WO2018002304A1 - Laser-mikroskopsystem - Google Patents

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WO2018002304A1
WO2018002304A1 PCT/EP2017/066278 EP2017066278W WO2018002304A1 WO 2018002304 A1 WO2018002304 A1 WO 2018002304A1 EP 2017066278 W EP2017066278 W EP 2017066278W WO 2018002304 A1 WO2018002304 A1 WO 2018002304A1
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laser
laser beam
lens
microscope
beam path
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Application number
PCT/EP2017/066278
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Inventor
Falk Schlaudraff
Original Assignee
Leica Microsystems Cms Gmbh
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Publication date
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    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/006—Optical details of the image generation focusing arrangements; selection of the plane to be imaged
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    • G02B21/32—Micromanipulators structurally combined with microscopes

Definitions

  • the present invention relates to a laser microscope system having a microscope stage for receiving a sample and a lens, which defines an optical axis and a rear focal plane of the objective, and with a laser and a downstream laser optics, the laser beam generated by the laser in such
  • the microscope is coupled, that it passes through the rear focal plane of the lens at a fixed point and the lens focuses the laser beam on an object plane of the microscope.
  • laser microscope system should be understood as meaning, for example, a laser microdissection system, but also other systems which use a microscope and a laser beam coupled into the microscope objective, for example systems used for laser excitations (eg "optogenetics") ,
  • opticals systems used for laser excitations
  • methods for processing biological samples by laser microdissection have existed since the mid-1970s and have been continuously developed since then.
  • cells, tissue regions, etc. can be isolated from a biological sample ("object”) and recovered as so-called dissectates.
  • a dissectate can be isolated from a sample by means of an ultraviolet laser beam through a cut line produced by the laser beam, which drops under the influence of gravity into a suitable dissektate collecting container.
  • the dissectate can be cut out of the sample also together with a membrane attached to the sample.
  • laser capture microdissection a thermoplastic membrane is heated by means of a corresponding infrared laser beam. The membrane fuses with the desired area of the sample and can be removed by tearing in a subsequent step.
  • dissectate by means of the laser beam to a lid of a Dissektatauffang practicers.
  • inverse microscope systems for laser microdissection by means of a transport pulse upwardly transported dissectates can also be attached to the bottom of a dissected collecting container which is provided with an adhesive coating.
  • Known microscope systems for laser microdissection have a Auflicht issued, in the beam path of a laser beam is coupled. The laser beam is focused by the particular microscope objective used on the sample, which rests on a motorized microscope stage. A cutting line can be created by moving the microscope stage during cutting in order to move the sample relative to the stationary laser beam.
  • this has, inter alia, the disadvantage that the sample can not be readily observed during the generation of the cutting line, since the sample moves in the field of vision and the image appears blurred or blurred without further compensation measures.
  • laser microdissection systems that have laser deflection or laser scanning devices that are set up to move the laser beam or its point of impact on the stationary sample to be dissected are more advantageous.
  • Derar- Current laser microdissection systems which are also to be used in the context of the present invention and offer special advantages there, are explained in detail below.
  • a particularly advantageous laser microscope system which has a laser deflection device with mutually adjustable glass wedges in the laser beam path is described, for example, in EP 1 276 586 B1.
  • pulsed lasers are generally used, a hole or depression being produced in the sample by each laser pulse.
  • a cutting line is created by an arrangement of such holes or depressions, possibly with an overlap.
  • the laser microdissection can be used to obtain single cells, cell compartments or defined tissue areas with, for example, a diameter of about 500 ⁇ m. With suitable control, the laser beam can also clearly cut larger areas, which are limited only by the size of the slide on which the sample to be cut is arranged.
  • the dissectates only have a size in the ⁇ range, for example around 20 ⁇ m or below, which are separated by a laser beam from the surrounding tissue and subsequently subjected to different diagnostic analysis methods, for example.
  • laser microdissection can be used to isolate specific (tumor) cells from a microscopic section and to screen them for specific metabolites, RNA expression levels, DNA mutations or proteins.
  • a scanning device is used in order to shift the laser beam focus perpendicular to the optical axis in the object plane.
  • This scanning device operates with two optical wedges (prisms, glass wedge plates), whose surfaces are inclined to the optical axis (wedge angle) and which are rotatably mounted about the optical axis. By rotating the optical wedges against each other, a beam deflection of the laser beam is generated so that the laser beam focus can be moved in a defined manner in the object plane to dissect a sample located there.
  • this scanning device is expressly made to the said European Patent EP 1 276 586 B1.
  • corresponding systems are distinguished by an upright basic stand with a fixed objective revolver that is not movable in the z-direction (perpendicular to the object plane), the microscope stage being moved to the focusing position in said z-direction.
  • the microscope stage is fixed in the x and y directions (ie in the object plane).
  • Scanning devices for moving the laser beam focus in the object plane can not be transferred to inverted microscopes or those with fixed microscope systems that can not be moved in the z direction, which are transmitted via the microscope objective or objective nosepiece and not via the z movement of the microscope stage adjust the focus.
  • the laser beam in order to deflect the laser beam focus, in the optical-wedge scanning apparatus, it is necessary that the laser beam always passes through the back focal plane of the objective at the same position to ensure reliable cutting and impact of the laser focus on the sample .
  • the position of the rear focal plane simultaneously changes, so that the laser beam passes through another point in this plane.
  • Object of the present invention is therefore to provide a laser microscope system, which offers the possibility to use a movable focus adjustment in the direction of the optical axis lens, without having to accept the disadvantages mentioned above.
  • the laser microscope system for laser microdissection is to be used with a scanning device which shifts the laser beam focus perpendicular to the optical axis in the object plane of the microscope. Summary of the invention
  • a laser microscope system which has a microscope with a microscope stage for receiving a sample and at least one objective, which defines an optical axis and a rear focal plane of the objective, as well as a laser, in particular a UV laser, and a downstream laser optics, which couples the laser beam generated by the laser in the microscope so that the laser beam passes through the rear focal plane of the lens at a fixed point and the lens focuses the laser beam on an object plane of the microscope the lens or the entire objective turret is designed to be displaceable in the direction of the optical axis in the present case for setting the focus.
  • the laser optics has an offset lens, which is displaceable along the axis of the laser beam path to move the laser beam focus in the direction of the optical axis of the lens.
  • the laser optics additionally has a compensation lens arranged in the laser beam path and displaceable along the axis of the laser beam path.
  • a control device and / or a mechanical coupling device which makes a shift of this compensation lens along the axis of the laser beam path, if the focus adjustment, a shift of the lens is made in the direction of the optical axis, so that the laser beam continues, even after focus adjustment by the fixed point of the rear focal plane of the lens.
  • a laser microscope system which via a microscope with a microscope stage for receiving a Sample and at least one lens which defines an optical axis and a rear focal plane of the lens has, as well as a laser, in particular a UV laser, and a downstream laser optics, which couples the laser beam generated by the laser in the microscope so that the Laser passes through the rear focal plane of the lens at a fixed point and the lens focuses the laser beam on an object plane of the microscope, again in this case, the lens for focus adjustment in the direction of the optical axis is slidably formed.
  • a laser in particular a UV laser
  • the laser optics has an offset lens, which is displaceable along the axis of the laser beam path in order to displace the laser beam focus in the direction of the optical axis of the objective.
  • the focus of the (UV) laser can be made to coincide with the focus of the objective and also with the illumination focus.
  • the laser optics as such ie, initially without the compensation lens according to the first aspect of the invention
  • the corresponding features according to the first or second aspect of the invention both lead to the objective that the laser beam coupled into the microscope runs unchanged through the fixed point of the rear focal plane of the objective, even if a displacement of the objective takes place along the optical axis for focus adjustment becomes.
  • This goal can be achieved through two different measures.
  • said compensating lens in the laser optics is displaced along the axis of the laser beam path to compensate for the displacement of the rear exit pupil plane of the lens at focus adjustment.
  • the necessary for this compensation size of the displacement of the compensation lens can be determined in practice, for example, empirically.
  • the corresponding relationship can be stored, for example, in a look-up table, which is accessed by the control device.
  • a mechanical coupling device can be provided, which can be provided in a mechanical way, for example by means of mechanical means. mechanical displacement coupling with a displacement of the lens makes the necessary shift of the compensation lens.
  • a displacement of the rear exit pupil plane when the objective is moved in the direction of the optical axis for focus adjustment is compensated by a corresponding movement of the carriage on which the laser optics are at least partially, preferably with all components except a deflecting mirror. which deflects the laser beam in the direction of the optical axis of the lens, possibly also together with the laser is mounted.
  • the carriage can be moved in the same direction so that the distance of the laser optics, in particular a scanning device present in the laser optics, from the rear focal plane of the objective is maintained.
  • a displacement of the carriage along the axis of the laser beam path with a displacement of the lens along the optical axis mechanically, in particular in the ratio of 1: 1, is coupled via a mechanical coupling device.
  • a displacement of the objective for focus adjustment then inevitably leads to a corresponding displacement of the carriage along the axis of the laser beam path, so that said distance to the rear focal plane of the objective always remains constant.
