DE102006009564A1

DE102006009564A1 - Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls und entsprechende Vorrichtung

Info

Publication number: DE102006009564A1
Application number: DE200610009564
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr. SÄGMÜLLER
Original assignee: PALM Microlaser Technologies GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2006-02-28
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2026-03-01
Also published as: DE102006009564B4; EP1989527A1; WO2007098825A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls sowie eine entsprechend ausgestaltete Vorrichtung. Das Verfahren beruht darauf, eine Abbildung zumindest eines Teils der Masse zu erzeugen, die Abbildung auszuwerten, um darin mindestens ein Objekt (30, 42, 46) der Masse auszuwählen und die Masse durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl zu schneiden, um das ausgewählte Objekt (30, 42, 46) von der Masse zu separieren und/oder das ausgewählte Objekt (30, 42, 46) von der Masse zu einer Auffangvorrichtung zu transferieren, wobei das Erzeugen der Abbildung und/oder das Schneiden der Masse mittels eines optischen Objektivs (18) erfolgt. Um die Genauigkeit des Verfahrens zu verbessern, ist dabei vorgesehen, das optische Objektiv automatisch abhängig von der zum Auswerten der Abbildung oder zum Schneiden der Masse erforderlichen Genauigkeit zu wechseln. Dabei können insbesondere Schnittlinien (S) um das ausgewählte Objekt (30, 42, 46) herum erzeugt werden, die mittels unterschiedlich vergrößernder optischer Objektive erzeugt wurden und somit unterschiedliche Schnittbreiten aufweisen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bearbeitung einer Masse, insbesondere einer biologischen Masse, mittels eines Laserstrahls sowie eine entsprechend ausgestaltete Vorrichtung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur effektiveren Bearbeitung, Separierung und/oder Gewinnung von mikroskopisch kleinen biologischen und/oder nicht biologischen Objekten aus einer Masse und eine zu diesem Zweck ausgestaltete Vorrichtung.
Für eine Vielzahl von biologischen Untersuchungen ist es erforderlich, einzelne Zellen, Zellkolonien, Zellbestandteile oder vergleichbare Strukturen aus einer Masse, wie zum Beispiel einem Zellverband, einem Gewebe oder einem histologischen Gewebepräparat, herauszupräparieren. Dies kann beispielsweise mit mechanischen Mikrowerkzeugen z.B. Mikrokapillaren oder Mikronadeln, erfolgen. Eine solche Vorgehensweise ist jedoch mühsam und es besteht eine Kontaminationsgefahr für die herausgelösten Objekte. Ferner bestehen bei einem solchen Verfahren Probleme hinsichtlich der Präzision, Automatisierbarkeit und Reproduzierbarkeit.
In der WO 97/29355 A der Anmelderin wurde daher ein neuartiges Verfahren zum Sortieren und zur Gewinnung von einzelnen biologischen Objekten vorgeschlagen. Für dieses Verfahren ist die biologische Masse, aus welcher die Objekte gewonnen werden, auf einem Träger angeordnet. Ein ausgewähltes biologisches Objekt wird von der umgebenden weiteren biologischen Masse durch einen Laserstrahl abgetrennt, so dass das ausgewählte biologische Objekt von der weiteren biologischen Masse freipräpariert ist. Das somit freipräparierte biologische Objekt wird anschließend mit Hilfe eines Laserschusses durch einen katapultierartigen Vorgang von dem Träger zu einer Auffangvorrichtung transferiert, wobei es sich bei dieser Auffangvorrichtung beispielsweise um ein Auffangsubstrat handeln kann. Als Träger der biologischen Masse kann beispielsweise eine Polymerfolie verwendet werden.
Ein zu separierendes biologisches Objekt einer auf dem Träger aufgebrachten biologischen Masse wird somit zunächst ausgewählt, dann aus der biologischen Masse ausgeschnitten und anschließend durch einen Laser-induzierten Transportprozess zu der Auffangvorrichtung transferiert. Unter „biologischen Objekten" werden im Rahmen der vorliegenden Anmeldung vor allem lebende oder fixierte biologische Zellen, Zellbestandteile oder Zellkolonien verstanden, welche in einem flüssigen oder festen biologischen Material, wie zum Beispiel einem Zellgewebe, einem Abstrich, einer Zellkultur oder dergleichen enthalten sind.
Mit Hilfe des zuvor beschriebenen Verfahrens können bestimmte Objekte aus einer biologischen Masse gezielt herausgelöst oder ausgesondert werden. Die biologischen Objekte können nebeneinander auf einem festen planaren Träger aufgebracht sein, wobei der Vorgang des Herauslösens oder Aussonderns innerhalb kurzer Zeit und berührungslos durchgeführt werden kann. Die Überlebensfähigkeit und Morphologie der biologischen Objekte bleibt erhalten, d.h. die biologischen Objekte werden durch den Abtrennprozess und den Laser-induzierten Transportprozess nicht geschädigt oder beeinträchtigt.
