NO120830B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av 5'-purin-nukleotider ved fermentering.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til fremstilling av 5'-purin-nukleotidene 5'-inosinsyre ti det folgende kalt 5<»->IMP), 5'-guanylsyre (5,-GMP), 5'-adenylsyre (5'-AMP) og 5'-xantyl-

syre (5'-XMP) og denne fremgangsmåte er kjennetegnet ved at Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 eller ATCC 6872 eller adenin- eller guaninkrevende mutanter derav dyrkes i et næringsmedium inneholdende (l) fra 0.5 til 50 mikrogram per milliliter av pantotensyre, et pantotensyre-givende stoff, P-alanin, pantetin eller koenzym A, og (2)

fra 0.1 til 10 mikrogram per milliliter av tiamin, tiaminhydrohalo-

genid eller et tiamin-givende stoff, idet næringsmediet også inne-

holder biotin og en purinbase eller et nukleosid derav, inntil i alt vesentlig maksimal dannelse av det onskede 5,-nukleotid er oppnådd,

og ved at 5'-nukleotidet gjenvinnes fra næringsmediet.

Fra belgisk patent nr. 621 122 er det kjent å tilsette pantotensyre og tiamin til næringsmediet ved dyrking av mikroorganismer tilhorende slekten Brevibacterium for fremstilling av 5'-nukleotider. Disse tilsetninger anvendes bare som næringsstoffer og er ikke -uunn-værlige i sammensetningen av mediet. Det må derfor sluttes at andre midler også kan benyttes. Det fremgår videre fra patentet at den samtidige tilstedeværelse av de nevnte vitaminstoffer ikke synes å være en betingelse. Ved utforelsen av foreliggende oppfinnelse er derimot den samtidig tilstedeværelse av nevnte vitaminer såvel som bruken av en spesiell mikroorganisme av arten Brevibacterium ammoniagenes av vesentlig betydning. Patentet anvender helt andre mikroorganismer enn de som anvendes i foreliggende oppfinnelse og patentet benytter også meget mindre mengder av pantotensyre og tiamin. Pro-duktutbytte i foreliggende oppfinnelse er meget storre enn det som oppnåes ved fremgangsmåten i det belgiske patent. I patentet oppnåes f.eks. bare 0.33 mg/ml GMP og 0.17-0.30 mg/ml AMP, mens utbyttet av disse forbindelser ved foreliggende fremgangsmåte henholdsvis er 3«9-4-9mg/ml og 6.5 mg/ml. Ved foreliggende oppfinnelse dannes således GMP og AMP i mengder som er 10 ganger storre enn de som frembringes ved det belgiske patentets fremgangsmåte.

Da moderstammene ATCC nr. 6871 og 6872 krever biotin som vektsfaktor, krever naturligvis de fra disse stammer avledede mutanter også biotin for sin vekst.

Som purinbase tilsettes en liten mengde adenin til den adenin-krevende mutant og en liten mengde guanin til den guaninkrevende mutant. Mengden som må tilsettes, varierer med stammene og dyrkningsbetingelsene, men utgjor normalt ca. l-200yu/ml beregnet som de respektive baser.

