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Die
Erfindung bezieht sich auf das Mikroskopieren eines Objektes mit
einer Kombination aus optischer Mikroskopie und Teilchenstrahlenmikroskopie.
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Unter
dem Begriff optische Mikroskopie wird im Sinne dieser Beschreibung
ein Mikroskopieverfahren verstanden, das zur Abbildung den optischen Gesetzen
gehorchende Strahlung, insbesondere im sichtbaren Bereich, also
Licht, verwendet. Teilchenstrahlenmikroskopie im Sinne dieser Beschreibung ist
dann gegeben, wenn eine Abbildung mittels einem Strahl geladener
Teilchen erfolgt, beispielsweise in Form der Elektronenstrahlmikroskopie.
Soweit in dieser Beschreibung von Lichtmikroskopie oder Elektronenstrahlmikroskopie
die Rede ist, ist dies lediglich beispielhaft für optische
Mikroskopie bzw. Teilchenstrahlmikroskopie zu verstehen.
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Insbesondere
für biologische und materialwissenschaftliche Proben ist
oftmals eine Untersuchung sowohl mit optischer Mikroskopie, z. B.
mit Lichtmikroskopie, und mit Teilchenstrahlenmikroskopie, z. B.
Elektronenmikroskopie, wünschenswert. Im Stand der Technik
verwendet man dazu aufwendige Mikroskope, die beide Mikroskopieverfahren
durchführen können. Ein solches Mikroskop ist
beispielsweise aus der
EP
0849765 A2 oder der
US 6683316 B2 bekannt. Solche Kombinationsmikroskope
sind insbesondere deshalb aufwendig, weil das optische Mikroskop
vollständig in die Vakuumkammer, die für die Teilchenstrahlenmikroskopie
benötigt wird, eingebaut werden muß, und ein Probentisch
vorgesehen werden muß, der die Probe zwischen beiden Mikroskopen
im Vakuum verschiebt. Die Folge sind ein relativ großes
Vakuumvolumen und zudem ein hoher Aufwand bei der Fertigung des
optischen Mikroskops, das dann in vakuumtauglicher Bauweise erstellt
werden muß. Verzichtet man bei der Teilchenstrahlmikroskopie
auf Anordnung des Objektes im Vakuum, wie z. B. im Kombinationsmikroskop
gemäß
US
20080308731 A1 , leidet die Abbildungsqualität, da
die Elektronen an einer Membran sowie an Luft gestreut werden.
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Eine
Alternative für die Verwendung solcher Kombinationsmikroskope
ist der sequentielle Einsatz von Einzelgeräten. Dies ist
beispielsweise bekannt aus der Veröffentlichung: M.
S. Lucas, P. Gasser, M. Günthert, J. Mercer, A. Helenius
and R. Wepf: Correlative 3D microscopy: LSM and FIB/SEM tomography used
to study cellular entry of vaccinia virus, A. Aretz, B. Hermanns-Sachweh,
J. Mayer (Eds.): EMC 2008, Vol. 3: Life Science, pp. 361–362,
Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008. Dort erfolgt zuerst
die optische Abbildung der Probe beispielsweise mit konfokaler Laser-Scanningmikroskopie.
Anschließend wird versucht, den bereits auf diese Weise
optisch abgebildeten Probenbereich (auch als region of interest – ROI
bezeichnet), mit einem Elektronenmikroskop aufzunehmen. Die Abbildung
der meist voluminösen Probe erfolgt dabei dadurch, daß die
Probe mittels eines fokussierten Ionenstrahls schichtweise abgetragen
und mit dem Elektronenmikroskop abgebildet wird.