Bei dem zuvor genannten Verfahren erfolgt die Bearbeitung der biologischen Masse allgemein derart, dass zunächst eine Abbildung der biologischen Masse erzeugt wird und darin das zu separierende Objekt oder die zu separierenden Objekte ausgewählt werden. Zu diesem Zweck wird eine Mikroskopanordnung verwendet, welche mittels eines vergrößernden optischen Objektivs die Abbildung der Masse erzeugt. Bei der anschließenden Bearbeitung der Masse mittels des Laserstrahls sowie für das Transferieren des Objekts von der Masse zu der Auffangvorrichtung wird der Laserstrahl durch das optische Objektiv auf die Masse gerichtet. Die Positionierung des Laserstrahls auf der Masse erfolgt durch eine entsprechende relative Bewegung des Trägers, auf welchem sich die Masse befindet, und des Objektivs. Es wird somit für das Erzeugen der Abbildung, das Schneiden der Masse sowie für das Transferieren des Objekts dasselbe optische Objektiv verwendet.
Die Verwendung desselben optischen Objektivs für das Erzeugen der Abbildung, für das Schneiden der Masse sowie zum Transferieren des Objekts ist jedoch mit bestimmten Problemen verknüpft. Beispielsweise können Probleme auftreten, wenn zur Identifizierung des Objekts ein optisches Objektiv benötigt wird, welches eine geringe Vergrößerung aufweist, damit beispielsweise die Gesamtstruktur und das Umfeld des Objekts sicher erkannt werden können, das Objekt jedoch im Anschluss mit einer hohen Präzision auszuschneiden ist, da es beispielsweise sehr nahe an weiteren Objekten liegt, die bei dem Ausschneidevorgang von der Schnittlinie nicht berührt werden dürfen. Weiterhin können Probleme bestehen, wenn Objekte identifiziert und zum anschließenden Separieren ausgewählt werden, die nur eine sehr geringe Größe aufweisen, so dass ein zuverlässiges Ausschneiden und/oder Transferieren des Objekts nicht möglich ist. Schließlich ist es auch möglich, dass mit dem optischen Objektiv eine zuverlässige Identifikation von Objekten nicht möglich ist, weil beispielsweise bestimmte Strukturen mit der vorgegebenen Vergrößerung nicht erkennbar sind.
Angesichts der oben genannten Probleme liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls sowie eine entsprechend ausgestaltete Vorrichtung zu schaffen, welches eine verbesserte Genauigkeit, eine höhere Zuverlässigkeit und eine hohe Flexibilität hinsichtlich der Art und Struktur der zu separierenden Objekte bietet.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 sowie durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 12. Die abhängigen Patentansprüche definieren bevorzugte oder vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls umfasst einen Schritt zum Erzeugen einer Abbildung zumindest eines Teils der Masse, ein Auswerten der Abbildung, um darin mindestens ein Objekt der Masse auszuwählen, ein Schneiden der Masse durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl, um das ausgewählte Objekt von der Masse zu separieren, und/oder ein Transferieren des ausgewählten Objekts von der Masse zu einer Auffangvorrichtung, wobei das Erzeugen der Abbildung und/oder das Schneiden der Masse mittels eines optischen Objektivs erfolgt. Erfindungsgemäß umfasst das Verfahren darüber hinaus einen Schritt zum automatischen Wechseln des optischen Objektivs abhängig von der zum Auswerten der Abbildung oder zum Schneiden der Masse erforderlichen Genauigkeit.
Auf diese Weise wird erreicht, dass die Vergrößerung des optischen Objektivs auf vorteilhafte Weise an die Erfordernisse des jeweils durchgeführten Verfahrensschritts angepasst werden kann. So ist es beispielsweise möglich, zunächst mit einer geringen Vergrößerung eine Übersichtsabbildung der biologischen Masse zu erzeugen, um dann anschließend mit einer höheren Vergrößerung Objekte in der Masse zu identifizieren und durch Laserbestrahlung von der Masse zu separieren. Weiterhin ist es möglich, wenn das ausgewählte Objekt sich eng benachbart zu einem weiteren Objekt oder einem Bereich befindet, welcher durch die Schnittlinie beim Ausschneiden des ausgewählten Objekts nicht beschädigt oder anderweitig beeinträchtigt werden soll, für den Vorgang des Schneidens der Masse auf ein optisches Objektiv mit einer höheren Vergrößerung zu wechseln, so dass eine genauere Positionierung und stärkere Fokussierung des Laserstrahls während des Schneidevorgangs erfolgen kann. Gleichzeitig ist es in unkritischen Bereichen der Schnittlinie, d.h. wenn sich in der Nähe der Schnittlinie keine solchen weiteren Objekte oder Bereiche befinden, auf ein optisches Objektiv mit einer geringeren Vergrößerung zu wechseln, so dass eine erhöhte Schnittgeschwindigkeit erreicht werden kann. Folglich kann die Schnittlinie, welche das ausgewählte Objekt vorzugsweise annähernd vollständig oder vollständig umschließt, Abschnitte aufweisen, welche mittels unterschiedlich vergrößernder optischer Objektive erzeugt wurden und somit eine unterschiedliche „Schnittgenauigkeit" aufweisen.