Ved de optimale tilsetningsméngder av hver base vil 5<*->lMP akkumuleres når det gjelder adenin-krevende mutant, og 5'- XM. P vil opp<-samles når det gjelder en guanin-krevende mutant. ;I fermenteringer hvor det anvendes moderstammer (ATCC nr. ;6871 eller 6872) må purinbase og/eller dennes nukleosid tilsettes som . prekursor, i en mengde på over 0.5 mg/ml. Hvis det tilsettes hypo.^can-tin og inosin vil ^'- IMP ansamle seg, mens 5<t_>GMP ansamles hvis guanin og guanosin tilsettes; og ved tilsetning av adenin og adenosin ansamles 5'-AMP. Det kan også benyttes naturmaterialer som i seg selv inneholder deres prekursorer. Eksempelvis er det mulig å tilsette ;fermenteringssuppe som er oppnådd fra en kultur av mikroorganismer som er i stand til å danne hypox.antin. ;Det benyttede grunnmedium inneholder en karbonkilde, en kilde for uorganisk nitrogen, uorganiske salter, en aminosyrekilde, og andre forbindelser som er nodvendige for veksten av den mikroorganisme som anvendes. Blant næringsbestanddelene er fosfater og magnesiumsalter viktige, og for å få gode utbytter er det nodvendig å tilsette begge disse, så det fåes en betydelig konsentrasjon av dem. Den mest foretrukne tilsetning utgjores av 0.6-1.5% KgHPO^, 0.6-1.5% KH2P0^og 0.6-15.% MgS0^.7H20, og tilsetningen bor skje slik at det oppnås nesten innbyrdes lik konsentrasjon av disse tre salter. Kt naturlig forekommende næringsmedium som inneholder pantotensyre og tiamin eller de foran nevnte beslektede stoffer er vel egnet for bruk i den foreliggende oppfinnelse. ;Blant naturmaterialer som inneholder pantotensyre og som kan nyttes i den foreliggende oppfinnelse kan det nevnes kjottekstrakt, leverekstrakt, risklid, melasse, opplost fiskemateriale og lignende. ;Blant brukbare naturmaterialer som inneholder tiamin kan ;nevnes risskall og -klid, gjærekstrakt, leverekstrakt, og lignende. ;Ved anvendelse av de adenin- eller guanin-krevende mutanter av Brevibacterium ammoniagenes utfores dyrkningen i et medium som inneholder en liten mengde av adenin respektivt av guanin, for dannelse av vedkommende 5'-purin-nukleotid. ;Selve fermenteringsmetoden er praktisk talt som for andre metoder. Temperaturen er 25-38°C; den optimale er ca. 30°C. Normalt er rysting av lukkede fermenteringsbeholdere fordelaktig, og submers fermentering er fordelaktig i tanker og åpne kar. Dyrkningstiden er 24-168 timer, og mengden av 5'-purin-nukleotid når sitt maksimum i lopet av 72-120 timer. ;De folgende eksempler belyser oppfinnelsen. Mediets sammensetning er i eksemplene angitt som den % av hver bestanddel som er opplost i vann, beregnet på det totale volum. ;Eksempel 1;Brevibacterium ammoniagenes ATCC nr. 6872 dyrkes etter autoklavering (15 minutter ved 120°C) i 24 timer i et podemedium som inneholder 2% glukose, 1.0% casaminosyrer (fri for vitamin) 0.1% KgHPO^, 0.03% MgS0^.7H20, 0.3% NaCl, 0.01% FeS0^.7H20 og 30/ug/liter biotin, (pH 7«3)j°g inokuleres i en mengde av 10% (volum) i fermenteringsmediet. Porsjoner på JO ml av mediene helles i en 250 ml erlenmeyer-kolbe,.og benyttes etter autoklavering (ved 120°C i 15 minutter). Det anvendes et fermenteringsmedium som har den nedenfor angitte sammensetning, og fermenteringen utfores ved 30°C under omroring. ;Fermenteringsmediets sammensetning: 10% glukose, 1% K2HP0^, 1% KH2P04, 1% MgS04.7H20, 0.01% CaCl2.2H20, 30/ug/liter biotin, 3 mg/ ml hypooc.antin, Ca-pantotenat i forskjellige konsentrasjoner. pH-verdien reguleres med 5n NaOH til 8.0 for behandling i autoklav (ved ;.120°C i 15 minutter). Etter steriliseringen tilsettes det til mediet 0.6% sterilisert urea og tiamin.HC1, i forskjellige konsentrasjoner. Den mengde 5'-inosinsyre (Na-salt) som har samlet seg i dyrkningsvæsken etter 96 timers forlop er angitt i den folgende tabell I. ; Eksempel 2;Dyrkningen utfores med samme stamme og samme dyrkningsbe-tingelser som i eksempel 1, men under tilsetning av B-alanin i forskjellige konsentrasjoner, istedenfor kalsiumpantoténat. Den mengde 5'-inosinsyre (Nansalt) som har dannet seg i lopet av 120 timer er angitt i den nedenstående tabell II. ; Eksempel 3;Det ble anvendt samme mikroorganismestamme som i eksempel;1 og samme podemedium, bare med den forskjell at det var tilsatt 1.5% pepton istedenfor 1.0% casaminosyrer. Det ble benyttet et fermenteringsmedium hvortil det var tilsatt passende mengder av B-alanin, pantetin, koenzym A samt gjærekstrakt, kjottekstrakt, leverekstrakt og opplost fiskemateriale inneholdende slike forbindelser istedenfor kalsiumpantotenat, samt l^ug/ml tiamin. Ellers er dyrkningsbetingelsene som i eksempel 1. Den nedenstående tabell III angir den mengde 5'-inosinsyre (Na-salt) som har samlet seg i fermenteringsmediet etter 120 timers foriop. ; Eksempel 4;Det benyttes Brevibacterium ammoniagenes ATCC nr. 6871. Det anvendes samme pode- respektivt fermenteringsmedium som i eksempel 3>og fermenteringen foregår med tilsatt pantotensyre (eller B-alanin) og tiamin i forskjellige konsentrasjoner. Ellers er fermen-teringsprosessen lik-* den i eksempel 1. Den folgende tabell IV angir hvor meget 5'-inosinsyre (Na-salt) det har samlet seg etter 96 timers fermentering.

