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Verfahren zur Gewinnung von Griseofulvin Bekannterweise werden zur
Ausscheidung des Antibiotikums Griseofulvin aus dem Mycelium und der nativen Lösung,
die von seinen Produzenten -Schimmelpilzen - gebildet werden, feuergefährliche und
explodierbare Extraktionsmittel: Butylazetat, Dioxan, Amylazetat, Dimethylformamid,
Diäthyläther und gesundheitsschädliche Extraktionsmittel: Trichloräthylen und Chloroform,
verwendet.
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Die Nachteile der genannten Extraktionsmittel, außer ihrer Feuer-
und Explosionsgefährlichkeit und Toxizität, bestehen darin, daß die meisten von
ihnen nicht trennscharf genug in bezug auf Griseofulvin und teuer sind und einen
wesentlichen Siedepunkt (über 50° C) haben.
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Die Anwendung von Extraktionsmitteln mit einem Siedepunkt über 50°
C ist mit einem Vakuumgebrauch zur Ausscheidung des Rohgriseofulvins und zur »Extraktionsmitteldestillation«
verbunden, um die Überhitzung und Inaktivierung des Rohgriseofulvins zu verhüten,
welches thermolabil in Gegenwart von phenolartigen Beimengungen ist, was mit zusätzlichen
Unkosten verknüpft ist.
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Das vorliegende Verfahren zur Gewinnung des Griseofulvins aus dem
Mycelium, der nativen Lösung und den festen Nährmedien durch Extraktion mit einem
Extraktionsmittel und nachfolgendem Eindampfen ist dadurch gekennzeichnet, daß zwecks
Verminderung der Feuer- und Explosionsgefährlichkeit und des Beimengungsgehaltes
in dem Rohprodukt, zur Extraktion Methylenchlorid, als praktisch unbrennbares, leichtsiedendes,
trennscharfes, billiges und wenig giftiges Extraktionsmittel verwendet wird.
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Methylenchlorid hat sehr beschränkte Explosionsgrenzen von 8,8 bis
11 Volumprozent bei Temperaturen von -14 bis -10° C, ist wesentlich billiger als
die üblicherweise angewandten Butylazetat, Trichloräthylen und Chloroform und besitzt
eine größere Trennschärfe in bezug auf Griseofulvin als diese Extraktionsmittel.
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So erhält man bei einer Extraktion mittels Butylazetat Rohgriseofulvin
mit einem 79,5%-Gehalt nach spektrophotometrischer Bestimmung, bei einer Extraktion
mittels Trichloräthylen 80%iges Rohgriseofulvin, bei einer Extraktion mittels Methylenchlorid
88%iges Rohgriseofulvin. Das ermöglicht im letzten Fall ein medizinisches Reinpräparat,
das keine Ballaststoffe enthält, mit erhöhter Ausbeute -71,5 % anstatt 58 oio -
zu erhalten.
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Der niedrige Siedepunkt des Methylenchlorids (38 bis 40 %) ermöglicht
die Verdampfung des Extrakts ohne Vakuumanwendung, ohne dabei die Beständigkeitsgrenze
des Rohgriseofulvins, die in Gegenwart von phenolartigen Beimengungen 50° C ist,
zu überschreiten.
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Eine andere Besonderheit des vorliegenden Verfahrens ist die Aufhellung
des bis zu einem Zehntel des Volumens verdampften Methylenchloridextrakts mittels
saurer aktivierter Kohle, wodurch die Abtrennung der Beimengungen von Farbstoffen
erzielt wird.
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Die dritte Besonderheit des vorliegenden Verfahrens ist ein Ausfrieren
des teilweise verdampften Methylenchloridextrakts, was bei der guten Löslichkeit
des Griseofulvins in Methylenchlorid die Abtrennung der ausfallenden bräunlichen
flockigen Beimengungen vor der Rohgriseofulvinkristallisierung ermöglicht.
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Die vierte Besonderheit des vorliegenden Verfahrens besteht in einer
vollen Abtrennung der von den Schimmelpilzen in großer Quantität synthesierten Fetten
oder fetthaltigen Substanzen, welche infolge besserer Löslichkeit im Methylenchlorid
als Griseofulvin nach der Kristallisierung des letzteren in der Methylenchloridmutterlauge
verbleiben.
