WO2010133196A1

WO2010133196A1 - Verfahren und vorrichtung zur durchführung einer quantitativen ortsaufgelösten lokal- und verteilungsanalyse chemischer elemente und in-situ charakterisierung der ablatierten oberflächenregionen

Info

Publication number: WO2010133196A1
Application number: PCT/DE2010/000484
Authority: WO
Inventors: Sabine Becker
Original assignee: Forschungszentrum Jülich GmbH
Priority date: 2009-05-20
Filing date: 2010-04-28
Publication date: 2010-11-25
Also published as: EP2433145A1; DE102009022219A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung, mit der sowohl eine quantitative ortsaufgelöste Nanolokal- und Verteilungsanalyse von Elementkonzentrationen einer Probe, als auch eine mikroskopische Erfassung der Oberflächentopographie im Nanometerbereich derselben Probe durchgeführt werden kann. Dazu wird die Probe auf einem Objekträger in eine Laserablationskammer eingebracht, und diese auf einem Scanningtisch eines lasergestützten Mikrodissektionssystems (LMD) angeordnet. Ein Teilbereich der Probe wird mit Hilfe eines vergrößenden Objektivs des LMD für die Untersuchung ausgewählt. Das Objektiv wird entfernt, (ohne dass die x-y Position der Probe verändert wird, der defokussierte Laserstrahl des LMD wird in der Nähe der vom Laser bestrahlten ausgewählten Oberfläche der Probe an einer Metall aufweisenden Spitze im Nahfeld verstärkt wird, wobei die Metall aufweisende Spitze in der Nähe des Spots des auf die Oberfläche der Probe fokussierten Laserstrahls durch eine nicht mit dem LMD gekoppelten Positionseinrichtung positioniert wird. Ein Teil der Probe wird ablatiert und mit Hilfe eines ICP-MS analysiert. Die Topographie der Probenoberfläche wird vor und/oder nach der Laserablation mit Hilfe derselben Metall aufweisenden Spitze als Teil des AFM erfasst.

Description

B e s c h r e i b u n g

Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung einer quantitativen ortsaufgelösten Lokal- und

Verteilungsanalyse chemischer Elemente und in-situ Charakterisierung der ablauerten Oberflächenregionen

Die Erfindung betrifft einerseits ein Verfahren zur quantitativen Lokalanalyse und Verteilungsanalyse zur Bestimmung von Elementkonzentrationen und der in-situ Charakterisierung von Probenoberflächen (Topographie) vor und nach der chemischen Analyse. Ferner betrifft die Erfindung eine zur Durchführung der vorgenannten Verfahren geeignete Vorrichtung.

Stand der Technik

Als Analysenmethode zur Messung von lateralen Elementverteilungen im μm Bereich und zur Bestimmung von Spurenelementen bis in den ng/g und sub-ng/g -Konzentrationsbereich werden derzeit in der Massenspektrometrie zur direkten Ablation des zu untersuchenden festen Probenmaterials verschiedene Verfahren, z. B. unter Verwendung von fokussierten Laserstrahlen, angewandt. Bekannt ist beispielsweise das Verfahren der Laserablation - induktiv gekoppelten Plasmamassenspektrometrie (LA-ICP-MS) in der Spuren- und Mikrolokalanaly- se. Dieses Verfahren ist nachteilig jedoch nicht in der Lage, Elementverteilungen und - konzentrationen im nanoskaligen Maßstab, insbesondere unterhalb von 1000 nm zu bestimmen, wie sie beispielsweise bei der Analyse an einzelnen Zellen oder auch Zellorganellen gefordert wird.

In zunehmendem Maße werden in der Analytik Laser, wie beispielsweise der Nd-YAG-Laser mit einer Wellenlänge im UV-Bereich (λ-266 nm oder 213 nm), eingesetzt. Diese Laser werden häufig für den Probeneintrag in nachweisstarke ICP-Massenspektrometer (LA-ICP-MS: laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry) verwendet. Zurzeit sind Nd- YAG-Lasersysteme mit einem Laserspotdurchmesser von einigen μm bis zu einigen hundert μm zur Mikrolokalanalyse kommerziell verfügbar (z. B. LSX 213, 500 CETAC Technologies, Ohama, USA oder UP 213, 266 New Wave Research, Fremont, USA). Nachteilig reicht die Leistungsdichte solcher Lasersysteme in der Regel nicht aus, um bei einem lateralen Auf- lösungsvermögen der LA-ICP-MS im unteren μm-Bereich biologische Matrizes direkt mit hoher Effizienz zu ablaueren. Der begrenzende Faktor ist dabei die Beugungsgrenze, die ein Laser regelmäßig nicht unterschreiten kann. Dies bedeutet, dass die mögliche minimale Auflösungsgrenze im Bereich einer Wellenlänge des Lasers liegt. Ortsaufgelöste Analysen unterhalb von 1 μm sind daher regelmäßig gar nicht möglich.

