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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Lasermikrodissektionssystem und ein Lasermikrodissektionsverfahren gemäß den jeweiligen Oberbegriffen der unabhängigen Patentansprüche sowie eine Verwendung des beanspruchten Lasermikrodissektionssystems.
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Stand der Technik
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Verfahren zur Bearbeitung biologischer Proben durch Lasermikrodissektion existieren bereits seit Mitte der 1970er Jahre und wurden seitdem kontinuierlich weiterentwickelt. Bei der Lasermikrodissektion können Zellen, Geweberegionen usw. aus einer biologischen Probe ("Objekt") isoliert und als sogenannte Dissektate gewonnen werden. Ein besonderer Vorteil der Lasermikrodissektion ist der kurze Kontakt der Probe mit dem Laserstrahl, durch den diese kaum verändert wird. Die Gewinnung der Dissektate kann auf unterschiedliche Weise erfolgen.
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Beispielsweise kann in bekannten Verfahren aus einer Probe mittels eines Infrarot- oder Ultraviolettlaserstrahls ein Dissektat isoliert werden, das unter dem Einfluss der Schwerkraft in einen geeigneten Dissektatauffangbehälter fällt. Das Dissektat kann dabei aus der Probe auch zusammen mit einer an der Probe anheftenden Membran ausgeschnitten werden. Bei der sogenannten "Laser Capture Microdissection" wird hingegen eine thermoplastische Membran mittels eines entsprechenden Laserstrahls erwärmt. Dabei verschmilzt die Membran mit dem gewünschten Bereich der Probe und kann in einem darauffolgenden Schritt durch Reißen entfernt werden. Eine weitere Alternative besteht darin, das Dissektat mittels des Laserstrahls an einen Deckel eines Dissektatauffangbehälters anzuheften. Bei bekannten inversen Mikroskopsystemen zur Lasermikrodissektion können nach oben transportierte Dissektate auch an den Boden eines Dissektatauffangbehälters, der mit einer adhäsiven Beschichtung versehen ist, angeheftet werden.
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Bekannte Mikroskopsysteme zur Lasermikrodissektion weisen eine Auflichteinrichtung auf, in deren Strahlengang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv auf die Probe fokussiert, die auf einem motorisch-automatisch verfahrbaren Mikroskoptisch aufliegt. Eine Schnittlinie kann dadurch erzeugt werden, dass der Mikroskoptisch beim Schneiden verfahren wird, um die Probe relativ zu dem feststehenden Laserstrahl zu bewegen. Dies hat jedoch unter Anderem den Nachteil, dass die Probe während des Erzeugens der Schnittlinie nicht ohne weiteres betrachtet werden kann, da sich die Probe im Gesichtsfeld bewegt und das Bild ohne weitere Kompensationsmaßnahmen verschwommen bzw. verschmiert erscheint.
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Vorteilhafter sind daher Lasermikrodissektionssysteme, die Laserablenk- bzw. Laserscaneinrichtungen aufweisen, die dazu eingerichtet sind, den Laserstrahl bzw. dessen Auftreffpunkt auf der zu dissektierenden feststehenden Probe zu bewegen. Derartige Lasermikrodissektionssysteme, die auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen sollen und dort besondere Vorteile bieten, werden unten im Detail erläutert. Ein besonders vorteilhaftes Lasermikroskopsystem das eine Laserablenkeinrichtung mit gegeneinander verstellbaren Glaskeilen im Laserstrahlengang aufweist, ist beispielsweise in der
EP 1 276 586 B1 beschrieben.
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In beiden Fällen, also in Systemen mit bewegter oder feststehender Probe, wird in der Regel mit gepulsten Lasern gearbeitet, wobei durch jeden Laserpuls ein Loch bzw. eine Vertiefung in der Probe erzeugt wird. Eine Schnittlinie entsteht durch eine Aneinanderreibung derartiger Löcher bzw. Vertiefungen, gegebenenfalls mit Überlappung.
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Die Lasermikrodissektion kann zur Gewinnung von Einzelzellen oder definierten Gewebebereichen verwendet werden, die mit einem Laserstrahl vom umliegenden Gewebe separiert und anschließend beispielsweise unterschiedlichen diagnostischen Analyseverfahren unterworfen werden. In der Onkologie kann die Lasermikrodissektion beispielsweise dafür eingesetzt werden, um spezifisch Tumorzellen aus einem mikroskopischen Schnitt zu isolieren und auf spezifische Metaboliten oder Proteine zu untersuchen.
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Weiterhin kann die Lasermikrodissektion auch zur Manipulation von Einzelzellen oder definierten Gewebebereichen eingesetzt werden. Hier ist beispielsweise an eine Fluoreszenzanregung zu denken oder an die Verwendung als optische Pinzette.
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Aus der
DE 100 43 504 A1 ist ein Verfahren zur Lasermikrodissektion bekannt, bei dem ein interessierender Probenbereich entlang einer Schnittlinie ausgeschnitten werden soll, wobei die Schnittlinie von mindestens zwei Stegen unterbrochen ist. Anschließend wird der interessierende Probenbereich mit einem einzigen, auf dem Probenbereich gerichteten Laserimpuls abgerissen, wodurch der Probenbereich von der Probe getrennt wird. Für diesen letzten Schritt wird der Laserstrahl aufgeweitet bzw. defokussiert, um seine Energie auf eine größere Fläche zu verteilen. Das vorgeschlagene Verfahren soll das bei dieser Art der Lasermikrodissektion typische Problem lösen, dass beim Schneiden eines Probenbereichs mit geschlossener Schnittlinie kurz vor Schließen der Schnittlinie nur noch ein schmaler Steg verbleibt, der mit der umgebenden Probe verbunden ist. Bedingt durch elektrische Aufladung oder durch mechanische Spannung im Steg kommt es häufig zu einem Wegklappen des bisher ausgeschnittenen Probenbereichs, so dass der verbleibende schmale Steg häufig nicht mehr in der Fokusebene des Laserstrahls liegt. Eine saubere Fertigstellung des Schnitts ist dann nicht möglich. Häufig kann auch ein Teil des umgeklappten Probenbereichs den verbleibenden Steg überlappen, so dass dieser Probenbereich beim weiteren Schneiden beschädigt würde. Auch ein Ablösen des ausgeschnittenen Probenbereichs mittels des Laserimpulses ist erschwert oder sogar unmöglich, da keine ausreichende Angriffsfläche für den Laserschuss vorhanden ist. Dieses Problem löst die genannte
DE 100 43 504 A1 durch die oben erläuterte Methode, bei der mindestens zwei, die Schnittlinie unterbrechende Stege in der Schnittlinie verbleiben. Auch dieses Verfahren kann allerdings Nachteile aufweisen, beispielsweise, wenn die Energie des aufgeweiteten Laserstrahls nicht ausreicht, alle verbliebenen Stege gleichzeitig zu durchtrennen, oder wenn zum Durchtrennen aller Stege die Energie des aufgeweiteten Laserstrahls in einer Weise erhöht werden muss, dass eine Gefahr der Schädigung des abzutrennenden Probenbereichs eintritt.