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Die fünfte Besonderheit des vorliegenden Verfahrens besteht in einem
Vorfrieren des abf ltrierten wasserhaltigen Myceliums bis zu -10° C, was ein zerreißen
der Zellenwände und eine bis 22% erhöhte Ausbeute des Rohgriseofulvins im Vergleich
zum üblichen Extrahieren im Homogenisator bedingt und eine Erhöhung der Reingriseofulvinausbeute
von 71,5 bis auf 87,5% vom Griseofulvingehalt im Mycelium ergibt.
Die
sechste Besonderheit des vorliegenden Verfahrens im Vergleich zum üblichen besteht
in der Umkristallisierung des Rohgriseofulvins aus Azeton mit einer gleichzeitigen
Aufhellung der Lösung mit saurer aktivierter Kohle anstatt der Ausfällung des Griseofulvins
aus der Azetonlösung mit Wasser, was den Umfang der Apparatur und die Lösungsmittelverluste
vermindert und die Notwendigkeit der Rektifikation zur Azetonwiedergewinnung ausschließt.
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Das Verfahren wird folgenderweise ausgeführt: Das von der nativen
Lösung auf einem Filter abgetrennte Mycelium wird innerhalb von 48 Stunden in einer
Gefrierkammer bei -10'C eingefroren und nachfolgend dreimal mit technischem Methylenchlorid,
das im Volumenverhältnis 2:1:1 zum Myceliumgewicht genommen wird, bei heftigem Umrühren
in einem Homogenisator innerhalb von einer halben Stunde extragiert. Letzterer ist
mit einem doppelten Vierschaufelschnellrührer, mit messerscharfen Schneidblättern,
wie bei einem Gewebezerkleinerer, versehen.
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Der Extrakt wird nach dem Abklären durch den Unterlauf abgegossen
und so von dem aufgeschwommenen Mycelium abgetrennt, aber nach der dritten Extraktion
auf dem Filter abgepreßt und das vom Mycelium beibehaltene Extraktionsmittel mit
Dampf abgeblasen.
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Die vereinigten Extrakte werden bis zu einem Zehntel des anfänglichen
Volumens eingedampft in einem Verdampfer, der mit nicht über 50° C heißem Wasser
erwärmt wird.
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Dem warmen orangegelben Konzentrat des Rohgriseofulvins wird bei ständigem
Umrühren 0,5% trockene saure aktivierte Holzkohle beigegeben, die höchstens 0,05%
Eisen enthält. Das Gemisch wird innerhalb von 20 Minuten umgerührt und die Klärung
in eine Probe geprüft. Die erschöpfte Kohle wird auf einem gewärmten Filter abgetrennt
und mit 2,5-01o auf 35 bis 36° C erwärmten Methylenchlorid gewaschen. Die Waschflüssigkeit
wird dem Hauptfiltrat zugefügt.
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Das geklärte Konzentrat wird bei -10' C innerhalb von 12 Stunden ausgefroren,
und danach werden die spärlisch ausfallenden, bräunlichen, flockigen Beimengungen
auf einem Filter abgetrennt.
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Das Filtrat wird bei höchstens 50° C in einem Verdampfungsapparat,
der mit Heißwasser erwärmt wird, bis zum Beginn des Rohgriseofulvinkristallisation,
d. h. ungefähr bis zu einem Fünfzehntel des anfänglichen Volumens des konzentrierten
Extrakts eingeengt.
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Letzterer wird in einem Kristallisationsapparat bis zu - 8° C gekühlt
und kristallisiert.
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Die ausgeschiedenen Rohgriseofulvinkristalle werden von der Mutterlauge
auf einer Schleuder abgetrennt.-Nachfolgend wird das Rohgriseofulvin auf dem Filter
mit Petroläther oder mit bis 5' C gekühltem Azeton im Umfang von etwa 10% vom Filtratvolumen
gewaschen, wobei die Waschflüssigkeit abgesondert wird. Dabei wird das Griseofulvin
von 880!o Reinheit nach spektrophotometrischer Bestimmung gewonnen mit einem Schmelzpunkt
von 210 bis 211' C und einer Ausbeute von 95% seines Gehalts im Mycelium.
