DE102016008230B4

DE102016008230B4 - Elementaranalyse von organischen Proben

Info

Publication number: DE102016008230B4
Application number: DE102016008230.5A
Authority: DE
Inventors: Alexander A. Makarov; Johannes Schwieters
Original assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Current assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Priority date: 2015-07-27
Filing date: 2016-07-05
Publication date: 2024-05-08
Anticipated expiration: 2036-07-06
Also published as: US20180120446A1; GB2544838A; GB201610583D0; CN106404886B; US20170031033A1; US9880287B2; JP6328700B2; US10488529B2; CN106404886A; US20190120974A1; US10162062B2; GB201513167D0; GB2544838B; JP2017026620A; DE102016008230A1

Abstract

Verfahren zur Abbildung von einem oder mehreren anorganischen, nichtflüchtigen Elementen in einer organischen Probe, umfassend:Bereitstellung der Probe als Schicht auf einem Substrat;Oxidieren der Probe auf dem Substrat zur Herstellung von einem oder mehreren flüchtigen Produkten, die aus der Probe aus- und in die Gasphase eintreten, während das eine oder die mehreren anorganischen, nichtflüchtigen Elemente in der Probe verbleiben und durch die Oxidation im Durchschnitt nicht mehr räumlich gestört werden als die räumliche Auflösung der bildgebenden Analyse, wobei ein gewichtsmäßig größerer Teil der Probenschicht durch die Oxidation vom Substrat entfernt wird und die verbleibende Probenschicht mit dem einen oder den mehreren anorganischen, nichtflüchtigen Elemente angereichert wird; und anschließendDetektieren des einen oder der mehreren anorganischen, nichtflüchtigen Elemente in der angereicherten Probenschicht mittels eines bildgebenden Elementaranalysators.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der bildgebenden Massenspektrometrie, insbesondere der bildgebenden Elementar-Massenspektrometrie. In bestimmten Aspekten bezieht sich die Erfindung auf die Analyse der Verteilung von speziellen Elementen in einer biologischen Probe, die als Elementtags in die Probe eingebracht worden sein oder von Natur aus in der Probe vorkommen können.
Hintergrund
Die Bestimmung der Verteilung von so genannten anorganischen Elemente in biologischen Proben ist aus mehreren Gründen wichtig. Der Begriff „Anorganische Elemente“ bezieht sich normalerweise auf andere Elemente als die, die typischerweise organisches Material bilden, wie z. B. C, H, N und O. Normalerweise sind die interessierenden anorganischen Elemente schwerer als Sauerstoff und es handelt sich typischerweise um metallische oder halbmetallische Elemente. Die natürliche Verteilung von anorganischen Elementen in biologischen Proben gibt wichtige Auskünfte über biologische Prozesse auf der Ebene der Gene, Proteine und Metaboliten, wie das aufstrebende Gebiet der Metallomik zeigt. Darüber hinaus kann bei einem Ansatz mit der Bezeichnung Element-Tagging eine Anzahl derartiger Elementtags (die auch als Marker bezeichnet werden können) den Zielobjekten in der Probe künstlich hinzugefügt werden, typischerweise mit Hilfe von spezifischen Bindemitteln (z. B. Antikörpern, Aptameren, metabolischen Markierungen usw.), um sich auf spezifische Zielobjekte oder Prozesse in biologischen Systemen zu konzentrieren. Zur Messung der Häufigkeit derartiger Tags können zahlreiche unterschiedliche Detektionstechniken verwendet werden, wie z. B. Radioaktivität, Licht (z. B. Fluoreszenz oder Absorption), einschließlich Röntgenfluoreszenz (XRF), Sekundärelektronenspektrometrie (SES), Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS), Elektronenmikrosondenanalyse (EMPA), Sekundärionenmassenspektrometrie (SIMS), Laserplasmaionisations-Massenspektrometrie (LPI MS) und Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP MS) usw.
Bei fluoreszenzbasierten Assays sind die Techniken zwar evtl. schnell, zeichnen sich aber durch geringe Empfindlichkeit aus und sind auf ein oder wenige Zielobjekte je Assay begrenzt - im Vergleich zu Massenspektrometrietechniken wie SIMS oder ICP MS.
Massenspektrometrietechniken ermöglichen ein hohes Maß an paralleler gemultiplexter Messung von Elementen, z. B. mittels Multicollector-Magnetsektor-, Time-of-Flight-, Orbitrap- oder Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz-Analysegeräten. Wenn jedoch eine räumlich aufgelöste Analyse erforderlich ist, z. B. bei der Abbildung von Geweben, stellt eine geringe Häufigkeit der Elemente für alle diese Analysegeräte eine Herausforderung dar, da die Spektren von intensiven Matrixpeaks aus den Geweben dominiert werden. Diese Matrixpeaks könnten von mehratomigen Spezies stammen, die die Masse der Gewebe bilden, wobei als wichtige Elemente nicht nur C, H, N, O, sondern auch S, P, Alkalimetalle (Na, K), usw. zu nennen sind. Obwohl mehratomige Spezies im Prinzip in ausschließlich im RF-Modus arbeitenden gasgefüllten Reaktionszellen (z. B. US5,767,512 A , US7,230,232 B2 ) beseitigt werden könnten, sind derartige Reaktionen hochgradig analytabhängig, könnten die interessierenden Metalle beeinflussen und allgemein zu Verlusten von diesen interessierenden Ionen führen. Dies ist besonders spürbar bei bildgebenden Anwendungen, bei denen die Startmenge des Analyten von Anfang an begrenzt ist.
Von ICP MS mit Laserablation (LA/ICPMS) ist bekannt, dass sie einen unbedeutenden Beitrag von mehratomigen Spezies aufweist; deshalb wurde sie zu einem der bevorzugten Verfahren für die elementare Bildgebung von Geweben, wie z. B. in WO2010/133196A1 , DE10354787A1 , WO0151907A1 , WO02054057A1 , US8274735B2 , WO2014/063246A1 , WO2015128490A1 und anderen dargestellt. Es wurde eine Aufnahmegeschwindigkeit von bis zu mehreren -zig Pixeln/Sekunde mit einer räumlichen Auflösung im Mikrometerbereich (µm) nachgewiesen. Selbst bei einer derart hohen Geschwindigkeit beansprucht die Aufnahme eines einzigen Bildes noch mehrere Stunden. Eine weitere Erhöhung der Aufnahmegeschwindigkeit wird jedoch eingeschränkt durch die zeitliche Ausbreitung des Signals aufgrund der Ausbreitung der Probenwolke bei ihrem Weg von der Oberfläche zur ICP-Fackel, da der Transportprozess zum größten Teil bei atmosphärischem Druck und niedrigen Transportgeschwindigkeiten erfolgt. Der atmosphärische Druck ist für den ICP-Vorgang von wesentlicher Bedeutung. Bei dieser Ausbreitung können Übertragungsleitungen mit Aerosol bestehend aus Probenmaterial beschichtet werden, was zu Verschleppen und Kontamination der Probeneinbringungseinheit führt. Bei höherem Durchsatz, wie er bei jeder klinischen Anwendung erforderlich ist, führt übermäßige Kontamination zu erhöhten Analysekosten und längeren Laufzeiten.
Die Verlagerung des lonisierungsprozesses ins Vakuum, wie nach dem Stand der Technik bei SIMS- oder Laserplasmaionisierungsansätzen bekannt, führt zu einem außerordentlich langen Scanvorgang aufgrund eines relativ geringen Stroms der interessierenden erzeugten Ionen, wodurch lange Belichtungszeiten erforderlich sind.
Ein derart schwacher Strom von erzeugten Ionen wird häufig nicht so sehr durch lonisierungsmittel oder einen geringen Wirkungsgrad der Generierung von Sekundärionen verursacht, sondern stattdessen durch eine relativ niedrige Konzentration von natürlichen Elementen oder Tags in der Zell-/Gewebematrix. Dadurch ist auch die Nutzung anderer Verfahren der Mehrkanal-Elementbildgebung wie SES, Mikro-Röntgenfluoreszenz (µXRF), usw. ausgeschlossen. Ein weiteres Problem besteht in der schnellen Kontamination der Vakuumkammer und von Komponenten des Analysegeräts durch das organische Matrixmaterial. So könnte z. B. die Analyse von nur einem typischen 5 µm starken Gewebeschnitt mit einer Fläche von 100 mm² ein Messinstrument bei vollständiger Verwendung zur Analyse im Sinne der Anforderungen an die Empfindlichkeit vollständig kontaminieren. Bei SIMS besteht zusätzlich das Problem einer relativ niedrigen Probenabtragsgeschwindigkeit, die die Analyse von typischen Gewebeproben, die häufig mindestens 3-5 Mikrometer stark sind, verlangsamt.
Auf dem Gebiet der Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS), insbesondere, wenn der Isotopenverhältnisanalysator an eine Gaschromatografie- (GC) oder Flüssigkeitschromatographie-(LC)-Trennstufe angeschlossen ist, werden die Proben oxidiert, um Gase wie z. B. CO₂, NO_x, H₂O zu bilden, die analysiert werden, um Isotopenverhältnisse von Elementen wie C, N und/oder O zu bestimmen. Die Oxidation kann in einem Verbrennungsofen (z. B. bei GC-IRMS) erfolgen, wie bei Z. Muccio und G. P. Jackson, Isotope ratio mass spectrometry, Analyst 134 (2009) 213-222, beschrieben, oder sie kann einen nasschemischen Oxidationsprozess (z. B. bei LC-IRMS) umfassen, wie in C. Osburn und G. St-Jean, Limnology and Oceanography: Methods 5 (2007) 296-308, beschrieben. „Trocken“-oxidation, z. B. durch UV-Ozon, kommt ebenfalls routinemäßig für das Entfernen von Kontaminationen auf Oberflächen von Halbleitern, Glas usw. zur Anwendung.
Die DE 198 46 039 A1 offenbart ein Verfahren zur Probenvorbehandlung für element-spurenanalytische Messungen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Veraschung der oxidierbaren Probenbestandteile bei Temperaturen unterhalb von 230 Kelvin durch Kondensate von Reaktivgasen durchgeführt wird. Die Kondensation des Oxidationsmittels kann vornehmlich am Ort der Probe stattfinden.
Vor diesem Hintergrund wurde die vorliegende Erfindung gemacht.
Zusammenfassung
Diese Erfindung bezieht sich auf einen Ansatz, der zur Verarbeitung von Gewebeproben vor deren Analyse durch eines der vorstehend genannten Verfahren zur Anwendung kommen kann. Da die Dicke von Geweben typischerweise durchaus vergleichbar mit der erforderlichen räumlichen Auflösung der Analyse ist, können sorgfältig kontrollierte Oxidationsbedingungen zu einer allmählichen Abtragung der organischen Matrix bei gleichzeitiger Begrenzung der Diffusion von schwereren Elementen oder Tags aus deren Ausgangsposition führen. Folglich wird eine erheblich geringere Materialmenge bei der Probenentnahme desorbiert oder abgetragen, während gleichzeitig die erforderlichen interessierenden Analyten und Bildgebungsinformationen zur Verfügung gestellt werden.
Diese Erfindung bietet einen verbesserten Ansatz zur Elementaranalyse von organischen Proben durch eine Vorkonzentration der zu analysierenden Elemente (die in diesem Schriftstück mit unterschiedlichen Begriffen als interessierende Elemente oder als Analytelemente bezeichnet werden können). Dabei handelt es sich typischerweise um die in der Probe entweder von Natur aus oder durch Einbringung als Tag vorkommenden anorganischen Elemente. Damit kann eine Vielzahl von Verfahren zur Elementbildgebung zur Anwendung kommen, die sich bei früheren Ansätzen als wirkungslos erwiesen haben.
Nach einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Abbildung von einem oder mehreren Analytelementen in einer organischen Probe bereitgestellt, umfassend:

Bereitstellen der Probe als eine Schicht auf einem Substrat;
Einwirken (vorzugsweise durch Oxidieren) auf die Probe auf dem Substrat zur Herstellung von einem oder mehreren flüchtigen Produkten, die aus der Probe austreten und in die Gasphase eintreten, während das eine oder die mehreren Analytelemente in der Probe verbleiben, wobei ein gewichtsmäßig größerer Teil der Probenschicht durch die Reaktion (vorzugsweise Oxidation) vom Substrat entfernt wird und in der verbleibenden Probenschicht das eine oder die mehreren Analytelementen angereichert bzw. konzentriert werden; und
Erkennen des einen oder der mehreren Analytelemente in der angereicherten oder konzentrierten Probenschicht mittels eines bildgebenden Elementaranalysators.

Vorzugsweise werden die Analytelemente durch die Reaktion räumlich nicht mehr als die räumliche Auflösung der bildgebenden Analyse gestört. Während einige einzelne Analyten evtl. durch eine größere Distanz als diese gestört werden, werden die Analytelemente im Durchschnitt durch die Reaktion vorzugsweise räumlich nicht mehr gestört als durch die räumliche Auflösung der bildgebenden Analyse.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Vorrichtung zur Abbildung von einem oder mehreren Analytelementen in einer organischen Probe bereitgestellt, umfassend:

eine Reaktionskammer (vorzugsweise eine Oxidationskammer) zur Aufnahme der Probe, wobei die Probe in Form einer Schicht auf einem Substrat bereitgestellt ist;
wobei die Reaktions-(vorzugsweise Oxidations-)Kammer eine elektromagnetische Strahlungsquelle und/oder einen Einlass zum Einbringen von einem oder mehreren chemischen oder ionischen Oxidationsmitteln in die Kammer zum Oxidieren der Probe umfasst, zur Herstellung von einem oder mehreren flüchtigen Produkten, die aus der Probe austreten und in die Gasphase eintreten, während das eine oder die mehreren Analytelemente in der Probe verbleiben, wobei ein gewichtsmäßig größerer Teil der Probenschicht durch die Oxidation aus dem Substrat entfernt wird und die verbleibende Probenschicht mit dem einen oder den mehreren Analytelementen angereichert wird; und
einen bildgebenden Elementaranalysator in einer Detektionskammer zur Erkennung der räumlichen Verteilung des genannten einen oder der mehreren Analytelemente in der angereicherten Probenschicht.

