WO2015121313A1 - Bereitstellen von probeninformationen mit einem lasermikrodissektionssystem - Google Patents

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WO2015121313A1
WO2015121313A1 PCT/EP2015/052892 EP2015052892W WO2015121313A1 WO 2015121313 A1 WO2015121313 A1 WO 2015121313A1 EP 2015052892 W EP2015052892 W EP 2015052892W WO 2015121313 A1 WO2015121313 A1 WO 2015121313A1
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WO
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sample
laser
information
slide
microscope
Prior art date
Application number
PCT/EP2015/052892
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English (en)
French (fr)
Inventor
Falk Schlaudraff
Christian Woditschka
Original Assignee
Leica Microsystems Cms Gmbh
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Publication date
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
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    • G01N2001/2886—Laser cutting, e.g. tissue catapult
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/34—Microscope slides, e.g. mounting specimens on microscope slides

Definitions

  • the present invention relates to a method for providing sample information and to a corresponding laser microdissection system according to the preambles of the independent patent claims.
  • cells, tissue regions, etc. can be isolated from a tissue matrix and obtained as so-called dissectates.
  • a particular advantage of laser microdissection is the short contact of the tissue with the laser beam, through which the tissue is hardly changed.
  • dissectates can take place in different ways (see, for example, Bancroft, JD and Gamble, M .: Theory and Practice of Histological Techniques, Elsevier Science, 2008, page 575, chapter "Laser Microdissection")
  • a dissectate which falls under the influence of gravity into a suitable dissektate collecting vessel can be isolated, and the dissectate can also be cut out of the sample together with an adhering membrane.
  • a reaction vessel can be connected, heated by means of a corresponding laser beam.
  • the membrane merges with the desired area of the object and can be removed in a subsequent step.
  • Another alternative is to attach the dissectate by means of the laser beam to a lid of a Dissektytauffang examples. Inverse microscope systems for laser microdissection are also known.
  • Known microscope systems for laser microdissection have an incident light device in whose beam path a laser beam is coupled.
  • the laser beam is focused by the particular microscope objective used on the sample, which rests on a motor-automatically movable microscope stage.
  • a cut line is created by moving the microscope stage during cutting to move the sample relative to the stationary laser beam.
  • this has the disadvantage, inter alia, that the sample can not be viewed well during the production of the cutting line, since it moves in the field of view.
  • laser microdissection systems that have laser scanning devices that are set up to correspondingly displace the laser beam or its impact point on the then stationary sample are more advantageous.
  • Such laser microdissection systems which also offer particular advantages in the context of the present invention, are explained in detail below.
  • a particularly advantageous laser microdissection system which has a laser scanning device with wedge prisms is described in EP 1 276 586 B1.
  • pulsed lasers are generally used, with each laser pulse producing a hole in the sample, for example.
  • a cutting line is created by a juxtaposition of such holes, possibly with overlap.
  • sample information relating to a microscopic sample on a slide is applied to the slide.
  • the present invention proposes a method for providing sample information and a corresponding laser microdissection system having the features of the independent patent claims.
  • Preferred embodiments are the subject of the dependent claims and the following description.
  • the present invention is based on a laser microdissection system which is set up to separate a dissected object from a sample to be dissected, for example a thin section on a microscope slide, by means of a focused laser beam.
  • a corresponding laser beam is focused onto the sample by means of a microscope objective and the sample is thereby moved relative to the laser beam or vice versa.
  • the dissektate (s) obtained are collected in a dissected collecting vessel.
  • the laser microdissection system used in the context of the invention has to be dissected with used for samples that have already been prepared for microscopy. These may be, for example, thin sections which are separated out of a larger tissue block by means of a microtome. Such a tissue block may be, for example, a fixed organ or a biopsy of a corresponding organ.
  • the present invention therefore does not serve to obtain samples to be dissected, but rather to process them and to isolate certain areas thereof. It is understood that the invention may also be used with other samples to be dissected, which are not obtained by means of a microtome, for example with smears, macerates, etc.
  • Microtomes are used exclusively in the preparation of microscopic samples. Microtomes can also have lasers for this purpose. The sections obtained by means of a microtome are applied to a microscope slide as mentioned above, possibly attached there, stained, etc. Only then are they available for use in the method according to the invention or a corresponding laser microdissection system.
  • a microtome differs fundamentally in its operation from a laser microdissection system in that it produces cuts with as homogeneous a cutting thickness as possible. Microtomes are therefore designed to produce a large number of identical cuts with parallel cut surfaces, whereas laser microdissection systems are arranged to separate dissects according to sample-dependent criteria, for example according to visual criteria.
  • microtomes do not include microscopes in whose observation beam path a laser beam is coupled.
  • the laser beam is therefore never focused in a microtome through a microscope objective, which is also used for viewing, on a processed sample, such as a tissue block.
  • the present invention proposes a method of providing sample information relating to a microscopic sample using a corresponding laser microdissection system.
  • the laser microdissection system comprises a microscope with at least one objective, a laser unit that generates a laser beam for processing the microscopic sample, a motorized microscope stage, a control computer and an information acquisition unit.
  • a slide with the sample is placed on the microscope stage and / or a Dissektatauf- catch container in which a separated by means of the laser beam from the sample dissector can be collected, arranged in the laser microdissection system.
  • known laser microdissection systems each have suitable holders or guides.
  • the sample information is applied to the slide on which the sample is located on the sample itself and / or on the dissektate collecting container. in which a dissected out by means of the laser beam from the sample can be collected, written.
  • the sample information is read using the information acquisition unit of the laser microdissection system from the slide, from the sample itself and / or from the dissektate collection container to which the sample information was previously written.
  • the present invention proposes a method which makes it possible in a laser microdissection system to identify a slide, a sample arranged thereon and / or a dissektate collecting container with corresponding information and / or such sample information from the slide, the sample and / or the Dissektatauffang prompter each read again.
  • the slide is not changed in its position during an experiment in which, for example, position markings on a sample or an image of such a sample are drawn on a screen. It is also desirable that it is always ensured that microscopic samples can be unambiguously assigned to their origin (for example a patient).
  • the present invention has the particular advantage that a marking of a slide or a sample and / or a readout of a corresponding Marking can be made in the laser microdissection system itself used.
  • the use of external marking devices is not required, at least for the provision of the sample information according to the invention.
  • the present invention therefore offers advantages over conventional systems for marking slides.
  • the invention enables a confusion-proof mark, since always exactly the slide or the sample can be labeled or read, which is currently in the laser microdissection system.
  • a corresponding method is particularly advantageous if in each case a position of the specimen slide, the specimen and / or the dissectate trapping container is determined relative to a reference point in the laser microdissection system.
  • a corresponding reference point can be incorporated into a higher-level reference system which is used to position a plurality or all of the moving components of the laser microdissection system, for example the motorized microscope stage and a laser scanning device.
  • one or more regions to be written to and / or read are determined on the slide, the sample and / or the dissecting receptacle and stored as coordinates relative to the reference point in the laser microdissection system. These areas can also be integrated into the overall reference system. Their positioning or spatial definition therefore also benefits from the mentioned advantages.
  • the method thus makes it possible at any time, by means of appropriate coordinates of the region or regions to be described and / or to be read, to approach it again by means of the microscope stage and to write and / or read the sample information after restarting. This can also be done several times. So For example, after removing one or more dissectates, a corresponding region of a slide can be approached, on which the successful separation can then be documented, if appropriate with further information such as position and / or size of a dissect. The same applies to a Dissektatauffang servinger.
  • the restarting as well as the writing and / or the reading of the sample information can thus advantageously take place during an ongoing processing and / or viewing of the same sample by means of the microscope of the laser microdissection system. This is also possible if the sample should in the meantime be taken from the laser microdissection system, as explained below.
  • the method according to the invention therefore works much more accurately and efficiently than conventional methods for laser microdissection in which object information is written and / or read.
  • the method may also advantageously comprise identifying the sample after restarting the region (s) to be written to and / or read by means of the written or read sample information and / or identifying the sample on that basis.
  • the former may include, for example, reading out an externally applied code and evaluating it in the laser microdissection system.
  • the sample, or a slide carrying it and / or a dissektate collecting container, may be marked on this basis.
  • sample information to be read out for example, to include processing instructions.
  • adapted processing for example using adapted processing parameters, can be carried out on this basis.
  • processing parameters can for example be predefined on the basis of a visual observation of the sample and stored on a slide. If this slide is subsequently processed, possibly after removal in the meantime or transfer to a (different) laser microdissection system, this information can be read and used for processing. It is also possible, for example, to write calibration marks and to identify them after removal and replacement of a slide or a Dissektatauffangbehalters in the laser microdissection system. The identification can be made visually, but also automatically using an image processing system. The identification allows a reconstruction of location information (coordinates) of the described area (s) relative to the mentioned reference point.
  • Dissektatauffangitesers can thus be continued without the positioning accuracy would be affected.
  • a corresponding slide is placed, for example, in a laser microdissection system, so that it is available for laser microdissection experiments.
  • one or more predefined or self-designed markers on the slide can be created using the laser microdissection system laser otherwise used to process the sample ,
  • these are alphanumeric and / or binary markers, for example in the form of character strings and / or bar or 2D codes such as QR codes.
  • a user interaction unit and / or via a control computer it is provided to enter the sample information from a user via a user interaction unit and / or via a control computer.
  • the user can use a keyboard to specify in a familiar manner a sample number, a sample description and / or other markings that are distinctive with respect to a microscopic sample, which are converted into suitable alphanumeric and / or binary symbols in the laser microdissection system and written on the slide.
  • a readout can be done in a similar manner. For example, if sample information in the form of alphanumeric and / or binary symbols is present on the slide, these symbols can be translated into readable text and output on the user interaction unit.
  • the invention allows a pathologist to examine a sample and make a diagnosis. For example, in this case an exact position of a pathologically changed cell can be determined and noted as position information on the slide. Together with the position information, a diagnosis made by the pathologist can be noted.
  • sample information can be written or read in the form of alphanumeric and / or binary strings and / or one and / or two-dimensional codes and / or in encrypted form.
  • the provision of sample information in encrypted form allows, for example, forgery-proof transmission of sample information and / or compliance with data protection requirements, for example if the sample information relates to a person from whom the microscopic sample originates.
  • the transmission of sample information in encrypted form also proves to be particularly advantageous in interlaboratory comparisons.
  • the same sample can be examined by several pathologists, each of whom diagnoses and notes on the slide. A hit rate can not be falsified by reading the diagnoses.
  • the sample information used in the context of the method according to the invention may comprise at least location information, source information and / or diagnostic information.
  • Location information is, for example, information on which structures of interest are arranged on a corresponding sample. This may be, for example, the mentioned coordinates of corresponding areas which relate to a fixed reference point on the slide (which can also be read out in the laser microdissection system). Alternatively, and as shown for example in FIG. 4, it may also be provided to provide a slide completely with unique reference points, wherein the object information relates to a position defined via corresponding reference points.
  • jektffy is re-inserted into the laser microdissection system.
  • it may be provided to design a laser microdissection system in such a way that a relevant area can be approached automatically.
  • a dissektate collecting container which serves to collect one or more dissectates of a corresponding sample in accordance with the invention. For example, information about which area of a particular sample, sample, and / or diagnosis has been cut out can be written on a corresponding disseparate collection container.
  • Further information may be provided, eg a finding (from a histological examination of a corresponding sample), a number and / or area of dissectates recovered in the laser microdissection system.
  • the microscope slide or a corresponding dissektate collecting container used itself becomes an information store.
  • the object information mentioned can be written on the slide as well as on the sample collection vessel as desired. In other words, it may be provided to provide the sample information as information regarding a dissected out of the sample or dissected out.