Eksempel 5

Brevibacterium ammoniagenes nr. 7208 ATCC nr. I5187 (adenin-krevende mutant av ATCC nr. 6872) blir anvendt. Det medium som fås ved å tilsette 5C<y>ug/ml adenin til det i eksempel 1 beskrevne medium benyttes som podemedium, og det medium som fås ved tilsetning av 5C<y>ug/ml adenin til det i eksempel 1 beskrevne fermenteringsmedium anvendes som fermenteringsmedium. Stammen dyrkes under tilsetning av passende mengder av kalsiumpantotenat (eller 8-alanin) og tiamin til fermenteringsmediet. Ellers er dyrkningsbetingelsene som i eksempel 1. Den folgende tabell V angir hvor meget 5<1->inosinsyre (Na-salt) det har dannet seg etter 120 timers dyrkning.

1 Eksempel 6

Det anvendes Brevibacterium ammoniagenes nr. 7309 ATCC nr. 15312 (adenin-krevende mutant av ATCC nr. 6872) samt det i eksempel 5 beskrevne pode- respektive fermenteringsmedium, til hvilke det er tilsatt 5/ug/ml adenin. Mediet blir dyrket uten tilsetning respektivt med tilsetning av 10<y>ug/ml kalsiumpantotenat og l<y>ug/ml tiamin. Ellers er dyrkningsbetingelsene som i eksempel 1. Etter 96 timers dyrkning finnes det bare spor av 5'-inosinsyre i det tilfelle hvor intet vitamin var tilsatt, men 6.3 mg/ml i det tilfelle hvor begge vitaminer var blitt tilsatt.

F. ksempel 7-

Det benyttes samme stamme og kulturmedium som i eksempel 6, samt et fermenteringsmedium til hvilket det er tilsatt B-alanin, pantetin, koenzym A, og naturmaterialer som inneholder B-alanin og koenzym A istedenfor kalsiumpantotenat. Kilers er dyrkningsbetingelsene de samme som i eksempel 1. Folgende tabell VI angir mengden av 5'-inosinsyre (Na-salt) som har samlet seg etter 120 timers dyrkning.

Eksempel 8

Det benyttes Brevibacterium ammoniagenes 7320 ATCC nr. 15190 (adenin-krevende mutant av ATCC nr. 6871), og forovrig er dyrkningsbetingelsene som i eksempel 5«Etter 9-6 timers dyrkning har det samlet seg 4-2 mg/ml 5'-inosinsyre (Na-salt). i det medium som var fått ved å tilsette 5/ug/ml P-alanin og l^ug/ml tiamin til fermenteringsmediet. I medium som er fritt for begge vitaminene dannes det derimot bare spor av 5'-inosinsyre.