Das Auswerten der Abbildung kann automatisiert oder manuell durch den Benutzer erfolgen, wobei in dem Fall, dass der erzeugten Abbildung die zum Auswerten erforderliche Genauigkeit fehlt, von einer Bildverarbeitungseinrichtung oder von dem Benutzer entsprechend ein automatischer Wechsel des optischen Objektivs veranlasst wird. Anschließend wird erneut eine Abbildung mit einer höheren Vergrößerung erzeugt, und daran eine erneute oder ergänzende Auswertung vorgenommen. Diese Vorgänge können wiederholt werden, bis die erforderliche Genauigkeit, insbesondere im Hinblick auf die im Anschluss durchzuführenden Laser-Bearbeitungsschritte, erreicht ist.
Nach dem Auswerten der Abbildung oder der Abbildungen kann ein automatischer Wechsel des optischen Objektivs auf die zum Schneiden der Masse geeignete Vergrößerung erfolgen. Darüber hinaus können auch abhängig von der zum Schneiden der Masse erforderlichen Genauigkeit während des Schneidevorgangs automatische Wechsel des optischen Objektivs vorgenommen werden. In diesem Zusammenhang ist es zum einen möglich, die verschiedenen Abschnitte der Schnittlinie entsprechend ihrer Reihenfolge entlang der Schnittlinie zu erzeugen, wobei an den Übergängen zwischen den verschiedenen Abschnitten der Schnittlinien jeweils ein entsprechender automatischer Wechsel des optischen Objektivs erfolgt.
Weiterhin ist es möglich, zunächst die zu einem optischen Objektiv mit einer bestimmten Vergrößerung gehörenden Abschnitte der Schnittlinie zu erzeugen, dann einen automatischen Wechsel des optischen Objektivs vorzunehmen, und anschließend die zum nunmehr verwendeten optischen Objektiv gehörenden Abschnitte der Schnittlinie zu erzeugen, und so weiter. In dem letzteren Fall kann die Anzahl von erforderlichen Objektivwechseln verringert werden.
Darüber hinaus ist es auch vorteilhaft, einen automatischen Wechsel des optischen Objektivs abhängig von der zum Transferieren des Objekts erforderlichen Genauigkeit vorzunehmen. So kann beispielsweise zum Transferieren eines Objekts mit nur geringer Größe ein optisches Objektiv mit einer hohen Vergrößerung verwendet werden. Umgekehrt kann für ein vergleichsweise großes Objekt ein optisches Objektiv mit einer geringen Vergrößerung verwendet werden.
Zum Transferieren des ausgewählten Objekts wird vorzugsweise der Laserstrahl durch das jeweils ausgewählte optische Objektiv auf das Objekt gerichtet, und durch Aktivieren des Laserstrahls für eine vorgegebene Zeitdauer wird das ausgewählte Objekt zu der Auffangvorrichtung transferiert. Die Eigenschaften des Laserstrahls, z.B. Leistung oder Pulsfrequenz, werden vorzugsweise abhängig von dem zur Durchführung des Transferiervorgangs ausgewählten optischen Objektivs angepasst.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls umfasst eine Laserlichtquelle zum Erzeugen eines Laserstrahls, um durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl die Masse zu schneiden und/oder ein Objekt der Masse zu einer Auffangvorrichtung zu transferieren, und Abbildungsmittel zum Erzeugen einer Abbildung zumindest eines Teils der Masse, wobei zum Erzeugen der Abbildung und zum Richten des Laserstrahls auf die Masse ein optisches Objektiv vorgesehen ist. Erfindungsgemäß umfasst die Vorrichtung mindestens ein weiteres optisches Objektiv und Mittel zum automatischen Wechsel des optischen Objektivs abhängig von der Genauigkeit, welche zum Auswerten der Abbildung, um darin das Objekt auszuwählen, und/oder zum Schneiden der Masse, um das Objekt von der Masse zu separieren, erforderlich ist.
Die Vorrichtung ist vorzugsweise zur Durchführung des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens ausgestaltet.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
1 zeigt einen prinzipiellen Aufbau einer Vorrichtung zur Realisierung der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt beispielhaft eine Abbildung einer biologischen Masse.
3 zeigt ein Ablaufdiagramm für ein Verfahren gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
4 zeigt einen Ausschnitt einer Abbildung der Masse, bei welcher eine Schnittlinie mit Abschnitten unterschiedlicher Genauigkeit erzeugt wird, um ein Objekt von der Masse zu separieren.
5 zeigt einen Ausschnitt einer weiteren Abbildung der Masse, bei welcher Schnittlinien mit erhöhter Genauigkeit erzeugt werden, um weitere Objekte von der Masse zu separieren.
1 zeigt schematisch den Aufbau eines Laser-Mikroskop-Systems oder Laser-Mikrodissektionssystems, welches zur Implementierung der vorliegenden Erfindung ausgestaltet ist. Das System ist modular aufgebaut und kann somit an unterschiedliche experimentelle Anforderungen individuell angepasst werden. Bei dem dargestellten Laser-Mikroskop-System handelt es sich insbesondere um ein inverses Laser-Mikrodissektionssystem zum Separieren, d.h. Herauslösen von biologischen Objekten, z.B. einzelnen Zellen, Zellkolonien oder Zellbestandteilen, aus einem biologischen Material bzw. Präparat, wobei die Erfindung jedoch selbstverständlich nicht auf diese bevorzugte Ausgestaltung beschränkt ist. Die Erfindung kann beispielsweise auch mit aufrechten Laser-Mikroskop-Systemen oder bei der Bearbeitung nichtbiologischer Materialien angewendet werden.
