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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren bzw. eine Vorrichtung
zum Bearbeiten von biologischen Objekten, wobei zum Bearbeiten Laserstrahlung
verwendet wird.
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Ein
herkömmliches
Verfahren zum Bearbeiten von biologischen Objekten mit Laserstrahlung
ist die so genannte Laser-Mikrodissektion, bei welcher ein biologisches
Objekt aus einer umgebenden biologischen Masse mittels Laserstrahlung
herausgeschnitten wird. Zur Weiterverarbeitung eines derart herausgeschnittenen
biologischen Objekts kann dieses dann mit Hilfe des so genannten
Laser-Pressure-Catapultings mit einem einzigen Laserschuss in einen
Auffangbehälter
katapultiert werden. Dieses Laser-Pressure-Catapulting ist beispielsweise
in der
WO 01/73398
A1 der Anmelderin detailliert beschrieben.
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Bei
einer Ausführungsform
des Laser-Pressure-Catapultings und/oder der Laser-Mikrodissektion wird
das biologische Objekt auf eine laserabsorbierende Membran aufgebracht,
und das Ausschneiden des biologischen Objekts erfolgt durch Ausschneiden
eines entsprechenden Bereichs der Membran. Ein für die Laser-Mikrodissektion
ausgelegter Halter für
eine derartige Membran ist beispielsweise in der
DE 100 39 979 A1 beschrieben.
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Eine
weitere Möglichkeit
zur Bearbeitung biologischer Objekte mittels Laserstrahlung ist
die so genannten Mikroinjektion, bei welcher mit einem Laser beispielsweise
gleichsam kleine Löcher
in Zellen gebohrt werden, um einen Substanz in die Zelle einzubringen.
Auch ein Verschmelzen von Zellen mittels Laserstrahlung ist möglich.
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Die
obigen Bearbeitungsverfahren werden häufig in derselben Vorrichtung
durchgeführt.
Als Laser wird dabei beispielsweise ein Stickstofflaser oder ein
Argon-Ionen-Laser mit Wellenlängen
im Bereich von 330 bis 360 nm, beispielsweise 355 nm verwendet.
Je nach gewünschter
Anwendung werden dann verschiedene Membranen als Träger für die Zellen eingesetzt.
Für die
oben beschriebene Laser-Mikrodissektion bzw. für das Laser-Pressure-Catapulting wird
beispielsweise eine Polyethylen-Naphtalat-Folie verwendet, welche
für derartige
Laserstrahlung eine deutliche Absorption zeigt und somit bereits
mit niedrigen Laserenergien geschnitten werden kann. Andererseits
verhindert diese Absorption jedoch, dass der Laser in die biologische
Masse eindringt, diese kann daher nur schwer mittels des Lasers
manipuliert werden.
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Für die oben
erwähnte
Mikroinjektion und ähnliche
Verfahren, bei welchen mit dem Laser direkt auf die biologische
Masse eingewirkt wird, wird dann beispielsweise eine Polyesterfolie
bzw. -membran (POL-Membran) verwendet. Eine derartige Membran absorbiert
den Laser kaum, d. h. der Laser dringt durch die Membran und die
biologische Masse kann bearbeitet werden. Wird jedoch nach einer
derartigen Bearbeitung eine Laser-Mikrodissektion gewünscht, muss
die Laserleistung stark erhöht
werden, um trotz der geringen Absorption die Membran schneiden zu können. Durch
die hohe Laserleistung kann es zu Nebeneffekten beim Schneiden kommen,
die die Schnittqualität
unter Umständen
beeinträchtigen können.
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Es
ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
und eine Vorrichtung zum Bearbeiten eines biologischen Objekts bzw.
einer biologischen Masse bereitzustellen, wobei eine flexible Verarbeitung
mit verschiedenen Bearbeitungsverfahren wie beispielsweise Mikroinjektion
oder Laser-Mikrodissektion möglich
ist.
