DE1445977B - ^Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von 5*-Purinnueleofid-monophosphaten - Google Patents
^Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von 5*-Purinnueleofid-monophosphatenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von S'-Purinnucleosid-monophosphaten,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Purine durch Bebrüten mit den Stämmen ATCC 6871
oder 6872 von Brevibacterium Ammoniagenes in einem Nährmedium, dem einerseits Pantothensäure,
Pantothensäuresalze, Pantethein, /3-Alanin oder Coenzym
A, andererseits Vitamin B1 oder dessen Salze bzw. diese Substanzen enthaltende Naturstoffe zugesetzt
worden sind, in die entsprechenden 5'-Purinnucleosid-monophosphate überführt und diese in
üblicher Weise aus der Fermentierflüssigkeit isoliert. Beispiele für 5'-Purinnucleotide sind z. B. 5'-Inosinsäure,
abgekürzt 5'-IMP, 5'-Guanylsäure, abgekürzt 5'-GMP, 5'-Adenylsäure, abgekürzt 5'-AMP und
5'-Xanthylsäure, abgekürzt 5'-XMP.
Aus der belgischen Patentschrift 621 122 ist ein Verfahren zur Totalsynthese von 5'-Guanylsäure bekannt,
bei dem mit Brevibacteriumstämmen sehr geringe Konzentrationen dieses Nucleotids hergestellt
werden können. Erfindungsgemäß werden mindestens lOfach höhere Konzentrationen erhalten. Ferner ist
aus der französischen Patentschrift 1 301 052 ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure durch
Fermentierung von Inosin in Gegenwart von organisehen Phosphaten bekannt. Inosin ist bekanntlich
eine ziemlich schwer zugängliche Substanz, während die erfindungsgemäß als Ausgangsprodukte eingesetzten
Purine leicht erhältlich sind. Andererseits werden erfindungsgemäß anorganische Phosphate
als Phosphorquellen verwertet, während gemäß der französischen Patentschrift 1 301 052 organische Phosphate,
wie Nitrophenylphosphat, notwendig sind.
Bei der erfindungsgemäßen Fermentierung unter Verwendung der Stämme Brevibacterium Ammoniagenes
ATCC 6871 und 6872 werden die Purinbasen als Präkursoren der Nucleotide in einer Menge
von mehr als 0,5 mg/ml zugegeben. Die Stämme ATCC 6871 und 6872 benötigen als Wachstumsfaktor
Biotin. Bei Zusatz von Hypoxanthin wird 5'-IMP gewonnen, 5'-GMP sammelt sich bei Zusatz von
Guanin an und 5'-AMP wird durch Zugabe von Adenin gewonnen. Natürliche Stoffe, welche deren
Präkursoren enthalten, können ebenfalls verwendet; werden. Zum Beispiel kann man eine Fermentationsflüssigkeit
zugeben, die mikrobiell gebildetes Hypoxanthin enthält.
Zu dem Kulturmedium wird eine geeignete Menge Pantothensäure, Pantothensäuresalze, wie z. B. CaI-ciumpantothenat,
/3-Alanin, Pantethein, CoenzymA
oder diese Substanzen enthaltende natürliche Stoffe zugefügt. Im allgemeinen liegt die zugefügte Menge
zwischen etwa 0,5 bis etwa 50 μ§/ηι1, bezogen auf die
Pantothensäure oder ähnliche Verbindung. Die Menge des in dem Medium vorliegenden Vitamins B1 oder
dessen Salzen bzw. diese Substanzen enthaltende Naturstoffe beträgt im allgemeinen etwa 0,1 bis etwa
10 μg/ml.
Auch natürliche Kulturmedien, die Pantothensäure und Vitamin B1 enthalten, sind im Rahmen der
Erfindung geeignet. Als Naturstoffe, welche Pantothensäure enthalten und die für die vorliegende
Erfindung geeignet sind, können Fleischextrakt, Leberextrakt, Reiskleie, Melasse oder lösliche Fischsubstanz
genannt werden.