Wesentlicher Bestandteil des in 1 dargestellten Systems ist eine Laservorrichtung 4, in der eine Laserlichtquelle zur Erzeugung eines Laserstrahls untergebracht ist. Des Weiteren ist in der Laservorrichtung 4 eine Optik 5, 6 untergebracht, welche dazu dient, den Laserstrahl in ein Mikroskop 1 einzukoppeln und den Laserfokus in der Objektebene auf den optischen Fokus des Mikroskops 1 abzustimmen. Im vorliegenden Fall handelt es sich um einen gepulsten UV- Stickstofflaser, dessen Wellenlänge z.B. 300 nm und dessen Pulsenergie z.B. 270 mJ beträgt. Die Pulsdauer beträgt z.B. 3 ms, während die Pulsfrequenz zwischen 1–1000 Impulse pro Sekunde einstellbar ist. Vorzugsweise wird eine Pulsfrequenz um 100 verwendet.
Der Stickstofflaser emittiert einen Laserstrahl mit einer festen Laserenergie. Für eine präzise Laser-Mikromanipulation und Laser-Mikrodissektion ist eine genaue Einstellbarkeit der Laserenergie erforderlich. Aus diesem Grund ist ein Abschwächerrad 5 senkrecht zum Laserstrahlpfad angeordnet. Dieses Abschwächerrad wird von einem Gleichstrommotor gedreht, welcher über einen Potentiometerknopf (nicht dargestellt) gesteuert werden kann, um somit die Laserenergie entsprechend einzustellen.
Neben der Einstellung der Laserenergie kann auch der Laserfokus unabhängig von dem Mikroskopfokus eingestellt werden, d.h. der Brennpunkt des Lasers kann in z-Richtung relativ zur Objektebene des Mikroskops 1 verschoben werden. Zu diesem Zweck ist ein Schrittmotor vorgesehen, der die in 1 gezeigten Linsen 6 bewegt. Die Fokussierung bzw. der Schrittmotor kann wiederum durch einen Potentiometerknopf gesteuert werden. Weiterhin ist auch eine automatisierte Fokussierung vorgesehen.
Der Laserstrahl wird über mehrere beschichtete Strahlteiler in das Mikroskop 1 eingekoppelt und zu einem optischen Objektiv 18 hin abgelenkt. Der Durchmesser des auf der Objektebene auftretenden Laserstrahls ist maßgeblich von der numerischen Apertur des Objektivs 18 abhängig. Ein Objektiv mit einer relativ hohen numerischen Apertur ermöglicht Laserstrahldurchmesser von weniger als 1 μm.
Das in 1 dargestellte Laser-Mikroskopsystem ist mit einem Mechanismus zum automatischen Wechsel des Objektivs 18 ausgestaltet. Dabei kann es sich insbesondere um einen Revolvermechanismus handeln, wobei selbstverständlich auch andere Mechanismen zum automatischen Wechsel des Objektivs 18 verwendet werden können. Insbesondere sind automatisch auswechselbare Objektive 18 mit Vergrößerungen von 2x, 5x, 10x, 20x, 40x, 63x und 100x vorgesehen. Diese Objektive 18 sind derart ausgestaltet, dass sie einen hohe Durchlässigkeit für die verwendete Laserwellenlänge aufweisen, so dass Energieverluste minimiert werden.
Der durch das Objektiv 18 geführte Laserstrahl trifft schließlich auf einen motorisierten und computergesteuerten Mikroskop- oder Trägertisch 3, auf dem ein Objektträgermittel mit einer zu bearbeitenden biologischen Masse angeordnet ist. Oberhalb des Trägertisches 3 befindet sich eine ebenfalls motorisierte und computergesteuerte Auffangvorrichtung 2. Der Mikroskoptisch 3 und die Auffangvorrichtung 2 ermöglichen eine exakte Positionierung mit einer Präzision im Nanometerbereich sowie eine automatische Durchführung von Mikromanipulationsvorgängen.
Der motorisierte Mikroskoptisch 3 ist entlang zweier linearer Achse (x- und y-Richtung) verfahrbar. Zu diesem Zweck sind vorzugsweise Schrittmotoren vorgesehen, so dass typischerweise eine minimale Schrittgröße von 20 nm gewährleistet wird. Das auf dem Trägertisch 3 befindliche Objektträgermittel kann somit mit sehr hoher Genautigkeit relativ zu der optischen Achse des Objektivs 18 positioniert werden.
Die Auffangvorrichtung 2 dient dazu, von dem Trägertisch 3 bzw. dem Objektträgermittel transferierte biologische Objekte aufzufangen. Die motorisierte Auffangvorrichtung 2 kann ebenfalls sowohl in x- als auch in y-Richtung verfahren werden. Zusätzlich ist eine Verfahrbarkeit in z-Richtung vorgesehen. Zu diesem Zweck sind Schrittmotoren vorgesehen, welche typischerweise dieselbe Präzision wie die Schrittmotoren des Trägertisches 3 aufweisen.