  • the laser optics additionally has a compensation lens arranged in the laser beam path and displaceable along the axis of the laser beam path (according to the first aspect of the invention), wherein the control device and / or the mechanical control device Coupling device is then designed such that a displacement of the carriage and / or the compensation lens along the axis of the laser beam path is made when a displacement of the lens is made for focus adjustment, so that the laser beam continues to pass through the fixed point of the rear focal plane of the lens.
  • This embodiment thus corresponds to a combination of the first and second aspects of the invention and allows for certain Punctures that require large z-directional displacements of the lens, such as cutting thick samples with three-dimensional cut lines, or gradual cutting thick materials in z-stacks, greater flexibility, and possibly accuracy.
  • the laser optics includes a scanning device to move the laser beam focus perpendicular to the optical axis in the object plane.
  • Such scanning devices are used in laser microdissection systems, but can also be used for laser excitation systems in which a laser beam scans a sample in order, for example, to excite it for fluorescence radiation.
  • the term "axis of the laser beam path" is understood to mean the axis of the undeflected laser beam path.
  • a scanning device which has two rotatable about the axis of the laser beam path optical wedges, wherein by the relative rotation of the optical wedges to each other, the resulting deflection angle of the laser beam with respect to the optical axis is variable and wherein the laser beam for all deflection angles above mentioned solid point of the rear exit pupil of the lens, wherein the exit pupil coincides with the rear focal plane.
  • a scanning device is known in particular from the already mentioned EP 1 276 586 B1.
  • the optical wedges are realized there as a glass wedge plates, which generate a beam deflection by their wedge angle, wherein the rotation angle of the glass wedge plates relative to each other, the resulting deflection angle of the laser beam with respect to the axis of the laser beam path is variable.
  • the laser beam passes through a fixed point of the rear focal plane of the lens for all deflection angles.
  • the mentioned fixed point is preferably chosen in the middle of the exit pupil. This has the advantage that the laser beam is perpendicular to the sample.
  • Such a scanning device is designed in particular as part of a laser microdissection system, as described in the exemplary embodiments.
  • a laser microscope system advantageously has a laser optical system in which the compensating lens, which is displaceable in the direction of the axis of the laser beam path, is connected downstream of the scanning device - with respect to the direction of the laser beam path.
  • the axis of the laser beam path to be coupled into the microscope is perpendicular to the optical axis of the microscope objective.
  • the laser beam path is coupled into the microscope and guided to the microscope objective, of which the laser beam is then focused on the object plane of the microscope.
  • the deflection mirror is usually a beam splitter, which passes from the sample through the microscope objective light coming from the observation beam path in the direction of the microscope tube while it reflects the light of the laser beam as completely as possible.
  • the compensation lens used for the laser microscope system according to the first aspect of the invention is advantageously arranged between the scanning device and deflection mirror in such a construction.
  • a deflecting mirror for coupling the laser beam path into the optical axis of the objective, wherein the deflecting mirror is expediently connected downstream of the scanning device. It is advantageous in such a construction, when the carriage carries those elements of the laser optics, which are connected upstream of the deflection mirror. This can in particular be all elements of the laser optics including the laser itself with the exception of the deflecting mirror. If a compensation lens is provided in the laser microscope system according to the second aspect of the invention, it is advantageously arranged between the scanning device and the deflection mirror in such a construction.
  • said offset lens which is slidable along the axis of the laser beam path to shift the laser beam focus in the optical axis direction of the lens, allows the (UV) laser beam focus in accordance with the focus of the illumination beam path in the microscope bring.
  • the offset lens is advantageously preceded by said scanning device and further preceded in particular by a laser beam aperture diaphragm in the laser optics, wherein the laser beam aperture diaphragm is in turn expediently connected upstream of the scanning device.
  • the object or the sample is also visually observed by means of the microscope.
  • the laser microscope system according to the first and / or second aspect advantageously on a lighting device with a light source and illumination optics for generating a particular visual illumination beam path, wherein the illumination optics comprises a deflection mirror for coupling the illumination beam path in the optical axis of the lens.
  • the illumination beam path can be guided to the sample via the objective.
  • the invention allows the use of a laser microdissection system with a scanning device based on the above-described rotatable optical wedges in combination with an objective displaceable for focus adjustment, as commonly used in inverted microscopes or the fixed-stage microscope already mentioned comes.
  • a laser microdissection system with a scanning device based on the above-described rotatable optical wedges in combination with an objective displaceable for focus adjustment, as commonly used in inverted microscopes or the fixed-stage microscope already mentioned comes.
  • Figure description shows schematically an embodiment of a laser microscope system according to the first aspect of the invention before focus adjustment
  • FIG. 2 shows the embodiment according to FIG. 1 after focus adjustment
  • FIG. 3 schematically shows an embodiment of a laser microscope system according to the second aspect of the invention before focus adjustment
  • FIG. 4 shows the embodiment according to FIG. 3 after focus adjustment.
  • the figures show a schematic representation of embodiments of a laser microscope system according to the first and second aspects of the invention.
  • the laser microscope system is designated 1 in each case and designed as a laser microdissection system.
  • the laser microscope system 1 has a microscope 10 and a UV laser 30 with a downstream laser optics 20.
  • the laser optical system 20 is used for coupling the laser beam 31 generated by the laser 30 into the microscope 10.
  • the microscope 10 has in a known manner via an objective 1 1 and a tube 16 to which schematically illustrated optical and / or electronic outputs for an eyepiece and / or a camera can be mounted.
  • the laser microscope system 1 is a lighting device with a light source 33 and a known per se and therefore not explained in detail lighting optics 35 for generating a visual illumination beam path 34, wherein the illumination optical system 35 has a deflection mirror 36 for coupling the illumination beam path 34 in the optical axis 12 of the lens 1 1. In the case shown, the illumination beam path 34 is guided over the lens 1 1 to the sample.
  • the laser beam 31 generated by the UV laser 30 is coupled into the microscope 10 via a downstream laser optics 20.
  • the laser optical system 20 first a negative lens 21 and a positive lens 22, which expand the laser beam 31 and collimate, and corresponding deflection devices 23 to supply the laser beam with the expanded laser beam cross section to the subsequent elements of the laser optics 20.
  • the laser beam 31 next passes through an attenuator 24, by means of which the energy of the laser beam is adjustable.
  • the attenuator 24 is followed by the offset lens 25, which brings the UV laser beam focus with the VIS focus of the illumination beam path 34 to cover.
  • the offset lens 25 can be moved along the axis 32 of the laser beam path.
  • the offset lens 25 is the laser beam aperture 26 downstream.
  • the opening of the laser beam aperture 26 determines the diameter of the laser beam 31 and thus the cutting width of the laser beam.
  • the laser beam 31 then passes into a scanning device 27, which has two rotatable about the axis 32 of the laser beam path optical wedges 271 and 272, wherein by rotation of these optical wedges 271, 272 relative to each other, the resulting deflection angle ⁇ of the laser beam 31 with respect to the optical axis 12 can be varied.
  • a scanning device 27 of EP 1 276 586 B1 are to be taken from and will therefore not be explained in detail here.
  • the laser beam 31 is coupled by a deflection mirror 28 which is formed in a beam splitter in the microscope 10 such that it passes through the lens 1 1 and is focused by the lens 1 1 in a focal plane 15 (front focal plane).
  • the laser beam 31 passes for all possible deflection angles ⁇ through the same fixed point 13 of the rear focal plane 17, which may preferably lie in the center, ie on the optical axis 12. From there it passes through the lens 1 1 and is focused by this in the focal plane 15.
  • the object plane 14 must coincide with the focal plane 15, so that an object plane 14 is located on the object plane 14. Liehe sample (not shown here) can be cut.
  • the laser beam focus in the object plane 14, that is to say on the sample to be cut is shifted by means of the scanning device 27 by setting corresponding deflection angles ⁇ .
  • a cut line is then produced and a desired region of the sample is cut out with the laser beam.
  • FIG. 1 now shows an embodiment of a laser microdissection system 1 in which the objective 1 1 or an objective revolver carrying the objective 11 is designed to be displaceable in the direction of the optical axis 12 (indicated by the double arrow).
  • the focus adjustment was made by moving the microscope stage in the direction of the optical axis 12. Since this did not lead to a displacement of the rear focal plane 17 of the lens 1 1, it was ensured that the deflected laser beam 31 always passes through the fixed point 13.
  • the lens 1 1 is designed to be displaceable in the direction of the optical axis 12 for focus adjustment. For setting the focus, the lens 1 1 is moved downward in the illustrated situation according to FIG. 1 until the focal plane 15 coincides with the object plane 14.
  • the rear focal plane 17 shifts in a corresponding manner, so that it is no longer guaranteed that the laser beam 31 passes through said point 13 of the rear focal plane 17.
  • the compensation lens designated 29 which is formed as part of the laser optics 20 displaceable along the axis 32 of the laser beam path, a shift of the point of incidence of the laser beam 31 on the rear focal plane 17 in a displacement of the lens 1 1 can be compensated Siert.
  • the compensation lens 29 is in the position shown in Figure 1.
  • FIG. 1 shows the object plane 14 does not coincide with the focal plane 15.
  • 15 only denotes the focus of the microscope objective 1 1 for the illumination or observation beam path used.
  • the illumination beam path 19 is shown only schematically.
  • the actual focal plane runs in a known manner through the point denoted by 15 parallel to the object plane 14 and parallel to the rear lens focal plane 17.