Für viele medizinisch-molekularbiologische Fragestellungen wird jedoch ein laterales Auflösungsvermögen des zu verwendenden Analysenverfahrens von einigen hundert nm bis in den unteren nm-Bereich gefordert. Eine solche Ortsauflösung könnte dazu führen, dass eine direkte Nanolokalanalytik an einzelnen Zellorganellen durchführbar wäre, und gleichzeitig eine ortsaufgelöste Verteilungsanalytik (1 D-Linescan, 2D- oder 3D-Imaging oder Mapping) im Nanometerbereich der interessierenden Elemente, wie beispielsweise Cu, Zn, S, Fe und P ermöglicht werden würde.

Fokussierte IR und UV Laserstrahlen werden heute schon in kommerziellen Instrumenten (mittels der bekannten lasergestützten Mikrodissektion - LMD) zum Ausschneiden eines exakt definierten Areals aus einem Gewebe eingesetzt. Die Lasermikrodissektion (LMD), die gezielt molekulargenetische Untersuchungen an minimalen Mengen eines spezifischen Gewebes erlaubt, ermöglicht auch die isolierte Untersuchung an ausgewählten Regionen lebender Einzelzellen. Derartige leistungsfähige LMD-Systeme mit einer Ortsauflösung im unteren Mikrometer- bzw. teilweise im Submikrometerbereich ( bis 0,5 μm) werden heutzutage zur Isolierung und Analyse von einzelnen Zellen oder Zellarealen, wie beispielsweise bei der Biopsie einzelner Krebszellen im Vergleich zu umliegenden gesunden Kontrollzellen, kleinen Gewebsstücken oder auch DNA Strängen für Routine und Forschungsaufgaben in der Medizin (Pathologie), aber auch in der Molekular- und Zellbiologie, eingesetzt. Vorhandene kommerzielle Systeme verfügen über exzellente Möglichkeiten der mikroskopischen Beobachtung der Probenoberflächen und ein sehr präzises Ausschneiden von Gewebestücken durch einen stark fokussierten Laserstrahl. Dabei wird im Gegensatz zu den Laserablationssystemen - hier wird die Ablation des Probenmaterials durch eine definierte Bewegung des Probentisches gesteuert - der Laserstrahl mit Hilfe einer ausgefeilten Laseroptik mit einer Präzision von ca. 0,07 μm über die Probenoberfläche definiert bewegt. Die ausgeschnittenen Gewebeproben werden anschließend, meist nach einem tryptischen Verdau (cell lysis), einer weiteren biomo- lekularen massenspektrometrischen off-line Analyse zugeführt. Eine quantitative Elementanalyse mit LMD on-line ist jedoch regelmäßig nicht möglich. Ein solches LMD-System besitzt gegenüber kommerziell verfügbaren Laserablationssystemen eine Reihe von herausragenden Vorteilen, beispielsweise eine verbesserte Ortsauflösung etwa um eine Größenordnung, eine signifikant verbesserte mikroskopische Auflösung oder auch in Verbindung mit speziellen Färbetechniken (immunostaining) und der Anwendung hochspezieller Softwarepakete die Erkennung spezieller Zellen (z. B. von Krebszellen in gefärbten Gewebeschnitten).

In [1] wird ein Verfahren beschrieben, das die Nahfeld (NF)-Laserablation zur Erzeugung neutraler Moleküle aus einer Antracen-Kristalloberfläche nutzt. Diese wurden über ein Interface (suction tube: 20 μm Stahlkapillare) in eine Elektronenstoßionenquelle eines Quadrupol- Massenspektrometers extrahiert. Die Laserablation des organischen Materials wurde mit Hilfe eines, die Frequenz verdreifachenden Nd-YAG-Lasers, mit einer Wellenlänge von 355 nm und mit 250 μJ Energie pro Puls, durchgeführt, dessen Laserstrahl in eine speziell präparierte optische Faser mit ausgezogener Spitze für die Nahfeldoptik eingekoppelt wurde. Diese Spitze hatte eine 170 nm Apertur. Die mit Hilfe der Laserablation erzeugten Krater auf der Antracen-Kristalloberfläche wiesen dabei etwa denselben Durchmesser auf.

Die Grundlagen und Prinzipien der Nahfeld-LA-ICP-MS sind bereits in DE 10354787 B4 beschrieben. Der experimentelle Aufbau zur NF-LA-ICP-MS ist aus [2] bekannt. Theoretische Überlegungen und die Grundlagen des Nahfeldeffektes bei der Laserablation wurden bereits in [3] zusammengefasst und diskutiert.