Zu den natürlichen Stoffen, welche Vitamin B1 enthalten,
gehören z. B. Reishülsen und Kleie, Hefeextrakt, Leberextrakt.
Diese Stoffe werden zu dem Grundmedium zugefügt, welches eine Kohlenstoffquelle, eine anorganische
Stickstoffquelle, anorganische Salze, eine Aminosäurequelle und andere Verbindungen enthält, die für das
Wachstum des verwendeten Mikroorganismus notwendig sind. Unter den Kulturbestandteilen sind
Phosphate und Magnesiumsälze wichtig, und um günstige Ausbeuten zu erhalten, ist es notwendig, beide
Bestandteile zuzusetzen, um weitaus höhere Konzentrationen zu bewirken.
Die günstigste Zugabe liegt bei 0,6 bis 1,5% K2HPO4,
0,6 bis 1,5% KH2PO4 und 0,6 bis 1,5% MgSO4 · 7 H2O.
Tier Zusatz soll so erfolgen, daß etwa gleiche Konzentrationen an diesen drei Salzen erhalten werden.
Die Fermentierung erfolgt nach an sich üblichen Bedingungen. Die Temperatur beträgt 25 bis 38° C,
wobei das Optimum bei etwa 30° C liegt. Normalerweise ist für Flaschen- und Kolbenkulturen Schütteln
erwünscht, und für Tank- und Schalengärbehälter sind Submerskulturen geeignet. Die Züchtungszeit
beträgt 24 bis 168 Stunden, und die Menge an 5'-Purinnucleosid-monophosphat
erreicht ihr Maximum bei 72- bis 120stündiger Kultivierungszeit. Die Isolierung erfolgt in an sich üblicher Weise.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung:
Brevibacterium Ammoniagenes ATCC 6872 wurde nach Autoklavieren (bei 120° C für 15 Minuten) des
Impfkulturmediums, welches 2% Glucose, 1,0% Casaminosäuren (frei von Vitamin), 0,1% K2HPO4,
0,03% MgSO4 · 7 H2O, 0,3% NaCl, 0,01% FeSO4 ■
7H2O und 30μg/l Biotin (pH 7,3) enthielt und
Beimpfung des Fermentationsmediums mit einer Menge von 10 Volumprozent 24 Stunden kultiviert.
Je 30 ml des Mediums wurden in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben gegossen und nach Autoklavieren
(bei 12O0C für 15 Minuten) verwendet. Das Fermentationsmedium
der folgenden Zusammensetzung wurde verwendet, und die Kultivierung bei 30° C unter Rühren durchgeführt. Die Zusammensetzung
des Fermentationsmediums war folgende: 10% Glucose, 1% K2HPO4,1% KH2PO4,1% MgSO4 · 7 H2O,
0,01% CaCl2 · 2 H2O, 30 μg/l Biotin, 3 mg/ml Hypoxanthin,
Calciumpantothenat in verschiedenen Konzentrationen. Der pH-Wert wurde vor dem Autoklavieren
(15 Minuten bei 120° C) mit 5n-NaOH
auf 8,0 eingestellt. Nach Sterilisierung wurden 0,6% sterilisierter Harnstoff und Vitamin-Bi-Hydrochlorid
in verschiedenen Konzentrationen zu dem Medium zugefügt. Die Menge an 5'-Inosinsäure (Natriumsalz),
welche sich nach 96 Stunden in der Kulturflüssigkeit angereichert hat, ist in der folgenden Tabelle I aufgeführt:
Zugegebenes | Zugegebenes | Gebildete |
Calciumpantothenat | Vitamin B1 · HCl | 5'-Inosinsäure |
^g/ml) | (μΕ/ml) | (Na-SaIz) (mg/ml) |
0 | 0 | Spur |
5 | 0 | Spur |
0 | 1 | Spur |
2 .·■ | 1 | 8,1 |
5 | 0,1 | 6,8 |
5 | 1 | 11,1 |
Die Kultivierung wird unter Verwendung des gleichen Stammes und unter ähnlichen Kultivierungsbedingungen,
wie im Beispiel 1 angegeben, unter Zusatz von β - Alanin in verschiedenen Konzentrationen
anstatt von Calciumpantothenat durchgeführt. Die Menge der sich, nach 120 Stunden angereicherten
5' - Inosinsäure (Natriumsalz) ist in Tabelle!! wiedergegeben.