  • the objective 1 1 is now moved toward the object plane 14 in the direction of the optical axis 12 until the focal plane 15 coincides with the object plane 14.
  • FIG. 2 shows the situation in which the objective 1 1 focuses the laser beam 31 onto the focal plane 15, which coincides with the object plane 14 of the microscope 10. It can also be seen from FIG.
  • the compensation lens 29 of the laser optical system 20 was displaced slightly in the opposite direction to the objective displacement for focus adjustment (ie, as it were away from the object), ie, in the direction of the scanning device 27 along the axis 32 of the laser beam path.
  • the displacement of the compensation lens 29 is controlled by a control device 60, which receives the displacement of the lens 1 1 as an input signal.
  • the connection with the resulting necessary displacement of the compensation lens 29 can be stored in the control device 60 as a look-up table or as a functional relationship.
  • the displacement of the compensation lens 29 can also be done mechanically with the displacement of the lens 1 1 via a mechanical coupling device, which may also be designated 60.
  • Figures 1 and 2 make it clear that by moving the compensation lens 29, the laser microdissection system 1 shown can also be used with a focusable lens 1 1. In this way it is also possible to focus within a sample to be cut in different sample areas (parallel to the optical axis 12). This is particularly useful for cutting thick samples. After completion of the cutting operation, the cut-out microdissect is collected by a receptacle 50 and can then be sent for further analysis.
  • Figures 3 and 4 show an embodiment of a laser microscope system according to the second aspect of the invention. Again, the laser microscope system is embodied as a laser microdissection system 1. With respect to the structure and operation, reference is made to the above descriptions.
  • Figure 3 shows a structure in which the essential components of the laser optics 20 are mounted on a carriage 40.
  • the laser 30 can be arranged to be movable with the carriage 40.
  • the following elements of the laser optics 20 are located on the carriage 40: the deflection devices 23 and the negative lens 21 and the positive lens 22; Furthermore, the elements connected in series attenuator 24, offset lens 25, laser beam aperture 26 and scanning device 27.
  • the person skilled in the art other realization options can be seen.
  • elements between which a parallel laser beam path extends can be pulled apart without affecting the beam path.
  • the corresponding preceding elements of the laser optics need not be mounted on the carriage 40 in such a case, while only the subsequent elements of the laser optics 20 are to be mounted on the carriage 40.
  • FIG. 3 shows, analogously to FIG. 1, a situation in which the focal plane 15 does not coincide with the object plane 14 of the microscope 10.
  • the lens 1 1 is displaced along the optical axis 12 until the focal plane 15 coincides with the object plane 14.
  • FIG. 4 shows an objective 11 displaced in the direction of the optical axis 12 (the displacement is again indicated by the double arrow).
  • Such a displacement results in a corresponding displacement of the rear focal plane 17, whereby the laser beam 31 would no longer pass through the same point 13 of the rear focal plane 17 without countermeasures as in Figure 3.
  • a displacement of the carriage 40 is coupled to a displacement of the objective 11.
  • This coupling can take place via a control device 60 or alternatively also mechanically by a mechanical coupling device, which may also be designated 60.
  • the displacement of the carriage 40 takes place in the same direction to the displacement of the lens 1 first
  • the shift is preferably carried out in the ratio 1: 1.
  • the laser optical system 20 can also have an equalizing lens 29 according to the first aspect of the invention.
  • the compensation lens between scanning device 27 and deflecting mirror 28 is arranged. It may be mounted on the carriage 40, but not on the carriage 40. In both cases, the potential field of application of the system 1 is increased in terms of flexibility and the possibility of dissection of larger sample areas in the z-direction.
  • the control device 60 and / or the mechanical coupling device is designed such that a displacement of the carriage 40 and / or the compensation lens 29 along the axis 32 of the laser beam path is made when a shift of the lens 1 1 takes place for focus adjustment, so that the laser beam 31 continues through the fixed point 13, in particular the center of the rear focal plane 17 of the lens 1 1 extends.
  • the invention has been explained with reference to an upright microscope 10. However, it can also be implemented without restriction on an inverted microscope in which the objective or the objectives are arranged below the microscope stage 18 and the receiving container for the dissected portions is arranged above the microscope stage 18.
  • a method of laser-assisted transfer of the dissectates from the sample to the receptacle is known in the art.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Laser-Mikroskopsystem (1) mit einem Mikroskop (10) mit einem Mikroskoptisch (18) zur Aufnahme einer Probe und einem Objektiv (11), das eine optische Achse (12) und eine hintere Brennebene (17) des Objektivs (11) definiert, und mit einem Laser (30) und einer nachgeschalteten Laseroptik (20), die den vom Laser (30) erzeugten Laserstrahl (31) derart in das Mikroskop (10) einkoppelt, dass dieser die hintere Brennebene (17) des Objektivs (11) an einem festen Punkt (13) durchläuft und das Objektiv (11) den Laserstrahl (31) auf eine Objektebene (14) des Mikroskops (10) fokussiert, wobei das Objektiv (11) zur Fokuseinstellung in Richtung der optischen Achse (12) verschiebbar ausgebildet ist, wobei die Laseroptik (20) eine Offset-Linse (25) aufweist, die entlang der Achse (32) des Laserstrahlengangs verschiebbar ist, um den Laserstrahlfokus in Richtung optischer Achse (12) des Objektivs (11) zu verschieben, wobei die Laseroptik (20) zusätzlich eine im Laserstrahlengang angeordnete und entlang der Achse (32) des Laserstrahlengangs verschiebbare Ausgleichslinse (29) aufweist, und wobei eine Steuereinrichtung (60) und/oder eine mechanische Kopplungseinrichtung vorgesehen ist, die eine Verschiebung der Ausgleichslinse (29) entlang der Achse (32) des Laserstrahlengangs vornimmt, wenn zur Fokuseinstellung eine Verschiebung des Objektivs (11) vorgenommen wird, sodass der Laserstrahl (31) weiterhin durch den festen Punkt (13) der hinteren Brennebene (17) des Objektivs verläuft. Alternativ oder zusätzlich zu einer verschiebbaren Ausgleichslinse (29) kann die Laseroptik (20) auf einem Schlitten (40) montiert sein, der entlang der Achse (32) des Laserstrahlengangs entsprechend einer Verschiebung des Objektivs (11) entlang der optischen Achse (12) verschoben wird.

Description

Laser-Mikroskopsystem
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Laser-Mikroskopsystem mit einem Mikroskoptisch zur Aufnahme einer Probe und einem Objektiv, das eine optische Achse und eine hin- tere Brennebene des Objektivs definiert, sowie mit einem Laser und einer nachgeschalteten Laseroptik, die den vom Laser erzeugten Laserstrahl derart in das Mikroskop einkoppelt, dass dieser die hintere Brennebene des Objektivs an einem festen Punkt durchläuft und das Objektiv den Laserstrahl auf eine Objektebene des Mikroskops fokussiert.
Stand der Technik
Unter dem Begriff "Laser-Mikroskopsystem" soll vorliegend beispielsweise ein Laser- mikrodissektionssystem verstanden werden, aber auch andere Systeme, die ein Mikro- skop und einen in das Objektiv des Mikroskops eingekoppelten Laserstrahl einsetzen, beispielsweise für Laseranregungen (z.B. "Optogenetics") eingesetzte Systeme. Der Einfachheit halber wird im Weiteren insbesondere auf Lasermikrodissektionssysteme Bezug genommen, ohne die vorliegende Erfindung hierauf zu beschränken. Verfahren zur Bearbeitung biologischer Proben durch Lasermikrodissektion existieren bereits seit Mitte der 1970er Jahre und wurden seitdem kontinuierlich weiterentwickelt. Bei der Lasermikrodissektion können Zellen, Geweberegionen usw. aus einer biologischen Probe ("Objekt") isoliert und als sogenannte Dissektate gewonnen werden. Ein besonderer Vorteil der Lasermikrodissektion ist der kurze Kontakt der Probe mit dem Laserstrahl, durch den diese kaum verändert wird. Die Gewinnung der Dissektate kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Beispielsweise kann in bekannten Verfahren aus einer Probe mittels eines Ultraviolettlaserstrahls durch eine mit dem Laserstrahl erzeugte Schnittlinie ein Dissektat isoliert werden, das unter dem Einfluss der Schwerkraft in einen geeigneten Dissektatauffang- behälter fällt. Das Dissektat kann dabei aus der Probe auch zusammen mit einer an der Probe anheftenden Membran ausgeschnitten werden. Bei der sogenannten "Laser Capture Microdissection" wird hingegen eine thermoplastische Membran mittels eines entsprechenden Infrarot-Laserstrahls erwärmt. Dabei verschmilzt die Membran mit dem gewünschten Bereich der Probe und kann in einem darauffolgenden Schritt durch Reißen entfernt werden. Eine weitere Alternative besteht darin, das Dissektat mittels des Laserstrahls an einen Deckel eines Dissektatauffangbehälters anzuheften. Bei bekannten inversen Mikroskopsystemen zur Lasermikrodissektion können mittels eines Transportpulses nach oben transportierte Dissektate auch an den Boden eines Dissektatauffangbehälters, der mit einer adhäsiven Beschichtung versehen ist, angeheftet werden. Bekannte Mikroskopsysteme zur Lasermikrodissektion weisen eine Auflichteinrichtung auf, in deren Strahlengang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv auf die Probe fokussiert, die auf einem motorisch verfahrbaren Mikroskoptisch aufliegt. Eine Schnittlinie kann dadurch erzeugt werden, dass der Mikroskoptisch beim Schneiden verfahren wird, um die Pro- be relativ zu dem feststehenden Laserstrahl zu bewegen. Dies hat jedoch unter Anderem den Nachteil, dass die Probe während des Erzeugens der Schnittlinie nicht ohne weiteres betrachtet werden kann, da sich die Probe im Gesichtsfeld bewegt und das Bild ohne weitere Kompensationsmaßnahmen verschwommen bzw. verschmiert erscheint.
