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Bisher wurden Purinnucleoside und -nucleotide entweder auf synthetischem
oder mikrobiologischem Wege erzeugt. Die entsprechenden Purinbasen können relativ
einfach hergestellt werden. Die Umsetzung des Aglycons mit D-Ribose zu den entsprechenden
Nucleosiden führt jedoch zur Bildung der verschiedensten Isomeren, so daß die Ausbeute
an den gewünschten Nucleosiden schlecht ist. Andererseits erzeugen Mikroorganismen
im allgemeinen selbst Nucleotide aus niedrigmolekularen Verbindungen, sie bilden
polymere Nukleinsäurederivate aus den Nucleotiden und spalten .sie zu. den entsprechenden
Purinbasen, Nucleosiden und Nucleotiden. Die Gesamtmenge und die prozentualen Anteile
dieser Verbindungen sind aber naturgemäß in gewisser Hinsicht beschränkt. Es ist
daher bei den mikrobiologischen Verfahren verhältnismäßig selten, daß besonders
große Ausbeuten an speziellen Zwischenprodukten erhalten werden und daß dieses Verfahren
industriell ausgewertet werden kann.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosiden
durch Züchten von Mikroorganismen in einem Nährmedium, das die entsprechenden Purinbasen
als Vorläufer enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zur Erzeugung von
Adenosin Bacillus subtilis 160-88 oder 160-151, hinterlegt beim Institut für angewandte
Mikrobiologie, Abteilung Biogenetik, Universität Tokio; in- einem Nährmedium züchtet,
das, außer Adenin als Vorläufer, Natriumcitrat und gegebenenfalls L-Tryptophan enthält.
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Wenn man Bacillus subtilis 160-88 oder 160-151-in einem Nährmedium,züchtet,
das 200 y/ml Adenin als Vorläufer enthält, so- reichern sich in dem Nährmedium etwa
200 1/ml Adenosin in Form praktisch eines :einzigen Nucleosides an. Diese Eigenschaft
zur Anreicherung von Purinnucleosiden kann durch Verbesserung der Bebrütungsbedingungen
noch erhöht werden. Wenn man dem Nährmedium Adenin zusetzt, so wird diese Purinbase
auf mikrobiologischem Wege in das entsprechende Purinnucleosid umgewandelt, selbst
wenn man dem - Nährmedium keine Ribose, Phosphoribose oder andere Riboside bzw.
Ribotide zusetzt.
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Die Mutantenstämme Bacillus subtilis 160-88 und Bacillus subtilis
160-151 leiten sich von Bacillus subtilis Marburg-160 ab. Beispiel 1 Ein Nährmedium
der nachstehend angegebenen Zusammensetzung wurde 40 Stunden unter aeroben Bedingungen
bei 37° C mit dem das Purin benötigenden Mutantenstamm bebrütet, der durch Ultraviolettbestrahlung
und Behandlung mit 2,6-Diaminopurin von Bacillus subtilis MarbÜrg-160 erhalten worden
war. Anschließend wurde die Kultur zentrifugiert, um das Mycel abzutrennen. Die
überstehende Flüssigkeit wurde .auf ein Zehntel des ursprünglichen Volumens konzentriert
und dann unter Verwendung eines Gemisches von Methylisobutylketon, Essigsäure und
Wasser als Lösungsmittel papierchromatographiert. Nach dem Trocknen wurde der RI-
Wert der Ultraviolett absorbierenden Fraktion mit demjenigen einer Standard-Nucleinsäureverbindung
verglichen. Auf Grund dieses Ergebnisses wurde der Stamm ausgewählt, der zur Anreicherung
einer beachtlichen Menge einer Substanz führte, die einen dem Adenosin entsprechenden
Ri- Wert aufwies. Auf diese Weise wurden die beiden Stämme Bacillus subtilis 160-88
und Bacillus subtilis 160-151 erhalten.
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Das Nährmedium hatte die folgende Zusammensetzung: Glucose .......
............. .... 0,5% Pulverförmiges Aminosäuregemisch . 0,05% Fleischextract
. . . . . . . . . . . . . . ...... 0,0005% L-Tryptophan . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 0,0030/0 MgS04 - 7 H2H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,020/0
KI-4P04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,846% KOH ........ .................
0,2260/a Natriumcitrat # 2 1-i20 . . . . . . . . . . . . . . 0,05% lt `1142`S04
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1b/0 NaCI ............................
0,50/0 Adenin .......................... 0;02% Bacillus subtilis 160-88 wurde in
diesem Nährmedium gezüchtet, und die dabei anfallende Gärbrühe wurde in. der beschriebenen
Weise papierchromatographiert. Diejenige Fraktion, die den gleichen Rf-Wert wie
Adenosin zeigte, wurde mit Wasser extrahiert. Der Extrakt wurde eingedampft, wodurch
man ein weißes Pulver erhielt.
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Die Prüfung dieses Pulvers bzw. einer Mischung desselben mit Adenosin
durch Papierchromatographie ergab, .daß der Rf-Wert jedesmal mit demjenigen von
Adenosin identisch war. Weiterhin wurde auch das Ulträviolettabsorptionsspektrum
einer wässerigen Lösung des Pulvers untersucht. Das Spektrum war praktisch identisch
.mit demjenigen von Adenosin. Außerdem würde das Pulver in der üblichen Weise hydrolysiert.