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Diese
Aufgabe wird gelöst
durch ein Verfahren nach Anspruch 1 bzw. eine Vorrichtung nach Anspruch
9. Die abhängigen
Ansprüche
definieren vorteilhafte bzw. bevorzugte Ausführungsbeispiele des Verfahrens
bzw. der Vorrichtung.
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Erfindungsgemäß wird ein
Verfahren zum Bearbeiten eines biologischen Objekts bereitgestellt, umfassend:
- – Auswählen einer
Laserwellenlänge
aus einer Mehrzahl von vorgegebenen Laserwellenlängen, und
- – Bearbeiten
des biologischen Objekts mit einem Laserstrahl der ausgewählten Laserwellenlänge.
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Eine
entsprechende Vorrichtung zum Bearbeiten eines biologischen Objekts
umfasst dann Lasermittel zum Erzeugen eines Laserstrahls mit einer Mehrzahl
von auswählbaren
Wellenlängen,
Auswahlmittel zum Auswählen
einer Laserwellenlänge
der Mehrzahl von Laserwellenlängen
und Steuermittel zum Ansteuern der Lasermittel derart, dass sie
einen Laserstrahl der ausgewählten
Laserwellenlänge
erzeugen und auf das biologische Objekt zur Bearbeitung desselben
lenken.
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Indem
Laserstrahlen verschiedener Wellenlängen ausgewählt werden können, kann
eine für
die jeweils geplante Bearbeitung des biologischen Objekts geeignete
Wellenlänge
ausgewählt
werden.
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Das
biologische Objekt kann insbesondere auf einer Membran aufgebracht
sein, wobei eine Wellenlänge
der Mehrzahl von Laserwellenlängen
von der Membran absorbiert wird, während eine zweite Wellenlänge der
Mehrzahl von Laserwellenlängen von
der Membran im Wesentlichen nicht absorbiert wird. Soll das Bearbeiten
des biologischen Objekts beispielsweise ein Schneiden der Membran
umfassen, wird die erste Wellenlänge
ausgewählt,
soll sie beispielsweise eine Mikroinjektion oder ein Verschmelzen
von Zellen umfassen, wird die zweite Wellenlänge ausgewählt.
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Es
können
auch mehrere Bearbeitungsschritte mit jeweils verschiedenen Wellenlängen der Mehrzahl
von Laserwellenlängen
durchgeführt
werden.
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Die
Lasermittel der Vorrichtung können
mehrere getrennte Laser, welche bei verschiedenen Wellenlängen der
Mehrzahl von Laserwellenlängen
arbeiten, umfassen. Es ist jedoch ebenso ein einzelner abstimmbarer
Laser oder auch eine Kombination dieser Möglichkeiten, d. h. mehrere
abstimmbare Laser, möglich.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
kann insbesondere ein aufrechtes oder inverses Mikroskopsystem umfassen,
mit welchem der Laserstrahl fokussiert auf das biologische Objekt
bzw. eine das biologische Objekt enthaltene Probe gelenkt werden kann.
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Die
Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme
auf die beigefügte
Zeichnung näher
erläutert.
Es zeigen:
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1 ein
Ausführungsbeispiel
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung
zum Bearbeiten von biologischen Objekten,
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2 eine
schematische Querschnittsansicht eines biologischen Objekts bei
der Bearbeitung mit Laserstrahlung,
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3 Absorptionsspektren
verschiedener für
Membranen verwendeter Materialien, und
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4 eine
Teilansicht eines weiteren Ausführungsbeispiels
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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Im
Folgenden werden bevorzugte Ausführungsbeispiele
der Erfindung unter Bezugnahme auf 1–3 beschrieben. 1 zeigt
dabei ein Ausführungsbeispiel
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung
in Form eines Mikroskopsystems, welches zur Laser-Mikrodissektion,
zum Laser-Pressure-Catapulting sowie zur Manipulation von biologischen Objekten
beispielsweise mittels Mikroinjektion oder Verschmelzen von Zellen
benutzt werden kann.