Vorteilhafter sind daher Lasermikrodissektionssysteme, die Laserablenk- bzw. Laserscaneinrichtungen aufweisen, die dazu eingerichtet sind, den Laserstrahl bzw. dessen Auftreffpunkt auf der zu dissektierenden feststehenden Probe zu bewegen. Derar- tige Lasermikrodissektionssysteme, die auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen sollen und dort besondere Vorteile bieten, werden unten im Detail erläutert. Ein besonders vorteilhaftes Laser-Mikroskopsystem, das eine Laserablenkeinrichtung mit gegeneinander verstellbaren Glaskeilen im Laserstrahlengang auf- weist, ist beispielsweise in der EP 1 276 586 B1 beschrieben.
In beiden Fällen, also in Systemen mit bewegter oder feststehender Probe, wird in der Regel mit gepulsten Lasern gearbeitet, wobei durch jeden Laserpuls ein Loch bzw. eine Vertiefung in der Probe erzeugt wird. Eine Schnittlinie entsteht durch eine Anei- nanderreihung derartiger Löcher bzw. Vertiefungen, gegebenenfalls mit Überlappung.
Die Lasermikrodissektion kann zur Gewinnung von Einzelzellen, Zellkompartimenten oder definierten Gewebebereichen mit beispielsweise einem Durchmesser von etwa 500 μηι genutzt werden. Bei geeigneter Ansteuerung kann der Laserstrahl auch deut- lieh größere Bereiche ausschneiden, die lediglich durch die Größe des Objektträgers begrenzt sind, auf welchem die zu schneidende Probe angeordnet ist.
In der Regel haben die Dissektate jedoch nur eine Größe im μΓΤΐ-Bereich, beispielsweise um die 20 μηι oder darunter, die mit einem Laserstrahl vom umliegenden Gewe- be separiert und anschließend beispielsweise unterschiedlichen diagnostischen Analyseverfahren unterworfen werden. In der Onkologie kann die Lasermikrodissektion beispielsweise dafür eingesetzt werden, um spezifische (Tumor-) Zellen aus einem mikroskopischen Schnitt zu isolieren und diese auf spezifische Metaboliten, RNA- Expressionslevel, DNA-Mutationen oder Proteine zu untersuchen.
Bei dem oben erwähnten Lasermikrodissektionssystem gemäß EP 1 276 586 B1 kommt eine Scaneinrichtung zum Einsatz, um den Laserstrahlfokus senkrecht zur optischen Achse in der Objektebene zu verschieben. Diese Scaneinrichtung arbeitet mit zwei optischen Keilen (Prismen, Glas-Keilplatten), deren Flächen gegen die optische Achse geneigt sind (Keilwinkel) und die um die optische Achse drehbar gelagert sind. Durch Drehung der optischen Keile gegeneinander wird eine Strahlablenkung des Laserstrahls erzeugt, sodass der Laserstrahlfokus auf definierte Weise in der Objektebene verschoben werden kann, um eine dort befindliche Probe zu dissektieren. Bezüglich Aufbau- und Funktionsweise dieser Scaneinrichtung sei ausdrücklich auf die genannte europäische Patentschrift EP 1 276 586 B1 verwiesen. In der Praxis zeichnen sich entsprechende Systeme durch ein aufrechtes Grundstativ mit festem, nicht in z-Richtung (senkrecht zur Objektebene) beweglichen Objektivrevolver aus, wobei zur Fokusein- Stellung der Mikroskoptisch in besagte z-Richtung bewegt wird. Während der Dissektion ist der Mikroskoptisch in x- und y-Richtung (also in der Objektebene) fest.
Andere Lasermikrodissektionssysteme basieren in der Regel auf inversen Mikroskopen und bedienen sich eines fixen Laserstrahls (ohne Scaneinrichtung), sodass die Probe mittels Bewegung des Mikroskoptisches in x- und y-Richtung geschnitten wird. Die Fokuseinstellung erfolgt bei solchen Systemen durch Bewegen des Objektivrevolvers in z-Richtung, der Mikroskoptisch selbst kann in z-Richtung dann in der Regel nicht bewegt werden. Nachteil des Standes der Technik ist, dass die auf optischen Keilen basierenden
Scaneinrichtungen zur Verschiebung des Laserstrahlfokus in der Objektebene nicht auf inverse Mikroskope oder solche mit in z-Richtung nicht bewegbaren Mikroskoptischen ("Fixed Stage Systeme") übertragen werden können, welche über das Mikroskopobjektiv bzw. den Objektivrevolver und nicht über die z-Bewegung des Mikroskoptisches die Fokuseinstellung vornehmen. Zur Ablenkung des Laserstrahlfokus ist es bei der auf optischen Keilen beruhenden Scaneinrichtung nämlich notwendig, dass der Laserstrahl immer die hintere Brennebene des Objektivs ("Back Focal Plane") an derselben Stelle durchläuft, um ein zuverlässiges Schneiden und Auftreffen des Laserfokus auf die Probe zu garantieren. Bei einer Bewegung des Mikroskopobjektivs zur Fokuseinstellung in z-Richtung verändert sich zugleich die Position der hinteren Brennebene, sodass der Laserstrahl eine andere Stelle in dieser Ebene durchtritt.
Aufgabe vorliegender Erfindung ist es deshalb, ein Laser-Mikroskopsystem anzugeben, das die Möglichkeit bietet, ein zur Fokuseinstellung in Richtung der optischen Achse verschiebbares Objektiv einzusetzen, ohne die oben genannten Nachteile in Kauf nehmen zu müssen. Insbesondere soll das Laser-Mikroskopsystem zur Laser- mikrodissektion mit einer Scaneinrichtung verwendet werden, die den Laserstrahlfokus senkrecht zur optischen Achse in der Objektebene des Mikroskops verschiebt. Kurzfassung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird ein Laser-Mikroskopsystem mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche vorgeschlagen. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der jeweiligen Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Vorteile der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Laser-Mikroskopsystem vorge- schlagen, welches über ein Mikroskop mit einem Mikroskoptisch zur Aufnahme einer Probe und mindestens einem Objektiv, das eine optische Achse und eine hintere Brennebene des Objektivs definiert, verfügt sowie über einen Laser, insbesondere einen UV-Laser, und einer nachgeschalteten Laseroptik, die den vom Laser erzeugten Laserstrahl derart in das Mikroskop einkoppelt, dass der Laserstrahl die hintere Brenn- ebene des Objektivs an einem festen Punkt durchläuft und das Objektiv den Laserstrahl auf eine Objektebene des Mikroskops fokussiert, wobei das Objektiv bzw. der gesamte Objektivrevolver im vorliegenden Fall zur Fokuseinstellung in Richtung der optischen Achse verschiebbar ausgebildet ist. Die Laseroptik weist eine Offset-Linse auf, die entlang der Achse des Laserstrahlengangs verschiebbar ist, um den Laser- Strahlfokus in Richtung optischer Achse des Objektivs zu verschieben. Hierdurch kann der Fokus des (UV-) Lasers mit dem Fokus des Objektivs und - insbesondere wenn die Mikroskopbeleuchtung durch das Objektiv geführt wird - auch mit dem beispielsweise visuellen Beleuchtungsfokus zur Deckung gebracht werden. Die Laseroptik weist zusätzlich eine im Laserstrahlengang angeordnete und entlang der Achse des Laser- Strahlengangs verschiebbare Ausgleichslinse auf. Weiterhin ist eine Steuereinrichtung und/oder eine mechanische Kopplungseinrichtung vorgesehen, die eine Verschiebung dieser Ausgleichslinse entlang der Achse des Laserstrahlengangs vornimmt, wenn zur Fokuseinstellung eine Verschiebung des Objektivs in Richtung der optischen Achse vorgenommen wird, sodass der Laserstrahl weiterhin, also auch nach Fokuseinstellung durch den festen Punkt der hinteren Brennebene des Objektivs verläuft.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Laser-Mikroskopsystem vorgeschlagen, welches über ein Mikroskop mit einem Mikroskoptisch zur Aufnahme einer Probe und mindestens einem Objektiv, das eine optische Achse und eine hintere Brennebene des Objektivs definiert, verfügt, sowie über einen Laser, insbesondere einen UV-Laser, und eine nachgeschaltete Laseroptik, die den vom Laser erzeugten Laserstrahl derart in das Mikroskop einkoppelt, dass der Laser die hintere Brennebene des Objektivs an einem festen Punkt durchläuft und das Objektiv den Laserstrahl auf eine Objektebene des Mikroskops fokussiert, wobei wiederum in diesem Fall das Objektiv zur Fokuseinstellung in Richtung der optischen Achse verschiebbar ausgebildet ist. Die Laseroptik weist auch hier eine Offset-Linse auf, die entlang der Achse des Laserstrahlengangs verschiebbar ist, um den Laserstrahlfokus in Richtung optischer Achse des Objektivs zu verschieben. Hierdurch kann der Fokus des (UV-) Lasers mit dem Fokus des Objektivs und auch mit dem Beleuchtungsfokus zur Deckung gebracht werden. Gemäß zweitem Aspekt der Erfindung ist nunmehr die Laseroptik als solche (also zunächst ohne die Ausgleichslinse gemäß erstem Aspekt der Erfindung) zumindest zum Teil auf einem entlang der Achse des Laserstrahlengangs verschiebbaren Schlitten montiert, und es ist eine Steuereinrichtung und/oder eine mechanische Kopplungseinrichtung vorgesehen, die eine Verschiebung dieses Schlittens vornimmt, wenn zur Fokuseinstellung eine Verschiebung des Objektivs in Richtung der optischen Achse vorgenommen wird, sodass der Laserstrahl weiterhin, also auch nach Fokuseinstellung durch den festen Punkt der hinteren Brennebene des Objektivs verläuft.