Die dabei erhaltene basische Fraktion erwies sich sowohl bei der Papierchromatographie
als auch hinsichtlich des Ultraviolettabsorptionsspektrums als identisch mit Adenin.
Die bei der Hydrolyse erhaltene neutrale Fraktion zeigte bei der Reaktion mit Methylresorcin
alle Eigenschaften einer Pentose. Durch Papierchromatographie wurde bestätigt, daß
es sich dabei um Ribose handelte. -Auf Grund dieser Untersuchungen steht also fest,
da'ß die durch die Mikroorganismen in der Nährlösung angereicherten SubstanzenAdenosin
enthielten.
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0,05m1 des aus der Gärbrühe bei der Züchtung von Bacillus subtilis
160-88 erhaltenen Konzentrates wurden in der vorstehend beschriebenen Weise papierchromatographiert,
um den adenosinhaltigen Anteil abzutrennen, worauf eine Extraktion mit 5 ml einer
0,1 n-Salzsäure folgte, die 20 Minuten dauerte. Dieser Extrakt zeigte eine Absorptionsbande
bei 258 ml,. Eine Berechnung des Absorptionskoeffizienten bestätigte, daß in, der
Gärbrühe 100 bis 200 y/ml Adenosinanwesendwaren. Es wurden also 20 bis 50% des zugesetzten
Adenins in Adenosin umgewandelt. Der größte Anteil des nicht umgewandelten Adenins
lag unverändert in der Gärbrühe vor. Eine kleine Menge des Adenins war unter Desaminierung
in Hypoxanthin umgewandelt worden. Andere Nucleinsäureverbindungen konnten nicht
identifiziert werden. Beispiel 2 10m1 eines sterilen Nährmediums, das im Liter 4
g Fleischextrakt, 10 g Pepton und 1 g Glucose enthielt und dessen pH-Wert zwischen
6,6 und 7,0 lag, wurden mit einer Drahtschlinge von einer Schrägkultur von Bacillus
subtilis 160-88 auf einem Fleischbrüheglucosenährboden überimpft. Die beimpfte Lösung
wurde 3 Stunden bei 37 ± 1° C unter Schütteln
bebrütet. 1 ml dieser
vegetativen Kultur wurde dann zur Beimpfung von 100 ml der gleichen sterilen Nährlösung
verwendet, die sich in einer 500 ml fassenden Sakaguchi-Flasche befand. Die Bebrütung
wurde gleichfalls 3 Stunden unter Schütteln bei 37 ± 1° C durchgeführt. 80 ml der
so erhaltenen Kultur wurden wiederum zur Beimpfung von 21 einer sterilen Nährlösung
in einem 61 fassenden Behälter verwendet, die im Liter 8,46 g KH2P04, 2,26 g KOH,
0,5 g Natriumcitrat, 1 g Ammoniumsulfat, 0,20 g Magnesiumsulfat, 5 g Glucose, 1
g Adenin und 30 mg L-Tryptophan sowie eine geringe Menge eines Silikons als Antischaummittel
enthielt. Diese beimpfte Nährlösung wurde unter Belüftung bei 37 ± 1° C und bei
einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 550 U/min bebrütet, wobei die Luftzufuhr pro
Minute dem Volumen der Nährlösung entsprach. Auf diese Weise wurden nach .einer
Fermentationszeit von 40 Stunden insgesamt 938 ),/ml Adenosin erhalten. Außerdem
enthielt das Reaktionsmedium 214 1/ml nicht umgesetztes Adenin und 283 y/ml Hypoxanthin.
Beispiel 3 Der gleiche Stamm Bacillus subtilis 160-88 wie im Beispiel 2 wurde unter
den dort beschriebenen Bedingungen gezüchtet. Das Adenin wurde jedoch in zehn Anteilen
von je 0,2 g/1 in Zeitabständen von 2 Stunden zugesetzt, so daß der Gesamtadeninzusatz
nach 18 Stunden seit Beginn der Umsetzung 2 g/1 betrug. Außerdem wurden insgesamt
5 g/1 Glucose in zehn Anteilen von je 0,5 g/1 zugesetzt. Nach einer Fermentationszeit
von 60 Stunden hatten sich 1080 1/ml Adenosin gebildet; das Reaktionsmedium enthielt
noch 708 y/ml nicht umgesetztes Adenin sowie noch 332 y/ml Hypoxanthin.
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Beispiel 4 Bacillus subtilis 160-88 wurde in der gleichen Nährlösung
wie im Beispiel 2 gezüchtet, die jedoch kein L-Tryptophan enthielt. Nach einer Fermentationszeit
von 48 Stunden hatten sich 889 y/ml Adenosin gebildet. Außerdem enthielt die Fermentationsbrühe
noch 345y/ ml nicht umgesetztes Adenin und 272 y/ml Hypoxanthin.
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Beispiel 5 Bacillus subtilis 160-151 wurde in der gleichen Nährlösung
wie im Beispiel 2 gezüchtet. Nach einer Fermentationszeit von 40 Stunden hatten
sich 816 y/ml Adenosin gebildet. Außerdem enthielt die Gärbrühe noch 300 y/ml nicht
umgesetztes Adenin und 354 y/ml Hypoxanthin.