Bevorzugte Ausführungsformen
Gemäß einer Ausführungsform umfasst der bildgebende Elementaranalysator zur Abbildung von einem oder mehreren Analytelementen in einer organischen Probe:

eine Kammer zur Aufnahme einer organischen Probe, die ein oder mehrere abzubildende Analytelemente enthält, wobei der die Probe umgebende Kammerinnendruck im Bereich von 10^-5 bis 10^-2 mbar liegt;
mindestens ein Primärbestrahlungsmittel, ausgewählt aus: (i) einer lonenkanone zum Bestrahlen der Probe mit einem Primärionenstrahl von hoher Intensität, wobei die Primärionen in der lonenkanone bei einem Druck unter 1 mbar gebildet werden, wobei die lonenkanone dazu dient, den Strahl der Primärionen auf einen lokalisierten Spot auf der Probenoberfläche zu fokussieren und den Spot im Lauf der Zeit zu einer Mehrzahl von Stellen auf der Probenoberfläche zu bewegen; (ii) einem Laser, vorzugsweise einem Hochleistungslaser, zum Bestrahlen eines lokalisierten Spots auf der Probenoberfläche zur Bildung von Ionen und um den Spot im Lauf der Zeit zu einer Mehrzahl von Stellen auf der Probenoberfläche zu bewegen;
eine gasgefüllte RF-Ionenführung zur Aufnahme der gebildeten Ionen, umfassend die aus der Probe in Reaktion auf die Primärbestrahlung freigesetzten Analytelemente, wobei die RF-lonenführung die Weiterleitung aller Ionen verhindert, deren m/z-Wert die Masse oder den Massenbereich der Analytelemente unterschreitet; wobei vorzugsweise mindestens einige der gebildeten Ionen in der genannten lonenführung eine lonen-Molekularreaktion durchlaufen; und
einen Time-of-Flight-(TOF-)Massenanalysator zur Aufnahme der gebildeten Ionen oder Reaktionsprodukte der gebildeten Ionen aus der RF-lonenführung, wobei der TOF-Massenanalysator dazu konfiguriert ist, eine Wiederholrate von mindestens 5 kHz, vorzugsweise 50-100 kHz, aufzuweisen.

Der Elementar-analysator kann zur Massenanalyse und vorzugsweise der Abbildung von einem oder mehreren Analytelementen in einer Probe bereitgestellt werden, wobei der Analysator umfassen kann:

eine Kammer zur Aufnahme einer Probe, die ein oder mehrere Analytelemente enthält, wobei vorzugsweise der die Probe umgebende Kammerinnendruck im Bereich von 10^-5 bis 10^-2 mbar liegt;
einen Laser zum Bestrahlen eines lokalisierten Spots auf der Probenoberfläche und zum Auslösen der Laserplasmaionisierung von mindestens einem oder mehreren Analytelementen in der Probe, wobei vorzugsweise der Laser dazu dient, den Spot im Lauf der Zeit zu einer Mehrzahl von Stellen auf der Probenoberfläche zu bewegen;
eine Reaktionszelle zur Aufnahme von durch Laserplasmaionisierung entstandenen Ionen von dem einen oder den mehreren Analytelementen, wobei eine Zusammensetzung und Emittanz der Ionen verändert - vorzugsweise reduziert - wird, während die Ionen die Reaktionszelle passieren; und
einen Massenanalysator, vorzugweise einen Time-of-Flight-(TOF-)-Massenanalysator, zur Aufnahme von Ionen von dem einen oder den mehreren Analytelementen und/oder Ionen von Reaktionsprodukten von dem einen oder den mehreren Analytelementen aus der Reaktionszelle, wobei vorzugsweise der TOF-Massenanalysator dazu konfiguriert ist, eine Wiederholrate von mindestens 5 kHz aufzuweisen.