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Das
in 1 gezeigte System umfasst eine Laservorrichtung 17,
welche einen ersten Laser 2 und einen zweiten Laser 3 umfasst.
Der erste Laser 2 und der zweite Laser 3 emittieren
bei verschiedenen Wellenlängen.
Beispielsweise kann der erste Laser 2 ein Neodym-YAG-Laser mit Frequenzverdreifacher
und einer Wellenlänge
von 355 nm sein, während
der zweite Laser 3 eine Laserdiode mit einer Wellenlänge von
408 nm ist. Wie später
näher erläutert werden
wird, sind jedoch auch andere Arten von Lasern wie beispielsweise
Festkörperlaser
wie Argon-Ionen-Laser, Gaslaser wie beispielsweise Stickstofflaser
oder Farbstofflaser im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbar.
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Ein
von dem ersten Laser 2 emittierter Laserstrahl wird über einen
Spiegel 4 auf einen verstellbaren Spiegel 6 gelenkt,
während
ein von dem zweiten Laser 3 emittierter Laserstrahl über einen
Spiegel 5 auf den beweglichen Spiegel 6 gelenkt
wird. Der bewegliche Spiegel 6 kann zwischen einer ersten
Position, in 1 durchgezogen dargestellt,
und einer zweiten Position, in 1 gestrichelt
dargestellt, wie durch einen Pfeil angedeutet hin- und herbewegt werden.
In der ersten Position lenkt der Spiegel 6 einen vom ersten
Laser 2 emittierten Laserstrahl zu einer Optik 15, 16,
während
in der zweiten Position ein von dem zweiten Laser 3 emittierter
Laserstrahl zu der Optik 15, 16 hin gelenkt wird.
Je nach Position des beweglichen Spiegels 6 wird also der
von dem ersten Laser 2 emittierte Laserstrahl oder der
von dem zweiten Laser 3 emittierte Laserstrahl in die Optik 15, 16,
welche im dargestellten Beispiel Linsen 16 zur Fokussierung
des Laserstrahls sowie einen Neutraldichtefilter 15 zur
Einstellung der Intensität
des Laserstrahls umfasst, eingekoppelt.
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Über Spiegel 7 wird
der Laserstrahl dann in eine Mikroskop 13 eingekoppelt,
wobei das in 1 dargestellte Mikroskop ein
so genanntes inverses Mikroskop ist, bei welchem ein Mikroskopobjektiv 12 unterhalb
eines Trägertisches 14,
auf welchem sich eine zu bearbeitende biologische Masse bzw. zu
bearbeitende biologische Objekte befinden, angeordnet ist. Die Spiegel 4, 5 und 7 sowie
der bewegliche Spiegel 6 können dabei als herkömmliche
entsprechend beschichtete Spiegel oder auch als Strahlteiler beispielsweise
in Form von Prismen ausgestaltet sein.
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Durch
eine Bewegung der Linsen 16 kann der Laserfokus unabhängig vom
Fokus des Objektivs 12 des Mikroskops verstellt werden,
so dass ein auf dem Trägertisch 14 befindliches
biologisches Objekt beispielsweise mit einem defokussierten Laserstrahl beleuchtet
werden kann und durch das Mikroskop 13 trotzdem scharf
betrachtet werden kann.
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Des
Weiteren weist das in 1 dargestellte System eine Auffangvorrichtung 1 auf,
in welcher durch Laser-Mikrodissektion und anschließendes Laser-Pressure-Catapulting
gewonnene biologische Objekte aufgefangen werden können.
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Die
in 1 dargestellte Vorrichtung wird durch einen Computer 11 gesteuert,
welcher in dem dargestellten Ausführungsbeispiel einen Bildschirm 8 zur
Datenausgabe sowie eine Tastatur 9 und eine Maus 10 zur
Eingabe von Daten aufweist. Selbstverständlich können auch weitere Peripheriegeräte vorhanden
sein. Der Computer 11 steuert insbesondere die Laservorrichtung 17 mit
dem beweglichen Spiegel 6, die Linsen 16, den
Trägertisch 14,
welcher als motorisierter XY-Tisch ausgestaltet sein kann, den Neutraldichtefilter 15 sowie
die Auffangvorrichtung 1. Durch Verwendung des Computers 11 zur
Steuerung kann die Bearbeitung von biologischen Objekten mit der
in 1 dargestellten Vorrichtung halb- oder vollautomatisch
erfolgen.