Zur Charakterisierung der Oberflächentopographie und -morphologie im Nanometerbereich werden beispielsweise in der optischen Nahfeldmikroskopie elektroakustische Sensoren eingesetzt. Ferner sind Raster-Tunnelmikroskope (STM = Scanning Tunneling Microscope) in der Lage, zerstörungsfrei und hoch auflösend die Topographie von Proben zu erfassen. Mit der Entwicklung des Atomkraftmikroskopes (AFM = Atomic Force Microscope) ist es auch möglich geworden, diese Untersuchungen auf nicht-leitfähige Proben auszuweiten. Nähere Ausführungen zum AFM und den unterschiedlichen Betriebsmodi sind aus [4] bekannt. Zur Charakterisierung von Probenoberflächen ist darüber hinaus auch das Nahfeld-Scanning- Mikroskop (SNOM = Scanning near-field optical microscope) geeignet. Diese Methode kann in Kombination mit Atomkraftmikroskopen oder dessen Varianten verwendet werden, indem beispielsweise eine optische Faser als AFM-Spitze dient. Bei dieser Art von SNOM wird eine Probe punktweise gerastert und von Laserlicht be- bzw. durchstrahlt. Das hierzu benutzte Licht wird meist mittels eines Lichtwellenleiters an die Probe herangeführt, der an seinem Ende eine opake Schicht trägt, die eine Apertur im Nanometerbereich aufweist. Ein Detektor registriert ortsabhängig das mit der Probe wechselwirkende Licht, z. B. im Transmissions-, Reflexions- oder Fluoreszenz-Modus, so dass die Aufnahme eines Rasterbildes der unmittelbar vor der Apertur angeordneten Probe ohne Begrenzung der Auflösung durch Beugung möglich ist.

Aufgabe und Lösung

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches einerseits eine hochaufgelöste mikroskopische Betrachtung der zu untersuchenden Probe erlaubt, ferner eine qualitative Lokal- und Verteilungsanalyse im Nanometerbereich und eine quantitative

Bestimmung von Elementkonzentrationen in verschiedenen Probenmaterialien ermöglicht, und zudem eine topographische Charakterisierung der untersuchten Probenoberfläche vor und nach der Analyse ermöglicht.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete

Vorrichtung zu schaffen.

Die Aufgaben der Erfindung werden gelöst durch ein Verfahren mit der Gesamtheit an Merkmalen gemäß Hauptanspruch sowie durch eine Vorrichtung mit der Gesamtheit an Merkmalen gemäß Nebenanspruch. Vorteilhafte Ausführungen des Verfahrens und der Vorrichtung finden sich in den jeweils darauf rückbezogenen Ansprüchen.

Gegenstand der Erfindung

Ziel der erfindungsgemäßen neuen experimentellen Anordnung und des Verfahrens zur ortsaufgelösten Lokal- und Verteilungsanalyse chemischer Elemente und der in-situ Charakterisierung von Oberflächen ist es, die Vorteile der Nahfeld-LA-ICP-MS zur Nanolokal- und Verteilungsanalyse chemischer Elemente, gekoppelt mit einer mikroskopischen Anordnung, basierend auf dem Prinzip der Rasterkraftmikroskopie (AFM — atomic force microscopy), mit einem lasergestützten Mikodissektionssystem (LMD) zu kombinieren, um beispielsweise die zu untersuchende Probenoberfläche auf einfache Weise vor und nach der Laserablation des Probenmaterials mit NF-LA-ICP-MS mit einer hohen lateralen Auflösung mikroskopisch darzustellen und zu charakterisieren.

Das prinzipielle Meßverfahren für die Nahfeld-LA-ICP-MS zur Nanolokal- und Verteilungsanalyse chemischer Elemente, gekoppelt mit einer mikroskopischen Anordnung, basierend auf dem Prinizip der Rasterkraftmikroskopie (AFM - atomic force microscopy), ist bereits aus [4] bekannt. Darin wird offenbart, die zu untersuchende Probe auf einem Probentisch in der Laserablationskammer anzuordnen, die mit einer in xyz-Richtung verstellbaren präzisen Positionseinrichtung verbunden ist. Die Positionseinrichtung für die dünne Ag-Spitze mit Halterung befindet sich außerhalb der Laserablationskammer, die auf einem vibrationsgedämpften Tisch montiert ist. In diese Laserablationskammer reicht die metallische Spitze für die Nahfeldverstärkung zu Laserablation, die Spitze ist gleichzeitig Teil eines AFM ist. Die metallische Spitze und das AFM sind mit einer Positioniereinrichtung verbunden, die ebenfalls auf dem vibrationsgedämpften Tisch angeordnet ist.

Es ist auch bekannt, dass Geräte zur Lasermikrodissektion (LMD) von biologischen Gewebenproben (meist dünne Gewebeschnitte) bereits über eine sehr entwickelte und hochaufgelöste Optik in Kombination mit der Möglichkeit des Ausschneidens von zuvor beobachteten und definiert ausgewählten Teilbereichen einer Probe, mittels eines fokussierten Laserstrahls, der definiert über einen Spiegel über die Probenoberfläche geführt wird, verfügen. Zum Ausschneiden wird dazu der fokussierte Laserstrahl über Spiegel abgelenkt und so entsprechend positioniert über die Probe geführt.

