und Fermentationsmedium wurde unter Zugabe von je 40 /Ug/ml Xanthin verwendet. Die Medien ohne Zusatz und mit Zusatz von 10 /ug/ml Calciumpantothenat und 1 /ug/ml Thiamln wurden entsprechend kultiviert. Andere Kultivierungsbedingungen waren ähnlich denen des Beispiel 1. Die nach 120 ständiger Kultivierungszeit angesammelte Menge an 5'-InOsInSaUTe (Natriumsalz), beläuft sich in dem Fall, da kein Vitamin zugesetzt wird, auf Spuren und im Fall der Zugabe beider Titamine auf 5,1 mg/ml.

Beispiel 5

Brevibacterium ammoniagenes Nr. 7309 ATCG Nr. 15312 (Adenin erfordernde Mutante_s abgeleitet von ATGG Nr. 6872) wurde verwendet, und das In Beispiel -1 beschriebene Impfmedium, und Fermentationsmedium, in dem die Menge des zu-

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gegebenen Adenine 5 /ug/ml betrug, wurde eingesetzt. Das Medium ohne Zusatz und mit Zusatz von 10 Aig/ml Oalciumpantothenat und 1 /ug/ml Thiamin wurde entsprechend kultiviert. Andere Kultivierungsbedingungen waren ähnlich denen des Beispiel 1. Die Menge an 5'-Inosinsäure, die sich, nach einer 96 ständigen Kultivierung ansammelte, beläuft sich, in dem Fall, da kein Vitaminzusatz erfolgte, auf Spuren und in dem Pail, da beide Vitamine zugegeben wurden, auf 6,3 mg/ml. Λ

Beispiel 4

Der gleiche Stamm und das gleiche Kulturmedium wie in Beispiel 3 wurde verwendet sowie das Fermentationsmedium, zu welchem als Ersatz für Oalciumpantothenat, ß-Alanin, Pantethin, Coenzym A und natürliche Stoffe, welche ßalanin, Pantethin und Ooenzym A enthielten, zugesetzt waren.

Andere Kultivierungsbedingungen waren ähnlich denen des Beispiel 1. Die Menge an 5'-InOsInSaUTe (Natriumsale), die λ sich nach 120 stündiger Kultivierung ansammelte, ist in Tabelle II wiedergegeben.

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Tabelle	II	angesammelte 5-^fInosinsäure (Na-SaIz) (mg/ml)
Pantothensäure verwandte Verbindungen oder natürliche Stoffe, die diese enthalten	zugesetztes Thiamin (//Ug/ml)	Spur
kein Zusatz	1	5,9
ß-Alanin 10 yug/ml	1	5,0
Pantethin 10 yUg/ml	1	4,9
Ooenzym A 40 /ug/ml	1	6,5
Hefe extrakt 1 #	- —	6,1
Leberextrakt 0,7 #	-	5,9
Fleischextrakt	-
BeIsT)IeI 5

Brevibacterium ammoniagenes 7320 ATOO Mr. 15 190 (Adenin erfordernde Mutante, abgeleitet von ATCCUr, 6871) wurde verwendet, und die anderen Kultivierungsbedingungen waren ähnlich denen des Beispiel 1. Nach 96 stündiger Kultivierung sammelten sich 4,2 mg/ml 5'-Inosineäure (Natriumsalz) in dem Medium an, das durch Zugabe von 5 Ai g/ml ßalanin und 1 /ug/ml Thiamin zum Permentationsmedium erhalten wurde. Andererseits sammelte sich in dem von beiden Titaminen freien Medium nur eine geringe Menge 5¹-Inosinsäure an.

Beispiel 6

Brevibacterium ammoniagenes Nr. 62 221 ATCC 15 138 (Guanin erfordernde Mutante) wurde verwendet. Das eingesetzte Medium

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wurde durch Zugabe von 10 /ug/ml Guanin zn dem in Beispiel 1 beschriebenen Impf medium erhalten. Das in Beispiel 1 beschriebene Permentationsmedium, zu dem 15 /ug/ml Guanin anstelle von Hypoxanthin und Pantothensäure (oder Pantethin, Ooenzym A) und Shiamln.Höl in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt wurden, wurde verwendet. Andere Kultivierungsbedingungen waren ähnlich denen des Beispiel Die Menge an 5*-Xanthyisäure (Natriumsalz), die sich nach einer Xultivierungszeit von 120 Stunden ansammelte, ist in !Tabelle III wiedergegeben.

zugesetzte Pantothensäure, verwandte Verbindungen (^tg/ml)

tabelle III

angesammelte

zugesetztes 5^f-Xanthylsäure Ihiamin (ITa-SaIa;

(/ug/ml) (mg/ml)

Calciumpantothenat 5	0	Spur
kein Zusatz	1	■ «
Calciumpantothenat 5	1	7,2
Pantethin 4	1	7,5
Ooenzym A 25	1	7,6

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Claims

Patentanspruch Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von 5f-PurInnuc~ leotiden, dadurch gekennze1ohnetfdaß man einen der Stämme Brevibaeterium ammoniagenes AfOG 15 187» 15 3t2f. 15 188, 15 190 und 15 138 in einem Kulturmedium, welches

1. Pantothensäure, hierzu verwandte Verbindungen und

2. Shiamin, hierzu verwandte Verbindungen oder solche Verbindungen enthaltende Naturstoffe enthält, vermehrt- und die gebildeten 5'-Nucleotide in Üblicher Weise aus der Permentationsflüssigkeit isoliert.

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