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Die
sequentielle Verwendung des konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops
und des Elektronenstrahlmikroskops hat den Nachteil, daß die
Position, insbesondere die axiale Position des im jeweiligen Mikroskop
untersuchten Probenbereichs nicht exakt der entsprechenden Position
der Untersuchung im anderen Mikroskop zugeordnet werden kann. Die Korrelation
der jeweils gewonnenen Daten ist also nur schwer möglich
oder zumindest sehr stark fehlerbehaftet. Eine korrelative optische
3D-Mikroskopie und Teilchenstrahlmikroskopie ist damit nicht oder nur
eingeschränkt möglich. In einem weiteren bekannten
Ansatz wird eine Probe eingebettet. Die Untersuchung lebender biologischer
Proben ist damit nicht mehr möglich. Dann wird, wie in K.
D. Micheva and Stephen J. Smith: Array Tomography: A New Tool for
Imaging the Molecular Architecture and Ultrastructure of Neural
Circuits, Neuron 55, 25–36, July 5, 2007, beschrieben,
die Probe mit einem Ultramikrotom in Dünnschnitte zerlegt.
Geht man von einer typischen Probenabmessung von 5 bis 10 μm aus,
entstehen so bei einer Schnittdicke von 100 nm ca. 50 bis 100 Schnitte,
die nacheinander zuerst im Lichtmikroskop und anschließend
im Elektronenmikroskop analysiert werden müssen. Die dadurch
erhaltenen 2D-Bildserien werden anschließend zu einem 3D-Bilddatensatz
fusioniert. Anschließend werden die 3D-Bilddatensätze
aus der optischen Mikroskopie und der Teilchenstrahlmikroskopie überlagert. Der
Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, daß Serienschnitte
erzeugt werden müssen, was bislang automatisiert nicht
möglich ist, sondern zeitaufwendige, fehleranfällige
und mühsame Handarbeit erfordert. Aufgrund dieser Handarbeit
ist darüber hinaus die Zusammenfügung der 2D-Bildserien
zu einem 3D-Bilddatensatz sehr aufwendig, da einzelne Schnitte zueinander
verdreht sein können und auf jeden Fall zueinander verschoben
sind.
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Die
einzige bisher bekannte Lösung zur Herstellung einer Korrelation
der Bilddaten aus den beiden Mikroskopen verwendet eine zusätzliche
Mechanik, die einen spitzen Gegenstand, z. B. eine Nadel in die
Probe drückt, um so einen sich verengenden Abdruck in der
Probe zu erzeugen. Zum einen muß dabei in das optische
Mikroskop eine entsprechende Mechanik integriert werden, was für
sich schon nachteilig ist. Zum anderen muß der Abdruck
außerhalb des Bildfeldes erfolgen, um die eigentliche Probeninformation
nicht zu zerstören. Damit ist aber automatisch die Übertragung
der Information auf den Probenbereich fehlerhaft. Ein weiterer Nachteil
besteht in dem zusätzlichen Zeitaufwand, der mit der Zuordnung
des Abdruckes zur eigentlich interessierten Probenstruktur verbunden
ist. Schließlich ist dieser Ansatz auf in Harz oder Plastik
eingebettete Proben beschränkt.
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Der
Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, eine korrelative optische
und Teilchenstrahlmikroskopie zu schaffen, mit der die Bildinformationen
aus den beiden Mikroskopieverfahren optimal zueinander in Korrelation
gebracht werden kann.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit
einem System zur korrelativen optischen Mikroskopie und Teilchenstrahlmikroskopie
einer Probe, das umfaßt: ein SPI-Mikroskop zur optischen
Abbildung der Probe, das die Probe entlang einer z-Richtung abbildet
und im wesentlichen senkrecht dazu beleuchtet, wobei das SPI-Mikroskop
eine Probenbewegungseinrichtung, welche die Probe so bewegt, daß verschiedene
Probenbereiche, die vor Bewegungsbeginn in unterschiedlichen Lagen
zumindest längs der z-Richtung sind, zur Abbildung kommen, und
eine Steuereinrichtung aufweist, die Koordinatendaten erfaßt,
welche einer zumindest in z-Richtung definierten Lage von in der
Probe detektierten Strukturen zugeordnet sind, eine Probenschneidevorrichtung,
die auf Basis der Koordinatendaten die Probe schneidet, und ein
Teilchenstrahlmikroskop zur Teilchenstrahlmikroskopie der nach dem
Schneiden verbliebenen Probe.