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Aufgabe vorliegender Erfindung ist es daher, den Prozess der Lasermikrodissektion zuverässiger, insbesondere ohne die genannten Nachteile, zu gestalten.
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Offenbarung der Erfindung
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Zur Lösung der genannten Aufgabe schlägt die vorliegende Erfindung ein Lasermikrodissektionssystem, Verwendungen dieses Systems sowie ein Verfahren zur Lasermikrodissektion gemäß den unabhängigen Patentansprüchen vor. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der jeweiligen Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
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Die vorliegende Erfindung geht aus von einem an sich bekannten Lasermikrodissektionssystem mit einem Mikroskop, das eine Aufnahmeeinrichtung zur Aufnahme einer biologischen Probe und eine Auflichteinrichtung mit einer Laserablenkeinrichtung aufweist, welche einen durch eine Lasereinheit bereitgestellten Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv des Mikroskops auf einen Probenbereich der biologischen Probe führt und welche einen Auftreffpunkt des Laserstrahls auf dem Probenbereich verschiebt.
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Ein entsprechendes Lasermikrodissektionssystem ist unten ausführlich unter Bezugnahme auf die 1 erläutert. Mittels der Auflichteinrichtung wird in einem solchen Lasermikrodissektionssystem der Laserstrahl aus einer Laserlichtquelle in den Beobachtungsstrahlengang des Mikroskops eingekoppelt. Der Laserstrahl wird durch das Mikroskopobjektiv, das auch zum Betrachten der Probe verwendet wird, auf diese fokussiert. Somit verläuft, mit anderen Worten, der Strahlengang des Laserstrahls der Lasereinheit durch die Auflichteinrichtung und durch das Mikroskopobjektiv und schneidet eine Objektebene des Mikroskopobjektivs an einem einstellbaren Schnittpunkt, der mittels Ansteuersignalen an die Laserablenkeinrichtung vorgegeben wird.
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Zur Vermeidung von Missverständnissen sei an dieser Stelle betont, dass das im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Lasermikrodissektionssystem mit Proben verwendet wird, die bereits mikroskopietauglich vorbereitet sind. Hierbei kann es sich beispielsweise um Gewebe-Dünnschnitte handeln, die mittels eines Mikrotoms aus einem größeren Gewebeblock herausgetrennt wurden, im vorliegenden Fall jedoch auch um dickere Schnitte aus einem entsprechenden Gewebeblock. Bei einem solchen Gewebeblock kann es sich beispielsweise um ein fixiertes Organ oder eine Biopsie eines entsprechenden Organs handeln. Das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem dient daher nicht zur Gewinnung von Proben, sondern zu deren Bearbeitung sowie zur Isolation von bestimmten Bereichen hiervon. Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung auch mit Proben, die nicht mittels eines Mikrotoms gewonnen werden, zum Einsatz kommen kann, z.B. mit Ausstrichen, Mazeraten usw. Wie erwähnt, eignet sich die Erfindung jedoch auch zur Verarbeitung dickerer Proben, die nicht mittels eines Mikrotoms vorbereitet wurden.
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Mikrotome werden ausschließlich bei der Vorbereitung von mikroskopischen Proben eingesetzt. Mikrotome können hierzu auch Laser aufweisen. Die mittels eines Mikrotoms erhaltenen Schnitte werden auf einen Objektträger, wie oben erwähnt, aufgebracht, gegebenenfalls dort befestigt, angefärbt usw. Erst dann stehen diese für einen Einsatz in dem Lasermikrodissektionssystem zur Verfügung. Ein Mikrotom unterscheidet sich in seinem Betrieb unter anderem dadurch fundamental von einem Lasermikrodissektionssystem, dass dort Schnitte mit möglichst homogener Schnittstärke gewonnen werden. Mikrotome sind daher dazu ausgebildet, eine große Anzahl an identischen Schnitten mit parallelen Schnittflächen zu erzeugen, wohingegen Lasermikrodissektionssysteme zum Heraustrennen von Dissektaten nach probenabhängigen Kriterien, beispielsweise nach visuellen morphologischen Kriterien, eingerichtet sind. Im vorliegenden Fall dient das Lasermikrodissektionssystem insbesondere zum Heraustrennen von Probenpartikeln, die anschließend in einem Suspendierfluid aufgenommen werden. Der Fachmann würde daher bei Mikrotomen eingesetzte technische Lösungen aufgrund der völlig unterschiedlichen Zielsetzung nicht auf derartige Lasermikrodissektionssysteme übertragen.
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Zum Heraustrennen von Probenpartikel bzw. Probenbereichen, also zur Gewinnung von Dissektaten, wird ein Probenbereich entlang einer Schnittlinie vollständig durchtrennt und somit von der umgebenden Probe abgelöst. Es ist beispielsweise nicht möglich, Material unterschiedlicher, übereinander liegender Gewebeschichten getrennt voneinander zu isolieren. Ein mittels Lasermikrodissektion gewonnenes Dissektat stellt daher stets ein "Sammelprobenbereich" durch die gesamte Dicke der bearbeiteten Probe dar; eine Differenzierung in einzelne Gewebeschichten mittels Lasermikrodissektion ist nicht möglich bzw. kann nur indirekt über die Dicke des Probenbereichs geschehen.