  • the sample information is written to a laser and / or thermosensitive area of the slide and / or the Dissektatauffang sensers and / or read from such an area.
  • the method can in principle also be used for standard slides which are not prepared for laser microdissection. In this case, for example, a micro engraving in the glass or a laser inscription of a lidded by cover glass sample can be made. If the sample itself is marked, in this case, for example, suitable markings are produced in a thin section of a fabric structure and / or an embedding medium.
  • a slide can be coated with a suitable membrane intended for laser microdissection.
  • a suitable membrane intended for laser microdissection.
  • Such a slide can, as also explained with reference to Figure 4, be provided with fields for mechanical and / or manual labeling.
  • a laser and / or thermosensitive area of the slide an area of the dissectable membrane itself is used and / or an additional area is provided, which is designed accordingly.
  • Such an area is intended exclusively for providing sample information during laser microdissection and is not used for a microscopic sample.
  • a laser power can also be changed, for example.
  • thermosensitive region in which at least one optically detectable property changes upon irradiation by means of the laser beam.
  • all laser-inscribable materials as they are known in principle, are suitable.
  • the inventive method is particularly suitable for use with a laser microdissection system comprising a microscope with a Auflicht coupled in which the laser beam is variably deflected using a Laserscan adopted and coupled into an observation beam path, the laser beam then focused through an objective of the microscope in an object area is in which the slide and / or a Dissektatauffangs adopted is located with the Dissek- tatauffang whatsoever.
  • the sample is mounted on one side in a laser microdissection system of this type, in bottom side upright systems, on a slide and is processed by the slide from the other side thereof with the laser beam.
  • the microscope stage is fixedly arranged in laser microdissection systems with a laser scanning device with respect to the xy direction (that is to say in the directions perpendicular to the optical axis of the microscope objective) during separation of the dissected object, ie during the dissecting process.
  • the laser scanning device is integrated in the incident light device.
  • laser microdissection systems with a microscope stage driven by a motor during the dissecting process which must have high positioning accuracy, particularly in the case of high-magnification objectives, in order to enable precise cuts
  • laser microdissection systems with a laser scanning device are simpler and less expensive to produce and have precision advantages.
  • the laser scanning device has two wedge prisms, which are inclined relative to an axis and can be rotated independently of one another about the axis, which generate a beam deflection due to their wedge angle. Due to the rotation of the wedge prisms, the resulting deflection angle of the laser beam with respect to the axis is variable.
  • the laser beam has a lateral beam offset with respect to the optical axis due to the thickness and the oblique position of the wedge prisms and strikes the center of the objective pupil of the microscope objective for all deflection angles.
  • Such a laser scanning device is therefore particularly advantageous over other laser scanning devices such as mirror scanners, galvanometer scanners or stepper motor scanners because they do not have to be arranged in a plane conjugate to the objective pupil. Thus, no so-called pupil imaging is required in order to ensure that the deflected beam hits the objective pupil.
  • a UV-compatible pupil image would be required.
  • Advantages of a laser scanning device with wedge prisms are mentioned in EP 1 276 586 B1.
  • the present invention is based on a laser microdissection system with a microscope, which has an incident light device, a microscope objective, a laser source and a laser scanning device.
  • a laser beam passes through the incident light device, through the laser scanning device arranged in the incident light device and through the microscope objective. tiv and is focused by the particular microscope objective used to process a sample on the sample.
  • the illustrated laser microdissection system corresponds in its basic structure, for example, to that disclosed in EP 1 276 586 B1.
  • a laser microdissection system comprises means for providing sample information relating to a microscopic sample. It also comprises a microscope with at least one objective, a laser unit which generates a laser beam for processing the microscopic sample, a motorized microscope stage, a control computer and an information acquisition unit.
  • a holder for a slide which is placed with the sample on the microscope stage and / or a Dissektatauffang consideringer, in which a separated by means of the laser beam from the sample dissector can be collected provided.
  • the laser microdissection system is characterized by a control unit having means for outputting control signals which cause the sample information to be written by means of the laser beam of the existing laser unit to the slide, the sample and / or to the dissektate collecting container and / or the Sample information is read by the information acquisition unit of the slide, the sample and / or from the Dissektatauffang practicer.
  • the laser microdissection system according to the invention is set up in particular for carrying out a previously explained method and has corresponding means. Reference is made to the respective features and advantages.
  • FIG. 1 shows a laser microdissection system according to one embodiment of the invention
  • FIG. 2 shows details of a laser microdissection system according to FIG. 1 in a schematic representation.
  • FIG. 3 shows details of a laser microdissection system according to FIG. 1 in a schematic representation.
  • FIG. 4 shows a slide for use according to an embodiment of the invention
  • FIG. 1 shows a laser microdissection system according to an embodiment of the invention is shown schematically and designated 100 in total.
  • the laser microdissection system 100 corresponds in substantial parts to that disclosed in EP 1 276 586 B1, to which reference is expressly made.
  • the laser microdissection system 100 comprises a microscope, designated here overall by 1.
  • a lighting device 3 In a microscope head 2 of the microscope 1, a lighting device 3 only partially shown can be provided. Light of the illumination device 3 can be influenced by means of a condenser unit 4.
  • a user interaction unit 5 can be arranged, for example in the form of a touchscreen.
  • the user can, for example, enter and / or read out viewing and / or processing parameters.
  • the user interaction unit 5 can also be designed to make information available to a user within the scope of a method according to the invention and / or to set up such information by a user.
  • a drive knob 6 is provided, which may be designed to operate a coarse and a fine drive.
  • a microscope stage 7 in its height (ie in z-direction) to be adjusted.
  • further adjusting devices 8 can be provided in a known manner.
  • a slide 10 with a microscopic sample 11 placed on it can be arranged in a sample area 9 of the laser microdissection system 100 or of the microscope 1.
  • the slide 10 is typically placed on a dissektate collecting device 20, which is likewise arranged in the sample area 9, and thus on the microscope stage 7, as also explained in more detail below with reference to FIGS. 2 and 3.
  • the microscope stage 7 is preferably formed motorized.
  • lenses 31 are provided.
  • the arrangement of the illustrated components is known to be reversed, i. the lighting device 12 is at the top, the lenses 31 at the bottom.
  • An observation beam path 32 extends through the lens 31 swiveled in each case and a tube unit 33 with outcouplers 34.
  • a visual inspection can be made via an eyepiece view 35; an electronic microscope image, for example by means of a CCD chip, can be obtained via a digital optical detection unit 36.
  • the microscope system 100 has a laser unit designated overall by 37 with a laser source 38.
  • a laser beam 39 provided by the laser source 38 is deflected at a first deflection element 41 and a second deflection element 42 in an incident light unit, which is designated here in its entirety by 40 and thus coupled into the observation beam path 32.
  • the laser beam 39 can thus be focused into the object area 9 by means of the respectively pivoted-in objective 31.
  • the position of the focal point of the laser beam 39 in the object region 9 can basically be set in different ways.
  • a laser scanning device 43 may be provided.
  • the laser beam 39 can be deflected variably with respect to an axis 44 extending between the first deflection unit 41 and the second deflection unit 42.
  • the laser beam can therefore impinge at different positions on the second deflection unit 42, so that the position of its focal point in the object region 9 shifts accordingly.
  • a corresponding deflection is shown in detail in EP 1 276 586 B1. It should be emphasized that other possibilities for deflecting the laser beam 39 and / or for positioning a sample 11 may also be used.
  • the laser scanning device 43 has two wedge prisms 45, which are inclined relative to the axis 44 and are rotatable about these independently.
  • the wedge prisms 45 are mounted, for example, with ball bearings 46 and 47 via gears by means of suitable actuators 48 movable.
  • the actuators 48 may have position sensors 49 (shown here only on the right actuator 48). A position detected thereby can be transmitted to a control unit 50.
  • the control unit 50 can adjust the position of the focal point of the laser beam 39 in the object region 9 by suitably activating the actuators 48.
  • the user interaction unit 5 and / or a control computer 51 can be connected to the control unit 50 by wire or wirelessly via a suitable communication link 52 , are used.
  • control unit 50 is in particular also designed to control the laser scanning device 43 in such a way that sample information can be applied to the slide 10 and / or to a dissektate collecting container arranged in the dissector catch device 20 by means of the laser 39. Values can also be predefined for this purpose by means of the user interaction unit 5 and / or the control computer 51.
  • an information acquisition unit 53 is furthermore provided, which can be set up, for example, to read out sample information by evaluating the data acquired by the image acquisition unit 36, which has previously been arranged on the slide 10 and / or in the dissektate collecting device 20 Dissektatauffang modelinger were applied.
  • the information acquisition unit 53 can also be designed, for example, as a bar code scanner. Although the information acquisition unit 53 is illustrated here as part of the image acquisition unit 36, it can also be integrated, for example, in the control unit 50 and / or the control computer 51 or arranged separately.
  • the image acquisition unit 36 and the control unit 50 and / or the control computer 51 can be wired or wirelessly connected via a suitable communication link.
  • the control computer 51 can also be designed to display microscopic images acquired by the image acquisition unit 36. It can also be a portable control computer 51 in the form of a smartphone and / or a tablet computer. Even in the latter cases, the control computer 51 can take over any display and control functions.
  • FIG. 2 shows a cross section through the microscope stage 7 with the dissectant collecting device 20 mounted thereon in a plane spanned by the optical axis of the observation beam path 32 and the x direction (perpendicular to the plane of the paper of FIG. 1).
  • the microscope stage 7 has a fixed base plate 7a, on which a plate 7b which is movable in the y direction (ie perpendicular to the plane of the paper) is arranged.
  • the movable plate 7b defines a table surface 7c of the microscope stage 7.
  • the movable plate 7b is displaceable relative to the stationary base plate 7a by means of a suitable device, for example using bearing balls 7d.
  • a suitable device for example using bearing balls 7d.
  • the already explained adjusting devices 8 can be used for mutually displacing the fixed base plate 7a and the movable plate 7b. If this is referred to as the stationary base plate 7a being "fixed”, this only relates to its position in relation to the movable plate 7b.
  • the "stationary" base plate 7a may also be in the x-direction, for example a further plate of the microscope stage 7 are moved and adjusted in the z-direction in height.
  • a dissektate collecting container 21 Arranged on the table surface 7c of the microscope stage 7 in the dissektate collecting device 20 is a dissektate collecting container 21 which, if necessary, can be displaced by means of a suitable adjusting device (see FIG. However, the dissectate collecting container 21 can also be moved manually in a free working space 22 of the dissektate collecting device 20.
  • the dissektate collecting container 21 can also be the lid of a known lidded vessel, which can be clamped in the dissecting collecting device 20.
  • the Dissektatauffang worn 20 has a support member 23, on which the slide 10 can be placed.
  • the sample 1 1 is attached to the underside of the slide 10.
  • the slide 10 is advantageously positioned so that the sample 1 1 is completely in the free working space 22.
  • a height 24 of the free working space 22 can be made adjustable by adjusting means and / or fixed by spacers (not shown).
  • the objective 31 faces the microscope slide 10 on the optical axis of the observation beam path 32 and generates an image of the object 11 via a corresponding lens arrangement (without designation).
  • the sample 11 is located in the focal plane of the objective 31.
  • a laser beam 39 which has been coupled in, as explained with reference to FIG. 1, can be focused onto the sample 11 in order to separate out a dissectate from the sample 11.
  • the Dissektatauffang samplinger 21 is arranged under the sample 1 1 so that the dissectate falls by gravity into them.
  • a dissectate 25 is shown in the dissectate catcher 21.
  • the number of dissektate receptacles 21 can be adapted to the respective requirements, for example the number of dissectates 25 to be recovered.
  • FIG. 2 illustrates the position of the focal point of the laser beam 39 when the laser beam 39 is used to separate out a dissectate 25 from a sample 11.