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Die
Aufgabe wird weiter gelöst mit einem Verfahren zur korrelativen
optischen Mikroskopie und Teilchenstrahlmikroskopie einer Probe,
das umfaßt: die Probe wird zuerst mittels SPI-Mikroskopie
in optisch abgebildet, wobei die Probe entlang einer z-Richtung
abgebildet und im wesentlichen senkrecht dazu beleuchtet, die Probe
derart bewegt wird, daß verschiedene Probenbereiche, die
vor Bewegungsbeginn in unterschiedlichen Lagen zumindest längs
der z-Richtung sind, abgebildet und Koordinatendaten erfaßt
werden, welche einer zumindest in z-Richtung definierten Lage von
in der Probe detektierten Strukturen zugeordnet sind, auf Basis
der Koordinatendaten die geschnitten wird, und die nach dem Schneiden
verbliebene Probe mittels Teilchenstrahlmikroskopie abgebildet wird.
Erfindungsgemäß sind also mehrere Vorrichtungen
vorgesehen, die zu einem System zusammengefaßt sind. Unter
den Systembegriff können dabei auch noch weitere Verfahrensmerkmale
im Sinne von Verwendungs- oder Benutzungsvorschriften für
die Vorrichtungen verstanden werden.
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Die
Erfindung kombiniert also ein SPI-Mikroskop mit einem Teilchenstrahlmikroskop
und sieht weiter eine Probenschneidevorrichtung bzw. das (Be-)Schneiden
der Probe zwischen den beiden Mikroskopievorgängen bzw.
bei mindestens einem der Mikroskopievorgänge vor.
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In
einer Probe, insbesondere in einer biologischen Probe, ist die Brechungszahl
in der Regel nicht örtlich konstant, sondern gehorcht einer
Verteilung, die mit der Probenstruktur zusammenhängt. Aufgrund
dieser Verteilung kann die axiale Position nicht über die
Fokuslage des optischen Mikroskops bestimmt werden, da die Variationen
der Brechzahl in einer entsprechenden Variation der z-Lage des Fokus
bei ansonsten gleicher optischer Anordnung resultieren. Da die Brechzahl
in der Probe nicht dreidimensional erfaßt werden kann,
läßt sich die Variation des Fokuspunktes nicht
korrigieren. Somit ist die Lage von in der Probe zu detektierenden
oder detektierten Strukturen in z-Richtung nicht hinreichend präzise
angebbar.
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Die
Verwendung eines an und für sich bekannten SPI-Mikroskops,
wie es beispielsweise in der
WO
2004/053558 beschrieben ist, erlaubt eine exakte Bestimmung
der axialen Position eines zu untersuchenden Probenbereichs. Die
Abbildung der Probe mit dem SPI-Mikroskop vermeidet diese Nachteile
der variierenden Brechzahl dadurch, daß die Beleuchtung
der Probe quer zur Abbildungsrichtung erfolgt. Wie in der zitierten
WO 2004/053558 , deren
Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich einbezogen ist, beleuchtet
das SPI-Mikroskop die Probe durch ein Lichtblatt, welches die Fokusebene
des quer darin abbildenden Objektivs durchdringt. Die Beleuchtung wird
durch eine Optik erreicht, deren optische Achse im wesentlichen
senkrecht auf der optischen Achse des Beobachtungsobjektivs steht,
und die beispielsweise eine Zylinderlinse o. ä. aufweist,
welche das Lichtblatt erzeugt. Das Lichtblatt ist gegenüber
dem Mikroskopobjektiv, d. h. der Fokusebene fixiert, so daß die
z-Koordinate der abgebildeten Probenebene hochpräzise bekannt
ist – und dies völlig unabhängig von
der Brechzahlvariation der Probe. Bewegt man nun die Probe längs
der z-Richtung, kann man die Tiefenstruktur der Probe aufnehmen
und erhält so eine dreidimensionale Abbildung. Durch eine
zusätzliche Drehbewegung um eine zu den Achsen von Beleuchtungs-
und Abbildungsstrahlengang im wesentlichen senkrechte Achse kann
eine isotrope Probenabbildung erreicht werden.