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Der Mikroskoptisch ist in Lasermikrodissektionssystemen mit einer Laserablenkeinrichtung, wie erfindungsgemäß eingesetzt, beim Bearbeiten der Probe gegenüber dem Mikroskopobjektiv bezüglich der x- und y-Richtung (also senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs) feststehend angeordnet.
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Im Gegensatz zu Lasermikrodissektionssystemen mit einem während des Dissektiervorgangs motorisch verfahrenen Mikroskoptisch (Scanningtisch), der insbesondere bei stark vergrößernden Objektiven eine hohe Positioniergenauigkeit besitzen muss, um präzise Schnitte zu ermöglichen, erweisen sich Lasermikrodissektionssysteme mit einer Laserablenkeinrichtung als einfacher und kostengünstiger in der Herstellung und besitzen Präzisionsvorteile.
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Die Laserablenkeinrichtung weist in einer besonders vorteilhaften Ausführungsform zwei dicke, gegen eine optische Achse geneigte und unabhängig voneinander um eine optische Achse drehbare gläserne Keilplatten („Glaskeile“) auf, welche durch ihre Keilwinkel eine Strahlablenkung erzeugen. Durch die Drehung der gläsernen Keilplatten ist der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls gegenüber der optischen Achse variabel. Am Ausgang der Laserablenkeinrichtung weist der Laserstrahl durch die Dicke und die Schrägstellung der gläsernen Keilplatten einen seitlichen Strahlversatz gegenüber der optischen Achse auf und trifft für alle Ablenkwinkel die Mitte der Objektivpupille des Mikroskopobjektivs. Der Schnittpunkt des Laserstrahls mit der Objektebene ist damit einstellbar.
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Eine derartige Laserablenkeinrichtung ist insbesondere deshalb vorteilhaft gegenüber anderen Laserablenkeinrichtungen wie beispielsweise Spiegelscannern, Galvanometerscannern oder Schrittmotorscannern, weil diese nicht in einer zu der Objektivpupille konjugierten Ebene angeordnet werden muss. Damit ist auch keine sogenannte Pupillenabbildung erforderlich, um zu erreichen, dass der abgelenkte Strahl die Objektivpupille trifft. Bei der Lasermikrodissektion mit UV-Laserlicht wäre dabei beispielsweise eine UV-taugliche Pupillenabbildung erforderlich. Weitere Vorteile einer derartigen Laserablenkeinrichtung mit Keilplatten sind beispielsweise in der
EP 1 276 586 B1 genannt.
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Vorteile der Erfindung
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Bei dem erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionsverfahren zum Gewinnen eines Probenbereichs aus einer biologischen Probe wird ein fokussierter Laserstrahl entlang zumindest eines Teils einer den Probenbereich umgebenden Schnittlinie geführt, wodurch der Probenbereich von der umgebenden Probe getrennt wird, und wobei vor einem Ablösen des Probenbereichs mindestens zwei Stege verbleiben, die den Probenbereich mit der umgebenden Probe verbinden. Erfindungsgemäß wird mindestens ein weiterer auf die Schnittlinie fokussierter Laserstrahl bereitgestellt und jeder der mindestens zwei verbleibenden Stege wird durch jeweils einen der Laserstrahlen durchtrennt. Dieses Verfahren führt zu einer erhöhten Zuverlässigkeit und einer erhöhten Geschwindigkeit des Probenschneidens mittels Lasermikrodissektion. Die zwei oder mehr verbleibenden Stege werden entsprechend mittels zwei oder mehr Laserstrahlen parallel und insbesondere gleichzeitig durchtrennt. Auf diese Weise kann zuverlässig sichergestellt werden, dass gleichzeitig alle verbleibenden Stege mittels auf diese Stege fokussierten Laserstrahlen durchschnitten werden, so dass sich der Probenbereich zuverlässig von der umgebenden Probe ablöst und als Dissektat weiterverarbeitet werden kann.
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Die Geschwindigkeit des Probenschneidens kann weiter erhöht werden, wenn einer des mindestens einen weiteren Laserstrahls entlang eines ihm vorher zugeordneten Teils der Schnittlinie geführt wird, bevor die Stege durchtrennt werden. Mit anderen Worten kann beim Vorhandensein von zwei Laserstrahlen ein Laserstrahl einen Teil der Schnittlinie und der andere Laserstrahl den anderen Teil der Schnittlinie mit Ausnahme der verbleibenden Stege schneiden, wobei anschließend die zwei verbleibenden Stege jeweils durch einen Laserstrahl durchtrennt werden. Entsprechendes gilt beim Vorhandensein von mehr als zwei Laserstrahlen.
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Es ist vorteilhaft, wenn die mindestens zwei verbleibenden Stege derart gewählt werden, dass sie entlang der Schnittlinie gleich verteilt sind. Auf diese Weise kann eine hohe Stabilität des durch die Stege mit der umgebenden Probe verbundenen Probenbereichs sichergestellt werden.
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Es ist weiterhin vorteilhaft, wenn (zumindest) zwei der verbleibenden Stege derart gewählt werden, dass die gedachte Verbindungslinie dieser zwei Stege durch den Flächenschwerpunkt des Probenbereichs verläuft. Bei einer geradzahligen Anzahl von Stegen kann beispielsweise jeweils ein Paar von Stegen derart gewählt werden, dass die gedachte Verbindungslinie zwischen den zwei Stegen dieses Paars durch den Flächenschwerpunkt des Probenbereichs verläuft. Auf diese Weise ist eine besonders hohe Stabilität des über die Stege mit der umgebenden Probe verbundenen Probenbereichs gewährleistet.
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Die mindestens zwei verbleibenden Stege sollten in Schnittlinienrichtung gleiche Länge aufweisen. Dies vereinfacht insbesondere das anschließende Durchtrennen dieser Stege mit den jeweiligen Laserstrahlen, da deren Parameter zur Durchtrennung im Wesentlichen gleich eingestellt werden können. Parameter sind unter anderem die Laserenergie, die Laserapertur und der Laserfokus.