Die entsprechenden Merkmale gemäß erstem oder zweitem Aspekt der Erfindung führen beide zu dem Ziel, dass der in das Mikroskop eingekoppelte Laserstrahl unverändert durch den festen Punkt der hinteren Brennebene des Objektivs verläuft, auch wenn eine Verschiebung des Objektivs entlang der optischen Achse zur Fokuseinstel- lung vorgenommen wird. Dieses Ziel kann durch zwei verschiedene Maßnahmen erreicht werden. Gemäß dem ersten Aspekt wird die genannte Ausgleichslinse in der Laseroptik entlang der Achse des Laserstrahlengangs verschoben, um die Verschiebung der hinteren Austrittpupillenebene des Objektivs bei einer Fokuseinstellung zu kompensieren. Die für diese Kompensation notwendige Größe der Verschiebung der Ausgleichslinse kann in der Praxis beispielsweise empirisch ermittelt werden. Der entsprechende Zusammenhang kann beispielsweise in einer Lookup-Tabelle hinterlegt werden, auf die die Steuereinrichtung zugreift. Alternativ kann eine mechanische Kopplungseinrichtung vorgesehen sein, die auf mechanische Art beispielsweise mittels me- chanischer Zwangskopplung bei einer Verschiebung des Objektivs die notwendige Verschiebung der Ausgleichslinse vornimmt.
Gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine Verschiebung der hinteren Aus- trittpupillenebene bei Bewegung des Objektivs in Richtung der optischen Achse zur Fokuseinstellung durch eine entsprechende Bewegung des Schlittens kompensiert, auf dem die Laseroptik zumindest zum Teil, vorzugsweise mit allen Bauteilen mit Ausnahme eines Umlenkspiegels, der den Laserstrahl in Richtung optischer Achse des Objektivs umlenkt, eventuell auch zusammen mit dem Laser, montiert ist. In der Praxis kann der Schlitten bei Bewegung des Objektivs in Richtung der optischen Achse in dieselbe Richtung mitverfahren werden, sodass der Abstand der Laseroptik, speziell einer in der Laseroptik vorhandenen Scaneinrichtung, zur hinteren Brennebene des Objektivs beibehalten wird. Bei dem Laser-Mikroskopsystem gemäß zweitem Aspekt der Erfindung ist es vorteilhaft, wenn eine Verschiebung des Schlittens entlang der Achse des Laserstrahlengangs mit einer Verschiebung des Objektivs entlang der optischen Achse mechanisch, insbesondere im Größenverhältnis 1 :1 , über eine mechanische Kopplungseinrichtung gekoppelt ist. Eine Verschiebung des Objektivs zur Fokuseinstellung führt dann zwangsweise zu einer entsprechenden Verschiebung des Schlittens entlang der Achse des Laserstrahlengangs, sodass der genannte Abstand zur hinteren Brennebene des Objektivs immer konstant bleibt.
Bei dem Laser-Mikroskopsystem gemäß zweitem Aspekt der Erfindung kann es vor- teilhaft sein, wenn die Laseroptik zusätzlich eine im Laserstrahlengang angeordnete und entlang der Achse des Laserstrahlengangs verschiebbare Ausgleichslinse (gemäß erstem Aspekt der Erfindung) aufweist, wobei die Steuereinrichtung und/oder die mechanische Kopplungseinrichtung dann derart ausgebildet ist, dass eine Verschiebung des Schlittens und/oder der Ausgleichslinse entlang der Achse des Laserstrahlengangs vorgenommen wird, wenn zur Fokuseinstellung eine Verschiebung des Objektivs vorgenommen wird, sodass der Laserstrahl weiterhin durch den festen Punkt der hinteren Brennebene des Objektivs verläuft. Diese Ausgestaltung entspricht also einer Kombination von erstem und zweitem Aspekt der Erfindung und erlaubt bei bestimmten An- Wendungen, bei denen größere Verschiebungen des Objektivs in z-Richtung erforderlich sind, wie beispielsweise beim Schneiden dicker Proben mit dreidimensionalen Schnittlinien oder bei der sukzessiven Durchtrennung dicker Materialien in z-Stapeln, eine höhere Flexibilität und möglicherweise auch Genauigkeit.
Wie bereits erwähnt, sind verschiedene Einsatzmöglichkeiten eines erfindungsgemäßen Laser-Mikroskopsystems gemäß erstem und zweitem Aspekt denkbar, insbesondere aber solche, bei denen die Laseroptik eine Scaneinrichtung enthält, um den Laserstrahlfokus senkrecht zur optischen Achse in der Objektebene zu verschieben. Sol- che Scaneinrichtungen kommen bei Lasermikrodissektionssystemen zum Einsatz, können aber auch für Systeme zur Laseranregung Verwendung finden, bei denen ein Laserstrahl eine Probe abscannt, um diese beispielsweise zur Fluoreszenzstrahlung anzuregen. Unter "Achse des Laserstrahlengangs" sei in diesem Fall die Achse des nicht abgelenkten Laserstrahlengangs verstanden.
In besonders vorteilhafter Weise wird eine Scaneinrichtung verwendet, die zwei um die Achse des Laserstrahlengangs drehbare optische Keile aufweist, wobei durch die relative Drehung der optischen Keile zueinander der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls gegenüber der optischen Achse variabel ist und wobei der Laserstrahl für alle Ablenkwinkel den oben erwähnten festen Punkt der hinteren Austrittspupille des Objektivs durchtritt, wobei die Austrittspupille mit der hinteren Brennebene zusammenfällt. Eine solche Scaneinrichtung ist insbesondere aus der bereits genannten EP 1 276 586 B1 bekannt. Die optischen Keile sind dort als Glas-Keilplatten realisiert, welche durch ihre Keilwinkel eine Strahlablenkung erzeugen, wobei durch die Drehung der Glas-Keilplatten relativ zueinander der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls gegenüber der Achse des Laserstrahlengangs variabel ist. Hierbei durchtritt der Laserstrahl für alle Ablenkwinkel einen festen Punkt der hinteren Brennebene des Objektivs. Der erwähnte feste Punkt wird vorzugsweise in der Mitte der Austrittspupille gewählt. Dies hat den Vorteil, dass der Laserstrahl senkrecht auf die Probe trifft. Zu Aufbau- und Funktionsweise einer solchen Scaneinrichtung sei ausdrücklich und voll umfänglich auf die genannte europäische Patentschrift verwiesen. Eine solche Scaneinrichtung ist insbesondere als Bestandteil eines Lasermikrodissektionssystems ausgeführt, wie in den Ausführungsbeispielen beschrieben. Ein Laser-Mikroskopsystem gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung weist mit Vorteil eine Laseroptik auf, bei der die in Richtung Achse des Laserstrahlengangs verschiebbare Ausgleichslinse der Scaneinrichtung nachgeschaltet bzw. nachgeordnet ist - be- zogen auf die Richtung des Laserstrahlengangs. Gleiches gilt für ein Laser- Mikroskopsystem gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung, soweit hier eine Ausgleichslinse vorhanden ist. Häufig steht die Achse des in das Mikroskop einzukoppelnden Laserstrahlengangs senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs. Mittels eines Umlenkspiegels wird der Laserstrahlengang in das Mikroskop eingekoppelt und zum Mikroskopobjektiv geführt, von dem der Laserstrahl dann auf die Objektebene des Mikroskops fokussiert wird. Bei dem Umlenkspiegel handelt es sich in der Regel um einen Strahlteiler, der von der Probe durch das Mikroskopobjektiv kommendes Licht des Beobachtungsstrahlengangs in Richtung des Mikroskoptubus durchlässt, während er Licht des Laserstrahlengangs möglichst vollständig reflektiert.
Die für das Laser-Mikroskopsystem gemäß erstem Aspekt der Erfindung eingesetzte Ausgleichslinse ist bei einem solchen Aufbau mit Vorteil zwischen Scaneinrichtung und Umlenkspiegel angeordnet.