  • FIG. 3 shows the position of the focal point of the laser beam 39 when the Laser beam 39 is used to write object information on the slide 10.
  • FIG. 3 shows a section corresponding to FIG. 2 through a microscope table 7 with a dissectant collecting device 20 arranged thereon according to a further embodiment of the invention.
  • two holding elements 26, of which only the left holding element 26 is provided with a reference numeral, are fastened to the stationary base plate 7a.
  • the holding elements 26 carry a contamination protection plate 27 which is fixed between the carrier element 26 and the Dissektatauffang practiceer 21.
  • the dissectate collecting container 21 is here together with further Dissektatauffang electern in a structure 28, for example a microtiter plate is formed.
  • the contamination protection plate 27 advantageously spans the entire table surface of the microscope stage 7 and thus limits the free working space 22 upwards.
  • the contamination protection plate 27 is formed with a cutout 29, so that a dissectate 25 can fall into the respective desired Dissektatauffang employer 21.
  • a dissectate collecting container 21 of the structure 28 for example, in each case one well of a microtiter plate, can be arranged below the cutout 29.
  • the contamination protection plate 27 prevents dust or other particles from the ambient air from falling into the dissected collecting containers 21.
  • dissectates 25 are prevented from falling into a "wrong" dissektate collecting container 21.
  • An adjusting device 7d may be part of an adjusting device for adjusting the microscope stage 7 and / or may be formed separately therefrom The adjusting device 7d can be operated manually, but preferably has a corresponding motor 16.
  • the adjusting device 7d is connected via a corresponding connection 7f to a control unit, for example to the explained control computer 51.
  • FIGS. 2 and 3 For further embodiments of the embodiments illustrated in FIGS. 2 and 3, reference is made in particular to DE 100 18 251 C1, to which reference is hereby expressly made.
  • the position of the focal point of the laser beam 39 is illustrated in FIG. 3 when the laser beam 39 is used to apply object information to the slide 10.
  • the focal point of the laser beam 39 is in this case outside a region of an object 1 1 and in a laser-sensitive region of the slide 10, as illustrated in FIG.
  • the laser beam 39 is used for applying object information to the dissecting collecting container 21, the position of its focal point is set correspondingly on the surface of the dissecting collecting container 21.
  • advantageously lenses 31 are used with a long working distance.
  • Figure 4 shows a slide 10 for use according to an embodiment of the invention in a schematic representation.
  • a microscopic sample 1 1 is applied in the example shown.
  • the microscopic sample 11 is located in a region 12 of the object carrier 10, which is provided for examination and / or processing in a laser microdissection system.
  • a corresponding region 12 is covered, for example, with a microdissectable membrane.
  • area 12 is further provided with unique location information, as illustrated at a section 14 of area 12.
  • region 12 as can be seen in section 14, two reference point networks are shown, each having reference points A to Z, 1 to 24, a to j, and ⁇ to ⁇ .
  • any partial area 14 can be considered.
  • the reference point network with the reference points A to Z, 1 to 24, a to j and ⁇ to ⁇ is visible in an enlarged view in the right part of Figure 4.
  • the area 14 of the sample area 12 can be uniquely identified by the reference points G, 4 and H of the reference point network. These are present in the illustrated triple combination only at a single position of the slide 10 or its region 12. This allows a unique Positioning.
  • the reference points A to Z, 1 to 24, a to j, ⁇ to ⁇ can also be designed such that they are only visible under certain viewing conditions, for example in the case of UV light or light of a specific wavelength.
  • the entire subarea 14 is clearly located on the slide 10.
  • the reference points A to Z and 1 to 24 are associated with a magnification stage with low magnification.
  • a higher resolution position determination can take place by means of the reference subnet of the next lower order at higher magnification, as shown in the right part of FIG.
  • a sample area marked here with a star or a corresponding marking made by a viewer can be localized in the reference point network 15 of the next lower order by the reference points e, d, ⁇ and f.
  • the marked with the star region of the sample or the corresponding, made by a viewer marker is thus located in total in the area 12 clearly over two reference point networks.
  • the respective higher-resolution reference points of a reference point network can of course be repeated within a lower-resolution reference point network as long as a clear identification is possible.
  • the slide 10 may further include an area 13 inscribable by a user or machine, as so far known.
  • the slide 10 has a temperature- and / or laser-sensitive region 16, which in turn may include partial regions 17 and 18, which may be associated, for example, with different magnification steps.
  • corresponding reference point information can be stored in the region 16 or the subregions 17 and 18.
  • object information position information or reference point information
  • This can, as shown, for example by means of a 2D barcode and / or in the form al phanumeric strings occur.
  • other information such as diagnostic or patient information, can be stored.
  • a subregion 18 of the region 16 set up for higher magnification it is accordingly possible to deposit position information relating to the higher-resolution reference point network, for example also in the form of a bar code and / or in the form of alphanumeric character strings.
  • the area 16 can comprise a multiplicity of partial areas which can be reserved for different information, different magnification levels and / or different marking possibilities.
  • the present invention can be used not only with a slide 10 having a reference point network as illustrated in FIG. Rather, it is also possible, for example, to store coordinate information relating to a fixed reference point on a slide 10 in a region 16. As mentioned, any information may be applied to and / or read from a slide.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zum Bereitstellen von Probeninformationen (19), die sich auf eine mikroskopische Probe (11) beziehen, unter Verwendung eines Lasermikrodissektionssystems (100), welches ein Mikroskop (1) mit wenigstens einem Objektiv (31), eine Lasereinheit (37), die einen Laserstrahl (39) zur Bearbeitung der mikroskopischen Probe (11) erzeugt, einen motorisierten Mikroskoptisch (7), einen Steuerrechner (51) und eine Informationserfassungseinheit (53) aufweist vorgeschlagen. Ein Objektträger (10) mit der Probe (11) wird auf den Mikroskoptisch (7) aufgelegt und/oder ein Dissektatauffangbehälter (21), in dem ein mittels des Laserstrahls aus der Probe (11) herausgetrenntes Dissektat (25) aufgefangen werden kann, wird in dem Lasermikrodissektionsystem angeordnet. Die Probeninformationen werden mittels des Laserstrahls (39) der vorhandenen Lasereinheit (37) auf den Objektträger (10), auf die Probe (11) und/oder auf den Dissektatauffangbehälter (21) geschrieben und/oder die Probeninformationen (19) werden mittels der Informationserfassungseinheit (53) von dem Objektträger (10), von der Probe (11) und/oder von dem Dissektatauffangbehälter (21) abgelesen. Ein entsprechendes Lasermikrodissektionssystem ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Description

Bereitstellen von Probeninformationen mit einem
Lasermikrodissektionssystem
Beschreibung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bereitstellen von Probeninformationen und ein entsprechendes Lasermikrodissektionssystem gemäß den Oberbegriffen der unabhängigen Patentansprüche.
Stand der Technik
Verfahren zur Bearbeitung mikroskopischer Proben bzw. Objekte durch die sogenannte Lasermikrodissektion existieren bereits seit Mitte der 1970er Jahre (siehe z.B. Isenberg, G. et al.: Cell surgery by laser micro-dissection: a preparative method. Journal of Microscopy, Band 107, 1976, Seiten 19-24) und wurden seitdem kontinuierlich weiter- entwickelt.
Bei der Lasermikrodissektion können Zellen, Geweberegionen usw. aus einem Gewebeverband isoliert und als sogenannte Dissektate gewonnen werden. Ein besonderer Vorteil der Lasermikrodissektion ist der kurze Kontakt des Gewebes mit dem Laser- strahl, durch den das Gewebe kaum verändert wird. Die spezifische Gewinnung der Dissektate kann dabei auf unterschiedliche Weise erfolgen (siehe z.B. Bancroft, J.D. und Gamble, M.: Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier Science, 2008, Seite 575, Kapitel„Laser Microdissection"). Beispielsweise kann aus einer Probe mittels eines Infrarot- oder Ultraviolettlaserstrahls ein Dissektat isoliert werden, das unter dem Einfluss der Schwerkraft in einen geeigneten Dissektatauffangbehälter fällt. Das Dissektat kann dabei aus der Probe auch zusammen mit einer anhaftenden Membran ausgeschnitten werden. Bei der sogenannten Laser Capture Microdissection wird eine thermoplastische Membran, die auch mit ei- nem Reaktionsgefäß verbunden sein kann, mittels eines entsprechenden Laserstrahls erwärmt. Dabei verschmilzt die Membran mit dem gewünschten Bereich des Objekts und kann in einem darauffolgenden Schritt entfernt werden. Eine weitere Alternative besteht darin, das Dissektat mittels des Laserstrahls an einen Deckel eines Dissek- tatauffangbehälters anzuheften. Auch inverse Mikroskopsysteme zur Lasermikrodissektion sind bekannt.
Bekannte Mikroskopsysteme zur Lasermikrodissektion, wie sie beispielsweise aus der WO 98/14816 A1 bekannt sind, weisen eine Auflichteinrichtung auf, in deren Strahlen- gang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv auf die Probe fokussiert, die auf einem motorisch-automatisch verfahrbaren Mikroskoptisch aufliegt. Eine Schnittlinie wird dadurch erzeugt, dass der Mikroskoptisch beim Schneiden verfahren wird, um die Probe relativ zu dem feststehenden Laserstrahl zu bewegen. Dies hat jedoch unter anderem den Nachteil, dass die Probe während des Erzeugens der Schnittlinie nicht gut betrachtet werden kann, da sich diese im Gesichtsfeld bewegt.
Vorteilhafter sind daher Lasermikrodissektionssysteme, die Laserscaneinrichtungen aufweisen, die dazu eingerichtet sind, den Laserstrahl bzw. dessen Auftreffpunkt auf der dann feststehenden Probe entsprechend zu verschieben. Derartige Lasermikrodissektionssysteme, die auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung besondere Vorteile bieten, werden unten im Detail erläutert. Ein besonders vorteilhaftes Lasermikro- dissektionssystem, das eine Laserscaneinrichtung mit Keilprismen aufweist, ist in der EP 1 276 586 B1 beschrieben.
In beiden Fällen, also sowohl in Lasermikrodissektionssystemen, in denen der Mikroskoptisch verfahren wird, als auch in Lasermikrodissektionssystemen, die eine Laserscaneinrichtung aufweisen, wird in der Regel mit gepulsten Lasern gearbeitet, wobei durch jeden Laserpuls beispielsweise ein Loch in der Probe erzeugt wird. Eine Schnittlinie entsteht durch eine Aneinanderreihung derartiger Löcher, gegebenenfalls mit Überlappung.
Bei der Lasermikrodissektion, aber auch bei anderen Verfahren, bei denen mikroskopische Proben auf Objektträger aufgebracht sind, werden die Objektträger häufig durch manuelle oder maschinelle Beschriftung oder mittels Barcodes markiert, um eine Zuordnung der aufgebrachten Proben zur ermöglichen. Es werden also, im Sprachgebrauch der vorliegenden Anmeldung, Probeninformationen, die sich auf eine mikroskopische Probe auf einem Objektträger beziehen, auf den Objektträger aufgebracht. Je- doch ist es in der Regel nicht möglich, entsprechende Probeninformationen abzurufen, während sich der Objektträger in einem Lasermikrodissektionssystem befindet, also beispielsweise auf einem Mikroskoptisch aufliegt. Ferner ist es nicht möglich, entsprechende Probeninformationen oder vergleichbare Markierungen auf den Objektträger zu schreiben, ohne diesen aus dem Lasermikrodissektionssystem zu entnehmen. Dies erweist sich als unpraktisch, insbesondere dann, wenn Lageinformationen bezüglich der Probe hinzugefügt werden sollen und/oder wenn eine große Anzahl von Proben zu bearbeiten ist.