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Eine Vereinfachung der Durchtrennung der verbleibenden Stege kann dadurch erzielt werden, dass einer, mehrere oder alle der Stege in gerade Abschnitte der Schnittlinie gelegt werden. Unter "gerader Abschnitt" sollen Abschnitte der Schnittlinie verstanden werden, die eine verhältnismäßig geringe Krümmung im Vergleich zu den übrigen Abschnitten dieser Schnittlinie zeigen.
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Das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem besitzt ein Mikroskop, das eine Aufnahmeeinrichtung zur Aufnahme einer biologischen Probe und eine Auflichteinrichtung mit einer Laserablenkeinrichtung aufweist, die einen durch eine Lasereinheit bereitgestellten Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv des Mikroskops auf eine einen Probenbereich dieser biologischen Probe umgebende Schnittlinie führt und dort fokussiert und den Auftreffpunkt des Laserstrahls entlang dieser Schnittlinie verschiebt. Dieses Lasermikrodissektionssystem weist zusätzlich mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung auf, die derart eingerichtet ist, dass sie mindestens einen weiteren Laserstrahl auf zumindest einen Teil der Schnittlinie führt und fokussiert.
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Ein solches Lasermikrodissektionssystem ist insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionsverfahrens ausgebildet. Bezüglich der entsprechenden Vorteile einer solchen Vorrichtung sei daher auf die obigen Erläuterungen im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verwiesen.
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Die genannte (mindestens eine) weitere Laserablenkeinrichtung ist derart eingerichtet, dass sie den (mindestens einen) weiteren Laserstrahl auf zumindest einen Teil der Schnittlinie führt und dort fokussiert. Hierdurch wird es möglich, einen Teil der Schnittlinie von einem weiteren Laser schneiden zu lassen. Insbesondere die oben ausführlich erwähnten Stege können einen solchen Teil der Schnittlinie bilden. Besonders vorteilhaft ist weiterhin, wenn die mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung auch zum Verschieben des Auftreffpunkts des mindestens einen weiteren Laserstrahls entlang zumindest eines Teils der Schnittlinie ausgestaltet ist. In diesem Fall kann die Schnittlinie von zwei oder mehr Lasern parallel und insbesondere gleichzeitig bearbeitet werden. Dies bringt eine enorme Zeitersparnis beim Schneiden von Probenbereichen aus einer Probe.
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Im Folgenden sollen mögliche und bevorzugte Ausführungsformen für die Bereitstellung weiterer Laserablenkeinrichtungen mit zugeordneten Laserstrahlen erörtert werden. Allgemein kann der weitere Laserstrahl (oder die weiteren Laserstrahlen) durch zusätzliche Lasereinheiten und/oder durch einen oder mehrere Strahlteileranordnungen erzeugt werden, die einen vorhandenen Laserstrahl in zwei oder mehr Strahlen aufteilen.
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Es kann vorteilhaft sein, wenn der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung eine weitere Lasereinheit zugeordnet ist, die einen des mindestens einen Laserstrahls bereitstellt. Somit ist mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung mit mindestens einer weiteren Lasereinheit vorhanden. Dies ist insbesondere dann zweckmäßig, wenn für jeden Laserstrahl die volle Laserleistung beispielsweise beim Laserschneiden benötigt wird.
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Es kann vorteilhaft sein, wenn der Lasereinheit eine Strahlteileranordnung nachgeordnet ist, die aus dem von der Lasereinheit bereitgestellten Laserstrahl den mindestens einen weiteren Laserstrahl durch Strahlteilung erzeugt. Es wäre somit prinzipiell ausreichend, wenn eine Lasereinheit vorhanden ist, aus der durch Strahlteilung mehrere Laserstrahlen erzeugt werden.
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Selbstverständlich können auch Mischformeln der beiden genannten Ausgestaltungen zweckmäßig sein. So kann einer weiteren Lasereinheit eine Strahlteileranordnung nachgeordnet sein die aus dem von dieser weiteren Lasereinheit bereitgestellten weiteren Laserstrahl wiederum mindestens einen weiteren Laserstrahl durch Strahlteilung erzeugt.
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Die genannten Laserablenkeinrichtungen können die jeweiligen Laserstrahlen auf verschiedene Weise auf eine Probe führen.
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Zum einen ist es möglich, alle Laserstrahlen durch dasselbe Mikroskopobjektiv des Mikroskops der Lasermikrodissektionseinrichtung zu leiten. Selbstverständlich ist es auch möglich, nur einen Teil aller zur Verfügung stehenden Laserstrahlen durch dasselbe Mikroskopobjektiv zu leiten. Hierbei ist die vorhandene Laserablenkeinrichtung und mindestens eine der (mindestens einen) weiteren Laserablenkeinrichtungen derart eingerichtet, dass die von diesen Laserablenkeinrichtungen abgelenkten Laserstrahlen durch das Mikroskopobjektiv des Mikroskops des erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionssystems geführt werden.
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Zum Anderen kann für einen, mehrere oder für alle der weiteren Laserstrahlen jeweils eine Laserfokussierlinse vorgesehen sein, die den jeweiligen weiteren Laserstrahl auf die Probe führt. Hierzu ist eine der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung derart eingerichtet, dass sie den von ihr abgelenkten Laserstrahl durch eine Laserfokussierlinse auf den Probenbereich (Schnittlinie, Steg) führt. Bei dieser Ausgestaltung würde dem Mikroskop bzw. dem Mikroskopobjektiv des Lasermikrodissektionssystems mindestens eine weitere Laserfokussierlinse zugeschaltet sein. Dies ist insbesondere dann sinnvoll, wenn ein Probenbereich zu bearbeiten ist, der nicht durch das selbe Mikroskopobjektiv bearbeitet werden kann, wobei zur Bearbeitung aber nicht ein weiterer Mikroskopaufbau notwendig ist.
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Schließlich kann es auch sinnvoll oder notwendig sein, wenn die genannte Laserfokussierlinse ein weiteres Mikroskopobjektiv eines weiteren Mikroskops darstellt. In diesem Fall umfasst das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem somit mehrere Mikroskope zur parallelen Bearbeitung eines Probenbereichs.
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Selbstverständlich sind die oben genannten drei Ausführungsformen beliebig miteinander kombinierbar, ohne dass es hierzu näherer Erläuterungen bedürfte.