Das Mikroskop 1 ist mit einer Kamera, insbesondere einer CCD-Kamera ausgestattet, welche den Bereich des Trägertisches 3, welcher zur Aufnahme des Objektträgermittels vorgesehen ist, aufnimmt. Insbesondere nimmt die Kamera das Bild über das Objektiv 18 des Mikroskops 1 auf. Das Videosignal der Kamera wird einem Computersystem 7 zugeführt, bei welchem es sich beispielsweise um einen handelsüblichen Personal Computer handeln kann.
In dem Computersystem 7 wird das Videosignal beispielsweise mittels einer so genannten Framegrabber-Karte verarbeitet und zu einer Abbildung in einem digitalen Format konvertiert, welches zur weiteren Verarbeitung in dem Computersystem 7 geeignet ist. Selbstverständlich ist es auch möglich, einen digital ausgestaltete Kamera zu verwenden, so dass ein digitales Videosignal erzeugt wird, welches direkt zur weiteren Verarbeitung in dem Computersystem 7 geeignet ist. Die von der Kamera aufgenommenen Bilder können in Echtzeit auf einem Bildschirm 8 des Computersystems 7 dargestellt werden.
Das Computersystem 7 hat weiterhin die Funktion eines Steuersystems. Zu diesem Zweck verfügt das Computersystem 7 über eine entsprechende Schnittstellenkarte, welche Steuersignale erzeugt, über welche eine automatische Ansteuerung der Laservorrichtung 4, des Mikroskops 1, der Auffangvorrichtung 2 und des Trägertisches 3 möglich ist. Zur Einstellung bzw. Auswahl dieser Funktionen sind für Computersysteme übliche Eingabemittel, wie beispielweise eine Tastatur 9 oder eine Computermaus 10, vorgesehen. Weiterhin kann das Computersystem 7 die Funktion eines Bilderkennungssystems aufweisen, um eine automatisierte Identifizierung und Auswahl von Objekten zu ermöglichen. Zu diesem Zweck ist eine entsprechend ausgestaltete Bilderkennungs- und Bildanalysesoftware vorgesehen.
Nachfolgend soll ein mit dem oben beschriebenen System durchzuführendes Verfahren zur Bearbeitung einer biologischen oder nicht biologischen Masse näher erläutert werden. Im Allgemeinen handelt es sich bei den beschriebenen Verfahrensschritten um automatisch durchgeführte Vorgänge, welche durch das Computersystem 7 durchgeführt oder gesteuert werden. Gegebenfalls werden jedoch auch Vorgänge manuell eingeleitet oder durchgeführt.
Das Verfahren beinhaltet ein Erzeugen einer Abbildung zumindest eines Teils der biologischen Masse. Eine solchen 20 ist beispielhaft in 2 dargestellt.
In der Abbildung zeigen sich verschiedenartige Strukturen, bei welchen es sich um einzelne Zellen, Zellkolonien, Zellbestandteile oder dergleichen handeln kann. Im Verlauf des Verfahrens werden eine oder mehrere dieser Strukturen als Objekte ausgewählt, die biologische Masse durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl geschnitten, um das ausgewählte Objekt oder die ausgewählten Objekte von der biologischen Masse zu separieren, und das ausgewählte Objekt oder die ausgewählten Objekte durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl zu der Auffangvorrichtung 2 transferiert. Abhängig von der zum Auswerten der Abbildung oder zum Schneiden der Masse erforderlichen Genauigkeit sowie abhängig von der zum Transferieren des ausgewählten Objekts oder der ausgewählten Objekte erforderlichen Genauigkeit wird automatisch zwischen den verschiedenen Objektiven 18 gewechselt.
Ein Beispiel für den grundlegenden Ablauf des Verfahrens ist schematisch in 3 dargestellt.
In einem ersten Schritt 100 wird eine Übersichtsabbildung der biologischen Masse mit einem Objektiv erzeugt, welches eine vergleichsweise geringe Vergrößerung im Bereich von einfacher bis fünffacher Vergrößerung aufweist. Zur Erzeugung der Übersichtsabbildung können auch mehrere Abbildungen mosaikartig oder kachelartig zusammengesetzt werden. Durch Auswerten der Übersichtsabbildung werden darin Bereiche identifiziert, die Strukturen enthalten, für welche eine genauere Auswertung vorgenommen werden soll. Weiterhin können auch bereits unmittelbar in der Übersichtsabbildung zu bearbeitende Objekte identifiziert und ausgewählt werden, wenn die Art der Objekte dies zulässt.
Im Schritt 110 erfolgt in den in dem Schritt 100 identifizierten Bereichen eine erneute Abbildung der biologischen Masse mit einer höheren Vergrößerung im Bereich von zehnfacher bis 100-facher Vergrößerung. Insbesondere können hier Objektive 18 mit einer 20-fachen, 63-fachen oder 100-fachen Vergrößerung eingesetzt werden. Zu diesem Zweck erfolgt ein automatischer Wechsel des Objektivs 18 und eine anschließende Refokussierung. Bei rechnerunterstützer manueller Auswertung der Abbildung kann der Objektivwechsel manuell von dem Benutzer veranlasst werden oder ein automatischer Wechsel des Objektivs von dem Benutzer manuell unterdrückt werden. Bei automatisierter Auswertung der Abbildung auf Basis einer Bilderkennung wird der automatische Wechsel des Objektivs durch das Bilderkennungssystem veranlasst. Der Schritt 110 kann mit sukzessive höher vergrößernden Objektiven 18 wiederholt werden, bis die zum Auswerten der Abbildung erforderliche Genauigkeit erreicht ist. Der Schritt 110 ermöglicht somit eine Auswertung mit einem gegenüber der Übersichtsabbildung des Schritts 100 gesteigerten Informationsgehalt.