Es besteht daher der Bedarf nach verbesserten Möglichkeiten zum Bereitstellen von Probeninformationen, insbesondere bei der Lasermikrodissektion.
Offenbarung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund schlägt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bereit- stellen von Probeninformationen und ein entsprechendes Lasermikrodissektionssystem mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche vor. Bevorzugte Ausgestaltungen sind jeweils Gegenstand der abhängigen Patentansprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung. Die vorliegende Erfindung geht von einem Lasermikrodissektionssystem aus, das dafür eingerichtet ist, aus einer zu dissektierenden Probe, beispielsweise einem Dünnschnitt auf einem Objektträger, mittels eines fokussierten Laserstrahls ein Dissektat herauszutrennen. Wie bereits erläutert, wird in bekannten Lasermikrodissektionssystemen ein entsprechender Laserstrahl mittels eines Mikroskopobjektivs auf die Probe fokussiert und die Probe dabei relativ zu dem Laserstrahl bewegt oder umgekehrt. Das oder die dabei erhaltenen Dissektate werden in einem Dissektatauffangbehälter aufgefangen.
Zur Vermeidung von Missverständnissen sei an dieser Stelle betont, dass das im Rahmen der Erfindung eingesetzte Lasermikrodissektionssystem mit zu dissektieren- den Proben verwendet wird, die bereits mikroskopietauglich vorbereitet sind. Hierbei kann es sich beispielsweise um Dünnschnitte handeln, die mittels eines Mikrotoms aus einem größeren Gewebeblock herausgetrennt werden. Bei einem solchen Gewebeblock kann es sich beispielsweise um ein fixiertes Organ oder eine Biopsie eines ent- sprechenden Organs handeln. Die vorliegende Erfindung dient daher nicht zur Gewinnung von zu dissektierenden Proben, sondern zu deren Bearbeitung sowie zur Isolation von bestimmten Bereichen hiervon. Es versteht sich, dass die Erfindung auch mit anderen zu dissektierenden Proben, die nicht mittels eines Mikrotoms gewonnen werden, zum Einsatz kommen kann, beispielsweise mit Ausstrichen, Mazeraten usw.
Mikrotome werden ausschließlich bei der Vorbereitung von mikroskopischen Proben eingesetzt. Mikrotome können hierzu auch Laser aufweisen. Die mittels eines Mikrotoms erhaltenen Schnitte werden auf einen Objektträger, wie oben erwähnt, aufgebracht, ggf. dort befestigt, angefärbt usw. Erst dann stehen diese für einen Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. einem entsprechenden Lasermikrodissekti- onssystem zur Verfügung. Ein Mikrotom unterscheidet sich in seinem Betrieb unter anderem dadurch fundamental von einem Lasermikrodissektionssystem, dass dort Schnitte mit möglichst homogener Schnittstärke gewonnen werden. Mikrotome sind daher dazu ausgebildet, eine große Anzahl an identischen Schnitten mit parallelen Schnittflächen zu erzeugen, wohingegen Lasermikrodissektionssysteme zum Heraustrennen von Dissektaten nach probenabhängigen Kriterien, beispielsweise nach visuellen Kriterien, eingerichtet sind. Der Fachmann würde daher bei Mikrotomen eingesetzte technische Lösungen nicht auf Lasermikrodissektionssysteme übertragen. Mikrotome umfassen ferner keine Mikroskope, in deren Beobachtungsstrahlengang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird daher in Mikrotomen auch niemals durch ein Mikroskopobjektiv, das auch zur Betrachtung verwendet wird, auf eine bearbeitete Probe, z.B. einen Gewebeblock, fokussiert. Die vorliegende Erfindung schlägt ein Verfahren zum Bereitstellen von Probeninformationen, die sich auf eine mikroskopische Probe beziehen, unter Verwendung eines entsprechenden Lasermikrodissektionssystems vor. Das Lasermikrodissektionssystem umfasst ein Mikroskop mit wenigstens einem Objektiv, eine Lasereinheit, die einen Laserstrahl zur Bearbeitung der mikroskopischen Probe erzeugt, einen motorisierten Mikroskoptisch, einen Steuerrechner und eine Informationserfassungseinheit.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird, wie insoweit bekannt, ein Objektträger mit der Probe auf den Mikroskoptisch aufgelegt und/oder ein Dissektatauf- fangbehälter, in dem ein mittels des Laserstrahls aus der Probe herausgetrenntes Dissektat aufgefangen werden kann, in dem Lasermikrodissektionssystem angeordnet. Hierzu weisen bekannte Lasermikrodissektionssysteme jeweils geeignete Halterungen bzw. Führungen auf.
Die Probeninformationen werden erfindungsgemäß unter Verwendung des Laserstrahls der vorhandenen Lasereinheit des Lasermikrodissektionssystems, insbesonde- re in Form alphanumerischer und/oder binärer Symbole, auf den Objektträger, auf dem sich die Probe befindet, auf die Probe selbst und/oder auf den Dissektatauffangbehäl- ter, in dem ein mittels des Laserstrahls aus der Probe herausgetrenntes Dissektat aufgefangen werden kann, geschrieben. Alternativ oder zusätzlich ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass die Probeninformationen unter Verwendung der Informationserfassungseinheit des Lasermikrodissektionssystems von dem Objektträger, von der Probe selbst und/oder von dem Dissektatauf- fangbehälter, auf den die Probeninformationen zuvor geschrieben wurden, abgelesen werden.
Mit anderen Worten schlägt die vorliegende Erfindung ein Verfahren vor, das es in einem Lasermikrodissektionssystem ermöglicht, einen Objektträger, eine auf diesem angeordnete Probe und/oder einen Dissektatauffangbehälter mit entsprechenden Informationen zu kennzeichnen und/oder solche Probeninformationen von dem Objekt- träger, der Probe und/oder dem Dissektatauffangbehälter jeweils wieder abzulesen.
Ist nachfolgend davon die Rede, dass„ein" Objektträger mit der Probe auf den Mikroskoptisch aufgelegt wird und/oder„ein" Dissektatauffangbehälter in dem Lasermikrodissektionssystem angeordnet wird, in welchem wiederum„ein" Dissektat aufgefangen wird, schließt dies selbstverständlich nicht aus, dass auch mehrere Objektträger, Dissektatauffangbehälter und/oder Dissektate, entweder parallel oder nacheinander, verwendet bzw. erzeugt werden können. Besonders vorteilhaft ist ein derartiges Verfahren, wenn die Probeninformationen geschrieben und/oder abgelesen werden, während der Objektträger auf dem Mikroskoptisch aufgelegt und/oder der Dissektatauffangbehälter in dem Lasermikrodissektions- system angeordnet ist. Dies ist im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, weil der schreibende Laser und/oder die ablesende Informationserfassungseinheit Teil des Lasermikrodissektionssystems selbst sind und ihr Betrieb daher bei der parallelen Bearbeitung und/oder Betrachtung der Probe möglich ist, ohne dass die Probe hierzu aus dem Lasermikrodissektionssystem entnommen werden müsste.
Wie erwähnt, ist es bislang in der Regel nicht möglich, eine Markierung eines Objektträgers während eines Experiments zu erzeugen und zu visualisieren. Insbesondere ist es herkömmlicherweise nicht möglich, Probeninformationen auf einen Objektträger oder eine Probe zu schreiben, während sich dieser in einem Mikroskop, beispielsweise einem Mikroskop eines Lasermikrodissektionssystems, befindet. Es ist daher herkömmlicherweise erforderlich, den Objektträger - gegebenenfalls nach Ausschwenken der jeweils verwendeten Objektive - aus einer Probenhalterung des Mikroskops herauszunehmen, dann eine Beschriftung vorzunehmen und den Objektträger anschließend wieder in die Probenhalterung einzulegen. Hierbei kommt es nahezu zwangsläufig zu Positionierungsproblemen, weil sich die Lage eines entsprechenden Objektträgers nicht exakt reproduzieren lässt.
Insbesondere bei der Lasermikrodissektion kann es jedoch entscheidend sein, dass während eines Experiments, bei dem beispielsweise Lagemarkierungen auf einer Probe bzw. einem Bild einer solchen Probe auf einem Bildschirm eingezeichnet werden, der Objektträger in seiner Position nicht verändert wird. Wünschenswert ist ferner, dass stets sichergestellt ist, dass mikroskopische Proben eindeutig ihrem Ursprung (beispielsweise einem Patienten) zugeordnet werden können.
Die vorliegende Erfindung hat dabei den besonderen Vorteil, dass eine Markierung eines Objektträgers oder einer Probe und/oder ein Auslesen einer entsprechenden Markierung in dem jeweils verwendeten Lasermikrodissektionssystem selbst vorgenommen werden kann. Die Verwendung externer Markierungseinrichtungen ist zumindest für die erfindungsgemäße Bereitstellung der Probeninformationen nicht erforderlich. Die vorliegende Erfindung bietet daher Vorteile gegenüber herkömmlichen Syste- men zur Markierung von Objektträgern. Insbesondere ermöglicht die Erfindung eine verwechslungssichere Markierung, da immer genau der Objektträger bzw. die Probe beschriftet bzw. ausgelesen werden kann, der sich momentan im Lasermikrodissektionssystem befindet. Besonders vorteilhaft ist ein entsprechendes Verfahren, wenn jeweils eine Position des Objektträgers, der Probe und/oder des Dissektatauffangbehälters relativ zu einem Bezugspunkt in dem Lasermikrodissektionssystem bestimmt wird. Dies ermöglicht ein besonders exaktes Anfahren entsprechender Positionen, das aufgrund der Möglichkeit, die Probeninformationen zu schreiben und/oder abzulesen, während der Objektträger auf dem Mikroskoptisch aufgelegt und/oder der Dissektatauffangbehälter in dem Lasermikrodissektionssystem angeordnet ist, durch die genannten Fehlerquellen nicht beeinflusst wird.
Ein entsprechender Bezugspunkt kann in ein übergeordnetes Bezugssystem einge- bunden sein, das zur Positionierung mehrerer oder aller beweglichen Komponenten des Lasermikrodissektionssystems, beispielsweise des motorisierten Mikroskoptischs und einer Laserscaneinrichtung, verwendet wird.
Es ist ferner vorteilhaft, wenn auf dem Objektträger, der Probe und/oder dem Dissek- tatauffangbehälter ein oder mehrere zu beschreibende und/oder abzulesende Bereiche bestimmt und als Koordinaten relativ zu dem Bezugspunkt in dem Lasermikrodissektionssystem gespeichert werden. Auch diese Bereiche können in das übergreifende Bezugssystem eingebunden werden. Ihre Positionierung bzw. räumliche Definition profitiert daher ebenfalls von den erwähnten Vorteilen.
Das Verfahren ermöglicht somit jederzeit, anhand entsprechender Koordinaten des oder der zu beschreibenden und/oder abzulesenden Bereiche, diese mittels des Mikroskoptisches erneut anzufahren und die Probeninformationen nach dem erneuten Anfahren zu schreiben und/oder abzulesen. Dies kann auch mehrfach erfolgen. So kann beispielsweise jeweils nach dem Heraustrennen eines oder mehrerer Dissektate ein entsprechender Bereich eines Objektträgers angefahren werden, auf dem dann das erfolgreiche Heraustrennen, ggf. mit Angabe weiterer Informationen wie Lage und/oder Größe eines Dissektats, dokumentiert werden kann. Entsprechendes gilt für einen Dissektatauffangbehälter.