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Die Erfindung betrifft weiterhin eine Verwendung eines erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionssystems für das Eingangs geschilderte erfindungsgemäße Verfahren. Hierbei wird ein Probenbereich durch Verschiebung des Auftreffpunktes des Laserstrahls entlang der den Probenbereich umgebenden Schnittlinie von der umgebenden Probe getrennt, wobei vor einem Ablösen des Probenbereichs mindestens zwei Stege verbleiben, die den Probenbereich mit der umgebenden Probe verbinden. Die Laserablenkeinrichtungen führen und fokussieren die jeweils zugeordneten Laserstrahlen jeweils auf die mindestens zwei verbleibenden Stege, so dass jeder dieser Stege durch jeweils einen der Laserstrahlen durchtrennt wird. Insbesondere kann mindestens einer der weiteren Laserstrahlen mittels der ihm zugeordneten Laserablenkeinrichtung mit seinem Auftreffpunkt entlang eines ihm zugeordneten Teils der Schnittlinie verschoben werden, bevor die Stege durchtrennt werden. Bezüglich Vorteile und weitere Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verwendung sei auf die obigen Erläuterungen der Erfindung verwiesen.
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Figurenbeschreibung
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1 zeigt ein Lasermikrodissektionssystem, das vorzugsweise den Ausgangspunkt der vorliegenden Erfindung darstellt, in schematischer Darstellung.
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2 zeigt schematisch einen von einer Schnittlinie umgebenen Probenbereich einer Probe (2A) und den entsprechenden Probenbereich nach dem Schneiden mit zwei gegenüberliegenden Stegen in einem ersten Fall (2B) und in einem zweiten Fall (2C), wobei die 2D bis 2F die perspektivischen Seitenansichten der Aufsichten gemäß 2A bis 2C darstellen.
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3 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen Schneidens eines Probenbereichs auf einer Probe.
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4 zeigt schematisch eine weitere erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen Schneidens eines Probenbereichs auf einer Probe.
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5 zeigt schematisch wiederum eine weitere erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen Schneidens eines Probenbereichs auf einer Probe.
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6 zeigt schematisch eine Möglichkeit der Bereitstellung weiterer Laserstrahlen durch weitere Lasereinheiten.
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7 zeigt schematisch die Bereitstellung weiterer Laserstrahlen mittels einer Strahlteileranordnung, und
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8 zeigt schematisch eine Kombinationsmöglichkeit aus den Beispielen der 6 und 7.
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In den Figuren sind einander entsprechende Elemente mit identischen Bezugszeichen angegeben und werden nicht wiederholt erläutert.
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In
1 ist ein Lasermikrodissektionssystem, das zur Durchführung der Erfindung verwendet werden kann, schematisch dargestellt und insgesamt mit
100 bezeichnet. Das Lasermikrodissektionssystem
100 entspricht in wesentlichen Teilen jenem, das in der
EP 1 276 586 B1 offenbart ist, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Ein Koordinatensystem, anhand dessen die nachfolgend erwähnten Achsen bzw. Richtungen x, y und z veranschaulicht sind, ist in der
1 mit
200 bezeichnet.
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Das Lasermikrodissektionssystem 100 umfasst ein Mikroskop 10. In einem Mikroskopfuß 11 des Mikroskops 10 kann eine hier nur teilweise dargestellte Beleuchtungseinrichtung 12 vorgesehen sein. Diese kann beispielsweise eine (nicht dargestellte) Lichtquelle und geeignete Mittel zur Beeinflussung des durch die Lichtquelle bereitgestellten Beleuchtungslichts umfassen, beispielsweise Filter und/oder Blenden. Zur Durchlichtbeleuchtung und zur Einstellung geeigneter Kontrast- bzw. Beobachtungsverfahren kann eine Kondensoreinheit 90 vorgesehen sein.
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Das Mikroskop 10 kann als Konfokal-, insbesondere als Spinning-Disk-Mikroskop ausgebildet sein und verfügt in diesem Fall über entsprechende weitere oder alternative Mittel (in 1 nicht dargestellt).
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Am Mikroskopfuß 11 kann beispielsweise auch eine Benutzereingabe- und/oder Benutzerinformationseinheit 13 angeordnet sein, die beispielsweise als Touchscreen ausgebildet sein kann, und über die der Benutzer beispielsweise Betrachtungs- und/oder Bearbeitungsparameter eingeben und/oder auslesen kann.
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Ferner ist ein Triebknopf 14 vorgesehen. Dieser dient zur Bedienung eines Grob- und eines Feintriebs zur Einstellung einer Höhe eines Mikroskoptischs 30. Eine Probe 51, beispielsweise eine in einer entsprechenden Aufnahmeeinrichtung bzw. Halterung 52 angebrachte Gewebeprobe, kann hierdurch in eine Objektebene eines Objektivs 41 gebracht werden. Das Objektiv 41 ist neben weiteren Objektiven 42 in einem Objektivrevolver 40 befestigt. Zum Schutz vor Laserstrahlung kann eine Schutzhaube 15 vorgesehen sein.
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Von der Probe 51 ausgehendes Beobachtungslicht verläuft entlang eines Beobachtungsstrahlengangs a. In einer Tubuseinheit 60 mit geeigneten Auskoppeleinrichtungen 61 kann ein vorzugsweise variabler Anteil des Beobachtungslichts, beispielsweise um 60°, ausgekoppelt und mittels eines Okularpaars 62 einem Benutzer dargeboten werden. Ein weiterer Anteil des Beobachtungslichts kann in eine digitale Bilderfassungseinheit 63 eingekoppelt und bildgebend erfasst werden. Der Bilderfassungseinheit 63 kann, vor Ort, in einer Steuereinheit 82 oder einem Steuerrechner 81 (siehe unten), oder in anderer räumlicher Anordnung, ein Bildauswertungsmodul 64 zugeordnet sein. Die dazu notwendigen Verbindungen zum Steuerrechner sind mit 83 bezeichnet.