Eksempel 9

Det anvendes samme stamme og podemedium som i eksempel 1, samt benyttes det medium som fås ved å tilsette 0.3% pepton til fer-ment eringsmediet i eksempel 1, uten at hypoxantin er tilstede. Det tilsettes pantotensyre eller en beslektet forbindelse i forskjellige konsentrasjoner samt tiamin. Tilsetningen av guanin under veskten utfores på en slik måte at det forefinnes 2 mg/ml guanin etter 72 timers dyrkning. Ellers er dyrkningsbetingelsene som i eksempel 1. Den folgende tabell VII angir mengden av 5'-guanylsyre (Na-salt) i væsken etter 96 timers dyrkning.

Eksempel 10

Det anvendes samme stamme og podemedium som i eksempel 1, samt et fermenteringsmedium som angitt i eksempel 9, til hvilket det er blitt tilsatt 5^\ ig/ m± pantotensyre og lyug/ml tiamin.HC1. Adenin tilsettes på en slik måte at det fås 2.5 mg/ml adenin etter dyrkning i 48 timer. Ellers er dyrkningsbetingelsene som i eksempel 1. Etter 96 timer har det i dyrkningsvæsken samlet seg 6.5 mg/ml adenylsyre. Hvis enten pantotensyre eller tiamin utelates, dannes det bare lite av 5'-adenylsyre.

Eksempel 11

Det anvendes Brevibacterium ammoniagenes ATCC nr. 6871. Det benyttes det i eksempel 9 beskrevne pode- respektive fermenteringsmedium, og. guanin eller adenin tilsettes på en slik måte at det oppnås 2.0 mg/ml guanin eller adenin etter 48 timers dyrkning. Ellers er dyrkningsbetingelsene som i eksempel 1. I tilfelle av at guanin er blitt tilsatt, fås det etter 96 timer 4-8 mg/ml 5'-guanylsyre (Na-salt) i dyrkningsvæsken, og hvis adenin er blitt tilsatt, fås det 5.1 mg/ml 5'-adenylsyre. Hvis enten pantotensyre eller tiamin utelates, dannes det bare lite av 5'-guanylsyre respektive 5'-adenylsyre.

Eksempel 12

Det benyttés Brevibacterium ammoniagenes nr. 62221 ATCC 15138 (guanin-krevende mutant)-. Det benyttede podemedium er et som er fått ved å tilsette 10^ug/ml guanin til det i eksempel 1 beskrevne podemedium. Videre anvendes det i eksempel 1 beskrevne fermenteringsmedium, til hvilket det er blitt tilsatt 15/ug/ml guanin istedenfor hypoxantin, og pantotensyre (eller pantetin, koenzym A) og tiamin.HC1 i forskjellige konsentrasjoner. Ellers ligner dyrkningsbetingelsene de i eksempel 1 anvendte. Den folgende tabell VIII angir den mengde 5''-xantylsyre (Na-salt) som er dannet etter 120 timers dyrkning.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av 5'-purin-nukleotidene 5'-inosinsyre, 5'-guanylsyre, 5'-adenylsyre og 5 <*-> xantylsyre, karakterisert ved at Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 eller ATCC 6872 eller adenin- eller guaninkrevende mutanter derav dyrkes i et næringsmedium inneholdende (l) fra 0.5 til 50 mikrogram per milliliter av pantotensyre, et pantotensyre-givende stoff, B-alanin, pantetin eller koenzym A, og (2) fra 0.1 til 10 mikrogram per milliliter av tiamin, tiaminhydrohalogenid eller et tiamin-givende stoff, idet næringsmediet også inneholder biotin og en purinbase eller et nukleosid derav, inntil i alt vesentlig maksimal dannelse av det onskede 5'-nukleotid er oppnådd, og ved at 5'-nukleotidet gjenvinnes fra næringsmediet.

2. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at det som mikroorganisme anvendes Brevibacterium ammoniagenes nr. 7208 (ATCC 15187).

3. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at det som mikroorganisme anvendes Brevibacterium ammoniagenes nr. 7309 (ATCC 15312).

4. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at det som mikroorganisme anvendes Brevibacterium ammoniagenes nr. 7320 (ATCC 15190).

5. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at det som mikroorganisme anvendes Brevibacterium ammoniagenes nr. 62221 (ATCC I5138).