Im Schritt 120 erfolgt eine wiederholte Auswertung, bei welcher gegebenenfalls andere Kriterien zugrunde gelegt werden als bei der Auswertung des Schritts 110. Insbesondere können die in dem Schritt 110 identifizierten und ausgewählten Strukturen einer nochmaligen Identifizierung unterworfen werden. Hierbei könnte beispielsweise eine weitere Untersuchung mittels Fluoreszenz oder Autofluoreszenz erfolgen. Weiterhin könnten ergänzende Daten der Abbildung überlagert werden, z.B. Schwingungsspektroskopiedaten bzw. Daten einer Abbildung im Infrarotbereich mit Hauptkomponentenanalyse. Auch im Rahmen des Schritts 120 wird abhängig von der zur Auswertung erforderlichen Genauigkeit das Objektiv 18 gewechselt und gegebenenfalls erneut eine Abbildung erzeugt. Abhängig von dem Ergebnis des Schritts 120 kann das Verfahren mit einer erneuten Ausführung des Schritts 110 fortgesetzt werden, z.B. wenn die überprüfende Auswertung des Schritts 120 Abweichungen von der Auswertung des Schritts 110 ergibt. Der Schritt 120 bildet somit eine Überprüfungs- oder Rektifikationsstufe.
Anschließend erfolgt in dem Schritt 130 eine Bearbeitung der biologischen Masse mittels des Laserstrahls, indem die identifizierten und ausgewählten Objekte aus der biologischen Masse ausgeschnitten und zu der Auffangvorrichtung 2 transferiert werden. Im Rahmen des Schritts 130 erfolgt ein automatischer Wechsel des Objektivs 18 abhängig von der zum Schneiden der biologischen Masse erforderlichen Genauigkeit. Weiterhin kann auch beim abschließenden Transferieren der ausgewählten Objekte durch Laserbestrahlung durch einen automatischen Wechsel des Objektivs 18 eine Anpassung an die dabei erforderliche Genauigkeit vorgenommen werden. Die Vorgehensweise beim Ausschneiden der ausgewählten Objekte und anschließenden Transferieren der Objekte soll nachfolgend anhand von 4 und 5 beispielhaft erläutert werden.
4 zeigt einen Ausschnitt aus einer Abbildung der biologischen Masse, in welchem unterschiedliche identifizierte Strukturen 30, 32, 42, 44 und 46 zu erkennen sind, wobei die Strukturen 30, 32, 42, 44 und 46 wurden auf die vorhergehend erläuterte Weise identifiziert wurden. Die Strukturen 30, 42 und 46 wurden zur weitergehenden Bearbeitung ausgewählt, d.h. diese ausgewählten Objekte sollen aus der biologischen Masse ausgeschnitten und zu der Auffangvorrichtung 2 transferiert werden.
Hierbei zeigt sich jedoch das Problem, dass die Strukturen 42 und 46 eng benachbart zu der Struktur 30 liegen. Aus diesem Grund sieht das Verfahren vor, den oder die Abschnitte einer Schnittlinie S zum Ausschneiden des Objekts 30, welcher bzw. welche eng benachbart zu den Objekten 42 und 46 sind, unter Verwendung eines entsprechend ausgewählten Objektivs 18 zu erzeugen, so dass für diesen Abschnitt durch Auswahl einer höheren Vergrößerung auch eine höhere Schnittgenauigkeit möglich ist. In den übrigen Abschnitten der Schnittlinie S wird hingegen mit einem Objektiv 18 mit geringerer Vergrößerung gearbeitet, so dass zum einen eine große Fläche zur Bearbeitung verfügbar ist und zum anderen eine höhere Schnittgeschwindigkeit erreicht werden kann. Der Ausschnitt der Abbildung, welcher mittels des Objektivs 18 mit höherer Vergrößerung darstellbar ist, ist in 4 mit A bezeichnet. Die Abschnitte der Schnittlinie S, welche mittels eines Objektivs 18 mit geringerer Vergrößerung, z.B. 20-facher oder 40-facher Vergrößerung erzeugt werden, sind in 4 als durchgezogene Linie dargestellt, während die Abschnitte der Schnittlinie S, welche mittels eines Objektivs 18 mit höherer Vergrößerung, z.B. 63-facher oder 100-facher Vergrößerung erzeugt werden, als gepunktete Linie geringere Stärke dargestellt sind.
Durch Verwendung eines Objektivs 18 mit höherer Vergrößerung in unmittelbarer Nähe der Objekte 42 und 46 wird erreicht, dass die Schnittlinie S in diesem Bereich eine geringere Breite aufweist. Eine Beschädigung der Objekte 42 und 46 beim Ausschneiden des Objekts 30 wird somit vermieden. Weiterhin kann verhindert werden, dass beim Ausschneiden des Objekts 30 versehentlich Teile der Objekte 42 und 46 mit ausgeschnitten werden, so dass im Ergebnis auch eine höhere Reinheit des separierten biologischen Materials erzielt wird.