Das erneute Anfahren sowie das Schreiben und/oder das Ablesen der Probeninformationen kann also vorteilhafterweise während einer laufenden Bearbeitung und/oder Betrachtung derselben Probe mittels des Mikroskops des Lasermikrodissektionssys- tems erfolgen. Dies ist auch dann möglich, wenn die Probe zwischenzeitlich dem La- sermikrodissektionssystem entnommen werden sollte, wie unten erläutert. Das erfindungsgemäße Verfahren arbeitet daher sehr viel genauer und effizienter als herkömmliche Verfahren zur Lasermikrodissektion, bei denen Objektinformationen geschrieben und/oder abgelesen werden.
Das Verfahren kann auch vorteilhafterweise umfassen, die Probe nach dem erneuten Anfahren des oder der zu beschreibenden und/oder abzulesenden Bereiche mittels der geschriebenen oder ausgelesenen Probeninformationen zu kennzeichnen und/oder die Probe auf dieser Grundlage zu identifizieren. Ersteres kann beispielsweise umfassen, einen extern aufgebrachten Code auszulesen und in dem Lasermikrodissektionssys- tem auszuwerten. Die Probe, bzw. ein diese tragender Objektträger und/oder ein Dissektatauffangbehälter, kann auf dieser Grundlage gekennzeichnet werden. Ferner ist es beispielsweise möglich, dass auszulesende Probeninformationen beispielsweise Bearbeitungsanweisungen umfassen.
Wird eine entsprechende Probe damit auf Grundlage ausgelesener Probeninformationen identifiziert, kann auf dieser Basis eine angepasste Bearbeitung, beispielsweise unter Verwendung angepasster Bearbeitungsparameter, erfolgen. Derartige Bearbeitungsparameter können beispielsweise auf Grundlage einer visuellen Betrachtung der Probe vorgegeben und auf einem Objektträger gespeichert werden. Wird dieser Objektträger anschließend bearbeitet, ggf. nach zwischenzeitlicher Entnahme oder Verbringung in ein (anderes) Lasermikrodissektionssystem, können diese Informationen abgelesen und zur Bearbeitung verwendet werden. Auch ist beispielsweise möglich, Kalibriermarkierungen zu schreiben und diese nach Entnehmen und Wiedereinlegen eines Objektträgers bzw. Dissektatauffangbehalters in das Lasermikrodissektionssystem zu identifizieren. Die Identifikation kann visuell, aber auch automatisiert unter Verwendung eines Bildverarbeitungssystems vorgenommen werden. Die Identifikation ermöglicht eine Rekonstruktion von Lageinformationen (Koordinaten) von dem oder den beschriebenen Bereichen relativ zu dem erwähnten Bezugspunkt. Eine Bearbeitung einer Probe und das weitere Auslesen und/oder Schreiben von Probeninformationen nach dem Wiedereinlegen des Objektträgers bzw.
Dissektatauffangbehälters kann damit fortgesetzt werden, ohne dass die Positioniergenauigkeit beeinflusst würde.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein entsprechender Objektträger beispielsweise in ein Lasermikrodissektionssystem eingelegt, so dass dieser für La- sermikrodissektionsexperimente zur Verfügung steht. Vor, während und nach dem La- sermikrodissektionsexperiment (also während der gesamten Zeit, während derer sich der Objektträger im Lasermikrodissektionssystem befindet) können mit dem ansonsten für die Bearbeitung der Probe verwendeten Laser des Lasermikrodissektionssystems eine oder mehrere vordefinierte oder selbstgestaltete Markierungen auf dem Objektträger erstellt werden. Insbesondere handelt es sich hierbei um alphanumerische und/oder binäre Markierungen, beispielsweise in Form von Zeichenketten und/oder Bar- oder 2D-Codes wie QR-Codes.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, die Probeninformationen von einem Benutzer über eine Benutzerinterakti- onseinheit und/oder über einen Steuerrechner einzugeben. Beispielsweise kann der Benutzer über eine Tastatur in vertrauter Weise eine Probennummer, eine Probenbeschreibung und/oder andere bezüglich einer mikroskopischen Probe kennzeichnungskräftige Bezeichnungen vorgeben, die in dem Lasermikrodissektionssystem zu geeigneten alphanumerischen und/oder binären Symbolen umgesetzt und auf den Objekt- träger geschrieben werden. Auch ein Auslesen kann in entsprechender Weise erfolgen. Beispielsweise kann, wenn auf dem Objektträger Probeninformationen in Form alphanumerischer und/oder binärer Symbole vorliegen, eine Umsetzung dieser Symbole in lesbaren Text und eine Ausgabe auf der Benutzerinteraktionseinheit erfolgen. Die Erfindung ermöglicht beispielsweise einem Pathologen, eine Probe zu untersuchen und eine Diagnose vorzunehmen. Beispielsweise kann hierbei eine exakte Position einer pathologisch veränderten Zelle bestimmt und als Lageinformation auf dem Objektträger vermerkt werden. Zusammen mit der Lageinformation kann eine vom Patho- logen getroffene Diagnose vermerkt werden.
Wie bereits erwähnt, können die Probeninformationen in Form alphanumerischer und/oder binärer Zeichenketten und/oder ein- und/oder zweidimensionaler Codes und/oder in verschlüsselter Form geschrieben oder ausgelesen werden. Die Bereitstellung von Probeninformationen in verschlüsselter Form ermöglicht dabei beispielsweise ein fälschungssicheres Übermitteln von Probeninformationen und/oder die Einhaltung von Datenschutzauflagen, beispielsweise wenn sich die Probeninformationen auf eine Person beziehen, von der die mikroskopische Probe stammt. Die Übermittlung von Probeninformationen in verschlüsselter Form erweist sich auch als besonders Vorteilhaft bei Ringversuchen. Hierbei kann einunddieselbe Probe von mehreren Pathologen untersucht werden, die jeweils Diagnosen vornehmen und auf dem Objektträger vermerken. Eine Trefferquote kann dabei nicht durch ein Ablesen der Diagnosen verfälscht werden. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Probeninformationen können zumindest Lageinformationen, Herkunftsinformationen und/oder Diagnoseinformationen umfassen. Bei Lageinformationen handelt es sich beispielsweise um Angaben, wo auf einer entsprechenden Probe Strukturen von Interesse angeordnet sind. Hierbei kann es sich beispielsweise um die erwähnten Koordinaten entsprechen- der Bereiche handeln, die sich auf einen festen Bezugspunkt auf dem Objektträger (welcher ebenfalls in dem Lasermikrodissektionssystem ausgelesen werden kann) beziehen. Alternativ dazu, und wie beispielsweise in der Figur 4 gezeigt, kann es auch vorgesehen sein, einen Objektträger vollständig mit eindeutigen Bezugspunkten zu versehen, wobei sich die Objektinformationen auf eine über entsprechende Bezugs- punkte definierte Position beziehen.
Damit ist es durch die Bereitstellung von Objektinformationen, die als Lageinformationen bereitgestellt sind, möglich, beispielsweise Koordinaten bezüglich zu dissektieren- der Bereiche zu speichern und diese wieder aufzurufen, wenn ein entsprechender Ob- jektträger erneut in das Lasermikrodissektionssystem eingelegt wird. Dabei kann vorgesehen sein, ein Lasermikrodissektionssystem derart auszubilden, dass ein betreffender Bereich automatisch angefahren werden kann. Wie bereits erwähnt, ist es insbesondere auch möglich, einen Dissektatauffangbehäl- ter, der zum Auffangen eines oder mehrere Dissektate einer entsprechenden Probe dient, erfindungsgemäß zu beschriften. Auf einem entsprechenden Dissektatauffang- behälter können beispielsweise Informationen darüber geschrieben werden, von welchem Bereich einer bestimmten Probe, von welcher Probe und/oder mit welcher Diag- nose entsprechende Dissektate ausgeschnitten wurden. Weitere Informationen können bereitgestellt werden, z.B. ein Befund (aus einer histologischen Untersuchung einer entsprechenden Probe), eine Anzahl und/oder eine Fläche in dem Lasermikrodissektionssystem gewonnener Dissektate. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der verwendete Objektträger bzw. ein entsprechender Dissektatauffang- behälter selbst zum Informationsspeicher. Die genannten Objektinformationen können dabei nach Wunsch sowohl auf den Objektträger als auch auf das Probenauffanggefäß geschrieben werden. Es kann also, mit anderen Worten, vorgesehen sein, die Probeninformationen als Informationen bezüglich eines aus der Probe herausgetrennten o- der herauszutrennenden Dissektats bereitzustellen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es besonders vorteilhaft, wenn die Probeninformationen auf einen laser- und/oder thermosensitiven Bereich des Objektträgers und/oder des Dissektatauffangbehälters geschrieben und/oder von einem solchen Bereich abgelesen werden. Das Verfahren lässt sich jedoch grundsätzlich auch bei Stan- dardobjektträgern anwenden, welche nicht für die Lasermikrodissektion vorbereitet sind. Hierbei kann beispielsweise eine Mikrogravur im Glas bzw. eine Laserbeschriftung einer mittels Deckgläschens eingedeckelten Probe vorgenommen werden. Wird die Probe selbst markiert, werden hierbei beispielsweise geeignete Markierungen in einem Dünnschnitt einer Gewebestruktur und/oder einem Einbettmedium erzeugt.
Beispielsweise kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Objektträger mit einer geeigneten, zur Lasermikrodissektion vorgesehenen Membran beschichtet sein. Ein derartiger Objektträger kann, wie auch unter Bezugnahme auf die Figur 4 erläutert, mit Feldern zur maschinellen und/oder manuellen Beschriftung versehen sein. Als laser- und/oder thermosensitiver Bereich des Objektträgers wird ein Bereich der dissektierba- ren Membran selbst verwendet und/oder es ist ein zusätzlicher Bereich vorgesehen, der entsprechend ausgebildet ist. Ein solcher Bereich ist exklusiv für die Bereitstellung von Probeninformationen während der Lasermikrodissektion vorgesehen und wird nicht für eine mikroskopische Probe verwendet. Zum Schreiben der Objektinformationen kann auch beispielsweise eine Laserleistung verändert werden.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn ein laser- und/oder thermosensitiver Bereich verwendet wird, bei dem sich bei einer Bestrahlung mittels des Laserstrahls wenigstens eine optisch erfassbare Eigenschaft ändert. Neben Lasermikrodissektionsmembranen eignen sich sämtliche laserbeschriftbaren Materialien, wie sie grundsätzlich bekannt sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Verwendung mit einem Lasermikrodissektionssystem, das ein Mikroskop mit einer Auflichteinrichtung aufweist, in der der Laserstrahl unter Verwendung einer Laserscaneinrichtung variabel abgelenkt und in einen Beobachtungsstrahlengang eingekoppelt wird, wobei der Laserstrahl anschließend durch ein Objektiv des Mikroskops in einen Objektbereich fokussiert wird, in dem sich der Objektträger und/oder eine Dissektatauffangeinrichtung mit dem Dissek- tatauffangbehälter befindet. Die Probe ist in einem Lasermikrodissektionssystem dieser Art an einer Seite, in Aufrechtsystemen der Unterseite, eines Objektträgers befestigt und wird durch den Objektträger von dessen anderer Seite aus mit dem Laserstrahl bearbeitet. Der Mikroskoptisch ist in Lasermikrodissektionssystemen mit einer Laserscaneinrichtung bezüglich der x-y-Richtung (also in den Richtungen senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs) beim Heraustrennen des Dissektats, also während des Dissektiervorgangs, feststehend angeordnet. Die Laserscaneinrichtung ist in der Auflichteinrichtung integriert. Im Gegensatz zu Lasermikrodissektionssystemen mit einem während des Dissektiervorgangs motorisch verfahrenen Mikroskoptisch, der insbesondere bei stark vergrößernden Objektiven eine hohe Positioniergenauigkeit besitzen muss, um präzise Schnitte zu ermöglichen, erweisen sich Lasermikrodissektionssys- teme mit einer Laserscaneinrichtung als einfacher und kostengünstiger in der Herstellung und besitzen Präzisionsvorteile. Ferner erscheint einem Betrachter in Lasermikrodissektionssystemen mit einem während des Dissektiervorgangs motorisch verfahrenen Mikroskoptisch das Bild während des Dissektiervorgangs bewegt. Insbesondere störend ist dies, wenn die Betrachtung mit einer vergleichsweise langsamen Kamera und einem Monitor erfolgt. Das Monitorbild verschwimmt in diesem Fall und zeigt ruckartige Veränderungen. Diesen Nachteil zeigen Lasermikrodissektionssysteme mit einer Laserscaneinrichtung hingegen nicht, weil der Mikroskoptisch feststeht. Damit kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch während der Bearbeitung einer Probe durch den verwendeten Laser ein sicheres Auslesen von Probeninformationen erfolgen, weil sich das Bild der Probe nicht bewegt.