Eine Vorkonzentration von Analytelementen, wobei es sich um Tags handeln kann, am Substrat wird dadurch implementiert, dass Oxidationsreaktionen ermöglicht werden, die die organische Matrix oder das Material der Probe in flüchtige Gase umwandeln, die entsorgt werden, während interessierende anorganische Elemente auf dem Substrat verbleiben. Dementsprechend enthalten die flüchtigen Produkte vorzugsweise im Wesentlichen keine Analytelemente. Weiterhin können die anorganischen Elementarspezies in oxidierter Form auf dem Substrat enden (d. h. in der oxidierten Probe).
Die in der übrigen Probe angereicherten Analytelemente können dann mittels eines bildgebenden Elementaranalysators erfasst werden. Die Detektion kann zu einem anderen Zeitpunkt und an einem anderen Ort (z. B. in einer anderen Kammer) als die Oxidation geschehen. Die Detektion findet z. B. typischerweise im Anschluss an die Oxidation statt. Aus der Detektion kann dann ein Bild der in der Probe erfassten Elemente generiert werden. Der bildgebende Elementaranalysator kann somit ein Datenerfassungssystem umfassen, das Eingangsdaten aus der Detektion des einen oder der mehreren Elemente empfängt und ein Bild des einen oder der mehreren Elemente in der Probe generiert. Der bildgebende Elementaranalysator ist wünschenswerterweise ein Gerät, das mehrere Elemente in kurzer Zeit parallel abbilden kann, wie z. B. ein Gerät, das einen Massenanalysator oder Polychromator umfasst.
Die Ausgangsprobe ist eine organische Probe, d. h. sie besteht meist aus organischer Materie und enthält eine geringfügige Menge oder Spurenmenge von anorganischer Materie, einschließlich der zu erfassenden Analytelemente. Es kann sich um jede Probe handeln, die eine organische Matrix umfasst, in der ein oder mehrere Analytelemente enthalten sind, die man erfassen möchte. Die Masse oder das Gewicht der Probe entfällt zum größten Teil auf die organische Matrix. Auf die organische Matrix können gewichtsmäßig mindestens 60% oder mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 99% oder mindestens 99,9% oder mindestens 99,99% der Probenschicht entfallen.
Die Probe kann eine biologische Probe, d. h. biologischer Herkunft, sein. Die biologische Probe kann von einem Organismus stammen. Der Organismus kann Pflanze oder Tier oder Bakterien sein. Bei einer bevorzugten Anwendung der Erfindung ist die biologische Probe Gewebe und/oder einzelne Zellen.
Die Analytelemente sind im Allgemeinen andere Elemente als diejenigen, die typischerweise die organische Matrix bilden (C, H, N und O). Typischerweise sind die Analytelemente schwerer als Sauerstoff. Typischerweise sind die Elemente metallische oder halbmetallische (metalloide) Elemente. Die Elemente können vorzugsweise Metalle sein, deren Masse schwerer als 16 ist. Die Elemente können Schwermetallelemente sein. Die Elemente können aus Seltenerdelementen (Lathanoiden) oder Übergangsmetallen oder Post-Übergangsmetallen oder Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen oder Metalloiden ausgewählt werden. Die Elemente können Radioisotope sein. Bei einer Vielzahl von Analyten können die Elemente jede Kombination der vorstehend genannten Klassen darstellen. Das eine oder die mehreren Analytelemente können zwei oder mehrere verschiedene Isotopen desselben Elements umfassen.
Das eine oder die mehreren Analytelemente können von Natur aus in der Probe vorkommen, wie z. B. Spurenelemente in einer Probe, wie z. B. einer biologischen Probe. Derartige Elemente könnten ebenfalls als interne Standards für eine verbesserte quantitative Bestimmung verwendet werden. Das eine oder die mehreren Analytelemente können in die Probe als Elementtags z. B. mittels in den nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren zum Element-Tagging, eingebracht worden sein. Eine Klasse von bevorzugten Elementtags sind Seltenerdelemente (insbesondere Lanthanoide). Die Tags können Radioisotopen sein, die durch einen Radioaktivitätsanalysator erfasst werden können.
Das eine oder die mehreren Elementtags können als Nanopartikel, Nanostäbchen, Massenpunkte oder Quantenpunkte vorliegen, z. B. nach der Beschreibung in US 2014/0221241 A1 .
Das eine oder die mehreren Elementtags können als gereinigte Isotopen von Seltenerd- oder anderen Elementen oder Kombinationen von diesen in einem vorgegebenen Verhältnis vorliegen.
Das eine oder die mehreren Elementtags können an ein Bindungselement angelagert sein, das an ein Zielobjekt in der Probe bindet. Das Bindungselement kann spezifisch sein, so dass es an ein spezifisches Zielobjekt in der Probe bindet. Jedes Elementtag (jede Masse), sofern mehr als eines vorliegt, kann an ein unterschiedliches Bindungselement angelagert sein, das für ein bestimmtes Zielobjekt in der Probe spezifisch ist. Somit kann eine Vielzahl von unterschiedlichen Zielobjekten vorliegen. Vorzugsweise ist jedes Elementtag an ein unterschiedliches spezifisches Bindungselement gebunden. Das eine oder die mehreren Elementtags können direkt oder indirekt (z. B. über einen Linker) an das Bindungselement angelagert sein. Das Bindungselement kann aus einem Flecken (z. B. fluoreszierendem Flecken), Polypeptid, Polynukleotid, Antikörper, Affikörper und einem Aptamer) oder einem SOMAmer (TM) ausgewählt werden. Das Zielobjekt kann jedes beliebige organische Molekül in der Probe sein. Bei biologischen Proben kann das Zielobjekt ein Biomolekül, z. B. ein Makromolekül sein, wie sie aus Proteinen, Polysacchariden, Lipiden und Nukleinsäuren ausgewählt werden, sowie kleine Moleküle, wie z. B. Metaboliten und natürliche Produkte. Das Zielobjekt kann ein Antigen sein. Als Beispiel kann das Elementtag an einen Antikörper angelagert sein, so dass es an einem Antikörper-Antigenkomplex angelagert wird, nachdem der Antikörper an ein Antigen bindet. Das - oder jedes - Zielobjekt ist vorzugsweise ein Biomarker.
In einigen Ausführungsformen können das eine oder die mehreren Elementtags auf metabolischem Weg in die Probe eingebracht worden sein, z. B. mit der Nahrung oder Trägermedien. Das Elementtag kann daher Bestandteil einer metabolischen Markierung sein.
Zum Tagging können auch mehrere Elemente in Art eines Barcodes verwendet werden, z. B. wie in US 2014/106976 A1 und bei B. Bodenmiller et al., Nature Biotechnology 30 (2012) 858-867, beschrieben.
Das eine oder die mehreren Elementtags können zwei oder mehrere verschiedene Isotopentags desselben Elements umfassen.
Die Probe wird als Schicht auf einem Substrat vorbereitet. Die Probe wird vorzugsweise als dünne Schicht bereitgestellt, besonders bevorzugt mit einer Dicke von höchstens (i) 20 µm oder (ii) 10 µm oder (iii) 5 µm oder (iv) 3 µm.
Beim Substrat handelt es sich typischerweise um einen Objektträger, z. B. einen planaren Objektträger. Das Substrat oder der Objektträger kann eine flache Platte aus Metall, Glas oder Keramik sein. In einigen Ausführungsformen kann das Substrat eine Oberfläche aus Titandioxid aufweisen. So kann z. B. jeder der vorstehend genannten Objektträger oder flachen Platten eine Oberfläche aus Titandioxid aufweisen. Hierzu kann das Substrat mit einer Schicht Titandioxid beschichtet sein, vorzugsweise in Form eines Titandioxidfilms oder von immobilisierten Titandioxidpartikeln. Eine der bevorzugten Ausführungsformen des Substrats ist ein Standard-Mikroskopobjektträger aus Glas mit Indium-Zinnoxidbeschichtung, wie sie nach dem Stand der Technik bekannt sind.
Bei einigen Ausführungsformen kann die Probe eine fixierte und eingebettete Gewebeprobe enthalten, z. B. ein mit Formalin fixiertes, in Paraffin eingebettetes (FFPE) Gewebe, das vorzugsweise mit einem Mikrotom, vorzugsweise auf eine Dicke von 3 - 5 µm, zugeschnitten wurde.
Bei einigen Ausführungsformen kann die Probe einzelne Zellen umfassen, die auf einem Substrat aufgebracht wurden, z. B. von einem Durchflusszytometer oder einer High-Content Screening-Vorrichtung. Die Zellen können z. B. rasterförmig aufgebracht sein (z. B. im Abstand von 50 µm oder im Abstand von 30 µm in X- und Y-Richtung). In diesem Fall kann eine typische Zelle bis zu 5 µm oder bis zu 10 µm oder 5-10 µm groß sein. Ein Beispiel für eine rasterförmige Probenvorbereitung ist in WO2014/063246A1 dargestellt.
In einigen Ausführungsformen kann die Probe eine Zellkultur auf einem Wachstumsmedium, z. B. einer Mikroben- oder Bakterienkultur auf einer dünnen Schicht eines Wachstumsmediums wie z. B. Agarose umfassen. Die Kultur ist vorzugsweise bis zu 10 µm oder bis zu 20 µm dick. Typischerweise ist das Wachstumsmedium dicker als diese Kultur. Die Kulturproben könnten in der vorliegenden Form oxidiert werden (z. B. mit Hilfe von Plasmaätzen), aber die Oxidation und nachfolgende Probenentnahme werden bei dicken Wachstumsmedium-Schichten weniger effektiv sein. Um Oxidation und Probenentnahme zu verbessern, sollte eine derartige Probe vorzugsweise auf die Dicke oder nahezu auf die Dicke einer dünnen Kulturschicht zugeschnitten werden.
In einigen Ausführungsformen kann die Probe durch einen automatischen Probengeber (z. B. einschließlich der folgenden Typen von automatischen Probengebern: Flussfokussierung, akustischer Tröpfchenausstoß, Induktion usw.) aufgebracht werden.
Die Probe kann auf dem Substrat, z. B. durch den automatischen Probengeber, in Form von einzelnen Tröpfchen in oder auf einem rasterartigen Muster (z. B. alle 30 - 50 µm in X- und Y-Richtung), oder in oder auf Mikroarrays oder in einer Multi-Well-Platte aufgebracht werden.
In einigen Ausführungsformen könnte eine Vielzahl von Proben (wobei es sich um unterschiedliche Proben handeln könnte) auf einem Substrat an unterschiedlichen Stellen des Substrats, z. B. in einem rasterartigen Muster, wie vorstehend aufgeführt, aufgebracht werden.
Das Taggen der Probe mit einem oder mehreren Analytelementen kann vor oder nach dem Bereitstellen der Probe auf dem Substrat, vorzugsweise danach, erfolgen.
Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei den Analytelementen nicht um Elementtags, sondern um in der Probe vorkommende natürliche Elemente (so genannte native Elemente). Somit bleibt die Probe in bestimmten Ausführungsformen unverarbeitet in dem Sinn, dass sie nicht markiert wird. Derartige Methoden können in Anwendungen eingesetzt werden, um die Verteilung von nativen anorganischen Elementen, wie z. B. Metallelementen, in der Probe zu ergeben, insbesondere nativen schwereren anorganischen Elementen (z. B. Metallen, z. B. Fe, Zn, Sn usw., z. B. für Versuche in der Metallomik).
Nachdem die Vorbereitung der Probe auf dem Substrat abgeschlossen ist, kann die Probe in eine Prozesskammer (z. B. Oxidationskammer) für den Oxidationsschritt überführt werden. Die Probe könnte optional vor dieser Überführung lyophilisiert werden, um den Wassergehalt darin zu vermindern. Die Probe kann in eine hermetische Reaktionskammer überführt werden, in der ein oder mehrere vorzugsweise starke Oxidationsmittel auf sie einwirken. In einer Ausführungsform könnte die Oxidation das Erwärmen der Probe in einem Sauerstoffstrom oder einer Sauerstoffatmosphäre umfassen, um die Verbrennung zu bewirken. Es können zahlreiche verschiedene Verbrennungs- oder Oxidationsprozesse funktionieren, solange die Analytelemente oder Tags durch den Prozess nicht mehr räumlich gestört werden als die gewünschte räumliche Auflösung der Analyse. Je feiner die räumliche Auflösung der Analyse (z. B. kann typischerweise eine räumliche Auflösung von 1 Mikron oder 3 - 5 Mikron zur Anwendung kommen), umso schonender sollte der Oxidationsprozess verlaufen. Unter keinen Umständen dürfen Gasblasen oder Sieden auftreten, da dies die ursprüngliche räumliche Verteilung der Elemente drastisch stören würde. In einigen Ausführungsformen können, wenn die gewünschte räumliche Auflösung in der Größenordnung von -zig Mikron liegt, stärkere und schnellere Oxidationen zur Anwendung kommen. Obwohl die Gasphasenoxidation bevorzugt wird, könnte ebenfalls nasschemische Oxidation und Ätzen durch RF-Entladungsplasma implementiert werden, solange die Anforderung einer nur geringen Störung der räumlichen Verteilung von Elementtags erfüllt bleibt. Es könnte eine Kombination von mehreren Oxidationsprozessen zum Beschleunigen der Anreicherung der übrigen Probe zur Anwendung kommen.
Die hermetisch abgedichtete Kammer kann eine von der Detektionskammer getrennte Reaktionskammer sein, in der die Erkennung oder Analyse stattfindet, oder es kann sich um dieselbe Kammer wie die Detektions- oder Analysekammer handeln. Entsprechend ist in einigen Ausführungsformen die Oxidationskammer dieselbe Kammer wie die Detektionskammer, d. h. in diesen Fällen gibt es eine einzige Oxidations- und Detektionskammer. Vorzugsweise findet die Oxidation in einer anderen als der Detektionskammer statt, in der sich der bildgebende Elementaranalysator befindet. Entsprechend muss die oxidierte Probe typischerweise von der Reaktions- (d.h. Oxidations-) Kammer in die Detektions-/Analysekammer überführt werden (in der sich der bildgebende Elementaranalysator befindet). Somit wird in diesen Fällen, sobald der Oxidationsprozess beendet ist, das Substrat (Objektträger) durch eine von zahlreichen verwendbaren Methoden in eine Vakuumkammer zur Elementbildgebung überführt (d. h. der Prozess als Ganzes ist ein zweistufiger Prozess: Umwandlung/Konzentration, gefolgt von vakuumbasierter bildgebender Analyse).
Vorzugsweise umfasst der Oxidationsschritt die Einwirkung von einem oder mehreren Oxidationsmitteln auf die Probe, wobei die Probe während des Oxidationsschrittes optional erwärmt wird. Die Vorrichtung, d. h. die Reaktionskammer, kann daher ferner ein Heizgerät zum Erwärmen der Probe während des Oxidationsschrittes umfassen. Die Reaktionskammer kann eine Vakuumkammer sein. Die Oxidation kann in der Kammer bei erhöhtem (mehr als atmosphärischem) Druck, bei atmosphärischem Druck oder bei vermindertem, d. h. weniger als atmosphärischem Druck erfolgen. Das reduzierte Druckregime kann zwischen 100 und 1000 mbar, oder zwischen 1 und 100 mbar liegen. Im letztgenannten Fall kann die Oxidation durch eine DC- oder RF-Gasentladung erleichtert werden. Das eine oder die mehreren Oxidationsmittel können ausgewählt werden aus (i) elektromagnetischer Strahlung und/oder (ii) einem oder mehreren chemischen Oxidationsmitteln der gasförmigen Phase und/oder (iii) Ionen oder Elektronen und/oder (iv) einem oder mehreren chemischen Oxidationsmitteln der flüssigen Phase. Somit kann eine Quelle von einem oder mehreren chemischen Oxidationsmitteln mit dem Einlass verbunden sein, wobei vorzugsweise das eine oder die mehreren Oxidationsmittel ausgewählt werden aus: Ozon, Wasserstoffperoxid, und als Beispiel für Oxidationsmittel der flüssigen Phase, einem Persulfat (z. B. Ammonium-, Natrium- oder Kaliumpersulfat). Letzteres wird vorzugsweise mit einem Katalysator eingesetzt, z. B. Phosphorsäure und Silbernitrat. Die Mittel können gemeinsam oder nacheinander bei reduziertem (weniger als atmosphärischem) Druck in die Kammer eingeleitet werden.
Zu den bevorzugten Oxidationsmitteln der Gasphase zählen Ozon und Wasserstoffperoxid. Die Probe kann durch das Einwirken von elektromagnetischer Strahlung - insbesondere Licht, speziell Licht mit einer Wellenlänge von <400 nm (vorzugsweise UV-Licht, in einigen Ausführungsformen aber auch Röntgenstrahlen) oxidiert werden. Im Beispiel der Ozonoxidation könnte eine UV-Ozonoxidationskammer bei atmosphärischem oder erhöhten Druck, wie sie nach dem Stand der Technik bekannt ist, mit zusätzlicher Zuführung von feuchter Luft oder feuchtem Sauerstoff und zusätzlicher Aktivierung mit UV-Licht von 254 nm und/oder 185 nm eingesetzt werden. Wenn die Oxidation mit Licht ausgeführt wird, befindet sich die Probe optional auf einer fotokatalytischen Oberfläche des Substrats (vorzugsweise einer Titandioxidoberfläche), die dem Licht ausgesetzt ist. Das oxidierende Licht bestrahlt die Oberfläche vorzugsweise bei Lichtstärken von über 0,1 oder über 1,0 oder über 10 Milliwatt/cm² oder im Bereich von 0,1 - 10 Milliwatt/cm².
Dementsprechend können das eine oder die mehreren Oxidationsmittel: (i) elektromagnetische Strahlung darstellen und der Oxidationsschritt umfasst das Bestrahlen der Probe mit Licht mit einer Wellenlänge von weniger als 400 nm, wobei das Substrat als Fotokatalysator wirkt, um die Probe zu oxidieren, oder (ii) ein oder mehrere chemische Oxidationsmittel sein und der Oxidationsschritt kann in der Einwirkung von einem oder mehreren chemischen Oxidationsmitteln auf die Probe bestehen, die ausgewählt werden aus Ozon und Wasserstoffperoxid.
Ein ähnlicher Effekt wird erzielt durch In-Kontakt-Bringen der Probe mit RF- oder DC-Gasentladung bei niedrigem Druck, so dass die Probenoberfläche durch geladene Partikel aus Plasma bombardiert wird und die Oxidation durch Sputtern ergänzt wird. Dieser Prozess ist typischerweise schneller und „aggressiver“ als die UV-Ozonbehandlung und somit besser geeignet für größere Elementklumpen oder -Kristalle.
Die beschriebenen Oxidationsprozesse sind dazu geeignet, eine schnelle Oxidation der organischen Matrixatome zu bewirken: z. B. eine oder mehrere der nachfolgenden Oxidationsreaktionen: C→ CO, CO₂, N→NO, NO₂, H→H₂O usw. Somit umfasst das eine oder die mehreren flüchtigen Produkte vorzugsweise ein oder mehrere Oxide der Elemente C, H, und/oder N. Optional wird S in SO₂ oder weitere Schwefeloxide umgewandelt. Die durch die Oxidation erzeugten flüchtigen Produkte werden vorzugsweise abgepumpt, sodass ein Teil - vorzugsweise der größte Teil - der Probenmasse abtransportiert wird. Gleichzeitig bilden die Analytelemente, z. B. schwereren Elemente (schwerer als O) und insbesondere die metallischen Elemente, keine flüchtigen Produkte und bleiben somit auf der ständig dünner werdenden Probenschicht, hauptsächlich in oxidierter Form, zurück. Somit wird die Probe vor der Analyse durch den bildgebenden Elementaranalysator mit dem einen oder den mehreren Analytelementen angereichert. Vorzugsweise verändert sich aufgrund der Reaktion der Ort der Analytelemente in der Probe auf dem Substrat nicht (zumindest nicht signifikant oder wesentlich). Hierzu kann die Reaktionsgeschwindigkeit gesteuert werden, so dass sich weder Blasenbildung noch Sieden eintritt und der Ort der Analytelemente nicht verändert. Die Diffusion ist bei schwereren Elementen oder größeren Klumpen oder Kristallen solcher Elemente gering, aber die Reaktionsgeschwindigkeit sollte so niedrig gewählt werden, dass die Diffusionslänge bei weniger als a) 1x Probendicke D, b) 0,5*D, c) 2*D gehalten wird. Dadurch stellt das somit ermittelte Bild der Analytelemente in der Probe die Verteilung der Analytelemente in der Originalprobe (vor der Reaktion) dar.
Vorzugsweise wird bei dem Reaktionsschritt der gewichtsmäßig größte Teil der Probenschicht vom Substrat entfernt. Besonders bevorzugt werden durch die Reaktion gewichtsmäßig mindestens 60% oder mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 99% oder mindestens 99,9% oder mindestens 99,99% der Probenschicht entfernt. In einigen Ausführungsformen werden durch den Reaktionsschritt gewichtsmäßig zwischen 90% und 99% oder zwischen 90% und 99,9% der Probenschicht entfernt.