Die Schnittlinie S kann derart erzeugt werden, dass die biologische Masse und der Laserstrahl mittels des Trägertisches 3 derart relativ zueinander bewegt werden, so dass der Laserstrahl einen geschlossenen oder annähernd geschlossenen Linienzug um das Objekt 32 herum beschreibt, wobei an den Übergängen zwischen den Abschnitten der Schnittlinie, welche mit unterschiedlich vergrößernden Objektiven 18 erzeugt werden, ein automatischer Wechsel des verwendeten Objektivs 18 erfolgt. Alternativ ist es möglich, zunächst die Abschnitte der Schnittlinie S zu erzeugen, welche mittels des geringer vergrößernden Objektivs 18 erzeugt werden, und anschließend die Abschnitte der Schnittlinie S zu erzeugen, welche mittels des höher vergrößernden Objektivs 18 erzeugt werden, oder umgekehrt. Bei letzterer Vorgehensweise wird die Anzahl der erforderlichen Objektivwechsel minimiert. Im Anschluss an einen automatischen Wechsel des Objektivs 18 erfolgt allgemein eine automatische Refokussierung des Laserstrahls auf die Objektebene.
Nach Erzeugung der Schnittlinie S um das Objekt 30 herum wird der Laserstrahl auf einen Zielpunkt des Objekts 30 gerichtet und für eine vorgegebene Zeitdauer aktiviert, so dass das ausgeschnittene bzw. freipräparierte Objekt 30 durch einen katapultierartigen Vorgang zu der Auffangvorrichtung 2 transferiert wird. Zu diesem Zweck wird allgemein ein geringer vergrößerndes Objektiv 18 verwendet, z.B. mit 20-facher oder 40-facher Vergrößerung.
5 zeigt denselben Ausschnitt einer Abbildung der Masse, welche einem Zeitpunkt entspricht, nachdem das Objekt 30 zu der Auffangvorrichtung 2 transferiert wurde. In 5 sind weitere Schnittlinien S' und S'' dargestellt, durch welche die Objekte 42 bzw. 46 aus der biologischen Masse herauspräpariert werden sollen. Aufgrund der engen Nachbarschaft zueinander und zu der Struktur 44 ist für die Schnittlinien S' und S'' eine Erzeugung mit einem höher vergrößernden Objektiv 18, z.B. mit 63-facher oder 100-facher Vergrößerung, vorgesehen. Dies ist in 5 durch gepunktete Linien um die Objekte 42 und 46 herum veranschaulicht.
Nach Erzeugung der Schnittlinien S' und S'' wird wiederum der Laserstrahl jeweils auf einen entsprechenden Zielpunkt der Objekte 42 und 46 gerichtet und für eine vorbestimmte Zeitdauer aktiviert, so dass die Objekte 42 und 46 durch einen katapultierartigen Vorgang zu der Auffangvorrichtung 2 transferiert werden. Aufgrund der geringen Größe der Objekte 42 und 46 erfolgt dies jedoch mittels des höher vergrößernden Objektivs 18. Die Parameter zur Erzeugung des Laserstrahls, z.B. Leistung oder Pulsfrequenz, werden an die Vergrößerung des verwendeten Objektivs 18 angepasst.
Die anhand von 4 und 5 erläuterten Bearbeitungsvorgänge sehen beispielhaft die Verwendung von zwei Objektiven 18 mit unterschiedlicher Vergrößerung vor. Selbstverständlich können hinsichtlich der erforderlichen Schnittgenauigkeit auch feinere Abstufungen vorgesehen sein, indem eine größere Anzahl unterschiedlicher Objektive verwendet wird. Vorzugsweise werden beim Ausschneiden und Transferieren der Objekte solche Objektive verwendet, welche auch bereits beim Erzeugen der Abbildungen in dem Verfahren gemäß 3 verwendet werden.
In der nachfolgenden Tabelle sind beispielhaft die Schnittbreiten angegeben, welche für eine biologische Masse auf einer Polymerfolie für Objektive unterschiedlicher Vergrößerung erreicht werden.
In der Tabelle bedeutet die mit „außen" bezeichnete Schnittbreite den Abstand des Schnitts von Rand zu Rand einschließlich eines Bereichs, in welchem sich die Folie aufwirft bzw. verformt. Mit „innen" ist die Breite des Schnitts in der biologischen Masse bezeichnet. Der letztere Wert ist für die Durchtrennung der Masse ausschlaggebend. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass es sich bei den zu separierenden Objekten um Strukturen handeln kann, deren Durchmesser weniger als 10 μm beträgt, wird somit beispielsweise durch einen Wechsel des Objektivs von 40-facher Vergrößerung auf 63-fache Vergrößerung eine erhebliche Verbesserung der Trennschärfe erreicht.
Wird die biologische Masse einschließlich der Polymerfolie auf einem Objektträger der Dicke 0,17 mm gehalten, werden die in der nachfolgenden Tabelle beispielhaften Daten erreicht.
Es ist erkennbar, dass auch in diesem Fall der Wechsel des Objektivs zu einer höheren Vergrößerung zu einer erheblichen Verbesserung der Trennschärfe führt.