Bei einem Laser-Mikroskopsystem gemäß zweitem Aspekt der Erfindung kann eben- falls ein Umlenkspiegel zur Einkopplung des Laserstrahlengangs in die optische Achse des Objektivs vorgesehen sein, wobei der Umlenkspiegel zweckmäßigerweise der Scaneinrichtung nachgeschaltet ist. Es ist bei einem solchen Aufbau vorteilhaft, wenn der Schlitten diejenigen Elemente der Laseroptik trägt, die dem Umlenkspiegel vorgeschaltet sind. Dies können insbesondere sämtliche Elemente der Laseroptik ein- schließlich des Lasers selbst mit Ausnahme des Umlenkspiegels sein. Ist in dem Laser-Mikroskopsystem gemäß zweitem Aspekt der Erfindung eine Ausgleichslinse vorhanden, so ist diese bei einem solchen Aufbau mit Vorteil zwischen Scaneinrichtung und Umlenkspiegel angeordnet. Bezüglich beider Aspekte der Erfindung ermöglicht die genannte Offset-Linse, die entlang der Achse des Laserstrahlengangs verschiebbar ist, um den Laserstrahlfokus in Richtung optischer Achse des Objektivs zu verschieben, den (UV-) Laserstrahlfokus in Übereinstimmung mit dem Fokus des Beleuchtungsstrahlengangs im Mikroskop zu bringen. Dies ist von Vorteil, wenn das Objekt bzw. die Probe parallel zur Beaufschlagung mit dem Laserstrahl beispielsweise mit sichtbarem Licht beleuchtet und vor, während und/oder nach der Dissektion beobachtet werden soll. Die Offset-Linse ist vorteilhafterweise der genannten Scaneinrichtung vorgeschaltet und weiter insbesondere einer Laserstrahl-Aperturblende in der Laseroptik vorgeschaltet, wobei die Laserstrahl-Aperturblende ihrerseits zweckmäßigerweise der Scaneinrichtung vorgeschaltet ist. Üblicher- und zweckmäßigerweise wird das Objekt bzw. die Probe mittels des Mikroskops auch visuell betrachtet. Hierzu weist das Laser-Mikroskopsystem gemäß erstem und/oder zweitem Aspekt vorteilhafterweise eine Beleuchtungseinrichtung mit einer Lichtquelle und einer Beleuchtungsoptik zur Erzeugung eines insbesondere visuellen Beleuchtungsstrahlengangs auf, wobei die Beleuchtungsoptik einen Umlenkspiegel zur Einkopplung des Beleuchtungsstrahlengangs in die optische Achse des Objektivs aufweist. Weiter kann insbesondere der Beleuchtungsstrahlengang über das Objektiv auf die Probe geführt werden.
Die Erfindung gemäß erstem und zweitem Aspekt erlaubt insbesondere die Verwen- dung eines Lasermikrodissektionssystems mit einer Scaneinrichtung basierend auf den oben beschriebenen drehbaren optischen Keilen in Kombination mit einem zur Fokuseinstellung verschiebbaren Objektiv, wie es üblicherweise bei inversen Mikroskopen oder dem bereits erwähntem Fixed Stage Mikroskopen zum Einsatz kommt. Diesbezüglich sei insbesondere auch auf die Ausführungsbeispiele verwiesen.
Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläu- ternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispieles in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben.
Figurenbeschreibung zeigt schematisch eine Ausführungsform eines Laser-Mikroskopsystems gemäß erstem Aspekt der Erfindung vor einer Fokuseinstellung,
Figur 2 zeigt die Ausführungsform gemäß Figur 1 nach Fokuseinstellung,
Figur 3 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines Laser-Mikroskopsystems gemäß zweitem Aspekt der Erfindung vor Fokuseinstellung und
Figur 4 zeigt die Ausführungsform gemäß Figur 3 nach Fokuseinstellung.
Die Figuren werden nachfolgend übergreifend erläutert. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen gleiche Elemente. Die Figuren zeigen in schematischer Darstellung Ausführungsformen eines Laser-Mikroskopsystems gemäß erstem und zweitem Aspekt der Erfindung. Das Laser-Mikroskopsystem ist jeweils mit 1 bezeichnet und als Laser- mikrodissektionssystem ausgeführt.
Allen Figuren 1 bis 4 ist der Grundaufbau eines Laser-Mikroskopsystems 1 gemeinsam, der im Folgenden kurz erläutert wird. Das Laser-Mikroskopsystem 1 weist ein Mikroskop 10 sowie einen UV-Laser 30 mit nachgeschalteter Laseroptik 20 auf. Die Laseroptik 20 dient zum Einkoppeln des vom Laser 30 erzeugten Laserstrahls 31 in das Mikroskop 10.
Das Mikroskop 10 verfügt in bekannter Weise über ein Objektiv 1 1 und einen Tubus 16, an dem schematisch dargestellte optische und/oder elektronische Ausgänge für ein Okular und/oder eine Kamera angebracht sein können.
In dem Laser-Mikroskopsystem 1 ist eine Beleuchtungseinrichtung mit einer Lichtquelle 33 und einer an sich bekannten und daher nicht näher erläuterten Beleuchtungsoptik 35 zur Erzeugung eines visuellen Beleuchtungsstrahlengangs 34 vorgesehen, wobei die Beleuchtungsoptik 35 einen Umlenkspiegel 36 zur Einkopplung des Beleuchtungsstrahlengangs 34 in die optische Achse 12 des Objektivs 1 1 aufweist. Im dargestellten Fall ist der Beleuchtungsstrahlengang 34 über das Objektiv 1 1 auf die Probe geführt.
Der von dem UV-Laser 30 erzeugte Laserstrahl 31 wird über eine nachgeschaltete Laseroptik 20 in das Mikroskop 10 eingekoppelt. Hierzu weist die Laseroptik 20 zunächst eine Negativlinse 21 und eine Positivlinse 22, welche den Laserstrahl 31 aufweiten und kollimieren, sowie entsprechende Umlenkeinrichtungen 23 auf, um den Laserstrahl mit dem aufgeweiteten Laserstrahlquerschnitt den nachfolgenden Elementen der Laseroptik 20 zuzuführen. Der Laserstrahl 31 durchläuft als nächstes einen Abschwächer 24, mittels dessen die Energie des Laserstrahls einstellbar ist. Dem Abschwächer 24 folgt die Offset-Linse 25, die den UV-Laserstrahlfokus mit dem VIS- Fokus des Beleuchtungsstrahlengangs 34 zur Deckung bringt. Hierzu kann die Offset- Linse 25 entlang der Achse 32 des Laserstrahlengangs verschoben werden. Der Offset-Linse 25 ist die Laserstrahl-Aperturblende 26 nachgeschaltet. Die Öffnung der Laserstrahl-Aperturblende 26 bestimmt den Durchmesser des Laserstrahls 31 und somit die Schnittbreite des Laserstrahls. Der Laserstrahl 31 tritt anschließend in eine Scaneinrichtung 27, die zwei um die Achse 32 des Laserstrahlengangs drehbare opti- sehe Keile 271 und 272 aufweist, wobei durch Drehung dieser optischen Keile 271 , 272 relativ zueinander der resultierende Ablenkwinkel α des Laserstrahls 31 gegenüber der optischen Achse 12 variiert werden kann. Wie bereits mehrfach erwähnt, sind Einzelheiten zur Funktionsweise und zum Aufbau einer Scaneinrichtung 27 der EP 1 276 586 B1 zu entnehmen und sollen daher vorliegend nicht näher erläutert werden.
Der Laserstrahl 31 wird von einem Umlenkspiegel 28, der in einem Strahlteiler ausgebildet ist, in das Mikroskop 10 derart eingekoppelt, dass er durch das Objektiv 1 1 verläuft und von dem Objektiv 1 1 in eine Fokusebene 15 (vordere Brennebene) fokussiert wird. Der Laserstrahl 31 tritt für alle möglichen Ablenkwinkel α durch denselben festen Punkt 13der hinteren Brennebene 17, der vorzugsweise in der Mitte, d.h. auf der optischen Achse 12, liegen kann. Von dort tritt er durch das Objektiv 1 1 und wird von diesem in die Fokusebene 15 fokussiert. Zur Laser-Mikrodissektion muss die Objektebene 14 mit der Fokusebene 15 zusammenfallen, damit eine auf der Objektebene 14 befind- liehe Probe (hier nicht dargestellt) geschnitten werden kann. Zum Schneiden wird der Laserstrahlfokus in der Objektebene 14, also auf der zu schneidenden Probe, mittels der Scaneinrichtung 27 durch Einstellung entsprechender Ablenkwinkel α verschoben. Durch geeignetes Verfahren des Laserstrahlfokus auf der Probe wird dann eine Schnittlinie erzeugt und eine gewünschte Region der Probe mit dem Laserstrahl ausgeschnitten.