Im Rahmen dieser Erfindung wurde nun herausgefunden, dass die bislang in den üblichen lasergestützten Mikrodissektionssystemen verwendeten, hochpräzisen und schwingungsgedämpften Scanningtische vorteilhaft derart modifiziert werden können, dass dadurch nunmehr direkt vor Ort auch eine Laserablation, zusammen mit einer quantitativen Bestimmung der Elementverteilungen im ausgewählten Probenbereich, durchgeführt werden kann. Die Erfindung verbindet vorteilhaft das genaue Meßverfahren für. die Nahfeld-L A-ICP-MS zur Nanolokal- und Verteilungsanalyse chemischer Elemente im sub μm-Bereich, gekoppelt mit einer mikroskopischen Anordnung, basierend auf dem Prinizip der Rasterkraftmikroskopie (AFM - atomic force microscopy), mit der bei einem lasergestützten Mikrodissektions- system vorhandenen hochauflösenden Optik und einem präzise positionierbaren Scanning- tisch, und ermöglicht somit auf einfache Weise, diese Untersuchungen zur quantitativen ortsaufgelösten Lokal- und Verteilungsanalyse chemischer Elemente und in-situ Charakterisierung der ablauerten Oberflächenregionen im Nanometerbereich durchführen zu können.

Da sich die Erfindung sowohl in einem Verfahren, als auch in der dazu geeigneten Vorrichtung manifestiert, wird die Erfindung nachfolgend in einer Kombination aus verfahrenstechnischen und physikalischen Eigenschaften beschrieben.

Bei der Erfindung umfasst die Laserablationskammer einen Objekträger zur Aufnahme wenigstens einer Probe, ein für Laserlicht durchlässiges Deckglas, sowie eine Zu- und Abführung für ein Transportgas. Die Laserablationskammer selbst ist während der Untersuchung auf dem Scanningtisch eines lasergestützten Mikrodissektionssystems (LMD) angeordnet, und bauartbedingt entsprechend ausgestaltet. Diese Anordnung weist den Vorteil auf, dass die hochauflösende Vergrößerung eines vorhandenen LMD (Vergrößerung des Objektivs: beispielsweise ca. 150) eingesetzt werden kann, um die Probe exakt für die Untersuchung zu positionieren. Ebenfalls vorteilhaft ist, dass der Scanningtisch eines solchen LMD regelmäßig eine sehr gute Präzision bezüglich der Positionierung aufweist, beispielsweise in x und y- Richtung ca. lμm und in z- Richtung ca. 0,05 μm). Ferner ist der in einem solchen Gerät vorhandene Laser geeignet, die zur Untersuchung notwendige Laserablation unter Verwendung der Nadel im Nahfeldbereich durchzufuhren.

Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren, bei dem ein laserinduziertes Nanoplasma zur stöchiometrischen Laserablation des untersuchten Materials eingesetzt wird. Dabei können neben beliebigen Festkörperproben auch vorteilhaft biologische Materialien untersucht werden. Unter biologischen Materialien sind dabei insbesondere Materialien in Zellorganellen (z. B. Mitochondrien), biologische Gewebeschnitte oder biologische Nanostrukturen zu verste- hen. Die Laserablationskammer ist vorteilhaft mit einem hochempfindlichen ICP-MS oder auch weniger empfindlichen ICP-OES (OES- optical emission spectrometry) gekoppelt. Der Beschuss der Probenoberfläche erfolgt mit Photonen eines Lasers, wobei durch die Anwendung des Nahfeldeffektes eine Ortsauflösung (Laserspotdurchmesser) auf der Oberfläche der Probe von weniger als 1 μm, insbesondere unterhalb von 0,5 μm, und vorteilhaft sogar unterhalb von 0,1 μm, realisierbar ist. Besonders vorteilhaft wird eine Ortsauflösung sogar bis in den Bereich von 20 bis 30 nm erreicht.

Zusätzlich können aber mit diesem laserinduzierten Analysenverfahren ebenso Bulkanalysen, das bedeutet Multielementanalysen am Probenmaterial mit einem Laserspotdurchmesser im unteren μm bis zu 300 μm Bereich und Verteilungsanalysen (Imaging) der Isotope und Elemente, durchgeführt werden. Weitere Details dieser Messung für die ortsaufgelöste Lokal- und Verteilungsanalyse chemischer Elemente sind aus [5, 6] bekannt, deren Inhalt explizit in dieser Anmeldung als mit offenbart angesehen wird.

Zusätzlich zu dieser Messung für die ortsaufgelöste Lokal- und Verteilungsanalyse chemischer Elemente weist das erfindungsgemäße Verfahren die Schritte auf, dass die untersuchte Probenoberfläche vor und/oder auch nach der erfolgten Ablation dargestellt und charakterisiert werden kann. Dazu erfolgt vor und/oder auch nach einer Ablation von Probenmaterial vorteilhaft eine Messung der Probenoberfläche im Nanometerbereich mit einer mikroskopischen Anordnung, basierend auf dem Prinzip der Rasterkraftmikroskopie (AFM - atomic force microscopy). Dazu muss die Probe aber weder verändert oder transportiert werden, sondern kann vorteilhaft in ihrer Position auf dem Probentisch verbleiben.

Durch definiertes Scannen der Nadel über die Probenoberfläche als Funktion der x,y,z- Koordinaten und durch Messung der Änderung der Frequenz im Schwingquarz kann die Oberflächentopographie der Probe vorteilhaft an gerade der Stelle abgebildet werden, an der die Ablation erfolgen soll, bzw. schon erfolgt ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird realisiert in einer zur Durchführung des vorgenannten Verfahrens geeigneten Vorrichtung. Die erfindungsgemäße Vorrichtung in Form einer Laserablationskammer wird dabei kombiniert mit einem vorhandenen LMD-Gerät sowie einer Po- sitioniereinrichtung für eine metallische Spitze, die gleichzeitig Teil eines AFM ist.