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Insbesondere
kann über
den Computer 11 wahlweise ein von dem Laser 2 oder
ein von dem Laser 3 emittierter Laserstrahl zur Bearbeitung
des biologischen Objekts durch Aktivierung des entsprechenden Lasers
und/oder durch Bewegen des beweglichen Spiegels 6 in die
entsprechende Position ausgewählt
werden.
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Das
in 1 dargestellte System eignet sich insbesondere
für die
Bearbeitung von auf einen Membranträger aufgebrachten biologischen
Objekten. Dies soll anhand der 2 und 3 nunmehr erläutert werden.
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2 zeigt
eine biologische Masse 20, beispielsweise eine Zelle, mit
einem Zellkern 21, welche auf einer Membran 19 aufgebracht
ist. Die Membran 19 kann beispielsweise aus Polyethylen-Naphtalin bestehen.
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Ein
Laserstrahl 22, welcher von dem ersten Laser 2 aus 1 emittiert
wird und beispielsweise eine Wellenlänge von 355 nm aufweist, wird
von der Membran 19 absorbiert und kann daher effektiv zum Schneiden
der Membran 19 verwendet werden, beispielsweise um einen
Bereich um den Zellkern 21 herum auszuschneiden und dann
durch einen gezielten Laserschuss diesen Bereich zusammen mit dem Zellkern 21 in
einen Auffangbehälter,
welcher sich in der Auffangvorrichtung 1 aus 1 befindet,
zu katapultieren. Auf der anderen Seite geht ein von dem zweiten
Laser 3 emittierter Laserstrahl 23, beispielsweise
mit einer Wellenlänge
von 408 nm, ohne wesentliche Absorption durch die Membran 19 hindurch und
kann somit zur Manipulation der biologischen Masse 20 verwendet
werden, beispielsweise zu der eingangs beschriebenen Mikroinjektion
oder zum Verschmelzen von Zellen. Auf diese Weise kann für verschiedene
Bearbeitungsverfahren für
die biologische Masse 20 jeweils eine geeignete Laserwellenlänge bereitgestellt
werden.
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Um
diese Wirkung näher
zu erläutern,
sind in 3 Absorptionsspektren verschiedener
für Membranen
wie die Membran 19 verwendeter Materialien dargestellt,
wobei die Absorption in willkürlichen
Einheiten über
der Wellenlänge
aufgetragen ist. Kurve 24 zeigt dabei die Absorption für Polyethylenterephthalat
(PET), Kurve 25 zeigt die Absorption für Polyetyhlen (POL) und Kurve 26 zeigt
den Verlauf der Absorption für
Polyethylen-Naphtalat (PEN) wie die Membran 19 im Ausführungsbeispiel
von 2. Wie die Kurve 26 zeigt, weist eine
derartige Polyethylen-Naphtalin-Membran bei einer Laserwellenlänge von
355 nm eine deutliche Absorption auf, während die Absorption bei einer
Laserwellenlänge
von 408 nm vernachlässigbar
ist.
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Für andere
Membranmaterialien müssen
gegebenenfalls andere Wellenlängen
gewählt
werden, wobei für
die Wellenlänge
von 408 nm auch Polyethylenterephthalat- und Polyestermembranen
(Kurven 24 und 25) keine wesentliche Absorption
aufweisen. Als kürzere
Wellenlänge
im ultravioletten Bereich könnte
für diesen
Fall dann beispielsweise eine Wellenlänge von 260 nm oder kleiner
verwendet werden. Bei einer Wellenlänge von 408 nm sind im Übrigen auch
andere Trägermaterialien
wie beispielsweise Teflon transparent.
