DE1445977A1 - Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von 5'-Purinnucleotiden - Google Patents

Description

ifr-lng. HANS RUSC

Patentanmeldung £ 52 642 ITa/12p

Kyowa HakKO Kogyo - K 53o _#

17.

KiOWA HAKKO KOGIO CO., LTD., Tokyo, Japan

Verfahren zur mlicrobiellen Herstellung von 5 *-Pur In-

nucleotiden

Sie Erfindung betrifft ein. Verfahren xur mikrobiellen Herstellung Tön ^'-Purinnucleotide!!, das aadurcii gekennzeichnet ist, daß man Purine durch Bebrüten mit den ßtämaen ATOC 6&71 oder 6872 von Brevibacterium Amatoniageneß «in einem »änrmediun, dem einerseits Pantothensäure, Pantothensauresalze, Pantethein, ι-Alan!η odei* Qo enzym A, andererseits Vitamin B^ oder dessen BaIae 1»zw. diese Substanzen entiialteilen Naturstoffe sugeeets* worden «ind, in die eoita^rechenden 5'-Purinnucltotide überführt und ä

diese in üblicher Weise aua der Fermentierflüeeigkeit isoliert. Beispiele für 5'-Purinnucleotide sind m.B· 5'-Ino8insäure_t abgekürzt 5'-IMP. 5'-Guany^äure, «|β·- kürzt 5^f-üMP, 5^f-Adenylaäure, abgekürst 5'-AMP und 5'-Xanthylsäure, abgekirzt 3 XKP*

Aus aer belgischen Patentschrift 621 122 ist ein Verfahren zur Totalsynthese von 5^f-Quanylsäure bekannt, bei dea juxt ixevibactei'iumstäinmen üelir geringe Konzentrationen

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BAD ORIGINAL

säure, Pntothensäuresalze, wie z.B. OalciuBBantotiienat, !-Alanin, Pantethein, Goenzya A und dergleichen oder diese Substanzen enthaltende natürliche Stoff· zugefügt. Xm allgemeinen liegt die zugefügte Menge »wischen etwa o,5 bis etwa 5o ug/ml, bezogen auf die Pantothensäure oder ähnliche Verbindung· Die Menge des in dem Medium vorliegenden Vitamin B^ oder dessen Salzen bzw. diese Substanzen enthaltende Naturstoffe beträgt im allgemeinen etwa o,1 bis etwa 1o ug/ml.

Auch natürliche Kulturmediin, die Pantothensäure und. Vitamin B^ enthalten, sind la Rahmen der Erfindung geeignet. Als Naturstoffe, welche Pantothensäure enthalten und die für die vorliegende Ärfiadung geeignet sind, können fleischextrakt, Leberextrakt, Relakleie, Melasse« lösliche JJlschsubstanz und dergleichen genannt werden·

Zu den natürlichen Stoffen* welch· Vitamin B₁ enthalten, gehören z.B. Reishülsen und Kleie, Hefeextrakt, Leberextrakt und dergleichen.

Diese Stoffe werden zu dem Grundmedium zugefügt» welches eine Kohlenstoffquelle, eiiie anorganische Stickstoffquelle, anorganische Salze, eine Aminosäurequelle und andere Verbindungen enthält, die für das Wachstum des verwend·-

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ten Mikroorganismus notwendig sind_e Unter den Kultur«, bestandteilen sind Phosphat* und Magnteiueaala· nichtig, und um günstige Ausbeuten zu erhalten, ist «s notwindig_t beide Bestandteile zuzusetzen, um weitaus höhere Kon-·

zentrationen au bewirken.

Die günstigste Zugabe liegt bei 0,6 bia 1,5 % X₂HPO₄, o,6 Dis 1,5 % KH₂PQ₄ und o₉6 bis 1,5 % %βο^.7Η₂Ο. Der Z-usata soll so erfolgen, daß etwa gleiche lonzentrationen an diesen drei Salzen erhalten werden.

Die Fermentierung erfolgt nach en sieh üblichen Bedingungen. Die Temperatur beträgt 25 bis 38⁰O, wobei das Optimum bei etwa 3°⁰C liegt. Normalerweise let für ΪΙ&- sciien- und- Kolbenkulturen Schütteln erwünscht, und für (Tank- und SchalengärtoeMlter sind Submerskulturen geeignet. Die Züchtungszeit beträgt 24 bis 168 Stunden und die Menge an 5'-Purinnucleotid erreicht ihr Maximum b#l 72 bis 12qstündiger Kultivierungszeit* Di· Isolierung erfolgt in an eich üblicher Weise«

Die folgenden Beispiele dienen zur SrUtuterui^ der Abfindung, ohne diese au begrenzen!