Figur 1 zeigt nun eine Ausführungsform eines Lasermikrodissektionssystems 1 , bei der das Objektiv 1 1 bzw. ein Objektivrevolver, der das Objektiv 1 1 trägt, zur Fokuseinstel- lung in Richtung der optischen Achse 12 verschiebbar ausgebildet ist (angedeutet durch den Doppelpfeil). In bisher üblichen Ausführungsformen wurde die Fokuseinstellung durch Verschiebung des Mikroskoptisches in Richtung optischer Achse 12 vorgenommen. Da dies nicht zu einer Verschiebung der hinteren Brennebene 17 des Objektivs 1 1 führte, war sichergestellt, dass der abgelenkte Laserstrahl 31 immer durch den festen Punkt 13 verläuft. In der vorliegenden Ausführungsform ist jedoch das Objektiv 1 1 zur Fokuseinstellung in Richtung der optischen Achse 12 verschiebbar ausgebildet. Zur Fokuseinstellung wird das Objektiv 1 1 in der dargestellten Situation gemäß Figur 1 nach unten verschoben, bis die Fokusebene 15 mit der Objektebene 14 übereinstimmt. Hierdurch verlagert sich jedoch die hintere Brennebene 17 in entsprechender Weise, sodass nicht mehr gewährleistet ist, dass der Laserstrahl 31 durch besagten Punkt 13 der hinteren Brennebene 17 verläuft. Durch die mit 29 bezeichnete Ausgleichslinse, die als Bestandteil der Laseroptik 20 verschiebbar entlang der Achse 32 des Laserstrahlengangs ausgebildet ist, kann eine Verschiebung des Auftreffpunktes des Laserstrahls 31 auf die hintere Brennebene 17 bei einer Verschiebung des Objektivs 1 1 kompen- siert werden. In einer Grundstellung befindet sich die Ausgleichslinse 29 in der in Figur 1 dargestellten Position.
Aus Figur 1 ist ersichtlich, dass die Objektebene 14 nicht mit der Fokusebene 15 übereinstimmt. Mit 15 ist streng genommen nur der Fokus des Mikroskopobjektivs 1 1 für den verwendeten Beleuchtungs- bzw. Beobachtungsstrahlengang bezeichnet. Der Beleuchtungsstrahlengang 19 ist nur schematisch dargestellt. Die eigentliche Fokusebene verläuft in bekannter Weise durch den mit 15 bezeichneten Punkt parallel zur Objektebene 14 sowie parallel zur hinteren Objektivbrennebene 17. Zur Fokuseinstel- lung wird nun das Objektiv 1 1 in Richtung der optischen Achse 12 auf die Objektebene 14 hinbewegt, bis die Fokusebene 15 mit der Objektebene 14 zusammenfällt. Diese Situation ist in Figur 2 dargestellt. Figur 2 zeigt die Situation, in der das Objektiv 1 1 den Laserstrahl 31 auf die Fokusebene 15 fokussiert, die mit der Objektebene 14 des Mikroskops 10 zusammenfällt. Aus Figur 2 ebenfalls ersichtlich ist, dass der Laserstrahl 31 weiterhin durch besagten festen Punkt 13 der hinteren Brennebene 17 verläuft. Dies ist durch entsprechende Verschiebung der Ausgleichslinse 29 der Laseroptik 20 erreicht. Die Ausgleichslinse 29 wurde hierzu gegenläufig zur Objektivverschiebung zur Fokuseinstellung (also gleichsam vom Objekt weg), also in Richtung Scaneinrichtung 27 entlang der Achse 32 des Laserstrahlengangs geringfügig verschoben. Die Verschiebung der Ausgleichslinse 29 wird von einer Steuereinrichtung 60 gesteuert, die als Eingangssignal die Verschiebung des Objektivs 1 1 erhält. Der Zusammenhang mit der daraus resultierenden not- wendigen Verschiebung der Ausgleichslinse 29 kann in der Steuereinrichtung 60 als Lookup-Tabelle oder als funktionaler Zusammenhang hinterlegt sein. Die Verschiebung der Ausgleichslinse 29 kann auch mechanisch mit der Verschiebung des Objektivs 1 1 über eine mechanische Kopplungseinrichtung, die ebenfalls mit 60 bezeichnet sein kann, erfolgen.
Die Figuren 1 und 2 machen deutlich, dass durch Verschieben der Ausgleichslinse 29 das dargestellte Lasermikrodissektionssystem 1 auch mit einem fokussierbaren Objektiv 1 1 verwendet werden kann. Auf diese Weise ist es auch möglich, innerhalb einer zu schneidenden Probe in verschiedene Probenbereiche (parallel zur optischen Achse 12) zu fokussieren. Dies ist zum Schneiden von dicken Proben besonders zweckmäßig. Nach Abschluss des Schneidvorgangs wird das ausgeschnittene Mikrodissektat von einem Aufnahmebehälter 50 aufgefangen und kann dann der weiteren Analyse zugeführt werden. Die Figuren 3 und 4 zeigen eine Ausführungsform eines Laser-Mikroskopsystems gemäß zweitem Aspekt der Erfindung. Wiederum ist das Laser-Mikroskopsystem als La- ser-Mikrodissektionssystem 1 ausgeführt. Bezüglich des Aufbaus und der Funktionsweise sei auf die obigen Schilderungen verwiesen. Figur 3 zeigt einen Aufbau, bei dem die wesentlichen Bestandteile der Laseroptik 20 auf einem Schlitten 40 montiert sind. Zusätzlich kann auch der Laser 30 mit dem Schlitten 40 verfahrbar angeordnet sein. Folgende Elemente der Laseroptik 20 befinden sich auf dem Schlitten 40: Die Umlenkeinrichtungen 23 sowie die Negativlinse 21 und die Positivlinse 22; weiterhin die hintereinander geschalteten Elemente Abschwächer 24, Offset-Linse 25, Laserstrahl-Aperturblende 26 und Scaneinrichtung 27. Dem Fachmann sind andere Realisierungsmöglichkeiten ersichtlich. Insbesondere können Elemente zwischen denen ein paralleler Laserstrahlengang verläuft, auseinandergezogen werden, ohne den Strahlenverlauf zu beeinflussen. Die entsprechenden vorangehenden Elemente der Laseroptik brauchen in einem solchen Fall nicht auf den Schlitten 40 montiert zu werden, während nur die nachfolgenden Elemente der Laseroptik 20 auf den Schlitten 40 zu montieren sind. Figur 3 zeigt analog zu Figur 1 eine Situation, in der die Fokusebene 15 nicht mit der Objektebene 14 des Mikroskops 10 zusammenfällt. Zur Fokuseinstellung wird das Objektiv 1 1 entlang der optischen Achse 12 verschoben, bis die Fokusebene 15 mit der Objektebene 14 zusammenfällt. Diese Situation ist in Figur 4 dargestellt. Figur 4 zeigt ein in Richtung optischer Achse 12 verschobenes Objektiv 1 1 (die Verschiebung ist wiederum durch den Doppelpfeil angedeutet). Eine derartige Verschiebung hat eine entsprechende Verschiebung der hinteren Brennebene 17 zur Folge, wodurch ohne Gegenmaßnahmen der Laserstrahl 31 nicht mehr durch denselben Punkt 13 der hinteren Brennebene 17 verlaufen würde wie in Figur 3. Um sicherzustellen, dass der Punkt 13 der hinteren Brennebene 17 auch bei Verschiebung des Objektivs 1 1 entlang der optischen Achse 12 beibehalten wird, wird der Schlitten 40 und mit ihm sämtliche auf dem Schlitten 40 befindlichen Elemente der Laseroptik 20 entsprechend verschoben. Im dargestellten Beispiel ist eine Verschiebung des Schlittens 40 mit einer Verschiebung des Objektivs 1 1 gekoppelt. Diese Kopplung kann über eine Steuereinrichtung 60 oder alternativ auch mechanisch durch eine mechanische Kopplungseinrichtung, die ebenfalls mit 60 bezeichnet sein kann, erfolgen. Die Verschiebung des Schlittens 40 erfolgt gleichsinnig zur Verschiebung des Objektivs 1 1 . Dabei wird die Verschiebung vorzugsweise im Verhältnis 1 :1 vorgenommen. Bei der in den Figuren 3 und 4 dargestellten Ausführungsform eines Laser- Mikrodissektionssystems 1 gemäß zweitem Aspekt der Erfindung kann die Laseroptik 20 ebenfalls eine Ausgleichslinse 29 gemäß erstem Aspekt der Erfindung zusätzlich aufweisen. Bezüglich Einzelheiten der Anordnung und Funktion einer solchen (in den Figuren 3 und 4 nicht dargestellten) Ausgleichslinse 29 sei auf die obigen Ausführungen in Zusammenhang mit den Figuren 1 und 2 verwiesen. Bevorzugt ist die Ausgleichslinse zwischen Scaneinrichtung 27 und Umlenkspiegel 28 angeordnet. Sie kann auf dem Schlitten 40, aber auch nicht auf dem Schlitten 40 montiert sein. In beiden Fällen ist der mögliche Einsatzbereich des Systems 1 hinsichtlich Flexibilität und der Möglichkeit der Dissektion größerer Probenbereiche in z-Richtung erhöht. Die Steuereinrichtung 60 und/oder die mechanische Kopplungseinrichtung ist derart ausgebildet, dass eine Verschiebung des Schlittens 40 und/oder der Ausgleichslinse 29 entlang der Achse 32 des Laserstrahlengangs vorgenommen wird, wenn zur Fokuseinstellung eine Verschiebung des Objektivs 1 1 erfolgt, sodass der Laserstrahl 31 weiterhin durch den festen Punkt 13, insbesondere die Mitte der hinteren Brennebene 17 des Objektivs 1 1 verläuft.