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Der Reinheitsgrad des Griseofulvins bezieht sich auf das so erhaltene
Kristallsolvat, welches nach der völligen Verflüchtigung des Extraktionsmittels
einen Reinheitsgrad von 95% des Rohgriseofulvins im Trockenzustand aufweist. Dabei
wird eine dementsprechende Erhöhung des Schmelzpunktes bis auf 214 bis 216° C erzielt.
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Das Arzneipräparat wird aus dem Rohgriseofulvin durch Lösung in Azeton,
das im Verhältnis 1 1 pro 40 g Rohgriseofulvin angewandt wird, gewonnen. Das Auflösen
wird in einem Apparat mit einem Ankerrührer und einem Rückflußkühler ausgeführt,
wobei 0,5% trockene saure Holzkohle beigegeben wird und ein Umrühren innerhalb von
15 Minuten erforderlich ist, wonach das Gemisch mit komprimiertem Stickstoff auf
ein erwärmtes Filter zur Abscheidung der in Azeton unlöslichen flockigen Beimengungen
übergedrückt wird.
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Die weitere Reinigung erfolgt durch Kristallisation des Griseofulvins
aus der Azetonlösung bei ihrem Abkühlen bis -8° C. Die ausgeschiedenen Kristalle
des Griseofulvins werden auf einer Schleuder abgetrennt und im Vakuumtrockenschrank
bei + 25/15 mm zwecks Azetonabscheidung getrocknet und nachfolgend im Heißluftschrank
bei 70° C nachgetrocknet.
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Die Ausbeute des Griseofulvins beträgt 92,5% des theoretischen Gehaltes
im Rohgriseofulvin oder 87,5% seines Gehaltes im Mycelium mit einem Schmelzpunkt
von 219 bis 22l° C und einem Reinheitgrad von 99,5°/o nach spektrophotometrischer
Bestimmung. Beispiel 1 3001 des Mediums ergeben 21,3 kg Mycelium mit einem Griseofulvingehalt
von 4,8 mkg/mg. Durch Extraktion des vorher bei -10°C eingefrorenen Myceliums nachfolgend
mit 42,6, 21,3 und 21,31 Methylenchlorid werden nach seiner Verdampfung, der Lösungsklärung
und Kristallisation 107g Rohgriseofulvin von 88%iger Reinheit gewonnen, als Kristallsolvat,
das nach der völligen Methylenchloridverfiüchtigung 99 g Rohgriseofulvin mit einem
95%-Griseofulvingehalt nach spektrophotometrischer Bestimmung ergibt. Durch Kristallisation
aus 2,681 Azeton werden 89,51 g Griseofulvin mit einem Schmelzpunkt von 219
bis 221° C, einem Gehalt der Hauptsubstanz von 99,5% nach spektrophotometrischer
Bestimmung, mit einer Feuchtigkeit von 0,340/0 gewonnen. Die Ausbeute beträgt 87,5%
seines theoretischen Gehalts im Mycelium.
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Beispiel 2 3001 des Mediums ergeben 22 kg Mycelium mit einem
Griseofulvingehalt von 6 mkg/mg im feuchten Mycelium.
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Durch nachfolgende Extraktion aus dem feuchten Mycelium mit 44,22
und 221 Methylenchlorid werden nach seiner Verdampfung, der Klärung und dem Ausfrieren
der Lösung und nachfolgender Kristallisation 122,5 kg Rohgriseofulvin 87,7%iger
Reinheit gewonnen, als Kristallsolvat, welches nach völliger Extraktionsmittelverflüchtigung
113 g Rohgriseofulvin von 95% Reinheitsgrad nach spektrophotometrischer Bestimmung
ergibt.
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Durch Kristallisation aus 3,071 Azeton und Klärung der Lösung mit
Kohle werden 101,9 g Griseofulvin mit einem Schmelzpunkt von 219 bis 221°
C, einem Gehalt der Hauptsubstanz von 99,6% und einer Feuchtiekeit von 0,16% eewonnen.
Die Ausbeute
beträgt 76,5 % seines theoretischen Gehalts im Mycelium.