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Beispiel 1

Brevibacfcerium Aswoniagenes ATOG 6872 wurde nach. Autoklavieren (bei 1£:o^oö für 15 Minuten) dee Impfkulturmediums, welches 2 H Glucose, 1,o % GasaminosÄuren (frei von Vitamin), o,1 % K₂HPO₄, 0,03 % MgBO₄.7H₂O, ο,3% KaCl, o,o1 % ?BB0₄.7H₂0 und 3o /Ug/1 Biotin (pH 7,3) enthielt und Be impfung des Ferment at ions mediums mit einer Menge von 1o Volua-% 24- Stunden kultiviert. Je 30 iiii öee Aiediums wurden in einen 250 ml üicienmeyeritolben gegossen und nach Autoklavieren (bei 11:0⁰C für kinuten) verwendet» Das Feuuiantationsmedium der folgenden Zusammensetzung wurde verwendet, und die Kultivierung bei 3ο⁰G unter führen durchgeführt· Die Zusammensetzung des Fermentationemediuos war folgendet 1o % eiucose, 1 % K₂HPO₄, 1 % KH₂PO₄, 1 % %8o₄»fH₂0_f o_to1 % GaOl₂.2H₂O₁ 30 yUg/1 Biotin, 3 mg/ml Hjpoxanthin, Galoiumpantothenat in verschiedenen Konzentrationen. Der pH-'Wert wurde vor dem Autoklavieren (15 Hinuten bei 1ko°O) ait 5 a HaOH auf 9,0 e Inge e te lit. Nach Sterilisier ung wurden 9_t6 % eteriliesierttr Harnstoff und Tniaaiin.HCl In verschiedenen Konzentrationen zu dem Medium augefügt. 121· Menge an 5'-IhOeInSaUTt (Natrlunsala), welche eich naoh 96 ßtunden in der KuIturflüßsigkeit angereichert hat» ist Ia der folgenden Tabelle I aufgeführtι

ιαηιβ/οιοι

Tabelle I

zugegebenes Calciumpantothenafe

(/US/Ml)

zugegebenes ViI .BI .HQl

U48977

gebildete 5'-eäure (HSI

5 Q

O 0 1 1

Spur

6,8

11,1

geben»

Die &u-U-lvIeriLTfc; wird uättr VerneMusg dee gleich«:* mid imktr ilmlioiien KultiTierun^%eüeguiigett»

1 abgegeben, unter Zusmta van ß-Alsuiia 1ä Y«r-Eongentrationen anstatt von,

Di* Mßiage des sieIi &«€& 12o ßtuaü*a

im £ab«ll· IX

zugegebenes	sugegebents Vit.B1.Bil	CBges&na	(Ka-SaIs)	•	BAD ORIGfHAL
O	1,o	Spur
t	1,ö	7.0
2	1,0	.9*1
5	1,o	11,5
Ίο 5	ft09810/0301	11 «3 ' %?

,Beispiel 3

Der gleiche Stamm und das gleiche impf medium «1« im Beispiel 1 wurden verwendet mit der Ausnahme, daß als Zusatz 1,5 % Pepton anstelle von 1,o % Casaainosäuren verwendet wurden. Zu dem verwendeten Feraentationemedium wurden geeigneten Mengen ß-^lanin, Pantethin, Ooensym A und dergleichen und Hefeextrakt ι Fleischextrakt;, Leberextrakt, lösliche S¹I schs u us tanz oder natürliche ötoff·» welche diese Verbindung enthielten, anstelle von Calciumpi tothenat zugesetzt, und weiterhin wurde 1 /Ug/xal ^It₈BI zugegeben. Andere Killt ivi er ungs bedingungen waren ähnlich denen des Beispiels 1· Die "enge an ^'-Inosinsäur· (Natriumaals), welche sich im Fermentationsmedium nach 12o-stündiger Kultivierung aneeuamelte, ist in Tabelle 111 wiedergegeben.

Tabelle III

Pantotuen&äure ver- Vit.Bi wandte Verbindungen

oder natürliche Stoffe, (,ug/ml) die diese enthalten '

aogesaraulte

^'-Inosineäure

CHa-BaIs)

kein Zusats ι 5

Pantethin 1 /Ug/al

1o »

Coerusym. Coenaym 4o " Hefeextrakt ο,5 % fleischextrakt 1,o % Leberextrakt ο,7 % lösliche pl*4haübatana1₁;

1 1 1 1 1

Spur

11_f1

6,9

7,8

11.2 1o,Ö

11.3 1o,2

&09810/0Θ01

BAD

Beispiel 4-

Bs wurdt Brevibacterium imAoniagesaa AtOO 6671 vuvBL das gleiche lapf- und Peraantationsaediua wl« la Beispiel 3 verwendet. Der ßtama wurdt unter Zugab« voa Pantothensäure (oder ß-Alaain) und Vit. BI in verschiedenen Konzentrationen kultiviert« ^it anderem 7eraentationaBafijt«haeA waren ähnlich denen dee Beispiels 1. Die ließ auch einer Kultivierungszeit von 96 Stunden ansammelnde Menge an f^'-Inosinsäura (Natriums&ls) 1st in Tabelle IV wiedergegeben.