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Die
so erzeugten Bilddaten über die Probenstruktur sind, wie
bereits erwähnt, hochgenau und unabhängig von
der Variation der Brechzahl der Probe.
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Nach
der derart erreichten optischen Abbildung erfolgt ein Schneiden
der Probe. Dies kann in einer Ausbildungsform der Erfindung dadurch
erfolgen, daß in eine Probenkammer des SPI-Mikroskopes
ein Mikrotom ans Probenschneidevorrichtung integriert ist. Natürlich
sind auch andere Probenschneidevorrichtungen in der Probenkammer
möglich. Die Integration der Probenschneidevorrichtung
in die Probenkammer hat den Vorteil, daß die zuvor ermittelten Koordinaten
der Probenstrukturen beim Schneiden der Probe berücksichtigt
werden können. Dieses Schneiden der Probe bewirkt eine
Verkleinerung der Probe auf Probenbereiche, die nachfolgend dann
in der Teilchenstrahlenmikroskopie abgebildet werden. Aufgrund der
in der optischen Mikroskopie zuvor ermittelten Koordinaten kann
also ein bestimmter Probenbereich noch in der Probenkammer des SPI-Mikroskops
definiert herausgeschnitten werden.
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Alternativ
oder zusätzlich kann das Abschneiden des Teiles der Probe
auch durch Ablation im Teilchenstrahlenmikroskop erfolgen, wenn
dies eine geeignete Doppelteilchenstrahlquelle aufweist, die einen
entsprechenden Teilchenstrahl zur Probenablation abgibt. Dies bietet
sich als alleiniges Schneiden dann an, wenn die zu untersuchende
Probe bereits so klein ist, daß sie im Teilchenstrahlmikroskop untersucht
werden kann, bzw. die mit Teilchenstrahlablation erreichbaren Abtragsdicken
ausreichen.
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Es
wird also in einer Ausführungsform der Erfindung folgender
Ablauf ausgeführt:
- a) Aufnahme eines
3D-Bildes mittels SPI-Mikroskop (entweder durch dreidimensionale
Probenverschiebung oder durch zweidimensionale Abbildung und Verschiebung
der Probe in z-Richtung),
- b) ggf. Bestimmung der Bildlage relativ zum Probenhalter,
- c) ggf. chemische Fixierung der Probe,
- d) Ermitteln eines interessierenden Probenbereichs aus den gewonnenen
Bilddaten,
- e) Herausschneiden des interessierenden Bereiches mittels des
Mikrotoms,
- f) Entnahme der verbleibenden bzw. durch Schneiden gewonnenen
Probe,
- g) gegebenenfalls Einbetten der Probe,
- h) Transfer in das Teilchenstrahlmikroskop,
- i) Übergabe der Koordinaten des interessierenden Probenbereichs
an das Teilchenstrahlmikroskop,
- j) Aufnahme eines 3D-Bildes durch Abbilden der Probe mit Teilchenstrahlmikroskopie,
ggf. unter Ablation der Probe mit Teilchenstrahl.
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Durch
die Erfindung wird eine Reduktion biologischer Proben auf ein Volumen
erreicht, das mit der Teilchenstrahlmikroskopie einfach abgebildet werden
kann, ohne daß die Koordinaten von interessierenden Probenbereichen
verloren gingen oder nicht mehr korrigiert werden könnten.
Manuelle Serienschnitte sind nicht mehr erforderlich. Damit lassen sich
auch lebende biologische Proben mit einer korrelativen optischen
und Teilchenstrahl-Mikroskopie abbilden.