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Das Lasermikrodissektionssystem 100 weist eine Lasereinheit 70 mit einer Laserlichtquelle 75 auf. Ein durch die Laserlichtquelle 75, bei der es sich beispielsweise um eine UV-Laserlichtquelle handeln kann, bereitgestellter Laserstrahl 77 mit Laserstrahlachse b wird in einer Auflichteinheit, die hier insgesamt mit 76 angegeben ist, an einem ersten Umlenkspiegel 71 und einem zweiten Umlenkspiegel 72 umgelenkt und durch das Objektiv 41 auf die Probe 51 fokussiert.
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Bei dem Lasermikrodissektionssystem 100 kann der Ort, an dem der Laserstrahl 77 auf die Probe 51 in der Objektebene, und damit auch in dem Probenbereich auftrifft, grundsätzlich auf unterschiedliche Weise eingestellt werden. Einerseits kann eine manuelle Verstelleinrichtung 31 vorgesehen sein, mittels derer der als Kreuztisch ausgebildete Mikroskoptisch 30 in x- und y-Richtung (also hier senkrecht bzw. parallel zur Papierebene) verstellt werden kann. Neben der Verstelleinrichtung 31 können auch elektromechanische Stellmittel vorgesehen sein, die beispielsweise durch eine Steuereinheit 82 angesteuert bzw. deren Position durch die Steuereinheit 82 erfasst werden kann.
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Die Steuereinheit 82 kann auch beliebige weitere motorisierte Funktionen des Lasermikrodissektionssystems 100 steuern und insbesondere eine Schnittstelle zu einem externen Steuerrechner 81, der über entsprechende Verbindungen 83 angebunden sein kann, bereitstellen. Die Steuereinheit 82 oder der Steuerrechner 81 kann auch beispielsweise mittels des Bildauswertungsmoduls 64 erhaltene Daten auswerten. Beispielsweise kann hierdurch eine Abfolge von Gewebeschichten oder anderer Strukturen der Probe 51 erkannt werden.
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Für die Lasermikrodissektion kann insbesondere eine Laserablenkeinrichtung
73 vorgesehen sein. Mittels der Laserablenkeinrichtung
73 kann der Laserstrahl
77 gegenüber einer zwischen dem ersten Umlenkspiegel
71 und dem zweiten Umlenkspiegel
72 verlaufenden optischen Achse c abgelenkt werden. Der Laserstrahl kann daher an unterschiedlichen Positionen auf den zweiten Umlenkspiegel
72 auftreffen, der beispielsweise als dichromatischer Teiler ausgebildet sein kann, und wird damit auch an unterschiedlichen Positionen auf die Probe
51 in der Objektebene fokussiert. Eine Ablenkung mittels einer Laserablenkeinrichtung
73 ist im Detail in der
EP 1 276 586 B1 gezeigt. Es sei betont, dass hier unterschiedliche Möglichkeiten zur Ablenkung eines Laserstrahls
77 bzw. zur Positionierung der Probe
51 in der Objektebene gegenüber dem Laserstrahl
77 zum Einsatz kommen können. Die Erfindung ist nicht auf das dargestellte Beispiel beschränkt.
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Im dargestellten Beispiel weist die Laserablenkeinrichtung 73 zwei massive gläserne Keilplatten 731 auf, die gegen die optische Achse c geneigt und unabhängig voneinander um die optische Achse c drehbar sind. Hierzu sind die Keilplatten 731 mit Kugellagern 732 gelagert. Jede der Keilplatten ist mit einem Zahnrad 733 verbunden. Die Zahnräder 733 können jeweils mittels Aktoren 734 gedreht werden, die mit entsprechenden Ansteuersignalen beaufschlagt werden können und entsprechend die Zahnräder 733 antreiben. Die Rotationseinrichtungen können über Positonsgeber 735 verfügen (hier nur an dem rechten Aktor 734 gezeigt). Eine durch die Positonsgeber 735 erfasste Position kann an die Steuereinheit 82 übermittelt werden.
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2 zeigt schematisch den Fall des Schneidens mittels eines Lasermikrodissektionsverfahrens, wie im Folgenden erläutert wird:
In an sich bekannter Weise wird beispielsweise mit einem Lasermikrodissektionssystems 100 gemäß 1 eine Probe 51 visualisiert. Ein interessierender Probenbereich 510 kann hierbei beispielsweise durch Färbung sichtbar gemacht sein. Dieser Probenbereich 510 soll als Dissektat einer weiteren Analyse zur Verfügung gestellt werden. Hierzu wird der Probenbereich 510 mit einer Schnittlinie 550 umgeben. Im dargestellten Ausführungsbeispiel gemäß 2A umgibt diese Schnittlinie 550 als individuelle Schnittlinie die Objektkontur des Probenbereichs 510. In der Praxis wird diese Schnittlinie 550 vom eigentlichen Probenbereich 510 um ein gewisses Delta beabstandet sein, um aufgrund des endlichen Durchmessers des Laserfokus beim Schneiden den Probenbereich 510 im Randbereich nicht zu zerstören. 2A zeigt die Aufsicht auf den Probenbereich 510, während 2D eine perspektivische Seitenansicht der Situation aus 2A darstellt.
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In an sich bekannter Weise wird mittels des in 1 dargestellten Lasermikrodissektionssystems 100 der Laserstrahl 77 entsprechend der Schnittlinie 550 verschoben, sodass der Laserstrahlfokus die Schnittlinie schreibt. Hierzu wird die Laserablenkeinrichtung 73 mittels der Steuereinheit 82 entsprechend angesteuert (vgl. die Erläuterungen zu 1). Die 2B und 2C zeigen zwei mögliche Situationen nach dem Schneiden.
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2B zeigt einen ersten Fall, bei dem zwei Stege 560 verbleiben, über die der Probenbereich 510 mit der umgebenden Probe 51 verbunden ist. 2E zeigt eine entsprechende perspektivische Seitenansicht. Es ist hieraus zu sehen, dass die von der Probe 51 abgelösten Abschnitte des Probenbereichs 510 in der Ebene der Probe 51 verbleiben. Dies stellt den optimalen Fall dar. Die beiden Stege 560 können anschließend parallel von jeweils einem auf den jeweiligen Steg 560 fokussierten Laserstrahl gleichzeitig durchtrennt werden. Auf diese Weise ist gesichert, dass der Probenbereich 510 sich sauber von der umgebenden Probe 51 löst und in einen Auffangbehälter gelangt. Weitere Details zum gleichzeitigen parallelen Durchtrennen der Stege 560 werden anhand der folgenden Figuren erläutert werden.