Es versteht sich, dass die oben angegebenen Werte abhängig sind von der Art der verwendeten Objektive und den zur Erzeugung des Laserstrahls verwendeten Parametern. Weiterhin ist auch die Art der zum Halten der biologischen Masse verwendeten Folie und die Art des verwendeten Objektträgers von Bedeutung. Es zeigt sich jedoch allgemein, dass durch einen Wechsel des Objektivs zu einer höheren Vergrößerung eine verbesserte Schnittgenauigkeit, d.h. eine geringere Breite der Schnittlinie, erreicht werden kann.

Claims

Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls, umfassend die Schritte: Erzeugen einer (20) zumindest eines Teils der Masse, Auswerten der (20), um darin mindestens ein Objekt (30, 42, 46) auszuwählen, und Schneiden der Masse durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl, um das ausgewählte Objekt (30, 42, 46) von der Masse zu separieren, und/oder Transferieren des ausgewählten Objekts (30, 42, 46) von der Masse zu einer Auffangvorrichtung (2), wobei das Erzeugen der (20) und/oder das Schneiden der Masse mittels eines optischen Objektivs (18) erfolgt, gekennzeichnet durch einen Schritt zum automatischen Wechseln des optischen Objektivs (18) abhängig von der zum Auswerten der (20) oder zum Schneiden der Masse erforderlichen Genauigkeit.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zum Schneiden der Masse der Laserstrahl mittels des optischen Objektivs (18) auf die Masse fokussiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei nach dem automatischen Wechsel des optischen Objektivs (18) der Schritt zum Erzeugen einer (20) mit einem höher vergrößernden optischen Objektiv (18) wiederholt wird, bis die zum Auswerten der (20) erforderliche Genauigkeit erreicht ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zum Schneiden der Masse Steuersignale erzeugt werden, welche eine automatisierte relative Bewegung der Masse und des Laserstrahls bewirken, um so in der Masse eine Schnittlinie (S, S', S'') hervorzurufen.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei eine Schnittlinie (S, S', S'') erzeugt wird, welche das ausgewählte Objekt (30, 42, 46) im Wesentlichen vollständig umschließt.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei der automatische Wechsel des optischen Objektivs (18) im Verlauf der relativen Bewegung der Masse und des Laserstrahls erfolgt, so dass die Schnittlinie (S) Abschnitte aufweist, welche mittels unterschiedlich vergrößernder optischer Objektive (18) erzeugt wurden.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Schnittlinie abschnittsweise erzeugt wird, indem der automatische Wechsel des optischen Objektivs (18) erst dann erfolgt, wenn alle Abschnitte der Schnittlinie (S) erzeugt sind, für welche die Erzeugung mittels dieses optischen Objektivs (18) vorgesehen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4–7, wobei die Vergrößerung des zu einem Abschnitt der Schnittlinie (S) gehörenden optischen Objektivs (18) abhängig von einem Abstand des ausgewählten Objekts (30, 42, 46) zu einem benachbarten Objekt (30, 32, 42, 44, 46) der Masse im Bereich dieses Abschnitts gewählt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Transferieren des ausgewählten Objekts (30, 42, 46) zu der Auffangvorrichtung (2) mittels des Laserstrahls erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei zum Transferieren des ausgewählte Objekts (30, 42, 44, 46) der Laserstrahl durch das optische Objektiv (18) auf das ausgewählte Objekt (30, 42, 46) gerichtet wird und durch Aktivieren des Laserstrahls für eine vorgegebene Zeitdauer das ausgewählte Objekt (30, 42, 46) zu der Auffangvorrichtung (2) transferiert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, umfassend einen automatischen Wechsel des optischen Objektivs (18) abhängig von der zum Transferieren des ausgewählten Objekts (30, 42, 46) erforderlichen Genauigkeit.
Vorrichtung zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls, umfassend: eine Laserlichtquelle (4) zum Erzeugen eines Laserstrahls, um durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl die Masse zu schneiden und/oder ein Objekt (30, 42, 46) der Masse zu einer Auffangvorrichtung (2) zu transferieren, und Abbildungsmittel (1) zum Erzeugen einer (20) zumindest eines Tels der Masse, wobei die Vorrichtung zum Erzeugen der (20) und zum Richten des Laserstrahls auf die Masse ein optisches Objektiv (18) umfasst, gekennzeichnet durch mindestens ein weiteres optisches Objektiv (18) und Mittel zum automatischen Wechsel des zum Erzeugen der Abbildung bzw. Richten des Laserstrahls auf die Masse verwendeten optischen Objektivs (18) abhängig von der Genauigkeit, welche zum Auswerten der (20), um darin das Objekt (30, 42, 46) auszuwählen, und/oder zum Schneiden der Masse, um das Objekt (30, 42, 46) von der Masse zu separieren, erforderlich ist.
Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die optischen Objektive (18) der Vorrichtung unterschiedliche Vergrößerungen aufweisen.
Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Vorrichtung wenigstens ein optisches Objektiv (18) mit einer Vergrößerung im Bereich von einfacher bis zehnfacher Vergrößerung umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12–14, wobei die Vorrichtung wenigstens ein optisches Objektiv (18) mit einer Vergrößerung im Bereich von 60-facher bis 100-facher Vergrößerung umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12–15, wobei die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–11 ausgestaltet ist.