Zugegebenes /S-Alanin |
Zugegebenes Vitamin Bl -HCI |
Angesammelte , 5'-Inosinsäure |
fag/ml) | ^g/ml) | (Na-SaIz) (mg/ml) |
0 | 1,0 | Spur |
1 | 1,0 | 7,0 |
2 | 1,0 | 9,1 |
5 | 1,0 | 11,5 |
10 | 1,0 | 11,3 |
5 | 0 | Spur |
5 | 0,1 | 6,1 |
5 | 0,5 | 9,7 |
Der gleiche Stamm und das gleiche Impfmedium wie im Beispiel 1 wurden verwendet mit der Ausnahme,
daß als Zusatz 1,5% Pepton an Stelle von 1,0% Casaminosäuren verwendet wurden. Zu dem
verwendeten Fermentationsmedium wurden geeigneten Mengen /S-Alanin, Pantethein und Coenzym A
und Hefeextrakt, Fleischextrakt, Leberextrakt, lösliche Fischsubstanz oder natürliche Stoffe, welche diese
Verbindung enthielten, an Stelle von Calciumpantothenat zugesetzt, und weiterhin wurde 1 μ§/ηύ Vitamin
B1 zugegeben. Andere Kultivierungsbedingungen waren ähnlich denen des Beispiels 1. Die Menge
an 5'-Inosinsäure (Natriumsalz), welche sich im Fermentationsmedium nach 120stündiger Kultivierung
ansammelte, ist in Tabelle III wiedergegeben.
Pantothensäure verwandte | Vitamin B1 | Angesammelte |
Verbindungen oder natürliche | (μ§/πι1) | 5'-Inosinsäure |
Stoffe, die diese enthalten | 1 | (Na-SaIz) (mg/ml) |
Kein Zusatz | 1 | Spur |
/?-Alanin, 5 μ§/πύ | 1 | 11,1 |
Pantethein, 1 μ§/πι1 | 1 | 6,9 |
Pantethein, 10 μ§/ηι1 | 1 | 10,9 |
Coenzym A, 10 μg/ml | 1 | 7,8 |
Coenzym, 40 μ£/πι1 | — | 11,0 |
Hefeextrakt, 0,5% | 1 | 11,2 |
Fleischextrakt, 1,0% | — | 10,8 |
Leberextrakt, 0,7% | 1 | 11,3 |
Lösliche Fischsubstanz, | 10,2 | |
1,2% | ||
55 B e i s ρ i e 1 4
Es wurde Brevibacterium Ammoniagenes ATCC 6871 und das gleiche Impf- und Fermentationsmedium wie im Beispiel 3 verwendet. Der Stamm
wurde unter Zugabe von Pantothensäure (oder /S-Alanin) und Vitamin B1 in verschiedenen Konzentrationen
kultiviert. Die anderen Fermentationsmaßnahmen waren ähnlich denen des Beispiels 1. Die
sich nach einer Kultivierungszeit von 96 Stunden ansammelnde Menge an 5'-Inosinsäure (Natriumsalz)
ist in Tabelle IV wiedergegeben.