Die erfindungsgemäße Laserablationskammer umfasst dabei eine Zu- und einer Abfuhrung für ein Transportgas, welches die ablatierte Probe in ein nachgeschaltetes Massenspektrome- ter zu überfuhren vermag. Ferner weist sie einen Objektträger zur Aufnahme wenigstens einer Probe und eine für Laserlicht durchlässiges Deckglas auf. Die Außenmaße der Laserablationskammer sind für den Einsatz auf dem Scanningtisch eines Lasermikrodissektions-Gerätes optimiert. Dazu gehören einerseits die Außenmaße der Laserablationskammer, die sich an dem freien Bauraum zwischen dem Objekttisch und der Optik des LMD ausrichten, als auch die Anordnung und Ausrichtung der Zu- und Abfuhrungsleitung für das Transportgas.

Zur Anwendung der Nahfeldtechnik weist die erfindungsgemäße Laserablationskammer eine Metall aufweisende Spitze auf, die in die Nähe des auf die Oberfläche der Probe strahlenden Lasers angeordnet werden kann. Dazu ist beispielsweise eine ultrafeine ganzmetallische Spitze geeignet. Diese besteht vorteilhaft aus Gold oder Silber. Die Spitze bewirkt vorteilhaft eine Verstärkung des elektrischen Feldes des Laserlichtes. Die metallische Spitze ist gleichzeitig Teil eines modifizierten Rasterkraftmikroskops, welches mit einem elektroakustischen Wandler für die Nahfeldmikroskopie ausgestattet ist. Es sind verschiedene Ausführungen von akustischen Wandlern bekannt, die jeweils Einfluss nehmen auf die Steifigkeit des Sensors, seine Resonanzfrequenz sowie auf die Ausrichtung seiner Schwingungsmoden, z. B. lateral oder vertikal. Weitere Ausgestaltungen sind dazu auch [4] zu entnehmen.

Die metallische Spitze des Rasterkraftmikroskops (AFM) mit gleichzeitiger Funktion der Nahfeldverstärkung für die Laserablation ist auf einer eigenen Vorrichtung zur Positionierung der Spitze in der Nähe der Probe angeordnet. Diese Positionierungsvorrichtung lässt sich vorteilhaft in allen drei Raumrichtungen verschieben. Die Schrittweitenauflösung sollte insbesondere bei wenigstens 1 μm liegen. Insbesondere erlaubt die Positioniervorrichtung eine Grobpositionierung der Spitze in der Nähe der zu untersuchenden Probe (mm bis in den μm - Bereich), sowie eine Feinjustierung der Spitze während der Untersuchungen, wenn die Kraft zwischen Spitze und Probenoberfläche bei einem Abstand im nm-Bereich gemessen werden kann. Die Spitze reicht dazu über eine Dichtung in die auf dem Scanningtisch des LMD positionierten Laserablationskammer hinein.

Während die Positioniervorrichtung für die Spitze vorteilhaft auf einem externen, vibrationsgedämpften Tisch angeordnet ist, ist die Laserablationskammer während der Untersuchung auf dem Scanningtisch des LMD angeordnet. Der Scanningtisch sollte insbesondere eine Auflösung in den drei Raumrichtungen von ca. 1 μm für die x und y- Richtung, und ca. 0,05 μm für die z- Richtung aufweisen. Vorteilhaft ist das LMD selbst ebenfalls auf einem vibrationsgedämpften Tisch angeordnet.

Erfindungsgemäß wird die Anordnung zur Nahfeld-Laserablation mit einem speziellen hochauflösenden Mikroskop (Rasterkraftmikroskop - AFM) mit elektroakustischem Wandler um ein lasergestütztes Mikrodissektionssystem (LMD) erweitert und mit diesem vorteilhaft gekoppelt. Dies ermöglicht, dass vor der analytischen Untersuchung mit Hilfe der hochauflösenden Optik des LMD die Probe auf einfache Weise beobachtet und der zu untersuchende Teil präzise ausgewählt werden kann. Dazu wird der Scanningtisch mit der darauf angeordneten Laserablationskammer und der darin angeordneten Probe entsprechend positioniert.

Gleichzeitig kann die unabhängig davon positionierbare metallische Spitze für den Nahfeldeffekt ebenfalls mit Hilfe der Optik des LMD grob auf die Probe ausgerichtet werden.