Tabelle IV

/zugesetzte Verbindung der Paatothenreihe

iugeeetstes ViI. BI (yug/al)

angesaaaeltes 5^f-I slnsäur· (Ia-SaIs) («g/al)

kein Zusatz

Oalciumpantothenat 1o l

kein Zusatz

OaIc iumpantotheiiÄt 1o l

B-llanin 1o

kein Zusatrs

Il

•pur

8.9 9,2

Beispiel 5

Der gleiche stamm und das gleiche Impfmedlua wie in spiel 1 wurden verwendet} sowie das Medium, das durch Zugabe von o,3 % Pepton zu dem Ifermentationsmediua des Beispiels 1 ohne Hypoxanthin erhalten wurde. Pantothensäure

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oder ihre verwandten Verbindungen und Thiamin wurden in verschiedenen Konzentrationen sugegeben« Der Zusats von Guanin während des Wachstum* erfolgte ·Ο| deJ naoh einer Kultivierung von 72 Stunden 2 ag/ml Guanin erhalten wurden. Andere Kultivierungabedingungen waren ähnlioh denen des Beispiele 1* Die Menge der nach einer Kultlvierungszeit von 96 Stunden sich in der Kulturflüaeigkeit ansammelnden y-auanyleäure (Natriumeale) ist In Tabelle T wiedergegeben·

»belle 1

zugesetzte Panto- angesammelte

thensäure, verwand- zugesetztes V-Guanylsäure

te Verbindungen Υ1Ϊ.Β1 BOX (Ha-ßals)

Calciumpantothenat 1o 0 Spur

kein Zusatz 2 "

CalciuBzpantothenat 1o 2 3,9

B-Alanin 1o 2 4,1

Fantethin 5 2 4,9

Ooenzya A 3o 2 4,8

Beispiel 6

lie wurde der gleiche Staun und das gHohe Impimtdlum wie in Beispiel 1, sowie ein ähnliohea ftraentationamedium wie in Beispiel 5 verwendet, zu de* 3 /ui/^{Bl ilLn}*⁰~ thensäure und 1 /Ug/ml Vit. B1 HOl sugefUgt wurden. Pit

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- 1ο -

Zugabe erfolgte so, daß nach, einer KuItivierungszeit von 48 stunden £_e5'mg/ml Adenin erhalten wurde. Ander© Kultivierön^sbedinguDiäen waren ähnlich denen des Beispiels 1_e Hack einer Kultivierungszeit von 96 Stunden sammelt· sich ta der Kulturflüssigireit 6_S5 mg/ml 5'-Adenylsäure· Wer aeii'Pantothensäure oder Vit« B1 weggelassen, so reichert sich 5 '-Adenylsäure nur geringfügig an.

Brevifeacfcerima aiJimoniagenes ΑϊΟβ Nr. 6871 wir de verwendet. Bas Impf me ο a um und £*»riai2itatioziemedium des Beispiels 5 mirden verwendet und die Koapontntsn in der Wei« β sugesetst» daß nach einer Kultivierung vom 46 Stuudea 2_fo mg/ml Guanin oder Adenin erhalten wurden· Andere Kultivierungsbedingungen waren ähnlich denen des Beispiele 1· ^oiait wurden in der Kultmrflüseigkeit nach einer Kultivieruag von 96 Stund«! 4*ö mg/al ^'-Guacylsaurt (Hatsriuoiialz) gewonnen; wenn Guanin svtgcfügt wurdt, und is Jail· der Zugute vast JLäealn s«üimtlt«ii eich 5_f1 ag/ml 5^f-Ad«iayleäure Wtim stan Pwitothentiäur· ο dt χ Tit. BI weelält, eo ln sich nur gering· M«sg«n 5'-GueLaylsäur« oder

5^r-Ad«nylsäure an·

BAD ORIGfWAL'

aofliio/ceoi

Claims (1)

1. g. HAMS RUSCHKE

   jtatontannioxdung K ?2 642 IVa/1tp DlpUM». HU , '· ^rL

   iiyowa Hakko Kogyo - IC 53 %M0A4W***"»>"

   Patentaneprucii 17.

   Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von 5^f-Purimiuoliotiden, dadurch βe^ctruizelehnet, daß man Purine durch Bebrüten mit den otämmen ATCC.6871 oder 6872 von Brevibacterium Ammoni age lies in einem NährmediuA» dem einerseits Pantothensäure, PantothensäureBalze, Pantethein, ß-Alanin oder Coen^ym A andererseits Vitamin B1 oder dessen Salze, bzv;· diese Substanzen enthaltende Naturstoffe zugesetzt worden sind, in aie entsprechenden 5'-Purinnucleotide überführt und diese in üblicher Weise aus der Fermentierflüssigkeit isoliert.

   &09810/Q801 . _IMM-

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