Die Laserscaneinrichtung weist in einer besonders vorteilhaften Ausführungsform zwei gegen eine Achse geneigte und unabhängig voneinander um die Achse drehbare Keilprismen auf, welche durch ihre Keilwinkel eine Strahlablenkung erzeugen. Durch die Drehung der Keilprismen ist der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls gegenüber der Achse variabel. Am Ausgang der Laserscaneinrichtung weist der Laserstrahl durch die Dicke und die Schrägstellung der Keilprismen einen seitlichen Strahlversatz gegenüber der optischen Achse auf und trifft für alle Ablenkwinkel die Mitte der Objektivpupille des Mikroskopobjektivs.
Eine derartige Laserscaneinrichtung ist insbesondere deshalb vorteilhaft gegenüber anderen Laserscaneinrichtungen wie beispielsweise Spiegelscannern, Galvanometerscannern oder Schrittmotorscannern, weil diese nicht in einer zu der Objektivpupille konjugierten Ebene angeordnet werden muss. Damit ist auch keine sogenannte Pupil- lenabbildung erforderlich, um zu erreichen, dass der abgelenkte Strahl die Objektivpupille trifft. Bei der Mikrodissektion mit UV-Laserlicht wäre dabei beispielsweise eine UV- taugliche Pupillenabbildung erforderlich. Vorteile einer Laserscaneinrichtung mit Keilprismen sind in der EP 1 276 586 B1 genannt. Anders ausgedrückt geht die vorliegende Erfindung von einem Lasermikrodissektions- system mit einem Mikroskop aus, das eine Auflichteinrichtung, ein Mikroskopobjektiv, eine Laserquelle und eine Laserscaneinrichtung aufweist. Ein Laserstrahl verläuft in diesem Lasermikrodissektionssystem durch die Auflichteinrichtung, durch die in der Auflichteinrichtung angeordnete Laserscaneinrichtung und durch das Mikroskopobjek- tiv und wird durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv zur Bearbeitung einer Probe auf die Probe fokussiert. Das erläuterte Lasermikrodissektionssystem entspricht in seinem grundsätzlichen Aufbau beispielsweise dem in der EP 1 276 586 B1 offenbarten.
Ein erfindungsgemäßes Lasermikrodissektionssystem umfasst Mittel zum Bereitstellen von Probeninformationen, die sich auf eine mikroskopische Probe beziehen. Es umfasst ferner ein Mikroskop mit wenigstens einem Objektiv, eine Lasereinheit, die einen Laserstrahl für die Bearbeitung der mikroskopischen Probe erzeugt, einen motorisier- ten Mikroskoptisch, einen Steuerrechner und eine Informationserfassungseinheit. In dem Lasermikrodissektionssystem ist eine Halterung für einen Objektträger, der mit der Probe auf den Mikroskoptisch aufgelegt wird und/oder einen Dissektatauffangbehälter, in dem ein mittels des Laserstrahls aus der Probe herausgetrenntes Dissektat aufgefangen werden kann, vorgesehen. Das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssys- tem zeichnet sich durch eine Steuereinheit mit Mitteln zum Ausgeben von Ansteuersig- nalen aus, die bewirken, dass die Probeninformationen mittels des Laserstrahls der vorhandenen Lasereinheit auf den Objektträger, die Probe und/oder auf den Dissektatauffangbehälter geschrieben werden und/oder die Probeninformationen mittels der Informationserfassungseinheit von dem Objektträger, der Probe und/oder von dem Dissektatauffangbehälter abgelesen werden.
Das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem ist insbesondere für eine Durchführung eines zuvor erläuterten Verfahrens eingerichtet und verfügt über entsprechende Mittel. Auf die jeweiligen Merkmale und Vorteile wird verwiesen.
Die vorliegende Erfindung und Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert.
Figurenbeschreibung
Figur 1 zeigt ein Lasermikrodissektionssystem gemäß einer Ausführungsform der
Erfindung in schematischer Darstellung. Figur 2 zeigt Details eines Lasermikrodissektionssystems gemäß Figur 1 in schema- tischer Darstellung.
Figur 3 zeigt Details eines Lasermikrodissektionssystems gemäß Figur 1 in schema- tischer Darstellung.
Figur 4 zeigt einen Objektträger für einen Einsatz gemäß einer Ausführungsform der
Erfindung in schematischer Darstellung.
In den Figuren sind einander entsprechende Elemente mit identischen Bezugszeichen angegeben. Diese werden nicht wiederholt erläutert.
Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen
In Figur 1 ist ein Lasermikrodissektionssystem gemäß einer Ausführungsform der Erfindung schematisch dargestellt und insgesamt mit 100 bezeichnet. Das Lasermikrodissektionssystem 100 entspricht in wesentlichen Teilen jenem, das in der EP 1 276 586 B1 offenbart ist, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Das Lasermikrodissektionssystem 100 umfasst ein hier insgesamt mit 1 bezeichnetes Mikroskop. In einem Mikroskopfuß 2 des Mikroskops 1 kann eine nur teilweise dargestellte Beleuchtungseinrichtung 3 vorgesehen sein. Licht der Beleuchtungseinrichtung 3 kann mittels einer Kondensoreinheit 4 beeinflusst werden.
Am Mikroskopfuß 2 kann eine Benutzerinteraktionseinheit 5 angeordnet sein, beispielsweise in Form eines Touchscreens. Mittels der Benutzerinteraktionseinheit 5 kann der Benutzer beispielsweise Betrachtungs- und/oder Bearbeitungsparameter eingeben und/oder auslesen. Die Benutzerinteraktionseinheit 5 kann auch dazu ausgebildet sein, einem Benutzer Informationen im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verfügung zu stellen und/oder zur Eingabe solcher Informationen durch einen Benutzer eingerichtet sein.
Ferner ist ein Triebknopf 6 vorgesehen, der zur Bedienung eines Grob- und eines Feintriebs ausgebildet sein kann. Mittels des Triebknopfs 6 kann ein Mikroskoptisch 7 in seiner Höhe (also in z-Richtung) verstellt werden. Zur horizontalen Verstellung des Mikroskoptischs 7 (also in x- und y-Richtung) können weitere Versteileinrichtungen 8 in bekannter Weise vorgesehen sein. In einem Probenbereich 9 des Lasermikrodissektionssystems 100 bzw. des Mikroskops 1 kann ein Objektträger 10 mit einer auf diesem angebrachten mikroskopischen Probe 1 1 angeordnet werden. Der Objektträger 10 wird dabei typischerweise auf eine ebenfalls in dem Probenbereich 9 angeordnete Dissektatauffangeinrichtung 20 und damit auf den Mikroskoptisch 7 aufgelegt, wie auch nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figuren 2 und 3 noch näher erläutert. Der Mikroskoptisch 7 ist vorzugsweise motorisiert ausgebildet.
Zur Beobachtung der Probe 1 1 sind in einem Objektivrevolver 30 angeordnete Objektive 31 vorgesehen. Bei inversen Lasermikrodissektionssystemen ist die Anordnung der erläuterten Komponenten bekanntermaßen umgekehrt, d.h. die Beleuchtungseinrichtung 12 befindet sich oben, die Objektive 31 unten.
Ein Beobachtungsstrahlengang 32 verläuft durch das jeweils eingeschwenkte Objektiv 31 und eine Tubuseinheit 33 mit Auskoppeleinrichtungen 34. Über einen Okulareinblick 35 kann eine visuelle Betrachtung vorgenommen werden, über eine digitaloptische Erfassungseinheit 36 kann ein elektronisches Mikroskopbild, beispielsweise mittels eines CCD-Chips, erhalten werden.
Zur Lasermikrodissektion verfügt das Mikroskopsystem 100 über eine insgesamt mit 37 bezeichnete Lasereinheit mit einer Laserquelle 38. Ein durch die Laserquelle 38 bereitgestellter Laserstrahl 39 wird in einer Auflichteinheit, die hier insgesamt mit 40 bezeichnet ist, an einem ersten Umlenkelement 41 und einem zweiten Umlenkelement 42 umgelenkt und damit in den Beobachtungsstrahlengang 32 eingekoppelt. Der Laserstrahl 39 kann damit mittels des jeweils eingeschwenkten Objektivs 31 in den Objekt- bereich 9 fokussiert werden.
Bei dem dargestellten Lasermikrodissektionssystem 100 kann die Lage des Fokuspunkts des Laserstrahls 39 in dem Objektbereich 9 grundsätzlich auf unterschiedliche Weise eingestellt werden. Einerseits kann der Mikroskoptisch 7, beispielsweise moto- risch und/oder mittels der Versteileinrichtungen 8, in x- und y-Richtung verfahren werden. Andererseits kann, wie im dargestellten Beispiel, eine Laserscaneinrichtung 43 vorgesehen sein. Mittels der Laserscaneinrichtung 43 kann der Laserstrahl 39 variabel gegenüber einer zwischen der ersten Umlenkeinheit 41 und der zweiten Umlenkeinheit 42 verlaufenden Achse 44 abgelenkt werden. Der Laserstrahl kann daher an unterschiedlichen Positionen auf der zweiten Umlenkeinheit 42 auftreffen, so dass sich die Lage seines Fokuspunkts in dem Objektbereich 9 entsprechend verschiebt. Eine entsprechende Ablen- kung ist im Detail in der EP 1 276 586 B1 gezeigt. Es sei betont, dass auch andere Möglichkeiten zur Ablenkung des Laserstrahls 39 und/oder zur Positionierung einer Probe 1 1 zum Einsatz kommen können.
Im dargestellten Beispiel weist die Laserscaneinrichtung 43 zwei Keilprismen 45 auf, die gegen die Achse 44 geneigt und unabhängig voneinander um diese drehbar sind. Hierzu sind die Keilprismen 45 beispielsweise mit Kugellagern 46 gelagert und über Zahnräder 47 mittels geeigneter Aktoren 48 bewegbar. Die Aktoren 48 können über Positionsgeber 49 verfügen (hier nur am rechten Aktor 48 gezeigt). Eine hierdurch er- fasste Position kann an eine Steuereinheit 50 übermittelt werden. Die Steuereinheit 50 kann durch ein geeignetes Ansteuern der Aktoren 48 die Lage des Fokuspunkts des Laserstrahls 39 in dem Objektbereich 9 einstellen. Zur Eingabe entsprechender Werte, beispielsweise von Schnittlinien zum Heraustrennen von Dissektaten aus der Probe 1 1 mittels des Lasers 39, kann die Benutzerinteraktionseinheit 5 und/oder ein Steuerrechner 51 , der über eine geeignete Kommunikationsstrecke 52 drahtgebunden oder draht- los an die Steuereinheit 50 angebunden ist, eingesetzt werden.