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Insbesondere
ist es natürlich möglich, die Probe im SPI-Mikroskop
in mehrere Schnitte zu zerlegen und diese elektronenmikroskopisch
zu untersuchen.
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Eine
isotrope Abbildung im SPI-Mikroskop kann dabei insbesondere durch
eine Rotation der Probe um eine im wesentlichen senkrecht zur z-Richtung
liegende Achse erreicht werden.
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Wesentlich
für die Korrelation der Bilddaten aus SPI-Mikroskopie und
Teilchenstrahlmikroskopie ist, daß die Probe nach der SPI-Mikroskopie
in ihrer Struktur zumindest im interessierenden Probenbereich nicht
mehr geändert wird. Es findet lediglich eine Verkleinerung
auf in der Teilchenstrahlmikroskopie brauchbare Abmessungen statt,
ggf. mehrmals.
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Die
Korrelation der in den beiden Mikroskopen gewonnenen Bilddaten ist
besonders einfach, wenn ein Datenkommunikationskanal zwischen SPI-Mikroskop
und Teilchenstrahlmikroskop vorgesehen ist, über den vom
SPI-Mikroskop zum Teilchenstrahlmikroskop Koordinaten von Bereichen und/oder
Strukturen in der Probe bzw. ein- oder mehrdimensionale Bilder der
Probe übertragen werden.
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Es
versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend
noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen
Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung
einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Nachfolgend
wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten
Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren,
noch näher erläutert. Es zeigen:
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1 eine
Schemadarstellung eines SPI-Mikroskops im erfindungsgemäßen
System,
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2 ein
Teilchenstrahlmikroskop des erfindungsgemäßen
Systems,
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3 die
perspektivische Darstellung einiger Elemente des Mikroskops der 1,
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4 eine
Schemadarstellung von Probenkammer, Probenhalterung und Mikrotom
des SPI-Mikroskops der 1 in einer Ansicht längs
der optischen Abbildungsachse und
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5 eine
Darstellung der in 4 gezeigten Elemente in einer
bezüglich der auf die 4 von oben
erfolgenden Ansicht.
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Nachfolgend
werden Vorrichtungen beschrieben, die zu einem System zusammengefaßt sind.
Die 1 und 2 zeigen schematisch zwei Vorrichtungen,
die das System bilden können. In 1 ist ein
SPI-Mikroskop 1 dargestellt, das eine Selective Plane Illumination
verwendet (daher die Abkürzung SPI), um eine Probe abzubilden,
vorzugsweise dreidimensional. Das Mikroskop 1 weist dazu eine
Probenkammer 2 auf, in der eine zu untersuchende biologische
Probe 3 angeordnet ist. Die Probenkammer 2 ist
in perspektivischer Darstellung teilweise nochmals in 3 sowie
den 4 und 5 zu sehen. In allen Figuren
wurden für strukturell und/oder funktionell gleiche Elemente
gleiche Bezugszeichen verwendet.
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Wie
in der
WO 2004/053558 beschrieben
ist, bewirkt das SPIM-Mikroskop
1 eine Probenabbildung dadurch,
daß die Probe
3 mit Beleuchtungsstrahlung quer
zur Abbildungsrichtung beleuchtet wird. Dazu weist das Mikroskop
1 eine
Lichtquelle
4 auf, die durch ein Beleuchtungsfenster
5 in
der Probenkammer
2 die Probe
3 mit in Form eines
Lichtblattes
6 gebildeter Beleuchtungsstrahlung beleuchtet.
Dadurch entsteht in der Probe
3 ein Lichtschnitt
7.