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Die
Erfindung ist nicht auf das in 1–3 dargestellte
Ausführungsbeispiel
beschränkt,
vielmehr können
eine Vielzahl von Modifikationen vorgenommen werden. Beispielsweise
können
statt des beweglichen Spiegels 6 aus 1 auch andere
optische Elemente zur wahlweisen Einkopplung des von dem ersten
Laser 2 und des von dem dritten Laser 3 emittierten
Laserstrahls in das Mikroskop 13 verwendet werden. Ein
Beispiel ist hierfür schematisch
in 4 dargestellt. Bei dem in 4 dargestellten
Fall wird statt des beweglichen Spiegels 6 ein Prisma 27 verwendet,
welches den vom ersten Laser 2 emittierten Laserstrahl 22 durch
Spiegelung in die Optik 16 lenkt, während der von dem zweiten Laser 3 emittierte
Laserstrahl 23 durch das Prisma 27 hindurchgeht
und so ebenfalls in die Optik 16 gelenkt wird. Das Prisma 27 entspricht
im Wesentlichen einem halbdurchlässigen
Strahlteiler. Die Auswahl des benötigten Laserstrahls kann dann
beispielsweise durch wahlweises Anschalten des ersten Lasers 2 und
des zweiten Lasers 3 oder durch wahlweises Schließen eines
vor dem ersten Laser 2 angeordneten Verschlusses und eines
vor dem zweiten Laser 3 angeordneten Verschlusses erfolgen.
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Allgemein
können
der erste Laser 2 und der zweite Laser 3 ja nach
Bedarf wahlweise ausgeschaltet werden, oder der jeweils nicht benötigte Laser kann
durch einen Verschluss (Shutter) abgeschirmt werden.
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Der
erste Laser 2 und der zweite Laser 3 sind für die oben
diskutierten Anwendungen bevorzugt gepulste Laser, je nach Anmeldung
können
jedoch ebenso Dauer-Laser verwendet werden.
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Statt
des ersten Lasers 2 und des zweiten Lasers 3 kann
auch nur ein einziger Laser mit einstellbarer Wellenlänge verwendet
werden. Ein derartiger Laser kann beispielsweise ein Festkörperlaser mit
entsprechend geeigneten Laserlinien sein. Beispielsweise weisen
Argon-Ionen-Laser
sowohl Linien im nahen UV-Bereich als auch im sichtbaren Bereich auf,
welche dann wahlweise beispielsweise durch Einstellung eines Laserresonators
des Lasers oder durch Verwendung von verschiedenen Filtern im Multimodebetrieb
des Lasers ausgewählt
werden können.
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Auch
ist die vorliegende Erfindung nicht auf zwei Laserwellenlängen begrenzt;
werden zur Bearbeitung von entsprechenden Objekten mehr als zwei verschiedene
Laserwellenlängen
benötigt,
können dementsprechend
mehr Laser vorgesehen sein, oder ein einziger Laser kann entsprechend
abgestimmt werden. Eine derartige Vorrichtung kann beispielsweise
zur Verwendung von verschiedenen Membranen mit verschiedenen Materialien
ausgelegt sein, wobei je nach verwendeter Membran entsprechend den
jeweiligen Absorptionsspektren geeignete Laserwellenlängen zum
Schneiden der Membran oder zum direkten Bearbeiten einer auf der
Membran befindlichen biologischen Masse ausgewählt werden.
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Auch
kann die erfindungsgemäße Vorrichtung
auch für
andere Anwendungen als die dargestellte Bearbeitung von auf einer
Membran befindlichen biologischen Objekten verwendet werden, beispielsweise
zur Bearbeitung von biologischen Objekten, bei welchen verschieden
Bereiche der biologischen Objekte auf Laser verschiedener Wellenlängen ansprechen.
Auch in einem derartigen Fall ist durch die erfindungsgemäße Vorrichtung,
bei welcher aus mehreren Laserwellenlängen ausgewählt werden kann, eine effiziente
Bearbeitung möglich.