Nach dem Entfernen des Objektivs des LMD und der Feinjustierung der metallischen Spitze in der Nähe des auf die Probenoberfläche treffenden Laserstrahls erfolgt die Laserablation des ausgewählten Probenbereichs mit Hilfe des nunmehr defokussiert vorliegenden Laserstrahls und unter Anwendung des Nahfeldeffektes im Nanometerbereich. Der Einsatz von den Laserstrahl umlenkenden Spiegeln, wie beim bislang bekannten Ablatieren mit Hilfe eines LMD, ist bei der Erfindung ausdrücklich nicht vorgesehen. Bekannte Laser aus lasergestützten Mikrodissektionssystemen sind Festkörperlaser oder auch durchstimmbare Farbstofflaser. Die Wellenlängen geeigneter Feststofflaser betragen beispielsweise 349 - 532 nm. Bei einem durchstimmbaren Laser kann vorteilhaft der Wellenlängenbereich dem Material der Spitze angepasst werden. Die Wiederholraten liegen zwischen 10 und 5000 Hz. Die Leistungsdichte des nicht fokussierten Lasers sollte vorteilhaft 10⁵ bis 10⁶ W/cm² betragen. Durch Anwen- düng des Nahfeldeffektes erhöht sich die Laserleistungsdichte dann auf 10⁹ bis 10¹⁰ W/cm², und ist somit für eine stöchiometrische Ablation ausreichend.

Während mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (AFM) allein lediglich die Topographie einer Probenoberfläche räumlich aufgelöst dargestellt werden kann, können mit der Nahfeld- Laserablations-ICP-Massenspektrometrie (NF-LA-ICP-MS) essentielle und toxische Metalle (z. B. Cu, Zn, Fe, Mn, Ni, Ca, K, Mg, Ti, Co, Pb, U. Cd, Hg u. a. ) oder auch Nichtmetalle (C, S, P, Cl u. a.) detektiert und quantifiziert werden. Ferner können mittels NF-LA-ICP-MS zu analysierenden Bereiche im nm-Bereich (z. B. Membranproteine in Einzelzellen) gezielt ausgewählt und auf Phosphor- oder Metallbindungen (Phosphoproteine bzw. Metalloproteine) definiert untersucht werden.

Zu Vergleichszwecken ist es dabei üblich, neben der zu untersuchenden Probe auch eine oder mehrere Standardproben mit auf den Objektträger in der Laserablationskammer anzuordnen und ebenfalls unter identischen Bedingungen zu ablaueren und zu analysieren. Die Quantifizierung der Analysenresultate der erfindungsgemäßen NF-LA-ICP-MS kann daher vorteilhaft über bekannte Quantifizierungsstrategien, beispielsweise unter Verwendung von zertifizierten Standardreferenzmaterialien, Matrix-angepasster Laborstandards oder mit Hilfe der Isotopen- verdünnungsanalyse erfolgen.

Die Vorteile der bekannten Kombination der NF-LA-ICP-MS mit AFM im Zusammenspiel mit einem LMD sind die besonders einfache Nutzung der hochpräzisen Optik des LMD zur Untersuchung und Auswahl des zu untersuchenden Probenbereichs und des vorhandenen Lasers aus dem LMD zur Durchführung einer quantitativen ortsaufgelösten Lokal- und Verteilungs-analyse chemischer Elemente und der zerstörungsfreien Analyse der Probenoberfläche in-situ vor und nach der zerstörenden Laserablation. Damit lassen sich insbesondere auch neue Erkenntnisse zum Laserablationsprozess im Nahfeldbereich erzielen.

Spezieller Beschreibungsteil

Nachfolgend wird der Gegenstand der Erfindung anhand von zwei Figuren näher erläutert, ohne dass der Gegenstand der Erfindung dadurch eingeschränkt werden soll. Dabei zeigt: Figur 1 : Detaillierte Anordnung der Laserablationskammer mit Nahfeldverstärkung durch eine verstellbare metallische Spitze, die über einen elektroakustischen Wandler aus Quarzglas an ein AFM gekoppelt ist: in Aufsicht (a) und Vorderansicht (b) aus [4].

Figur 2: Detaillierte Anordnung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Laserablationskammer mit Nahfeldverstärkung durch eine verstellbare metallische Spitze, die über einen elektroakustischen Wandler aus Quarzglas an ein AFM gekoppelt ist: in Aufsicht (a) und Vorderansicht (b).

Dabei bedeuten in den Figuren:

1 Laserablationskammer

2 dünne metallische Spitze aus Silber oder Gold zur Erzielung der Nahfeldverstärkung

3 Elektroakustischer Wandler (Quarzglas)

4 Positioniervorrichtung der Spitze und Vorrichtung zur Signalaufbereitung

5 x-y-z-Positioniereinrichtung für die Grob- und Fein-Positionierung der Nadel, die Abstandsmessung von Nadel zu Probenoberfläche und für den AFM Modus.