Orthogonal dazu wird die Probe mit einer Abbildungseinrichtung
8,
welche ein in die Probenkammer
2 ragendes Objektiv
9 hat,
die Probe abgebildet. Die optische Achse dieser Abbildung sei nachfolgend
als z-Richtung oder z-Achse bezeichnet und liegt im wesentlichen
senkrecht zum Lichtblatt
6. Wesentlich für das
Mikroskop
1 ist, daß der Abstand zwischen Fokus
des Objektivs
9 und Lichtschnitt
7, der durch
das Lichtblatt
6 erzeugt wird, räumlich fixiert
ist. Es ist für das SPI-Mikroskop also immer bekannt, in
welcher räumlichen Lage, d. h. z-Koordinate, ein aufgenommenes
Bild liegt. Diese Zuordnung ist unabhängig von der Brechzahl
in der Probe.
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Eine
dreidimensionale Aufnahme von der Probe wird erhalten, indem die
Probe 2 entlang der optischen Achse des Objektivs 9 verschoben
wird. Dazu ist in der Probenkammer 2 ein geeignet verstellbarer
Probentisch 12 vorgesehen, der wie das gesamte Mikroskop 1 über
nicht näher bezeichnete bzw. dargestellte Datenverbindungen
mit einem Steuergerät 13 verbunden ist. Durch
die Verschiebung der Probe 3 wandert die Beobachtungsebene, d.
h. der Lichtschnitt 7 durch die Probe. Falls die Abbildungseinrichtung 8 mit
dem Objektiv 9 ein zweidimensionales Bild erzeugt, genügt
zur 3D-Abbildung eine Verschiebung des Lichtschnittes 7 durch
Probenbewegung entlang der z-Achse, d. h. der Beobachtungsachse.
Verwendet die Abbildungseinrichtung 8 hingegen eine konfokale
Detektion, ist für eine dreidimensionale Abbildung noch
zusätzlich eine Verschiebung der Probe 3 längs
der Ebene des Lichtschnittes 7 vorzusehen. Auf zusätzlich
mögliche Probenbewegungen wird später noch anhand
der 3 genauer eingegangen.
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Die
Probe 3 soll nicht nur im optischen SPI-Mikroskop 1 untersucht
werden, sondern auch in einem Teilchenstrahlmikroskop 15,
wie es beispielsweise in 2 dargestellt ist. Hierfür
ist vorgesehen, daß aus der Probe 3 ein interessierender
Probenbereich 17 ab- oder herausgeschnitten wird. Damit
dies bezogen auf das erzeugte dreidimensionale Probenbild bewerkstelligt
werden kann, ist in der Probenkammer 2 ein Mikrotom 10 vorgesehen,
das ein zum Schneiden der Probe 3 geeignetes Messer 11 aufweist.
Auch dieses Mikrotom ist vom Steuergerät 13 angesteuert.
Mit ihm wird z. B. durch Ansteuerung des Probentisches 12 ein
bestimmter, interessierender Probenbereich aus der Probe 3 heraus-
oder von dieser abgeschnitten. Bei diesem Schneiden wird Bezug auf
die zuvor erzeugte (idealer Weise dreidimensionale) Probenabbildung
genommen, so daß Probentisch und Mikrotom relativ in eine
bestimmte Lage gebracht werden und dann durch ggf. automatische
Mikrotombetätigung ein hochpräzises Herausschneiden
des interessierenden Probenbereiches erfolgt.
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Dieser
Probenbereich 17 (z. B. Probenschnitt) wird dann in eine
Vakuumkammer 18 des Elektronenstrahlmikroskops 15 (vgl. 2)
eingebracht und dort auf einen entsprechenden Probenhalter oder
Probentisch 18 gelegt. Das Elektronenstrahlmikroskop ist
in dieser Ausführungsform als Doppelstrahlmikroskop ausgebildet.