Der Reaktionsschritt wird vorzugsweise fortgesetzt, bis der Oxidationsprozess im Wesentlichen oder nahezu die Sättigung erreicht, so dass der größte Teil der organischen Matrix entfernt ist (ganz besonders vorzugsweise gewichtsmäßig >90% oder >95% oder >99%) und die typischerweise schwereren Analytelemente für die nachfolgende Analyse die ausreichende Konzentration aufweisen.
Vorzugsweise umfasst der Reaktionsschritt das Kontrollieren der Geschwindigkeit des Oxidationsprozesses durch Regulieren der Zufuhr von Oxidationsmitteln (einschließlich Licht oder Ionen, sofern diese benutzt werden) und/oder der Temperatur der Probe. In einigen Ausführungsformen kann die Bildung von zumindest einem der flüchtigen Produkte und/oder deren Konzentration in der Gasphase zur Prozesssteuerung überwacht werden (z. B. mittels Verwendung von einem oder mehreren Gassensoren), z. B. zum Feststellen der Zeit zur Beendigung der Oxidationsreaktion (zur Überwachung der Vollständigkeit der Oxidation, so dass der Anteil an unerwünschten Produkten minimiert wird), oder der Oxidationsgeschwindigkeit (so dass sie nicht zu hoch ist, was den Standort der Elemente oder Tags stören könnte), sowie zur Diagnose, z. B. zur Messung des relativen Gehalts an bestimmten Elementen in den flüchtigen Produkten oder von deren Isotopen, um weitere Informationskategorien über die Probe zu erhalten, wie z. B. Nebenprodukte, Verunreinigungen usw. Eine weitere Ausführungsform der Reaktionskammer umfasst die Verwendung von Probenobjektträgern aus porösem anorganischen Material, durch das die Oxidationsmittel (Ozon, Wasserstoffperoxid, Persulfat) aus einer darunter befindlichen Zuführung gezogen werden. Dieser Ansatz beruht auf der schnellen Diffusion dieser Mittel durch den dünnen Gewebeschnitt und führt daher mit höherer Wahrscheinlichkeit zu Blasenbildung und Sieden. In diesem Fall kann jedoch ein anderer poröser Objektträger nur wenige Mikrometer vom Gewebe entfernt angeordnet werden, um nichtflüchtige Oxide von schwereren Elementen, die durch den entstehenden Gasstrom abgetragen werden, „abzufangen“. Dieser Durchlauf-Ansatz ermöglicht einen schnelleren Oxidationsprozess ohne Verlust der interessierenden Analyten, selbst bei Blasenbildung.
Dementsprechend umfasst der Prozess der Reaktion der Probe auf dem Substrat bei einigen Ausführungsformen das Hindurchführen von einem oder mehreren Oxidationsmitteln von einer gegenüberliegenden Seite des Substrats zur Probe durch Poren im Substrat, um die Probe zu erreichen, wobei sich ein zweites Substrat in der Nähe der Probe befindet, jedoch in einem gewissen Abstand von dieser und auf diese gerichtet, wobei das eine oder die mehreren Oxidationsmittel durch die Probe hindurch diffundieren und dabei flüchtige Produkte aus der Probe generieren und dazu führen, dass nichtflüchtige (schwerere) Analytelemente und/oder deren Oxide die Oberfläche des zweiten Substrats erreichen und dort verbleiben, um vom bildgebenden Analysator erfasst zu werden. Wenn zwischen den beiden Substraten ein ausreichend kleiner Zwischenraum besteht, z. B. 5-10 Mikrometer, ist der Zwischenraum so beschaffen, dass die räumliche Verteilung der schwereren Analytelemente in der Probe nach Überführung der Elemente zum zweiten Substrat im Wesentlichen erhalten bleibt. Die zum zweiten Substrat überführten Analytelemente werden zumindest vorzugsweise im Durchschnitt durch die Oxidation nicht mehr räumlich gestört als durch die räumliche Auflösung der durchzuführenden bildgebenden Analyse.
Der bildgebende Elementaranalysator kann ausgewählt werden aus einer Gruppe bestehend aus: einem Sekundärelektronenspektrometer (SES), einem Röntgen-Photoelektronenspektrometer (XPS), einem Röntgenfluoreszenzspektrometer (XRF), energiedispersiven Röntgenmikroanalysator, einem Radioaktivitätsanalysator, lonenmobilitätsanalysator und einem Massenspektrometer (MS), vorzugsweise einem Massenspektrometer.
Vorzugsweise umfasst die Erkennung des einen oder der mehreren Elemente das Bestrahlen der konzentrierten Probe mit einem Strahl aus Primärpartikeln, wie z. B. Ionen oder Photonen, die auf einen lokalisierten Spot auf der Probenoberfläche fokussiert sind, um Sekundärpartikel von dem Spot auszusenden und die Sekundärpartikel zu analysieren, um das Vorliegen und optional die Menge des einen oder der mehreren Elemente an dem Spot zu ermitteln, wobei der Spot im Lauf der Zeit zu einer Mehrzahl von Stellen auf der Probenoberfläche bewegt wird, um dabei ein Bild von dem einen oder den mehreren Elementen in der Probe zu erhalten, wobei jede Stelle des Spots auf der Probenoberfläche einem Pixel des Bildes entspricht. Zumindest einige der Sekundärionen sind Ionen, die das eine oder die mehreren Analytelemente umfassen. Die Sekundärpartikel können direkt bei der Abgabe von der Probenoberfläche analysiert werden (z. B. wenn es sich bei den Sekundärpartikeln bereits um Elementarionen oder deren Oxidionen handelt und der Analysator ein Massenspektrometer ist, oder wenn die Sekundärpartikel Photonen oder Elektronen sind, die von dem einen oder den mehreren Analytelementen abgegeben werden, die für das eine oder die mehreren Analytelemente charakteristisch sind), oder sie können zu Analysezwecken in eine andere Form umgewandelt werden, z. B. von abgegebenen neutralen oder ionischen polyatomaren Partikeln in monoatomare Elementarionen zur Massenanalyse umgewandelt werden (z. B. in einer ICP-Ionenquelle eines Massenanalysators), oder in Reaktionsprodukte umgewandelt werden (durch lonenmolekül- oder lonen-lonen-Reaktionen) in einer Reaktions- oder Kollisionszelle, die dem Massenanalysator vorgeschaltet ist.
Somit kann der bildgebende Elementaranalysator eine Primärpartikelquelle (z. B. eine lonenkanone) oder eine Photonenquelle (z. B. einen Laser) zum Generieren des Primärpartikelstrahls und zum Fokussieren des Strahls auf einen lokalisierten Spot auf der Oberfläche der Probe umfassen, um Sekundärpartikel von dem Spot auszusenden, und er umfasst einen Sekundärpartikelanalysator, um die Sekundärpartikel zu analysieren, um das Vorhandensein und optional die Menge des einen oder der mehreren Elemente an dem Spot zu ermitteln, wobei die Primärpartikelquelle dazu konfiguriert ist, den Spot im Lauf der Zeit zu einer Mehrzahl von Stellen auf der Probenoberfläche zu bewegen, um dabei ein Bild von dem einen oder den mehreren Elementen in der Probe zu erhalten, wobei jede Stelle des Spots an der Probenoberfläche einem Pixel des Bildes entspricht. Der bildgebende Elementanalysator kann das Bild mit einer Geschwindigkeit von mindestens 100 Pixeln pro Sekunde oder mindestens 1000 Pixeln pro Sekunde oder im Bereich von 1000-10000 Pixel pro Sekunde erfassen.
Die Primärpartikel werden vorzugsweise ausgewählt aus IR-Photonen oder Photonen im sichtbaren Wellenlängenbereich oder UV- oder Röntgenphotonen, Elektronen und Ionen. Ebenso handelt es sich bei den Sekundärpartikeln vorzugsweise um ausgewählte Photonen (insbesondere Röntgenphotonen), Elektronen und Ionen.
Vorzugsweise weisen die Primärpartikel eine Energie von über 1 keV auf.
Vorzugsweise sind die Primärpartikel Ionen und somit umfasst die Primärpartikelquelle besonders bevorzugt eine lonenkanone. Vorzugsweise ist der Primärionenstrahl kontinuierlich. In einigen Ausführungsformen ist jedoch der Primärionenstrahl gepulst. Vorzugsweise sind die Primärpartikel Ionen, die bei einem Druck von unter 1 mbar erzeugt werden, und die Sekundärionen sind Ionen zur Analyse durch den Massenanalysator. Somit kann der bildgebende Elementaranalysator ein bildgebendes Sekundärionen-Massenspektrometer (SIMS) sein, das dazu konfiguriert ist, dass durch Abpumpen ein Vakuum hergestellt wird, wobei die Primärpartikel Ionen sind, die in der Quelle bei einem Druck von unter 1 mbar erzeugt werden und wobei die Sekundärpartikel Ionen zur Analyse durch einen Massenanalysator des SIMS sind.
Das Scannen der Probe kann durch Führungsplatten der lonenkanone und/oder durch Bewegen eines Objekttisches, auf dem sich die Probe oder das Substrat befindet, erfolgen. Eine höhere räumliche Auflösung für subzelluläre und suborganelle Auflösung könnte z. B. durch Verwendung einer dünneren Probe (z. B. Gewebeschnitt mit einer Dicke von 3 µm und weniger) und/oder stärkere räumliche Fokussierung des Primärstrahls und/oder schwächeren Primärstrahlstrom zur Reduzierung der Defokussierung der Raumladung erreicht werden.
Der Primärionenstrahl hat vorzugsweise eine Intensität von bis zu 100 nA je 1 µm Spotgröße (d. h. Spotdurchmesser 1 µm). Vorzugsweise hat der Primärionenstrahl eine Intensität von mindestens: a) 1 pA oder b) 100 pA oder c) 1 nA oder d) 10 nA bei einer Spotgröße von 1 µm.
Wenn Photonen als Primärpartikel eingesetzt werden, liegt die Fluenz im lonisierungspuls vorzugsweise bei über a) 5, b) 10, c) 20, d) 50 J/cm², was die Bildung von Plasma mit hoher Dichte und das Erreichen eines hohen lonisierungsgrades ermöglicht, wie nach dem Stand der Technik bekannt. Als Photonenquelle kommt vorzugsweise ein Lasergerät zur Anwendung. Ein derartiger Laser ist vorzugsweise ein gepulster Laser, wobei die einzelnen Pulse vorzugsweise die vorstehend genannte Fluenz aufweisen. Es könnten Laser mit beliebiger Wellenlänge verwendet werden, jedoch vorzugsweise nicht länger als die erforderliche räumliche Auflösung und vorzugsweise mit einer Extinktionslänge (d. h. durch einen Faktor e (Euler'sche Zahl) abzuschwächende Länge für die Laserintensität) von höchstens a) 100 nm, b) 200 nm, oder c) 500 nm. So überschreitet z. B. die Fluenz im Bestrahlungspuls a) 5 oder b) 10 J/cm² (oder die anderen bevorzugten Fluenzwerte) und weist eine Extinktionslänge von maximal 500 nm auf. Ganz besonders vorzugsweise kommen Festkörperlaser wie Nd:YAG für die Ionisierung mit oder ohne Frequenzvervielfachung zum Einsatz (letztere könnte erforderlich sein, um ausreichend kurze Extinktionslängen zu erreichen).
Die Laserstrahlung könnte von der Vorder- oder der Rückseite auf die Probe auftreffen. Im letztgenannten Fall wird das Fokussieren des Laserstrahls, die Orthogonalität des Laserlichts auf der Probe und somit das Herstellen eines runden Spots vereinfacht - allerdings sollte Glas mit hohem Strahlungsgrenzwert verwendet werden, um Strahlungsschäden am Objektträger zu vermeiden. Bei Bestrahlung von vorne trifft das Laserlicht typischerweise in einem Winkel auf (um anspruchsvollere Anforderungen der Extraktionsionenoptik zu vereinfachen), während die optische Beobachtung des fokalen Spots von der Rückseite durch den Glasobjektträger möglich ist.
In Ausführungsformen, in denen der bildgebende Elementaranalysator einen Massenanalysator zur Bestimmung des m/z-Wertes von emittierten Ionen oder deren Reaktionsprodukten umfasst, kann der Massenanalysator ausgewählt werden aus: einem Time-of-Flight- (TOF-) Massenanalysator, einem Distance-of-Flight-Massenanalysator, einem Quadrupol-Ionenfallen-Massenanalysator, einem Massenanalysator mit elektrostatischer Falle (EST) (wie z. B. einem Orbital EST, z. B. Orbitrap), einem lonenzyklotronresonanz-Massenanalysator (FT-ICR), insbesondere einem EST oder ICR, die mit abbildender Stromerkennung arbeiten, einem Magnetsektormassenanalysator und einem Array oder einer beliebigen Kombination von diesen, wobei der Massenanalysator besonders bevorzugt einen TOF-Massenanalysator umfasst. Der TOF-Analysator kann ein TOF-Analysator mit orthogonaler Beschleunigung (OA-TOF) sein, insbesondere ein OA-TOF mit hoher Wiederholrate, wie er nach dem Stand der Technik bekannt ist, vorzugsweise mit gitterloser orthogonaler Beschleunigung, optional mit einem oder mehreren lonenspiegeln, die einfache oder mehrfache Reflexion von Ionen im Analysator bieten (besonders bevorzugt einfache Reflexion). Der Massenanalysator ist vorzugsweise zur Analyse eines kontinuierlichen Sekundärionenstrahls gleichzeitig über einen großen Massenbereich von Ionen in der Lage, wie z. B. TOF oder Orbitrap oder eine elektrostatische Orbitalfalle. Vorzugsweise ist eine Vielzahl von Analytelementen zu analysieren (abzubilden), z. B. von einer Vielzahl von Elementtags. Besonders vorzugsweise werden mindestens 5 oder mindestens 10 Analytelemente oder Elementtags vom Elementaranalysator analysiert. Ein Massenspektrometer, insbesondere ein TOF-Massenspektrometer, ist mühelos in der Lage, eine derartige Mehrkanalanalyse in kurzen Zeiträumen durchzuführen. Eine Kombination von Analysatoren könnte für die Multimodalanalyse eingesetzt werden, z. B. TOF-Massenanalysator für die Nennmassenelementaranalyse und eine elektrostatische Falle mit Bildstromdetektion, wie z. B. eine Orbitrap - zur organischen Analyse oder hohen Auflösung von Interferenzen.
Die Sekundärionen der Analytelemente (Tags) können in einen mittleren Vakuumdruck von 10^-5-10^-2 mbar statt eines höheren Vakuums abgegeben werden, weshalb niedrigere Anforderungen an die Probenentfeuchtungs- und Transferzeit im Vergleich zu Hochvakuum- (z. B. SIMS-) Instrumenten gelten. Somit liegt der Druck in der Kammer zur Aufnahme der mit Primärionen bestrahlten Probe bei einem die Probe umgebenden Kammerinnendruck im Bereich von 10^-5 bis 10^-2 mbar.
Vorzugsweise werden die Sekundärpartikel nach der Abstrahlung von der Oberfläche zur Analyse durch den Massenanalysator in eine RF-lonenführung überführt und von der lonenführung an den Massenanalysator übergeben. Somit umfasst der bildgebende Elementaranalysator vorzugsweise eine RF-Ionenführung zur Aufnahme der Sekundärionen nach deren Abstrahlung von der Oberfläche und zum Transport der Sekundärionen in den Massenanalysator. Die verwendete lonenführung ist vorzugsweise auf einen Druck von mindestens 10^-2 mbar mit Gas gefüllt, wobei alle m/z-Werte unter dem Massenbereich der Analytelemente oder deren Oxide - sofern Oxide der elementaren Ionen detektiert werden - entfernt werden. Die lonenführung kann dadurch vorteilhafterweise als Reaktions- oder Kollisionszelle fungieren.
Die lonenführung kann in einigen Ausführungsformen ein Reaktivgas zur Bildung von Reaktionsprodukten mit den Sekundärpartikeln (z. B. via lonen-Molekular-Reaktionen) enthalten, wobei die Sekundärpartikel Ionen sind, die ein oder mehrere der Elemente umfassen. So kann z. B. das Reaktivgas ein Gas wie NO oder O₂ umfassen, um die meisten Analytelemente (z. B. native Metalle oder Seltenerdelemente) vollständig zu Oxiden zu oxidieren, wie nach dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. G. Koyanagi, D. Bohme. J. Phys. Chem. A, 105 (2001) 8964-8968) und somit Interferenzen zu reduzieren (durch Massenverschiebung von diesen Elementpeaks um 16 amu, während andere Peaks nicht verschoben werden) und die Anzahl der parallel zu analysierenden Kanäle zu erhöhen. Wenn ein reaktives Gas zum Einsatz kommt, könnten alle Oxide und sonstigen molekular bedingten Interferenzen beseitigt werden. Somit durchlaufen vorzugsweise mindestens einige der generierten (Sekundär-) Ionen in der lonenführung eine lonen-Molekular-Reaktion. Die lonenführung kann eine Abkühlung der Ionen beim Transport durch die lonenführung bewirken. Somit wird die Energieverteilung oder Emittanz der Ionen am Ausgang der lonenführung gegenüber den Ionen am Eingang der lonenführung verändert (vorzugsweise reduziert). Entsprechend kann in einigen Ausführungsformen eine Zusammensetzung und/oder Energieverteilung der Ionen am Ausgang der lonenführung gegenüber den Ionen am Eingang der lonenführung verändert sein. Die lonenführung ist somit vorzugsweise als Reaktionszelle konfiguriert. Nach dem Stand der Technik ist bekannt, dass Gase wie N₂O, NO₂, O₂, CO₂, NO die Oxidation von zahlreichen Metallionen, insbesondere mit Werten von m/z>100, erleichtern, was wiederum die Reduzierung der Anzahl von Analysekanälen je Isotop auf einen ermöglicht. Auch NH₃ und NO könnten dazu verwendet werden, polyatomare Spezies wie Hydride vor dieser Oxidation zu beseitigen. Die Reaktionszelle kann daher mit einem oder mehreren dieser Gase gefüllt werden, die als ein oder mehrere Reaktivgase in der Reaktionszelle wirksam sind.
In bestimmten Ausführungsformen können schwerere Elemente, wenn sie auf der Objektträgeroberfläche konzentriert werden, einen neuen Matrixtyp bilden, der damit beginnen kann, die Analyse zu beeinträchtigen, was zu einer geringeren lonisationsausbeute oder Auswirkungen auf die Topographie führen kann. So können sich z. B. Phosphor und Phospholipide um Zellmembranen (einschließlich der Kernmembran) konzentrieren und DNAinnerhalb des Kerns bilden. Alkalimetalle (z. B. Na, K) könnten in verschiedenen Konzentrationen auf gegenüberliegenden Seiten der Membranen auftreten, usw. Daher sollten bei derartigen Ausführungsformen ein oder mehrere dieser Elemente (z. B. P, Na, K) vorzugsweise ebenfalls überwacht und je nach deren Häufigkeit Korrekturen vorgenommen werden. Wenn z. B. in einigen Ausführungsformen die Konzentrationen von derart häufigen Elementen (z. B. Na, K usw.) nicht die erwarteten Konzentrationen in bekannten Probenbereichen aufweisen, dann kann die beobachtete Abweichung von deren erwarteter Konzentration als Grundlage für die Korrektur von erkannten Häufigkeiten der (typischerweise schwereren) Analytelemente verwendet werden.
Darüber hinaus könnte die Probe einer weiteren Behandlung unterzogen werden, z. B. Anwendung einer zusätzlichen Matrix zur Verstärkung der lonisierung und Ausgleich für Matrixeffekte usw. So kann z. B. eine gleichförmige Beschichtung, die ein oder mehrere Elemente zur Unterstützung der lonisierung umfasst, auf die Probe angewandt werden (z. B. bekanntlich erhöht Sauerstoff eine Ausbeute an Sekundärionen von Metallen). Bei Bestrahlung und/oder lonisierung durch einen Laser kann die Probe auch mit einer lichtabsorbierenden Schicht versehen werden.
Der Massenanalysator ist vorzugsweise ein TOF-Massenanalysator, insbesondere vom Typ OA-TOF, und die Wiederholrate des TOF-Massenanalysators ist mindestens gleich oder größer als (a) 5 kHz oder (b) 20 kHz oder (c) 50 kHz oder (d) 100 kHz. Die Wiederholrate kann z. B. 50-100 kHz betragen. Hier bezeichnet die Wiederholrate die Rate von pulsierenden Ionen in den TOF-Analysator zur lonentrennung nach ihrem Masse-/Ladungsverhältnis (m/z). Von jedem lonenpuls in den TOF-Analysator wird ein erfasstes Ionensignal (Intensität versus m/z) erhalten. Eine Summierung der Detektionssignale von jedem lonenpuls in den TOF-Analysator an einem gegebenen Spot auf der Probenoberfläche kann dazu verwendet werden, das entsprechende Pixel des Elementarverteilungsbildes zu generieren. Vorzugsweise wird das Elementarverteilungsbild mit einer Geschwindigkeit von mindestens 100 Pixeln pro Sekunde oder mindestens 1000 Pixeln pro Sekunde oder im Bereich von 100 - 10000 Pixel pro Sekunde erfasst. Vorzugsweise ist der Massenanalysator dazu konfiguriert, Elemente oder Oxide der Elemente zu detektieren.
Vorzugsweise werden für die Analyse eines jeden Spots mittels des TOF-Massenanalysators nicht mehr als (a) 2 oder (b) 5 oder (c) 10 Pulse des TOF-Analysators benötigt. Die Analysezeit eines jeden Spots ist vorzugsweise die Zeit für die Erfassung eines Massenspektrums eines ausreichenden oder wünschenswerten Signal-Rausch-Verhältnisses oder einer ausreichenden oder wünschenswerten Empfindlichkeit zur Verwendung in den Pixeln des Bildes.
Diese Erfindung kann für eine der folgenden Anwendungen eingesetzt werden:

i. Gewebedarstellung, z. B. wie sie für anatomische Pathologie zur Anwendung kommt, insbesondere Krebs, einschließlich fixierten, paraffineingebetteten Geweben und in Verbindung mit der Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H&E);
ii. High-Content-Zellanalyse;
iii. auf Mikroarrays basierende gezielte Assays für klinisch relevante Biomarker für Krankheiten;
iv. pharmazeutische, chemische und klinische Hochdurchsatzanalyse;
v. Identifizierung und Resistenzbestimmung von Bakterien (mit Kulturen auf dünnen Medienschichten).
vi. Zytometrie, einschließlich Offline-Durchflusszytometrie;

In Fällen, in denen es sich bei der Probe um eine biologische Probe handelt, insbesondere klinisch relevante Proben, kann das Verfahren ferner die Verwendung des Bildes von einem oder mehreren Elementen in der Probe zur Bestimmung eines physiologischen Zustandes oder zur Diagnose eines Krankheitszustandes in einem Organismus umfassen, von dem die biologische Probe entnommen wird.
Der Ansatz der Proben-Vorkonzentration nach der Erfindung kann zahlreiche Vorteile bieten, wie z. B. die erhöhte Pixelaufnahmegeschwindigkeit und somit den Durchsatz der Elementbildgebung; verminderte Kontaminierung der Instrumente, Anwendbarkeit mit einem größeren Bereich von Elementbildgebungstechniken, und eine erhöhte lonisierungseffizienz aufgrund des Vorliegens von oxidierten Elementarionenspezies auf der oxidierten Oberfläche.
Beschreibung der Zeichnungen

1 zeigt schematisch eine Ausführungsform einer Vorrichtung zur Abbildung von einem oder mehreren Elementen in einer organischen Probe entsprechend der Erfindung.
2 zeigt schematisch eine weitere Ausführungsform einer Vorrichtung zur Abbildung von einem oder mehreren Elementen in einer organischen Probe entsprechend der Erfindung.
3 zeigt schematisch eine Durchlauf-Ausführungsform mit Überführung der interessierenden Analyten auf einen gegenüberliegenden Objektträger.

Detaillierte Beschreibung von Ausführungsformen
Um ein detaillierteres Verständnis der Erfindung zu ermöglichen, werden nun zahlreiche Ausführungsformen beispielhaft und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnung beschrieben.
Unter Bezugnahme auf 1 ist schematisch eine Vorrichtung zur Abbildung von einem oder mehreren Elementen in einer organischen Probe dargestellt. Eine dünne Schicht einer zu analysierenden Probe wird auf dem Objektträger (2) aufgebracht. Die Probe kann als Mikroarray auf dem Objektträger angeordnet sein. Der Objektträger ist typischerweise ein flacher Glasobjektträger mit ITO-Beschichtung. Alternativ könnte es sich um eine Metallplatte handeln.
Die Probe ist z. B. eine bio(organische) Probe, wie z. B. eine Gewebeprobe oder Zelllinie. Allerdings ist die Probe im Allgemeinen nicht auf einen gegebenen Typ beschränkt. Die Probe könnte beliebige der folgenden Elemente umfassen:

- eine biologische oder eine chemische (organische aber nichtbiologische) Probe
- eine fixiertes und eingebettetes Gewebe, z. B. ein mit Formalin fixiertes, in Paraffin eingebettetes (FFPE) Gewebe, das vorzugsweise mit einem Mikrotom, vorzugsweise auf eine Dicke von 3 - 5 µm zugeschnitten wurde
- einzelne auf dem Objektträger aufgebrachte Zellen, z. B. von einem Durchflusszytometer oder einer High-Content-Screening-Vorrichtung, z. B. mit einem rasterartigen Muster (z. B. in Abständen von 50 µm in X- und Y-Richtung aufgebracht, bei einer typischen Zellengröße bis zu 5-10 µm). Typischerweise wird jede Rasterzelle oder jedes Quadrat von nicht mehr als einer einzigen biologischen Zelle belegt. Die Zellen im Raster können alle unterschiedlich sein (d. h. aus unterschiedlichen Proben oder Versuchen stammen), oder es können mindestens einige, optional alle der Zellen im Raster von einer Probe oder Population stammen, um eine Variation innerhalb dieser Probe oder Population festzustellen
- eine Zellkultur auf einem Wachstumsmedium, z. B. einer Mikroben- oder Bakterienkultur auf einer dünnen Schicht eines Wachstumsmediums wie z. B. Agarose (vorzugsweise ist die Kultur bis zu 10 µm oder bis zu 20 µm stark)
- eine Probe, wie z. B. eine nichtzelluläre Probe, die auf dem Objektträger aufgebracht ist, z. B. durch einen automatischen Probengeber jedes bekannten Typs (einschließlich durch Flussfokussierung, akustischer Tröpfchenausstoß, Induktion usw.) die Probe kann in Form von einzelnen Tröpfchen auf einem rasterartigen Muster (z. B. alle 50 µm in X- und Y-Richtung), oder in einem Mikroarray aufgebracht werden.