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Im zweiten Fall gemäß 2C und 2F ist zu erkennen, dass die von der Probe 51 abgetrennten Abschnitte des Probenbereichs 510 nicht in der Ebene der Probe 51 verbleiben, sondern aufgrund Oberflächenspannungen und/oder Eigengewicht sich aus der Ebene der Probe 51 heraus bewegen. Dies stellt den schlechten Fall dar, den es zu vermeiden gilt. In diesem Fall ist es also zweckmäßig, drei oder mehr Stege vorzusehen. Die drei oder mehr Stege sind dabei so entlang der Schnittlinie zu verteilen, dass nach dem Schneiden abgelöste Abschnitte möglichst vollständig in der Ebene der Probe 51 verbleiben. Hierbei ist es beispielsweise sinnvoll, ein weiteres Paar von Stegen 560 vorzusehen, deren Verbindungslinie ebenfalls durch den Flächenschwerpunkt des Probenbereichs 510 verläuft, wobei alle vier Stege über die Schnittlinie 550 möglichst gleich verteilt sein sollten.
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Anhand von 2B sollen die beiden Möglichkeiten des Schneidens mit zwei Laserstrahlen nochmals kurz erläutert werden. Zum Einen kann mittels eines Laserstrahls die Schnittlinie 550 geschnitten werden, bis zwei Stege 560 verbleiben. Diese beiden Stege 560 werden dann durch zwei parallele Laserstrahlen gleichzeitig durchtrennt. Es ist aber auch möglich, dass ein erster Laser den mit 551 bezeichneten Abschnitt der Schnittlinie 550 schneidet, während ein zweiter Laser den mit 552 bezeichneten Abschnitt der Schnittlinie 550 schneidet. Die beiden verbliebenen Stege 560 werden dann wiederum gleichzeitig von zwei parallel betriebenen Lasern durchtrennt. Entsprechendes gilt für den Fall, dass drei oder mehr Stege verbleiben.
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3 zeigt schematisch eine Möglichkeit des parallelen Schneidens eines Probenbereichs auf einer Probe. Hierzu wird, wie anhand von 1 bereits erläutert, ein Laserstrahl 77 auf eine Probe 51 mittels eines Mikroskopobjektivs 41 fokussiert. Die Position des Fokus des Laserstrahls 77 auf der Probe 51 wird mit Hilfe einer Laserablenkeinrichtung 73, wie sie anhand von 1 bereits erläutert wurde, gesteuert.
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Mittels eines weiteren Laserstrahls 77' mit zugeordneter weiterer Laserablenkeinrichtung 73' kann derselbe Probenbereich 510 der Probe 51 bearbeitet werden, indem beide Laserstrahlen 77 und 77' parallel und insbesondere gleichzeitig den Probenbereich 510 entlang der Schnittlinie 550 (vgl. 2) schneiden. Auf diese Weise kann die Geschwindigkeit des Dissektierens erhöht werden. Die parallelen Laser 77, 77' können also entlang derselben Schnittlinie 550 an unterschiedlichen Koordinaten gleichzeitig schneiden, aber prinzipiell auch an gleichen Koordinaten, etwa bei dicken Proben. Hierbei können die Foki der Laser 77, 77' in unterschiedlichen Probentiefen liegen, um dicke Proben schneller und effektiver zu schneiden.
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Mittels entsprechender Umlenkspiegel 72, 72' können die Achsen b, b' der Laserstrahlen 77, 77' in die optische Achse c des Objektivs 41 eingekoppelt werden.
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4 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Möglichkeit zum parallelen Bearbeiten eines Probenbereichs auf einer Probe. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen wiederum gleiche Elemente wie in den vorangegangen Figuren.
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Die Ausführungsform gemäß 4 soll als weitere Ausgestaltung des parallelen Bearbeitens eines Probenbereichs 510 auf einer Probe 51 (vgl. 3) verstanden werden. Im Vergleich zu der Ausführungsform gemäß 3 sind in 4 aber zwei Fokussierlinsen 41, 41' bzw. ein Mikroskopobjektiv 41 und eine Fokussierlinse 41' bzw. zwei Mikroskopobjektive 41, 41' vorgesehen. Somit werden die beiden Laserstrahlen 77, 77' nicht durch eine einzige Fokussierlinse bzw. ein einziges Mikroskopobjektiv 41 geführt, sondern durch jeweils ein zugeordnetes Mikroskopobjektiv oder eine zugeordnete Fokussierlinse 41 bzw. 41'. Dies ermöglicht beispielsweise nicht nur innerhalb des Sichtfelds eines Mikroskopobjektivs, sondern auch außerhalb dieses Sichtfelds und schließlich innerhalb der Sichtfelder zweier Mikroskopobjektive zu arbeiten, je nachdem ob 41 und 41' eine Fokussierlinse und ein Mikroskopobjektiv oder zwei Mikroskopobjektive bezeichnet.
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5 zeigt eine weitere Ausgestaltung der Anordnung gemäß 4. Hierbei ist ein zusätzlicher dritter Laserstrahl 77'' vorgesehen, der in der Darstellung gemäß 5 auf die Unterseite der Probe 51 gerichtet ist, während die beiden Laserstrahlen 77, 77' auf die Oberseite dieser Probe 51 gerichtet sind. Der auf die Unterseite der Probe 51 gerichtete Laserstrahl 77'' besitzt eine ihm zugeordnete Laserablenkeinrichtung 73''. Die in 5 dargestellte Vorrichtung eignet sich wiederum zum Schneiden eines einzigen Probenbereichs 510 auf der Probe 51. Hierzu sei auf die Erläuterungen im Zusammenhang mit 4 verwiesen.