Es verfügt über zwei Strahlquellen, nämlich
eine Ionenstrahlquelle 19, welche einen Ionenstrahl 20 auf
den nun als Probe dienenden Probenbereich 17 richtet, und
ein elektronenoptisches System in Form einer Elektronenstrahleinrichtung 21,
die einen Elektronenstrahl 22 auf die Probe richtet, sowie
einen Detektor 14 zum Nachweis von Elektronen, die von
der Probe rückgestreut werden. Der Ionenstrahl 20 bewirkt
aufgrund seiner hohen Energie den Abtrag von Probenmaterial, wie
es der Fachmann aus dem Stand der Technik kennt. Die Anordnung wird
nun dazu benutzt, durch im Wechsel stattfindende Abbildung mit dem
Elektronenstrahl 22 und Abtragung mit dem Ionenstrahl 20 die
Probe im Volumen abzubilden. Dabei wird die Probe 17 natürlich
zerstört.
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Aufgrund
der dreidimensionalen Bildgebung im Mikroskop 1 mit insbesondere
hochpräzisen Angaben über z-Koordinaten von Probenbereichen kann
im System ein interessierender Probenbereich 17, beispielsweise
durch das Mikrotom 10, derart isoliert werden, daß die
Bilddaten aus dem Mikroskop 1 und dem Elektronenstrahlmikroskop 15 hochpräzise zueinander
korreliert werden können, wodurch aus beiden Mikroskopen
maximale gut zueinander zugeordnete Bildinformationen über
die Probe 3 gewonnen werden. Durch die zuvor bewirkte (3D-)Bildgebung
im Mikroskop 1 kennt man die Lage, welche der im Teilchenstrahlmikroskop
abgebildete Probenbereich 17 in der ursprünglichen
Probe 3 hatte, genau und kann so die elektronenmikroskopisch
gewonnenen Bilddaten zu den optischen Bilddaten korrelieren.
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3 zeigt,
wie bereits erwähnt, schematisch den Bereich der Probenkammer 2 des
Mikroskops 1. In dieser Ausführungsform befindet
sich der (nicht weiter gezeigte) Probentisch unter der Probe 3, welche
sich in einem Zylinder befindet, der senkrecht zu den optischen
Achsen von Beleuchtungs- und Abbildungsoptik drehbar ist. Eine dreidimensionale
Aufnahme der Probe 3 wird nun dadurch erhalten, daß die
Probe entlang der optischen z-Achse durch eine in 3 schematisch
dargestellte z-Verschiebung verschoben wird. Zusätzlich
wird die Probe ggf. nach einer solchen Verschiebung nochmals gedreht
und die Abbildung wird wiederholt. Dadurch erhält man mehrere
Datensätze, die geeignet zu einem isotropen und hochaufgelösten
Bilddatensatz fusioniert werden.
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Bei
der Probe 3 handelt es sich hier um ein biologisches Material,
das exemplarisch in ein Agarose-Gel 26 eingebettet ist.
Weiter ist die Probe im der Probenkammer 2 mit Wasser umspült,
was eine Anpassung an die Brechzahl der Probe erreicht und die optische
Auflösung verbessert.
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Der
Vorgang des Schneidens der Probe ist in den 4 und 5 schematisch
dargestellt. Die Darstellung der 4 entspricht
dabei im wesentlichen einer Ansicht der 1 von unten
(bezogen auf die Darstellung der 1). 5 zeigt
hingegen eine Darstellung, die im wesentlichen der 1 entspricht.
Die Probenkammer 2 hat einen Zugang für die Probe 3,
welche in das bereits erwähnte Agarose-Gel 26 eingebettet
ist. Sie befindet sich weiter in einem Zylinder 29, der
beispielsweise aus einem Glasröhrchen besteht. Im Zylinder
geführt kann die Probe längs der Zylinderachse
verschoben werden, wodurch der Agarose-Gel-Zylinder in die bzw.
aus der Probenkammer 2 transferiert werden kann.
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Bei
der hier dargestellten Ausführungsform wird eine biologische
Probe 3 untersucht. Für hochauflösende
Untersuchungen ist es dabei erforderlich, den Zustand der Probe
zu fixieren. Dies erfolgt in der Regel durch Zugabe eines chemischen
Fixiermittels. Hierfür sind im Zylinder 29 Zuleitungen 30,
die beispielsweise als Kapillaren ausgebildet sein können, vorgesehen. Über
sie kann das Fixiermittel zugegeben werden, und nach der Fixierung ändert
sich die Probe nicht.