Aus den nachstehend beschriebenen Gründen ist der Objektträger bei einigen Ausführungsformen mit einer Schicht Titandioxid beschichtet, z. B. in Form eines Films oder immobilisierter Partikel.
In einigen Ausführungsformen könnte die Probe auf dem Objektträger in der vorliegenden Form analysiert werden (d. h. unverarbeitet, ungetaggt), um eine Verteilung von nativen schwereren anorganischen Elementen (z. B. Fe, Zn, Sn usw., z. B. für Metallomik-Versuche) zu bestimmen. In anderen Ausführungsformen könnte die Probe getaggt sein, vorzugsweise mit einem oder mehreren Elementen, die nicht-native Elemente auf der Probe sind (nachstehend als nicht-native Elemente bezeichnet). Seltenerdelemente stellen eine nach dem Stand der Technik bekannte Klasse von Elementtags dar. Das eine oder die mehreren Tags sind typischerweise spezifisch für ein oder mehrere verschiedene entsprechende Zielobjekte in der Probe. Die Probe könnte mit den Tags versehen werden, bevor oder nachdem sie auf dem Objektträger aufgebracht wird, jedoch vorzugsweise danach. Die Spezifität des Taggings kann mit Hilfe von Bindeelementen erreicht werden, wie z. B. Antikörpern, Aptameren, Somameren, metabolischen Markierungen und anderen bekannten Verfahren. Tags könnten Polymerketten, Nanopartikel (wie in US 8,679,858 B2 dargestellt), Quantenpunkte usw. enthalten. Das Tagging könnte sich auch mehrerer Elemente in der Art von Barcodes bedienen, wie in US 2014/106976 A1 und B. Bodenmiller et al., Nature Biotechnology 30 (2012) 858-867, dargestellt.
Der nächste Schritt im Verfahren zur Analyse der Probe besteht im Einbringen des Objektträgers mit der (getaggten) Probe in eine Reaktions- oder Oxidationskammer (10), wobei eine Oxidationsreaktion stattfindet, um die Masse der Probe durch Entfernen des größten Teils der organischen Matrix zu reduzieren, so dass die Probe, die die interessierenden Analytelemente enthält, typischerweise in Form von Oxiden, zurückbleibt. Es könnten einer oder beide von zwei Ansätzen für Oxidation zur Anwendung kommen. Der erste Ansatz umfasst den Einsatz von Licht mit einer Wellenlänge von <400 nm, wie z. B. UV-Licht (12), zum Bestrahlen des Objektträgers und der Probe, vorzugsweise bei Intensitäten mit oder über 0,1-10 Milliwatt/cm² und einer Wellenlänge von <400 nm (z. B. aus einer Gasentladungsquelle, wie sie nach dem Stand der Technik bekannt ist). Dies sind die Ausführungsformen, bei denen der Objektträger, der UV-Licht ausgesetzt ist, bevorzugt mit einer Schicht Titandioxid oder eines anderen Photokatalysators zu versehen ist. Titandioxid weist sehr starke fotokatalytische Eigenschaften auf, die zur schnellen Oxidation der Matrixatome führen. Alternativ oder zusätzlich wird ein chemisches Oxidationsmittel, vorzugsweise Ozon oder Wasserstoffperoxiddampf, in die Oxidationskammer (10) durch den Einlass (14) eingebracht und aus dieser durch einen Auslass (16) ausgestoßen. Die Probe kann auf dem Objektträger erwärmt werden, um den Oxidationsprozess zu unterstützen, wie es nach dem Stand der Technik bekannt ist.
Unter dem Einfluss von UV-Licht und/oder den Oxidationsmittel findet eine schnelle Oxidation von Matrixatomen statt: z. B. C→CO₂, N--+NO, NO₂, H→H₂O, usw. Die flüchtigen Produkte werden durch eine mit der Kammer (nicht abgebildet) verbundene Vakuumpumpe abgepumpt; somit wird die Probenmasse größtenteils abtransportiert. Unterdessen bilden schwerere Atome, einschließlich der Analytelemente der Tags oder der nativen schwereren Elemente keine flüchtigen Produkte und bleiben somit auf der dünner werdenden Probenschicht, hauptsächlich in oxidierter Form, zurück. Nachdem der Prozess die Sättigung erreicht hat und die organische Matrix zum größten Teil entfernt wurde (vorzugsweise gewichtsmäßig >90% oder >99%, z. B. 90-99%, entfernt), sind die schwereren Atome ausreichend konzentriert für die nachfolgende Analyse. Die Geschwindigkeit des Oxidationsprozesses kann durch Steuerung der Versorgung mit Oxidationsmitteln oder der einstrahlenden Lichtleistung und/oder der Probentemperatur reguliert werden. Eine Oxidation, die unerwünschter Weise zu schnell ist, könnte zu Gasblasen führen, die die interessierenden schwereren Atome abtransportieren. Daher sollte die Oxidationsgeschwindigkeit sorgfältig auf die Probenproduktion in der Reaktionskammer abgestimmt werden. Die flüchtigen Produkte können zur Prozesssteuerung verwendet werden (z. B. zur Bestimmung einer Zeit zum Beenden der Oxidation), und/oder zur Diagnose (z. B. zur Messung des relativen Gehalts an Elementen oder deren Isotopen, um zusätzliche Informationskategorien zu erhalten). So könnten z. B. die Elemente der flüchtigen Produkte überwacht werden. Wenn z. B. das überwachte Verhältnis von C zu O gleich 1:1 ist, weist dies auf unvollständige Oxidation hin; wenn das Verhältnis von C zu O jedoch 1:2 ist, weist dies auf vollständige Oxidation zu CO₂ hin. In einem weiteren Beispiel könnten die Isotopenverhältnisse, z. B. C¹²/C¹³ als Prozessindikatoren dienen. So könnte dieses Verhältnis z. B. zur Unterscheidung verwendet werden, wann der Prozess das Oxidieren einer Bakterienkultur beendet hat und mit dem Oxidieren des Mediums beginnt (das ein unterschiedliches Verhältnis C¹²/C¹³ gegenüber den Bakterien aufweisen könnte).
Ein alternativer Ansatz ist in 3 dargestellt und ermöglicht höhere Reaktionsgeschwindigkeiten, was im Prinzip sogar Sieden und Blasenbildung der Probe gestattet. In diesem Fall werden ein oder mehrere Oxidationsmittel (Ozon, Wasserstoffperoxid, Persulfat) von einer (nicht dargestellten) Versorgung unter dem Objektträger (102), der eine Probe (104) trägt, z. B. eine dünne Gewebeprobe, getrieben (101). In dieser Ausführungsform liegen zwei in einem Abstand angeordnete, jedoch nahe beabstandete Proben-Objektträger (102,106) vor, die jeweils aus porösem anorganischen Material (z. B. Glas, Keramik, ITO) hergestellt sind. Das eine oder die mehreren Oxidationsmittel werden durch die beiden nahe beabstandeten Proben-Objektträger getrieben. Diese Mittel diffundieren schnell durch den dünnen Gewebeschnitt, wobei sie auf dem Weg leichte Gase erzeugen (z. B. flüchtige Produkte). Dieses Gemisch fließt weiter durch einen Spalt von 5-10 Mikrometer vom Proben-Objektträger (102) zum gegenüberliegenden Objektträger(106) und durch Letzteren hindurch. Wenn die Probe ausreichend lyophilisiert ist, könnte sie tatsächlich in direkten Kontakt mit dem gegenüberliegenden Objektträger (106) gebracht werden. Die Größe der Poren im gegenüberliegenden Objektträger wird so gewählt (vorzugsweise im Bereich von 1-10 nm), dass nichtflüchtige schwerere Elemente und deren Oxide nicht in die Poren gelangen können, sondern auf der Oberfläche des gegenüberliegenden Objektträgers zur nachfolgenden Analyse bleiben. Somit kann die Analyse, wie in diesem Schriftstück beschrieben, auf dem gegenüberliegenden Objektträger durchgeführt werden. Wenn der Spalt zwischen den Objektträgern klein genug ist, wird die räumliche Verteilung der schwereren Elemente in der Probe im Wesentlichen beibehalten. Dieser Durchlauf-Ansatz ermöglicht einen schnelleren Oxidationsprozess ohne Verlust von interessierenden Analyten, selbst bei Blasenbildung. Vorzugsweise ist der gegenüberliegende Objektträger transparent im UV-Bereich, um Ozonbildung und Titandioxidreaktionen zu ermöglichen (z. B. wenn das Probensubstrat eine Titandioxidoberfläche aufweist), unterstützt durch UV-Strahlung aus einer UV-Quelle (108). Dadurch kann der Oxidationsprozess gefördert werden.
Die Reaktion könnte ebenfalls durch einen über die Oberfläche gerasterten, fokussierten Laser erleichtert werden. In einer Art von Ausführungsformen kann die Laserleistung so hoch sein, dass sie zu lokaler Erwärmung führt, die die Aufspaltung von organischen Stoffen und die Oxidationsgeschwindigkeit beschleunigt.
Es versteht sich, dass mehrere Proben-Objektträger gleichzeitig in der Oxidationskammer verarbeitet werden könnten.
Für die nachfolgende Analyse wird die Probe aus der Reaktionskammer herausgenommen und auf eine Vorrichtung übertragen, die zur schnellen parallelen Abbildung von mehreren Elementen geeignet ist, vorzugsweise mit einer Aufnahmegeschwindigkeit von >100 oder >1000 Pixeln/Sekunde (z. B. 100-1000 Pixeln/Sekunde, oder 2000 Pixeln/Sekunde). Die Geschwindigkeit kann in einigen Fällen bis zu 10⁵ Pixel/Sekunde erreichen. Die Pixelgröße für eine derartige Aufnahmegeschwindigkeit kann 10 µm oder weniger, oder 5 µm oder weniger, oder 2 µm oder weniger betragen, oder im Idealfall eine subzelluläre Auflösung von 1 µm oder weniger erreichen (z. B. 0,5-1,0 µm). Es ist zu beachten, dass die Reaktionskammer alternativ in die Bildgebungsvorrichtung integriert sein könnte, was zu bevorzugen wäre, wenn z. B. ein Mittel im Inneren von Letzterer (z. B. Ionen- oder Elektronenkanone oder Röntgenkanone des bildgebenden Analysators) zum Beschleunigen der Oxidation verwendet werden könnte.
Eine bevorzugte Bildgebungsvorrichtung in Form eines Sekundärionen-Massenspektrometer (SIMS) oder LPI (Laserplasmaionisations-) Massenspektrometer ist in 1 dargestellt. Sie umfasst einen Hochleistungs-Laser oder eine -lonenkanone (20) als Bestrahlungsmittel zur Erzeugung von Ionen aus der Probe. Unter Bezugnahme auf 2, die viele gemeinsame Merkmale mit 1 aufweist, ist eine lonenkanone (20) als Quelle von Primärionen zur Bestrahlung der Probe detaillierter dargestellt. Die lonenkanone umfasst die Ionisationskammer (22), das Linsensystem (24), das optionale Kollimatorsystem (26), die Fokussierungsoptik (28) zum Fokussieren des lonenstrahls auf einen kleinen Spot auf der Probenoberfläche sowie Rasterelektrodenplatten (30) zum Scannen des lonenspots über die Probe. Der Primärionenstrahl ionisiert die interessierenden Elementtags oder nativen schwereren Elemente und führt zu deren Abgabe von der Oberfläche. Alternativ könnte Laserablation (LA) oder Laserplasmaionisation (LPI) zur Anwendung kommen, vorzugsweise bei hohen Fluenzen >1-10 Joule/cm², um die Dissoziation von Molekülbindungen und die Freisetzung von Ionen von Elementen zu erleichtern. Durch Scannen des kontinuierlichen Primärstrahls (Ionen- oder Laserstrahl) kann die Probe schneller abgebildet werden, als dies durch mechanische Bewegung des Probenträgers möglich wäre. Typischerweise könnte eine Kombination von Rasterung mit Ablenkplatten über 0,5x0,5 oder 1×1 mm Fläche mit mechanischer Rasterung über größere Abstände, z. B. 50 × 100 oder 100 × 200 mm, kombiniert werden.
Generell wird ein kontinuierlicher Primärionenstrahl mit hoher Intensität (36) von bis zu 100 nA in einem 1 µm-Spot generiert. So ist z. B. eine geeignete lonenquelle ein Sauerstoffionenstrahl, der mit einer RF-Gasphasenionenquelle, wie in N.S. Smith, Appl. Surf. Science, 255 (2008) 1606-1609) beschrieben, generiert wird. Dadurch werden Sekundärionen (38) von der Probenoberfläche generiert, die die Elementtags bei einem mittleren Vakuumdruck von 10^-5-10^-2 mbar in der Kammer umfasst, die die Probe enthält, so dass die benötigte Probenentfeuchtungs- und Transferzeit im Vergleich zu typischen SIMS-Instrumenten verkürzt wird. Allgemein werden die von den Proben durch SIMS oder LPI erzeugten Ionen bei einem mittleren Vakuumdruck von 10^-5-10^-2 mbar in der Kammer, die die Probe enthält, hergestellt.
Die erzeugten Ionen (38) (Sekundärionen bei Bestrahlung der Proben durch Primärionen) werden durch eine kurze gasgefüllte hochfrequenz-(RF)-getriebene lonenführung oder Kollisionszelle (40) bei erhöhtem Druck (typischerweise >10^-2 mbar) beschleunigt, wobei alle Ionen mit m/z-Werten unterhalb des Massenbereichs der Tags (oder von deren Oxiden) entfernt werden. Die Emittanz des lonenstrahls wird ebenfalls vermindert, während die Ionen die Führung passieren. Die RF-Ionenführung umfasst typischerweise einen Multipol, wie z. B. einen Quadrupol (42), der sich in einem gasgefüllten Gehäuse (44) befindet. Durch diesen erhöhten Druck in der RF-Ionenführung oder -Kollisionszelle ist - anders als in US 7,910,882 B2 - die Verwendung eines optionalen Reaktivgases in der lonenführung möglich (insbesondere eines Oxidationsgases, wie z. B. NO, O₂), um im Wesentlichen den größten Teil der Metallionen zu Oxiden zu oxidieren, wie es nach dem Stand der Technik bekannt ist (siehe z. B. G. Koyanagi, D. Bohme. J. Phys. Chem. A, 105 (2001) 8964-8968, S. Tanner, V. Baranov, D. Bandura, Spectrochimica Acta B, 57 (2002) 1361-1452), und somit Interferenzen durch Überwachung der Oxide der Elemente oder Tags zu vermindern und die Anzahl der parallel zu analysierenden Kanäle zu erhöhen. Somit ist in bestimmten Ausführungsformen die lonenführung als Reaktionszelle konfiguriert. Vorzugsweise weist die RF-Ionenführung einen DC-Gradienten zur Beschleunigung und Steuerung des lonentransports auf.
Nach dem Passieren der RF-Ionenführung (40) werden die hergestellten Ionen (38) von Elementtags oder nativen Elementen mittels eines Hochgeschwindigkeits-(OA) TOF-Massenspektrometers mit orthogonaler Beschleunigung (50), wie nach dem Stand der Technik bekannt, einer Massenanalyse unterzogen, jedoch vorzugsweise im Betrieb mit einer Wiederholrate von 50-100 kHz (d. h. es liegen mehrere MS-Scans je Spot (Pixel) der ionisierten Probe vor). Vorzugsweise, wie in 1 dargestellt, verfügt dieses TOF-MS über einen gitterlosen orthogonalen Beschleuniger (52), wie in WO 01/11660 A1 beschrieben, einen einstufigen lonenspiegel (54) und einen Detektor für den hochdynamischen Bereich (56), umfassend einen Elektronenvervielfacher, z. B. wie in einem der folgenden Dokumente beschrieben: US 6,940,066 B2 , US 6,864,479 B1 , US 2013/264474 A1 oder anderen. Die hergestellten Ionen (38) werden damit nach deren m/z-Wert getrennt und wie dargestellt detektiert. Der TOF-Analysator ermöglicht die gleichzeitige Analyse eines großen Massenbereichs von Ionen. Vorzugsweise ist eine Vielzahl von Analytelementen zu analysieren (abzubilden).
Das Scannen der Probenoberfläche erfolgt durch Ablenk-(Raster-) Platten der lonenkanone oder unter Verwendung eines beweglichen Spiegels im Fall eines Lasers und/oder durch Bewegen des Probentisches (z. B. in x- und/oder y-Richtung). Eine höhere räumliche Auflösung für subzelluläre und suborganelle Auflösung könnte durch Verwendung einer dünneren Probe (z. B. eines Gewebeschnitts mit einer Dicke von 3 µm und weniger) und/oder stärkere räumliche Fokussierung auf den Primärionenstrahl und schwächeren Primärstrahlstrom zur Reduzierung der Defokussierung der Raumladung erreicht werden.
Aufgrund des vorstehend genannten hohen Primärionenstroms oder der Verwendung von leistungsfähigen Lasern könnte der Sekundärionenstrom aus den erzeugten Ionen Hunderte von Picoampere (pA) erreichen (z. B. bis zu 100, 200, 500 oder 1000 Picoampere oder mehr), wobei ein erheblicher Anteil des Stroms auf Ionen aus den Analytelementen (oder Tags) entfällt. Das bedeutet, dass ein vollständiges Pixel in nur 1 TOF MS-Puls analysiert werden könnte, wodurch die Aufnahmegeschwindigkeit in einigen Anwendungen (z. B. Analysieren von Eisen in Hirnschnitten) nahezu 10⁵ Pixel/Sekunde erreichen kann. Somit könnte ein vollständiger Objektträger innerhalb einer Minute analysiert werden, was die Kosten je Analyse erheblich reduzieren würde. Es können Bilder von 500x500 Pixeln oder mehr hergestellt werden, die für histologische Bilder geeignet sind. Das Bild kann ein 500x500 µm großes Feld der Probe sein (z. B. mit einer Pixelgröße von 1 µm). Im Vergleich zur konventionellen Fluoreszenzerfassung von getaggten Proben bietet das Verfahren nach der Erfindung eine Ausgabe, die gleichwertig ist mit bis zu zehn bis hundert Farben oder Kanälen, und dies bei einer Geschwindigkeit, die mit der einer Einzelfarbenmessung vergleichbar ist.
Aus der vorstehenden Beschreibung und 1 ist ersichtlich, dass verschiedene bevorzugte Bildgebungsanordnungen zur Darstellung der Elemente in der Probe, die die Reaktion oder Oxidation durchlaufen hat, verwendet werden können. In einer Anordnung kann die Laserplasmaionisation zur Herstellung von Ionen aus der Probe verwendet werden, die in eine nachgeschaltete Reaktionszelle eingeführt werden (wobei die Zusammensetzung und Emittanz der produzierten Ionen verändert wird, vorzugsweise in Richtung von kleineren Variationen), und im Anschluss in einen Massenanalysator, vorzugsweise einen TOF-Massenanalysator, eingeführt werden. Die Laserplasmaionisation kann über die Probe gescannt werden, um ein elementares Bild der Probe zu erhalten. In einer weiteren Anordnung kann ein SIMS-System zur Anwendung kommen, in dem ein Primärionenstrahl zur Herstellung von Sekundärionen aus der Probe verwendet werden, die in eine nachgeschaltete Reaktionszelle eingeführt werden (wobei die Zusammensetzung und Emittanz der produzierten Ionen verändert wird, vorzugsweise in Richtung von kleineren Variationen), und im Anschluss in einen Massenanalysator, vorzugsweise einen TOF-Massenanalysator eingeführt werden. Der Primärionenstrahl kann über die Probe gescannt werden, um ein elementares Bild der Probe zu erhalten.
Dieses beschriebene Verfahren kann ebenfalls eine höhere absolute Empfindlichkeit bei Ansätzen zur Detektion von Analytelementen aufgrund erhöhter lonenausbeute ergeben, die auf das Vorhandensein von oxidierten Analytelementatomen auf der oxidierten Oberfläche zurückzuführen ist, wie nach dem Stand der Technik bekannt ist. Bei einer lonisationseffizienz von 0,1-1% und verlustarmem Transport unter Vakuumbedingungen kann das SIMS- oder LPI-Verfahren einen Vorteil hinsichtlich der Größenordnung gegenüber z. B. LA/ICP-MS aufgrund von hohen Verlusten (die typischerweise zu 1×10⁴-1×10⁵-fachen Verlusten führen) beim Transport nach dem letztgenannten Verfahren bieten. Andererseits ist das vorgeschlagene Verfahren zur Aufbereitung von Proben ebenfalls mit LA/ICP-MS vollständig kompatibel, wobei es auch Kontamination und Verschleppen von Proben vermindern könnte.
Die Ergebnisse der Analyse könnten in einem analogen oder quantitativen Modus präsentiert werden (z. B. indem bestimmt wird, wie viel von einem Element oder Tag als Konzentration vorliegt, vorzugsweise unter Berücksichtigung von Matrixeffekten), oder in einem digitalen oder qualitativen Modus (z. B. indem bestimmt wird, ob ein Element oder Tag vorhanden ist oder nicht). Die Ergebnisse können durch Software zu einem Bild zusammengefasst werden, z. B. einem Elementarverteilungsbild (und somit einer Zielverteilung, insoweit das Element an ein Zielobjekt in der Probe getaggt wurde).
Als Beispiel für einen Arbeitsablauf unter Anwendung der Erfindung sind die folgenden Schritte vorgegeben:

1) Vorbereiten einer Probe, zum Beispiel einer Gewebeprobe,
2) Oxidieren der Probe mit Licht durch Photokatalyse und/oder mit chemischen Oxidationsmitteln, um annähernd die gesamte organische Matrix zu entfernen;
3) Bestrahlen der oxidierten Probenoberfläche mit einer lonenkanone mit Dauerstrom oder fokussierten Laserpulsen mit einer räumlichen Auflösung von 0,5-10 µm, mit einer Intensität, die so beschaffen ist, dass die Probe in ihre Bestandselemente zerlegt wird, die als Ionen von der Oberfläche freigesetzt werden; der Bestrahlungs-Spot wird über den Bereich der Probenoberfläche gescannt, den man analysieren möchte;
4) paralleles Erfassen von Signalen aus den Ionen der Elemente (Mehrkanal-Detektion) für jeden einzelnen Bestrahlungs-Spot mittels eines Massenspektrometers;
5) Feststellen eines Vorhandenseins oder Fehlens der räumlichen Verteilung von Elementen in der Probe, basierend auf den massenspektrometrischen Informationen.

Ein derartiger Arbeitsablauf kann nach der vorstehenden Beschreibung variiert werden, z. B. könnten Elementverteilungen ersatzweise für entsprechende Antigene bei Verwendung als Elementtags zur Anwendung kommen.
Als Alternative zum vorstehend beschriebenen Primärionenverfahren der lonisierung des bildgebenden SIMS-Analysators aus 2 könnten andere lonisationsverfahren im Vakuum, die für die massenspektrometrische Analyse zweckmäßig sind, zur Anwendung kommen: z. B. Laserplasmaionisation oder Laserablation mit Laserpostionisation. Es ist anzumerken, dass Laserstrahlung alternativ von der Rückseite des Objektträgers abgegeben werden könnte, wodurch dessen Transparenz genutzt und das optische System vereinfacht werden würde.
Als Alternativen zur Massenanalyse von der Probenoberfläche generierten Ionen könnten ebenfalls andere, z. B. zerstörungsfreie, Verfahren der Elementbildgebung zum Abbilden von Elementtags verwendet werden, zum Beispiel:

- Mikroröntgenfluoreszenz (µXRF), die die Analyse bei atmosphärischen Druckbedingungen ermöglicht, wobei vorzugsweise ein MultielementDetektor zur Anwendung kommt, um parallele Detektion zu ermöglichen
- Röntgen-Fotoelektronenspektroskopie (XPS)
- Elektronenmikrosondenanalysator (EMPA), insbesondere wenn er in ein Elektronenmikroskop integriert ist
- Sekundärelektronenspektrometrie (SES)
- energiedispersive Röntgenmikroanalyse, vorzugsweise mittels eines Siliziumdriftdetektors

Jede der Elementarbildgebungstechniken könnte mit anderen Arten der Probenabbildung (z. B. optischer Abbildung) kombiniert werden. Derartige optische Abbildung könnte als interner Standard für eine verbesserte quantitative Bestimmung der Probe dienen.
Aus der vorstehenden Beschreibung ist ersichtlich, dass die Erfindung das Bereitstellen eines Substrats oder einer Oberfläche mit einer dünnen Schicht einer (bio-)organischen Probe umfasst, die einem Oxidationsprozess unterzogen wird, der organische Matrix, z. B. C, H, N, O, S, in flüchtige Spezies umwandelt, die in die Gasphase eintreten und hauptsächlich schwerere anorganische Elemente in der Probe zurücklassen, insbesondere in oxidierter Form. Die daraus resultierende Probe wird einer Hochgeschwindigkeits-Bildgebungsanalyse der verbleibenden schwereren Elemente durch Massenspektrometrie oder andere Techniken im Vakuum unterzogen, um die räumliche Verteilung der Elemente in der Probe zu messen.
In Ausführungsformen ermöglicht die Erfindung ein Elementbildgebungs-Massenspektrometer, das subzelluläre laterale Auflösung in Verbindung mit hochgradig multiplexierter Ausgabe der Probe bei einem wesentlich höheren Durchsatz und niedrigen Kosten pro Analyse bieten kann. Die Erfindung basiert vorzugsweise auf Sekundärionen- oder Laserplasma-Massenspektrometrie im Vakuum mit Time-of-Flight-Massenanalyse (1).
Die Erfindung findet in vielen der heutigen Wachstumsmärkte Anwendung, wie z. B:

- Gewebedarstellung, wie sie z. B. in der anatomischen Pathologie, insbesondere bei Krebs, zur Anwendung kommt;
- auf Mikroarrays basierende gezielte Assays für klinisch relevante Biomarker für Krankheiten oder Biomarker-Panels und zum Einsatz in Forschung und Entwicklung in Life Sciences;
- High-Content-Zellanalyse;
- pharmazeutische und klinische Hochdurchsatzanalyse;
- Identifizierung und Resistenzbestimmung von Bakterien.

Es versteht sich, dass an den vorstehenden Ausführungsformen der Erfindung Änderungen vorgenommen werden können, die jedoch immer noch in den Geltungsbereich der Erfindung fallen. Jedes in der Spezifikation offengelegte Merkmal kann, sofern nicht anders angegeben, durch alternative Merkmale ersetzt werden, die dem gleichen, gleichwertigen oder ähnlichen Zweck dienen. Somit stellt, sofern nicht anders angegeben, jedes offengelegte Merkmal ein Beispiel einer generischen Reihe von gleichwertigen oder ähnlichen Merkmalen dar.
Die Verwendung von einem und allen hier bereitgestellten Beispielen, oder von beispielhafter Sprache („beispielsweise“, „wie z. B.“, „zum Beispiel“ und dergleichen) soll lediglich der besseren Veranschaulichung der Erfindung dienen und stellt keine Einschränkung in Bezug auf den Geltungsbereich der Erfindung dar, sofern nichts anderes beansprucht wird. Keine sprachliche Formulierung in der Spezifikation soll so ausgelegt werden, dass sie irgendein nicht beanspruchtes Element als wesentlich für die Praxis der Erfindung anzeigt.
Im Sinne ihrer Verwendung in diesem Dokument, einschließlich der Ansprüche, sind Singularformen von Begriffen in diesem Schriftstück so auszulegen, dass sie auch die Pluralform und umgekehrt umfassen, sofern der Kontext nicht etwas anderes nahelegt. Zum Beispiel, sofern der Kontext nicht etwas anderes nahelegt, bedeutet ein Singularbezug in diesem Schriftstück, einschließlich in den Ansprüchen, wie z.B. „ein“ oder „eine“, „ein/eine/eines oder mehrere“.
In der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen dieser Spezifikation bedeuten die Worte „umfassen“, „einschließlich“, „aufweisend“ und „enthalten“ und die Varianten der Worte, zum Beispiel „umfassend“ und „umfasst“ usw., „einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein“, und sollen andere Komponenten nicht ausschließen (und schließen sie nicht aus).
Alle in dieser Spezifikation beschriebenen Schritte können in jeder beliebigen Reihenfolge oder gleichzeitig ausgeführt werden, sofern nicht anders angegeben oder der Kontext nicht etwas anderes erfordert.
Alle in dieser Spezifikation offengelegten Merkmale können in jeder beliebigen Kombination kombiniert werden, mit Ausnahme von Kombinationen, bei denen mindestens einige dieser Merkmale und/oder Schritte sich gegenseitig ausschließen. Insbesondere gelten die bevorzugten Merkmale der Erfindung für alle Aspekte der Erfindung und können in jeder beliebigen Kombination verwendet werden. Ebenso können in nicht wesentlichen Kombinationen beschriebene Merkmale getrennt (nicht miteinander kombiniert) verwendet werden.