Im Rahmen einer Ausführungsform der Erfindung ist die Steuereinheit 50 insbesondere auch dazu ausgebildet, die Laserscaneinrichtung 43 derart anzusteuern, dass mittels des Lasers 39 Probeninformationen auf den Objektträger 10 und/oder auf ein in der Dissektatauffangeinrichtung 20 angeordneter Dissektatauffangbehälter aufgebracht werden können. Hierzu können ebenfalls Werte mittels der Benutzerinteraktionseinheit 5 und/oder des Steuerrechners 51 vorgegeben werden. lm Rahmen dieser oder einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist ferner eine Informationserfassungseinheit 53 vorgesehen, die beispielsweise dazu eingerichtet sein kann, durch Auswerten der mittels der Bilderfassungseinheit 36 erfassten Daten Probeninformationen auszulesen, die zuvor auf den Objektträger 10 und/oder ein in der Dissektatauffangeinrichtung 20 angeordneter Dissektatauffangbehälter aufgebracht wurden. Die Informationserfassungseinheit 53 kann auch beispielsweise als Barcodescanner ausgebildet sein. Wenngleich die Informationserfassungseinheit 53 hier als Teil der Bilderfassungseinheit 36 veranschaulicht ist, kann sie beispielsweise auch in der Steuereinheit 50 und/oder dem Steuerrechner 51 integriert oder separat ange- ordnet sein. Die Bilderfassungseinheit 36 und die Steuereinheit 50 und/oder der Steuerrechner 51 können dabei über eine geeignete Kommunikationsstrecke drahtgebunden oder drahtlos verbunden sein.
Der Steuerrechner 51 kann auch zur Anzeige mikroskopischer Bilder, die mittels der Bilderfassungseinheit 36 erfasst werden, ausgebildet sein. Es kann sich auch um einen portablen Steuerrechner 51 in Form eines Smartphones und/oder eines Tabletrechners handeln. Auch in letzteren Fällen kann der Steuerrechner 51 beliebige Anzeige- und Ansteuerfunktionen übernehmen. In Figur 2 ist ein Querschnitt durch den Mikroskoptisch 7 mit der darauf angebrachten Dissektatauffangeinrichtung 20 in einer durch die optische Achse des Beobachtungsstrahlengangs 32 und die x-Richtung (senkrecht zur Papierebene der Figur 1 ) aufgespannten Ebene dargestellt. Der Mikroskoptisch 7 weist eine feststehende Basisplatte 7a auf, auf der eine in y- Richtung (also senkrecht zur Papierebene) verfahrbare Platte 7b angeordnet ist. Die verfahrbare Platte 7b definiert eine Tischoberfläche 7c des Mikroskoptischs 7. Die verfahrbare Platte 7b ist gegenüber der feststehenden Basisplatte 7a mittels einer geeigneten Einrichtung, beispielsweise unter Verwendung von Lagerkugeln 7d, verschieb- bar. Zum wechselseitigen Verschieben der feststehenden Basisplatte 7a und der verfahrbaren Platte 7b können die bereits erläuterten Versteileinrichtungen 8 verwendet werden. Ist hier davon die Rede, dass die feststehende Basisplatte 7a„feststeht", bezieht sich dies nur auf ihre Position gegenüber der verfahrbaren Platte 7b. Die„feststehende" Basisplatte 7a kann auch beispielsweise ihrerseits in x-Richtung gegenüber einer weiteren Platte des Mikroskoptischs 7 verschoben und in z-Richtung in ihrer Höhe verstellt werden.
Auf der Tischoberfläche 7c des Mikroskoptischs 7 ist in der Dissektatauffangeinrich- tung 20 ein Dissektatauffangbehälter 21 angeordnet, der ggf. mit einer geeigneten Versteileinrichtung (vgl. Figur 3) verschoben werden kann. Der Dissektatauffangbehälter 21 kann jedoch auch manuell in einem freien Arbeitsraum 22 der Dissektatauffangein- richtung 20 bewegt werden. Bei dem Dissektatauffangbehälter 21 kann es sich auch um den Deckel eines bekannten Deckelgefäßes handeln, der in der Dissektatauffan- geinrichtung 20 eingespannt werden kann.
Die Dissektatauffangeinrichtung 20 weist ein Trägerelement 23 auf, auf das der Objektträger 10 aufgelegt werden kann. Die Probe 1 1 ist an der Unterseite des Objektträgers 10 angebracht. Der Objektträger 10 wird vorteilhafterweise so positioniert, dass sich die Probe 1 1 vollständig in dem freien Arbeitsraum 22 befindet. Eine Höhe 24 des freien Arbeitsraums 22 kann durch Verstellmittel verstellbar ausgebildet und/oder durch Abstandshalter (nicht gezeigt) festgelegt sein.
Das Objektiv 31 ist auf der optischen Achse des Beobachtungsstrahlengangs 32 dem Objektträger 10 zugewandt und erzeugt über eine entsprechende Linsenanordnung (ohne Bezeichnung) ein Bild des Objekts 1 1 . Die Probe 1 1 befindet sich hierzu in der Brennebene des Objektivs 31 .
Ferner kann durch das Objektiv 31 ein wie zu Figur 1 erläutert eingekoppelter Laser- strahl 39 auf die Probe 1 1 fokussiert werden, um aus der Probe 1 1 ein Dissektat herauszutrennen. Der Dissektatauffangbehälter 21 ist derart unter der Probe 1 1 angeordnet, dass das Dissektat durch Schwerkraftwirkung in diesen herabfällt. Ein Dissektat 25 ist in dem Dissektatauffangbehälter 21 dargestellt. Die Anzahl der Dissektatauffangbehälter 21 kann an die jeweiligen Erfordernisse, beispielsweise die Anzahl der zu ge- Winnenden Dissektate 25, angepasst werden.
In Figur 2 ist die Lage des Fokuspunkts des Laserstrahls 39 veranschaulicht, wenn der Laserstrahl 39 zum Heraustrennen eines Dissektats 25 aus einer Probe 1 1 verwendet wird. Figur 3 zeigt hingegen die Lage des Fokuspunkts des Laserstrahls 39, wenn der Laserstrahl 39 zum Schreiben von Objektinformationen auf den Objektträger 10 eingesetzt wird.
Figur 3 zeigt dabei einen der Figur 2 entsprechenden Schnitt durch einen Mikroskop- tisch 7 mit einer darauf angeordneten Dissektatauffangeinrichtung 20 gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung.
In dem dargestellten Beispiel sind an der feststehenden Basisplatte 7a zwei Halteelemente 26, von denen nur das linke Halteelement 26 mit einem Bezugszeichen verse- hen ist, befestigt. Die Halteelemente 26 tragen eine Kontaminationsschutzplatte 27, die zwischen dem Trägerelement 26 und dem Dissektatauffangbehälter 21 feststeht. Der Dissektatauffangbehälter 21 ist hier zusammen mit weiteren Dissektatauffangbehältern in einer Struktur 28, beispielsweise einer Mikrotiterplatte, ausgebildet. Die Kontaminationsschutzplatte 27 überspannt vorteilhafterweise die gesamte Tischoberfläche des Mikroskoptischs 7 und begrenzt damit den freien Arbeitsraum 22 nach oben. Die Kontaminationsschutzplatte 27 ist mit einem Ausschnitt 29 ausgebildet, damit ein Dissektat 25 in den jeweils gewünschten Dissektatauffangbehälter 21 fallen kann.
Jeweils ein Dissektatauffangbehälter 21 der Struktur 28, beispielsweise jeweils eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte, kann unterhalb des Ausschnitts 29 angeordnet werden. Durch die Kontaminationsschutzplatte 27 wird verhindert, dass Staub oder andere Partikel aus der Umgebungsluft in die Dissektatauffangbehälter 21 fallen. Ferner wird verhindert, dass Dissektate 25 in einen„falschen" Dissektatauffangbehälter 21 fallen. Eine Versteileinrichtung 7d kann Teil einer Versteileinrichtung zur Verstellung des Mikroskoptischs 7 sein und/oder separat hierzu ausgebildet sein. Die Versteileinrichtung 7d kann Eingriffsmittel 7e aufweisen, die mit dem Dissektatauffangbehälter 21 bzw. einer entsprechenden Struktur 28 verbunden werden können. Die Versteileinrichtung 7d kann manuell bedient werden, weist vorzugsweise jedoch einen entsprechenden Motor auf. Die Versteileinrichtung 7d ist hierzu über eine entsprechende Verbindung 7f mit einer Steuereinheit, beispielsweise dem erläuterten Steuerrechner 51 , verbunden. Zu weiteren Ausgestaltungen der in den Figuren 2 und 3 dargestellten Ausführungsformen sei insbesondere auf die DE 100 18 251 C1 verwiesen, auf die hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Wie erwähnt, ist in Figur 3 die Lage des Fokuspunkts des Laserstrahls 39 veranschaulicht, wenn der Laserstrahl 39 zum Aufbringen von Objektinformationen auf den Objektträger 10 eingesetzt wird. Der Fokuspunkt des Laserstrahls 39 befindet sich hierbei außerhalb eines Bereichs eines Objekts 1 1 und in einem lasersensitiven Bereich des Objektträgers 10, wie er in Figur 4 veranschaulicht ist. Wird der Laserstrahl 39 hinge- gen zum Aufbringen von Objektinformationen auf dem Dissektatauffangbehälter 21 eingesetzt, wird die Lage seines Fokuspunkts entsprechend auf die Oberfläche des Dissektatauffangbehälters 21 eingestellt. Hierzu werden vorteilhafterweise Objektive 31 mit großem Arbeitsabstand eingesetzt. Figur 4 zeigt einen Objektträger 10 für einen Einsatz gemäß einer Ausführungsform der Erfindung in schematischer Darstellung.
Auf den Objektträger 10 ist im dargestellten Beispiel eine mikroskopische Probe 1 1 aufgebracht. Die mikroskopische Probe 1 1 befindet sich in einem Bereich 12 des Ob- jektträgers 10, der zur Untersuchung und/oder Bearbeitung im einem Lasermikro- dissektionssystem vorgesehen ist. Ein entsprechender Bereich 12 ist beispielsweise mit einer mikrodissektierbaren Membran bespannt. Im dargestellten Beispiel ist der Bereich 12 ferner mit eindeutigen Lageinformationen versehen, wie an einem Ausschnitt 14 des Bereichs 12 veranschaulicht. In dem Bereich 12 sind, wie in dem Aus- schnitt 14 ersichtlich, zwei Bezugspunktnetze dargestellt, die jeweils Bezugspunkte A bis Z, 1 bis 24, a bis j und α bis κ aufweisen. In dem Bereich 12 kann ein beliebiger Teilbereich 14 betrachtet werden. Das Bezugspunktnetz mit den Bezugspunkten A bis Z, 1 bis 24, a bis j und α bis κ ist in einer vergrößerten Darstellung im rechten Teil der Figur 4 sichtbar.
Wie aus der Figur 4 ersichtlich, kann der Bereich 14 des Probenbereichs 12 eindeutig durch die Bezugspunkte G, 4 und H des Bezugspunktnetzes identifiziert werden. Diese sind in der dargestellten Dreifachkombination lediglich an einer einzigen Position des Objektträgers 10 bzw. seines Bereichs 12 vorhanden. Dies ermöglicht eine eindeutige Positionsbestimmung. Die Bezugspunkte A bis Z, 1 bis 24, a bis j, α bis κ können auch derart ausgebildet sein, dass sie nur unter bestimmten Betrachtungsbedingungen, beispielsweise bei UV-Licht oder Licht einer bestimmten Wellenlänge, sichtbar sind. Der gesamte Teilbereich 14 ist dabei eindeutig auf dem Objektträger 10 lokalisiert. In der dargestellten Ausführungsform der Figur 4 sind die Bezugspunkte A bis Z und 1 bis 24 einer Vergrößerungsstufe mit geringer Vergrößerung zugeordnet. Wenn ein entsprechender beliebiger Teilbereich 14 mittels dieses Bezugspunktnetzes lokalisiert wurde, kann eine höher aufgelöste Positionsbestimmung mittels des Bezugspunktnet- zes der nächstniedrigeren Ordnung bei höherer Vergrößerung erfolgen, wie im rechten Teil der Figur 4 dargestellt. Ein hier mit einem Stern markierter Probenbereich bzw. eine entsprechende, durch einen Betrachter vorgenommene Markierung, ist in dem Bezugspunktnetz 15 der nächstniedrigeren Ordnung durch die Bezugspunkte e, d, δ und f lokalisierbar.