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Der auf die Unterseite gerichtete Laserstrahl 77'' gemäß 5 kann insbesondere zum Schneiden dicker Probenbereiche eingesetzt werden. Beispielsweise kann der Laserstrahl 77' von oben auf die Schnittlinie geführt 550 (vgl. 2) werden, während der Laserstrahl 77'' von unten auf dieselbe Schnittlinie 550 geführt wird, so dass die Schnittlinie 550 von zwei Seiten geschnitten wird. Auf diese Weise kann ein dicker Probenbereich schonender geschnitten werden, als wenn mit einem einzigen Laserstrahl entsprechend hoher Energie nur von einer Seite aus geschnitten würde.
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Bzgl. der 4 und 5 sei weiterhin betont, dass die dort dargestellte Schrägstellung der Laserachsen nicht unbedingt nur durch die dargestellte Schrägstellung der optischen Achsen der Mikroskopobjektive bzw. Laserfokussierlinsen erreicht werden kann. Ein entsprechender Auftreffwinkel des Laserstrahls auf die Probe kann, wie anhand der 1 und 3 erläutert, auch und vorzugsweise mit Objektiven bzw. Laserfokussierlinsen erzielt werden, deren optische Achsen senkrecht auf die Probe stehen, wobei die Schrägstellungen der Laserachsen dann allein durch die zugeordneten Laserablenkeinrichtungen bewirkt werden. Die Schrägstellungen der Achsen in den 4 und 5 dienen somit eher der leichteren Verständlichkeit.
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6 zeigt schematisch eine Möglichkeit der Bereitstellung weiterer Laserstrahlen durch weitere Lasereinheiten. Hierbei sind zwei Lasereinheiten 70 und 70' in einem Lasermikrodissektionssystem 100 vorhanden (vgl. 1). Die Lasereinheiten 70, 70' erzeugen entsprechende Laserstrahlen 77, 77', die durch ihnen zugeordnete Laserablenkeinheiten 73, 73' auf einem Probenbereich geführt und dort verschoben werden.
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7 zeigt schematisch die Bereitstellung weiterer Laserstrahlen mittels einer Strahlteileranordnung. Die Lasereinheit 70 erzeugt einen Laserstrahl, der eine Strahlteileranordnung 78 durchläuft. Hierbei wird der Laserstrahl in zwei Strahlen geteilt, wobei einer der beiden Strahlen mit 77 bezeichnet ist. Der andere der beiden geteilten Strahlen sei mit 77' bezeichnet. Auf diese Weise können zwei Laserstrahlen 77, 77' erzeugt werden, deren Intensität entsprechend geringer ist als die des ursprünglichen Laserstrahls 77. Beispielsweise kann der Laserstrahl 77' an einem Umlenkspiegel 74 reflektiert und einer ihm zugeordneten Laserablenkeinrichtung 73' zugeführt werden.
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Während die Ausführungsform gemäß 6 insbesondere für Schneidprozesse sinnvoll ist, bei denen die volle Laserintensität benötigt wird, ist die Ausführungsform gemäß 7 für Prozesse vorteilhaft, für die ein Teil der ursprünglichen Laserleistung ausreichend ist.
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Schließlich zeigt 8 eine Kombinationsmöglichkeit der Ausführungsformen von den 6 und 7. Hierbei wird der von der Lasereinheit 70 erzeugte Laserstrahl 77 einer Laserablenkeinrichtung 73 zugeführt. Ein weiterer Laserstrahl wird durch eine weitere Lasereinheit 70' erzeugt. Dieser weitere Laserstrahl wird in zwei Laserstrahlen aufgespalten, wobei wiederum einer der beiden aufgespaltenen Laserstrahlen mit 77', der andere hingegen mit 77'' bezeichnet werden soll. Die Aufspaltung erfolgt wiederum in einer Strahlteileranordnung 78'. Die auf diese Weise erzeugten Teilstrahlen 77' und 77'' werden dann jeweils entsprechenden Laserablenkeinrichtungen 73' und 73'' zugeführt, wobei für den Laserstrahl 77'' wiederum ein Umlenkspiegel 74 zum Einsatz kommen kann. Eine Anordnung, wie sie in 8 gezeigt ist, kann beispielsweise zum parallelen Schneiden von dicken Proben bzw. Probenbereichen (mit Laserstrahl 77) und dünnen Proben bzw. Probenbereichen (mit den Laserstrahlen 77' und 77'') verwendet werden. Dem Fachmann erschließen sich aus den 6 bis 8 weitere Kombinationsmöglichkeiten.
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Bezugszeichenliste
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- 10
- Mikroskop
- 11
- Mikroskopfuß
- 12
- Beleuchtungseinrichtung
- 13
- Benutzereingabe-/informationseinheit
- 14
- Triebknopf
- 15
- Schutzhaube
- 30
- Mikroskoptisch
- 31
- manuelle Verstelleinrichtung
- 40
- Objektivrevolver
- 41
- Objektiv
- 41', 41''
- Laserfokussierlinse, Objektiv
- 42
- Objektiv
- 51
- Probe
- 52
- Aufnahmeeinrichtung
- 510
- Probenbereich
- 550
- Schnittlinie
- 551
- Teil der Schnittlinie
- 552
- Teil der Schnittlinie
- 560
- Steg
- 60
- Tubuseinheit
- 61
- Auskoppeleinrichtungen
- 62
- Okularpaar
- 63
- Bilderfassungseinheit
- 64
- Bildauswertungsmodul
- 70, 70'
- Lasereinheit
- 71
- Umlenkspiegel
- 72, 72'
- Umlenkspiegel
- 73, 73', 73''
- Laserablenkeinrichtung
- 74
- Umlenkspiegel
- 75
- Laserlichtquelle
- 76
- Auflichteinheit
- 77, 77', 77''
- Laserstrahl
- 78, 78'
- Strahlteileranordnung
- 731
- Keilplatten
- 732
- Kugellager
- 733
- Zahnrad
- 734
- Aktor
- 735
- Positionsgeber
- 81
- Steuerrechner
- 82
- Steuereinheit
- 83
- Verbindungen
- 90
- Kondensoreinheit
- 100
- Lasermikrodissektionssystem
- 200
- Koordinatensystem
- a
- Beobachtungsstrahlengangachse
- b, b'
- Laserstrahlachse
- c, c', c''
- optische Achse
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- EP 1276586 B1 [0005, 0020, 0049, 0058]
- DE 10043504 A1 [0009, 0009]