6 vibrationsgedämpfter, von der Positioniereinrichtung 4 unabhängig einstellbarer Scan- ningtisch der Lasermikrodissektion (LMD) Apparatur

7 Probentisch zur Aufnahme der zu analysierenden Probe in der Laserablationskammer 7b Probentisch zur Aufnahme der zu analysierenden Probe als Teil der Laserablationskammer, z. B. Objektträger

8 fester, defokussierter Laserstrahl für Nahfeld-Laserablation

9 Deckglas der Laserablationskammer

10 Trägergasstrom

11 Trägergasstrom mit ggf. ablatiertem Probenmaterial zur Einleitung ins ICP-MS

12 lasergestütztes Mikrodissektionssystem (LMD)

13 Laser

14 hochauflösendes Objektiv (während der NA-LA-ICP-MS entfernt)

15 Labortisch bzw. schwingungsgedämpfte Unterlage Die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer Ablationskammer ist für die direkte Analyse von Gewebeschnitten oder einzelnen Zellen mittels NF-LA-ICP-MS in Kombination mit einer speziellen Rastersondenkraftmikroskopie (AFM) im Nahfeldbereich (Nahfeldmikroskopie) geeignet. Dabei wird die dünne Spitze, insbesondere eine Ag-Draht- Spitze, mit einem elekt- roakustischen Wandler (atomic force sensor) gekoppelt (siehe Figur 1). Man ist damit in der Wahl der Steifigkeit des Sensors, seiner Resonanzfrequenz sowie der Ausrichtung seiner Schwingungsmoden (lateral und vertikal) frei und kann sich den Anforderungen der NF-LA- ICP-MS anpassen. Die Positionierung der Spitze in x-y Richtung für die Laserablation im Nahfeld und die AFM Messungen und die Signalaufbereitung der AFM Daten erfolgt über eine speziell entwickelte Steuerelektronik.

Das erfindungsgemäße Analysensystem ist insbesondere gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

• Die Ablationskammer ist geeignet für den Einsatz in einem lasergestütztes Mikrodissekti- onssystem (LMD), mit einem Eintrittsfenster für Laserstrahlung und einem Objektträger zur Aufnahme von Probe und Standards, zusätzlich umfassend eine Metall aufweisende Spitze für den Nahfeldeffekt.

• Die dünne Spitze ist an einen elektroakustischen Wandler (Quarzglas) montiert, der mit einer Steuerelektronik zur Positionierung der Spitze in x-y-Richtung für die Laserablation und Mikroskopie der Probenoberfläche im Nahfeld und zur Signalaufbereitung verbunden ist.

• Die Positionierungseinrichtung und die Steuerelektronik zur Positionierung der Spitze sind unabhängig von der in dem LMD angeordneten Laserablationskammer. Dazu reicht die Spitze über eine Dichtung der Laserablationskammer in diese hinein.

• Als Laser werden verwendet geeigneter Festkörperlaser oder durchstimmbarer Farbstofflaser mit einer Pulsbreite < 5 ns, Wellenlänge (z. B. für Ag-Spitzen von 532 nm), Wiederholraten von bis zu 5000 Hz und gausförmigem transversalen Strahlenprofil. Die minimal benötigte Laserleistungsdichte des defokussierten Laserstrahls beträgt 10⁵ - 10⁶ W/cm². Durch Anwendung des Nahfeldeffektes erhöht sich die Laserleistungsdichte regelmäßig auf l0⁹ - 10¹⁰ W/cm².

• Die Probenbeobachtung und Auswahl wird mit Hilfe eines hochauflösenden Zoommikroskops (LMD) ermöglicht. • Die 3-dimensionale hochpräsise Probenpositionierung erfolgt durch den Scanningtisch des LMD mit einer Auflösung von < 1 μm.

• Der Einsatz eines zusätzlichen, stark vergrößernden optischen Mikroskops (< 50Ox) außerhalb der Strahlachse zur Feinpositionierung der Nanospitze ist möglich.

• Die Feinjustierung der Spitze kann während der Messung mit dem AFM vorgenommen werden.

Alle Eintrittsfenster der Laserablationskammer sind abgedichtet.

Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung ist die quantitative intra- und extrazelluläre Elementverteilung in gesunden und pathologischen Zellen und Geweben mit gleichzeitiger rasterson- denmikroskopischen Untersuchung im Nahfeldbereich der Probenoberfläche vor und nach der Laserablation.

Die erfindungsgemäße Analysenmethode eignet sich vorteilhaft insbesondere für folgende Anwendungsbeispiele:

^■ Nanolokal- und ortsaufgelöste Verteilungsanalyse an Gewebeschnitten (z. B. von Hirnproben zum Studium neurodegenerativer Erkrankungen) und Zellorganellen (z. B. Mito- chondrien) mittels NF-LA-ICP-MS.

^■ Nanolokal- oder Verteilungsanalyse an Festkörperoberflächen (z. B. S-Layer, Nano- cluster, Nanodrähte, Mikro- und Nanoarrays) an Interfaces oder an dünnen Schichten (Mikro- und Nanoelektronik, Materialforschung).

^■ Nanolokal- oder Verteilungsanalyse an biologischen Proben (z. B. an sehr kleinen Ausschnitten pflanzlichen und tierischen Gewebes), medizinischen Proben (Zähnen, Knochen, Haare u. ä.) oder auch an geologischen Proben (Einschlüsse, Inhomogenitäten).

In der Anmeldung zitierte Literatur:

[1] R. Stöckle et al., "Nanoscale Atmospheric Pressure Laser Ablation Mass Spectrometry",

Anal. Chem. 73, 2001, 1399-1402. [2] M. V. Zoriy, M. Kayser, J. S. Becker, „Possibility of nano-local element analysis by near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS): New experimental arrangement and first application", International Journal of Mass

Spectrometry 273 (2008) 151-155. [3] J. S. Becker, A. Gorbunoff, M. Zoriy, A. Izmer, M. Kayser, "Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometer scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples", J.