Der mit dem Stern markierte Bereich der Probe bzw. die entsprechende, durch einen Betrachter vorgenommene Markierung, ist damit insgesamt in dem Bereich 12 eindeutig über zwei Bezugspunktnetze lokalisiert. Die jeweils höher aufgelösten Bezugspunkte eines Bezugspunktnetzes können sich dabei selbstverständlich innerhalb eines ge- ringer aufgelösten Bezugspunktnetzes wiederholen, solange eine eindeutige Identifizierung möglich ist.
Der Objektträger 10 kann ferner einen durch einen Benutzer oder eine maschinelle Einrichtung beschriftbaren Bereich 13 umfassen, wie insoweit bekannt.
Erfindungsgemäß weist der Objektträger 10 einen temperatur- und/oder lasersensitiven Bereich 16 auf, der wiederum Teilbereiche 17 und 18, die beispielsweise unterschiedlichen Vergrößerungsstufen zugeordnet sein können, umfassen kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist dargestellt, wie in dem Bereich 16 bzw. den Teilbereichen 17 und 18 entsprechende Bezugspunktinformationen hinterlegt werden können. Beispielsweise kann in einem für eine höhere Vergrößerung eingerichteten Teilbereich 17 des Bereichs 16 der durch die Bezugspunkte G, 4 und H definierte Ort als Objektinformation (Lageinformationen bzw. Bezugspunktinformationen) hinterlegt werden. Dies kann, wie dargestellt, beispielsweise mittels eines 2D-Barcodes und/oder in Form al- phanumerischer Zeichenketten erfolgen. Neben Bezugspunktinformationen können auch andere Informationen, beispielsweise Diagnose- oder Patienteninformationen, hinterlegt werden. In einem für höhere Vergrößerung eingerichteten Teilbereich 18 des Bereichs 16 kann entsprechend eine Positionsinformation bezüglich des höher aufgelösten Bezugspunktnetzes hinterlegt werden, beispielsweise ebenfalls in Form eines Barcodes und/oder in Form alphanumerischer Zeichenketten. Der Bereich 16 kann dabei eine Vielzahl von Teilbereichen umfassen, die für unterschiedliche Informationen, unter- schiedliche Vergrößerungsstufen und/oder unterschiedliche Markierungsmöglichkeiten reserviert sein können.
Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung nicht nur mit einem Objektträger 10 mit einem Bezugspunktnetz, wie es in der Figur 4 veranschaulicht ist, verwendet wer- den kann. Vielmehr ist es beispielsweise auch möglich, in einem Bereich 16 Koordinateninformationen, die sich auf einen festen Bezugspunkt auf einem Objektträger 10 beziehen, zu hinterlegen. Wie erwähnt, können beliebige Informationen auf einen Objektträger aufgebracht und/oder von diesem abgelesen werden.
Bezugszeichenliste
100 Lasermikrodissektionssystem
1 Mikroskop
2 Mikroskopfuß
3 Beleuchtungseinrichtung
4 Kondensoreinheit
5 Benutzerinteraktionseinheit
6 Triebknopf
7 Mikroskoptisch
7a Basisplatte
7b verfahrbare Platte
7c Tischoberfläche
7d Versteileinrichtung
7e Eingriffsmittel
7f Verbindung
8 Versteileinrichtung
9 Probenbereich
10 Objektträger
1 1 Probe
12 Proben bereich
13 manuell beschriftbarer Bereich
14 Teilbereich des Probenbereichs
15 Bezugspunktnetz
16 temperatur- und/oder lasersensitiver Bereich
17 Teilbereich des temperatur- und/oder lasersensitiven Bereichs
18 Teilbereich des temperatur- und/oder lasersensitiven Bereichs
20 Dissektatauffangeinrichtung
21 Dissektatauffangbehälter
22 freier Arbeitsraum
23 Trägerelement
24 Höhe
25 Dissektat
26 Halteelement 27 Kontaminationsschutzplatte
28 Struktur
29 Ausschnitt
30 Objektivrevolver
31 Objektive
32 Beobachtungsstrahlengang
33 Tubuseinheit
34 Auskoppeleinrichtungen
35 Okulareinblick
36 Erfassungseinheit
37 Lasereinheit
38 Laserquelle
39 Laserstrahl
40 Auflichteinheit
41 erstes Umlenkelement
42 zweites Umlenkelement
43 Laserscaneinrichtung
44 Achse
45 Keilprisma
46 Kugellager
47 Zahnrad
48 Aktor
49 Positionsgeber
50 Steuereinheit
51 Steuerrechner
52 Kommunikationsstrecke
53 Informationserfassungseinheit

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zum Bereitstellen von Probeninformationen (19), die sich auf eine mikroskopische Probe (1 1 ) beziehen, unter Verwendung eines Lasermikrodissektions- Systems (100), welches ein Mikroskop (1 ) mit wenigstens einem Objektiv (31 ), eine
Lasereinheit (37), die einen Laserstrahl (39) zur Bearbeitung der mikroskopischen Probe (1 1 ) erzeugt, einen motorisierten Mikroskoptisch (7), einen Steuerrechner (51 ) und eine Informationserfassungseinheit (53) aufweist, wobei ein Objektträger (10) mit der Probe (1 1 ) auf den Mikroskoptisch (7) aufgelegt und/oder ein Dissektatauffangbehälter (21 ), in dem ein mittels des Laserstrahls (39) aus der Probe (1 1 ) herausgetrenntes Dissektat (25) aufgefangen werden kann, in dem Lasermikrodissektionssystem (100) angeordnet wird,
dadurch gekennzeichnet, dass die Probeninformationen (19) mittels des Laserstrahls (39) der vorhandenen Lasereinheit (37) auf den Objektträger (10) , auf die Probe (1 1 ) und/oder auf den Dissektatauffangbehälter (21 ) geschrieben werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem die Probeninformationen (19) mittels der Informationserfassungseinheit (53) von dem Objektträger (10), von der Probe (1 1 ) und/oder von dem Dissektatauffangbehälter (1 1 ) abgelesen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Probeninformationen (19) geschrieben und/oder abgelesen werden, während der Objektträger (10) auf dem Mikroskoptisch (7) aufgelegt und/oder der Dissektatauffangbehälter (21 ) in dem Lasermikrodissektionssystem angeordnet ist.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem jeweils eine Position des Objektträgers (10) und/oder des Dissektatauffangbehälters (21 ) relativ zu einem Bezugspunkt in dem Lasermikrodissektionssystem (100) bestimmt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem auf dem Objektträger (10) und/oder dem Dissektatauffangbehälter (21 ) ein oder mehrere zu beschreibende und/oder abzulesende Bereiche (16) bestimmt und als Koordinaten relativ zu dem Bezugspunkt in dem Lasermikrodissektionssystem (100) gespeichert werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem anhand der Koordinaten der oder die zu beschreibenden und/oder abzulesenden Bereiche (16) mittels des Mikroskoptisches erneut angefahren werden und die Probeninformationen (19) nach dem erneuten Anfahren geschrieben und/oder abgelesen werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das erneute Anfahren sowie das Schreiben und/oder das Ablesen der Probeninformationen (19) während einer laufenden Bearbeitung und/oder Betrachtung derselben Probe (1 1 ) mittels des Mikroskops (1 ) des Lasermikrodissektionssystems (100) erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Probe (1 1 ) nach dem erneuten Anfahren des oder der zu beschreibenden und/oder abzulesenden Bereiche (16) mittels der geschriebenen oder ausgelesenen Probeninformationen (19) gekennzeichnet und/oder auf dieser Grundlage identifiziert wird.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Probeninformationen (19) von einem Benutzer über eine Benutzerinteraktionseinheit (5) und/oder über einen Steuerrechner (51 ) eingegeben werden.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Probeninformationen (19) in Form alphanumerischer und/oder ein- und/oder zweidimensionaler binärer Codes und/oder in verschlüsselter Form geschrieben werden.
1 1 . Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Probeninfor- mationen (19) zumindest Lageinformationen, Herkunftsinformationen und/oder Diagnoseinformationen umfassen.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Probeninformationen (19) Informationen bezüglich eines aus der Probe (1 1 ) herausgetrennten oder herauszutrennenden Dissektats (25) umfassen.
13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Probeninformationen (19) auf einen laser- und/oder thermosensitiven Bereich (16) des Objektträgers (10) und/oder des Dissektatauffangbehälters (21 ) geschrieben und/oder von einem solchen Bereich (16) abgelesen werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem ein laser- und/oder thermosensitiver Bereich (16) verwendet wird, bei dem sich bei einer Bestrahlung mittels des Laserstrahls (39) wenigstens eine optisch erfassbare Eigenschaft ändert.
15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem ein Lasermikro- dissektionssystem (100) verwendet wird, das ein Mikroskop (1 ) mit einer Auflichteinrichtung (40) aufweist, in der der Laserstrahl (39) unter Verwendung einer Laserscaneinrichtung (43) variabel abgelenkt und in einen Beobachtungsstrahlengang (32) eingekoppelt wird, wobei der Laserstrahl (39) durch ein Objektiv (31 ) des Mikroskops (1 ) in einen Objektbereich (9) fokussiert wird, in dem sich der Objektträger (10) und/oder eine Dissektatauffangeinrichtung (20) mit dem Dissektatauffangbehälter (21 ) befindet.
16. Lasermikrodissektionssystem (100) mit Mitteln zum Bereitstellen von Probeninformationen (19), die sich auf eine mikroskopische Probe (1 1 ) beziehen, mit einem Mikroskop (1 ) mit wenigstens einem Objektiv (31 ), einer Lasereinheit (37), die einen Laserstrahl (39) für die Bearbeitung der mikroskopischen Probe (1 1 ) erzeugt, einem motorisierten Mikroskoptisch (7), einem Steuerrechner (51 ) und einer Informationserfassungseinheit (53), wobei in dem Lasermikrodissektionssystem (100) eine Halterung für einen Objektträger (10), der mit der Probe (1 1 ) auf den Mikroskoptisch (7) aufgelegt wird und/oder einen Dissektatauffangbehälter (21 ), in dem ein mittels des Laserstrahls (39) aus der Probe (1 1 ) herausgetrenntes Dissektat (25) aufgefangen werden kann, vorgesehen ist,
gekennzeichnet durch eine Steuereinheit (50) mit Mitteln zum Ausgeben von Ansteuersignalen, die bewirken, dass die Probeninformationen (19) mittels des Laser- Strahls (39) der vorhandenen Lasereinheit (37) auf den Objektträger (10), auf die Probe (1 1 ) und/oder auf den Dissektatauffangbehälter (21 ) geschrieben werden.
17. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 16, bei dem die Ansteuer- Signale bewirken, dass die Probeninformationen (19) mittels der Informationserfassungseinheit (53) von dem Objektträger (10), von der Probe (1 1 ) und/oder von dem Dissektatauffangbehälter (1 1 ) abgelesen werden.
18. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 16, das zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 eingerichtet ist.
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