Die Erfindung wurde anhand eines aufrechten Mikroskops 10 erläutert. Sie kann aber ohne Beschränkung auch an einem inversen Mikroskop implementiert werden, bei dem das Objektiv bzw. die Objektive unterhalb des Mikroskoptisches 18 angeordnet sind und der Aufnahmebehälter für die Dissektate oberhalb des Mikroskoptisches 18 angeordnet ist. Ein Verfahren zum lasergestützten Transfer der Dissektate von der Probe zum Aufnahmebehälter ist aus dem Stand der Technik bekannt.
Bezuqszeichenliste
1 Laser-Mikroskopsystem, Lasermikrodissektionssystem
10 Mikroskop
1 1 Objektiv
12 optische Achse
13 Punkt der hinteren Objektivbrennebene
14 Objektebene
15 Fokusebene, vordere Brennebene
16 Tubus
17 hintere Objektivbrennebene
18 Mikroskoptisch
19 Beleuchtungsstrahlengang
20 Laseroptik
21 Negativlinse
22 Positivlinse
23 Umlenkeinrichtung
24 Abschwächer
25 Offset- Linse
26 Laserstrahl-Aperturblende
27 Scaneinrichtung
28 Umlenkspiegel
29 Ausgleichslinse
30 Laser
31 Laserstrahl
32 Achse des Laserstrahlengangs
33 Lichtquelle
34 Beleuchtungsstrahlengang
35 Beleuchtungsoptik
36 Umlenkspiegel
40 Schlitten
50 Aufnahmebehälter
60 Steuereinrichtung
271 optischer Keil
272 optischer Keil
α Ablenkwinkel

Claims

Patentansprüche
1 . Laser-Mikroskopsystem (1 )
mit einem Mikroskop (10) mit einem Mikroskoptisch (18) zur Aufnahme einer Probe und einem Objektiv (1 1 ), das eine optische Achse (12) und eine hintere Brennebene (17) des Objektivs (1 1 ) definiert,
und mit einem Laser (30) und einer nachgeschalteten Laseroptik (20), die den vom Laser (30) erzeugten Laserstrahl (31 ) derart in das Mikroskop (10) einkoppelt, dass dieser die hintere Brennebene (17) des Objektivs (1 1 ) an einem festen Punkt (13) durchläuft und das Objektiv (1 1 ) den Laserstrahl (31 ) auf eine Objektebene (14) des Mikroskops (10) fokussiert,
wobei das Objektiv (1 1 ) zur Fokuseinstellung in Richtung der optischen Achse (12) verschiebbar ausgebildet ist,
wobei die Laseroptik (20) eine Offset-Linse (25) aufweist, die entlang der Achse (32) des Laserstrahlengangs verschiebbar ist, um den Laserstrahlfokus in Richtung optischer Achse (12) des Objektivs (1 1 ) zu verschieben,
wobei die Laseroptik (20) zusätzlich eine im Laserstrahlengang angeordnete und entlang der Achse (32) des Laserstrahlengangs verschiebbare Ausgleichslinse (29) aufweist,
und wobei eine Steuereinrichtung (60) und/oder eine mechanische Kopplungseinrichtung vorgesehen ist, die eine Verschiebung der Ausgleichslinse (29) entlang der Achse (32) des Laserstrahlengangs vornimmt, wenn zur Fokuseinstellung eine Verschiebung des Objektivs (1 1 ) vorgenommen wird, sodass der Laserstrahl (31 ) weiterhin durch den festen Punkt (13) der hinteren Brennebene (17) des Objektivs verläuft.
2. Laser-Mikroskopsystem (1 ) nach Anspruch 1 , wobei die Laseroptik (20) eine Scaneinrichtung (27) enthält, um den Laserstrahlfokus senkrecht zur optischen Achse (12) in der Objektebene (14) zu verschieben.
3. Laser-Mikroskopsystem (1 ) nach Anspruch 2, wobei die Scaneinrichtung (27) zwei um die Achse (32) des Laserstrahlengangs drehbare optische Keile (271 , 272) aufweist, wobei durch die Drehung der optischen Keile (271 , 272) der resultierende Ablenkwinkel (a) des Laserstrahls (31 ) gegenüber der optischen Achse (12) variabel ist und wobei der Laserstrahl (31 ) für alle Ablenkwinkel (a) den festen Punkt (13) der hinteren Brennebene (17) des Objektivs (1 1 ) durchtritt.
4. Laser-Mikroskopsystem (1 ) nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Ausgleichslinse (29) der Scaneinrichtung (27) nachgeschaltet ist.
5. Laser-Mikroskopsystem (1 )
mit einem Mikroskop (10) mit einem Mikroskoptisch (18) zur Aufnahme einer Probe und einem Objektiv (1 1 ), das eine optische Achse (12) und eine hintere Brennebene (17) des Objektivs (1 1 ) definiert,
und mit einem Laser (30) und einer nachgeschalteten Laseroptik (20), die den vom Laser (30) erzeugten Laserstrahl (31 ) derart in das Mikroskop (10) einkoppelt, dass dieser die hintere Brennebene (17) des Objektivs an einem festen Punkt (13) durchläuft und das Objektiv (1 1 ) den Laserstrahl (31 ) auf eine Objektebene (14) des Mikroskops (10) fokussiert,
wobei das Objektiv (1 1 ) zur Fokuseinstellung in Richtung der optischen Achse (12) verschiebbar ausgebildet ist,
wobei die Laseroptik (20) eine Offset-Linse (25) aufweist, die entlang der Achse (32) des Laserstrahlengangs verschiebbar ist, um den Laserstrahlfokus in Richtung optischer Achse (12) des Objektivs (1 1 ) zu verschieben,
wobei die Laseroptik (20) zumindest zum Teil auf einem entlang der Achse (32) des Laserstrahlengangs verschiebbaren Schlitten (40) montiert ist,
und wobei eine Steuereinrichtung (60) und/oder eine mechanische Kopplungseinrichtung vorgesehen ist, die eine Verschiebung des Schlittens (40) vornimmt, wenn zur Fokuseinstellung eine Verschiebung des Objektivs (1 1 ) vorgenommen wird, sodass der Laserstrahl (31 ) weiterhin durch den festen Punkt (13) der hinteren Brennebene (17) des Objektivs (1 1 ) verläuft.
6. Laser-Mikroskopsystem (1 ) nach Anspruch 5, wobei die Laseroptik (20) zusätzlich eine im Laserstrahlengang angeordnete und entlang der Achse (32) des Laserstrahlengangs verschiebbare Ausgleichslinse (29) aufweist, und wobei die Steuereinrichtung (60) und/oder die mechanische Kopplungseinrichtung derart ausgebildet ist, dass eine Verschiebung des Schlittens (40) und/oder der Ausgleichslinse (29) entlang der Achse (32) des Laserstrahlengangs vorgenommen wird, wenn zur Fokuseinstellung eine Verschiebung des Objektivs (1 1 ) vorgenommen wird, sodass der Laserstrahl (31 ) weiterhin durch den festen Punkt (13) der hinteren Brennebene (17) des Objektivs verläuft.
7. Laser-Mikroskopsystem (1 ) nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Laseroptik (20) eine Scaneinrichtung (27) enthält, um den Laserstrahlfokus senkrecht zur optischen Achse (12) in der Objektebene (14) zu verschieben.
8. Laser-Mikroskopsystem (1 ) nach Anspruch 7, wobei die Scaneinrichtung (27) zwei um die Achse des Laserstrahlengangs drehbare optische Keile (271 , 272) aufweist, wobei durch die Drehung der optischen Keile (271 , 272) der resultierende Ab- lenkwinkel (a) des Laserstrahls gegenüber der optischen Achse (12) variabel ist und wobei der Laserstrahl (31 ) für alle Ablenkwinkel (a) den festen Punkt (13) der hinteren Brennebene des Objektivs (1 1 ) durchtritt.
9. Laser-Mikroskopsystem (1 ) nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Scaneinrichtung (27) ein Umlenkspiegel (28) zur Einkopplung des Laserstrahlengangs in die optische
Achse (12) des Objektivs (1 1 ) nachgeschaltet ist, wobei der Schlitten (40) diejenigen Elemente der Laseroptik (20) trägt, die dem Umlenkspiegel (28) vorgeschaltet sind.
10. Laser-Mikroskopsystem (1 ) nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die Aus- gleichslinse (29) der Scaneinrichtung (27) nachgeschaltet ist.
1 1 . Laser-Mikroskopsystem (1 ) nach einem der Ansprüche 2 bis 4 oder 7 bis 10, wobei die Offset-Linse (25) der Scaneinrichtung (27) vorgeschaltet ist.
12. Laser-Mikroskopsystem (1 ) nach einem der vorangehenden Ansprüche mit einer Beleuchtungseinrichtung mit einer Lichtquelle (33) und einer nachgeschalteten Beleuchtungsoptik (35) zur Erzeugung eines Beleuchtungsstrahlengangs (34), wobei die Beleuchtungsoptik (35) einen Umlenkspiegel (36) zur Einkopplung des Beleuchtungsstrahlengangs (34) in die optische Achse (12) des Objektivs (1 1 ) aufweist.
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