Zugesetzte Verbindung der Pantothenreihe |
Zugesetztes Vitamin B1 fcg/ml) |
Angesammelte 5'-Inosinsäure (Na-SaIz) (mg/ml) |
20 Kein Zusatz Calciumpantothenat, 10 μ£/ηΐ1 Kein Zusatz , Calciumpantothenat, 5 10 μg/ml /J-Alanin, 10 μg/ml |
kein Zusatz kein Zusatz . 2 . 2 2 |
Spur Spur Spur 8,9 9,2 |
Der gleiche Stamm und das gleiche Impfmedium wie im Beispiel 1 wurden verwendet sowie das Medium,
das durch Zugabe von 0,3% Pepton zu dem Fermentationsmedium des Beispiels 1 ohne Hypoxanthin
erhalten wurde. Pantothensäure oder ihre verwandten Verbindungen und Vitamin B1 wurden in verschiedenen
Konzentrationen zugegeben. Der Zusatz von Guanin während des Wachstums erfolgte so, daß
während einer Kultivierung von 72 Stunden 2 mg/ml Guanin eingesetzt wurden. Andere Kultivierungsbedingungen waren ähnlich denen des Beispiels 1.
Die Menge der nach einer Kultivierungszeit von 96 Stunden sich in der Kulturfiüssigkeit ansammelnden
5'-Guanylsäure (Natriumsalz) ist in Tabelle V wiedergegeben.
Zugesetzte Pantothensäure,
verwandte Verbindungen
60 Calciumpantothenat, 10
Kein Zusatz
Calciumpantothenat, 10
/S-Alanin, 10
Pantethein, 5
Coenzym A, 30
Kein Zusatz
Calciumpantothenat, 10
/S-Alanin, 10
Pantethein, 5
Coenzym A, 30
Zugesetztes
Vitamin Bl HCi
(Kg/ml)
2
2
2
2
2
Angesammelte
5'-Guanylsäure
(Na-SaIz)
(mg/ml)
Spur
Spur
Spur
3,9
4,1
4,9
4,8
Es wurde der gleiche Stamm und das gleiche Impfmedium wie im Beispiel 1 sowie ein ähnliches Fermentationsmedium
wie im Beispiel 5 verwendet, zu dem 5 μg/ml Pantothensäure und 1 μβ/ηιΐ Vitamin B1
Hydrochlorid zugefügt wurden. Die Zugabe erfolgte so, daß während einer Kultivierungszeit von 48 Stun-
den 2,5 mg/ml Adenin eingesetzt wurde. Andere Kultivierungsbedingungen waren ähnlich denen des
Beispiels 1. Nach einer Kultivierungszeit von 96 Stunden sammelte sich in der Kulturflüssigkeit 6,5 mg/ml
5'-Adenylsäure. Werden Pantothensäure oder Vitamin B1 weggelassen, so reichert sich 5'-Adenylsäure
nur geringfügig an.
Brevibacterium Ammoniagenes ATCC 6871 wurde verwendet. Das Impfmedium und Fermentationsmedium des Beispiels 5 wurden verwendet und die
Komponenten in der Weise zugesetzt, daß während einer Kultivierung von 48 Stunden 2,0 mg/ml Guanin
oder Adenin eingesetzt wurden. Andere Kultivierungsbedingungen waren ähnlich denen des Beispiels 1.
Somit wurden in der Kulturflüssigkeit nach einer Kultivierung von 96 Stunden 4,8 mg/ml 5'-Guanylsäure
(Natriumsalz) gewonnen, wenn Guanin zugefügt wurde, und im Falle der Zugabe von Adenin sammelten
sich 5,1 mg/ml 5'-Adenylsäure an. Wenn man Pantothensäure oder Vitamin B1 wegläßt, so sammeln sich
nur geringe Mengen 5'-Guanylsäure oder 5'-Adenylsäure an.
5
5
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von 5'-Purinnucleosid-monophosphaten, dadurch gekennzeichnet, daß man Purine durch Bebrüten mit den Stämmen ATCC 6871 oder 6872 von Brevibacterium Ammoniagenes in einem Nährmedium, dem einerseits Pantothensäure, Pantothensäuresalze, Pantethein, ß-AIanin oder Coenzym A, andererseits Vitamin Bl oder dessen Salze bzw. diese Substanzen enthaltende Naturstoffe zugesetzt worden sind, in die entsprechenden 5'-Purinnucleosid-monophosphate überführt und. diese in üblicher Weise aus der Fermentierflüssigkeit isoliert.
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