Claims

Verfahren zur Abbildung von einem oder mehreren anorganischen, nichtflüchtigen Elementen in einer organischen Probe, umfassend: Bereitstellung der Probe als Schicht auf einem Substrat; Oxidieren der Probe auf dem Substrat zur Herstellung von einem oder mehreren flüchtigen Produkten, die aus der Probe aus- und in die Gasphase eintreten, während das eine oder die mehreren anorganischen, nichtflüchtigen Elemente in der Probe verbleiben und durch die Oxidation im Durchschnitt nicht mehr räumlich gestört werden als die räumliche Auflösung der bildgebenden Analyse, wobei ein gewichtsmäßig größerer Teil der Probenschicht durch die Oxidation vom Substrat entfernt wird und die verbleibende Probenschicht mit dem einen oder den mehreren anorganischen, nichtflüchtigen Elemente angereichert wird; und anschließend Detektieren des einen oder der mehreren anorganischen, nichtflüchtigen Elemente in der angereicherten Probenschicht mittels eines bildgebenden Elementaranalysators.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Probe um eine biologische Probe handelt, die ausgewählt ist aus Gewebe, Zellen, Bakterienkultur und bioorganischer Lösung.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das eine oder die mehreren Elemente von Natur aus in der Probe vorkommende Elemente sind und/oder als Elementtags in die Probe eingebracht wurden.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das eine oder die mehreren Elementtags ein oder mehrere Seltenerdelemente, Schwermetallelemente und/oder Radioisotopen umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei das eine oder die mehreren Elementtags an einem Bindungselement angelagert sind, das aus einem Polypeptid, Polynukleotid, Antikörper, Affikörper und einem Aptamer ausgewählt wird, wobei das Bindungselement an ein Zielobjekt in der Probe bindet.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das eine oder die mehreren Elemente Metalle oder Halbmetalle sind.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Schicht eine dünne Schicht ist, insbesondere mit einer Dicke von höchstens (i) 20 µm oder (ii) 10 µm oder (iii) 5 µm.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei durch die Oxidation gewichtsmäßig mindestens 60% oder mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 99% oder mindestens 99,9% oder mindestens 99,99% der Probenschicht entfernt werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Oxidation das Einwirken von einem oder mehreren Oxidationsmitteln auf die Probe umfasst, wobei optional die Probe während des Oxidationsschrittes erwärmt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das eine oder die mehreren Oxidationsmittel ausgewählt werden aus (i) elektromagnetischer Strahlung und/oder (ii) Ionen und erregten Spezies, erzeugt durch Gasentladung, und/oder (iii) einem oder mehreren chemischen Oxidationsmitteln.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das eine oder die mehreren Oxidationsmittel: (i) elektromagnetische Strahlung darstellen und der Oxidationsschritt das Bestrahlen der Probe mit Licht mit einer Wellenlänge von weniger als 400 nm umfasst, wobei das Substrat als Fotokatalysatorwirkt, um die Probe zu oxidieren, oder (ii) ein oder mehrere chemische Oxidationsmittel sind und der Oxidationsschritt das Einwirken von einem oder mehreren chemischen Oxidationsmitteln auf die Probe umfasst, die ausgewählt werden aus: Ozon, Persulfat und Wasserstoffperoxid.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Substrat ein planarer Objektträger ist, insbesondere ein Metall, ein beschichtetes oder unbeschichtetes Glas oder eine beschichtete oder unbeschichtete flache Keramikplatte oder ein Substrat mit einer Titandioxid-Oberfläche.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Schritt der Oxidation der Probe auf dem Substrat das Hindurchführen von einem oder mehreren Oxidationsmitteln von einer gegenüberliegenden Seite des Substrats zur Probe durch Poren im Substrat umfasst, um die Probe zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei sich ein zweites Substrat in der Nähe der Probe befindet, jedoch in einem gewissen Abstand von dieser und auf diese gerichtet, wobei das eine oder die mehreren Oxidationsmittel durch die Probe hindurch diffundieren und dabei flüchtige Produkte aus der Probe erzeugen und bewirken, dass nichtflüchtige Elemente und/oder deren Oxide die Oberfläche des zweiten Substrats erreichen und dort verbleiben, um vom bildgebenden Elementaranalysator erfasst zu werden, wobei ein Spalt zwischen den Substraten so beschaffen ist, dass die räumliche Verteilung der Elemente, die zum zweiten Substrat überführt werden, durch die Oxidation im Durchschnitt nicht mehr räumlich gestört wird als die räumliche Auflösung einer durch den bildgebenden Elementaranalysator durchgeführten bildgebenden Analyse.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, das weiterhin das Generieren eines Bildes der in der Probe erfassten Elemente umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der bildgebende Elementaranalysator ausgewählt wird aus: einem Sekundärelektronenspektrometer, einem Röntgen-Photoelektronenspektrometer, einem Röntgenfluoreszenzspektrometer, einem energiedispersiven Röntgenmikroanalysator, einem lonenmobilitätsanalysator, einem Radioaktivitätsanalysator und einem Massenspektrometer.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Detektieren des einen oder der mehreren Elemente das Bestrahlen der angereicherten Probenschicht mit einem Strahl aus Primärpartikeln, wie z. B. Ionen oder Photonen umfasst, die auf einen lokalisierten Spot auf der Probenoberfläche fokussiert sind, um Sekundärpartikel von dem Spot auszusenden und die Sekundärpartikel zu analysieren, um das Vorliegen und optional die Menge des einen oder der mehreren Elemente an dem Spot zu ermitteln, wobei der Spot im Lauf der Zeit zu einer Mehrzahl von Stellen auf der Probenoberfläche bewegt wird, um dabei ein Bild von dem einen oder den mehreren Elementen in der Probe zu erhalten, wobei jede Stelle des Spots auf der Probenoberfläche einem Pixel des Bildes entspricht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei das Bild mit einer Geschwindigkeit von mindestens 100 Pixeln pro Sekunde oder mindestens 1000 Pixeln pro Sekunde oder im Bereich von 1000 - 10000 Pixel pro Sekunde erfasst wird.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Primärpartikel ausgewählt werden aus Röntgenphotonen, Elektronen und Ionen und wobei die Sekundärpartikel ausgewählt werden aus Phononen, Elektronen und Ionen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Primärpartikel eine Energie von über 1 keV aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei die Primärpartikel Ionen sind, die bei einem Druck von unter 1 mbar gebildet werden, und die Sekundärionen Ionen zur Analyse durch den Massenanalysator sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei der Primärpartikelstrahl einen Primärionenstrahl umfasst und eine Intensität von 1 bis 100 nA je 1 µm Spotdurchmesser aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei der Primärpartikelstrahl einen Photonenstrahl von einem gepulsten Laser mit einer Fluenz je Puls von mehr als a) 5 oder b) 10 oder c) 20 oder d) 50 J/cm2 umfasst und eine Extinktionslänge in der Probe von nicht mehr als a) 100 nm oder b) 200 nm oder c) 500 nm aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 23, wobei die Sekundärpartikel Ionen sind und der bildgebende Elementaranalysator einen Massenanalysator umfasst, wobei der Massenanalysator ausgewählt wird aus: einem Time-of-Flight-(TOF-)Massenanalysator, einem Distanceof-Flight-Massenanalysator, einem Quadrupol-lonenfallen-Massenanalysator, einem Massenanalysator mit elektrostatischer Falle, einem lonenzyklotronresonanz-Massenanalysator und einem Magnetsektormassenanalysator oder einem Array oder einer Kombination von diesen.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Sekundärpartikel nach der Abstrahlung von der -Oberfläche zur Analyse durch den Massenanalysator in eine RF-Ionenführung überführt und von der RF-lonenführung an den Massenanalysator übergeben werden.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die RF-Ionenführung ein Reaktivgas zur Bildung von Reaktionsprodukten mit den Sekundärpartikeln enthält, wobei die Sekundärpartikel Ionen sind, die ein oder mehrere der Elemente umfassen, wobei eine Zusammensetzung und/oder Energieverteilung der Ionen am Ausgang der RF-Ionenführung gegenüber den Ionen am Eingang der RF-Ionenführung verändert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei der Massenanalysator ein TOF-Massenanalysator ist und die Wiederholrate des TOF-Massenanalysators mindestens gleich oder größer als (a) 5 kHz oder (b) 20 kHz oder (c) 50 kHz oder (d) 100 kHz ist, wobei optional für die Analyse eines jeden Spots mit dem TOF-Massenanalysator nicht mehr als (a) 2 oder (b) 5 oder (c) 10 Pulse des TOF-Analysators benötigt werden.
Vorrichtung zur Abbildung von einem oder mehreren anorganischen, nichtflüchtigen Elementen in einer organischen Probe, umfassend: eine Reaktionskammer zur Aufnahme der Probe, wobei die Probe in Form einer Schicht auf einem Substrat bereitgestellt ist; wobei die Reaktionskammer zum Herstellen ein oder mehrerer flüchtiger Produkte eine elektromagnetische Strahlungsquelle und/oder einen Einlass zum Einbringen von einer oder mehreren chemischen oder ionischen Oxidationsmitteln in die Kammer zum Oxidieren der Probe umfasst, wobei die ein oder mehreren flüchtigen Produkte aus der Probe austreten und in die Gasphase eintreten, während das eine oder die mehreren anorganischen, nichtflüchtigen Elemente in der Probe verbleiben und durch die Oxidation im Durchschnitt räumlich nicht mehr gestört werden als die räumliche Auflösung der bildgebenden Analyse, wobei ein gewichtsmäßig größerer Teil der Probenschicht durch die Oxidation aus dem Substrat entfernt wird und die verbleibende Probenschicht eine Anreicherung bezüglich des einen oder der mehreren anorganischen, nichtflüchtigen Elemente aufweist; und einen bildgebenden Elementaranalysator in einer Detektionskammer zum Erkennen der räumlichen Verteilung des einen oder der mehreren anorganischen, nichtflüchtigen Elemente in der angereicherten Probenschicht.
Vorrichtung nach Anspruch 28, wobei der bildgebende Elementaranalysator ein Datenerfassungssystem umfasst, das Eingangsdaten aus der Detektion des einen oder der mehreren Elemente empfängt und ein Bild des einen oder der mehreren Elemente in der angereicherten Probenschicht generiert.
Vorrichtung nach Anspruch 28 oder 29, wobei die Probe eine biologische Probe ist, ausgewählt aus Gewebe, Bakterien und Zellen, und wobei das eine oder die mehreren Elemente von Natur aus in der Probe vorkommen und/oder als Elementtags in die Probe eingebracht wurden.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 30, wobei die Strahlungsquelle eine Ultraviolett- oder Röntgen-Lichtquelle umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 31, wobei eine Quelle von einem oder mehreren chemischen Oxidationsmitteln mit einem Eingang der RF-lonenführung verbunden ist, wobei das eine oder die mehreren Oxidations-mittel ausgewählt werden aus: Ozon, Persulfat und Wasserstoffperoxid.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 32, wobei der bildgebende Elementaranalysator ausgewählt wird aus: einem Sekundärelektronenspektrometer, einem Röntgen-Photoelektronenspektrometer, einem Röntgenfluoreszenzspektrometer, einem Radioaktivitätsanalysator und einem Massenspektrometer.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 33, wobei der bildgebende Elementaranalysator eine Primärpartikelquelle zum Generieren eines Primärpartikelstrahls und Fokussieren des Strahls auf einen lokalisierten Spot auf der Oberfläche der Probe umfasst, um Sekundärpartikel von dem Spot auszusenden, und einen Sekundärpartikelanalysator umfasst, um die Sekundärpartikel zu analysieren, um das Vorliegen und optional die Menge des einen oder der mehreren Elemente an dem Spot zu ermitteln, wobei die Primärpartikelquelle dazu konfiguriert ist, den Spot im Lauf der Zeit zu einer Mehrzahl von Stellen auf der Probenoberfläche zu bewegen, um dabei ein Bild von dem einen oder den mehreren Elementen in der Probe zu erhalten, wobei jede Stelle an dem Spot an der Probenoberfläche einem Pixel des Bildes entspricht.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 34, wobei der bildgebende Elementaranalysator das Bild mit einer Geschwindigkeit von mindestens 100 Pixeln pro Sekunde oder mindestens 1000 Pixeln pro Sekunde oder im Bereich von 1000-10000 Pixel pro Sekunde erfassen kann.
Vorrichtung nach Anspruch 34 oder 35, wobei die Primärpartikel ausgewählt werden aus Photonen, Elektronen und Ionen und wobei die Sekundärpartikel ausgewählt werden aus Photonen, Elektronen und Ionen und wobei die Primärpartikel eine Energie von mehr als 1 keV aufweisen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 35 bis 36, wobei der bildgebende Elementaranalysator ein bildgebendes Sekundärionen-Massenspektrometer (SIMS) ist, das dazu konfiguriert ist, dass durch Abpumpen ein Vakuum hergestellt wird, wobei die Primärpartikel Ionen sind, die in der Quelle bei einem Druck von unter 1 mbar erzeugt werden und wobei die Sekundärpartikel Ionen zur Analyse durch einen Massenanalysator des SIMS sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 35 bis 37, wobei die Primär- und Sekundärpartikel Ionen sind und der bildgebende Elementaranalysator einen Massenanalysator umfasst, wobei der Massenanalysator ausgewählt wird aus: einem Time-of-Flight-(TOF-) Massenanalysator, einem Distance-of-Flight-Massenanalysator, einem Quadrupol-lonenfallen-Massenanalysator, einem Massenanalysator mit elektrostatischer Falle, einem lonenzyklotronresonanz-Massenanalysator und einem Magnetsektormassenanalysator oder einem Array oder einer Kombination von diesen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 35 bis 38, wobei der bildgebende Elementaranalysator eine RF-Ionenführung zur Aufnahme der Sekundärionen nach deren Abstrahlung von der Oberfläche und zum Transport der Sekundärionen in den Massenanalysator umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 39, wobei die RF-lonenführung dazu konfiguriert ist, ein Reaktivgas aufzunehmen, das die RF-Ionenführung zur Herstellung von Reaktionsprodukten mit den Sekundärionen füllt, wobei die Sekundärionen Ionen sind, die ein oder mehrere der Elemente umfassen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 39 bis 40, wobei der Massenanalysator ein TOF-Massenanalysator ist und die Wiederholrate des TOF-Massenanalysators mindestens gleich oder größer ist als (a) 5 kHz oder (b) 20 kHz oder (c) 50 kHz oder (d) 100 kHz.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 41, wobei der bildgebende Elementaranalysator zur Abbildung des einen oder der mehreren anorganischen, nicht-flüchtigen Elemente in der organischen Probe geeignet ist, wobei der Elementaranalysator Folgendes umfasst: eine Kammer zur Aufnahme der organischen Probe, die das eine oder die mehreren abzubildenden anorganischen, nichtflüchtigen Elemente enthält, wobei der die Probe umgebende Kammerinnendruck im Bereich von 10^-5 bis 10^-2 mbar liegt; mindestens ein Bestrahlungsmittel, ausgewählt aus: (i) einer lonen-kanone zum Bestrahlen der Probe mit einem Primärionenstrahl von hoher Intensität, wobei die Primärionen in der lonenkanone bei einem Druck unter 1 mbar gebildet werden, wobei die lonenkanone dazu dient, den Primärionenstrahl auf einen lokalisierten Spot auf der Probenoberfläche zu fokussieren und den Spot im Lauf der Zeit zu einer Mehrzahl von Stellen auf der Probenoberfläche zu bewegen; (ii) einem Laser zum Bestrahlen eines lokalisierten Spots auf der Probenoberfläche und um den Spot im Lauf der Zeit zu einer Mehrzahl von Stellen auf der Probenoberfläche zu bewegen; eine gasgefüllte RF-Ionenführung zur Aufnahme der gebildeten Ionen, umfassend die aus der Probe als Reaktion auf die Bestrahlung durch die Primärionen oder den Laser freigesetzten Elemente, wobei die RF-lonenführung die Weiterleitung aller Ionen verhindert, deren m/z-Werte die Masse oder den Massenbereich der anorganischen, nichtflüchtigen Elemente unterschreiten; und einen Time-of-Flight-(TOF-)Massenanalysator zur Aufnahme der gebildeten Ionen oder Reaktionsprodukte der Sekundärionen aus der RF-Ionenführung, wobei der TOF-Massenanalysator für eine Wiederholrate von mindestens 5 kHz konfiguriert ist.