Anal. At. Spectrom., 2006, 21, 19 - 25. [4] DE 102 008 049 833 [5] DE 103 54 787 Al [6] DE 102009016512

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e

1. Verfahren zur Analyse von Elementkonzentrationen und zur topographischen Charakterisierung einer Probe mit Hilfe der Laserablation - induktiv gekoppelten Plas- mamassenspektrometrie (LA-ICP-MS) und der Rasterkraftmikroskopie (AFM), mit den Schritten a. eine Probe wird auf einem Objekträger in eine Laserablationskammer eingebracht, b. die Laserablationskammer wird auf einem Scanningtisch eines lasergestützten Mikrodissektionssystems (LMD) angeordnet, c. ein Teilbereich der Probe wird mit Hilfe eines vergrößernden Objektivs des LMD für die Untersuchung ausgewählt, d. das Objektiv wird entfernt, (ohne dass die x-y Position der Probe verändert wird) e. der defokussierte Laserstrahl des LMD wird in der Nähe der vom Laser bestrahlten ausgewählten Oberfläche der Probe an einer Metall aufweisenden Spitze im Nahfeld verstärkt wird, wobei die Metall aufweisende Spitze in der Nähe des Spots des auf die Oberfläche der Probe fokussierten Laserstrahls durch eine nicht mit dem LMD gekoppelten Positionseinrichtung positioniert wird. f. ein Teil der Probe wird ablauert und mit Hilfe eines ICP-MS analysiert, g. die Topographie der Probenoberfläche wird vor und/oder nach der Laserablation mit Hilfe derselben Metall aufweisenden Spitze als Teil des AFM erfasst.

2. Verfahren nach vorhergehendem Anspruch 1, bei dem der Laserstrahl auf einen Spotdurchmesser von weniger als 10 μm, insbesondere von weniger als 1 μm, und vorteilhaft von weniger als 100 nm, fokussiert wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, bei dem eine Metall aufweisende Spitze aus Silber oder Gold eingesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Topographie der Probenoberfläche im zerstörungsfreien Nicht-Kontaktmodus erfasst wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Metall aufweisende Spitze an einen elektroakustischen Wandler montiert ist, und über eine Positionierungsvorrichtung oberhalb der Probe mit einer Verschiebeauflösung von weniger als 1 μm in allen drei Raumrichtungen positioniert werden kann.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Signalaufbereitung des AFM über die Metall aufweisende Spitze erfolgt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem mit einer Steuerelektronik sowohl die Positionierung der Spitze in x-y Richtung für die Laserablation im Nahfeld, als auch für die mikroskopische Untersuchung der Probenoberfläche im Nahfeld, erfolgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem neben der Probe auch wenigstens ein Standard untersucht wird.

9. Vorrichtung zur Analyse von Elementkonzentrationen und zur topographischen Charakterisierung einer Probe umfassend a. eine Laserablationskammer mit einem Objektträger zur Aufnahme wenigstens einer Probe, mit einem für Laserlicht durchlässigen Deckglases sowie mit einer Zu- und Abführung für ein Transportgas, b. ein Rastersondenmikroskop mit einer Metall aufweisenden Spitze, c. eine Positionierungsvorrichtung zur Positionierung dieser Metall aufweisenden Spitze, wobei diese Spitze in der Laserablationskammer angeordnet ist und derart mit der Positioniereinrichtung verbunden ist, dass sie während des analytischen Betriebs der Vorrichtung zur Nahfeldverstärkung des Laserstrahls in der Nähe des Spots des auf die Oberfläche der Probe fokussierten Laserstrahls positioniert werden kann, und während des mikroskopischen Betriebs in x-y-z Richtung über die Oberfläche der Probe bewegt werden kann, dadurch gekennzeichnet, d. dass die Laserablationskammer für den Einsatz auf dem Scanningtisch eines lasergestützten Mikodissektionssystems (LMD) geeignet ist, wobei die mit der Laserablationskammer verbundene Positioniereinrichtung für die Metall aufweisende Spitze benachbart zum LMD angeordnet ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, mit einer Gold- oder Silberspitze als Metall aufweisende Spitze.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 10, bei dem das AFM einen elektroakustischen Wandler aufweist.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 1 1, bei der die Positionierungseinrichtung für die Spitze mit der Signalaufbereitung des AFM verbunden ist.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, bei der die Positionierungsvorrichtung für die Spitze auf einer 3-dimensionealen Verschiebeeinheit angeordnet ist, die eine Verschiebeauflösung von wenigstens 2 μm aufweist.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, bei der die 3-dimensionale Positionierung der Laserablationskammer durch den Scanningtisch des LMD eine Genauigkeit in den drei Raumrichtungen von ca. 1 μm für die x und y- Richtung, und ca. 0,05 μm für die z- Richtung aufweist.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 14, bei der der Laser im Nahfeld der Spitze eine Leistungsdichte von wenigstens 10⁹ W/cm² aufweist.