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Nach
der Fixierung soll die Probe 3 elektronenmikroskopisch
weiter untersucht werden. Aufgrund der wesentlich höheren
Auflösung eines Elektronenmikroskops und der regelmäßig
geringen Abtragsrate eines Ionenstrahls, ist es bei den meisten Proben 3 vorteilhaft
bzw. notwendig, nur einen interessierenden Probenbereich 17 der
Probe 3 zur Elektronenmikroskopie zu bringen, also zum
Elektronenmikroskop zu transferieren. Folglich muß in den meisten
Fällen die Probe, gegebenenfalls nach der Fixierung, auf
den interessierenden Probenbereich 17 zugeschnitten werden.
Um die Bilddaten des Elektronenmikroskops mit den Bilddaten des
optischen Mikroskops perfekt korrelieren zu können, muß der Zuschnitt
natürlich in exakter und bekannter Position erfolgen. Dazu
ist in der Probenkammer 2 ein Zugang für das bereits
erwähnte Mikrotom 10 vorgesehen. Es wird vorzugsweise
auf der dem Beleuchtungsfenster 5 gegenüberliegenden
Seite zugeführt und umfaßt neben dem Messer 11 eine
Auffangplatte 10, auf der abgeschnittene Scheiben der Probe
zu liegen kommen. Für jeden Schnitt ist dabei aufgrund
der vorherigen Bildgebung zumindest die z-Koordinate der Schnittgrenzen
bekannt. Durch Entnahme der Auffangplatte 32 kann dann
der Schnitt aus der Probenkammer 2 entnommen werden. Zum
Erzeugen eines Schnittes wird dabei das Messer 11 in Richtung
des Pfeiles 31 vorgeschoben.
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Soweit
vorgehend Bezug auf einen zylindrischen Probenhalter genommen wurde,
kann dieser insbesondere so ausgebildet sein, daß er nicht
nur im optischen Mikroskop 1 verwendet werden kann, sondern
auch in das Elektronenmikroskop 15 eingesetzt werden kann.
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Die
erwähnte Fixierung der Probe ist für bestimmte
Probentypen vorteilhaft. Bei anderen Probentypen hingegen ist eine
direkte, zeitnahe Fixierung der Probe während er Beobachtung
im Mikroskop 1 nicht erforderlich.
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Die
Abbildung der Probe mit Teilchenstrahlenmikroskopie kann natürlich
besonders bevorzugt mit einem Elektronenstrahlmikroskop erfolgen.
Alternativ kann jedoch auch eine Ionenquelle, z. B. mit Heliumionen
arbeitend, verwendet werden. Gleiches gilt für den Abtrag
des Probenbereichs 17 im Teilchenstrahlmikroskop 15.
Hierfür kommen verschiedenste Ionenquellen in Frage.
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Die
optische Mikroskopie der Probe kann sowohl in Fluoreszenzmikroskopie
als auch im Hellfeld-Verfahren erfolgen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
- - EP 0849765
A2 [0003]
- - US 6683316 B2 [0003]
- - US 20080308731 A1 [0003]
- - WO 2004/053558 [0012, 0012, 0030]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - M. S. Lucas,
P. Gasser, M. Günthert, J. Mercer, A. Helenius and R. Wepf:
Correlative 3D microscopy: LSM and FIB/SEM tomography used to study
cellular entry of vaccinia virus, A. Aretz, B. Hermanns-Sachweh,
J. Mayer (Eds.): EMC 2008, Vol. 3: Life Science, pp. 361–362,
Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008 [0004]
- - K. D. Micheva and Stephen J. Smith: Array Tomography: A New
Tool for Imaging the Molecular Architecture and Ultrastructure of
Neural Circuits, Neuron 55, 25–36, July 5, 2007 [0005]